light diagnostics™

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LIGHT DIAGNOSTICS™

KIT IFA PANEL PARA LA

DETECCION Y IDENTIFICACION DE LOS VIRUS RESPIRATORIOS

Identificación cualitativa de Adenovirus, Influenza A, Influenza B, Parainfluenza de Tipo 1, 2, 3, y Virus

Respiratorio Sincitial Suplemento Español De la Lengua

3105

1 x 250, 7 x 50

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Uso previsto

El Kit IFA Panel para la detección y identificación de los Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ es para la detección e identificación de virus respiratorios) es para el uso diagnóstico in vitro para la confirmación cualitativa de los cultivos de adenovirus, de los virus de la influenza A y B, de los virus de la parainfluenza 1, 2 y 3, y del virus respiratorio sincitial (VRS).

Resumen y explicación

En el hombre, los virus respiratorios son responsables de una proporción significativa de enfermedades. Algunos virus (por ej., el virus de la influenza) son estacionales en tanto que otros (por ej. los adenovirus) afectan predominantemente a distintos grupos de edad. En una población dada, los virus respiratorios pueden ser responsables de una considerable morbilidad. El advenimiento de tratamientos antivíricos apropiados contra algunos virus respiratorios hace imperativa la investigación rápida para la identificación de estos microorganismos, lo que permitirá la institución precoz del tratamiento. Los dos agentes antivíricos más ampliamente usados en la actualidad son la amantadina/rimantadina para la influenza A y la ribavirina para la bronquiolitis producida por el VRS. Ambos agentes tienen mecanismos de acción distintos aunque la mayoría afectan a los estadios precoces de la infección, tales como la penetración o la descapsulación (41, 63). En las concentraciones fisiológicas alcanzables, la amantadina y la rimantadina inhiben específicamente la replicación del virus de la influenza A (13). La ribavirina tiene una actividad de amplio espectro in vitro contra diversos virus, como el VRS o los virus del sarampión, influenza A y B, y parainfluenza (46, 47, 53).

Los dos métodos habitualmente usados para identificar los virus son: el aislamiento en cultivo / confirmación y la detección directa. El aislamiento en cultivo /confirmación es el método estándar en la mayoría de los laboratorios, y es el método con mayor sensibilidad disponible para la detección de los virus respiratorios. El Kit IFA Panel para la detección y identificación de los Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ utiliza anticuerpos monoclonales para la confirmación del cultivo, que proporciona resultados claros y fáciles de interpretar en sólo 60 minutos.

A los 2 años, la mayoría de los niños han experimentado la infección por el virus respiratorio sincitial virus (VRS), lo que significa que representa la etiología vírica más frecuente de las enfermedades del aparato respiratorio

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inferior en la niñez (64). La infección por VRS suele dar lugar a resfriados con rinorrea profusa, pero en las primoinfecciones de los lactantes de 6 semanas a 6 meses, el 25-40% desarrollarán una enfermedad del aparato respiratorio inferior (64). En la mayoría de las áreas investigadas, el VRS era responsable de más neumonías y bronquiolitis que el resto de los patógenos microbianos (48). Hay estudios que sugieren que las neumonías y bronquiolitis de la niñez causadas por el VRS pueden dar lugar a alteraciones respiratorias a largo plazo, tales como función pulmonar anormal, asma y tos y bronquitis recurrentes (52). El VRS también ha sido implicado en el síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL), aunque no se ha determinado la naturaleza de dicha asociación (58).

El VRS pertenece a la familia Paramyxoviridae, género Pneumovirus. Es un virus pleomórfico encapsulado, de 150-300 nm de diámetro (5, 31, 34) con un genoma de ARN monocatenario (64).

El VRS se puede detectar mediante inmunofluorescencia, EIA, neutralización, o aislamiento en cultivo y confirmación (21, 32, 49). Existen diversas estirpes celulares para el cultivo del VRS. Para el aislamiento primario, son aceptables las estirpes HEp-2 (33) o HeLa (34), aunque también se han utilizado otras estirpes, como Vero, LLC MK-2 ó CV-l. El virus produce efectos citopáticos característicos con formación de sincitios y destrucción celular (48).

Los virus de la influenza causan una enfermedad respiratoria altamente contagiosa que da lugar, típicamente, a epidemias (27). Hay tres tipos, A, B y C, en los cuales la especificidad es conferida por los antígenos de la nucleoproteína interna y de la proteína de la matriz (40).

La infección del adulto por el virus de la influenza característicamente da lugar a traqueobronquitis y afectación de las vías aéreas de pequeño tamaño (43, 66) con desarrollo posible de rinitis y/o faringitis. Sin embargo, la infección puede presentarse con manifestaciones clínicas que varían entre la ausencia de síntomas y la neumonía fatal (25). En los niños se puede dar el mismo espectro de respuesta clínica con algunas diferencias concretas. La fiebre se puede ser más alta en los niños, y acompañarse de convulsiones febriles (23, 24, 62, 70, 71). Los virus de la influenza son responsables del 14% de las fiebres de la niñez con síntomas respiratorios lo bastante graves para justificar la atención del médico (23, 71). Los niños experimentan más afectación gastrointestinal que los adultos (14) y desarrollan miositis, otitis media y crup con más frecuencia (28, 38). La infección neonatal puede dar lugar a fiebre inexplicable (50) y es potencialmente fatal (1, 18, 50, 59). La enfermedad de las vías respiratorias inferiores de los niños y adultos asociada a la infección por el virus de la influenza se puede manifestar como tres formas de neumonía: neumonía vírica primaria, neumonía vírica-bacteriana combinada e infección por el virus de la influenza seguida de

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neumonía bacteriana (54). Las respuestas clínicas no pulmonares a la infección por el virus de la influenza incluyen la viremia, la afectación cardiaca y del SNC, el síndrome de Reyes y el choque tóxico (54).

Los virus de la influenza tipos A y B causan, esencialmente, el mismo espectro de enfermedades. No obstante, la infección por el virus A requiere hospitalización con una frecuencia aproximadamente cuatro veces mayor que la del tipo B (38), y el tipo B produce más frecuentemente miositis y afectación digestiva (11, 16, 37, 42).

El tipo C del virus de la influenza produce enfermedad de las vías aéreas inferiores con poca frecuencia pero produce esporádicamente enfermedad de las vías altas (19, 38, 51). En la edad adulta, casi todos los individuos tienen anticuerpos frente al tipo C (57).

Los virus de la influenza son miembros de la familia Orthomyxoviridae. Son pleomórficos, encapsulados y contienen un genoma de ARN monocatenario segmentado de sentido negativo. Su diámetro oscila entre 80 y120 nm (40).

La adición de tripsina permite cultivar los virus de la influenza en una variedad de estirpes celulares como las células de riñón canino de Madin-Darby (MDCK), de carcinoma pulmonar A549 y las células primarias de riñón de mono (PMK) (20, 65) así como en los clásicos huevos de gallina embrionados o sistema de la "allantoin-on-shell" (17).

El virus de la influenza puede ser detectado con técnicas de inmunofluorescencia, de hemadsorción o de hemaglutinación, usando hematíes de pollo o cobaya. El aislamiento en cultivo y confirmación es una técnica fácil, sensible y relativamente rápida para la identificación de las infecciones por los virus de la influenza. El efecto citopático es evidente de 3 a 7 días después de la inoculación, en forma de vacuolización y degeneración celular.

Los virus de la parainfluenza, combinados con el VRS, representan los patógenos respiratorios más significativos de las vías respiratorias altas en los lactantes y niños pequeños (4, 6, 7, 39). Se han identificado cuatro tipos de virus de la parainfluenza en niños y adultos. Los tipos 1 y 2 son causas importantes de laringotraqueobronquitis (crup). La gravedad de la enfermedad es mayor en los niños de 2 a 4 años (67). La infección por el virus de la parainfluenza del tipo 3 puede dar lugar a crup pero lo más notable es que el tipo 3 ocupa el segundo lugar, tras el VRS, como causa de bronquiolitis y neumonía del lactante (8, 9, 25, 60, 61). La enfermedad debida a la infección por el tipo 3 es más grave en los niños de menos de 1 año de edad (67).

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En los niños de más edad y en adultos, la enfermedad puede ser asintomática o similar a un resfriado (68). El crup grave durante la lactancia o en la infancia temprana puede dar lugar a hiperactividad bronquial después del ejercicio en los niños mayores o adolescentes. Sin embargo, sigue estando sin determinar si la hiperactividad bronquial era una afección preexistente que desempeñó un papel en la patogenia del crup, o si se desarrolla como complicación del crup grave (26, 44).

El tipo 4 del virus de la parainfluenza se ha asociado solamente a enfermedad leve de las vías respiratorias superiores en los adultos y los niños, y es difícil de identificar en cultivos celulares (67).

Los virus de la parainfluenza pertenecen al género Paramyxovirus de la familia Paramyxoviridae. Son virus encapsulados con un genoma de ARN monocatenario de polaridad negativa cuyo diámetro oscila entre 150 y 200 nm (10).

Los virus de la parainfluenza crecen bien en las estirpes primarias de células de riñón de mono o humano y en la estirpe LLC-MK2, una estirpe de células heteroploides de riñón de mono rhesus (20). Para la recuperación de los tipos 1 y 2, pero no para el tipo 3, es necesaria la presencia de tripsina en el medio. La infección del cultivo tisular por el virus se puede identificar mediante hemadsorción con hematíes de cobaya. Los tipos 2 y 3 se pueden reconocer por la formación de sincitios.

Los adenovirus son responsables de un número significativo de enfermedades respiratorias clínicas. Las enfermedades de las vías respiratorias superiores causadas por los adenovirus comprenden resfriados, faringitis y tonsilitis, y ocurren sobre todo en los lactantes y niños pequeños. Probablemente alrededor del 10% de las neumonías de la infancia están causadas por adenovirus (45). Otras enfermedades de las vías respiratorias inferiores relacionadas con el adenovirus son la bronquitis y la bronquiolitis (29). En los niños de menos de 5 años de edad, el adenovirus es responsable de aproximadamente el 5% de los casos de enfermedades respiratorias agudas (ERA). Las ERA se pueden manifestar por congestión nasal, rinitis, tos y, ocasionalmente, amigdalitis, fiebre y mialgias. La asociación de conjuntivitis y ERA constituye la fiebre faringoconjuntival (3). El adenovirus se ha asociado frecuentemente a un síndrome del tipo de la tos ferina, pero los estudios recientes sugieren que la presencia del adenovirus en estos casos pueda deberse a una reactivación del virus latente del tejido amigdalino durante las infecciones por Bordetella pertussis (55).

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Las enfermedades oculares que resultan de la infección por adenovirus comprenden la queratoconjuntivitis epidémica (QCE), la conjuntivitis hemorrágica aguda y la conjuntivitis folicular aguda. El adenovirus está relacionado con diversas afecciones gastrointestinales y probablemente está presente en el 7-17% de todas las gastroenteritis de la niñez. Los tipos 40 y 41 se han asociado a diarrea y gastroenteritis aguda (15, 22, 69). El virus también se ha relacionado con intususcepción (2), cistitis hemorrágica aguda (56) y meningoencefalitis.

Las investigaciones indican que la incidencia de las infecciones por adenovirus en los pacientes con compromiso inmunitario probablemente no sea superior a la los individuos normales; sin embargo, la gravedad y la probabilidad de la muerte pueden ser superiores (30).

Los adenovirus humanos pertenecen a la familia Adenoviridae, género Mastadenovirus. No poseen cápsula, tienen un genoma de ADN bicatenario, forma icosaédrica y un diámetro entre 70 y 90 nm (29). Tienen una capa proteica de capsómeros, 240 hexones y 12 pentones.

El adenovirus puede ser cultivado y aislado en diversas estirpes celulares, e identificado mediante varios métodos. Las estirpes celulares apropiadas son HEp-2, HeLa, KB:A549 y HEK. Para la propagación de los tipos 40 y 41 pueden utilizarse las células Graham 293. La confirmación de la infección generalmente se realiza mediante inmunofluorescencia o enzimoimmunoanálisis (EIA), pero también se puede realizar mediante los métodos de fijación del complemento, inhibición de la hemaglutinación y neutralización (35). Los efectos citopáticos (CPE por las siglas en inglés) típicos del adenovirus se manifiestan como agrupamientos celulares en racimos de uvas formados por células redondeadas y refráctiles. Teñidas con hematoxilina y eosina, estas células presentan inclusiones intranucleares que aparecen a los 3 a 10 días (12).

Principio del análisis

El Kit IFA Panel para la detección y identificación de los Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ utiliza una técnica de inmunofluorescencia indirecta para la identificación del virus en los cultivos celulares infectados. Los anticuerpos monoclonales de ratón proporcionados se unirán al antígeno vírico apropiado en la muestra del portaobjetos. El anticuerpo no unido se lava del portaobjetos con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Esto se sigue de la adición de IgG de cabra anti-ratón marcada con isocianato de fluoresceína (FITC), que se une al complejo antígeno-anticuerpo. El anticuerpo marcado no unido se lava del portaobjetos con PBS. Al ser

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excitado con luz ultravioleta, el FITC muestra una fluorescencia de color verde manzana que permite la visualización del complejo mediante microscopía de la fluorescencia. La fluorescencia celular indica positividad de la muestra. Las células no infectadas se tiñen de un color rojo pálido debido a la presencia de Evans Blue como tinción de contraste en el anticuerpo secundario marcado con FITC. El reactivo Respiratory Viral Screen se utiliza para confirmar la presencia indiscriminada de virus respiratorios. Para la identificación específica de los virus se utilizan anticuerpos monoclonales individuales contra adenovirus, influenza A y B, parainfluenza 1, 2 y 3, y VRS.

Componentes del Kit

1. Reactivos IFA identificación - Siete (7) frascos cuentagotas de 2 ml que contienen anticuerpo monoclonal contra: adenovirus, influenza A, influenza B, parainfluenza 1, parainfluenza 2, parainfluenza 3 y VRS en PBS con estabilizador de proteínas, y azida sódica al 0,1% (conservante).

5000 Adeno MAB

5001 Flu A MAB

5002 Flu B MAB

5003 Para 1 MAB

5004 Para 2 MAB

5005 Para 3 MAB

5006 RSV MAB

La cantidad suministrada es suficiente para 50 pruebas. Estimación se basa en las pruebas de caída de 40μL; el número real de las pruebas pueden variar.

2. Antigen Control Slides - Cuatro (4) portaobjetos de testigo que contienen pocillos con células de testigo, positivos y negativos. Cada pocillo de testigo positivo está infectado con lo siguiente: adenovirus, influenza A, influenza B, parainfluenza 1, parainfluenza 2, parainfluenza 3 y VRS. Los pocillos de testigo negativo contienen células no infectadas.

5009 Adenovirus Control Slide

5010 Influenza A & B Control Slide

5011 Parainfluenza 1, 2, & 3 Control Slide

5012 RSV Control Slide

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3. Respiratory Viral Screen 5007: Un frasco cuentagotas de 10 ml que contiene anticuerpos monoclonales contra: adenovirus, influenza A, influenza B, parainfluenza 1, parainfluenza 2, parainfluenza 3 y virus respiratorio sincitial en PBS con estabilizador de proteínas, y azida sódica al 0,1% (conservante).

La cantidad suministrada es suficiente para 250 pruebas. Estimación se basa en las pruebas de caída de 40μL; el número real de las pruebas pueden variar.

4. Normal Mouse Antibody - 5014: Un frasco cuentagotas de 10 ml que contiene anticuerpo de ratón normal que se utilizará como testigo negativo en PBS con estabilizador de proteínas, y azida sódica al 0,1% (conservante).

5. Anti-Mouse IgG : FITC Conjugate - 5008: Dos (2) frascos cuentagotas de 10 ml que contienen IgG de cabra anti-ratón marcado con FITC en PBS con azul de Evans al 0,02% como tinción de contraste, BSA al 0,2% y azida sódica al 0,1% como conservante.

6. Phosphate - Buffered Saline (PBS) - 5087: Un envase de las sales para preparar 1 litro de solución salina tamponada con fosfato tras su disolución en agua destilada. Guardar en un envase cerrado y limpio, a la temperatura ambiente.

7. Tween® 20 / Sodium Azide Solution (100X) 5037: Un frasco de 10 ml que contiene monolaurato de polioxietilen sorbitan (Tween 20) y azida sódica (NaN3) concentrada, para diluir 1:100 en PBS.

8. Mounting Fluid - 5013: Un frasco cuentagotas de 10 ml que contiene tampón Tris, glicerina, amplificador de la fluorescencia y azida sódica como conservante. Guarde a temperatura entre 2°C y 25ºC.

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Material necesario pero no incluido

1. Cultivo celular para el aislamiento de los virus respiratorios: Todos los laboratorios deben mantener reservas de células viables en el paso o estado apropiado para realizar de forma eficiente la replicación de los virus respiratorios de las muestras procesadas de los pacientes. Estas células deben ser comprobadas periódicamente para conocer su capacidad para servir de soporte al crecimiento de los virus respiratorios. Se pueden obtener estirpes celulares apropiadas de la ATCC® (American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, VA.

2. Para el aislamiento de los virus se utiliza un medio de transporte que no inhiba a los virus respiratorios ni a las células usadas para el aislamiento de los virus en cultivo: Un medio apropiado es la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con antibióticos y un estabilizador de las proteínas. Evitar el uso de sueros animales (excepto el suero bovino fetal precalostral (FBS)) como estabilizador de las proteínas para prevenir las interferencias de los anticuerpos inherentes.

3. Para el mantenimiento después de la infección con el virus se pueden utilizar medios de cultivo como el RPMI o el medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) con la cantidad apropiada de FBS.

4. Tubos de cultivo, dram vials o placas multipocillos estériles

5. Acetona, 99,5% Nota: La acetona es higroscópica y se debe guardar en envases bien cerrados. La presencia de humedad en la acetona puede dar lugar a un aspecto nebuloso del substrato durante la microscopia de la fluorescencia.

6. Portaobjetos de vidrio limpiados con acetona 7. Pipetas estériles 8. Cámara húmeda 9. Solución de hipoclorito de sodio (0,05%) 10. Cubreobjetos del Nº 1 11. Incubador con reóstato para la regulación de temperatura 12. Torundas estériles 13. Pinzas 14. Frascos para la obtención y transporte de las muestras

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15. Microscopio de fluorescencia con la combinación apropiada de filtros para FITC (pico de excitación 490 nm, pico de emisión 520 nm)

16. Perlas de vidrio estériles (diámetro de 1-3 mm) 17. Centrifugadora 18. Vórtex o agitador por ultrasonido 19. Agua destilada

Estabilidad y almacenamiento

Guardado a 2-8 ºC, el Kit IFA Panel para la detección y identificación de los Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta del kit. No congele ni exponga a temperatura elevada. Deseche los restos de reactivos después de la fecha de caducidad del kit.

Una disminución marcada de la fluorescencia puede indicar deterioro del conjugado o del anticuerpo. Con cada lote de muestras hay que analizar un testigo positivo para asegurar el funcionamiento apropiado de estos reactivos y el procedimiento de tinción. Si hay una disminución de la intensidad de la tinción después del análisis apropiado, hay que dejar de usar los reactivos.

Advertencias y precauciones

• La azida sódica (presente en el conjugado, los anticuerpos monoclonales, el disolución de PBS/Tween 20 y el medio de montaje) puede reaccionar con tuberías de plomo o cobre, formando azidas metálicas potencialmente explosivas. Al desechar estos materiales, enjuagar con agua en abundancia para evitar la acumulación de azida.

• La dilución o las mezclas de los conjugados o de los anticuerpos monoclonales pueden causar resultados erróneos.

• No permita que se sequen los portaobjetos en ningún momento durante el proceso de tinción.

• Manejar todas las muestras y el material como potencialmente infecciosos. Descontaminar con hipoclorito de sodio al 0,05% (una dilución 1:100 de lejía doméstica) antes de desecharlos.

• No exponer los reactivos a una iluminación intensa durante el almacenamiento o la incubación.

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• Evitar el contacto con Evans Blue (presente en el Anti-Mouse IgG : FITC

Conjugate 5008) porque es un cancerígeno potencial. Si entrara en contacto con la piel, enjuague con agua abundante.

• La acetona es sumamente inflamable y su ingestión o inhalación es nociva para la salud. Conserve este producto alejado del calor, chispas o llamas. Evite la inhalación de los vapores. Utilice una ventilación apropiada.

• No pipetee los reactivos con la boca. • No sustituir con los reactivos de otros fabricantes. • La modificación del protocolo proporcionado puede causar resultados

erróneos. • Al teñir muestras múltiples en un portaobjetos, evitar la contaminación

cruzada entre las mismas. • El anticuerpo de ratón normal se debe comprobar con cada aislado del

cultivo celular. La fluorescencia indica una reacción no específica y la prueba se considera no válida.

• El Mounting Fluid 5013 contiene un amplificador de fluorescencia que puede resultar destructivo para las mucosas. Evite el contacto directo con la piel o las mucosas. Si ocurriera el contacto, enjuague con agua abundante.

Obtención de muestras

La extracción, el transporte, el procesamiento y el almacenamiento apropiados de la muestra son de importancia fundamental para el aislamiento y confirmación del virus infectante. La selección de la técnica de obtención apropiada requiere el conocimiento de la patogenia de la enfermedad. Una regla sencilla es que cuando una infección está en una superficie (piel o membrana mucosa), hay que cultivar material del área infectada. En las infecciones profundas o generalizadas (erupciones no vesiculosas, meningitis, encefalitis, fiebre de origen desconocido o infecciones congénitas), es recomendable tomar muestras de múltiples sitios.

El tipo de muestra a extraer y su procesamiento ulterior dependen de la enfermedad y del virus que hay que detectar. La información detallada sobre los síntomas y las técnicas de obtención de las muestras se puede encontrar en el Manual of Clinical Microbiology, Balows, A. et al., eds. 5ª ed. (1991). American Society for Microbiology, Washington, D.C. Adenovirus, Ch. 86; Respiratory Syncytial Virus, Ch. 83; Influenza Viruses, Ch. 81; Parainfluenza Viruses, Ch. 82; Animal and Animal Cell Culture Systems, Ch. 19.

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Para el transporte apropiado de las muestras, consultar 42 CFR (Code of Federal Regulations) part 72.

Proceso de muestras

Antes de procesar las muestras, comprobar que hayan sido obtenidas y transportadas correctamente. La manipulación incorrecta de las muestras puede causar resultados erróneos.

Cuando se usen aspirados, lavar la muestra mezclando aproximadamente 0,2 a 0,4 ml de la secreción sin diluir con un 2,0 ml de PBS frío. Agitar la muestra en un vórtex para separar las células del moco. Agregar 10 ml de PBS y centrifugar a 200-500 g durante 7-10 minutos. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado del sedimento celular hasta que desaparezca el moco de la muestra. Resuspender de nuevo las células en el medio apropiado y agitar en el vórtex, o sonicar, para disgregar las células. Centrifugar y utilizar el sobrenadante como material de inoculación.

Para las torundas nasofaríngeas o de la garganta, agitar el envase con la muestra para separar las células. Para aumentar la recuperación celular, agregar algunas perlas de cristal estériles a la muestra y agitar con vórtex o sonicar a 8-12 kc/seg hasta 1 minuto. Deseche la torunda en una solución de hipoclorito de sodio. Centrifugar la muestra a 200-500 g durante 7-10 minutos. Utilizar el sobrenadante como material de inoculación.

Examine los cultivos celulares inmediatamente antes de sembrar la muestra para verificar que la morfología sea adecuada. Lavar la monocapa con medio fresco y aspirarlo. Agregar 0,2 - 0,5 ml del inóculo a cada uno de los frascos de cultivo. Inocular las muestras por duplicado. Dejar a 37 °C durante 30 a 60 minutos o, después de la inoculación, centrifugar los frascos de cultivo durante 30 minutos entre 500 y 700 x g y dejarlos a 37 °C durante 30 minutos (se deben realizar los controles apropiados para asegurar que no haya ningún efecto perjudicial de la centrifugación sobre las estirpes celulares utilizadas). Después del período de incubación, cubrir los cultivos con medio de mantenimiento fresco e incubar a 35-37 °C. Renovar el medio de cultivo celular cada 3 ó 4 días.

