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U S A Runité support de l’ANR

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Biologie et Santé (CSD 8)

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Biologie et Santé (CSD 8)

le programmeblanc

Centromeric RNAs (CenRNAs) and heterochromatin formation in mammals

Geneviève Almouzni

Protein coats and their control by the GDP/GTP cycle of small G proteins from the Arf family

Bruno Antonny

Integration of cortical functions in epithelial cells by the membrane-cytoskeleton linker ezrin.

Monique Arpin

Stress Oxydant chez Escherichia coli : homéostasie cellulaire et hétérogénéité populationnelle

Frédéric Barras

DNA traffic in bacteria: role and action mechanism of the ATP-dependent DNA translocase FtsK

François-Xavier Barre

Conformation and dynamics of the E. coli chromosome during cell cycle

Frédéric Boccard

2

Femtoenzymology – Watching photolyase repair UV-damaged DNAKlaus Brettel

Evolution humaine : de l’origine des premiers primates anthropoïdes à l’emergence des hominidés. Evolutions et paléoenvironnements

Michel Brunet

Cold-Adapted RNA MetabolismAgamemnon Carpousis

Epigenetic regulation of genome function and nuclear architecture : the role of Polycomb Group proteins

Giacomo Cavalli

Translation Control in Transposable ElementsMichael Chandler

Conséquences structurales et fonctionnelles des duplications globales de génomes : étude chez le modèle Paramecium tetraurelia

Jean Cohen

Décryptage des réseaux de régulation transcriptionnels gouvernant la prolifération, la différenciation et l’identité des cellules murines

Irwin Davidson

le programmeblanc

3

le programmeblanc

Dynamics of DNA Replication in Mammalian Cells : Impact on Chromosome Stability

Michelle Debatisse

Mitotic chromosomal checkpoint control mechanismsStefan Dimitrov

How do genes arise ? Lessons and questions from the evolution of yeast genomes

Bernard Dujon

Formation des muscles au cours du développement : interactions avec les tendons

Delphine Duprez

Immunoregulatory functions of histamine through Organic CationTransporter 3 (OCT3) and H4 receptors (H4R) :

new targets for anti-allergic treatment ? Michel Dy

Robustness and evolution of the molecular network underlying C. elegans vulva development

Marie-Anne Félix

Structure et propriétés de fusion de la glycoprotéine G des rhabdovirus

Yves Gaudin

Diversité des cellules endothéliales :Caractérisation moléculaire et fonctionnelle du phénotype

cuboïdal lié à l’inflammationJean-Philippe Girard

Tyrosines kinases de la famille de FAK : bases structurales de la régulation et de la localisation intracellulaire

Jean-Antoine Girault

Studying cell death in the alternative model organism Dictyostelium discoideum

Pierre Golstein

Investigating Hox protein Function at the Organogenetic,Cellular and Transcriptional levels

Yacine Graba

MicroRNAs in mammalian cell differentiationAnnick Harel-Bellan

Domaines immunosuppresseurs des protéines d’enveloppe rétrovirale : développement de nouvelles approches vaccinales

et de molécules thérapeutiquesThierry Heidmann

4

le programmeblanc

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Cryptic Unstable Transcripts and post-transcriptionnal qualitycontrol of transcription in eukaryotes

Alain Jacquier

Biosynthesis and function of nucleolar and Cajal body-specific small ribonucleoproteins

Tamás Kiss

Structure d’un complexe kinésine-tubulineMarcel Knossow

Analyse génétique et cellulaire de la mécanotransduction pendant la morphogenèse embryonnaire

Jean Labarre

Études structurales des machineries moléculairesinitiant la formation de filaments d’actine

Michel Labouesse

Etude in vitro et in vivo de l’évolution dynamique du complexe EJC

Hervé Le Hir

Régulation des réserves corporelles lors d'une dépletion / replétionénergetiques : approches protéomique et morpho-fonctionnelle

Yvon Le Mahole programmeblanc

6

le programmeblanc

Probing the mechanical properties of cells in vivo : dynamics and contractility of the acto-myosin network

in Drosophila epithelial cellsThomas Lecuit

Chordate regulatory networksPatrick Lemaire

Réseaux génétiques contrôlant la formation de l'axe dorso-ventralet des asymétries bilatérales chez les échinodermes

Thierry Lepage

Etude structurale de l’interaction entre Tau et la tubulineGuy Lippens

Structural and functional studies of the SDF-1/CXCL12 interactionswith heparan sulfate in both homeostasis and Pathology

Hugues Lortat-Jacob

Etudes structurales et fonctionnelles des glycosyltransférases :bases moléculaires de la biosynthèse des glycosaminoglycanes

Jacques Magdalou

Rôle du complexe transcriptionnel SIX/EYA dans le lignage myogénique et sa diversité

Pascal Maire

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le programmeblanc

Functional Memory of the Plasma Membrane : Regulating Cell Activation Thresholds

Didier Marguet

Les origines de réplication et le contrôle de l’identité cellulaireMarcel Mechali

Les récepteurs à dépendance : mécanismes moléculaires et rôles biologiques dans le développement

et l’homéostasie des mammifèresPatrick Mehlen

Rôle des protéines de la recombinaison lors de l’inactivation de la réplication bactérienne

