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.. FECHA DE: INICIO: FECHA DE TERMINACION: NOMBRE DEL TUTOR EXTERNO: PUESTO: ADSCRIPCI6N:

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FIRMA

DE LOS ALUMNOS:

DEL TUTOR :

ROSARIO OLGUTN'YAEEZ MA. DE LOS ANGELES ORTIZ PGREZ 5 42 4 7 32

6 89 18 72

82339628

82342689

23.2.032.88

ING. DE ALIMENTOS 80-0

25

I,

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS EN EL AREA DE BIO- TECNOLOGfA EN LA U.N.A.M. 25 DE JULIO DE 1988

3 1 DE MAYO DE 1989

DR. PABLO PGREZ-GAVILAN E. INVESTIGADOR TITULAR. INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMl?DICAS, U.N.A.M. DISER0 DE.UN METODO PARA EVA- LUAR EL VALOR NUTRITIVO DE - LOS CARBOHIDRATOS EN LOS -- ALIMENTOS: qORRELACI6N CON - LA DIGEST-XD EN MONOGAS-

3 TRICOS,

_- /e

4

6:

3 5

-4- c

.- D I S E R 0 D E UN METODO PARA EVALUAR EL VALOR

I.

N U T R I T I V O D E LOS CARBOHIDRATOS EN L O S -

ALIMENTOS. (CORRELACION CON LA D I G E S T I B I -

LIDAD EN MONOGASTRICOS) .

. I N T R O D U C C I O N

Debido al costo y dificultad de esperimentación con ani-

males, se han buscado métodos para análizar los alimen - tos y asignarles una predicción de valor alimenticio.

La mayoría de los métodos analíticos que se uti1 izan co-

múnmente dependen de diversos procedimientos químicos - que son específicos para un determinado alimento, com - - puesto o grupo de compuestos. Los datos cuantitativos - pueden obtenerse mediante procedimientos que implican - la titulación con ácidos o b a s e s , colorimetría, cromato-

b

un conjunto de métodos analíticos; se destina a la des - cripción rutinaria de piensos y, aunque bajo un punto de

vista de la nutrición presenta varios defectos, sigue - utilizandose ampliamente. Consiste en determinar las di-

ferentes fracciones que se obtienen, incluyen: agua, - proteína bruta, extracto etéreo, cenizas, fibra bruta y

extracto libre de nitrógeno.

Proteína bruta: El sistema ut.ilizado es el conocido como

método Kjeldahl. El material que va a ser anal izado es - /, *

digerido en primer lugar con ácido sulfúrico concentrado,

que transforma el N en sul?ato de amonio, Posteriormente

se enfria ésta mezcla, se diluye con agua y se neutraliza .z=

con hidróxido de sodio, que pone el N en forma de amonio

ionizado. Se destila la muestra y el destilado se titula

?

con ácido. Este analísis es seguro y repetible: aunque es

relativamente largo e implica el empleo de productos quí-

micos peligrosos,

Bajo un punto de vista nutritivo, ,los datos obtenidos son-

aplicables a los rumiantes que son capaces de utilizar e.fi - cazmente casi todas las formas de N, aunque pueden ser de-

poca utilidad para especies monogástricas, tales cgmo hom-

bre, cerdo y aves.

Las especies monogástricas tienen necesidades específicas-

para diversos a.a, y no utili.zan eficazmente compuestos - de N no proteico, tales como amidas, sales de 'amonio y urea.

a t.

Extracto etéreo:.Este método obliga a extractar con éter - las muestras molturadas durante un periodo de cuatro horas

o más. Las materias. solubles en éter incluyen una amplia - gama de compuestos orgánicos de los que tan sólo unos PO - cos tienen importancia nutritiva.

Si el extracto contiene grandes porcentajes de ceras, acei

tes esenciales, resinas o compuestos similares los datos - alcanzados tienen poca significación, ya que estos compues

tos tienen poco valor para los animales.

Cenizas: Es el residuo que permanece tras quemar todo el ma

terial combustible en un horno mufla a 500-600°C. nutritiva -

mente el valor de las cenizas tiene poca importancia, aunque

valores execivamente altos pueden indicar una contaminación

con tierra o dilución de los alimentos con sustancias tales

1. 8

2.

como sal o piedra caliza. En el análisis inmediato !.os datos

correspondientes a las cenizas se precisan para obtener -- otros valores. Deberá destacprse que algunos elementos mine

rales, tales como el yodo y el selenio pueden ser volátiles'

y no aparecer con las cenizas. Normalmente, estos elementos

representan solamente porcentajes muy pequeños del total,. - por lo que el error es mínimo.

Fibra bruta: Se determina a partir de una muestra sometida-

a extraccci6n con éter, se hierve en ácido diluido, después

en una base diluida, se deseca y se quema.en la mufla. La - diferencia de peso antes y después"de quemar es la fracción

correspondiente a la fibra bruta. Se trata de un método de-

laboratorio tedioso que no suele dar los mismos resultados-

al repetir la comprobación. Intenta simular primero la diges - tión que tierle lugar el estómago y después en el intestino - delgado de los animales.

La fibra bruta representa primordialmente a los carbohidratos

de las estructuras vegetales, tale's como celulosa y hemicelu-

losa aunque también contiene algo de lignina, un material su-

mamente indigestible asociado con la porción fibrosa de los - tejidos vegetales. Para los animales monogástricos, el valor-

de la fibra bruta es variable, aunque siempre escaso; su va -

I

lor no es constante para los rumiantes, aunque la utilizan - mucho mejor que los animales monogástricos.