Examine diariamente en busca del CPE (efecto citopático). Las cultivos celulares sometidos a adsorción o centrifugación, según lo descrito previamente, pueden mostrar CPE tan precozmente como a las 48 horas.

Se debe sembrar una muestra de cada lote de las estirpes celulares empleadas para el cultivo celular con cepas representativas de virus respiratorios para establecer la susceptibilidad y el desarrollo posterior de CPE. Los cultivos

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celulares no inoculados también deben crecerse y examinarse diariamente en busca de virus y micoplasma. Este funcionará como un testigo de morfología celular normal y puede resultar útil para detectar un CPE temprano. A menos que estos cultivos celulares testigo tengan un crecimiento adecuado, los resultados del aislamiento en cultivo celular deben considerarse inválidos.

Después de la incubación apropiada y/o tras la observación de > 25 % CPE, retirar el medio del frasco de cultivo. Congelar el medio que no ha sido utilizado hasta que se haya terminado la prueba. En el caso de que surja algún problema, se puede intentar el aislamiento vírico de este medio. El aislamiento vírico de las muestras congeladas puede ser drásticamente inferior al de las muestras frescas.

Lavar el cultivo celular suavemente, tres veces, con 1-2 ml de HBSS. Deseche todos los lavados en una solución de hipoclorito de sodio. Agregar una décima parte del volumen del cultivo de ácido etilenediamino tetraacético de sodio - tripsina (0,05%) -- (EDTA-4Na, 0,53 mM) y dejar actuar durante 30 segundos. Golpee suavemente el recipiente de cultivo para desprender las células. Agregar medio fresco hasta el volumen original. Centrifugar la muestra a 200-500 x g durante 7-10 minutos. Resuspenda las células sedimentadas en una gotas de PBS estéril para obtener una suspensión ligeramente turbia. Para ser considerados adecuados para la detección, los portaobjetos deben contener al menos tres células por campo de 400x aumentos.

Alternativamente, las células se pueden desprender rascando y llevar a volumen pequeño de PBS.

Manchar con la suspensión celular un portaobjetos limpiado con acetona y secarlo al aire totalmente. Fije el portaobjetos en acetona fría (2 a 8 °C) durante 10 minutos y secarlo al aire completamente. Guardar los portaobjetos no utilizados con desecante a -20 °C.

Procedimiento de prueba Preparación del reactivo: Disolución de PBS/Tween 20 1. Disolver el contenido del paquete de PBS en 950 ml de agua desionizada. 2. Agregar el concentrado de Tween 20 / azida sódica 100X (10 ml) al PBS y

mezclar bien. 3. Añadir agua destilada a la mezcla, hasta obtener 1 litro. Transferir a un

envase, limpio y etiquetado, para su almacenamiento y cerrarlo bien. Todos los demás reactivos se proporcionan listos para su uso.

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Procedimiento (de tinción) inmunofluorescente indirecto sugerido:

1. Permita que los portaobjetos de testigo fijados en acetona, la muestra y los reactivos alcancen la temperatura ambiente.

Nota: No permita que se sequen los portaobjetos en ningún momento durante el proceso de tinción.

Nota: Debe utilizarse primero Respiratory Viral Screen para confirmar la presencia de un virus respiratorio. Las muestras positivas deben entonces ser investigadas con los anticuerpos monoclonales contra los virus individuales para su identificación específica.

2. Agregue suficiente Respiratory Virus Screen 5007 o anticuerpo específico de identificación o anticuerpo normal de ratón (reactivo de testigo negativo) para cubrir las células; 1 gota para las manchas celulares y 4 a 6 gotas para los shell vials.

3. Incube el portaobjetos a 37 °C durante 30 minutos en una cámara húmeda.

4. Enjuague el portaobjetos suavemente con una piseta de PBS/Tween 20 Disolución durante 10 a 15 segundos para eliminar el exceso de solución de anticuerpo monoclonal, tenga cuidado de dirigir el chorro lejos del pocillo. Para shell vials: aspire el reactivo del frasco y lave suavemente cada shell vial 3 veces con 1 mL de PBS/Tween 20 disolución.

5. Coloque el portaobjetos en una placa de tinción o en un recipiente de Coplin (con cestillo para portaobjetos o equivalente) y cubra con PBS. Enjuague 2 a 3 veces durante 5 a 10 minutos. Agite suavemente con un agitador magnético o manualmente.

6. Sacuda el exceso PBS/Tween 20 disolución del portaobjetos y seque cuidadosamente el área que rodea la mancha de células.

7. Agregue suficiente FITC-labeled Anti-Mouse IgG Conjugate 5008 o equivalente para cubrir las células; 1 gota para manchas de células y 4 a 6 gotas para shell vials.

8. Repita los pasos 3 a 6.

9. Prepare bajo un cubreobjetos con Mounting Medium acuoso pH 8,5

5013 o equivalente. Para shell vials: aspire el PBS/Tween de los shell vials. Levante cada cubreobjetos con una aguja doblada fijada a una jeringa pequeña y sáquelo cuidadosamente con pinzas. Prepare cada cubreobjetos

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con el LADO DE LAS CÉLULAS HACIA ABAJO sobre un portaobjetos de vidrio con líquido de preparación.

10. Seque el exceso de líquido de los bordes del portaobjetos.

Nota: Para obtener los mejores resultados, examine los portaobjetos inmediatamente después de la tinción. Si los portaobjetos tuvieran que almacenarse después de la tinción, guárdelos entre 2 y 8 ºC en un envase seguro y protegidos de la luz.

11. Examine los portaobjetos, con un microscopio de fluorescencia a 100-200x, en busca de células que presenten fluorescencia. Puede realizarse un examen detallado a 400x.

Nota: El buen funcionamiento del microscopio de fluorescencia tiene una importancia crucial para lograr resultados de análisis satisfactorios. Dado que los objetivos, la intensidad y potencia de la lámpara y los filtros pueden afectar a los resultados, el empleo de un testigo positivo verificará el funcionamiento de los reactivos, la metodología de cultivo y el microscopio.

Interpretación de los resultados

El patrón de la tinción dependerá del virus causante de la infección y refleja el patrón del crecimiento del virus. Los patrones de tinción típicos observados con los virus respiratorios se describen a continuación:

Virus respiratorio sincitial (VRS)

La fluorescencia se localiza en el citoplasma y se asocia a los sincitios. La tinción citoplásmica es punteada con inclusiones pequeñas.

Influenza A y B La fluorescencia es nuclear, citoplásmica o ambas. La tinción nuclear es uniformemente brillante. La tinción citoplásmica es a menudo punteada, con inclusiones grandes.

Tipos 1, 2 y 3 del virus de la parainfluenza La fluorescencia está confinada al citoplasma. La tinción citoplásmica es punteada, con inclusiones irregulares.

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Adenovirus La fluorescencia es nuclear, citoplásmica o ambas. La tinción nuclear es uniformemente brillante. La tinción citoplásmica es a menudo punteada.

Células negativas

Examinar primero los portaobjetos de testigo para comprobar la idoneidad de la tinción. El testigo positivo debe mostrar células con fluorescencia nuclear, del citoplasma o de ambos, dependiendo de la etapa del crecimiento. El testigo negativo debe mostrar células teñidas de un color un rojo pálido debido al contraste con Evans Blue. Las células muestran un color rojo pálido en el citoplasma y un color entre rojo burdeos oscuro a casi negro en el núcleo. La tinción de estas células es debida a la presencia de Evans Blue como contraste.

Resulta útil examinar las células negativas antes que las positivas para determinar si hay tinción del fondo. La tinción positiva para un virus está representada por la presencia, al menos, de dos o más células intactas por campo de 400x que exhiban el tipo de fluorescencia descrito previamente.

Precaución: Se debe ignorar la tinción fluorescente de los fragmentos celulares, que a menudo se debe a que el conjugado queda atrapado en dichos fragmentos. Si los testigos positivo y negativo no pueden ser distinguidos claramente la prueba es inválida y debe repetirse. Un resultado negativo no elimina la presencia de adenovirus, VRS, la influenza A o B, o los tipos 1, 2 ó 3 del virus de la parainfluenza. El resultado negativo puede ser debido a diversos de factores, por ejemplo: muestra inadecuada, incorrecta obtención y manipulación de la muestra, técnica de cultivo incorrecta, el uso de una estirpe celular o temperatura inadecuadas durante el aislamiento, o los factores mencionados en “Limitaciones”. Todos los resultados negativos deben informarse como "No se observa ningún virus".

Limitaciones

• El apropiado transporte y procesamiento ulterior de las muestras son de importancia crítica para el aislamiento en el cultivo. Por lo tanto, un resultado negativo no elimina la presencia de la infección vírica. Los resultados se deben interpretar cuidadosamente, teniendo en cuenta la evaluación clínica y otras pruebas de diagnóstico de los pacientes.

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• Para que la prueba sea válida, hay que procesar en cada muestra los testigos positivo y negativo, que deben mostrar la tinción apropiada.

• La tinción perinuclear o citoplásmica difusa puede corresponder a la unión no específica del anticuerpo, debida a la presencia de receptor de Fc en las células infectadas por virus herpes (36).

• Las muestras contaminadas por Staphylococcus aureus pueden exhibir fluorescencia de color amarillo verdoso pálido debido a la presencia de grandes cantidades de proteína A. La fluorescencia es el resultado de la unión no específica de la proteína A a los fragmentos Fc del anticuerpo.

• Los anticuerpos monoclonales de este kit son específicos de grupo para adenovirus y VRS y, por lo tanto, no pueden ser utilizados para distinguir los tipos.

Valores esperados

Los resultados variarán dependiendo del estado socioeconómico, de la edad de la población, de la localización geográfica, de la época del año (algunos virus son estacionales) y de la manipulación de la muestra. Se ha analizado un total de 646 muestras en dos centros de la costa oriental, tres localizaciones meridionales y dos en la zona centro, así como de tres centros de la costa occidental. Los centros han sido hospitales, hospitales infantiles, universidades y laboratorios de referencia. Las evaluaciones realizadas de septiembre de 1991 a julio de 1992 proporcionaron las siguientes tasas de detección: Adenovirus - 6,7% (43/646); VRS - 10,2% (66/646); Influenza A - 1,7% (11/646); Influenza B - 0,6% (4/646); Parainfluenza 1 - 1,7% (11/646); Parainfluenza 2 - 0,8% (5/646); Parainfluenza 3 - 4,3% (28/646).

Características de la eficacia diagnóstica

Análisis de la reactividad cruzada

Los estudios sobre la detección de virus y bacterias con cada anticuerpo monoclonal proporcionaron los resultados siguientes. Los cultivos de ATCC® (American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, VA se identifican por el número de la cepa. Los prototipos indicados fueron aislados por los Centers for Disease Control, Atlanta, GA. Los cultivos restantes eran aislados clínicos, a menos que se indique otra cosa.

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ANTICUERPOS MONOCLONALES:

Adeno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Adenovirus: Tipos 1-47 prototipos; + 30 aislados clínicos actuales de los tipos 1,2,3,4,5,7,8,37

+ - - - - - -

Polyomavirus: SV-40 - - - - - - - Virus del herpes: 2 aislados clínicos de los virus herpes tipos 1 y 2, HSV-1 ATCC VR733, HSV-2 ATCC VR734; 1 aislado clínico de CMV y de VVZ

- - - - - - -

Echovirus: Aislados clínicos tipos 1,4,6,9,11,30,33, prototipo Echo-27, prototipo Polio-2

- - - - - - -

Coxsackievirus: Prototipo A14, A24var (4 aislados), B4 (2 aislados)

- - - - - - -

Enterovirus 70: 4 aislados - - - - - - - Rhinovirus: 6 aislados - - - - - - - Coronavirus: Prototipos OC43 y 229E

- - - - - - -

Tipo A del virus de la influenza: 2 aislados cada uno de Cepas A/Leningrado / 360/86 y A/Filipinas/2/82; subtipo H3N2: A/Victoria/3/75 - 7 aislados, A/Texas/1/77 - 1 aislado, Cepas A/England/496/80 - 2 aislados, A/England/X/82 - 12 aislados; subtipo H1N1: A/USSR/90/77 - 2 aislados, A/England/333/80 - 1 aislado; subtipos H3N2 y H1N1 todas las cepas - 25 aislados

- - + - - - -

Tipo B del virus de la influenza: 2 aislados de B/USSR/100/83; 14 aislados de B/Singapur/222/79

- - - + - - -

Virus de la parainfluenza: Prototipo del tipo 1 y 6 aislados recientes

- - - - + - -


- - - - - + -

18


Adeno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3


- - - - - - +

Virus de la parainfluenza: Tipos 4A, 4B prototipos y 6 aislados recientes de cada uno

- - - - - - -

Virus de la parotiditis: prototipo, 6 aislados y CDC V5004

- - - - - - -

Virus del sarampión: Cepa Edmonston; CDC V4009

- - - - - - -

Virus de simio: Cepas de referencia 5 y 41

- - - - - - -

VRS: Cepas de referencia Long, A2, 18537, V1680E y V670; 30 aislados recientes de las cepas del grupo 1 (Long-like); 30 aislados de las cepas del grupo 2 (18537-like)

- + - - - - -

Acholeplasma laidlawii: ATCC 23206

- - - - - - -

Bordetella bronchiseptica: ATCC 10580

- - - - - - -

Bordetella pertussis: ATCC 9340

- - - - - - -

Bordetella parapertussis: ATCC 15237

- - - - - - -

Branhamella catarrhalis: ATCC 25238

- - - - - - -

Chlamydia trachomatis: Syva

- - - - - - -

Corynebacterium diptheriae: ATCC 13812

- - - - - - -

Legionella micdadei: ATCC 33204

- - - - - - -

Legionella pneumophila: CDC-BC 1640

- - - - - - -

Mycobacterium avium: clínico

- - - - - - -

Mycobacterium intracellularae: clínico

- - - - - - -

Mycobacterium tuberculosis: clínico

- - - - - - -

19


Adeno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Mycoplasma fermentans: ATCC 19989

- - - - - - -

Mycoplasma hominis: ATCC 23114

- - - - - - -

Mycoplasma orale: ATCC 23714

- - - - - - -

Mycoplasma pneumoniae: clínico

- - - - - - -

Neisseria meningitidis: ATCC 13077

- - - - - - -

Ureaplasma urealyticum: ATCC 27618

- - - - - - -

Testigos de la célula huésped:

Todos los anticuerpos monoclonales dieron resultado negativo frente a los testigos celulares siguientes:

Adenovirus Testigos celulares pHEK, HEp-2, NCI-H292, RD, HLF, HeLa y A549

Polyomavirus Testigo de células PMK Enterovirus Testigos de células RD y HLF Paramyxovirus Testigos de células HEp-2, Vero y PMK

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Comparación clínica para la confirmación del cultivo celular La confirmación del cultivo celular de las muestras respiratorias fue probada en siete laboratorios clínicos de EE.UU. que compararon con el Kit IFA Panel para la detección y identificación de los Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ de con otros kits de diagnóstico in vitro. Los resultados son los siguientes:


Adeno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Positivo verdadero 43 66 11 4 11 5 28 Positivo falso 0 0 0 0 0 0 0 Negativo verdadero 602 580 635 642 635 641 618 Negativo falso 1 0 0 0 0 0 0 Sensibilidad (%) 97.7 100 100 100 100 100 100 Especificidad (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valor predictivo positivo (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valor predictivo negativo (%) 99.8 100 100 100 100 100 100

La confirmación del cultivo celular de las muestras respiratorias del repositorio congelado fue probada en siete laboratorios clínicos de EE.UU. que compararon el Kit IFA Panel para la detección y identificación de los Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ con otros kits de diagnóstico in vitro. Los resultados son los siguientes:


Adeno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Positivo verdadero 7 3 30 36 33 5 16 Positivo falso 0 0 0 0 0 0 0 Negativo verdadero 144 148 121 115 118 146 135 Negativo falso 0 0 0 0 0 0 0 Sensibilidad (%) 100 100 100 100 100 100 100 Especificidad (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valor predictivo positivo (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valor predictivo negativo (%) 100 100 100 100 100 100 100

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Resolución de problemas

La preparación de las muestras depende mucho de la técnica y puede afectar a los resultados que se obtengan. Para poder solucionar posibles problemas de eficacia, es necesario examinar todos los pasos del proceso.

Una disminución muy marcada de la fluorescencia podría indicar:

1) Un deterioro de los reactivos

2) Problemas relacionados con la microscopía

3) Otros problemas del equipo o de la técnica

• Verifique la fecha de caducidad de todos los reactivos empleados.

• Si los reactivos no hubieran caducado, verifique el funcionamiento del microscopio y vuelva a examinar los portaobjetos control.

• Si aún no se determinara el problema, verifique la operación de todo el equipo según el folleto y repita el análisis.

Para solicitar asistencia, llame al Servicio Técnico de EMD Millipore Corporation. Para encontrar la oficina más cercana, visite www.millipore.com/offices.

La sección de “Bibliografía” de este folleto informativo de IVD de Light Diagnostics™ aparece solamente en la versión completa en inglés. Consulte esta versión acerca de los detalles específicos del producto.

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Glosario de Símbolos

Símbolo Se utiliza para Símbolo Se utiliza para

Número de catálogo

El uso por parte AAAA-MM-DD o AAAA MM-

Fabbricante

Representante autorizado en la Comunidad Europea

Precaución, consulte los documentos adjuntos

Contenido suficiente para <n> pruebas

Diagnóstico in vitro de dispositivos médicos

Límites de temperatura

Consulte las instrucciones de uso

Los riesgos biológicos

Control

El control negativo

El control positivo

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GARANTÍA Y LIMITACIÓN DE RESPONSABILIDAD: 1. Millipore garantiza que sus productos cumplirán con sus especificaciones publicadas cuando

sean usados de acuerdo con sus instrucciones durante un período de un año desde el envío de los productos.

2. El Cliente inspeccionará los Productos cuando éstos le sean entregados. Cualquier reserva relativa a defectos obvios o a falta de Productos, debidos a una posible falta por Millipore Iberica, S.A, debe ser notificada inmediatamente por escrito al transportista y por correo certificado a Millipore Iberica, S.A, durante los tres (3) días laborables siguientes a la entrega, o como muy tarde, durante los diez (10) días naturales siguientes a la fecha de facturación, en el caso de que se trate de una falta de Productos. 3. No puede devolverse un producto sin el previo acuerdo de Millipore Iberica, S.A, y sin seguir sus indicaciones al respecto. Cualesquiera de los Productos devueltos sin previo acuerdo de Millipore Iberica, S.A no serán abonados en la cuenta del Cliente. 4. Millipore Iberica, S.A no será responsable por el deterioro de los Productos adquiridos por el Cliente como consecuencia de las incorrectas condiciones de almacenamiento. A este efecto, el Cliente se obliga a respetar las especificaciones y condiciones de uso de dichos Productos; en caso de incumplimiento, no será aplicable ninguna de las garantías otorgadas por Millipore Iberica, S.A. 5. En el supuesto de incumplimiento de dicha garantía, Millipore únicamente estará obligado a reparar o reemplazar, a su elección, el producto o parte de éste. Si después de realizar esfuerzos razonables al efecto Millipore no es capaz de reparar o reemplazar el producto o parte de éste, entonces Millipore deberá devolver al cliente todo el dinero satisfecho por dicho producto o parte de éste. 6. Con carácter general, cualquier garantía otorgada por Millipore Iberica, S.A no es aplicable en los siguientes casos: instalación, uso y mantenimiento incorrectos de los Productos, sin cumplir con las instrucciones dadas por Millipore Iberica, S.A. desgastes ocasionados por uso ordinario de los Productos o falta del adecuado mantenimiento. 7. Millipore no será reputado responsable por perjuicios indirectos como perjuicio comercial, pérdida de clientela, pérdida de Pedidos, otros problemas comerciales, daño emergente, daños a su propiedad o marcas, sufridos por cualquier cliente como consecuencia del uso de los productos. 8. Cualesquiera acciones dirigidas contra el Cliente por un tercero constituye un perjuicio indirecto y no produce derecho alguno a compensación. 9. En cualquier caso, las multas y sanciones que puedan ser atribuidas a Millipore Iberica, S.A en supuestos en que la responsabilidad de ésta se haya reconocido, quedarían limitadas a una cantidad igual a las sumas efectivamente satisfechas a Millipore Iberica, S.A por el Cliente en concepto de la compra del producto del que se derive la responsabilidad de Millipore Iberica, S.A.

Tween® es una marca comercial de ICI Americas Inc. ATCC® es una marca comercial de la American Type Culture Collection Corporation. 2019 EMD Millipore Corporation, una división de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. Todos los derechos reservados. EMD, EMD Millipore, Millipore, la marca M, Light Diagnostics y todas las demás marcas comerciales, a menos que específicamente identificados anteriormente en el texto como perteneciente a un tercero, son propiedad de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.




RESPIRATORY PANEL VIRAL

SCREENING AND IDENTIFICATION IFA KIT

Qualitative Identifizierung von Adenovirus,

Influenza A, Influenza B, Parainfluenza Typ 1, 2, 3 und Respiratory Syncytial Virus

Deutsche Sprachenergänzung

3105

1 x 250, 7 x 50

1

Verwendungszweck

Das Light Diagnostics™ Respiratory Panel Viral Screening and Identification IFA Kit ist für die In-vitro-Diagnose zur qualitativen Kulturbestätigung von Adenovirus, Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3 und RSV (Respiratory Syncytial Virus) bestimmt.

Zusammenfassung und Erläuterung

Respiratorische Viren sind für einen erheblichen Prozentsatz an Krankheiten der menschlichen Bevölkerung verantwortlich. Einige Viren (z. B. Influenza) treten saisonal auf, während andere (z. B. Adenovirus) hauptsächlich unterschiedliche Altersgruppen betreffen. Respiratorische Viren können in einer beliebigen Bevölkerung für eine erhebliche Anzahl an Todesfällen verantwortlich sein. Mit der kommenden Einführung entsprechender Antivirentherapie gegen einige respiratorische Viren werden schnelle Screeningtests zum Nachweis dieser Organismen unerlässlich, um eine Therapie frühzeitig bestimmen zu können. Die zwei derzeit am häufigsten verwendeten Antivirus-Agenzien sind Amantadin/Rimantadin für Influenza A und Ribavirin für RSV-Bronchiolitis. Beide Agenzien verfügen über unterschiedliche Wirkungsweisen, die jedoch meistens frühe Infektionsschritte wie das Eindringen oder das Freisetzen des Genoms (uncoating) einschließen (41, 63). In physiologisch erzielbaren Konzentrationen blockieren Amantadin und Rimantadin spezifisch die Replikation von Influenza A (13). Ribavirin verfügt über ein breites Spektrum an In-vitro-Aktivität gegen eine Vielzahl von Viren wie RSV, Masern, Influenza A und B und Parainfluenza (46, 47, 53).

Die Identifizierung von Viren wird im Allgemeinen auf eine der beiden folgenden Arten durchgeführt: Kulturisolierung/-bestätigung und direkter Nachweis. Die Kultur-isolierung und -bestätigung ist die Standardmethode der meisten Labors und die empfindlichste der verfügbaren Methoden für den Nachweis respiratorischer Viren. Light Diagnostics™ Respiratory Panel Viral Screening and Identification IFA Kit liefert mithilfe von monoklonalen Antikörpern für die Kulturbestätigung innerhalb von nur 60 Minuten klare und einfach zu interpretierende Ergebnisse.

Im Alter von zwei Jahren haben die meisten Kinder Infektionen mit RSV (Respiratory syncytial virus) durchlaufen. Diese gehören somit zu den wichtigsten durch ein Virus verursachten Kinderkrankheiten des unteren

2

Respirationstrakts (64). RSV-Infektionen resultieren in der Regel in Erkältungen mit übermäßiger Nasenschleimabsonderung, führen bei Erstinfektionen von 6 Wochen bis 6 Monate alten Säuglingen jedoch zu 25-40% zu einer Erkrankung des unteren Respirationstrakts (64). In den meisten erforschten Gebieten war RSV für mehr Fälle von Pneumonie und Bronchiolitis verantwortlich als alle anderen mikrobiellen Pathogene (48). Studien deuten darauf hin, dass RSV-Pneumonie und -Bronchiolitis in der Kindheit langfristig zu respiratorischen Anomalien führen können, wie abnormer Lungenfunktion, Asthma und wieder-kehrendem Husten und Bronchitis (52). RSV wurde außerdem mit SIDS (sudden infant death syndrome, plötzlicher Kindstod) in Verbindung gebracht, obwohl die Art der Assoziierung unbestimmt ist (58).

