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Applications de la technologieHRM en infectiologie

CNBH Lille 6.10.2010

HRM en infectiologie

Dr Monique CHOMARAT

Franck BREYSSECHU Lyon-Sud Faculté de Médecine Lyon-Sud Charles Mérieux

[email protected]

ACNBH

Agrément FMCN° 100 168

DECLARATION D’INTERETDANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION

REALISEES POUR L’ACNBH

39ème Colloque Nationaldes Biologistes des Hôpitaux

Lille, 4 au 8 oct 2010

Dr Monique CHOMARAT………………Exerçant au CHU LYON ………………… déclare sur l’honneur


Exerçant au CHU LYON ………………… déclare sur l’honneur

Ne pas avoir de conflit d’intérêt avec les entreprises pharmaceutiques, dudiagnostic ou d’édition en relation avec le DMDIV

Technique HRM ou FHR : définition

HRM = High Resolution Melting analysis ou

FHR = Fusion Haute Résolution

La Fusion Haute Résolution est une extension deLa Fusion Haute Résolution est une extension del’analyse en courbe de fusion dont l’objectif principall’analyse en courbe de fusion dont l’objectif principal


l’analyse en courbe de fusion dont l’objectif principall’analyse en courbe de fusion dont l’objectif principalest :est :

Criblage et identification de nouveaux variants suramplicon entier en utilisant uniquement des amorcesspécifiques

Quels appareils?• ABI 7500 (Applied

Biosystems)

• RotorGene (Qiagen)


• LightScanner (Idahotechnology)

• LightCycler 480(Roche Diagnostics)

Technique HRM

Utilisation du LightCycler 480

Détection qualitative

Quantification de gène :

Absolue ou Relative


Absolue ou Relative

Génotypage : détection de variants connus d’un gène

HRM Fusion Haute Résolution :Technique de criblage des variations de séquences en amontd’une technique de séqençage.

Nouveau

Technique HRM ou FHR : définition

HRM = High Resolution Melting analysis ouFHR = Fusion Haute Résolution

La fusion Haute Résolution est une extension de l’analyse en courbe de fusionLa fusion Haute Résolution est une extension de l’analyse en courbe de fusiondont l’objectif principal est :dont l’objectif principal est :

Criblage et identification de nouveaux variants sur amplicon entier en utilisantuniquement des amorces spécifiques


uniquement des amorces spécifiques3 pré3 pré--requis :requis :

Homogénéité thermique et sensibilité optique = LightCycler 480

Un intercalant saturant sans inhibition de PCR = HRM Résolight

Une approche de l’analyse spécifique = Logiciel dédié

HRM : principe

• Intégration d’un fluorochromeintercalant à de l’ADN amplifié

• Augmentation de températureprogrammée et progressive entraîneune dénaturation de certainsfragments du brin d’ADN

• Elimination du fluorochrome et


• Elimination du fluorochrome etbaisse de fluorescence (extinction totale= dénaturation complète)

• A une séquence d’ADN donnéecorrespond, pour une montée entempérature standard, unefluorescence spécifique représentéepar une courbe de fusion

Principe de l’HRM


AT

CG

AC

TG

fluor

esce

nce

• Le profil de dénaturation d’un produit de PCR dépend de sa teneur en GC, desa longueur et de sa séquence.• HRM est une technique de mise en évidence de modifications de profils dedénaturation suite à la formation d’hétéroduplexes

Une fusion haute résolution pour des

échantillons homozygotes

(homoduplexes d’ADN sauvage ou

HRM : principe


Fusion des hétéroduplexes

A

T

C

G

TA

CG

Fusion deshomoduplexes

Fusion des échantillonsHomozygotes

température

fluor

esce

nce

AC

TG

(homoduplexes d’ADN sauvage ou

mutant) donne des profils de courbes

similaires

Une fusion haute résolution pour des

échantillons hétérozygotes (homo &

hétéroduplexes) donne des profils de

courbes distincts

HRM : 3 éléments

• 1. La PCR

• 2. L’intercalant


• 3. Le logiciel

La PCR


LC® 480, Fusion Haute RésolutionRecommandations / Expériences (1)

• Amplicons courts de 100-250 pb (≤ 500 pb) Les structures secondaires affectent l’efficacité d’amplification

Un amplicon peut avoir plusieurs domaines de fusion.