3

Extracto libre de nitrógeno ( E L N ) : Esta denominación es

errónea, ya que no se trata de ningún extracto. Se deter I

mina mediante una diferencia es decir, E L N es la diferen - cia entre el peso de la muestra orig-nal y la suma de - - los pesos del agua, extracto etéreo, proteína bruta, - fibra bruta y cenizas. Recibe la denominación de extracto

libre de nitrógeno porque ordinariamente no contiene ni-

trógeno. El ELN consta principalmente de carbohidratos - facilmente digeribles, tales como azúcares y almidones,

..

aunque también puede contener algo de hemicelulosa y de

1 ignina, especialmente en a'l imentos como los forrajes.

Un aná1 i s i s más apropiado determinaría específ icamente - l o s carbohidratos facilmente digeribles, hidrol izando - los almidones hasta azúcares y determinando analíticamen

te la totalidad de azúcares presentes.

Nutritivamente, la fracción de ELFl de l o s cereales es - bien utilizada por casi todas las especies domésticas.

En las tablas I y I t se presentan las especies más abun-

i' cjantes de carbohidratos en la dieta. Su importancia re-

lativa sólo está dada como una gula aproximada y variará

de acuerdo a la naturaleza o composición de los alimen - to S-.

j .

I

4

TABLA I

Azúcares libres en alimentos """"""""""---""""""""""""""""""""""- FRECUENCIA RELATIVA

CATEGORIA ESPECIES EN LA DIETA

Pentosas Arabinosa Rara Xylosa Rara

c

Hexosas Glucosa Fructuosa Galactosa*

Disacáridos Sacarosa . b- Lactosa**

Maltosa '

Mayor Mayor Menor

Mayor Menor Menor

Oligosacáridos Rafinosa 'I Menor Maltotriosa Menor Estaguiosa Menor

*

**

I

11

Usualmente restringida sólo a productos lácteos fermentados.

Sólo en leches y productos lilcteos.

Especialmente en alimentos que contienen jarabe de glucosa.

Estos son comunes en muchos vegetales.

5

TABLA I1

Polisaciridos en alimentos

................................

Agrupación General Clases Tipos Presentes Importancia Rela tiva en la dieta

................................

Polisacáridos de -: Almidones Dextrínas . reserva Amilosa

Amilopectina Modificados

L- Otras rs servas - de poli- sacáridos Glucdgeno

Fructanos Mananos Galactoglucomana nos

-

Polisacáridos estructural es

Sin celg losa Substancias Pécticas

Hemicelulosa Gomas Mucilaginosas

Celulosa Variando el grado de polimenzación

Menor Mayor Mayor Menor

Menor Menor Mensr

Menor

Menor Menor Menor

Menor

ALGAL Polisacáridos Sulfata-

dos [) 8 Carragenina]Agar Menor

No sulfa tados Alginatos Menor

- I (

c , . """""""""""""" r~""""-c""""""""""""-

6

Í

Pruebas de Digestión (Digestibilidad)

Estas pruebas se usan para determinar la proporción de un

alimento que'es utilizable por el animal mediante absor - ción en tracto gastriontestinal (TGI). Loa animales son - alimentados con una dieta de compocisión conocida durante

un periodo de tiempo de varios días, durante los cuales - se recogen la heces que son analizadas para determinar. - los componentes que interesan. Es aconsejable mantener un

consumo diario constante de alimentos durante varios días .-

para reducir al mínimo la variación diaria en la producción

de heces. E l tiempo preciso para que los residuos de los - alimentos atraviesen el TGI es de uno a tres días para los

animales monogástricos y de cinco a diez días para los ru-

miantes. Por consiguiente, es preciso un período preliminar

de cuatro a diez días para que se eliminen del TGI los re - siduos de los alimentos anteriores a la iniciación de la - prueba y para que el animal se adapte a la dieta comprobada

tras el período preliminar de adaptación sigue un período - de recolección de heces de cuatro a diez dias. Pueden obte-

nerse valores correspondientes a la digestibilidad aparente d B

de cualquier nutriente aunque los datos pueden ser poco siq

Snificativos para algunos nuirientes como vitaminas y minera

les cuyo paso desde 12 luz de1 TGI al organismo y desde el-

organismo a la luz del TGI es bastante variable y sometido - a cambios. Existen dos medios generales para calcular la di-

n c..

7

gestibilidad de un alimento o de sus componentes . Uno es - mediante recolección total de alimentos y heces, que permite

una medición directa de la digestibilidad aparente. Se calcu

la :

Digestibilidad aparente(%) := Nutriente ingerido - Nutriente x - en heces

'I

100

Nutriente ingerido

U

Un segundo procedimiento, el apropiado cuando es imposible o no conveniente-medir e¡ consumo total de alimento o recoger todas las heces, es el método indicador.

Este método depende del empleo de una sustancia inerte de re- ,.,

ferencia. Los indicadores internos son aquellos que como la lig-

nina se hallan presentes en el alimento. Indicadores externos - como el óxido crómico,se ad.icionan al alimento o se suministran

al animal.

Un indicador no debe ser tóxico, ser sabroso y fácil de determi-

nar: deberá ser insoluble y atravesar el TGI con una velocidad

uniforme. El cálculo de la digestibilidad de un nutriente en - , ,

particular, utilizando el método indicador, es como sigue:

Digestibilidad aparente = 100 -

% de indicador % de nutrientes - en las heces en las heces % de indicador % de nutriente en el alimento en el alimento

Dicha proporción constituye un cálculo de la digestibilidad de

8

un nutriente particular sin conocer ni el consumo total de

alimento ni la expresión total de heces.