Bénédicte Michel

Croissance et Métabolisme chez la drosophile : Mécanisme d’activation et cibles du module DHR3/dS6K

Jacques Montagne

Régulation de la transcription par les récepteurs nucléaires via laphosphorylation : étude structurale de complexes multimoléculaires

Dino Moras

Regulation of cell polarity and migration : a systematic cell biology-based RNA

interference approach Franck Perez

8

le programmeblanc

Archaeal viruses : deciphering structure and functions of proteinsand enzymes from a new class of extremophiles

David Prangishvili

Obésité et leptinorésistance : altération du transport de la leptinedans le cerveau par l’éminence médiane de l’hypothalamus

Vincent Prévot

Structure and function of secretin in the bacterial type II protein secretion system

Anthony Pugsley

Plasticité de l’organisation fonctionnelle de la chaîne respiratoire et contrôle de l’homéostasie cellulaire

Michel Rigoulet

Analysis of Nuclear Receptor Coregulator Interactions in Live Cellsby Cross Correlation Spectroscopy

Catherine Royer

The regulation of spatial organization in oocytes and eggs and its impact on early development

Christian Sardet

Rôle du stroma médullaire dans la différenciation précoce des lymphocytes B

Claudine Schiff

Role of endocytosis in Notch receptor signalingFrançois Schweisguth

9

le programmeblanc

The role of the class B scavenger receptor CD36 : a novel physiopathologic and therapeutic approach in AMD

Florian Sennlaub

Analyse Multidisciplinaire du Processus de Colonisation de Surfacepar les Bactéries : Surfactine, Migration, Formation des Profils

Simone Séror

Vers une ingénierie du code génétique : une approche intégrant expérience et théorie

Thomas Simonson

Le rôle des protéines intrinsèquement dépliéesdans l’assemblage du ribosome

Mathias Springer

Des molécules chimiques pour le déchiffrage et la modulation d’un nouveau code génétique, “le code de l’épissage”

Jamal Tazi

Origines de réplication chez les métazoaires : caractérisation et nouvelles approches à l’échelle du génome

Claude Thermes

Mécanismes d’Activation de Bax au cours de l’ApoptoseFrançois Vallette

Role of insulin-degrading enzyme in processing of MHC class I-presented antigens and in cellular protein metabolism

Peter Van Endert

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Nature et mode d’action de l’hepcidine, une nouvelle hormoneimpliquée dans le métabolisme du fer et ses pathologies

Sophie Vaulont

Contrôle des divisions asymétriques et de l’arrêt CSF lors de lamaturation méiotique des ovocytes de souris

Marie-Hélène Verlhac

Phospholipase D-derived lipids in biological membrane fusionNicolas Vitale

Generation of cellular diversity during chordate embryogenesisHitoyoshi Yasuo

Rôle des microdomaines lipidiques (ou rafts) dans les mécanismesd’adressage apical des protéines glypiées (protéines GPI)

dans les cellules épithélialesChiara Zurzolo

le programmeblanc

Au-delà des ARN codants, une nouvelle catégorie d’ARN non codants (ncRNAs)émerge dont l’importance dans les mécanismes de régulation épigénétique

est de plus en plus appréciée. Par exemple, chez S. pombe, des siARN provenantde transcrits primaires dérivés des séquences centromériques ont été impliquésdans ces mécanismes. Les enjeux actuels sont de savoir d’une part, si de telsmécanismes interviennent également chez les mammifères et d’autre part, d’unefaçon plus générale comment de tels ARNs centromériques (CenARN) sontcapables de cibler une hétérochromatinisation au niveau de sites spécifiques etune fois le ciblage effectué de maintenir une telle structure d’hétérochromatine aucours des divisions cellulaires.

Notre projet vise à identifier ces CenARNs chez les mammifères et à comprendreleur rôle en utilisant comme système modèle le centromère chez la souris (voirfigure 1). Nous avons tiré parti de tests originaux développés au laboratoire afinde définir la nature exacte, le rôle précis et le mode d’action des CenARNs dansla formation de l’hétérochromatine constitutive. Nous poursuivons trois objectifsspécifiques (i) l’identification des CenARNs, (ii) l’identification de ses partenairesprotéiques, (iii) l’analyse des complexes ARN/protéines tant pour le suivi de leurdynamique que pour leur fonction in vivo.Ces avancées sont non seulement une contribution à notre compréhension del’organisation de l’hétérochromatine centromérique mais aussi ouvre la voie pourenvisager comment des ARNs participent à l’organisation d’autres domaines nucléaires.

Résumé

Centromeric RNAs (CenRNAs) and heterochromatin formation in mammals

Geneviève Almouzni

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le programmeblanc

Acronyme CenRNAs Edition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 360 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 115,2

Autres IT : 46,8Recrutés : 27

Discipline Biologie et Santé

Mots clés • Hétérochromatine• ARN non codants• HP1• Organisation nucléaire• Centromères

UMR 218 CNRS/Institut CurieOrganisation du centromère chez la souris

12

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursNotre approche pour identifier des nouveaux CenARN(s) sans a priori nécessitait la mise a point d'un test robuste. Pour cela nous avons tenté d'exploiter un test decomplémentation, dans lequel des ARNs nucléaires restituent une accumulation des protéines HP1alpha au niveau des régions péricentromériques dans des cellulespréalablement traitées par la Rnase. Dans la mesure où la robustesse du test s'est avérée extrêmement dépendante des lots de RNAase quelque soit les fournisseurs, nousavons préféré nous concentrer sur notre approche 'candidats' des CenRNA(s) qui s'est avérée plus prometteuse (voir ci-dessous).