RSV gehört zur Familie der Paramyxoviridae und zum Genus Pneumovirus. Es handelt sich um ein gehülltes pleomorphes Virus mit einem Durchmesser zwischen 150 und 300 nm (5, 31, 34) und einem Einzelstrang-RNA-Genom (64).

RSV kann durch Immunfluoreszenz, EIA, Neutralisierung oder Kulturbestätigung nachgewiesen werden (21, 32, 49). Für die RSV-Kultivierung ist eine Vielzahl von Zelllinien geeignet. Bei der Primärisolation sind HEp-2 (33) oder HeLa (34) zulässige Zelllinien, obwohl auch andere wie Vero, LLC MK-2 oder CV-l verwendet wurden. Das Virus erzeugt charakteristische zytopathische Effekte der Synzytium-Bildung und des Zellverfalls (48).

Influenza-Viren verursachen äußerst ansteckende respiratorische Krankheiten, die in der Regel zu Epidemien führen (27). In den drei Typen A, B und C wird die Spezifität durch interne Nukleoprotein- und Matrixprotein-Antigene übertragen (40).

Beim Erwachsenen führt eine Infektion mit Influenza-Virus im Allgemeinen zu Tracheobronchitis und Beteiligung der kleinen Atemwege (43, 66) mit einer möglichen Entwicklung von Rhinitis und/oder Pharyngitis. Eine Infektion kann jedoch klinische Manifestationen von einem symptomfreien Verlauf bis hin zu Pneumonie mit Todesfolge aufweisen (25). Dasselbe Spektrum einer klinischen Reaktion kann bei Kindern beobachtet werden, mit einigen deutlichen Unterschieden. Das Fieber kann bei Kindern höher und von Schüttelkrämpfen begleitet sein (23, 24, 62, 70, 71). Influenza-Viren sind für 14 Prozent kindlicher Fiebererkrankungen verantwortlich, bei denen die Symptome des Respirationstrakts ernst genug sind, um eine ärztliche Konsultation zu erfordern (23, 71). Bei Kindern kommt häufiger eine Beteiligung des Magen-Darm-Trakts hinzu als bei Erwachsenen (14), und sie entwickeln häufiger Myositis, Mittelohrentzündung und Krupp (28, 38). Eine Infektion des Neugeborenen kann in nicht erklärbarem Fieber resultieren (50) und verläuft möglicherweise tödlich (1, 18, 50, 59). Bei Kindern und Erwachsenen manifestieren sich

3

Krankheiten des unteren Respirationstrakts, die mit einer Influenza-Infektion assoziiert sind, in drei Formen von Pneumonie: primäre Viruspneumonie, kombinierte viral-bakterielle Pneumonie und Influenza-Infektion gefolgt von bakterieller Pneumonie (54). Nichtpulmonale klinische Reaktionen auf eine Influenza-Infektion sind unter anderen Virämie, Kardial- und ZNS-Beteiligung, Reye-Syndrom und toxischer Schock (54).

Die Influenza-Typen A und B rufen im Wesentlichen dasselbe Krankheitsspektrum hervor. Eine Infektion mit Typ A resultiert jedoch viermal häufiger in einer stationären Einweisung als Typ B (38), und Typ B führt häufiger zu Myositis und einer Beteiligung des Magen-Darm-Trakts (11, 16, 37, 42).

Influenza vom Typ C führt selten zu Erkrankungen des unteren Respirationstrakts, ruft aber sporadisch Krankheiten des oberen Respirationstrakts hervor (19, 38, 51). Bei Erreichen des Erwachsenenalters haben beinahe alle Personen Antikörper gegen Typ C (57).

Influenza-Viren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae. Sie sind pleomorph, gehüllt und enthalten ein segmentiertes, einzelsträngiges Negativ-Sense-RNA-Genom. Ihr Durchmesser liegt zwischen 80 und 120 nm (40).

Durch Hinzufügen von Trypsin können Influenza-Viren in einer Vielzahl von Zelllinien kultiviert werden, wie MDCK (Madin-Darby canine kidney, Madin-Darby Hunde-Nierenzellen), A549-Lungenkarzinom und PMK (primary monkey kidney, primäre Affennierenzellen) (20, 65) wie auch die klassischen bebrüteten Hühnereier oder das Allantoin-auf-Schale-System (17).

Influenza-Virus kann durch Immunfluoreszenz-, Hämadsorptions- oder Hämagglutinationsverfahren mithilfe von Hühner- oder Meerschwein-Erythrozyten nachgewiesen werden. Die Isolierung/Kulturbestätigung stellt ein einfaches, empfindliches und relativ schnelles Verfahren für die Identifizierung von Influenza-Infektionen dar. Ein zytopathischer Effekt wird 3-7 Tage nach Inokulation als Vakuolisierung und Zellverfall apparent.

Parainfluenza-Viren, kombiniert mit RSV, stellen die bedeutendsten Pathogene der oberen Atemwege bei Säuglingen und Kleinkindern dar (4, 6, 7, 39). Vier Typen von Parainfluenza-Viren wurden bei Kindern und Erwachsenen identifiziert. Die Typen 1 und 2 sind die Hauptursache für Laryngotracheobronchitis (Krupp). Die Krankheit verläuft bei Kindern zwischen zwei und vier Jahren am schwersten (67). Eine Infektion mit Parainfluenza Typ 3 kann zu Krupp führen. Wichtiger ist jedoch, dass Typ 3 nach RSV die zweithäufigste Ursache für Säuglings-Bronchiolitis und -Pneumonie ist (8, 9, 25,

4

60, 61). Der Krankheitsverlauf bei Infektionen mit Typ 3 ist bei Säuglingen unter einem Jahr am schwersten (67).

Bei älteren Kindern und Jugendlichen kann die Krankheit asymptomatisch verlaufen oder wie eine normale Erkältung erscheinen (68). Schwerer Krupp in früher Kindheit oder im Säuglingsalter kann bei älteren Kindern oder Jugendlichen nach körperlicher Betätigung in bronchialer Hyperaktivität resultieren. Es bleibt jedoch unbestimmt, ob die bronchiale Hyperaktivität bereits vorlag und die Pathogenese des Krupp beeinflusste, oder ob sie sich als Komplikation eines schweren Krupps entwickelt hat (26, 44).

Parainfluenza vom Typ 4 wurde bei Erwachsenen und Kindern nur mit leichten Erkrankungen der oberen Atemwege in Verbindung gebracht und ist in Zellkulturen schwer nachzuweisen (67).

Parainfluenza-Viren gehören zum Genus Paramyxovirus der Familie der Paramyxoviridae. Es handelt sich bei ihnen um behüllte Viren mit einem Einzelstrang-RNA-Genom negativer Polarität und einem Durchmesser von 150-200 nm (10).

Parainfluenza-Viren werden am besten in primären Simian- oder humanen Nierenzelllinien und in LLC-MK2 angezüchtet, einer heteroploiden Nieren-Zelllinie des Rhesusaffen (20). Trypsin ist im Medium für die Gewinnung der Typen 1 und 2, nicht jedoch des Typs 3 erforderlich. Die Virusinfizierung der Gewebekultur kann durch Hämadsorption von Meerschwein-Erythrozyten erkannt werden. Die Typen 2 und 3 können durch Synzytium-Bildung erkannt werden.

Adenoviren sind für eine bedeutende Anzahl klinischer Atemwegserkrankungen verantwortlich. Erkrankungen der oberen Atemwege, die durch Adenoviren hervorgerufen werden, sind u. a. Erkältungen, Pharyngitis und Mandelentzündungen und kommen hauptsächlich bei Säuglingen und Kleinkindern vor. Bei annähernd 10% der Pneumonien im Kindesalter sind Adenoviren die wahrscheinliche Ursache (45). Weitere, auf Adenoviren zurückzuführende Krankheiten der oberen Atemwege sind unter anderen Bronchitis und Bronchiolitis (29). Bei Kindern unter fünf Jahren ist Adenovirus für ca. 5% aller Fälle von ARD (acute respiratory disease, akute respiratorische Krankheit) verantwortlich. ARD kann sich in Nasenverstopfung, Coryza, Husten sowie manchmal Mandelentzündung, Fieber und Myalgie manifestieren. Beim Pharyngokonjunktivalfieber tritt Konjunktivitis mit ARD auf (3). Adenovirus wurde allgemein mit dem Pertussis-Syndrom assoziiert; neue Studien legen jedoch nahe, dass das Vorhandensein von Adenoviren in diesen Fällen

5

möglicherweise eine Reaktivierung eines im Tonsillargewebe vorhandenen latenten Virus aus Bordetella pertussis-Infektionen ist (55).

Augenkrankheiten, die aus einer Infektion mit Adenovirus entstanden sind, umfassen EKC (epidemic keratoconjunctivitis, Keratokonjunktivitis epidemica), akute hämorrhagische Konjunktivitis und akute Konjunktivitis follicularis. Adenovirus steht mit mehreren Magen-Darm-Krankheiten in Zusammenhang und ist wahrscheinlich bei 7-17% aller Gastroenteritiden im Kindesalter nachweisbar. Die Typen 40 und 41 wurden mit Diarrhoe und akuter Gastroenteritis assoziiert (15, 22, 69). Das Virus wurde außerdem mit Intussuszeption (2), akuter hämorrhagischer Zystitis (56) und Meningoenzephalitis in Verbindung gebracht.

Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Adenovirus-Infektionen bei immun-geschwächten Patienten möglicherweise nicht häufiger vorkommen als bei normalen Personen, jedoch schwerer verlaufen und häufiger tödlich enden können (30).

Humane Adenoviren gehören zur Familie der Adenoviridae, Genus Mastadenovirus. Es handelt sich bei ihnen um unbehüllte Doppelstrang-DNA-Viren ikosaedrischer Form von 70-90 nm Durchmesser (29). Sie verfügen über einen Proteinmantel von 240 Hexon- und 12 Pentonkapsomeren.

Adenovirus kann in einer Vielzahl von Zelllinien kultiviert und isoliert und mit verschiedenen Methoden identifiziert werden. Geeignete Zelllinien sind unter anderen HEp-2, HeLa, KB:A549 und HEK. Graham 293-Zellen können für die Vermehrung der Typen 40 und 41 verwendet werden. Der Nachweis der Infektion wird in der Regel durch Immunfluoreszenz oder Enzym-Immunassay (EIA) nachgewiesen, ist jedoch auch durch Komplementfixierungs-, Hämagglutinationshemmungs- und Neutralisations-verfahren möglich (35). Adenovirus-typische zytopathische Effekte (CPE, cytopathic effect) sind als traubenförmige Cluster von abgerundeten, verklumpten Zellen manifestiert. Diese Zellen weisen bei Anfärbung mit Hämatoxylin und Eosin Einschlüsse im Zellkern auf, die nach 3 bis 10 Tagen auftreten (12).

Testprinzip

Das Light Diagnostics™ Respiratory Panel Viral Screening and Identification IFA Kit verwendet ein indirektes Immunfluoreszenzverfahren für den Nachweis eines Virus in infizierten Zellkulturen. Die mitgelieferten monoklonalen Maus-Antikörper werden an das entsprechende Virus-Antigen auf dem Objektträger der Einzelprobe gebunden. Ungebundene Antikörper werden

6

mit PBS (phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) vom Objektträger gewaschen. Anschließend wird ein mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG hinzugefügt, das an den Antigen-Antikörper-Komplex gebunden wird. Ungebundene markierte Antikörper werden mit PBS vom Objektträger gewaschen. FITC weist bei Anregung mit ultraviolettem Licht eine apfelgrüne Fluoreszenz auf; daher kann der Komplex mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Zellfluoreszenz kennzeichnet eine positive Einzelprobe. Nicht infizierte Zellen werden mattrot angefärbt, wegen des Vorhandenseins einer Evans Blue -Gegenfärbung im FITC-markierten sekundären Antikörper. Das Respiratory Viral Screen-Reagenz wird zur Bestätigung des unterschiedslosen Vorhandenseins respiratorischer Viren verwendet. Dann werden zum spezifischen Virusnachweis individuelle monoklonale Antikörper-Reagenzien für Adenovirus, Influenza A & B, Parainfluenza 1, 2, & 3 und RSV eingesetzt.

Kit-Komponenten

1. IFA Identifizierung Reagenz - Sieben (7) x 2 ml Tropffläschchen mit monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen Adenovirus, Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3 und RSV in PBS mit Protein-Stabilisator, und 0,1% Natriumazid (Konservierungsmittel).

5000 Adeno MAB

5001 Flu A MAB

5002 Flu B MAB

5003 Para 1 MAB

5004 Para 2 MAB

5005 Para 3 MAB

5006 RSV MAB

Bereitgestellte Betrag ist ausreichend für 50 Tests. Schätzung basiert auf Tests von 40 ul Tropfen beruhen; tatsächliche Anzahl der Tests können variieren.

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2. Antigen Control Slides - Vier (4) Kontroll-Objektträger, die Vertiefungen mit Zellen für Negativ- und Positivkontrollen enthalten. Jede Positivkontroll-Vertiefung ist mit einem der Folgenden infiziert: Adenovirus, Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3 und RSV. Negativkontroll-Vertiefungen enthalten nicht infizierte Zellen.





3. Respiratory Viral Screen - 5007: Ein 10 ml-Tropffläschchen mit monoklonalen Antikörpern gegen: Adenovirus, Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3 und Respiratory Syncytial Virus in PBS mit Protein-Stabilisator, und 0,1% Natriumazid (Konservierungsmittel). Bereitgestellte Betrag ist ausreichend für 250 Tests. Schätzung basiert auf Tests von 40 ul Tropfen beruhen; tatsächliche Anzahl der Tests können variieren.

4. Normal Mouse Antibody - 5014: Ein 10 ml-Tropffläschchen mit normalem Maus-Antikörper für die Negativkontrolle in PBS mit Protein-Stabilisator, und 0,1% Natriumazid (Konservierungsmittel).

5. Anti-Mouse IgG : FITC Conjugate - 5008: Zwei (2) 10 ml-Tropffläschchen mit FITC-markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG Antikörper in PBS mit 0,02% Evans-Blau-Gegenfärbung, 0,2% BSA und 0,1% Natriumazid (Konservierungsmittel).

6. Phosphate - Buffered Saline (PBS) - 5087: Eine Packung Phosphate Buffered Saline-Salze ergibt nach Auflösen in destilliertem Wasser 1 Liter. In einem sauberen, verschlossenen Behälter bei Raumtemperatur lagern.

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7. Tween® 20 / Sodium Azide Solution (100X) - 5037: Ein 10 ml-Fläschchen mit einem Konzentrat von Polyoxyethylen-Sorbitanmonolaurat (Tween 20) und Natriumazid (NaN3) in PBS 1:100 zu verdünnen.

8. Mounting Fluid - 5013: Ein 10 ml-Tropffläschchen mit Tris-Puffer, Glyzerin, Fluoreszenzverstärker und Natriumazid als Konservierungsmittel. Bei temperatur lagern bei 2ºC - 25ºC.

Zusätzlich erforderliche, nicht mitgelieferte Materialien

1. Zellkultur für die Isolierung von respiratorischen Viren: Jedes Labor muss Vorräte lebensfähiger Zellen in den entsprechenden Übertragungszuständen aufbewahren, die die effiziente Replikation respiratorischer Viren aus verarbeiteten Patientenproben ermöglichen. Diese Zellen müssen in regelmäßigen Abständen auf Eignung für die Anzüchtung respiratorischer Viren überprüft werden. Entsprechende Zelllinien können von der American Type Tissue Culture Collection ATCC® , Manassas, VA, bezogen werden.

2. Virustransportmedium, das sich auf die respiratorischen Viren nicht hemmend auswirkt, sowie die für die Virusisolation verwendeten Gewebekulturzellen: HBBS (Hank's balanced salt solution) mit Antibiotika und einem Proteinstabilisator ist ein geeignetes Medium. Vermeiden Sie den Gebrauch von tierischen Seren als Proteinstabilisator (außer präkolostralem fetalem bovinem Serum, FBS), um die störende Wirkung inhärenter Antikörper zu verhindern.

3. Für die Aufbewahrung nach der Virusinfizierung können Gewebekulturmedien wie RPMI oder Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) mit der entsprechenden Menge an FBS verwendet werden.

4. Sterile Röhrchen für Gewebekulturen, Dram-Fläschchen (1 Dram: 1/8 oz. oder ca. 3,7 ml) oder Platten mit Mehrfachvertiefungen

5. Aceton, 99,5%

Hinweis: Aceton ist hygroskopisch und sollte in dicht verschlossenen Flaschen aufbewahrt werden. Wenn im Aceton Feuchtigkeit vorhanden ist, kann dies während der Fluoreszenzmikroskopie zu einer trüben Darstellung auf dem Substrat führen.

6. Aceton-gereinigte Objektträger aus Glas

7. Sterile Pipetten

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8. Feuchte Kammer

9. Natriumhypochlorit-Lösung (0,05%)

10. Deckgläser Nr. 1

11. Inkubator mit Regelwiderstand für die Temperaturregulierung

12. Sterile Tupfer

13. Zange

14. Fläschchen für die Sammlung und den Transport der Proben

15. Fluoreszenzmikroskop mit entsprechender Filterkombination für FITC (Anregungsmaximum 490 nm, Emissionsmaximum 520 nm)

16. Sterile Glaskügelchen (1-3 mm Durchmesser)

17. Zentrifuge

18. Vortex-Mischer oder Ultraschallgerät

19. Destilliertes Wasser

Stabilität und Lagerung

Bei Lagerung bei 2-8°C ist das Light Diagnostics™ Respiratory Panel Viral Screening and Identification IFA Kit bis zum auf dem Etikett aufgedruckten Verfalldatum stabil. Nicht einfrieren oder hohen Temperaturen aussetzen. Entsorgen Sie alle verbliebenen Reagenzien nach dem Verfalldatum des Kits.

Eine deutliche Abnahme an Fluoreszenz kann auf eine Zersetzung der Konjugate oder Antikörper hindeuten. Mit jeder Gruppe von Einzelproben sollte eine Positivkontrolle getestet werden, um die ordnungsgemäße Funktion dieser Reagenzien und ordnungsgemäße Färbeverfahren zu gewährleisten. Wenn nach entsprechender Analyse eine Abnahme der Färbungsintensität zu verzeichnen ist, verwenden Sie die Reagenzien nicht weiter.

Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen

• Natriumazid (im Konjugat, in den monoklonalen Antikörpern, im PBS/Tween 20 Lösung und im Fixiermedium enthalten) kann mit Blei- oder Kupferrohren zu potenziell explosiven Metallaziden reagieren. Spülen Sie beim Weggießen dieser Materialien mit viel Wasser nach, um die Anlagerung von Aziden zu vermeiden.

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• Das Vermischen oder Verdünnen von Konjugaten oder monoklonalen Antikörpern kann zu falschen Ergebnissen führen.

• Achten Sie darauf, dass die Objektträger während des Färbungsverfahrens nicht trocken werden.

• Behandeln Sie alle Einzelproben und Materialen als potenziell infektiös. Desinfizieren Sie sie vor der Entsorgung mit 0,05-prozentigem Natriumhypochlorit (eine 1:100-Verdünnung handelsüblicher Chlor-Bleichmittel).

• Setzen Sie die Reagenzien während der Lagerung oder Inkubation keinem hellen Licht aus.

• Vermeiden Sie den Kontakt mit Evans Blue (im Anti-Mouse IgG : FITC

Conjugate 5008 enthalten), da es potenziell krebserregend ist. Spülen Sie bei Hautkontakt mit großen Mengen Wasser nach.

• Aceton ist extrem entzündlich und schädlich, wenn es verschluckt oder eingeatmet wird. Von Hitze, Funken oder Flammen fernhalten. Vermeiden Sie das Einatmen der Dämpfe. Sorgen Sie für ausreichende Belüftung.

• Pipettieren Sie Reagenzien nicht mit dem Mund. • Verwenden Sie keine Reagenzien anderer Hersteller. • Eine Änderung des mitgelieferten Protokolls kann falsche Ergebnisse

verursachen. • Vermeiden Sie beim Anfärben mehrerer Proben auf einem Objektträger eine

Kreuzkontaminierung zwischen den Proben. • Mit jedem Zellkultur-Isolat sollte normaler Maus-Antikörper getestet

werden. Eine unspezifische Reaktion wird durch Fluoreszenz gekennzeichnet, und der Test ist ungültig.

• Mounting Fluid 5013 enthält einen Fluoreszenz-Enhancer, der die Schleimhäute angreifen kann. Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit der Haut oder den Schleimhäuten. Wenn ein Kontakt erfolgt, spülen Sie mit großen Mengen Wasser nach.

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Sammlung von Einzelproben

Ordnungsgemäße Verfahren bei Sammlung, Transport, Verarbeitung und Lagerung der Einzelproben sind für die Isolierung und den Nachweis des infizierenden Virus von grundlegender Bedeutung. Bei der Wahl der angemessenen Sammlungstechniken ist eine Kenntnis der Pathogenese der Krankheit erforderlich. Eine einfache Faustregel besteht darin, bei einer Oberflächeninfektion (Haut oder Schleimhaut) Material aus der infizierten Region zu kultivieren. Bei tiefersitzenden oder allgemeinen Infektionen (Ausschläge ohne Bläschenbildung, Meningitis, Enzephalitis, Fieber mit unbekannter Ursache oder Infektionen von Geburt an) sollten Proben an mehreren Stellen genommen werden.

Der Typ der genommenen Einzelproben sowie deren nachfolgende Verarbeitung hängt von der Krankheit und dem nachzuweisenden Virus ab. Detaillierte Informationen über Symptome und Verfahren für die Probensammlung finden Sie in The Manual of Clinical Microbiology, Balows, A. et al., eds. 5th ed. (1991). American Society for Microbiology, Washington, D.C. Adenoviruses, Ch. 86; Respiratory Syncytial Virus, Ch. 83; Influenza Viruses, Ch. 81; Parainfluenza Viruses, Ch. 82; Animal and Animal Cell Culture Systems, Ch. 19.

Entnehmen Sie Informationen über den fachgerechten Transport der Proben dem 42 CFR (Code of Federal Regulations), Part 72.

Probenverarbeitung

Stellen Sie vor der Verarbeitung der Einzelproben sicher, dass diese ordnungsgemäß gesammelt und transportiert wurden. Eine unsachgemäße Behandlung der Einzelproben kann zu falschen Ergebnissen führen.

Waschen Sie bei Verwendung von Absaugungen die Einzelprobe, indem Sie ca. 0,2 bis 0,4 ml des unverdünnten Sekrets mit ca. 2,0 ml kalter PBS mischen. Vortexen Sie die Probe, um die Zellen vom Schleim zu trennen. Fügen Sie 10 ml PBS hinzu, und zentrifugieren Sie bei 200-500 x g für 7-10 Minuten. Saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie das Zellpellet wiederholt, bis der Schleim aus der Probe entfernt ist. Resuspendieren Sie die Zellen im entsprechenden Medium und schließen Sie die Zellen durch Vortexen bzw. mit Ultraschall auf. Zentrifugieren Sie und verwenden Sie den Überstand als Inokulierungsmaterial.

Schütteln Sie bei Nasenrachenraum- oder Rachenabstrichen den Einzelprobenbehälter, um die Zellen vom Abstrich zu trennen. Um möglichst

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viele Zellen zu gewinnen, fügen Sie der Einzelprobe einige sterile Glaskügelchen hinzu und vortexen bzw. behandeln Sie mit Ultraschall bei 8-12 kHz bis zu einer Minute lang. Entsorgen Sie den Abstrichtupfer in Natriumhypochloritlösung. Zentrifugieren Sie die Einzelproben 7-10 Minuten lang bei 200-500 x g. Verwenden Sie den Überstand als Inokulierungsmaterial.