Metabolismo de la energía (Bioenergética) . Es importante en el conjunto de la nutrición anima1,porque la energía repre-

senta, cuantitativamente el componente más importante en la

dieta de l o s animales y todas los estandars de la alimenta-

ción se basan en las necesidades de enrgía. -

Terminología energética. La energía química utilizada por los

animales pusde medirse en t&minos de calor y expresarse en

forma de calorías.

La energía es dividida en distintas fracciones en términos de

su utilización por parte del animal.

Energía bruta (EB) es la cantidad de calor resultante de la

oxidación completa del alimento, pienso o de otras sustancias.

El término calor de combustión que se emr>lea en la terminolo-

gía química es lo mismo. La EB se mide en aparatos llamados

bombas calorimétricas. Varian los valores energéticas .,de 10s

distintos nutrientes. Aunque los valores típicos son (Kcal/gf;

carbohidratos,4.1: proteínas 5.65 y grasa 9 . 4 5 . Estas dife-

pncias reflejan principalmente el estado de oxidación del - compuesto inicial.

Un alimento de escasa calidad como la paja de avena tiene el - mismg valor Qe EB que el maíz en grano. Esta comparación pone

claramente de manifiesto que los valores de la EB , por s í - mismos tienen poco valor práctico en la valoración de los al&

mentos destinados a los animales.

9

Se denomina Energía digestibnle aparente (ED) a la EB del

alimento consumido menos la energía fecal. En la práctica

el consumo de energía bruta de una animal se mide cuidado-

samente durante un período de tiempo en el que se efectúa I >.

la recogida de las heces, Ta.nto los alimentos como las heces

se analizan para determinar su contenido de er,ergía y los - datos obtenidos permiten calcular la energía digestible.

La energía digestible aparente no constituye una medida ver-

dadera de la digestibilidad de una dieta o de un nutriente

determinado*-porque el TGI de un animal representa un lugar '

activo para la expresión de diversos productos que se eli-

minan con las heces, y porque las heces pueden tener cant&

dades apreciables de restos celulares procedentes de la des

carnación de las células que recubren el TGI, a s í como por - factores que no tienen una relación directa con los tejidos'

alimenticios no digeridos. Además los microbios no digeridos

y sus subproductos metabólicos pueden constituir una porción

importante de las heces de algunas especies. Aunque algunos

de estos microbios podrían ser digeridos si pasasen a través

del estómago y del intestino delgado, una buena parte de su

crecimiento tiene lugar en e1 ciego y en el intestino grueso,

donde no existen enzimas entéricas y la absorción es relati-

, . vamente escasa, Tan solo en el caso de componentes fibrosos -

C.

de los vegetales como son celulosa, y xilano, que son materias

extrafias para el organismo animal, representan los valores una

medida de la digestibilidad verdadera.

10

Nutrientes digestibles totales (TDN) es la determinación

más común de la energía utilizada en la formulación de racio - nes para rumiantes y cerdos en E.U.

El TND es comparable, a groso modo con la ED~aunque se ex-

presa en unidades de peso o en forma de %, cuando se desea - transformar el TDN en ED, los valores utilizados generalmente

son: 4 . 4 Kcal de ED/g de TNU . E l TDN s e determina efectuan-

do una prueba de digestión y sumando la proteína digestible,

los carbohidratos (ELN) y 'fibra bruta y 2.25 veces el extrae-

to etéreo digestible (Grasa bruta) . La grasa se multiplica - por 2.25 debido a su mayor 17alOr calórico. Cuando se compara

con la ED, el TDN infravalora a la proteína, ya que la proteína

no es oxidada totalmente en el organismo, mientras que s í lo es

en la bomba calorimétrica. Multiplicando la Proteína digestible

por 1.25 se situaría el TDN en una base más real cuando se - compara con la ED.

La f6rmula para el TDN es :

TDN= Proteína bruta digestible + ELN digestible + fibra bruta

..

c.

digestible + 2.25 (Extracto etéreo digestible)

Las publicaciones actuales del NRC tienden a valorar otros

valores de la energía, aunque debe sefialarse que la mayoría

de estos valores para la energía metabolizable (EM) o la - energía neta (EN) derivan del TDN.

<.., c .

Energía metabolizable (EM) se define como la energía bruta del

alimento menos la energía presente en hedes, orina y productos

11

gaseosos de la digestión. Las pérdidas de los gases combus-

tibles son despreciables :y normalmente se ignoran en muchas

especies monogástricas, aunque se producen algunas pérdidas

como resultado de fermentaciones en el ciego y en el intes- * <.

tino grueso.

La EM se emplea comúnmente para valorar los alimentos desti-

nados a las aves y para establecer sus estándares de alimen-

tación porque las heces y la orina son excretados juntos. - Así es conven,iente el empleo de los valores de la EM para - estas esp'&cies.

Una fórmula apropiada para calcular la EM correspondiente a

los cerdos, cuando se conoce la ED, es : L.

Energía Neta (EN) = EM - calor dinámico específico 6 incremento de calor (IC) y el calor de ferm. (CF)

Si se desea estudiar la utilización de la EM, es preciso - medir (a) la producción de calor de los animales o (b) la - '

energía retenida en los tejidos, la utilizada para el trabajo

l ' productivo o eliminada en un producto como la leche. Si se - conoce una de estas cantidades (a 6 b) puede hallarse la -- otra restando la conocida de la EM.