Résultats majeurs1- Nous avons identifié des CenRNA par des approches biochimiques et microscopiques. Ces résultats sont des données sensibles qui font actuellement l'objet de manuscripts en préparation.2- Nous avons caractérisé des transitions clefs dans l’organisation de l’hétérochromatine centromérique et le maintien de cette organisation au cours du développementprécoce de la souris et lors de la réplication dans différents contextes cellulaires. Nos données montrent que cette organisation subit des réarrangements majeurs des régionscentriques et péricentrique au cours du premier cycle cellulaire embryonnaire du développement. De plus, nos résultats montrent qu’un centromère fonctionnel est générétout en gardant la distinction de l’origine parentale du génome lors du retour vers la totipotence du zygote. Sur la base de nos données, nous proposons un mécanismeoriginal, distinct des points de contrôle basés sur l'intégrité de l'ADN (DNA damage checkpoint) qui permet de controler la progression de la phase S. Dans ce mécanisme, laréplication de l'hétérochromatine péricentrique constituerait un verrou stérique qu'il s'agit de surmonter pour pouvoir poursuivre la phase S.

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ces Invitées

• GRC 2006 Chromatin Structure and Function, II Ciocco,Barga (Italie), 21-26 mai 2006 : "Histone dynamicsand their modifications".

• Cold Spring Harbor Meeting on "Dynamic Organizationof Nuclear Function", Cold Spring Harbor Laboratory,New York (NY, USA), 2006 et 2008.

• Keystone Symposia "Genome Instability and Repair",Breckenridge (CO, USA), 17-22 janver 2007:"Interplay between chromatin and repair"

• FASEB Summer Research Conference Chromatin andTranscription, Snowmass (CO, USA), 7-12 juillet 2007.

• GRC 2008 Chromatin Structure and Function, II Ciocco,Barga (Italie), 11-16 mai 2008 : "When histonechaperones meet the replication fork ".

Colloques : 12

Production scientifique depuis le début du projet

On connaît assez bien les différentes étapes conduisant la génèse de vésiculesde transport au niveau du Golgi. Le projet a consisté à étudier des aspects

dynamiques et physicochimiques: désassemblage du manteau COPI induit par lesprotéines ArfGAP, rôle de la courbure, importance de la composition membranaire,

effet de la tension de membrane. Par ailleurs nous avons exploré le caractèregénéral du motif ALPS, senseur de courbure, et pu explorer son rôle dans le casd’une corde membranaire.

Résumé

Protein coats and their control by the GDP/GTPcycle of small G proteins from the Arf family

Bruno Antonny

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le programmeblanc

Acronyme Arf/ManteauxEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 400 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 235

Autres IT : 47Recrutés : 40


Mots clés • Manteau protéique • Courbure membranaire • Hélice Amphipathique • Corde moléculaire

Bruno ANTONNY, (coordinateur) IPMC, UMR 6097 CNRS & université de Nice, Valbonne - Pierre GOUNON, Centre Commun de Microscopie Appliquée, Université de Nice - Jean-Baptiste MANNEVILLE, Institut Curie - UMR 144, Paris

Modèle du motif ALPS et réponse à la courbure membranaire des deux motifs ALPSd’ArfGAP1. D’après Mesmin et al Biochemistry (2007).

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs• Définir un programme bioinformatique basé sur la structure secondaire pour rechercher des hélices amphipathiques particulières• Etablir des mesures de l’attachement de liposomes par des cordes moléculaires.• Suivre l’assemblage d’un manteau protéique sur liposome géant par microscopie optique

Résultats majeursAu début de cet étude, le motif ALPS n'était qu'un curieux motif d'une protéine permettant de sentir la courbure des membranes. Le résultat majeur de notre travail a été ladémonstration que ce motif avait un caractère universel: sa physicochimie originale est en effet retrouvée dans d'autres protéines. Il permet ainsi à un ensemble de protéinestrès variées, de reconnaitre la courbure des membranes et ce pour des fonctions très différentes: arrimer des vésicules à l'appareil de Golgi, détacher un manteau protéiqued'une vésicule ou enfin extraire ou délivrer du cholestérol sur des membranes en fonction de leur état physique. Cela ouvre de nouvelles voies d'études des phénomènes liésau transport membranaire intracellulaire.