Überprüfen Sie unmittelbar vor der Inokulation von Einzelproben die Zellkulturen auf ordnungsgemäße Morphologie. Spülen Sie die Monolayer mit frischem Medium und saugen Sie ab. Fügen Sie jedem Kulturgefäß 0,2-0,5 ml des Inokulums hinzu. Inokulieren Sie Einzelproben doppelt. Lassen Sie die Kulturgefäße bei 37°C für 30-60 Minuten stehen oder zentrifugieren Sie sie nach Inokulation 30 Minuten lang bei 500-700 x g, und lassen Sie sie bei 37°C für 30 Minuten stehen (dabei sollten entsprechende Kontrollen aufbewahrt werden, um sicherzustellen, dass sich die Zentrifugierung auf die verwendeten Zelllinien nicht nachteilig auswirkt). Bedecken Sie die Kulturen nach dem Inkubationszeitraum mit frischem Aufbewahrungsmedium und inkubieren Sie bei 35-37°C. Erneuern Sie das Zellkulturmedium alle 3-4 Tage.

Untersuchen Sie täglich auf CPE (cytopathic effect, zytopathischer Effekt). Bei Zellkulturen, die der zuvor beschriebenen Adsorption oder Zentrifugierung ausgesetzt wurden, kann ein CPE schon nach 48 Stunden nachgewiesen werden.

Eine Einzelprobe jeder Menge der für die Zellkultur verwendeten Zelllinien sollte mit repräsentativen respiratorischen Virus-Stämmen inokuliert werden, um die Anfälligkeit und die Entwicklung des entsprechenden CPE nachzuweisen. Es sollten außerdem nicht inokulierte Zellkulturen angezüchtet und täglich auf kontaminierende Viren oder Mycoplasma untersucht werden. Dies dient als Kontrolle der normalen Zellmorphologie und kann bei der Erkennung von frühzeitigem CPE hilfreich sein. Nur wenn diese Kontrollzellkulturen ein entsprechendes Wachstum aufweisen, können die Ergebnisse der Zellkulturenisolierung als gültig betrachtet werden.

Entfernen Sie nach der angemessenen Inkubation und/oder bei Beobachtung von CPE > 25% das Medium vom Kulturgefäß. Frieren Sie nicht verwendetes Medium ein, bis alle Tests durchgeführt wurden. Im Falle eines Problems kann dieses Medium zur Virusisolierung verwendet werden. Aus gefrorenen Proben wird möglicherweise erheblich weniger Virus isoliert als aus frischen Proben.

Spülen Sie die Zellkulturen drei Mal behutsam mit 1-2 ml HBSS. Entsorgen Sie alle Spülungen in Natriumhypochloritlösung. Fügen Sie ein Zehntel des Kulturvolumens an Trypsin (0,05%) – Natrium-Äthylendiamintetraessigsäure (ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA-4Na, 0,53 mM) hinzu und lassen Sie das Gefäß für 30 Sekunden stehen. Tippen Sie leicht an das Kulturgefäß, um die

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Zellen zu lösen. Füllen Sie mit frischem Medium bis zum ursprünglichen Volumen auf. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 7-10 Minuten lang bei 200-500 x g. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einigen Tropfen steriler PBS, um eine trübe Suspension zu erhalten. Die Objektträger müssen bei 400facher Vergrößerung mindestens drei Zellen pro Feld aufweisen, um einen hinreichenden Nachweis darzustellen.

Wahlweise können die Zellen in ein kleines Volumen PBS geschabt werden.

Tragen Sie die Zellsuspension punktförmig auf einem Aceton-gereinigten Objektträger auf und lassen Sie sie an der Luft vollständig trocknen. Fixieren Sie den Objektträger in gekühltem Aceton (2-8ºC) für 10 Minuten und lassen Sie ihn an der Luft vollständig trocknen. Lagern Sie unbenutzte Objektträger mit Trocknungsmittel bei -20ºC.

Testverfahren

Vorbereitung der Reagenzien:

PBS/Tween 20 Lösung:

1. Lösen Sie den Inhalt der PBS-Packung in 950 ml deionisiertem Wasser auf.

2. Fügen Sie das Tween 20 / Natriumazid 100x-Konzentrat (10 ml) der PBS hinzu und vermischen Sie gut.

3. Fügen Sie der Mischung destilliertes Wasser hinzu, um 1 Liter zu erhalten. Gießen Sie die Lösung in einen sauberen, etikettierten Aufbewahrungsbehälter und verschließen Sie ihn gut. Alle weiteren Reagenzien werden gebrauchsfertig geliefert.

Empfohlenes Verfahren für Indirekte Immunfluoreszenz (Anfärben):

1. Warten Sie, bis der mit Aceton fixierte Kontroll- und/oder Testobjektträger und die Reagenzien Raumtemperatur angenommen haben.

Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Objektträger während des Färbungs-verfahrens nicht trocken werden.

Hinweis: Zuerst sollte mit dem Respiratory Viral Screen das Vorhandensein eines respiratorischen Virus bestätigt werden. Positive Einzelproben sollten dann zum spezifischen Nachweis mit monoklonalen Antikörpern auf individuelle Viren getestet werden.

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2. Fügen Sie ausreichend Respiratory Virus Screen 5007 bzw. spezifischen Nachweis-Antikörper oder normalen Maus-Antikörper (Reagenz für Negativkontrolle) hinzu, so dass die Zellen bedeckt sind: Bei Zellauftrag 1 Tropfen und bei Shell-Vials 4-6 Tropfen.

3. Inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang bei 37ºC in einer feuchten Kammer.

4. Spülen Sie den Objektträger behutsam mit einer Spritzflasche, die PBS/Tween 20 -Lösung enthält, 10-15 Sekunden lang, um die überschüssige monoklonale Antikörperlösung zu entfernen, und achten Sie darauf, dass der Strahl nicht auf die Vertiefung trifft. Bei Shell-Vials: Saugen Sie das Reagenz aus dem Vial ab und waschen Sie jedes Shell-Vial 3 Mal mit 1 ml PBS/Tween 20 -Lösung.

5. Platzieren Sie den Objektträger in einer Färbewanne oder einem Coplin-Färbetrog (mit Objektträgergestell oder entsprechender Vorrichtung) und bedecken Sie ihn mit PBS. Spülen Sie 5-10 Minuten lang 2-3 Mal. Rühren Sie behutsam mit einem Magnetrührstab oder schütteln Sie per Hand.

6. Schütteln Sie überschüssige PBS/Tween 20 -Lösung vom Objektträger ab und trocknen Sie den Bereich um den Zellauftrag sorgfältig.

7. Fügen Sie ausreichend FITC-markiertes Anti-Mouse IgG Conjugate

5008 oder ein äquivalentes Produkt hinzu, so dass die Zellen bedeckt sind: Bei Zellauftrag 1 Tropfen und bei Shell-Vials 4-6 Tropfen.

8. Wiederholen Sie die Schritte 3-6.

9. Decken Sie das Produkt unter einem Deckglas mit wässrigem Mounting

Medium pH 8,5 5013 oder äquivalentes Produkt ein. Bei Shell-Vials: Saugen Sie das PBS/Tween aus den Shell-Vials ab. Heben Sie jedes Deckglas mit einer gebogenen Nadel an, die an einer kleinen Spritze angebracht ist, und entfernen es mit einer Zange. Legen Sie jedes Deckglas MIT DER ZELLENSEITE NACH UNTEN auf einen gläsernen Objektträger mit Mounting Fluid.

10. Wischen Sie überschüssiges Eindeckmittel von den Rändern des Objektträgers ab.

Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, lesen Sie die Objektträger direkt nach der Färbung. Wenn die Objektträger nach dem

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Anfärben gelagert werden sollen, lagern Sie sie bei 2-8°C in einem sicheren Behälter in Dunkelheit.

11. Untersuchen Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 100-200facher Vergrößerung auf Zellen, die Fluoreszenz aufweisen. Eine detaillierte Untersuchung kann bei einer 400fachen Vergrößerung ausgeführt werden.

Hinweis: Die Leistung des Fluoreszenzmikroskops ist zum Erzielen befriedigender Testergebnisse von entscheidender Bedeutung. Da sich Objektive, Lampenstärke, Wattzahlen und Filter auf die Ergebnisse auswirken können, wird durch eine Positivkontrolle die Funktion von Reagenzien, der Kulturmethodologie und des Mikroskops überprüft.

Interpretation der Ergebnisse

Die Art des Färbungsmusters hängt von dem infizierenden Virus ab und spiegelt das Wachstumsmuster des Virus wieder. Die typischen Färbungsmuster, die bei respiratorischen Viren bekannt sind, sind unten dargestellt:

Respiratory syncytial virus (RSV)

Fluoreszenz zeigt sich im Zytoplasma und ist mit Synzytien assoziiert. Die Färbung des Zytoplasmas ist punktiert mit kleinen Einschlüssen.

Influenza A und B Fluoreszenz liegt im Kern, im Zytoplasma oder in beidem vor. Die Färbung des Zellkerns ist gleichförmig hell. Die Färbung des Zytoplasmas ist oftmals punktiert mit großen Einschlüssen.

Parainfluenza Typen 1, 2 und 3 Fluoreszenz ist auf das Zytoplasma beschränkt. Die Färbung des Zytoplasmas ist punktiert mit unregelmäßigen Einschlüssen.

Adenovirus Fluoreszenz liegt im Kern, im Zytoplasma oder in beidem vor. Die Färbung des Zellkerns ist gleichförmig hell. Die Färbung des Zytoplasmas ist oftmals punktiert.

Negative Zellen

Untersuchen Sie zuerst die Kontroll-Objektträger auf die entsprechende Färbung. Die Positivkontrolle sollte Zellen ergeben, die je nach dem

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Wachstumsstadium eine Fluoreszenz des Zellkerns, des Zytoplasmas oder beidem aufweisen. Die Zellen der Negativprobe sollten aufgrund der Evans Blue -Gegenfärbung eine mattrote Färbung aufweisen. Die Zellen weisen eine mattrote Färbung des Zytoplasmas und eine tief kastanienbraune bis beinahe schwarze Färbung im Zellkern auf. Die Färbung in diesen Zellen beruht auf dem Vorhandensein von Evans Blue in der Gegenfärbung.

Es bietet sich an, die negativen Zellen vor den positiven Zellen zu untersuchen, um zu bestimmen, ob eine Hintergrundfärbung vorliegt. Eine positive Färbung für ein Virus liegt dann vor, wenn bei 400facher Vergrößerung pro Feld mindestens zwei intakte Zellen vorhanden sind, die den oben beschriebenen Fluoreszenztyp aufweisen.

Vorsicht:

Eine fluoreszente Färbung von Zellfragmenten, oft dadurch bedingt, dass das Konjugat in solchen Zerfallsprodukten gefangen wird, sollte ignoriert werden. Wenn die Positiv- und Negativkontrollen nicht deutlich unterschieden werden können, ist der Test ungültig und sollte wiederholt werden. Ein negatives Ergebnis schließt das Vorhandensein von Adenovirus, RSV, Influenza A oder B sowie der Parainfluenza-Virustypen 1, 2 oder 3 nicht aus. Das negative Ergebnis kann durch eine Vielzahl von Faktoren verursacht worden sein, z. B.: unzulängliche Proben, nicht ordnungsgemäße Sammlung und Behandlung von Proben, falsche Kulturtechniken, Verwendung ungeeigneter Zelllinien oder Temperaturen während der Isolierung oder andere Faktoren, die im Abschnitt „Einschränkungen“ erwähnt werden. Alle negativen Ergebnisse sollten als „Kein Virus beobachtet“ berichtet werden.

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Einschränkungen • Der ordnungsgemäße Transport wie auch die nachfolgende Verarbeitung der

Einzelproben sind bei der Kulturisolierung von entscheidender Bedeutung. Ein negatives Ergebnis schließt daher das Vorhandensein einer Virusinfektion nicht aus. Ergebnisse sollten sorgfältig und im Hinblick auf die klinische Evaluierung des Patienten sowie andere diagnostische Tests interpretiert werden.

• Positiv- und Negativkontrollen sollten mit jeder Einzelprobe getestet werden und müssen die entsprechende Färbung aufweisen, damit der Test gültig ist.

• Eine perinukleäre und/oder diffuse zytoplasmische Färbung kann wegen einer unspezifischen Antikörperbindung aufgrund des Vorhandenseins des Fc-Rezeptors in mit Herpes-Virus infizierten Zellen auftreten (36).

• Mit Staphylococcus aureus verunreinigte Proben können aufgrund des Vorhandenseins großer Mengen an Protein A eine matte gelb-grüne Fluoreszenz aufweisen. Die Fluoreszenz ergibt sich aus einer unspezifischen Bindung von Protein A an Antikörper-Fc-Fragmente.

• Die monoklonalen Antikörper in diesem Kit sind für Adenovirus und RSV gruppenspezifisch und können daher nicht zur Unterscheidung von Typen eingesetzt werden.

Erwartete Werte

Die Ergebnisse sind je nach sozioökonomischen Status, Alter der Bevölkerung, geographischem Standort, Jahreszeit (manche Viren sind saisonal) und Behandlung der Einzelproben unterschiedlich. Es wurden insgesamt 646 Proben in zwei Umgebungen an der Ostküste, drei Orten im Süden und zwei im Mittleren Westen, wie auch an drei Standorten an der Westküste getestet. Die Umgebung umfasste Krankenhäuser, Kinderkrankenhäuser, Universitäten und Referenzlabors. Auswertungen von September 1991 bis Juli 1992 ergaben die folgenden Erkennungsraten: Adenovirus: 6,7% (43/646); RSV: 10,2% (66/646); Influenza A: 1,7% (11/646); Influenza B: 0,6% (4/646); Parainfluenza 1: 1,7% (11/646); Parainfluenza 2: 0,8% (5/646); Parainfluenza 3: 4,3% (28/646).

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Spezifische Leistungsmerkmale Kreuzreaktionsanalyse

Die folgenden Ergebnisse wurden aus Studien für die Virus- und Bakterienerkennung mit dem jeweiligen monoklonalen Antikörper gewonnen. Kulturen der American Type Tissue Culture Collection ATCC® , Manassas, VA sind nach Stammnummer gekennzeichnet. Die angegebenen Prototypen wurden durch die Centers for Disease Control, Atlanta, GA isoliert. Die restlichen Kulturen waren, wenn nicht anders angegeben, klinische Isolate.

MONOKLONALE ANTIKÖRPER:

Adeno RSV Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Adenoviren: Prototypen von Typ 1-47; plus 30 aktuelle klinische Isolate der Typen 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 und 37

+ - - - - - -

Polyomaviren: SV-40 - - - - - - - Herpes-Viren: Jeweils 2 klinische Isolate der Herpes-Typen 1 u. 2, HSV-1 ATCC VR733, HSV-2 ATCC VR734; jeweils 1 klinisches Isolat von CMV und VZV

- - - - - - -

Echo-Viren: Klinische Isolate der Typen 1, 4, 6, 9, 11, 30, 33, Echo-27-Prototyp, Polio-2-Prototyp

- - - - - - -

Coxsackie-Virus: A14-Prototyp, A24var (4 Isolate), B4 (2 Isolate)

- - - - - - -

Enterovirus 70: 4 Isolate - - - - - - - Rhinoviren: 6 Isolate - - - - - - - Corona-Viren: OC43- u. 229E-Prototypen

- - - - - - -

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Adeno RSV Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Influenza-Virus Typ A: Jeweils 2 Isolate von A/Leningrad/360/86 u. A/Philippines/2/82; Subtyp H3N2-Stämme: A/Victoria/3/75 - 7-Isolate, A/Texas/1/77 - 1 Isolat, A/England/496/80 - 2 Isolate, A/England/X/82 - 12 Isolate; Subtyp H1N1-Stämme: A/USSR/90/77 - 2 Isolate, A/England/333/80 - 1 Isolat; Subtypen H3N2 u. H1N1 alle Stämme - 25 Isolate

- - + - - - -

Influenza-Virus Typ B: 2 Isolate von B/USSR/100/83; 14 Isolate von B/Singapore/222/79

- - - + - - -

Parainfluenza-Virus: Typ 1-Prototyp u. 6 neue Isolate

- - - - + - -


- - - - - + -


- - - - - - +

Parainfluenza-Virus: Typ 4A- bzw. 4B-Prototyp u. jeweils 6 neue Isolate

- - - - - - -

Mumps-Virus: Prototyp, 6 Isolate, u. CDC V5004

- - - - - - -

Masern-Virus: Edmonston-Stamm; CDC V4009

- - - - - - -

Simian-Virus: 5 u. 41 Referenzstämme

- - - - - - -

RSV: Long-, A2-, 18537-, V1680E- u. V670-Referenzstämme; 30 neue Isolate von Stämmen der Gruppe 1 (Long-förmig); 30 Isolate von Stämmen der Gruppe 2 (18537-förmig)

- + - - - - -

Acholeplasma laidlawii: ATCC 23206

- - - - - - -

Bordetella bronchiseptica: ATCC 10580

- - - - - - -

Bordetella pertussis: ATCC 9340

- - - - - - -

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Adeno RSV Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Bordetella parapertussis: ATCC 15237

- - - - - - -

Branhamella catarrhalis: ATCC 25238

- - - - - - -

Chlamydia trachomatis: Syva

- - - - - - -

Corynebacterium diptheriae: ATCC 13812

- - - - - - -

Legionella micdadei: ATCC 33204

- - - - - - -

Legionella pneumophila: CDC-BC 1640

- - - - - - -

Mycobacterium avium: klinisch

- - - - - - -

Mycobacterium intracellularae: klinisch

- - - - - - -

Mycobacterium tuberculosis: klinisch

- - - - - - -

Mycoplasma fermentans: ATCC 19989

- - - - - - -

Mycoplasma hominis: ATCC 23114

- - - - - - -

Mycoplasma orale: ATCC 23714

- - - - - - -

Mycoplasma pneumoniae: klinisch

- - - - - - -

Neisseria meningitidis: ATCC 13077

- - - - - - -

Ureaplasma urealyticum: ATCC 27618

- - - - - - -

Wirtszellen-Kontrollen:

Alle monoklonalen Antikörper wurden bezüglich der folgenden Zellkontrollen negativ getestet:

Adenovirus Zellkontrollen für pHEK, HEp-2, NCI-H292, RD, HLF, HeLa u. A549

Polyomaviren PMK-Zellkontrolle Enteroviren RD- u. HLF-Zellkontrollen Paramyxoviren Zellkontrollen für HEp-2, Vero u. PMK

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Klinischer Vergleich für die Zellkulturbestätigung Zellkulturbestätigungen von respiratorischen Einzelproben wurden in sieben, über die USA verteilten klinischen Laboratorien getestet, um das Light Diagnostics™ Respiratory Panel Viral Screening and Identification IFA Kit mit anderen in vitro-Diagnosekits zu vergleichen. Die Ergebnisse sind im Folgenden aufgeführt:


Adeno RSV Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Echt positiv 43 66 11 4 11 5 28 Falsch positiv 0 0 0 0 0 0 0 Echt negativ 602 580 635 642 635 641 618 Falsch negativ 1 0 0 0 0 0 0 Sensitivität (%) 97,7 100 100 100 100 100 100 Spezifität (%) 100 100 100 100 100 100 100 Prognostizierter Wert positiv % 100 100 100 100 100 100 100 Prognostizierter Wert negativ % 99,8 100 100 100 100 100 100

Zellkulturbestätigungen von respiratorischen Einzelproben aus Gefrierlagerung wurden in sieben, über die USA verteilten klinischen Laboratorien getestet, um das Light Diagnostics™ Respiratory Panel Viral Screening and Identification IFA Kit mit anderen in vitro-Diagnosekits zu vergleichen. Die Ergebnisse sind im Folgenden aufgeführt:


Adeno RSV Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Echt positiv 7 3 30 36 33 5 16 Falsch positiv 0 0 0 0 0 0 0 Echt negativ 144 148 121 115 118 146 135 Falsch negativ 0 0 0 0 0 0 0 Sensitivität (%) 100 100 100 100 100 100 100 Spezifität (%) 100 100 100 100 100 100 100 Prognostizierter Wert positiv %) 100 100 100 100 100 100 100 Prognostizierter Wert negativ (%) 100 100 100 100 100 100 100

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Problembehandlung

Die Vorbereitung der Proben hängt von der jeweils verwendeten Methode ab und kann sich auf die erzielten Ergebnisse auswirken. Um Fragen zur Leistungsfähigkeit zu beantworten, müssen alle Schritte des Verfahrens analysiert werden.

Eine deutliche Reduzierung der Fluoreszenz kann folgende Ursachen haben:

1) Reagenzzerfall

2) Mikroskopische Probleme

3) Auswirkung anderer Geräte oder Methoden

• Das Ablaufdatum aller verwendeten Reagenzien überprüfen.

• Wenn das Ablaufdatum eines Reagenz nicht überschritten wurde, die Mikroskopleistung überprüfen und die die Positivkontrolle erneut lesen.

• Wenn die Ursache des Problems weiterhin nicht gefunden werden kann, die Arbeitsweise der gesamten Ausstattung anhand der Beipackzettel überprüfen und den Test erneut durchführen.

Für zusätzliche technische Hilfe wenden Sie sich bitte an den Technischen Kundendienst von EMD Millipore Corporation. Ihre nächstgelegene Niederlassung finden Sie online unter: www.millipore.com/offices.

Die Abschnitte bezüglich der literaturen referenzen diese Beipackzettel zur Light Diagnostics IVD sind nur in den vollständigen englischsprachigen Versionen aufgeführt. Bitte entnehmen Sie diesen Versionen die produkt-spezifischen Details.

http://www.millipore.com/offices

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Glossar der Symbole

Symbole Verwendet für Symbole Verwendet für

Katalog-Nummer

DIE Nutzung durch JJJJ-MM-DD oder YYYY-MM

Fabrikant

Autorisierte Vertretung in der Europ äischen Gemeinschaft

Achtung, Beglitdokumente

Inhalausreichhend fü r<n>ansätze

In-vitro-Diagnostikum

Temperaturbegrenzung

Gebrauchsanweisung beachten

BiologiskenRisiken

Kontrolle

Negative Kontrolle

Positive Kontrolle

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GEWÄHRLEISTUNG UND HAFTUNG 1. Nur die Produkteigenschaften, welche von Millipore in den maßgeblichen Spezifikationen auf der Website (www.millipore.com) veröffentlicht wurden, gelten als die vertraglich vereinbarte Beschaffenheitsmerkmale der verkauften Waren. Andere öffentliche Aussagen von Millipore über die Produkteigenschaften, insbesondere in der Werbung, sind nicht Bestandteil der vertraglich vereinbarten Beschaffenheitsmerkmale der verkauften Waren. Die Gewährleistung entfällt, wenn die Ware nicht gemäß den Vorgaben hierfür eingesetzt wurde. Die Ansprüche des Kunden wegen eines Mangels verjähren innerhalb von einem Jahr ab dem gesetzlichen Verjährungsbeginn. Jegliche weitergehende Gewährleistung wird ausgeschlossen. 2. Der Kunde hat die Ware bei Anlieferung unverzüglich gemäß § 377 HGB zu untersuchen. Der Kunde hat etwaige offensichtliche Mängel zum Erhalt der Gewährleistungsansprüche unverzüglich, spätestens bis zum Ablauf des 3. Werktages nach Anlieferung, schriftlich Millipore und, sofern der Mangel auch auf dem Transport aufgetreten sein kann, auch dem Frachtführer anzuzeigen. Fehlende Ware ist entsprechend spätestens binnen 10 Kalendertagen ab Rechnungsdatum anzuzeigen. 3. Außer im Falle einer berechtigten Rückabwicklung des Vertrages darf der Kunde Waren nicht ohne ausdrückliche schriftliche Zustimmung von Millipore zurücksenden. 4. Millipore haftet nicht für eine Wertminderung der vom Kunden erworbenen Ware aufgrund unzureichender Aufbewahrungsbedingungen. Der Kunde verpflichtet sich diesbezüglich, die Spezifikationen, Nutzungs- und Lagerbedingungen der relevanten Ware zu berücksichtigen. Bei Nichtbeachtung dieser Spezifikationen, Nutzungs- und Lagerbedingungen ist eine Gewährleistung von Millipore ausgeschlossen. 5. Sofern dem Kunden ein gesetzlicher Anspruch auf Nacherfüllung zusteht, kann Millipore als Nacherfüllung nach eigener Wahl die Beseitigung des Mangels oder die Lieferung einer mangelfreien Sache anbieten. Bei form- und fristgerecht vorgebrachten, sachlich gerechtfertigten Beanstandungen und Fehlschlagen der Nacherfüllung hat der Kunde das Recht, angemessene Kaufpreisminderung zu verlangen, vorbehaltlich des Rechts von Millipore, stattdessen die bemängelte Ware zurückzunehmen und den Kaufpreis zu erstatten. Schadenersatzansprüche des Kunden wegen eines Sachmangels sind ausgeschlossen, es sei denn, es liegt einer der in Abs. 7 genannten Fälle vor. 6.Gewährleistungsansprüche des Kunden gegen Millipore bestehen nicht im Falle: fehlerhafter Installation, Nutzung oder Wartung der Waren entgegen den entsprechenden Vorgaben von Millipore; normaler Abnutzung der Waren oder aufgrund fehlender ordnungsgemäßer Wartung. Gewährleistungsansprüche des Kunden bestehen ebenfalls nicht im Falle eines unerheblichen Mangels. 7. Millipore haftet bei Vorsatz oder grober Fahrlässigkeit unbeschränkt. Ebenfalls unbeschränkt haftet Millipore im Falle einer fahrlässigen Pflichtverletzung, sofern Ansprüche aus der Verletzung des Lebens, des Körpers oder der Gesundheit betroffen sind. Im Übrigen haftet Millipore bei einfacher Fahrlässigkeit nur, wenn eine wesentliche Vertragspflicht verletzt worden ist. In diesem Fall ist die Haftung von Millipore auf einen Höchstbetrag, der dem Kaufpreis entspricht, und auf solche Schäden begrenzt, mit deren Eintritt bei Vertragsschluss vernünftigerweise zu rechnen war. Die Haftung von Millipore für Verzug wird bei einfacher Fahrlässigkeit ganz ausgeschlossen. Eine Haftung von Millipore nach den Vorschriften des Produkthaftungsgesetztes, wegen Arglist oder einer Garantie bleibt unberührt. 8. Millipore haftet nicht für Verlust oder Beschädigung der Waren auf dem Transport. Der Kunde hat hieraus resultierende Schadensersatzansprüche gegen den Frachtführer zu richten.