12

De lo anterior se deduce que sería necesario idear un - método para analizar los alimentos y asignarles una pre-

dicción de valor alimenticio %+e facilite su medición :

evite,ba dificultad de experimentación con animales para

encontrar el total de nutrientes digestibles y esto es lo

que se pretende con este trabajo.

L.

r,. .

OBJETIVO

r

~ - .

Diseiiar un método para evaluar el valor nutritivo de los

carbohidratos en los alimentos, basado en la fermentación

de los azúcares presentes disponibles para la levadura -

- S. cerevisiae y relacionados con la producción de etanol.

Correlacionar los carbohidratos fermentecibles con la - digestibilidad en monogástricos.

..

Determinar el valor nutritivo de los alimentos en unida-

des calóricas digestibles.

(r, . C.

JUST I Fl CAC I ON

' C

Con éste método se pretende facilitar la medición b e la

digestibilidad de alimentos en animales monogástricos.

Suponiendo que por analogia del tracto gastrointestinal

(TGI) secreta entimas digestivas como la amilasa pan - - creática que actúa en el almidón y dextrinas y la alfa-

glucosidasa-producidas en las'glándulas intestinales y

que a l ser adi.cionadas éstas enzimas a diferentes al¡ - mentos los convierte en azúcares de tal forma que la - levadura pueda tomarlos e iniciar la fermentación.

Se considera que la levadura actuará de manera similar-

que l o s monogástricos, esto es', hombre, cerdo, pollo, - etcétera.

Cabe mencionar que los azúcares fermentad:os por S. cere - visiae son glucosa, fructosa, manosa, galactosa, sacar0 -

C.

sa, mal tosa y raf inosa.

E l mgtodo que se describirá posteriormente se basó en la

fermentación de los azúcares por la levadura S. cerevi - siae que los convierte en alcohol y considerando la est2

quiornetría de la reacción:

Glucosa - - - - - - - - - 2 Etanol

t

La que relaciona la cantidad de azúcares fermentecibles

con l a producción de alcohol.

15

La hipótesis de selección del método se fundamentó en que

se consideran l o s carbohidratos fermentecibles por la - levadura como los carbohibratos digestibles por los mono-

gástricos.

L

L

* La razón de diseñar éste mgtodo, es que se tienen en mente

las 1 imitaciones existentes, para calcu,lar ? a d-ig,estL.b.ili- .

dad que se utiliza para determinar la proporción de nutri-

mentos que"se encuentran en un alimento o dieta que pue-

den absorberse en el aparato digestivo, ya que'el animal

vive de calorias totales absorbidas y no de porcentajes - en el alimento.

De tal forma que l o s nutrientes digestibles totales se - calcularian sustituyendo el extracto libre de nitrógeno - por carbohidratos fermentecibles, expresado de la siguiec

te forma:

TND (-9) = C a r b o h i d r a t o s ' f e r m e n t e c i b l e s + Proteína Bruta Digestible + 2.25 (Extracto - - etéreo digestible).

R

16

MATS9IIAL3S Y MI!TODOS.

METODO GENERAL.

Cepa. La cepa utilizada fué Saccharomyces cerevisiae, - - de SAF-HEX (levadura enológica 1 iofjl izada).

Hidrólisis del sustrato. La hidrólisis fué hecha con alfa- ' L

amilasa (Takaterm) y glucosidasa (Diazyme); ambas de - - ENMEX,S.A.

Procedimiento:

- A un matraz volumétrico de 100 m 1 se le adicionan 10 g de

sustrato. .I

- Agregar un poco de agua. - Adicionar .1 m1 de enzima alfa-amilasa.

- Calentar el matraz en bafio Maria a 96C durante 30 minutos. - Enfriar a 25aC.

c.

- Ajústar el pH con ácido sulfúrico 2N d e 4 a 4.5 para que

actúe la segunda enzima.

- Adicionar . l m l de enzima glucosidasa.

- Calentar el matraz en baño Maria a 70°C durante 30 minutos.

- Adicionar agua corriente. - Adicionar 1 g de extracto de levadura.

- Enfriar a 25°C. - Ajustar el pH para iniciar la fermentación con ác. sulfúrico

2 N entre 4.10 a 4.3 . - Aforar el matraz con agua corriente a 100 ml.

- Adicionar 0.5 g de levadura S. cerevisiae . -

17

- Tapar l o s matracea con papel aluminio.

- Mantener en reposo el medio contenido en los matraces - durante 4 dias a 2g0C, para que se realice la fermentación

- Determinar % de etanol en las muestras por cromatografia 'C..

de gases . Se utilizó un cromatógrafo modelo 3700 de -- V A R I A N , equipado con detector de ionización de flama e in-

tegrador. La curva patrón se realizó inyectando 1 microli-

tro de soluciones de etanol de concentraciones conocidas,

éstas fueron de 2 y 10 % de etanol v / v .

La inyección se realizó en cromatógrafo el cual cuenta con

una columna de acero inoxidable de 3 pies de largo y empa- i

cada con cromosor !II a/w DMCS y 20 % Tween 80, 28 áC. fOS-

c

fórico.

Las condiciones del aparato Fueron como sigue:

10"C/min iniciando en 70°C

y terminando en 120°C.

Los flujos de gases fueron como siguen:

, . Hidrógeno --------- 20 ml/min < -. I .

Se toma u n a muestra de 10 m1 de producto fermentado y se - filtra a través de papel filtro.