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ces• Drin G, Casella JF, Gautier R, Boehmer T, Schwartz TU, Antonny B. (Equipe 1). A general

amphipathic alpha-helical motif for sensing membrane curvature. Nat Struct Mol Biol.2007;14:138-46. Selected by Faculty of 1000 «must read»

• Mesmin B, Drin G, Levi S, Rawet M, Cassel D, Bigay J, Antonny B. (Equipe 1). Two lipid-packing sensor motifs contribute to the sensitivity of ArfGAP1 to membrane curvature.Biochemistry. 2007; 46:1779-90. Selected by Faculty of 1000 «recommended»

• Drin G, Morello V, Casella JF, Gounon P, Antonny B. (Equipes: 1 et 3). Asymmetric tetheringof flat and curved lipid membranes by a golgin. Science. 2008; 320:670-3. Selected byFaculty of 1000 «exceptional »

• Macia E, Partisani M, Favard C, Mortier E, Zimmermann P, Carlier MF, Gounon P, Luton F,Franco M. (Equipes 2 et 3). The pleckstrin homology domain of the Arf6-specific exchangefactor EFA6 localizes to the plasma membrane by interacting with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and F-actin.J Biol Chem. 2008;283:19836-44.

• Gautier R, Douguet D, Antonny B, Drin G. (Equipe 1) HELIQUEST: a web server to screensequences with specific ?-helical properties. Bioinformatics. 2008 ; 24 :2101-2

• Manneville J-B, Casella J-F, Ambroggio E, Gounon P, Bertherat J, Bassereau P, Cartaud J,Antonny B, Goud B. (Equipes 1, 3 et 4). COPI coat assembly occurs on liquid disordereddomains and the associated membrane deformations are limited by membrane tension.Proc Natl Acad Sci USA. 2008 2008 Nov 4;105(44):16946-51.

Invitées•2005. Gordon Conference on molecular membrane

biology. Andover, NH, USA. •2005. Biosciences 2005. From genes to systems.

Glasgow, UK2005. •2006. FEBS meeting. New concepts in lipidology.

Noordwijkerhout. The Netherlands. •2007. FASEB conference on “Arf family GTPases, Il

Ciccio, Italy2007. •2007. Proteins and Membranes a joint venture. Société

Belge de Biophysique

Colloques : 10


L’ezrine qui assure l’ancrage des filaments d’actine à la membrane a un rôleessentiel dans la morphogenèse, la migration, l’adhérence des cellules

épithéliales et participe à la transmission de signaux provenant des facteurs decroissance et des complexes d’adhérence. Nous cherchons à comprendre commentl’ezrine régule l’assemblage de domaines spécifiques de la membrane plasmiquedes cellules épithéliales et participe aux fonctions cellulaires associées à cesdomaines en particulier les microvillosités du pôle apical et les jonctionsadhérentes. Notre hypothèse de travail est que l’ezrine recrute dans cescompartiments des complexes multimoléculaires qui régulent la

polymérisation/l’organisation des filaments d’actine et le transport de protéinesmembranaires. Nous avons identifié les partenaires de l’ezrine qui nousfournissent les bases moléculaires pour comprendre son rôle dans l’organisationdes filaments d’actine et le transport des protéines membranaires. Nous avonsaussi identifié des partenaires de l’ezrine phosphorylée par la kinase Src et nousanalysons le rôle de l’ezrine dans la signalisation en aval des facteurs decroissance.

Résumé

Integration of cortical functions in epithelial cellsby the membrane-cytoskeleton linker ezrin

Monique Arpin

15

le programmeblanc

Acronyme EZRINEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 240 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 144



Mots clés • Morphogenèse• Epithelium• Protéines ERM• Signalisation• Cytosquelette

UMR 144 Morphogenèse et signalisation cellulaires - Institut CurieSurface apicale des cellules épithéliales recouvertes de microvillosités: l’ezrine (rouge) estdistribuée le long des microvillosités.

16

Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs

Résultats majeursPour assurer ses fonctions, l’ezrine doit être dans une conformation active dans laquelle ses sites d’interaction avec l’actine et les protéines membranaires sont démasqués.Des anticorps recombinants reconnaissant des conformations «actives» de la protéine ont été isolés et permettent de suivre l’activation de l’ezrine in vivo lorsqu’ils sontexprimés dans la cellule. Nous avons montré que l’ezrine recrute au pôle apical des cellules un facteur d’échange de la GTPase RhoG et son effecteur, ELMO. Ces protéinesparticipent au remodelage de l’actine et à la macropinoytose. Enfin nous avons montré que l’ezrine phosphorylée par la kinase Src recrute et active la kinase Fes dans lesjonctions adhérentes et cette association est nécessaire pour la dissociation des cellules traitées par l’HGF.

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ces• Srivastava, J., B.E. Elliott, D. Louvard, and M. Arpin. 2005. Src-dependent ezrin

phosphorylation in adhesion-mediated signaling. Mol. Biol. Cell. 16:1481-1490.• Cha, B., M. Tse, C. Yun, O. Kovbasnjuk, S. Mohan, A. Hubbard, M. Arpin, and M. Donowitz.

2006. The NHE3 juxtamembrane cytoplasmic domain directly binds ezrin:dual role inNHE3 trafficking and mobility in the brush border. Mol. Biol. Cell. 17:2661-2673.

• D’Angelo, R., S. Aresta, A. Blangy, L. Del Maestro, D. Louvard, and M. Arpin. 2007.Interaction of ezrin with the novel guanine nucleotide exchange factor PLEKHG6 promotesRhoG-dependent apical cytoskeleton rearrangements in epithelial cells. Mol. Biol. Cell.18:4780-4793.