Tween® ist eine eingetragene Marke von ICI Americas, Inc. ATCC® ist eine Marke der American Type Culture Collection Corporation. 2019 EMD Millipore Corporation, eine Sparte der Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland. Alle Rechte vorbehalten. EMD, EMD Millipore, Millipore, der Markierung M, Light Diagnostics und alle anderen Marken, sofern nicht ausdrücklich oben im Text identifiziert, wie die Zugehörigkeit zu einer dritten Partei, von der Firma Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland gehört.




KIT IFA PANEL PER SCREENING E IDENTIFICAZIONE DEI VIRUS

RESPIRATORI Identificazione qualitativa di adenovirus, dei

virus influenzali di tipo A e B, dei virus parainfluenzali di tipo 1, 2 , 3, e del virus respiratorio sinciziale

Supplemento Italiano Di Lingua

3105

1 x 250, 7 x 50

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Uso previsto

Il Kit IFA Panel per Screening and Identificazione dei Virus Respiratori de Light Diagnostics™ è concepito per uso diagnostico in vitro nella conferma diagnostica qualitativa mediante coltura di adenovirus, virus influenzali di tipo A e B, virus parainfluenzali di tipo 1, 2 e 3 e VRS (respiratory syncytial virus, virus respiratorio sinciziale).

Sunto e spiegazione

I virus respiratori sono responsabili di una parte significativa di malattie delle popolazioni umane. Certi virus (ad esempio, i virus influenzali) sono stagionali mentre altri (ad esempio, gli adenovirus) colpiscono in prevalenza gruppi d'età diverse. In una data popolazione, i virus respiratori possono essere responsabili di un tasso notevole di morbilità. L'avvento di una terapia antivirale adeguata contro certi virus respiratori rende essenziale un metodo di screening rapido per l'identificazione di tali organismi, permettendo di stabilire una terapia precoce. Gli agenti antivirali più usati oggi sono l'amantadina e la rimantadina per il virus influenzale di tipo A e la ribavirina per la bronchiolite da VRS. Entrambi gli agenti hanno vari meccanismi d'azione benché la maggior parte di questi comporti delle fasi d'infezione precoce come la penetrazione o l'uncoating.(41, 63) A concentrazioni fisiologicamente raggiungibili, l'amantadina e la rimantadina inibiscono in modo specifico la replicazione del virus influenzale di tipo A.(13) La ribavirina ha un ampio spettro d'azione in vitro contro una moltitudine di virus quali VRS, morbillo, virus influenzali di tipo A e B e virus parainfluenzali.(46, 47, 53)

I due metodi d'identificazione virale più diffusi sono: l'isolamento in coltura con successiva conferma e il rilevamento diretto. L'isolamento in coltura con successiva conferma è il metodo standard in molti laboratori ed è il metodo più sensibile disponibile per il rilevamento dei virus respiratori. Il Kit IFA Panel per Screening and Identificazione dei Virus Respiratori de Light Diagnostics™fa uso di anticorpi monoclonali per la conferma diagnostica in coltura per fornire in soli 60 minuti risultati chiari e facili da interpretare.

All'età di 2 anni la maggior parte dei bambini ha già sofferto di un'infezione da VRS, rendendolo la causa virale più importante di malattie delle vie respiratorie inferiori dell'infanzia.(64) L'infezione da VRS in genere porta a raffreddori con rinorrea profusa, ma la prima volta che l'infezione colpisce bambini di età

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compresa fra 6 settimane e 6 mesi, il 25-40% di questi manifesterà malattie delle vie respiratorie inferiori.(64) Nella maggior parte delle zone studiate, l'VRS risultò responsabile di un maggior numero di casi di polmoniti e bronchioliti rispetto a tutti gli altri patogeni microbici.(48) La ricerca suggerisce che la polmonite e la bronchiolite da VRS nell'infanzia possono portare ad anomalie respiratorie a lungo termine, quali una funzionalità polmonare anomala e asma oltre a tosse e bronchiti ricorrenti.(52) L'VRS è anche stato coinvolto nella SIDS (sudden infant death syndrome, sindrome della morte improvvisa del neonato), benché non si sia determinata la natura di questa associazione.(58)

L'VRS appartiene alla famiglia dei Paramyxoviridae e al genere Pneumovirus. È un virus pleiomorfo con envelope, diametro variabile da 150-300 nm (5, 31, 34) e RNA a filamento singolo.(64)

L'VRS può essere riconosciuto mediante immunofluorescenza, EIA, neutralizzazione o isolamento in coltura con successiva conferma.(21, 32, 49) Esistono varie linee cellulari idonee alla coltura dell'VRS. Per un isolamento primario, HEp-2 (33) o HeLa (34) sono linee cellulari accettabili benché si siano usati altri simili, come ad esempio Vero, LLC MK-2 o CV-l. Il virus produce gli effetti citopatici caratteristici quali la formazione di sincizi e la distruzione cellulare.(48)

I virus influenzali provocano malattie respiratorie altamente contagiose che portano tipicamente all'insorgenza di epidemie.(27) La specificità dei tre tipi A, B e C è conferita dalla nucleoproteina interna e dagli antigeni della proteina della matrice.(40)

Le infezioni da virus influenzali negli adulti portano tipicamente alla tracheobronchite e al coinvolgimento delle piccole vie aeree (43, 66) con possibile insorgenza di riniti e/o faringiti. La manifestazione clinica dell'infezione può tuttavia variare dall'assenza di sintomatologia ad una polmonite mortale.(25) Lo stesso spettro di risposte cliniche è riscontrabile nei bambini, con delle differenze precise. La febbre può essere più alta nei bambini e può essere accompagnata da convulsioni.(23, 24, 62, 70, 71) I virus influenzali sono responsabili del 14% delle febbri dell'infanzia con sintomi a carico dell'apparato respiratorio abbastanza seri da giustificare il ricorso a cure mediche.(23, 71) I bambini soffrono di un maggior coinvolgimento gastrointestinale degli adulti(14) e sono affetti da miosite, otite media e crup con maggior frequenza.(28, 38) Le infezioni neonatali possono portare a febbre inspiegata (50) e sono potenzialmente mortali.(1, 18, 50, 59) Le malattie delle vie respiratorie inferiori associate all'infezione influenzale nei bambini e negli adulti si manifestano con tre forme di polmonite: polmonite virale primaria, polmonite virale-batterica combinata ed infezione influenzale seguita dalla

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polmonite batterica.(54) Le risposte cliniche non polmonari all'infezione da virus influenzali comprendono viremia, coinvolgimento cardiaco e del sistema nervoso centrale, sindrome di Reyes e shock tossico.(54)

I virus influenzali di tipo A e B portano fondamentalmente lo stesso spettro di malattie. Tuttavia, le infezioni da tipo A portano ad un'ospedalizzazione circa quattro volte superiore di quelle da tipo B,(38) mentre il tipo B più comunemente provoca miositi e coinvolgimento gastrointestinale.(11, 16, 37, 42)

Il virus influenzale di tipo C raramente porta malattie delle vie respiratorie inferiori ma provoca malattie delle vie respiratorie superiori sporadiche.(19, 38, 51) In età adulta quasi tutti gli individui sono muniti di anticorpi contro il tipo C.(57)

I virus influenzali appartengono alla famiglia degli Orthomyxoviridae. Sono pleiomorfi, enveloped e contengono un RNA segmentato, a filamento singolo e di senso negativo. Il loro diametro può variare da 80 a 120 nm.(40)

L'aggiunta della tripsina rende possibile la coltura dei virus influenzali in varie linee cellulari quali MDCK (Madin-Darby canine kidney, rene canino Madin-Darby), carcinoma polmonare A549 e PMK (primary monkey kidney, rene primario di scimmia) (20, 65) oltre alle classiche uova embrionate di gallina o al sistema allantoina su guscio.(17)

È possibile riconoscere i virus influenzali mediante metodiche d'immunofluorescenza, di emoadsorbimento o di emoagglutinazione usando eritrociti di pollo o di cavia. L'isolamento/coltura con successiva conferma forniscono una metodica d'identificazione facile, sensibile e abbastanza rapida delle infezioni influenzali. L'effetto citopatico si manifesta 3-7 giorni dopo l'inoculazione sotto forma di vacuolizzazione e di degenerazione cellulare.

I virus parainfluenzali associati all'VRS sono i patogeni più significativi delle vie respiratorie superiori nei lattanti e nei bambini più piccoli.(4, 6, 7, 39) Sono stati identificati quattro tipi di virus parainfluenzali nei bambini e negli adulti. I tipi 1 e 2 sono le principali cause di laringotracheobronchiti (crup). La gravità della malattia è maggiore nei bambini di età compresa fra 2 e 4 anni.(67) L'infezione da virus parainfluenzale di tipo 3 può portare a crup, ma è risaputo che il tipo 3 è superato solo dall'VRS come causa di bronchioliti e polmoniti infantili.(8, 9, 25, 60, 61) La malattia da infezione di tipo 3 è più grave nei lattanti sotto l'anno di età.(67)

Nei bambini più grandi e negli adulti, la malattia può essere asintomatica oppure imitare il raffreddore comune.(68) Il crup acuto nei lattanti e nei bambini piccoli

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può portare ad un'iperattività bronchiale nei bambini più grandi e negli adolescenti in seguito all'esercizio fisico. Tuttavia resta da definire se l'iperattività bronchiale fosse una condizione preesistente che ha avuto qualche ruolo nella patogenesi del crup o se si sviluppa come complicazione del crup grave.(26, 44)

Il virus parainfluenzale di tipo 4 è stato associato solo con una lieve malattia delle vie respiratorie superiori negli adulti e nei bambini ed è di difficile riconoscimento nelle colture cellulari.(67)

I virus parainfluenzali appartengono al genere Paramyxovirus della famiglia dei Paramyxoviridae. Sono virus enveloped con un RNA a filamento singolo, polarità negativa e diametro variabile da 150 a 200 nm.(10) I virus parainfluenzali crescono bene nelle linee cellulari primarie di scimmia, nel rene umano e nell'LLC-MK2, una linea cellulare eteroploide di rene di scimmia Rhesus.(20) La tripsina è necessaria nel terreno di coltura per il riconoscimento dei tipi 1 e 2 ma non del tipo 3. È possibile riconoscere le infezioni virali delle colture di tessuto dall'emoadsorbimento degli eritrociti di cavia. I tipi 2 e 3 sono riconoscibili dalla formazione di sincizi.

Gli adenovirus sono responsabili di un numero significativo di malattie respiratorie cliniche. Le malattie delle vie respiratorie superiori provocate dagli adenovirus comprendono raffreddori, faringiti e tonsilliti e si presentano soprattutto nei lattanti e nei bambini più piccoli. Circa il 10% delle polmoniti infantili è probabilmente dovuto agli adenovirus.(45) Altre malattie delle vie respiratorie inferiori dovute agli adenovirus comprendono bronchiti e bronchioliti.(29) Nei bambini sotto i 5 anni, l'adenovirus è responsabile di circa il 5% dei casi di ARD (acute respiratory disease, malattie respiratorie acute). L'ARD si può manifestare con congestione nasale, rinite acuta, tosse e talvolta con tonsilliti, febbre e mialgie. La comparsa della congiuntivite unitamente all'ARD costituisce la febbre faringocongiuntivale.(3) L'adenovirus è comunemente stato associato alla sindrome della pertosse, ma studi recenti suggeriscono che la presenza degli adenovirus in questi casi possa essere una riattivazione di un virus latente nel tessuto tonsillare durante infezioni da Bordetella pertussis.(55)

Le malattie oculari causate da infezioni da adenovirus comprendono EKC (epidemic keratoconjunctivitis, cheratocongiuntiviti epidemiche), congiuntivite emorragica acuta e congiuntivite follicolare acuta. L'adenovirus è associato a varie patologie gastrointestinali e si manifesta probabilmente nel 7-17% di tutte le gastroenteriti dell'infanzia. I tipi 40 e 41 sono stati associati a diarrea e

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gastroenterite acuta.(15, 22, 69) Il virus è anche stato associato ad intussuscezione,(2) cistite emorragica acuta (56) e meningoencefalite.

Gli studi dimostrano che l'incidenza d'infezioni da adenovirus in pazienti immunocompromessi probabilmente non è più alta che negli individui normali. Tuttavia la gravità e la possibilità di morte possono essere maggiori.(30)

Gli adenovirus umani appartengono alla famiglia degli Adenoviridae, genere Mastadenovirus. Sono virus icosaedrici, non-enveloped con DNA a doppio filamento ed un diametro variabile da 70 a 90 nm.(29) Hanno un rivestimento proteico di capsomeri da 240 esoni e da 12 pentoni.

Gli adenovirus possono essere coltivati e isolati in varie linee cellulari e identificati mediante svariate metodiche. Le linee cellulari idonee comprendono HEp-2, HeLa, KB:A549 e HEK. È possibile utilizzare le cellule Graham 293 per la propagazione dei tipi 40 e 41. L'infezione viene in genere confermata dall'immunofluorescenza o dall'EIA (enzyme immunoassay, dosaggio immunoenzimatico), ma può esserlo pure mediante metodiche di fissazione del complemento, inibizione dell'emoagglutinazione e neutralizzazione.(35) I CPE (cytopathic effects, effetti citopatici) tipici degli adenovirus si manifestano con la comparsa di raggruppamenti di cellule arrotondate refrattarie disposte a grappolo d'uva. Quando sono colorate con ematossilina-eosina queste cellule presentano inclusioni intranucleari che compaiono in 3 - 10 giorni.(12)

Principi del test

Il Kit Kit IFA Panel per Screening and Identificazione dei Virus Respiratori de Light Diagnostics™utilizza la metodica de l'immunofluorescenza indiretta per identificare i virus nelle colture cellulari infette. Gli anticorpi monoclonali di topo forniti si legheranno all'antigene virale specifico del campione sul vetrino. Gli anticorpi non legati vengono lavati dal vetrino con il PBS (phosphate buffered saline, soluzione salina tampone fosfato). Questo è seguito dall'aggiunta di IgG antimurine di capra marcate con FITC (fluorescein isothiocyanate, isotiocianato di fluoresceina) che si legheranno al complesso antigene-anticorpo. Gli anticorpi marcati non legati si lavano dal vetrino con il PBS. FITC presenta una fluorescenza verde mela quando viene eccitato dalla luce a raggi UV, permettendo di visualizzare il complesso mediante microscopia a fluorescenza. La fluorescenza cellulare indica un campione positivo. Le cellule non infette si colorano di un rosso pallido a causa della presenza del colorante di contrasto di Evans Blue nell'anticorpo secondario marcato con FITC. Il Respiratory Viral Screen reagent viene usato per confermare la presenza non differenziata dei virus respiratori. Gli adenovirus singoli, i virus influenzali di tipo A e B, quelli

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parainfluenzali 1, 2 e 3 e i reagenti anticorpali monoclonali dell'VRS vengono poi utilizzati nell'identificazione specifica dei virus.

Componenti del Kit

1. Reagenti IFA Identificazione - Sette (7) flaconi contagocce da 2 ml contenenti anticorpi monoclonali contro: adenovirus, virus influenzali A e B, virus parainfluenzali 1, 2 e 3 e VRS in PBS con una proteina stabilizzante, e lo 0,1% di sodio azide (conservante).

5000 Adeno MAB

5001 Flu A MAB

5002 Flu B MAB

5003 Para 1 MAB

5004 Para 2 MAB

5005 Para 3 MAB

5006 RSV MAB Importo previsto è sufficiente per 50 tests. Stima si basa su prove di caduta di 40μL; il numero effettivo dei tests possono variare.

2. Antigen Control Slides - Quattro (4) vetrini di controllo contenenti pozzetti con cellule di controllo positive e negative. Un pozzetto di controllo positivo viene infettato con quanto segue: adenovirus, virus influenzali A e B, virus parainfluenzali di tipo 1, 2 e 3 ed VRS. I pozzetti di controllo negativi contengono cellule non infette.




5012 Respiratory Syncytial Virus Control Slide

3. Respiratory Viral Screen 5007: Un flacone contagocce da 10 ml contenente anticorpi monoclonali contro: adenovirus, virus influenzali di tipo A e B, virus parainfluenzali 1, 2 e 3 e VRS in PBS con una proteina stabilizzante, e lo 0,1% di sodio azide (conservante).

Importo previsto è sufficiente per 250 tests. Stima si basa su prove di caduta di 40μL; il numero effettivo dei tests possono variare.

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4. Normal Mouse Antibody 5014: Un flacone contagocce da 10 ml contenente anticorpi normali di topo da usare come controllo negativo in PBS con una proteina stabilizzante, e lo 0,1% di sodio azide (conservante).

5. Anti-Mouse IgG : FITC Conjugate 5008: Due (2) flaconi contagocce da 10 ml contenenti FITC marcato con IgG antimurine di capra in PBS con 0,02% del colorante di contrasto blu di Evans, 0,2% di BSA e 0,1% di sodio azide come conservante.

6. Phosphate - Buffered Saline (PBS) 5087: Una confezione di sali di soluzione fisiologica tampone fosfato rende 1 litro quando viene sciolta in acqua distillata. Conservare a temperatura ambiente in un contenitore pulito e chiuso.

7. Tween® 20 / Sodium Azide Solution (100X) 5037: Un flacone da 10 ml contenente concentrato Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate, monolaurato di poliossietilene sorbitano) e sodio azide (NaN3) da diluire 1:100 in PBS.

8. Mounting Fluid 5013: Un flacone contagocce da 10 ml contenente glicerina in tampone tris, un amplificatore della fluorescenza e sodio azide come conservante. Conservare a temperatura entre 2ºC - 25ºC.

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Materiali necessari, ma non forniti

1. Coltura cellulare per l'isolamento dei virus respiratori: ciascun laboratorio deve mantenere scorte di cellule vitali in una fase e condizioni tali da permettere l'efficiente replicazione dei virus respiratori da campioni prelevati da pazienti e trattati. Si deve controllare periodicamente la capacità di queste cellule di sostenere la crescita dei virus respiratori. Si possono ottenere linee cellulari idonee dalla American Type Tissue Culture Collection ATCC® , Manassas, VA.

2. Un mezzo di trasporto virale per l'isolamento virale, che non inibisca i virus respiratori e le cellule delle colture di tessuto usate: HBSS (Hank's balanced salt solution, soluzione salina equilibrata di Hank) con antibiotici e una proteina stabilizzante è un mezzo idoneo. Evitare l'uso di siero animale, eccetto l'FBS (fetal bovine serum, siero fetale bovino) prelevato prima della formazione del colostro, come proteina stabilizzante per evitare interferenze da parte di anticorpi intrinseci.

3. Si possono usare terreni di coltura dei tessuti come RPMI o EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) con l'adeguata quantità di FBS per il mantenimento dopo l'infezione virale.

4. Provette sterili per la coltura di tessuto, flaconi da 3,6 ml o piastre con multipozzetti.

5. Acetone al 99,5%

Nota: l'acetone è igroscopico e va conservato in bottiglie ben chiuse. La presenza di umidità nell'acetone può portare ad un aspetto indistinto del substrato durante l'esame al microscopio a fluorescenza.

6. Vetrini puliti con acetone

7. Pipette sterili

8. Camera umida

9. Soluzione d'ipoclorito di sodio (0,05%)

10. N. 1 vetro copri oggetti

11. Incubatore munito di reostato per la regolazione della temperatura

12. Tamponi sterili

13. Pinze

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14. Flaconi per la raccolta e il trasporto di campioni

15. Microscopio a fluorescenza con l'adeguata combinazione di filtri per FITC (picco d'eccitazione 490 nm, picco d'emissione 520 nm)

16. Perle sterili di vetro (1-3 mm di diametro)

17. Centrifuga

18. Miscelatore a vortice o sonicatore

19. Acqua distillata

Stabilità e conservazione Se conservato a 2-8 °C, il Kit IFA Panel per Screening and Identificazione dei Virus Respiratori de Light Diagnostics™ rimane stabile fino alla data di scadenza stampata sull'etichetta del kit. Non congelare né esporre a temperature elevate. Eliminare tutti i reagenti rimasti dopo la data di scadenza del kit.

Un marcato calo nella fluorescenza può indicare il deterioramento del coniugato o dell'anticorpo. È necessario testare un controllo positivo con un gruppo di campioni per assicurare il corretto funzionamento di questi reagenti e corrette procedure di colorazione. Se, dopo un'adeguata analisi, si nota un calo nell'intensità della colorazione, sospendere l'uso dei reagenti.

Avvertenze e precauzioni

• La sodio azide (presente nel coniugato, negli anticorpi monoclonali, nel PBS/Tween 20 soluzione e nel liquido di montaggio) può reagire con tubature in piombo o rame formando azidi di metallo potenzialmente esplosive. Quando si smaltiscono questi materiali, far scorrere abbondante acqua per evitare che l'azide si depositi.

• I coniugati per il pool o per la diluizione e gli anticorpi monoclonali possono dare risultati errati.

• Non lasciare che i vetrini si asciughino durante la procedura di colorazione. • Trattare tutti i campioni e i materiali come se fossero potenzialmente

infettivi. Decontaminare con ipoclorito di sodio allo 0,05% (diluizione 1:100 di candeggina per uso domestico) prima di eliminare.

• Non esporre i reagenti a luci intense durante la conservazione o l'incubazione.

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• Evitare il contatto con Evans Blue (presente nell'IgG anti-mouse: FITC

Conjugate 5008), essendo un potenziale carcinogeno. In caso di contatto con la pelle, lavare con abbondante acqua.

• L'acetone è estremamente infiammabile e dannoso se ingerito o inalato. Tenere lontano da calore, scintille o fiamme. Evitare di respirarne i vapori. Ventilare in modo adeguato.

• Non pipettare mai i reagenti con la bocca. • Non sostituire con reagenti di altri produttori. • Modifiche al protocollo fornito possono dare risultati errati. • Quando si colorano campioni multipli su un vetrino, evitare la

contaminazione crociata fra i campioni stessi. • L'anticorpo normale di topo deve essere testato con ciascun isolato delle

colture cellulari. La fluorescenza indica una reazione aspecifica ed il test è da considerarsi non valido.

• Il liquido di supporto (Mounting Fluid 5013) contiene un potenziatore di fluorescenza che può distruggere le membrane della mucosa. Evitare il contatto diretto con la pelle o le membrane della mucosa. Se c'è contatto, far scorrere grandi quantità di acqua sulla parte.