18

1 microlitro de éstos filtrados se inyecta en el cromatógrafo

y los resultados reportados por el integrador se dan en % de

c;, etanol v/v después de compararlos con la curva estandard. I.*

- Relacionar cantidad de etanol producido con la cantidad de azúcares fermentecibles en la muestra, expresados como gluco-

sa presente, de la siguiente manera:

En base a los valores teóricos en m1 de etanol según la este-

qiometría de la reacción a partir de diferentes concentracio-

nes de glucosa, se encuentra una relación directamente propor - cional que permite obtener una recta teórica . De esta recta tenemos una pendiente teórica.

Posteriormente se procede a calcular en forma experimental - el % de etanol a diferentes concentraciones de glucosa, de - estos valores obtenemos una recta y a su pendiente la llama-

remos real o experimenta1,Si relacionamos las dos pendientes

obtenemos un factor de corrección (No.), de tal manera que - el % de etanol base seca promedio de los alimentos se multi-

..

plique por éste factor y se asegure la determinación del %

de azúcares fermenteci)!es de la muestra expresados como - - I- .

glucosa presente.

El cálculo de los valores teóricos esperados en m1 de etanol

CL,. según l a estequiometría de la reacCiÓn es muy senc,iIlo : o

C H 0 _-_-- - - -_- 6 12 6 2 C H 3 -CH2 - O H + 2 C 0 2

glucosa etanol

PM = 180 g glucosa ------------ 92 g de etanol

La humedad de la glucosa es de 9.029 %

De 10 g de glucosa tenemos 9.0971 g de glucosa seca.

180 g glucosa --------- 92 g etanol 9.0971 ” ”””“ X

x = 4.649 g etanol

0 . 7 9 g/ml = 5.88 m1 de etanol esperado.

Densidad del etanol = 0.79 g/ml

VALORES TEdRICOS ESPERADOS DE ETANOL (ml)

A PARTIR DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE GLUCOSA ( 9 )

GLUCOSA ( 9 ) 1 0 5 2

ETANOL ( m l ) teórico esperado 5.88 2.94 1.17

Ecuación de la recta teórica y = 0 . 5 8 ~ - 0.0058 m = m No. T r m,.: pendiente teórica

m = 0.58 T mR: pendiente real o experimental

No.: Factor de corrección b 1 . I

m

m

% etanol X No. = % alcoholt= % azúcar de la muestra

alcoholt = alcohol t e ó r i c o esperado

T - No. R

- . )

<, c.

2 3

En base al procedimiento del método general se realizaron - los siguientes experimentos:

EXPERIMENTO 1 . Influencia de la adición de sulfato de amonio

como fuente de nitrógeno en la producción de etanol por la - levadura S. cerevisiae.

Se utiliza el mdtodo general pero modificando la fuente de - nitrógeno y el .* pH. Se probaron tres cantidades como fuente de nitrógeno para - formar e1 medio de cultivo.

1 ) 1 g de extracto de levadura, sin sulfato de amonio.

2) 0.1 g de sulfato de amonio, sin extracto de levadura.

3) 1 g de extracto de levadura con 0.1 g de sulfato de - - amonio.

Se manejaron dos pHs de 4.5 y de 4.

‘ t

EXPERIMENTO 2. Influencia de la cantidad de levadura y del

pH en la producción de etanol. i . ’

Se realizaron 4 experimentos por duplicado con el mismo - método general pero modificando cantidad *de levadura y pH.

Condiciones: pH 5 4.5 con 0.2 g de levadura - S. cerevisiae. o c;

pH = 4.5 con 1 g de levaduia S. cerevisiae.

pH = 4.3 con 0.2 g de levadura - S. cerevisiae.-

pH = 4.3 con t . 0 g de levacju‘ra 2. derevisias.. 21

EXPERlflENTO 3. lnfluencia de l a concen - tración de glucosa en

la producción de etanol.

Se realizaron 6 experimentos con el método qeneral utilizando

tres concentraciones de glucosa 10 g, 5 g y 2 g.

I >

EXPERIMENTO 4. Cinética de la1 producción de etanol a partir

de la fermentación de glucosa (lOg/IOO m1 dis).

h

Se realizaron 4 experimentos utilizando el método general.

c.

EXPERIMERTO 5. Determinación de la cantidad de producto - fermentado de diferentes alimentos.

Se prueban 7 harinas aplicando el mismo método general. Para

fines prácticos de la experimentación se utilizó avena en - hojuelas; fécula de maíz (Maizena); sorgo, trigo y yuca en

harina; porcitina (alimento comercial); y alimento para pollo

molido hecho en la U . N . A . M .

Para saber la cantidad de carbohidratos fermentecibles de - cualquier grano, deberá molerse y homogeneizar la mezcla.

, - $

Las cálculos'para obtener el !% de carbohidratos fermentecibles

en base seca se muestran en e1 anexo 1 .

- c.

22

- CORRELACldN CON LA" DIGESTIBLLIDAD.

Los nutrientes digestibles totales (TND) se calculan por

éste método, sustituyendo el extracto l i b r d d e nitrógeno por

- ' t

carbohidratos ferrnentecibles, expresados d e la siguiente - - forma:

TND (9) = Carbohidratos fermentecibles (g) + Proteína b r u t a digestible (.g) + 2.25 (extracto etéreo digestible)(g)

T N D (Kca]) = Carboh-Fdratos fermentecibles (9) (4.4 Kcal/g)

+ Proteína bruta digestible (9 ) (4.4 Kcal/g)

+ 2.25 (Extracto etéreo digestible) (9) (4.4 Kcal/g)

La fibra b r u t a en monogástricos no es aprovechable.

