Listeria monocytogenes Aspectos relevantes e implicación en

la seguridad alimentaria

Dr. David Rodríguez Lázaro Área de Microbiología. Facultad de Ciencias

• Gram + • Catalasa positiva • Anaerobia facultativa • Contenido bajo en G-C

Listeria spp.

10 especies: • L. monocytogenes • L. innocua • L. ivanovii • L. seeligeri • L. welshimeri • L. grayi

Humanos, rumiantes

Rumiantes

4 nuevas especies: L. rocourtiae, L.marthii, L.fleischmannii and L.weihenstephanensis

Bacterias Gram+ bajo % G+C

• Patógeno de origen alimentario

• Modelo en investigación biomédica

- análisis molecular del parasitismo intracelular - respuesta inmune de base celular - dinámica del citoesqueleto de actina

• Múltiples biotopos

- suelo y materia vegetal descomposición - alimentos procesados - intestino de los vertebrados - células animales • Crecimiento a 4ºC

• Supervivencia en el ambiente

Lactobacillus casei Streptococcus pyogenes Eneterococcus faecalis Listeria monocytogenes Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Mycoplasma pneumoniae

¿Por qué es una bacteria tan interesante?

Listeria es un modelo para … + estudios de biología celular de organismos superiores Para respuesta inmune de base celular dinámica del citoesqueleto de actina Conocimiento del metabolismo celular normal

Listeria es un modelo para … + estudios evolutivos tanto meramente darwinianos como sobre patogenicidad

• L. monocytogenes • L. innocua • L. ivanovii • L. welshimeri • L. seeligeri • L. grayi

L. welshimeri

L. innocua

L. ivanovii

L. monocytogenes

L. seeligeri

prs prfA plcA hly mpl actA plcB orfB orfA ldh

orfX orfZ

orfC orfD orfE orfK dplcB

prs

prs

ldh

ldh

orfX orfL

ORF3

ORF6

ORF5 ORF7

ORF11 ORF8

ORF10 ORF9

ORF9 i- inlB smcL

i -inlF

i -inlE i- inlH i -inlJ

i -inlI

i -inlK i- inlL i- inlB 2

ORF3

ORF6

ORF5 ORF7

i-inlG

LIPI-2

L. ivanovii

L. monocytogenes

Listeria es un modelo para … + estudios sobre patogenecidad y regulación microbiana

PrfA regula positivamente la expresión de los factores de virulencia de LIPI-1

The PrfA virulence regulon P4 P3 P2 P1

PPP2 P3P

prs prfA plc A hly mpl ac tA plc B orfB orfAorfX

orfZP1P2 P1

PrfA

(Positive Regulatory Factor)

P

inlA inlB

P

hpt

P

inlC

-41.5

TGTTTTCTGCATG aTAACAAGTGTTAA TGACGGAAAGAGAGTATCTGGTTTATATTTTTA... hpt

CCCTTTATCGTCG TTAACAAATGTTAA TGCCTCAACATAAAAGTCACTTTAAGATAGGAATA plcATTATGTTGAGGCA TTAACATTTGTTAA CGACGATAAAGGGACAGCAGGACTAGAATAAAGCTAT hly

AAATTTAGAAGAA TTAACAAATGTaAA AGAATATCTGACTGTTTATCCATATAATATAAGCA mplTGGGGTTAACTGA TTAACAAATGTTAg AGAAAAATTAATTCTCCAAGTGATATTCTTAAAT actA

TAAAGGGTAGAGG aTAACATAaGTTAA TTCTTTTTTTTGGAAAAATAGTTATTATTATTTAA inlATTTTCGATTATTA TTAACgCTTGTTAA TTTAAACATCTCTTATTTTTGCTAACATATAA inlC

TTAACANNTGTTAA CONSENSUS

P1P2

prfA

P

plcA

PrfA

Positive regulatory factor

Ambiente Intracelular Genes de virulencia necesarios Cambio conformación de PrfA y gran Gran cantidad de PrfA Genes PrfA dependientes activamente expresados

Ambiente Extracelular Genes de virulencia no necesarios (gasto metabólico) Forma PrfA no activa y poca cantidad Genes PrfA dependientes no expresados

Ingestión /inicio de invasión Genes de virulencia empiezan a ser necesarios Forma PrfA no activa y regulación sigmaB Genes PrfA dependientes ligeramente expresados

P1P2

prfA

P

plcA

PrfA

Positive regulatory factor

PrfA inactivo PrfA Activo

plcA prfA

COFACTOR

prfA plcA

a b

c d

ACTIVADO

Mecanismo de regulación de PrfA

INACTIVO

Ambiente extracelular Ambiente extracelular

P14 P14-A

Valencia 1989 Madrid 1999

Identificación de mutantes hiperhemolíticos de L. monocytogenes Espontáneo (Ripio et al. 1996) Inducido (Ermolaeva et al. 1997)

Mutantes hiperhemolíticos portan mutaciones puntuales en prfA y sobre-expresan constitutivamente todos los genes PrfA-dependientes Mutantes Hly+++ portan una sustitución Gly145®Ser en PrfA (mutación PrfA*)