• Fiévet, B.T., D. Louvard, and M. Arpin. 2007. ERM proteins in epithelial cell organizationand functions. Biochim. Biophys. Acta, Molecular Cell Research. 1773:653-660.

• Monni, R., L. Haddaoui, A. Naba, I. Gallais, M. Arpin, P. Mayeux, and P. Moreau-Gachelin.2008. Ezrin is a target for oncogenic Kit mutants in murine erythroleukemia. Blood.111:3163-3172.

• Naba, A., C. Reverdy, D. Louvard, and M. Arpin. 2008. Spatial recruitment and activationof the Fes kinase by ezrin promotes HGF-induced cell scattering. EMBO J. 27:38-50.

Brevets : 2

Invitées•Arpin: Ezrin/Radixin/Moesin proteins: Conformational

activation and signaling functions. Cytoskeletonworkshop. Bern. 2005.

•Arpin: M. Plasma membrane organization and cellgrowth signaling by the membrane-cytoskeleton linkerezrin. European cytoskeleton workshop. Luxembourg.2005.

•Arpin: M. 2008. Morphogenèse des cellules épithéliales:rôle de l'ezrine dans la régulation des complexesd'adhérence. Adhérence et migration cellulaire:récepteurs et molécules associées. Nice. 2008.

Colloques : 9


Stress Oxydant chez Escherichia coli :homéostasie cellulaire et hétérogénéité

populationnelleFrédéric Barras

17

le programmeblanc

BARRAS Frédéric, Laboratoire de Chimie Bactérienne (LCB), UPR CNRS 9043 - LAFITTE Daniel, Faculté de Pharmacie, UMR CNRS 6032, Université de la Méditerranée -MIHALCESCU Irina, Laboratoire de Spectrométrie Physique, UMR 5588 CNRS-UJF.

Système microfluidique final entièrement contrôlé et piloté par un système de commandecompatible avec le microscope.

T ous les organismes vivants produisent, ou sont exposés à, des dérivés del'oxygène toxiques pour la cellule. Ces espèces, appelées formes actives de

l'oxygène, sont capables d’oxyder les macromolécules biologiques, et plusparticulièrement les protéines, ce qui entraîne une perte de leur activité. Leprésent projet porte sur la réponse cellulaire au stress oxydant et il a comme cadred'étude les microorganismes modèles Escherichia coli et Salmonella typhimurium.Les principaux objectifs se situent à deux échelles, cellulaire et moléculaire. Lespriorités sont axées sur trois points :(i) Une meilleure compréhension des modifications engendrées par le stressoxydant in vivo.

(ii) L’analyse de l’effet du stress oxydant sur l’hétérogénéité populationnelled’une culture bactérienne en phase stationnaire. (iii) L'étude des voies de réparation et de dégradation impliquées dans la luttecontre le stress oxydant.Comprendre les mécanismes mis en jeu au cours du processus du vieillissement,et plus particulièrement l'influence du stress oxydant et de l'arsenal enzymatiquedéveloppé par les organismes vivants pour en limiter les effets, représentel'objectif principal de ce projet.

Résumé

Acronyme Stress OxydantEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 550 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 139,2



Mots clés • Stress oxydant• Escherichia coli• Dommages• Hétérogénéité populationnelle• Salmonella

18

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursProblème technologique lié à l’étude de l’hétérogénéité populationnelle, avec : (i) un retard important dans la mise en place du système microfluidique à Grenoble. Ceproblème a été contourné par le développement d’une plateforme de microfluidie à Marseille permettant l’exploitation de sondes flurescentes, le traitement des images, etle “time lapse” (ii) une importante instabilité des ARN extraits en phase stationnaire. Des techniques d'extraction et de purification appropriées ont permis l’identificationd’un nombre très restreint de gènes ayant une variation significative d’expression entre deux sous-populations.

Résultats majeurs- Etablissement d’une causalité entre agrégats protéiques et mort cellulaire : mise en évidence de ‘hot spots’ de carbonylation au sein des protéines oxydées chez E. coli.- Régulation de la synthèse de la méthionine sulfoxide réductase B : proposition d’un modèle original impliquant inhibition par RhyB et activation par la RNaseE.- Identification d’un arsenal anti-oxydant chez Salmonella. Analyse génétique et phénotypique en conditions de culture et en conditions d’infection.- Construction d’une plateforme d’analyse par microscopie et microfluidique. Construction d’un prototype permettant analyse populationnelle et réponse à des agents externes.

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ces• Maisonneuve E., Fraysse L., Moinier D., Dukan S. Existence of abnormal protein

aggregates in healthy Escherichia coli cells. J. Bacteriol. 190 (2008) 887-893.• Angelini S., Gerez C., Ollagnier de Choudens S., Sanakis Y., Fontecave M., Barras F., Py B.

NfuA, a new factor required for maturing Fe/S proteins in Escherichia coli under oxidativestress and iron starvation conditions. J. Biol. Chem. 283 (2008) 14084-14091.

• Maisonneuve E., Ezraty B., Dukan S. Protein aggregates: an aging factor involved in celldeath. J. Bacteriol. 190 (2008) 6070-6075.