• 5 à 30 ng d’ADN purifié / réaction(même procédure de purification pour tous les échantillons)

Ajuster tous les échantillons à la même concentration / réaction(minimiser la dispersion en point final)

LC® 480, Fusion Haute RésolutionRecommandations / Expériences (2)

Conditions PCR :

– Concentration des amorces 0.1-0.3 µM & Tm = 60°C

(0.2 µM en première intention, 58°C ≤ Tm ≤ 63°C)


– Concentration MgCl2 3 mM final

– Protocole en Touchdown (en première intention)

– Hot start

– Fusion de 65 à 95°C, 25 acquisitions / °C

– Valider la spécificité de l’amplification et son efficacité, Cp < 30cycles pour les courbes d’amplifications avec un intervalle de +/- 1,5cycles

LC® 480, Fusion Haute RésolutionEGFR – Exon 19, validation d’un couple d’amorces (3)

Hsieh et al, 2006-2

Variant 2

Variant 1

Communs


Bonnes amplifications Cp < 30 cyclesHomogénéité au plateau des courbesd’amplifications

Meilleur couple d’amorces Variant 2

Variant 1

L’agent intercalant



SYBR Green : Intégration en moyenne toutes les 10pb

Influence du SYBR Green


Le logiciel


3 étapes

Normalisation (1)


LC® 480, Fusion Haute RésolutionTm shift (2)

Définition du Tm-Shift : Compenser la dispersion entre les échantillons d’un même groupe, pour en améliorerl ’ h o m o g é n é i t é


Avantage : Meilleure séparation des groupes hétéroduplexes / homoduplexes entre eux, sur la base de leur profil de courbede dénaturation.

Note : Les homozygotes, ayant souvent un profil similaire, sont confondus.

LC® 480, Fusion Haute RésolutionNormalisation du signal, Ex. Gène MDR-1

Différence plot (3)Courbe de fusion Différence de points


1. Validation des amplifications 2. Analyse en gene scanning

LC® 480, Fusion Haute RésolutionLogiciel Gene Scanning, Approche pour l’analyse


Optimisation: discrimination desHomoduplexes

• Les amplicons obtenus pour des échantillons hétérozygotes ethomozygotes donnent des profils de courbes distinctes.

• Les amplicons obtenus pour des échantillons homozygotes(contenant des homoduplexes ADN sauvage et mutant) peuventdonner des profils de courbes similaires.


donner des profils de courbes similaires.

Solution : Ajouter de l’ADN d’un échantillon homozygote connu à des

échantillons inconnus permet de discriminer les génotypes entre eux.

Liew M, Pryor R, Palais R, Meadows C, Erali M, Lyon E, Wittwer C.Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms by High-Resolution Melting ofSmall Amplicons. Clin Chem. 50:7 (2004) 1156-1164

Optimisation: discrimination desHomoduplexes


Echantillons sans l‘ajoutd‘ADN sauvage

Echantillons avec ajoutd‘ADN sauvage

• Echantillons: ADN génomique humain (purifiée à partir de sang) approx. 20 ng/réaction• Spiking: 20 % d‘ADN sauvage

Applications de l’HRM

• Divers domaines comme– Onco-hématologie :

• Distinction entre la monoclonalité et la polyclonalité deslymphomes non-Hodgkiniens

• Mutations des gènes NMP1 ou FLT3 dans les LAM• Mutations des gènes MPL et de l’hexon 12 de JAK2 dans les


• Mutations des gènes MPL et de l’hexon 12 de JAK2 dans lesSyndromes Myélo-Prolifératifs

– Oncologie :• Détection et quantification de mutations telles que K-ras, JAK2,

BRCA1 et 2• Caractérisation de gènes de sensibilité aux traitements anti-

cancéreux• Identifier les sous-types de cancer

– Etude du gène CFTR de la mucoviscidose

Recherche mutations LAM


Oscar Fuster,* Eva Barraga´,Pascual Bolufer,Jose Cervera,† Maria Jose Larrayoz,‡, Antonio Jime´nez-Velasco,§Joaquín Martínez-Lopez, Ana Valencia,†Federico Moscardo ,† and Miguel Angel Sanz J Molecular Diagnostics 2009; 11:458-63.

Applications en infectiologie

• Applications récentes, depuis 2008

• Les études publiées ont 3 champs d’application :

– Identification des espèces microbiennes

– Epidémiologie :


– Epidémiologie :

• Typer les souches virales ou bactériennes

• Différencier les souches vaccinales des souches sauvages

– Détection de mutations sur les gènes de résistance

Rapid Detection and Identification of Mucormycetes from Culture and TissueSamples Using High Resolution Melt Analysis.Hrncirova K, et al. J Clin Microbiol. 2010 Jun 30

Rapid diagnosis of Old World Leishmaniasis by high-resolution melting analysis ofthe 7SL RNA gene.Nasereddin A, Jaffe CL. J Clin Microbiol. 2010 Jun;48(6):2240-2

En parasitologie, mycologie


Nasereddin A, Jaffe CL. J Clin Microbiol. 2010 Jun;48(6):2240-2

Genotyping of Candida albicans using length fragment and high-resolution meltinganalyses together with minisequencing of a polymorphic microsatellite locus.Costa JM, et al. J Microbiol Methods. 2010 Mar;80(3):306-9

Leishmaniose


Nasereddin A, Jaffe CL.