1 M N A Q A E E F K K Y L E T N G I K P K Q F H K K 25

26 E L I F N Q W D P Q E Y C I F L Y D G I T K L T S 50

51 I S E N G T I M N L Q Y Y K G A F V I M S G F I D 75

76 T E T S V G Y Y N L E V I S E Q A T A Y V I K I N 100

101 E L K E L L S K N L T H F F Y V F Q T L Q K Q V S 125

126 Y S L A K F N D F S I N G K L G S I C G Q L L I L 150

151 T Y V Y G K E T P D G I K I T L D N L T M Q E L G 175

176 Y S S G I A H S S A V S R I I S K L K Q E K V I V 200

201 Y K N S C F Y V Q N L D Y L K R Y A P K L D E W F 225

226 Y L A C P A T W G K L N 237

S

F S

CIII CIII

a b

Mutaciones PrfA* aumentan la capacidad de unión a DNA de PrfA

0

15

30

45

norm

alis

ed g

ene

expr

essi

on

PrfA* HeLa / PrfA-wt BHI

PrfA-wt HeLa / PrfA-wt BHI

PrfA* BHI / PrfA-wt BHI

PrfA* HeLa / PrfA* BHI

PrfA* HeLa / PrfA-wt HeLa

PrfA-wt HeLa / PrfA* BHI

42.42

24.82

15.89

2.67 1.71 1.58 0.93 0.86 0.71 1.31 1.08 1.21

PrfA* PrfA specific non-specific

Mutaciones PrfA* aumentan la capacidad de unión a DNA de PrfA

+ estudios de parasitismo intracelular Listeria es un modelo para …

Entrada

Evasión de la vacuola fagocítica y replicación citosólica

Movilidad intracelular y paso de célula a célula

Movilidad intracelular de Listeria monocytogenes

speed 150 ´ (0.3 m/s)

Listeria es un modelo para … + Patógeno alimentario

• Organismo ubicuo (=en todas partes) • Organismo piscrotrofo (capaz de crecer a temperaturas de refrigeración) • Amplio rango de pH (de pH próximos a 4 hasta 9) • Moderadamente resistente a concentraciones de sal • Ligeramente resistente a tratamientos de pasteurización baja • Capaz de producir BIOPELÍCULAS

• Aislado en todas las sectores alimentarios (cárnico, lácteo, pesquero …) • Elevada mortalidad (superior al 25% y llegando hasta el 60%) • Capaz de pasar la barrera hematoencefálica ð LESIONES Y SÍNTOMAS NERVIOSOS • Capaz de pasar la barrera hematoplacentaria ð ABORTOS Y LESIONES EN EL FETO • Requiere más de 5 días para su detección

Ecología de Listeria monocytogenes Suelo (vegetación en descomposición) ? ® ambiente rural (abono, etc) ® cadena alimentaria

Patofisiología de la infección por Listeria (Listeriosis)

- enfermedad severa, mortalidad media 20-50 % en humanos

- Dos formas clínicas:

perinatal (1/3) (mujeres embarazadas, fetos, y recién nacidos)

pacientes adultos (2/3) (>40 años)

placentitis, abortos y sepsis neonatal

meningoencefalitis

Gran Canaria 1992 24 4b cheese?

Location date cases strain food

Canada (N. Scotia) 1981 41 4b coleslaw Massachussets 1983 49 4b milk?

Boston 1979 23 4b vegetables?

California 1985 142 4b cheese Switzerland (Vaud) 1983-87 122 4b cheese United Kingdom 1987-1989 >300 4b pâté

France 1992 279 4b pork tongue in aspic France 1993 38 4b “rillettes”

France 1995 35* 4b cheese Illinois 1994 45* 1/2b chocolate milk

France 1997 14 4b cheese Italy 1996 39 1/2b rice salad

* gastroenteritis

Epidemias de listeriosis de origen alimentario

………….. ………. …. ….. ………… Canada 2008 43 (22 V) RTE delis Austria 2009-10 34 (8V) Cheese

Relevancia en la salud pública USA

9,388,075 casos

Relevancia en la salud pública USA

Casi 19% muertes 29% bacterianas

Desde el punto de vista legislativo

Tolerancia cero (AUSENCIA): EE.UU., Canadá, Japón En función de la capacidad del alimento de soportar el crecimiento de Listeria: EU ðAquellos que no lo soportan: 100 ufc/g ðAquellos que lo soportan: 100 ufc/g

Cómo se analiza?

Cómo se analiza?

Dos apuntes finales de los dos últimos brotes serios …

CASO ESTUDIO: Brote de Listeriosis en Canadá

Verano 2.009

Patatas Meléndez S.L. Valladolid, 26 de Enero 2.009

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Reacciones:

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Reacciones:

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Reacciones:

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Reacciones:

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Lección aprendida por la empresa ð Actitud pro-activa y de liderazgo

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Brote de Listeriosis en Canadá – verano 2.008

Brote de Listeriosis en Austria – verano 2.009

EMPRESA OFICIAL / UNIVERSIDAD

Nivel de contaminación: < 5 cfu / 100g ò

Probabilidad de detección 45-60% (usando 5 muestras de 25g)

Probabilidad de detección <20%

(usando 1 muestra de 25g)

Probabilidad de detección usando ISO 11290-2 <1%

Brote de Listeriosis en Austria – verano 2.009