Raccolta dei campioni

L'adeguata raccolta di campioni, trasporto, trattamento e conservazione sono d'importanza fondamentale nell'isolamento e successiva conferma del virus infettante. La scelta di un'adeguata tecnica di raccolta richiede conoscenze sulla patogenesi della malattia. Secondo una regola semplice, quando un'infezione è superficiale (pelle o membrane mucose), si raccoglie il materiale di coltura dall'area infetta. Nelle infezioni a localizzazione profonda o in quelle generalizzate in natura (eruzioni cutanee non vescicolari, meningiti, encefaliti, febbri d'origine sconosciuta o infezioni congenite) è consigliabile saggiare più siti.

Il tipo di campione raccolto e il suo successivo trattamento dipendono dalla malattia e dal virus da riconoscere. Informazioni dettagliate sui sintomi e sulle tecniche di raccolta dei campioni sono reperibili nel The Manual of Clinical Microbiology, Balows, A. et al., eds. 5th ed. (1991). American Society for Microbiology, Washington, D.C. Adenoviruses, Ch. 86; Respiratory Syncytial

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Virus, Ch. 83; Influenza Viruses, Ch. 81; Parainfluenza Viruses, Ch. 82; Animal and Animal Cell Culture Systems, Ch. 19.

Per il trasporto adeguato dei campioni consultare il 42 CFR (code of federal regulations, codice dei regolamenti federali), parte 72.

Trattamento dei campioni

Prima di trattare i campioni accertarsi che siano stati raccolti e trasportati in modo adeguato. Il trattamento improprio dei campioni può dare risultati errati.

Nell'uso di aspirati, lavare il campione miscelando circa 0,2 a 0,4 ml di secreto non diluito con circa 2,0 ml di PBS freddo. Far vorticare il campione per staccare le cellule dal muco. Aggiungere 10 ml di PBS e centrifugare a 200-500 x g per 7-10 minuti. Aspirare il sopranatante e ripetere il lavaggio del grumo di cellule finché il muco non viene rimosso dal campione. Risospendere le cellule nell'adeguato mezzo e far vorticare o sonicare per disgregare le cellule. Centrifugare e usare il sopranatante come materiale d'inoculazione.

Per tamponi nasofaringei o faringo-tonsillari, agitare il contenitore del campione per staccare le cellule dal tampone. Per aumentare il recupero cellulare, aggiungere poche perle sterili di vetro al campione e far vorticare o sonicare a 8-12 kc/sec per 1 minuto. Eliminare il tampone in una soluzione d'ipoclorito di sodio. Centrifugare il campione a 200-500 x g per 7-10 minuti. Usare il sopranatante come materiale d'inoculazione.

Poco prima d'inoculare i campioni, esaminare le colture cellulari per verificare la corretta morfologia. Lavare il monostrato con un terreno fresco e aspirare. Aggiungere 0,2-0,5 ml dell'inoculato a ciascun recipiente da coltura. Fare una duplice inoculazione dei campioni. Lasciare riposare a 37 °C per 30-60 minuti o, dopo l'inoculazione, centrifugare i recipienti della coltura per 30 minuti a 500-700 x g e lasciar riposare a 37 °C per 30 minuti (si devono mantenere controlli adeguati per assicurarsi che la centrifugazione non abbia alcun effetto dannoso sulle linee cellulari). Dopo il periodo d'incubazione, coprire le colture con un terreno di mantenimento fresco e incubare a 35-37 °C. Rinnovare il terreno di coltura cellulare ogni 3-4 giorni.

Esaminare ogni giorno per verificare eventuali CPE (cytopathic effect, effetti citopatici). Le colture cellulari soggette all'assorbimento o alla centrifugazione, come descritto sopra, possono presentare CPE persino dopo 48 ore.

Un campione di ciascun lotto delle linee cellulari usate per la coltura cellulare deve essere inoculato con ceppi di virus respiratori rappresentativi per

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dimostrarne la suscettibilità e l'insorgenza dell'adeguato CPE. Vanno anche cresciute ed esaminate quotidianamente colture cellulari non inoculate per eventuali virus contaminanti o micoplasma. Ciò agirà da controllo della normale morfologia cellulare e può essere utile per il rilevamento di CPE. Se queste colture cellulari di controllo non mostrano una crescita appropriata, i risultati dell'isolamento della coltura cellulare devono essere considerati non validi.

Dopo un adeguato periodo d'incubazione e/o in seguito all'osservazione di CPE >25%, rimuovere il terreno dal recipiente di coltura. Congelare il terreno non utilizzato fino alla conclusione delle analisi. Nell'eventualità di un qualche problema, si potrà tentare l'isolamento virale da questo terreno. L'isolamento virale da campioni congelati può essere drasticamente inferiore a quello da campioni freschi.

Lavare delicatamente la coltura cellulare tre volte con 1-2 ml di HBSS. Eliminare tutti i risciacqui in una soluzione di ipoclorito di sodio. Aggiungere tripsina corrispondente ad un decimo del volume originario della coltura (0,05%), EDTA-4Na (sodium ethylenediamine tetraacetic acid, sodio di acido etilendiammino-tetracetico) (0,53 mM) e lasciar riposare per 30 secondi. Dare leggeri colpetti sul recipiente di coltura per sciogliere le cellule. Aggiungere un terreno fresco per portare al volume originario. Centrifugare la sospensione cellulare a 200-500 x g per 7-10 minuti. Risospendere il grumo di cellule in varie gocce di PBS sterile per ottenere una sospensione torbida. I vetrini devono presentare almeno tre cellule per campo a 400 x d'ingrandimento per essere ritenuti idonei per il rilevamento.

In alternativa, le cellule possono essere raschiate e immesse in una piccola quantità di PBS.

Punteggiare la sospensione cellulare su un vetrino pulito con acetone e lasciare asciugare completamente all'aria. Fissare il vetrino con acetone freddo (2-8 °C) per 10 minuti e far asciugare all'aria. Conservare i vetrini inutilizzati con un agente essiccante a -20 C.

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Procedura di test

Preparazione del reagente:

Soluzione PBS/Tween 20

1. Sciogliere il contenuto della confezione di PBS in 950 ml di acqua deionizzata.

2. Aggiungere il concentrato Tween 20/sodio azide 100X (10 ml) al PBS e miscelare bene.

3. Aggiungere acqua distillata alla miscela per preparare 1 litro. Trasferirlo in un contenitore da conservazione pulito ed etichettato e chiudere bene. Tutti gli altri reagenti sono forniti pronti per l'uso.

Procedura di immunofluorescenza (colorazione) indiretta consigliata:

1. Lasciare che il vetrino di controllo fissato con l'acetone e/o il vetrino per il test e i reagenti si equilibrino a temperatura ambiente.

Nota: non lasciare che i vetrini si asciughino durante la procedura di colorazione.

Nota: usare prima il Respiratory Viral Screen per confermare la presenza di un virus respiratorio. Per il riconoscimento specifico è necessario poi testare i campioni positivi con anticorpi monoclonali contro i virus singoli.

2. Aggiungere la quantità necessaria di Respiratory Virus Screen 5007, di un anticorpo di riconoscimento specifico o di normali anticorpi di topo (reagente di controllo negativo) per coprire le cellule; 1 goccia per ogni macchia cellulare e 4-6 gocce per shell vial.

3. Incubare il vetrino alla temperatura di 37 °C per 30 minuti nella camera umida.

4. Sciacquare delicatamente il vetrino con una bottiglia a siringa di Soluzione PBS/Tween 20 per 10-15 secondi per rimuovere l'eccesso di soluzione di anticorpo monoclonale, facendo attenzione a dirigere il getto lontano dal pozzetto. Per le shell vial: aspirare il reagente dalla fiala e lavare delicatamente ciascuna shell vial per 3 volte con 1 ml di PBS/Tween 20 soluzione.

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5. Mettere il vetrino in una vaschetta per colorazione o vaschetta Coplin (con portavetrino o equivalente) e coprire con PBS. Sciacquare 2-3 volte per 5-10 minuti. Agitare delicatamente con una frusta magnetica o a mano.

6. Eliminare il PBS/Tween 20 soluzione in eccesso dal vetrino e asciugare bene l'area che circonda la macchia cellulare.

7. Aggiungere la quantità necessaria di FITC-labeled Anti-Mouse IgG

Conjugate 5008 o un equivalenteper coprire le cellule. 1 goccia per macchia cellulare e 4-6 gocce per le shell vial.

8. Ripetere le fasi da 3 a 6.

9. Montare sotto un vetro copri oggetti usando un mezzo di supporto acquoso

a pH 8,5 5013 o un equivalente. Per le shell vial: aspirare il PBS/Tween dalle shell vial. Sollevare ciascun vetro copri oggetto con un ago piegato fissato ad una piccola siringa e rimuoverlo con attenzione con pinze. Montare ciascun vetro copri oggetti con il LATO DELLA CELLULA VERSO IL BASSO su un vetrino di vetro con fluido di supporto.

10. Asciugare il fluido in eccesso dal bordo del vetrino.

Nota: per i migliori risultati, leggere i vetrini immediatamente dopo la colorazione. Se i vetrini devono essere conservati dopo la colorazione, tenere alla temperatura di 2-8°C, in un contenitore sicuro, al buio.

11. Esaminare i vetrini, usando un microscopio a fluorescenza a 100-200x per eventuali cellule che mostrino fluorescenza. Un esame dettagliato può essere fatto ad ingrandimento di 400x.

Nota: la performance del microscopio a fluorescenza è di importanza cruciale per ottenere risultati del test soddisfacenti. Poiché obiettivi, intensità e numero di watt della lampada e filtri possono influenzare i risultati, l'uso di un controllo positivo verificherà il funzionamento dei reagenti, la metodologia della coltura e il microscopio.

Interpretazione dei risultati

Il pattern di colorazione dipende dal virus infettante e riflette il pattern di crescita del virus stesso. Segue la descrizione dei tipici pattern di colorazione osservati nei virus respiratori.

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VRS (respiratory syncytial virus, virus respiratorio sinciziale)

La fluorescenza si osserva nel citoplasma e associata ai sincizi. La colorazione citoplasmatica è punteggiata di piccole inclusioni.

Virus influenzali di tipo A e B La fluorescenza può essere nucleare, citoplasmatica o entrambe le cose. La colorazione del nucleo presenta una luminosità uniforme. La colorazione citoplasmatica è spesso punteggiata di grandi inclusioni.

Virus parainfluenzali di tipo 1, 2 e 3 La fluorescenza è limitata al citoplasma. La colorazione citoplasmatica è punteggiata di inclusioni a forma irregolare.

Adenovirus La fluorescenza può essere nucleare, citoplasmatica o entrambe le cose. La colorazione del nucleo presenta una luminosità uniforme. La colorazione citoplasmatica è spesso punteggiata.

Cellule negative

Esaminare prima il vetrino di controllo se la colorazione è idonea. Il controllo positivo deve presentare cellule aventi una fluorescenza nucleare, citoplasmatica o entrambe a seconda della fase di crescita. Il controllo negativo deve evidenziare cellule che si colorano di un rosso pallido con il colorante di contrasto Evans Blue Le cellule presentano un citoplasma rosso pallido e un nucleo rosso cupo quasi nero. La colorazione di queste cellule si deve alla presenza del Evans Blue nel colorante di contrasto.

È utile esaminare le cellule negative prima di quelle positive per stabilire se è presente un'eventuale colorazione di fondo. La colorazione positiva per un virus consiste nella presenza di almeno due o più cellule intatte per campo a 400 x d'ingrandimento, che presentano il tipo di fluorescenza descritta sopra.

Avvertenza: la colorazione a fluorescenza di frammenti cellulari, spesso dovuta a coniugato intrappolato in questi detriti, va ignorata. Se non è possibile distinguere chiaramente i controlli positivi e negativi, il test è da ritenersi non valido e da rifare. Un risultato negativo non esclude la presenza di adenovirus, VRS, virus influenzali di tipo A e B e virus parainfluenzali di tipo 1, 2 e 3. Il risultato negativo può essere dovuto a vari fattori quali: un campione inadeguato, una inadeguata procedura di raccolta e trattamento dei campioni, una tecnica di coltura inadeguata, l'uso di linee cellulari o di temperature non

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idonee durante l'isolamento o i fattori descritti alla voce “Limitazioni”. Tutti i risultati negativi vanno riportati come “nessun virus osservato”.

Limitazioni

• Il trasporto adeguato e il successivo trattamento dei campioni è di importanza fondamentale nell'isolamento delle colture. Quindi un risultato negativo non esclude la presenza di un'infezione virale. I risultati vanno interpretati con attenzione per quanto riguarda la valutazione clinica di pazienti o di altri test diagnostici.

• I controlli positivi e negativi devono essere analizzati con ciascun campione e devono presentare la colorazione adeguata perché il test sia valido.

• Una colorazione perinucleare e/o diffusa del citoplasma potrebbe essere dovuta ad un legame anticorpale aspecifico a causa della presenza del recettore Fc nelle cellule infettate coi virus erpetici.(36)

• Campioni contaminati con Staphylococcus aureus potrebbero presentare una fluorescenza giallo-verde pallida a causa della presenza di grandi quantità di proteina A. La fluorescenza è dovuta al legame aspecifico fra proteina A e frammenti anticorpali Fc.

• Gli anticorpi monoclonali presenti in questo kit sono gruppo specifici per gli adenovirus e l'VRS, per cui non si possono usare per la tipizzazione.

Valori previsti

I risultati possono variare a seconda dello stato socioeconomico, dell'età della popolazione, del sito geografico, del tempo dell'anno (alcuni virus sono stagionali) e del trattamento dei campioni. Un totale di 646 campioni furono testati in due aree lungo la costa orientale, tre aree nel sud, due nel midwest e tre lungo la costa occidentale. Queste aree comprendevano ospedali, ospedali pediatrici, università e laboratori di riferimento. Le valutazioni dal settembre 1991 al luglio 1992 hanno portato agli indici di rilevamento indicati di seguito. Adenovirus: 6,7% (43/646); VRS: 10,2% (66/646); Influenza A: 1,7% (11/646); Influenza B: 0,6% (4/646); Parainfluenza 1: 1,7% (11/646); Parainfluenza 2: 0,8% (5/646); Parainfluenza 3: 4,3% (28/646).

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Caratteristiche specifiche della performance

Analisi della reattività crociata

I seguenti risultati si ottennero da studi di riconoscimento virale e batterico eseguiti con ciascun anticorpo monoclonale. Le colture della American Type Tissue Culture Collection ATCC® , Manassas, VA sono identificate dal numero del ceppo. I prototipi indicati furono isolati dai Centers for Disease Control, Atlanta, GA. Le colture restanti erano degli isolati clinici, se non si è specificato diversamente.

ANTICORPI MONOCLONALI:

Adeno VRS Influenza A

Influenza B

Para 1

Para 2

Para 3

Adenovirus Prototipi dei tipi 1-47; + 30 isolati clinici recenti dei tipi 1,2,3,4,5, 7,8,37

+ - - - - - -

Poliomavirus SV-40 - - - - - - - Herpes virus 2 isolati clinici ciascuno di Herpes virus di tipo 1 & 2, HSV-1 ATCC VR733, HSV-2 ATCC VR734; 1 isolato clinico ciascuno di CMV e VZV.

- - - - - - -

Echovirus Isolati clinici dei tipi 1,4,6,9, 11,30,33, prototipo dell'Echo-27, prototipo del Polio-2

- - - - - - -

Virus coxsackie Prototipo A14, A24var (4 isolati), B4 (2 isolati)

- - - - - - -

Enterovirus 70 4 isolati - - - - - - - Rinovirus 6 isolati - - - - - - - Coronavirus Prototipi OC43 e 229E

- - - - - - -

18



Influenza B

Para 1

Para 2

Para 3

Virus influenzale di tipo A 2 isolati ciascuno di ceppi A/Leningrad/ 360/86 & A/Philippines/2/82; sottotipo H3N2: A/Victoria/3/75 -7 isolati, A/Texas/1/77 - 1 isolato, A/England/496/80 - 2 isolati, A/England/X/82 -12 isolati; sottotipo dei ceppi H1N1: A/England/90/77 - 2 isolati, A/England/X/333/80 - 1 isolato; sottotipi H3N2 e H1N1 tutti i ceppi - 25 isolati

- - + - - - -

Virus influenzale di tipo B 2 isolati di B/USSR/100/83; 14 isolati di B/ Singapore/222/79

- - - + - - -

Virus parainfluenzali Prototipo di tipo 1 e 6 isolati recenti

- - - - + - -


- - - - - + -


- - - - - - +

Virus parainfluenzali Tipo 4A, prototipo di tipo 4B e 6 isolati recenti

- - - - - - -

Virus della parotite Prototipo, 6 isolati e CDC V5004

- - - - - - -

Virus del morbillo Ceppo Edmonston; CDC V4009

- - - - - - -

Virus della scimmia Ceppi di riferimento 5 e 41

- - - - - - -

RSV Ceppi di riferimento Long, A2, 18537, V1680E e V670; 30 isolati recenti di ceppi di gruppo 1 (simil -Long); 30 isolati di ceppi di gruppo 2 (simil-18537)

- + - - - - -

Acholeplasma laidlawii ATCC 23206

- - - - - - -

Bordetella bronchiseptica ATCC 10580

- - - - - - -

Bordetella pertussis ATCC 9340

- - - - - - -

19



Influenza B

Para 1

Para 2

Para 3

Bordetella parapertussis ATCC 15237

- - - - - - -

Branhamella catarrhalis ATCC 25238

- - - - - - -

Chlamydia trachomatis Syva

- - - - - - -

Corynebacterium diptheriae ATCC 13812

- - - - - - -

Legionella micdadei ATCC 33204

- - - - - - -

Legionella pneumophila CDC-BC 1640

- - - - - - -

Mycobacterium avium Clinico

- - - - - - -

Mycobacterium intracellularae Clinico

- - - - - - -

Mycobacterium tuberculosis Clinico

- - - - - - -

Mycoplasma fermentans ATCC 19989

- - - - - - -

Mycoplasma hominis ATCC 23114

- - - - - - -

Mycoplasma orale ATCC 23714

- - - - - - -

Mycoplasma pneumoniae Clinico

- - - - - - -

Neisseria meningitidis ATCC 13077

- - - - - - -

Ureaplasma urealyticum ATCC 27618

- - - - - - -

Controlli delle cellule ospite:

Tutti gli anticorpi monoclonali si sono dimostrati negativi nei controlli cellulari descritti di seguito.

Adenovirus Controlli cellulari pHEK, HEp-2, NCI-H292, RD, HLF, HeLa e A549

Poliomavirus Controllo cellulare PMK Enterovirus Controlli cellulari RD & HLF Paramyxovirus Controlli cellulari HEp-2, Vero e PMK

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Comparazione clinica per confermare la coltura cellulare

La conferma della coltura cellulare di campioni respiratori è stata testata in sette laboratori clinici distribuiti negli USA paragonando il Kit IFA Panel per Screening and Identificazione dei Virus Respiratori de Light Diagnostics™ad altri kit diagnostici in vitro. Di seguito sono riportati i risultati.


Adeno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Vero positivo 43 66 11 4 11 5 28 Falso positivo 0 0 0 0 0 0 0 Vero negativo 602 580 635 642 635 641 618 Falso negativo 1 0 0 0 0 0 0 Sensibilità (%) 97,7 100 100 100 100 100 100 Specificità (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valore positivo previsto % 100 100 100 100 100 100 100 Valore negativo previsto % 99,8 100 100 100 100 100 100

La conferma della coltura cellulare di campioni respiratori conservati congelati è stata testata in sette laboratori clinici distribuiti negli USA paragonando il Kit IFA Panel per Screening and Identificazione de los Virus Respiratorios de Light Diagnostics™ ad altri kit diagnostici in vitro. Di seguito sono riportati i risultati.


Adeno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Vero positivo 7 3 30 36 33 5 16 Falso positivo 0 0 0 0 0 0 0 Vero negativo 144 148 121 115 118 146 135 Falso negativo 0 0 0 0 0 0 0 Sensibilità (%) 100 100 100 100 100 100 100 Specificità (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valore positivo previsto % 100 100 100 100 100 100 100 Valore negativo previsto % 100 100 100 100 100 100 100

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Ricerca e risoluzione dei problemi

La preparazione dei campioni dipende dalla tecnica e può influenzare i risultati finali. Per risolvere eventuali problemi relativi alle prestazioni, è necessario analizzare tutte le fasi del processo.

Una notevole riduzione della fluorescenza può indicare:

1) Il deterioramento del reagente

2) Un problema al microscopio

3) L'effetto di un altro strumento o tecnica.

• Verificare la data di scadenza di tutti i reagenti usati.

• Se i reagenti non sono scaduti, verificare la prestazione del microscopio; rileggere il controllo positivo.

• Se il problema non è ancora stabilito, verificare tutto il funzionamento della strumentazione secondo quanto riportato sulle confezioni e ripetere il test.

Per ulteriore supporto, contattare l’Assistenza tecnica EMD Millipore Corporation. L’indirizzo della sede EMD Millipore Corporation più vicina è disponibile c/o www.millipore.com/offices.

I riferimenti bibliografici di questi foglietti illustrativi per prodotti IVD della Light Diagnostics™ sono solo nella versione inglese. Consultare tale versione per i dettagli specifici.

http://www.millipore.com/offices

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Glossario dei simboli

Symboli Utilizzato per Symboli Utilizzato per

Numero di catalogo

Uso dea parte AAAA-MM-GG o AAAA-MM

Fabbricante

Representante autorizzato della Communità europea

Attenzione, consultar la documentazione allegata

Contenuto sufficient per < n > test

Nel dispositivo medico-diagnostico in vitro

Temperature limite

Consultare leistruzion per l’uso

Rischi biologici

Controllo

Controllo negativo

Controllo positivo

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GARANZIE E LIMITAZIONI DELLA RESPONSABILITÀ 1. Millipore garantisce che i suoi Prodotti sono conformi alle specifiche indicate nel sito ad essi riferibili, purché utilizzati secondo le istruzioni applicabili, per un periodo di un anno dalla spedizione dei Prodotti. Millipore non fornisce, espressamente o tacitamente, alcuna ulteriore garanzia. 2. Il Cliente è tenuto a controllare i Prodotti al momento della consegna. Qualunque riserva in relazione a difetti evidenti per causa imputabile a Millipore , deve essere comunicata immediatamente per iscritto al corriere e tramite lettera raccomandata a Millipore , al massimo entro tre (3) giorni lavorativi dal ricevimento ovvero, in caso di mancata consegna dei Prodotti, entro i dieci (10) giorni di calendario successivi alla data di fatturazione. 3. L’eventuale restituzione dei Prodotti dovrà avvenire solamente con il preventivo consenso di Millipore , e secondo le modalità dalla stessa stabilite. Eventuali restituzioni dei Prodotti senza il preventivo consenso di Millipore non saranno accreditate al Cliente. 4. Millipore non risponderà del deterioramento dei Prodotti acquistati dal Cliente dovuto alle inadeguate condizioni di stoccaggio. A tal fine, il Cliente si impegna a rispettare le specifiche e le condizioni d’uso di tali Prodotti. In caso di inadempimento a tale obbligo, non sarà applicabile alcuna garanzia fornita da Millipore. 5. Nel caso di violazione della suddetta garanzia, Millipore sarà esclusivamente obbligata a riparare o sostituire, a sua discrezione, il Prodotto in questione o una parte dello stesso. Nel caso in cui, in seguito a sforzi ragionevoli, Millipore non fosse in grado di riparare o sostituire il Prodotto o parte del Prodotto, Millipore dovrà restituire al Cliente tutte le somme versate per tale Prodotto o parte del Prodotto. 6. In generale, le garanzie cui Millipore è di regola tenuta, non si applicano in caso di: installazione, uso o manutenzione scorrette dei Prodotti, eseguiti in violazione delle istruzioni fornite da Millipore. normale usura dei Prodotti o mancanza di conservazione o manutenzione adeguata. 7. Millipore non risponderà di ogni eventuale danno indiretto - quali il danno commerciale, la perdita della clientela, la perdita delle Ordinazioni, il danno alle cose o al marchio - che dovessero essere subiti da chiunque in relazione all’uso dei Prodotti. 8. Eventuali danni ai Prodotti o la perdita dei Prodotti dovuti al trasporto non comportano la responsabilità di Millipore . Ogni richiesta in relazione a detti danni o perdita dovrà essere inoltrata dal Cliente al corriere. 9. Eventuali azioni promosse nei confronti del Cliente da parte di terzi costituiscono danni indiretti e pertanto non danno luogo a risarcimento. 10. In ogni caso, eventuali multe o sanzioni imputabili a Millipore , nell’ipotesi in cui sia accertata una responsabilità di quest’ultima, sono limitate alle somme effettivamente versate a Millipore dal Cliente per l’acquisto originario del Prodotto che ha dato luogo alla responsabilità di Millipore.