.. ,

RESULTADOS Y DISCUSION

EXPERIMENTO 1 . Influencia de la adición de sulfato de amonio

como fuente de nitrógeno en la producción de etanol por la - levadura - S. cerevisiae.

De acuerdo a los resultados se observa en la tabla 1 que la

adición de sulfato de amonio no influye en el aumento de la

producción de etanol; ya que, de las tres condiciones pro-

badas, la prueba ( 1 ) que no tenia sulfato de amonio producía

el nivel más alto contando st510 con la fuente de nitrógeno

del extracto de ievadura; en l a prueba (3) donde se adicio-

naron las dos fuentes de nitrógeno no reflejan un cambio - considerable en la producción de etanol con respecto a la - primera prueba; en la prueba (2) donde se adicionó sulfato - de amonio sin extracto, la producción de alcohol fué menor - comparada con las d o s prueba!; anteriores del experimento.

Puede apreciarse además, que a un pH de 4 la producción de - etanol es menor que a un pH de 4.5.

.-

L- '

- EXPERIMENTO 2. Influencia de la cantidad de levadura y del pH

en la producción de etanol.

<-

En la tabla 2 se observa que utilizando 0.2 g de levadura en

ambos experimentos- obtienen los mismos resultados en la -

24

TABLA 1

EXPERIMENTO 1

i

INFLUENCIA DE LA ADlCtON DE SULFATO D E AMONIO C O M O FUENTE DE NITROGEN0

EN LA PRODUCCldN DE ETANOL POR LA LEVADURA - S. cerevislae. 1 2 3 L 5 6

GLUCOSA ( g / 1 0 0 m1 d i s . ) . 10 . 1 0 1 o '7 10

TAKATERM (m1/100 m 1 d i s . ) 0.1 o. 1 o. 1 o , 1

DIAZYME (m1/100 m1 d i s . ) 0.1 0.1 o. 1 0 . 1

LEVADURA ( g / ? O O m 1 d i s . ) 0.2 @:2 0.2 0.2

EXTRACTO DE LEVADURA 1 1 ( g / m1 d i s . )

SULFATO DE AMONfO (g/ m 1 d i s . )

pH I N I C I A L 4 . 5 4 . 5 4 . 5 4 . 0

ETANOL PROD. ( % ) 4 . 6 2 4 3 9 896 4 . 4 6 3 4 . 4 4 9 3 . 6 8 2 ' 4 . 4 7 6

1 0 " 10

o. 1 o. 1

o. 1 o. 1

0 . 2 0.2

i?-

"- ' . 1 "- 1

-" 0 . 1 0 . 1 "- o . 1 o. 1

4. o ' 4 . 0

Se utilizó el método general, pero modificando : l a fuente de nitrógeno y el pH.

u1 Iu

,-,

TABLA 2

EXPERIMENTO 2

INFLUENCIA DE LA CANTIDAD DE LEVADURA Y DEL pH EN LA PRODUCCldN DE ETANOL.

1 f>

GLUCOSA (g/lOO m 1 dis.) 10

2 3 'TT 4

10 10 10

TAKATERM (m1/100 m 1 d i s . ) o. 1 o. 1 o. 1 o. 1

DIAZYME (ml/ 1 0 0 m 1 d i s . ) 0.1 ', 0.1 o. 1 o . 1

LEVADURA( g/100 m 1 d i s . ) 0.2 1 0.2 1

EXTRACTO DE LEVADURA 1 (g/lOO m 1 d i s . )

pH INICIAL 4.5

PROD. ETANOL 4%) 5.272

1 1 1

4 . 5 4 . 3 4 . 3

5 . 3 2 7 5 6 3 9 5 . 6 5

v

Se uttlitó el método general pero modificando l a cantidad d e levadura y el pH.

f?

producción de etanol que con la ad,ición de 1 g; por otro lado

se observa que el pH al inicio de la fermentación influye - apreciablemente, ya -que una pequeña:diferencia de 4.5 a 4.3,

cambia la- concentración de alcohol; a un pH de 4.3 la concen-

tración es mayor.

EXPERl HENTO 3. Influencia de la concentración de glucosa en la

producción de etanol.

c

En .la tabla 3 se observa que la concentracióp de glucosa influye

en la producción de etanol en forma directamente proporcional

(r-0.987). De los 6 experimentos se deriva una ecuación lineal

cuya pendiente es igual a 0.5343 y que posteriormente se rela-

cidna con la pendiente de la recta teórica,, lo que permite - realizar los cálculos para encontrar el factor de corrección - (No.) a l % de etanol en base seca promedio (ver anexo 1 ) .

EXPERIMENTO 4. .Cinética de l a producción de etanol a partir de

la fermentación de glucosa ( 10 g /100 m1 D i s . )

i, Se observa en la tabla 4 que se obtienen buenos resultados res-

pecto a la producción de etanol a los 4 dias de la fermentación

y en un rango de pH de 4 . 1 3 a 4.31. L . .

2T

TABLA 3 EXPERIMENTO 3

INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE GLUCOSA EN LA PRODUCCldN DE ETANOL.

GLUCOSA EXP. PH i i % ETANOL 4 DfAS FERM.

10 9 1 4 . 1 6 5 . 7 4

2 4 . 2 4 4 * 7 7 6

2.688 5 s 1 4 . 2 1

2 4 . 3 4 2 5 6 5

2 g 1 4 . 1 7 I . 0 6 4

2 4 . 2 3 0 . 9 2 3

r = 0 . 9 8 7

b = - 0 . 0 5 7 4

m = 0.5323 -

p H i : pH a l inicio de la fermentación.