• Maisonneuve E., Fraysse L., Lignon S., Capron L., Dukan S. Carbonylated proteins aredetectable only in a degradation-resistant aggregate state in Escherichia coli. J. Bacteriol.190 (2008). 6609-6614.

• Ansaldi M., Théraulaz L., Baraquet C., Panis G., Méjean V. Aerobic TMAO respiration inEscherichia coli. Mol. Microbiol. 66 (2007) 484-494.

Invitées•-F Barras - University of Miami. Dpt. of Biochemistry

and Molecular Biology. Miami. 2005

Colloques : 8


Proteins of the FtsK family are involved in a wide range of functions in bacteriaand archaea including cell division, chromosome segregation, sporulation,

conjugation and recombination. Escherichia coli FtsK serves to resolve chromosome dimers. It can be divided intothree domains, an N-terminal domain (FtsKN) essential for cell division, a C-terminal domain (FtsKC) that translocates on double stranded DNA and a longlinker region. As FtsKC is anchored in the septum via FtsKN, FtsK translocationmobilizes chromosomal DNA trapped at midcell at cell division. The E. colichromosome carries FtsK-Orienting Polar Sequences (KOPS), which are directlyand stochastically recognized. They provide FtsK with the necessary information to

faithfully distribute the genetic material between the two daughter cells. FtsKC isalso required for direct activation of Xer recombination at dif, which serves toresolve chromosome dimers into monomers. As dif is located in the region whereKOPS converge, the dif region is the last to be segregated, which ensures that Xerrecombination only occurs at the last stage of segregation if a chromosome dimeris still present. The aim of this project was to further our understanding of FtsK activity. Wefocused specifically on how KOPS orient DNA translocation, how DNA translocationis integrated in the cell cycle and whether or not it involves formation of a poreby FtsKN to pass DNA through a closed septum.

Résumé

DNA traffic in bacteria: role and actionmechanism of the ATP-dependent DNA

translocase FtsKFrançois-Xavier Barre

19

le programmeblanc

Acronyme DNA trafficEdition 2005Durée du projet 42 moisFinancement 450 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 42



Mots clés • Chromosome segregation• Cell division • DNA translocation• Site-specific recombination• Single molecule

François-Xavier BARRE, Centre de Génétique Moléculaire, CNRS, Gif sur Yvette Jean-François ALLEMAND, Laboratoire de Physique Statistique, Ecole Normale Supérieure de Paris

DNA translocation by FtsK through a closing septum in bacteria. This picture was created by D. Larivière and E. Fourmentin

20

Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs- Mise en place d’un système de suivi par fluorescence de molécules uniques : construction d’un dispositif d’onde évanescente- Mise en place d'un protocole de purification de formes actives de V. cholerae XerC, XerD et FtsK

Résultats majeurs

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ces• Bigot S, Saleh OA, Cornet F, Allemand JF, Barre FX (2006) Oriented loading of FtsK on

KOPS. Nat Struct Mol Biol 13: 1026-1028.• Lionnet T, Dawid A, Bigot S, Barre FX, Saleh OA, et al. (2006) DNA mechanics as a tool to

probe helicase and translocase activity. Nucleic Acids Res 34: 4232-4244.• Barre FX (2007) FtsK and SpoIIIE: the tale of the conserved tails. Mol Microbiol 66: 1051-

1055.• Bigot S, Sivanathan V, Possoz C, Barre FX, Cornet F (2007) FtsK, a literate chromosome

segregation machine. Mol Microbiol 64: 1434-1441.• Kennedy SP, Chevalier F, Barre FX (2008) Delayed activation of Xer recombination at dif by

FtsK during septum assembly in Escherichia coli. Mol Microbiol 68 1018-1028.• Val M-E, Kennedy SP, El karoui M, Bonné L, Chevalier F, et al. (2008) FtsK-dependent

dimer resolution on multiple chromosomes in the pathogen Vibrio cholerae. PLoS Genet 4:1-11.

Invitées•F.-X. Barre, Workshop on Site-Specific Recombination

and Transposition, September 14-19, 2008, MarineBiological Laboratory, Woods Hole, MA. USA

•F.-X. Barre, FASEB summer research on Nucleic AcidEnzymes, June 8-13, 2008, Saxton’s River, Vermont, USA

•J.-F. Allemand, ASM meeting, June 1-5, 2008, Boston,USA

•F.-X. Barre, International Symposium on ChromosomalDynamics in Ise, May 28-30, 2008, Ise-Shima, Mie, Japan

•F.-X. Barre, ASM conference on Mobile DNA, February24 – March 1, 2006, Banff, Alberta, Canada

Colloques : 10


Notre projet vise à identifier et caractériser les processus qui régissent lastructuration et la dynamique du chromosome du colibacille au cours du cycle

cellulaire. Ce projet a été réalisé en utilisant une approche multidisciplinaireimpliquant de la génétique, de la biologie moléculaire, de la biologie cellulaire,de la bio-informatique et de la génomique. Par des approches de microscopie àfluorescence, nous avons établi une carte topologique du chromosome endéterminant la localisation de sites appartenant à différents macrodomaines dansune cellule sauvage. En suivant la localisation des macrodomaines au cours ducycle cellulaire, nous avons visualisé la dynamique de la molécule d’ADN en

différents points du chromosome et les processus de ségrégation deschromosomes frères. Un système génétique a été développé pour révéler lacapacité des chromosomes frères à interagir entre eux. Nous avons caractérisé lanature de la structuration d’un macrodomaine en identifiant les déterminantsnucléique et protéique impliqués dans sa structuration. Certains remaniementschromosomiques programmés affectant l’organisation des macrodomaines ontdes répercussions importantes sur la physiologie des cellules ; les processusaffectés par ces remaniements ont été identifiés.