Tween® è un marchio registrato di ICI Americas, Inc. ATCC® è un marchio di American Type Culture Collection. 2019 EMD Millipore Corporation. una divisione di Merck KGaA, Darmstadt, Germany. Tutti i diritti riservati. Nessuna parte di queste opere può essere riprodotta in alcuna forma senza permesso scritto. EMD, EMD Millipore, Millipore, M marca, Light Diagnostics è un marchio registrato di Merck KGaA, Darmstadt, Germany.




TROUSSE IFA PANEL POUR DEPISTAGE ET IDENTIFICATION

DES VIRUS RESPIRATOIRES

Identification qualitative de l'adénovirus, l'influenza A & B, le parainfluenza de type 1, 2, 3, et

le virus respiratoire syncytial

Supplément Français De Langue

3105

1 x 250, 7 x 50

1

Application

La Trousse IFA Panel pour Depistage et Identification des Virus Respiratoires de Light Diagnostics™ est destinée au diagnostic in vitro en matière de confirmation bactériologique qualitative d'adénovirus, influenza A, influenza B, parainfluenza 1, parainfluenza 2, parainfluenza 3, et du virus respiratoire syncytial (VRS).

Résumé et explication

Les virus respiratoires sont responsables d'une grande partie des maladies chez les populations humaines. Certains virus (par ex. l'influenza) sont saisonniers alors que d'autres (par ex. l'adénovirus) touchent principalement des groupes d'âge différents. Chez une population donnée, les virus respiratoires peuvent être responsables d'un taux de morbidité considérable. La venue d'un traitement antiviral approprié contre certains virus respiratoires rend impératif le dépistage rapide pour l'identification de ces organismes, et permet l'institution précoce d'un traitement. Les deux agents antiviraux les plus utilisés aujourd'hui sont l'amantadine / la rimantadine pour l'influenza A, et la ribavirine pour la bronchiolite ou le VRS. Les deux agents ont des modes d'action différents bien que la plupart impliquent des étapes d'infection précoce telles que la pénétration ou le « déshabillage » (41, 63). Lorsqu'elles ont des concentrations à portée physiologiquement réalisable, l'amantadine et la rimantadine inhibent en particulier la réplication de l'influenza A (13). La ribavirine dispose d'un spectre activité in vitro très large contre toute une série de virus tels que le VRS, la rougeole, l'influenza A et B, et la parainfluenza (46, 47, 53).

Les deux modes d'identification des virus couramment utilisés sont : l'isolement en culture / la confirmation bactériologique et le dépistage direct. L'isolement en culture / la confirmation bactériologique est la méthode de référence de la plupart des laboratoires, et la méthode la plus sensible qui existe pour le dépistage des virus respiratoires. La Trousse IFA Panel pour Depistage et Identification des Virus Respiratoires de Light Diagnostics™ utilise des anticorps monoclonaux pour la confirmation bactériologique, qui permet de fournir des résultats clairs et faciles à interpréter en 60 minutes seulement.

A l'âge de 2 ans, la plupart des enfants ont été exposés à l'infection à virus respiratoire syncytial (VRS), ce qui en fait la cause virale la plus importante d'infection des voies respiratoires inférieures chez les enfants (64). L'infection à

2

VRS entraîne généralement des rhumes accompagnés de rhinorrhée abondante, mais parmi les nourrissons âgés de 6 semaines à 6 mois sujets à une première infection, 25 à 40 % développent une infection des voies respiratoires inférieures (64). Dans la plupart des domaines recherchés, le VRS était responsable de plus de pneumonies et bronchiolites que tous les autres pathogènes microbiens (48). Les études suggèrent que la pneumonie et la bronchiolite dues au VRS chez l'enfant peuvent entraîner des anomalies respiratoires à long terme, telles qu'une fonction pulmonaire anormale, de l'asthme, des rhumes et des bronchites récurrents (52). Le VRS a également été impliqué dans le syndrome de mort soudaine du nourrisson (MSN), bien que la nature de l'association soit indéterminée (58).

Le VRS appartient à la famille des Paramyxoviridae et au genre Pneumovirus. C'est un virus pléomorphe de 150 à 300 nm de diamètre protégé par une enveloppe (5, 31, 34), qui comporte un génome constitué d'ARN simple brin (64).

Le VRS peut être dépisté par immunofluorescence, immunoenzymunologie, neutralisation, ou isolement en culture et confirmation bactériologique (21, 32, 49). Diverses lignées cellulaires conviennent à la mise en culture du VRS. Pour un premier isolement, les lignées de cellules HEp-2 (33) ou HeLa (34) sont acceptables bien que d'autres telles que les Vero, LLC MK-2, ou les CV-l ont été utilisées. Le virus produit des effets cytopathiques caractéristiques de formation de syncytium et de destruction de cellules (48).

Le virus Influenza est à l'origine d'une maladie respiratoire très contagieuse qui est généralement la source d'épidémies (27). Les trois types A, B, et C, tiennent leur spécificité d'antigènes internes constitués par des nucléoprotéines et protéines de matrice (40).

L'infection à virus influenza chez l'adulte entraîne de manière caractéristique une trachéo-bronchite qui touche les petites bronches (43, 66) et peut évoluer en rhinite et / ou pharyngite. L'infection peut toutefois présenter des manifestations cliniques allant de l'absence de symptômes à la pneumonie mortelle (25). Le même spectre de réaction clinique peut se manifester chez les enfants à quelques différences distinctes près. La fièvre peut être plus forte chez les enfants et accompagnée de convulsions fébriles (23, 24, 62, 70, 71). Les virus de l'influenza sont responsables de 14 % des fièvres d'enfants accompagnées de symptômes au niveau de l'appareil respiratoire suffisamment graves pour attirer l'attention du médecin (23, 71). Les lésions de la région gastro-intestinale sont plus importantes chez les enfants que chez les adultes (14), et ils développent plus fréquemment une myosite, une otite moyenne et un croup (28, 38). Les infections chez les nourrissons peuvent entraîner une fièvre inexpliquée (50) qui

3

peut être mortelle (1, 18, 50, 59). Les infections des voies respiratoires inférieures associées avec l'infection à virus influenza chez les enfants et les adultes se manifestent par trois formes de pneumonie : la pneumopathie virale primaire, la pneumopathie virale-bactérienne combinée, et l'infection à virus influenza suivie de la pneumonie bactérienne (54). Les réactions cliniques non pulmonaires par rapport à l'infection à virus influenza incluent la virémie, les lésions cardiaques et du SNC, le syndrome de Reye, et le choc toxique staphylococcique (54).

Les types A et B du virus influenza provoquent en principe le même spectre de maladies. L'infection de type A conduit toutefois environ 4 fois plus souvent à l'hospitalisation que le type B (38), et le type B entraîne plus souvent des myosites et lésions de la région gastro-intestinale (11, 16, 37, 42).

L'influenza de type C aboutit rarement à des infections des voies respiratoires inférieures mais il est à l'origine d'infections sporadiques des voies respiratoires supérieures (19, 38, 51). A l'âge adulte, la plupart des personnes disposent d'anticorps contre le type C (57).

Les virus à influenza sont des membres de la famille des Orthomyxoviridae. Ils sont pléomorphes, protégés par une enveloppe, et ils contiennent un génome d'ARN négatif monocaténaire segmenté. Leur diamètre varie entre 80 et 120 nm (40).

L'ajout de trypsine permet de cultiver les virus à influenza dans diverses lignées cellulaires telles que les MDCK (Madin-Darby canine kidney), le modèle A549 de carcinome pulmonaire et les PMK (primary monkey kidney) (20, 65) de même que le système classique d'embryons d'œufs de poule ou d'allantoïne sur coquille (17).

Le virus influenza peut être dépisté par des techniques d'immunofluorescence, de résorption sanguine ou d'hémagglutination à l'aide de globules rouges de poulet ou de cochon d'Inde. L'isolement / la confirmation bactériologique constitue une technique facile, sensible et relativement rapide d'identification des infections à influenza. L'effet cytopathique se manifeste dans les 3 à 7 jours suivant l'inoculation sous forme de vacuolisation et de dégradation cellulaire.

Les virus Parainfluenza, combinés au VRS, représentent la majorité des pathogènes des voies respiratoires supérieures chez les nourrissons et les enfants en bas âge (4, 6, 7, 39). Quatre types de virus parainfluenza ont été identifiés chez les enfants et les adultes. Les types 1 et 2 sont des causes majeures de laryngo-trachéo-bronchite (croup). La gravité de la maladie est supérieure chez les enfants âgés de 2 à 4 ans (67). L'infection par le virus parainfluenza de type 3

4

peut entraîner des croups ; le type 3 est notamment la deuxième cause de bronchiolite et de pneumonie après le VRS chez les nourrissons (8, 9, 25, 60, 61). Les pathologies résultant de l'infection de type 3 sont les plus graves chez les nourrissons âgés de moins d'un an (67).

Chez les enfants plus âgés et les adultes, la maladie peut être asymptomatique ou imiter le coryza (68). Un croup grave survenu pendant la petite enfance peut être à l'origine d'une hyperactivité bronchique chez les enfants plus âgés ou les adolescents à l'issue d'une activité physique. On ne sait toutefois toujours pas si l'hyperactivité bronchique était une condition préexistante ayant joué un rôle dans la pathogénèse du croup, ou si cette dernière s'est développée comme complication d'un croup grave (26, 44).

Le Parainfluenza de type 4 a été uniquement associé avec de légères infections des voies respiratoires supérieures chez les adultes et les enfants, et il est difficile à identifier dans les cultures cellulaires (67).

Les virus Parainfluenza appartiennent au genre Paramyxovirus de la famille des Paramyxoviridae. Ce sont des virus protégés par une enveloppe, qui comportent un génome d'ARN monocaténaire à polarité négative dont le diamètre varie entre 150 et 200 nm (10).

Les virus Parainfluenza connaissent une bonne croissance dans les lignées cellulaires de simien de type 1 ou de rein humain, et de rhésus LLC-MK2, une lignée cellulaire à partir d'une souche hétéroploïde de rein (20). L'ajout de trypsine dans le milieu est nécessaire pour la guérison des infections de types 1 et 2 mais pas du type 3. L'infection de la culture tissulaire par le virus est souvent reconnaissable à la résorption sanguine des globules rouges de cochon d'Inde. Les types 2 et 3 sont reconnaissables à la formation de syncytium.

Les adénovirus sont responsables d'un nombre significatif de cas cliniques de maladies respiratoires. Les affections des voies respiratoires supérieures provoquées par des adénovirus incluent les rhumes, les pharyngites et les amygdalites, qui affectent principalement les nourrissons et les enfants en bas âge. On estime à environ 10 % le nombre de pneumonies infantiles dues aux adénovirus (45). Les bronchites et bronchiolites sont des infections des voies respiratoires inférieures dues à d'autres adénovirus (29). Chez les enfants de moins de 5 ans, l'adénovirus est responsable d'environ 5 % des cas d'infections respiratoires aiguës (IRA). Les IRA peuvent se manifester par une congestion nasale, un coryza, une toux, et parfois, une amygdalite, de la fièvre et une myalgie. L'apparition d'une conjonctivite en plus de l'IRA constitue une pharyngo-conjonctivite (3). L'adénovirus a souvent été associé à la coqueluche, mais de récentes études conduisent à penser que la présence de l'adénovirus peut

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être, dans ces cas, une réactivation du virus latent présent dans le tissu des amygdales lors des infections à Bordetella pertussis (55).

Les maladies oculaires issues d'une infection à adénovirus incluent la kérato-conjonctivite épidémique, la conjonctivite aiguë hémorragique, et la conjonctivite aiguë folliculaire. L'adénovirus est lié à plusieurs troubles gastro-intestinaux, et il est probablement évident dans 7 à 17 % de toutes les gastroentérites infantiles. Les types 40 et 41 ont été associés à la diarrhée et à la gastro-entérite aiguë (15, 22, 69). Un rapprochement a également été fait entre le virus et l'invagination (2), la cystite hémorragique aiguë (56) et la méningo-encéphalite.

La recherche indique que l'incidence de l'infection à adénovirus n'est probablement pas plus élevée chez les patients immunodéprimés que chez les personnes disposant d'un système immunitaire normal ; il est toutefois possible que la gravité, la probabilité et le risque de mortalité soient supérieurs (30).

Les adénovirus humains appartiennent à la famille des Adenoviridae, et au genre Mastadenovirus. Ce sont des virus à ADN bicaténaire non protégés par une enveloppe, de forme icosaédrique, et d'un diamètre de 70 à 90 nm (29). Ils sont recouverts d'une couche de protéines qui compose les capsomères constitués de 240 hexons et 12 pentons.

Les adénovirus peuvent être cultivés et isolés dans diverses lignées cellulaires, et identifiés par plusieurs méthodes. Les cellules des lignées HEp-2, HeLa, KB:A549 et HEK sont appropriées. Des cellules 293 du Dr. Graham peuvent être utilisées pour la propagation des types 40 et 41. On obtient généralement une confirmation de l'infection par immunofluorescence ou dosage immunoenzymatique, mais ceci peut se faire par fixation du complément, inhibition de l'hémagglutination, et par des méthodes de neutralisation (35). Les effets cytopathiques typiques de l'adénovirus (CPE) se manifestent sous forme de groupes cellulaires en forme de grappes de cellules rondes et réfractaires. Ces cellules, une fois colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine, présentent des inclusions intranucléaires qui apparaissent dans un délai de 3 à 10 jours (12).

Principe du test de la Trousse

La Trousse IFA Panel pour Depistage et Identification des Virus Respiratoires de Light Diagnostics™ utilise une technique d'immunofluorescence indirecte pour l'identification du virus dans les cultures cellulaires infectées. Les anticorps monoclonaux de souris fournis se lient à l'antigène viral approprié sur la lame de l'échantillon. Les anticorps non liés sont

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éliminés de la lame à l'aide de sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS). Ceci est suivi de l'ajout de IgG de chèvre anti-souris, marquée par de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), qui se lie au complexe antigène-anticorps. Les anticorps non liés marqués sont éliminés de la lame avec du PBS. Le FITC prend une fluorescence vert pomme lorsqu'il est excité par rayons ultraviolets, ce qui permet la visualisation du complexe par microscopie de fluorescence. La fluorescence des cellules indique que l'échantillon est positif. La coloration des cellules non infectées est d'un rouge terne en raison de la présence d'un contre-colorant Evans Blue dans l'anticorps secondaire marqué par du FITC. Le réactif de dépistage des virus respiratoires est utilisé pour confirmer la présence indiscriminée de virus respiratoires. Des réactifs d'anticorps monoclonaux individuels pour l'adénovirus, l'influenza A & B, le parainfluenza 1, 2, & 3, et le VRS sont alors utilisés en vue d'une identification spécifique des virus.

Composants de la Trousse

1. Réactifs IFA Identification - Sept (7) flacons compte-gouttes de 2 ml contenant un anticorps monoclonal contre : l'adénovirus, l'influenza A, l'influenza B, le parainfluenza 1, le parainfluenza 2, le parainfluenza 3, et le VRS dans du PBS avec un stabilisateur protéinique, et 0,1 % d'azide de sodium (conservateur).

5000 Adeno MAB

5001 Flu A MAB

5002 Flu B MAB

5003 Para 1 MAB

5004 Para 2 MAB

5005 Para 3 MAB

5006 RSV MAB

Montant prévu est suffisant pour 50 tests. Estimation est basée sur les tests de goutte de 40μL; nombre réel de tests peut varier.

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2. Antigen Control Slides - Quatre (4) lames de contrôle comportant des puits de cellules témoins positives et négatives. Chaque puits de contrôle positif est infecté par l'un des virus suivants : l'adénovirus, l'influenza A, l'influenza B, le parainfluenza 1, le parainfluenza 2, le parainfluenza 3, et le VRS. Les puits de contrôle négatifs contiennent des cellules non infectées.





3. Respiratory Viral Screen - 5007: Un flacon compte-gouttes de 10 ml contenant des anticorps monoclonaux contre : l'adénovirus, l'influenza A, l'influenza B, le parainfluenza 1, le parainfluenza 2, le parainfluenza 3, et le virus respiratoire syncytial dans du PBS avec un stabilisateur protéinique, et 0,1 % d'azide de sodium (conservateur).

Montant prévu est suffisant pour 250 tests. Estimation est basée sur les tests de goutte de 40μL; nombre réel de tests peut varier.

4. Normal Mouse Antibody - 5014: Un flacon compte-gouttes de 10 ml contenant des anticorps de souris normaux à utiliser comme contrôle négatif dans du PBS avec un stabilisateur protéinique, et 0,1 % d'azide de sodium (conservateur).

5. Anti-Mouse IgG : FITC Conjugate - 5008: Deux flacons compte-gouttes contenant 10 ml de IgG de chèvre anti-souris marquée par FITC dans du PBS additionné de 0,02 % de contre-colorant bleu Evans, de 0,2 % de SAB et de 0,1 % d'azide de sodium (conservateur).

6. Phosphate - Buffered Saline (PBS) - 5087: Un paquet de sels pour sérum physiologique tamponné au phosphate produit 1 litre après dissolution dans de l'eau distillée. Conserver dans un récipient propre et hermétique à température ambiante.

7. Tween® 20 / Sodium Azide Solution (100X) - 5037: Un flacon de 10 ml contenant du monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane (Tween 20) et un concentré d'azide de sodium (NaN3) à diluer à 1/100 dans le PBS.

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8. Mounting Fluid - 5013: Un flacon compte-gouttes de 10 ml contenant du trométamol, de la glycérine, un amplificateur de fluorescence, et de l'azide de sodium comme conservateur. Conserver à une température comprise entre 2ºC - 25 °C.

Matériel requis mais non fourni

1. Culture sur cellules pour l'isolement de virus respiratoires : chaque laboratoire doit maintenir des cellules souches viables à état de passage approprié qui permettra une réplication efficace des virus respiratoires des échantillons traités de patients. La capacité de ces cellules à soutenir la croissance des virus respiratoires doit être vérifiée régulièrement. Des lignées cellulaires adéquates peuvent être obtenues auprès de l’American Type Tissue Culture Collection (ATCC®), Manassas, VA.

2. Milieu de transport viral non inhibitoire de virus respiratoires et cellules de culture tissulaire utilisées pour isolement de virus : le soluté de base de Hank conjugué à des antibiotiques et à un stabilisateur protéinique constitue un milieu adéquat. Éviter l'utilisation de sérum animal (excepté le SVF [sérum de veau fœtal] pré-colostrum) comme stabilisateur protéinique pour empêcher l'interférence d'anticorps inhérents.

3. Un milieu de culture tissulaire tel que le RPMI ou le milieu essentiel minimum d'Eagle (EMEM) additionné d'une quantité appropriée de SVF peut être utilisé à des fins de maintenance après l'infection par le virus.

4. Tubes stériles de culture tissulaire, flacons dram, ou plaques multi-puits

5. Acétone, 99,5 %

Remarque : L'acétone est hygroscopique et doit être conservé dans des flacons bien bouchés. La présence d'humidité dans l'acétone peut donner une apparence voilée au substrat lors de la microscopie de fluorescence.

6. Lames de verre nettoyées à l'acétone

7. Pipettes stériles

8. Chambre humide

9. Solution d'hypochlorite de sodium (0,05 %)

10. Couvre-objet no 1

11. Incubateur pourvu d'un rhéostat pour réguler la température

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12. Écouvillons stériles

13. Forceps

14. Flacon pour le prélèvement et le transport des échantillons

15. Microscope à fluorescence doté d'une combinaison de filtres appropriée pour le FITC (excitation maximale de 490 nm, émission maximale de 520 nm)

16. Perles de verre stériles (1 à 3 mm de diamètre)

17. Centrifugeuse

18. Vortex ou agitateur à ultrasons

19. Eau distillée

Stabilité et conservation

Lorsqu'elle est conservée entre 2 et 8 °C, la Trousse IFA Panel pour Depistage et Identification des Virus Respiratoires de Light Diagnostics™ est stable jusqu'à la date de péremption imprimée sur l'étiquette du trousseau. Ne pas congeler ou exposer à des températures élevées. Jeter tout reste de réactif après la date de péremption du trousseau.

Une diminution marquée de la fluorescence peut indiquer une détérioration du conjugué ou des anticorps. Un contrôle positif doit être testé dans chaque lot d'échantillons pour garantir que ces réactifs et la procédure de coloration fonctionnent correctement. Si, après une analyse adéquate, une diminution de l'intensité de la coloration est visible, arrêter d'utiliser ces réactifs.

Avertissements et précautions

• L'azide de sodium (présent dans le conjugué, les anticorps monoclonaux, le solution PBS/Tween 20, et le liquide de montage) peut réagir avec les conduites en plomb ou en cuivre pour former des azides métalliques très explosifs. Lors de la mise au rebut de ces matériaux, rincer à grande eau pour éviter une accumulation d'azoture.

• Le regroupement ou la dilution de conjugués ou d'anticorps monoclonaux peut causer des résultats erronés.

• Ne laisser les lames sécher à aucun moment lors de la procédure de coloration.

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• Manipuler tous les échantillons et matériaux comme du matériel potentiellement infectieux. Décontaminer avec 0,05 % d'hypochlorite de sodium (une dilution à 1/100 d'une solution d'eau de javel commerciale) avant la mise au rebut.

• • Ne pas exposer les réactifs à la lumière vive lors de la conservation ou de

l'incubation. • Éviter le contact avec Evans Blue (présent dans la IgG anti-souris :

conjugué FITC 5008) étant donné qu'il s'agit d'un carcinogène potentiel. En cas de contact avec la peau, rincer à grande eau.

• L'acétone est extrêmement inflammable et nocif en cas d'ingestion ou d'inhalation. À conserver à l'écart des étincelles, des flammes ou de toute source de chaleur. Éviter de respirer les vapeurs. Utiliser une ventilation appropriée.

• Ne jamais pipeter à la bouche. • Ne pas remplacer par des réactifs d'autres fabricants. • Des modifications du protocole fourni peuvent causer des résultats erronés. • Lors de la coloration de multiples échantillons sur une lame, éviter toute

contamination croisée entre les échantillons. • Les anticorps de souris normaux doivent être testés dans chaque isolat de

culture cellulaire. La fluorescence indique une réaction non spécifique et le test est considéré non valide.

• Le liquide de montage (Mounting Fluid 5013) contient un amplificateur de fluorescence qui peut détruire les muqueuses. Éviter tout contact direct avec la peau ou les muqueuses. En cas de contact, rincer à grande eau.

Prélèvement des échantillons

Le prélèvement, le transport, le traitement, et la conservation corrects des échantillons sont des éléments d'une importance fondamentale pour l'isolement et la confirmation du virus source de l'infection. La connaissance de la pathogenèse de la maladie est nécessaire pour la sélection d'une technique de prélèvement adéquate. Une méthode empirique simple consiste à mettre en culture le matériel de la zone infectée lorsqu'une infection est en surface (peau ou membrane muqueuse). Dans le cas des infections profondes ou généralisées par nature

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(exanthème non vésiculaire, méningite, encéphalite, fièvres d'origine inconnue, ou infections congénitales), il est conseillé d'effectuer des prélèvements à des sites multiples.

Le type d'échantillon prélevé et son traitement ultérieur dépendent de la maladie et du virus à dépister. Pour de plus amples informations concernant les symptômes et techniques de prélèvement des échantillons, consulter The Manual of Clinical Microbiology, Balows, A. et al., eds. 5ème édition (1991). American Society for Microbiology, Washington, D.C. Adénovirus, Ch. 86 ; virus respiratoire syncytial, Ch. 83 ; Virus Influenza, Ch. 81 ; Virus Parainfluenza, Ch. 82 ; Systèmes de culture sur cellules animales, Ch. 19.