% H g l u c o s a = 9 . 0 2 9 r

N

.- O

-.

U m

.- . . . . . .

CIM@I'ICA DE IA.'hWODUCCI6N DE ETANOL

PARTIR DE L A FE:RMEHTACIdN de GLUCOSA ..

8 ETANOL

( V/V 1 -%"

S

I

i i . .. " 4

3

2

i

f: i i

I

/, ' TIEMPO (hr 1

,,

c: P

E X P E R I M E N T O 5. Determinación de la cantidad de producto

fermentado de diferentes alimentos.

-

Se'utilizó el método general y se aplicó el factor de correc-

ción No.(l.O89) a l % de etanol en base seca promedio; expre-

sando los carbohidratos fermentecibles como glucosa presente.

(ver tabla 5).

Comparando con tablas de composición de éstas harinas se ob-

serva que los valores en % de almidón o carbohidratos repor-

tados, son semejantes o cercanos a los obtenidos por éste - método.

CORRELACldN CON LA DIGESTIBILIDAD.

Se observa en la tabla 6 la determinación del total de nutrien

tes digestibles (TND), que se calculan por este método de la siguiente

manera:

T N D (Kcal) = Carbohidratos fermentecibles ( S ) * (4.4 Kcal/g)

-

+ Proteína btuta digestible (g) (4.4 Kcal/g)

+ 2.25 (Extracto etéreo digestible) (9 ) (4.4 Kcal/g)

[ '

De esta manera se determina el valor nutritivo de los alimentos

en unidades calóricas digestibles. . , j

c, . - * Lectura obtenida de la tabla 5 .

EXPERIMENTO 5 . DETERMINACION DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FERMENTADO DE DIFERENTES ALIMENTOS.

TABLA 5

HARINA Experimento pHi %Humedad %Etano1 %ETOH %ETOHc-~ Promedio de CHOS ,-: Base fermentecibles

Seca Base Seca (g/lOg) Promedio

: I_ I

AVENA 1 2

4.12 4.07

7.60 7.78

3.826 4-12 4.48 3.798

6.925

9.47

6.26

MAIZENA 1 2

4.5 4.5

10.53 10.6

5.066 5.628 6.13 5.002

SORGO 1 2 3

4.5 4.5 4.3

7.90 8.12 8.1

3.232 3.719 4.05 3,346 3.682

TRIGO 3 1 - 2

4.15 4.15

10.41 10.6

4.623 5.272 5.74 4.814

8.87

7.50

6.20

4.52

P

YUCA 1 2

4.3 4.3

7.69 7.56

4.083 4.458 4.85 4.155

3.331 3.684 4.01 3.328

4.13 4.12

9.56 9.70

PORCITINA 1 (alimPcomercia1) 2

ALIM.P/POLLO 1 ( U . N . A . M . 1 2

4 .ll 4.15

9.22 9.20

2.499 2.689 2.93 2.384

%ETOHc : % de etanol corregido por el factor No. (1.089)

TABLA 6

DETERMI NAC I Ofl DE L TOTAL DE NUTRl ENTES Dl GESTl BLES (TND)

BASE: 100 q

HARl NA TNF* PROTE fNAS DI GEZ GRASA DIGES TND (Kcal)

(!A TIBLES (9) TIBLE (9) i

"""""".""""""""""""

AVENA 69.25 10.8 3 . 5

MAIZENA 94.7 0.6 0.2 421.3

SORGO 62.6 11.2 3.0 354.42

TRi GO 58.7 8.6 1.6 462.65

YUCA 75.0 1 .o 0.4 338 .36

386.87

ALIM.P/POLLO (u.N.A.M.~

62.0

45.2

12.0 ,?

-

2.0 345.4 r *

bJ P

* TOTAL DE NUTRI t'NTES FERMENTECI BLES (CARBOHI DRATOS FERMENTECI'BLES) .

. .

CONCLUSION

Se diseñó un método indirecto para medir carbohidratos - digestibles en los alimentos y posteriormente se correlaciond

con l'a digestibilidad en monogástricos. La diqestibil idad ' - es una prueba que se usa para determinar la proporción de - al imento que es uti1 izable. por e4 anims.L med.iant.e.,Ja absor-

ciBn en el tracto gastrointestinal (TGI).

Este rnétoda resulta ser más práctico en la medición de - - nutrientes digestibles totales en comparación con los mé-

todos convencionales en los cuales las mediciones son tedio-

sas, complicadas y tardadas como lo refieren los métodos - anteriormente descritos ( digestibilidad aparente mediante

recolección total de alimento y heces; y el método por indi-

cador ) . La importancia de medir los nutrientes digestibles totales - ( T N D ) en los alimentos es porque el productor requiere de - estimaciones más acertadas en la calidad de la's dietas de - sus animales, con relación a los requisitos a la máxima pro-

[-d'ucciGn. Además que puede predecir si -esos alimentos o sus - combinaciones tienen probabilidades de mantenerlo bien ali-

mentado y cuánto mis debe pagar por unidad alimenticia en - vei'de unidkd de peso.

35

1 4

E

Con éste método se pueden predecir valores alimenticios - aminorando el costo y la dificultad de experimentación - - con los animales.

< <-

Numerosos alimentos que no se encuentran en tablas, pueden

ser analizados utilizando éste método y en productos comer

ciales pueden detectarse adulteraciones en la formulación

de la composición.

Este método I. es más apropiado para determinar especifica-

mente los carbohidratos fácilmente digeribles, hidrol izando

los almidones hasta azúcares simples y determinando analí-

ticamente la total idad de az-úcares presentes. No e.s aplica - ble a alimentos con alto contenido de fibra, ya que es ne-

cesario controlar el volumen de- la disolución y,es imposi-

ble el manejo; por ejemplo, en alfalfa.