Résumé

Conformation and dynamics of the E. colichromosome during cell cycle

Frédéric Boccard

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le programmeblanc

Acronyme EC3

Edition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 200 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 100,8

Autres IT : Recrutés : 36


Mots clés • Organisation du chromosome bactérien• Dynamique de la molécule d’ADN• Cycle cellulaire • Réarrangements chromosomiques • Plasticité des génomes

Centre de Génétique Moléculaire du CNRS, Gif-sur-YvetteCellules anormales ayant subi un réarrangement chromosomique dommageable

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLe système génétique sélectionné pour révéler les interactions intermoléculaires s’est avéré inapproprié pour notre étude. Un nouveau système a du être conçu et développé.Le soutien de l’ANR nous a permis de financer pour moitié l’achat d’un microscope à fluorescence. Différents problèmes (logiciel de pilotage, platine chauffante,automatisation) ont nécessité une période de mises au point et des changements de logiciel.

Résultats majeursDurant ces 3 années, nous avons confirmé directement par microscopie à fluorescence la structuration du chromosome que nous avions révélée par une approche génétique.Les régions définies comme non structurées par l’approche génétique apparaissent moins contraintes que les régions structurées appelées macrodomaines. Le facteur destructuration du macrodomaine Ter et ses cibles ont été identifiés. L’inactivation de facteur nous a permis de révéler l’importance de la structuration du macrodomaine Ter.L’analyse d’un grand nombre de souches ayant subi des réarrangements chromosomiques nous a permis d’identifier les processus qui limitent la plasticité chromosomiquebactérienne. Finalement les interactions interchromosomiques peuvent être détectées par un nouveau système génétique.

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ces• Moulin, L., Rahmouni, A.R., Boccard, F. (2005) Topological insulators inhibit diffusion of

transcription-induced positive supercoils in the chromosome of E. coli. MolecularMicrobiology, 55: 601-610.

• Boccard, F., Esnault, E., Valens, M. (2005) Spatial arrangement and macrodomainorganization of bacterial chromosomes. Molecular Microbiology 57 :9-16.

• Espéli, O., Boccard, F. (2006) Organization of the E. coli chromosome into macrodomainsand its possible functional implications. Journal of Structural Biology, 156:304-310.

• Esnault, E., Valens, M., Espéli, O., Boccard, F. (2007) Chromosome structuring limitsgenome plasticity in E. coli. PLoS Genetics, 3: e226.

• Espéli, O., Mercier, R., Boccard, F. (2008) DNA dynamics vary according to macrodomaintopography in the E. coli chromosome. Molecular Microbiology, 68 : 1418–1427.

• Mercier, R., Petit, M.-A., Schbath, S., Robin, S., El Karoui, M., Boccard, F., Espéli, O.(2008) The MatP/matS site specific system organizes the Terminus region of the E. colichromosome into a Macrodomain. Cell, 135 : 475-485.

Invitées•May 2006: General Meeting American Society for

Microbiology, Orlando, Florida, USA •October 2006: EMBO conference on Molecular

Microbiology: Dynamics, evolution and expression ofprokaryotic genomes, Heidelberg, Germany.

•June 2008: EMBO Workshop on “Replication andSegregation of chromosomes”, Geilo, Norway

•September 2008: Society for General MicrobiologyMeeting, Session “DNA packaging and processing”,Dublin, Ireland.

•Novembre 2008: Annual meeting of the Department ofMicrobiology, Lausanne University.

Colloques : 2


Présente dans de nombreux organismes vivants, la photolyase catalyse laréparation des principales lésions induites dans l'ADN par les UV : les dimères

de pyrimidines du type cyclobutane (CPD) dans lequel deux bases pyrimidiquesadjacentes d'un même brin sont liées par deux liaisons covalentes. La réparationest initiée par un photon bleu ou proche UV absorbé par le cofacteur flavineadénine dinucléotide (FAD) dans sa forme doublement réduite (FADH–). Laphotoréparation implique probablement un transfert d’électron très rapide del’état excité du FADH– vers le CPD, suivi par la rupture des liaisons entre lespyrimidines. Une deuxième photoréaction, appelée photoactivation, permet derétablir l’état doublement réduit FADH– à partir de l’état semi-réduit FADH°.

Cette réaction implique un transfert d’électron le long d’une chaîne de trois résidustryptophane (Trp) vers le FADH° excité. Le projet visait à établir les mécanismesdétaillés de ces réactions.Le fait que toutes ces réactions soient déclenchées par la lumière permet d’utiliserdes techniques spectroscopiques à haute résolution temporelle pour suivre lesmodifications déclenchées par une impulsion lumineuse de courte durée. Desdéveloppements techniques importants étaient envisagés afin de pouvoir résoudreles signaux à la fois rapides et de faible amplitude dus aux photoréactions de laphotolyase.