J Clin Microbiol. 2010 Jun;48(6):2240-2

En virologie• Development of a rapid high-throughput method for high-resolution melting analysis

for routine detection and genotyping of noroviruses. Tajiri-Utagawa E, Hara M, et al.J Clin Microbiol. 2009;47(2):435-40

• Classification of fowl adenovirus serotypes by use of high-resolution melting-curveanalysis of the hexon gene region. Steer PA, Kirkpatrick NC, et al. J Clin Microbiol.2009 Feb;47(2):311-21

• Differentiation between vaccine and wild-type varicella-zoster virus genotypes byhigh-resolution melt analysis of single nucleotide polymorphisms. Toi CS, Dwyer DE. J


high-resolution melt analysis of single nucleotide polymorphisms. Toi CS, Dwyer DE. JClin Virol. 2008 Sep;43(1):18-24

• Rapid differentiation of influenza A virus subtypes and genetic screening for virusvariants by high-resolution melting analysis. Lin JH, Tseng CP, et al. J Clin Microbiol.

2008 Mar;46(3):1090-7

• A new approach for the evaluation of the human papillomavirus type 16 variabilitywith high resolution melting analysis. Sabol I, Cretnik M, et al. J Virol Methods.

2009;162(1-2):142-7

Papillomavirus


Sabol I, Cretnik M, Hadzisejdić I, Si-Mohamed A, Matovina M, Grahovac B, Levanat S, Grce M.J Virol Methods. 2009 Dec;162(1-2):142-7

Différenciation entre souchessauvages et souches vaccinales VZV

CNBH Lille 6.10.2010 Toi CS, Dwyer DE.

J Clin Virol. 2008 Sep;43(1):18-24

En bactériologie• Rapid detection of rifampicin- and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis by high-resolution

melting analysis.Ong DC, Yam WC, Siu GK, Lee AS. J Clin Microbiol. 2010 Apr;48(4):1047-54

• Rapid identification and differentiation of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis types by useof real-time PCR and high-resolution melt analysis of the MAP1506 locus.Castellanos E, Aranaz A, De Buck J. J Clin Microbiol. 2010 Apr;48(4):1474-7

• Rapid identification and discrimination of Brucella isolates by use of real-time PCR and high-resolution meltanalysis.Winchell JM, Wolff BJ, Tiller R, Bowen MD, Hoffmaster AR. J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):697-702

• Differentiation of Mycoplasma gallisepticum strains using PCR and high-resolution melting curve analysis.Ghorashi SA, Noormohammadi AH, Markham PF. Microbiology. 2010 Apr;156(Pt 4):1019-29


• Campylobacter jejuni and Campylobacter coli genotyping by high-resolution melting analysis of a flaAfragment.Merchant-Patel S, Blackall PJ, Templeton J, Price EP, Tong SY, Huygens F, Giffard PM. Appl EnvironMicrobiol. 2010 Jan;76(2):493-9

• Rapid identification of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates by rpoB gene scanning usinghigh-resolution melting curve PCR analysis.Pietzka AT, Indra A, Stöger A, Zeinzinger J, Konrad M, Hasenberger P, Allerberger F, Ruppitsch W.JAC. 2009 ;63(6):1121-7. Epub 2009 Apr 15. Erratum in: J Antimicrob Chemother. 2009 Aug;64(2):436

• Rapid and accurate typing of Bordetella pertussis targeting genes encoding acellular vaccine antigens usingreal time PCR and High Resolution Melt analysis.Chan WF, Maharjan RP, Reeves PR, Sintchenko V, Gilbert GL, Lan R. J Microbiol Methods. 2009Jun;77(3):326-9

• High-resolution melting analysis of the spa repeat region of Staphylococcus aureus.Stephens AJ, Inman-Bamber J, Giffard PM, Huygens F. Clin Chem. 2008 Feb;54(2):432-6

Différenciation des espèces deBrucella


Winchell JM, Wolff BJ, Tiller R, Bowen MD, Hoffmaster AR.

J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):697-702.

Gène rpoB MDR-MTBc

CNBH Lille 6.10.2010 Pietzka A.T. et al. JAC 2009; 63(6):1121-7.

Détection de mutations du gène kat G


HRM de la région spa de S. aureus


Souches de référence S. aureus HRMgène spa

Clone st80Clone « New Pediatric »

Clone « Lyon »Clone « Lyon »

Clone « Geraldine »

Clone « Pediatric »

En conclusion, HRM

• Méthode simple, rapide (< 2heures), peucoûteuse (1 €/test + primers)

• Grandes sensibilité et spécificité

• Pas d’utilisation de sondes spécifiques, donc


• Pas d’utilisation de sondes spécifiques, doncréduction du coût de l’analyse

• Analyse de la variabilité génétique possiblepour un grand nombre d’échantillons

• Diminution du recours au séquençage ou àla DHPLC

Merci de votreattention


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