RESUMEN:

El almidón de diferentes harinas fue'hidro,lizado enzimática- mente y usado para la producción.de etanol por Saccharomyces cerevisiae, e indirectamente se evaluaba la cantidad de --- carbohidratos fermentecibles y posteriormente se correlacio- naba con la digestibilidad en monogástricos.

' i

i

37

ANEXO I

CALCULOS PARA ENCONTRAR EL FACTOR DE CORRECCIdN AL

%ETANOL EN BASE SECA PROMEDIO. b..

I.

y = 0 . 5 8 ~ - 0.0058 Ec. de la recta teórica

y = 0.5323~ - 0.0574 Ec. de la recta 6 experimental de la Tabla 4

% = 0.58 m pendiente teórica T .

% = 0.5323 m pendiente real o experimental R .

*e

"r " - NO. No.:NÚmero como factor de corrección m R

m = No. m T R

%alcohol X No. = %alcoholT = % azúcar de la muestra

%alcoholT : % alcohol teóriccl

0.58 0.5323

No. = = 1.089

%Etano1 Base Seca Promedio X: 1.089 = %Etanolc

Para obtener el %promedio de carbohidratos fermentecibles (TNF) en base seca, tenemos que:

180 g de glucosa -------- ¿. '

92 de etano' = 116.455 m1 etanol 0 .79

Entonces si tenemos % de etanol en 10 g de<sustrato, y . obtenemog cibles en Base a la glucosa.

, decimos que x cantidad son m1 los g de carbohidratos fermente

<. c-

38

i

BIBILIOGRAF~

A.K..Mallett, C.A.Bernae,P.J.Young and J.R.Rouland.Inf1uence of starches of low digestibility on the rat caecal micloflora. British Journal of Nutrition. Vol. 60, No.3, NoveLber 1988. 597-604.

Alfred C. Olson, Gregory M. Gray, Mei-Chem, and Judith R. Turnland. - Monosaccharides Produced by Acid Hydrolysis of Selected Foods, Dietary Fibers, and Fecal Residues From White and Whole meat Bread Consumed - by Humans. J. Agric. Food Chem. 1988. Vol 36, pQg. 300-304.

Allen Richard D. Nutrition and Healt. Ingredient Analisys Table: 1981 Edition. Feedstuffs Reference ISSUE. Vol. 53, No. 30. 1981. The Miller Publishing Company. Minneapolks.

Bardazov, V.;.Rivarova,F.Determination of the carbohydrate content of foods by HPLC. 3(2) (30-34) (1987) (25 ref. Bg., rv, en) (Nauchen - Inst. Po Khiyiena; Profesionalni Zabolyzvaniga, Sofía, Bulgaria.).

Bouchard Jean, Esteban Chornet and Ralph P Overend. High-Performance Liquid Chomatographic Monktaring of Carbohydrate Fractions in Par - tialli Hidrolyzed Corn Starch. J. Agric, Chem, Vol. 36, No. 6 1988. 1188-1198.

E. Favela Torres y J. Baratti. Ethanol Production from Wheat Fluor- ,

by Zymomonas mobilis. J. Ferment. Technol., Vo1.66, No.2. 1988. - 167-172.

Enriquez, V.F., Arteaga y G . Avila. Harina de Yuca (Manihot esculenta crantz) en dietas para pol o de engorda y gallinas en postura. Tec. - Pec. 1977. Mdxico. 32; 53-

GutiCrrez, N. Buitrago, J-rCfilculo de raciones de mínimo costo para - cerdos en zonas tropicales. Centro Internacional de Agricultura --

; Tropical (CIAT). Serie E S , No. 4 . Cali Colombia. 1974.

3 9

Hernández Mercedes, Chavez Adolfo y Bouges Héctar. Valor Nutritivo de los alimentos mexicanos. Instituto Nacional de la Nutricih, México. 1983.

(-

* Hobler Chistine,. Jean Luc Barry, Agnes David and Jean Delort Laval. Rapid Acid Hydrolysis of Plan$ Cell Wall Polysaqcharides and Simpli- fied Quantitative Determination of their Neutral; Monosaccharides by Gas-Liquid Chromatography. J. Agric. Food Chem., Vol 3 7 . No.2. - 1989. 360-367.

Sattler W., H. Esterbauer,.O. GLatter, and W. Sqeinar. The Rffect of Enzyme Concentration on the Rate of the hydrolysis of Cellulose. - .

Biotechnology and Bioengineering. Vo1.33, No.10, April 20, 1989. 1221-1233.

S.P. Tsai and Y. H. Lee. A criterion for selectting fermentation - stoichiometry methods. Biotechnology and bioengineering, Vo1.33, - Jo.10, April 2 0 , 2989. 1347-1349.

Southgate. Analysis of food carbohidrate. D.A.T, Applied. Science - Publishers, London. 1976. 345-365.

Nellaiah H. , T.Karunakaran, y :P. Gunasekaran. Ethanol Fermentation by Efficient Strain, NRRL - B - 4 2 8 6 , of Zymomolpas mobilis. J. Fer- ment. Technol., Vo1.66, No.2 1988. 219-223.

Manual para los técnicos a nivel bachillerato e$ alimentación y - cuidado de bovinos, porcinos y aves. Colegio dt$ ciencias y humani- .dades unidad académica. Dpto. de opciones técnicas. Agosto. 1981.

.

40