Pour un transport approprié des échantillons se référer au CFR 42 (Code of Federal Regulations), article 72.

Traitement des échantillons

Avant le traitement des échantillons, s'assurer qu'ils ont été prélevés et transportés correctement. Une mauvaise manipulation des échantillons peut causer des résultats erronés.

Lors de l'utilisation d'aspirations, laver l'échantillon en mélangeant correctement 0,2 à 0,4 ml de sécrétion non diluée à 2 ml de froid (PBS). Vortexer l'échantillon pour déloger les cellules du mucus. Ajouter 10 ml de PBS et centrifuger entre 200 et 500 x g pendant 7 à 10 minutes. Aspirer le surnageant et répéter le lavage de l'agrégat de cellules jusqu'à ce que le mucus soit éliminé de l'échantillon. Suspendre à nouveau les cellules dans le milieu approprié et vortexer ou agiter par ultrasons pour perturber les cellules. Centrifuger et utiliser le surnageant comme inoculum.

Pour les écouvillonnages pharyngés et rhino-pharyngiens, agiter le récipient de l'échantillon pour déloger les cellules de l'écouvillon. Pour améliorer la récupération des cellules, ajouter quelques perles de verre stériles à l'échantillon et vortexer ou agiter par ultrasons entre 8 et 12 kc/sec pendant 1 minute ou moins. Jeter l'écouvillon dans la solution d'hypochlorite de sodium. Centrifuger l'échantillon entre 200 et 500 x g pendant 7 à 10 minutes. Utiliser le surnageant comme inoculum.

Juste avant l'inoculation des échantillons, vérifier que morphologie des cultures cellulaires est correcte. Rincer la couche unique avec un milieu frais préparé et aspirer. Ajouter 0,2 à 0,5 ml d'inoculum à chacun des récipients de culture. Inoculer les échantillons en double. Laisser agir à 37 °C pendant 30 à 60 minutes

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ou, après inoculation, centrifuger les récipients de cultures pendant 30 minutes entre 500 et 700 x g et laisser à agir à 37 °C pendant 30 minutes (des contrôles adéquats doivent être maintenus pour garantir que la centrifugation n'a pas d'effet préjudiciable sur les lignées cellulaires utilisées). Après la période d'incubation, recouvrir les cultures de milieu de maintenance frais et incuber à une température comprise entre 35 et 37 °C. Renouveler le milieu de culture cellulaire tous les 3 à 4 jours.

Guetter l'apparition d'un ECP (effet cytopathique) quotidiennement. Les cultures cellulaires ayant été soumises à l'adsorption ou à la centrifugation selon la procédure décrite ci-dessus peuvent révéler un ECP dans un délai de 48 heures seulement.

Un échantillon de chaque lot de lignées cellulaires utilisé pour la culture cellulaire doit être inoculé avec des souches de virus respiratoire représentatives pour démontrer la sensibilité et le développement de l'ECP approprié. Les cultures cellulaires non inoculées doivent être cultivées et examinées quotidiennement à la recherche de virus contaminateur ou de mycoplasme. Ceci servira à contrôler la normalité de la morphologie cellulaire et peut être utile à la détection d'un ECP précoce. À moins que ces cultures cellulaires témoins ne fassent preuve d'une croissance adéquate, les résultats de l'isolement de la culture cellulaire doivent être considérés non valides.

Après une incubation adéquate et / ou sur observation d'un ECP > 25 %, éliminer le milieu du récipient de culture. Congeler le milieu non utilisé jusqu'à la fin du test. En cas de problème, un isolement du virus peut être tenté à partir de ce milieu. L'isolement du virus à partir d'échantillons congelés peut être nettement inférieur à celui effectué à partir d'échantillons frais.

Rincer la culture cellulaire délicatement trois fois avec 1 à 2 ml du soluté de base de Hank. Jeter tous les rinçages dans la solution d'hypochlorite de sodium. Ajouter un dixième du volume culture de trypsine (0,05 %) -- sodium d'acide ethylène-diamine tétracétique (EDTA-4Na, 0,53 mM) et laisser agir pendant 30 secondes. Tapoter délicatement contre le récipient de culture pour délier les cellules. Ajouter du milieu frais pour recouvrir le volume d'origine. Centrifuger la suspension de cellules entre 200 et 500 x g pendant 7 à 10 minutes. Suspendre à nouveau l'agrégat de cellules dans plusieurs gouttes PBS stérile pour obtenir une suspension trouble. Les lames doivent comporter au moins trois cellules par champ grossi 400 fois pour être considérées adéquates au dépistage.

Le cas échéant, il est possible de racler les cellules dans une petite quantité de PBS.

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Déposer la suspension de cellules sur une lame nettoyée à l'acétone et laisser sécher à l'air complètement. Fixer la lame dans de l'acétone réfrigéré (entre 2 et 8 °C) pendant 10 minutes et laisser sécher à l'air complètement. Conserver les lames inutilisées avec un dessiccatif à -20 C.

Procédure de test

Préparation des réactifs :

Solution de PBS/Tween 20:

1. Dissoudre le contenu du paquet de PBS dans 950 ml d'eau déionisée.

2. Ajouter le Tween 20 / l'azide de sodium 100X concentré (10 ml) au PBS et bien mélanger.

3. Ajouter de l'eau distillée au mélange pour obtenir 1 litre. Le transférer dans un récipient propre et étiqueté destiné à la conservation et bien reboucher. Tous les autres réactifs sont prêts à l’emploi.

Procédure d'immunofluorescence indirecte suggérée (coloration) :

1. Laisser la lame de contrôle fixée à l'acétone et / ou la lame de test et les réactifs s'équilibrer à température ambiante.

Remarque: Ne laisser les lames sécher à aucun moment lors de la procédure de coloration.

Remarque: L'écran pour virus respiratoire doit être d'abord utilisé pour confirmer la présence de virus respiratoire. Les échantillons positifs doivent être testés avec des anticorps monoclonaux contre des virus individuels pour permettre une identification spécifique.

2. Ajouter suffisamment Respiratory Virus Screen 5007, d'anticorps d'identification spécifique ou d'anticorps de souris normal (réactif de contrôle négatif) pour recouvrir les cellules ; 1 goutte pour les tâches cellulaires et 4 à 6 gouttes pour les flacons cylindriques.

3. Incuber la lame à 37 °C pendant 30 minutes dans une chambre humide.

4. Rincer la lame délicatement à l'aide d'un flacon pulvérisateur rempli de solution PBS/Tween 20 pendant 10 à 15 secondes pour éliminer l'excès de solution d'anticorps monoclonaux, en prenant soin de détourner le jet du

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puits. Pour les flacons cylindriques : aspirer le réactif du flacon et laver délicatement chaque flacon cylindrique à 3 reprises avec 1 ml de solution PBS/Tween 20.

5. Placer la lame dans une boîte de coloration ou des tubes à coloration de Coplin (avec le support pour lames ou son équivalent) et recouvrir de PBS. Rincer 2 à 3 fois pendant 5 à 10 minutes. Agiter délicatement avec un barreau d'agitateur magnétique ou manuellement.

6. Agiter pour enlever tout excès de solution PBS/Tween 20 de la lame et faire sécher la zone entourant la tâche de cellule avec soin.

7. Ajouter suffisamment de conjugué de IgG anti-souris marqué au FITC

5008 ou équivalent pour recouvrir les cellules ; 1 goutte pour les tâches de cellules et 4 à 6 gouttes pour les flacons cylindriques.

8. Répéter les étapes 3 à 6.

9. Monter sous une lamelle à l'aide d'un milieu de montage aqueux au pH de

8,5 5013 ou équivalent. Pour les flacons cylindriques : aspirer le PBS/Tween des flacons cylindriques. Soulever chaque lamelle à l'aide d'une aiguille tordue, fixée à une petite seringue, et la retirer avec précaution en utilisant les forceps. Monter chaque lamelle CÔTÉ CELLULE TOURNÉ VERS LE BAS sur une lame de verre avec du liquide de montage.

10. Essuyer l'excès de liquide des bords de la lame.

Remarque: Pour de meilleurs résultats, lire les lames tout de suite après la coloration. Si les lames doivent être conservées après la coloration, les conserver à une température comprise entre 2 et 8 °C, dans un récipient sûr et dans l'obscurité.

11. Examiner les lames, à l'aide d'un microscope à fluorescence à un grossissement de 100 à 200 à la recherche des cellules fluorescentes. Un examen détaillé peut être effectué à un grossissement par 400.

Remarque: La performance du microscope à fluorescence est d'une importance critique pour l'obtention de résultats de test satisfaisants. L'utilisation d'un contrôle positif permet de vérifier le fonctionnement des réactifs, de la méthode de culture et du microscope alors que les objectifs, l'intensité de l'ampoule, la puissance, et les filtres peuvent affecter les résultats.

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Interprétation des résultats

Le type de modèle de coloration dépendra du virus responsable de l'infection, et il reflète le modèle de croissance du virus. Les modèles de coloration typiques vus avec les virus respiratoires sont décrits ci-dessous :

Virus respiratoire syncytial (VRS)

La fluorescence est observée dans le cytoplasme, et elle est associée à un cyncytium. La coloration du cytoplasme est ponctuée de petites inclusions.

Influenza A et B La fluorescence est nucléaire, cytoplasmique, ou les deux à la fois. La coloration nucléaire est uniformément vive. La coloration du cytoplasme est souvent ponctuée de grosses inclusions.

Parainfluenza de type 1, 2, et 3 La fluorescence est confinée dans le cytoplasme. La coloration du cytoplasme est ponctuée d'inclusions irrégulières.

Adénovirus La fluorescence est nucléaire, cytoplasmique, ou les deux à la fois. La coloration nucléaire est uniformément vive. La coloration du cytoplasme est souvent ponctuée.

Cellules négatives

Vérifier dans un premier temps que la coloration des lames est appropriée. Le contrôle positif devrait révéler des cellules présentant une fluorescence du noyau, du cytoplasme, ou des deux, selon le stade de croissance. Le contrôle négatif devrait révéler des cellules d'une coloration rouge terne en raison du contre-colorant Evans Blue. Le cytoplasme des cellules présente une coloration rouge terne, et le noyau un marron foncé presque noir. La coloration de ces cellules est due à la présence de Evans Blue dans le contre-colorant.

Il est utile d'examiner les cellules négatives avant les cellules positives pour déterminer s'il existe une coloration de fond. La coloration positive d'un virus est représentée par la présence d'au moins deux cellules intactes par champ, à un grossissement de 400 révélant le type de fluorescence décrit ci-dessus.

Attention: La coloration fluorescente de fragments de cellules, relevant fréquemment de l'emprisonnement du conjugué dans de tels débris, doit être

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ignorée. Si les contrôles positifs et négatifs ne peuvent être clairement distingués, le test est non valide, et il doit être répété. Un résultat négatif n'exclut pas la présence d'adénovirus, de VRS, d'influenza A ou B, ou du virus parainfluenza de type 1, 2, ou 3. Le résultat négatif peut relever de divers facteurs tels que : un échantillon inadéquat, un prélèvement et une manipulation incorrects de l'échantillon, une technique de mise en culture mal effectuée, l'utilisation d'une lignée cellulaire ou d'une température inappropriée au cours de l'isolement, ou des facteurs mentionnés sous la rubrique « Limites ». Tous les résultats négatifs doivent être rapportés avec la mention « Aucun virus observé ».

Limites

• Un transport et un traitement ultérieur corrects des échantillons est d'une importance critique en matière d'isolement de culture. Un résultat négatif n'exclut donc pas la présence d'une infection virale. Les résultats doivent être soigneusement interprétés en prenant en compte l'évaluation clinique du patient et d'autres tests diagnostiques.

• Les contrôles positifs et négatifs de chaque échantillon doivent être testés, et ils doivent fournir la coloration appropriée pour que le test soit valide.

• Une coloration périnucléaire et / ou diffuse du cytoplasme peut être une liaison non spécifique des anticorps due à la présence de récepteur Fc dans les cellules infectées par des herpèsvirus (36).

• Les échantillons contaminés par le Staphylococcus aureus peuvent révéler une fluorescence jaune-vert due à la présence de grandes quantités de protéine A. La fluorescence est un résultat de liaison non spécifique de la protéine A aux fragments d'anticorps Fc.

• Les anticorps monoclonaux compris dans ce trousseau sont spécifiques au groupe pour l'adénovirus et le VRS, et ils ne peuvent donc être utilisés pour différencier les types.

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Valeurs attendus

Les résultats dépendront du statut socio-économique, de l'âge de la population, de l'emplacement géographique, du moment de l'année (certains virus sont saisonniers), et de la manipulation des échantillons. Un total de 646 échantillons a été testé dans deux établissements de la côte est, à trois endroits dans la région du sud et deux dans le centre-ouest des États-Unis, de même que dans trois centres situés sur la côte ouest. Les établissements comprenaient des hôpitaux, des hôpitaux pour enfants, des universités, et des laboratoires de référence. Les évaluations conduites de septembre 1991 à juillet 1992 ont rapporté les taux de dépistage suivants : Adénovirus – 6,7 % (43/646); VRS – 10,2 % (66/646); Influenza A – 1,7 % (11/646); Influenza B – 0,6 % (4/646); Parainfluenza 1 – 1,7 % (11/646); Parainfluenza 2 – 0,8 % (5/646); Parainfluenza 3 – 4,3 % (28/646).

Caractéristiques de performance spécifiques

Analyse de réactivité croisée

Les résultats suivants ont été obtenus à partir d'études de dépistage viral et bactérien effectuées sur chaque anticorps monoclonal. Les cultures de l’American Type Tissue Culture Collection (ATCC®), Manassas, VA sont identifiées à partir de leur numéro de souche. Les prototypes indiqués ont été isolés par les Centers for Disease Control, Atlanta, GA. Les cultures restantes constituaient, sauf indication, des isolats cliniques.

ANTICORPS MONOCLONAUX : Adéno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Adénovirus : Prototypes des types 1 à 47 ; + 30 isolats cliniques actuels de type 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 37

+ - - - - - -

Virus du polyome : SV-40 - - - - - - - Virus de l'herpès : 2 isolats cliniques de chaque type 1 & 2 d'herpès, VHS-1 ATCC VR733, VHS-2 ATCC VR734 ; 1 isolat clinique de CMV et de HV varicellae

- - - - - - -

Échovirus : Isolats cliniques de type 1, 4, 6, 9, 11, 30, 33, prototype d'Écho-27, prototype de Polio-2

- - - - - - -

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Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Virus Coxsackie : Prototype A14, A24var (4 isolats), B4 (2 isolats)

- - - - - - -

Pan-Entérovirus 70 : 4 isolats - - - - - - - Rhinovirus : 6 isolats - - - - - - - Coronavirus : Prototypes OC43 & 229E

- - - - - - -

Virus Influenza de type A : 2 isolats chacun de A/Leningrad/ 360/86 & A/Philippines/2/82 ; Souches de sous-type H3N2 : A/Victoria/3/75 - 7 isolats, A/Texas/1/77 - 1 isolat, A/Angleterre/496/80 - 2 isolats, A/Angleterre/X/82 - 12 isolats ; Souches de sous-type H1N1 : A/Russie/90/77 - 2 isolats, A/Angleterre/333/80 - 1 isolat ; sous-types H3N2 & H1N1 Toutes souches confondues - 25 isolats

- - + - - - -

Virus Influenza de type B : 2 isolats de B/Russie/100/83 ; 14 isolats de B/Singapour/222/79

- - - + - - -

Virus Parainfluenza : Prototype du type 1 & 6 isolats récents

- - - - + - -


- - - - - + -


- - - - - - +

Virus Parainfluenza : Prototypes de types 4A, 4B & 6 isolats récents de chaque

- - - - - - -

Virus des oreillons : Prototype, 6 isolats, & CDC V5004

- - - - - - -

Virus de la rougeole : Souche Edmonston ; CDC V4009

- - - - - - -

Virus Simien : Souches de référence 5 & 41

- - - - - - -

VRS : Souches de référence de type long, A2, 18537, V1680E, & V670 ; 30 isolats récents du groupe de souches 1 (du type long); 30 isolats de souches du groupe 2 (du type 18537)

- + - - - - -

Acholeplasma laidlawii : ATCC 23206

- - - - - - -

19


Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Bordetella bronchiseptica : ATCC 10580

- - - - - - -

Bordetella pertussis : ATCC 9340

- - - - - - -

Bordetella parapertussis : ATCC 15237

- - - - - - -

Branhamella catarrhalis : ATCC 25238

- - - - - - -

Chlamydia trachomatis : Syva

- - - - - - -

Corynebaterium diptheriae : ATCC 13812

- - - - - - -

Legionella micdadei : ATCC 33204

- - - - - - -

Legionella pneumophila : CDC-BC 1640

- - - - - - -

Mycobacterium avium : Clinique

- - - - - - -

Mycobacterium intracellularae : Clinique

- - - - - - -

Mycobacterium tuberculosis : Clinique

- - - - - - -

Mycoplasma fermentans : ATCC 19989

- - - - - - -

Mycoplasma hominis : ATCC 23114

- - - - - - -

Mycoplasma orale : ATCC 23714

- - - - - - -

Mycoplasma pneumoniae : Clinique

- - - - - - -

Neisseria meningitidis : ATCC 13077

- - - - - - -

Ureaplasma urealyticum : ATCC 27618

- - - - - - -

Cellules témoins hôtes :

Tous les anticorps monoclonaux ont donné des résultats négatifs contre les cellules témoins suivantes :

Adénovirus Cellules témoins pHEK, HEp-2, NCI-H292, RD, HLF, HeLa, & A549

Virus du polyome Cellules témoins PMK Entérovirus Cellules témoins RD & HLF Paramyxovirus Cellules témoins HEp-2, Vero, & PMK

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Comparaison clinique pour la confirmation bactériologique des cellules La confirmation bactériologique des échantillons respiratoires a été testée dans sept laboratoires cliniques aux États-Unis, en comparant la Trousse IFA Panel pour Depistage et Identification des Virus Respiratoires de Light Diagnostics™ à d'autres trousses de diagnostic in vitro. Les résultats sont les suivants:

ANTICORPS MONOCLONAUX :

Adéno

VRS

Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Vrai positif 43 66 11 4 11 5 28 Faux positif 0 0 0 0 0 0 0 Vrai négatif 602 580 635 642 635 641 618 Faux négatif 1 0 0 0 0 0 0 Sensibilité (%) 97.7 100 100 100 100 100 100 Spécificité (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valeur prédictive positive (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valeur prédictive négative (%) 99.8 100 100 100 100 100 100

La confirmation bactériologique de cellules d'échantillons respiratoires conservés par congélation a été testée dans sept laboratoires cliniques aux États-Unis en comparant la Trousse IFA Panel pour Depistage et Identification des Virus Respiratoires de Light Diagnostics™ à d'autres trousses de diagnostic in vitro. Les résultats sont les suivants :

ANTICORPS MONOCLONAUX :

Adéno VRS Influ A

Influ B

Para 1

Para 2

Para 3

Vrai positif 7 3 30 36 33 5 16 Faux positif 0 0 0 0 0 0 0 Vrai négatif 144 148 121 115 118 146 135 Faux négatif 0 0 0 0 0 0 0 Sensibilité (%) 100 100 100 100 100 100 100 Spécificité (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valeur prédictive positive (%) 100 100 100 100 100 100 100 Valeur prédictive négative (%) 100 100 100 100 100 100 100

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Dépannage

La préparation des prélèvements repose sur des gestes techniques dont la bonne réalisation détermine la qualité des résultats obtenus. Afin de résoudre les éventuels problèmes de performance, chacune des étapes du processus doit être analysée.

L’obtention d’une fluorescence nettement atténuée peut être le signe :

1) d’une détérioration des réactifs,

2) de problèmes liés au microscope,

3) d’autres défaillances matérielles ou techniques.

• Vérifier la date de péremption de tous les réactifs utilisés.

• Si les réactifs n’ont pas dépassé leur date de péremption, vérifier les performances du microscope ; faire une nouvelle lecture des lames de contrôle positives.

• Si la cause du problème n’a toujours pas pu être déterminée, vérifier le fonctionnement de tous les appareils comme indiqué sur la notice et répéter l’analyse.

Contacter les services techniques de EMD Millipore Corporation pour toute assistance supplémentaire. Pour trouver les coordonnées de la filiale la plus proche, rendez-vous sur www.millipore.com/offices.

Les parties références bibliographiques de ces notices de produit de diagnostic in vitro Light Diagnostics™ ne sont données en version intégrale qu’en anglais. Consulter ces versions pour tout ce qui concerne les détails spécifiques à ces produits.

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Glossaire des Symboles

Symboles Utilisé pour Symboles Utilisé pour

Le numéro de catalogue

Utilisation par les AAAA-MM-JJ ou AAAA-MM

Fabricant

Représentant autorisé dans la Communauté européenne

Attention, veuillez consulter les documents d’accompagnement

Contenu suffisant pour <n> les tests

De diagnostic in vitro dispositif médical

Limitation de la température

Consulter les instructions pour l’utilisation

Les risques biologiques

Contrôle

Contrôle Négatif

Contrôle positif

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GARANTIE ET LIMITATIONS DE RESPONSABILITÉ 1. Millipore SAS s'engage à ce que ses produits correspondent aux conditions applicables

publiées par elle, sous réserve qu'ils soient utilisés conformément aux instructions données. Cette garantie joue pendant un délai d'un an à partir de l'expédition des produits. Aucune autre garantie, expresse ou implicite, n'est fournie.

2. Le client est tenu d'inspecter les produits lors de leur livraison. Toutes les réserves relatives à des vices apparents ou à des produits manquants dus à un éventuel manquement de la part de Millipore SAS doivent être notifiées immédiatement par écrit au transporteur et par lettre recommandée avec avis de réception à Millipore SAS au plus tard dans les trois (3) jours ouvrés suivant leur réception ou au plus tard dans les dix (10) jours calendaires suivant la date de facturation, dans l'hypothèse de produits manquants.

3. Un éventuel retour des produits ne peut être réalisé qu'avec l’accord de Millipore SAS, et selon ses instructions. Les produits renvoyés à Millipore SAS sans son accord ne seront pas crédités au compte du client.

4. Millipore SAS ne saurait être tenue responsable de la détérioration des produits acquis par le client du fait de mauvaises conditions de stockage. A ce titre, le client s’engage à respecter les spécifications et conditions d’utilisation desdits produits. A défaut, toute garantie de Millipore SAS sera exclue.

5. En cas de non-respect de la garantie énoncée ci-dessus, la seule obligation de Millipore SAS consiste à réparer ou remplacer, à sa discrétion, le produit ou la partie du produit en cause. Si, après avoir fait ses meilleurs efforts, Millipore SAS est dans l'impossibilité de réparer ou remplacer le produit ou la partie du produit en cause, Millipore SAS devra rembourser le client des sommes engagées pour l'achat de ce produit ou de sa partie.

6. D’une manière générale, toute garantie de Millipore SAS est exclue en cas: o de mauvaise installation, utilisation ou entretien des produits, en violation des

instructions de Millipore SAS ; o d'usure normale des produits;

7. Millipore SAS ne saurait être tenue responsable des préjudices indirects qui seraient subis par un client du fait de l'utilisation du produit, tels qu'un préjudice commercial, une perte de clientèle, une perte de commandes, tout autre problème de nature commerciale, une perte de profits, une atteinte aux biens ou une atteinte au droit des marques.

8. Aucun dommage causé aux produits et aucune perte de ceux-ci résultant de leur transport n'engage la responsabilité de Millipore SAS. Le client doit adresser toutes les réclamations relatives à de tels dommages ou perte au transporteur.

9. Toutes les actions engagées contre le client par une tierce partie constituent un préjudice indirect et n'ouvrent donc pas droit à réparation.

10. Dans tous les cas, les amendes et sanctions qui peuvent être infligées à Millipore SAS dans le cas où sa responsabilité serait reconnue sont expressément limitées à un montant égal aux sommes effectivement versées à Millipore SAS par le client à l'occasion du premier achat du produit qui a conduit à engager la responsabilité de Millipore SAS.

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3105

March 2019

Revision 3.0; 3105CESUPPMAN

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