Résumé

Femtoenzymology – Watching photolyase repairUV-damaged DNA

Klaus Brettel

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le programmeblanc

Acronyme PhotolyaseEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 480 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 64,8



Mots clés • Photolyase de l’ADN• Lésions UV de l’ADN• Transfert d’électron• Femtoenzymologie• Spectroscopie d’absorption cinétique

BRETTEL Klaus, IBITEC-S, CEA Saclay VOS Marten, CNRS UMR7645, Laboratoire d’Optique et Biosciences, Ecole Polytechnique

Le « nanofil » à transfert d’électron ultra-rapide dans la photolyase de l’ADN

24

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLes changements d’absorption liés à la réparation du CPD dans l’ADN sont attendus dans l’UV, zone spectrale difficile à atteindre par la spectroscopie d’absorption cinétique,et sur une échelle temporelle de 100 ps à quelques nanosecondes, à la limite lente des montages ultra-rapide typiques et à la limite rapide des montages « classiques ».La troisième difficulté majeure est la nécessité de remplacer l’ADN réparée par une ADN lésée entre deux coups d’excitation, ce qui complique énormément le moyennagedes signaux, nécessaire pour améliorer le rapport signal sur bruit.

Résultats majeursUn nouveau montage de spectroscopie d’absorption cinétique en temps réel a été conçu et réalisé. Sa résolution temporelle de 300 ps est dix fois meilleure qu’auparavantet permet un recouvrement avec l’échelle femtosecondes-picosecondes de la spectroscopie pompe-sonde ultra-rapide.Nos études détaillées de la photoactivation par spectroscopie ultra-rapide (pompe-sonde) et « classique » (en temps réel) sur des photolyases sauvages et mutées ont établique la chaîne FAD-Trp382-Trp359-Trp306 assure un transfert d’électron sur 15 Å par sauts successifs d’un électron. L’étape limitant est la première, du Trp382 vers le FADH°excité, en ~30 ps. La chaîne se comporte ainsi comme un « nanofil » effectif au sein de la protéine.

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ces• Lukacs, A., Eker, A.P.M., Byrdin, M., Villette, S., Pan, J., Brettel, K., and Vos, M.H. Role of

the middle residue in the triple tryptophan electron transfer chain of DNA photolyase:ultrafast spectroscopy of a Trp?Phe mutant. J. Phys. Chem. B 110, 15654-15658 (2006).

• Byrdin, M., Villette, S., Eker, A. P. M., and Brettel, K. Observation of an IntermediateTryptophanyl Radical in W306F Mutant DNA Photolyase from Escherichia coli SupportsElectron Hopping along the Triple Tryptophan Chain. Biochemistry 46, 10072-10077(2007).

• Byrdin, M., Villette, S., Espagne, A., Eker, A.P.M., and Brettel, K. Polarized TransientAbsorption To Resolve Electron Transfer between Tryptophans in DNA Photolyase. J. Phys.Chem. B 112, 6866–6871 (2008).

• Lukacs, A., Eker, A.P.M., Byrdin, M. Brettel, K. and Vos, M.H. Electron Hopping through the15 Å Triple Tryptophan Molecular Wire in DNA Photolyase Occurs within 30 ps. J. Am.Chem. Soc. 130, 14394-14395 (2008).

Invitées•M. Byrdin, International Plant Photobiology Meeting,

Paris, avril 2006. Light-induced multi-step electrontransfer in DNA photolyase (and cryptochrome).

•K. Brettel, Séminaire de l’Institut de Physique et deChimie des Matériaux de Strasbourg, septembre 2006.Electron transfer and proton dynamics in DNAphotolyase: hopping along the FAD-Trp-Trp-Trp chain.

•M. Vos, COST D35-ESF DYNA Conference on ElectronicExcited States in Condensed Phases, Catane, Italie, juin2008. Ultrafast light-induced flavin reduction in thephoto-enzyme DNA photolyase.

•A. Lukacs, Seminar of the Department of ChemicalSciences and Pharmacy, University of East Anglia,Norwich, UK, novembre 2008. Ultrafast electronhopping between distinct aromatic residues in theflavoprotein DNA photolyase.

Colloques : 9


En 2002, la découverte au Tchad du plus ancien Hominidé connu,Sahelanthropus tchadensis (7 Ma) conduit à revoir de manière drastique les

conceptions sur les premières phases de l’histoire du rameau humain. Cettenouvelle forme est proche de la dichotomie chimpanzés-humains et suggère unedivergence plus précoce que celle prévue par des phylogénies moléculaires. Cesrecherches viennent combler une lacune importante dans notre histoire. Ellesdoivent être approfondies car les relations paléobiogéographiques entre lesgrands bassins sédimentaires africains ont été un élément clé de l’origine et del’histoire des hominidés. Dans ce nouveau contexte, l’Afrique Centrale a joué un

rôle déterminant qui reste encore trop méconnu. L'autre volet de ce projetconcerne l’origine et l’évolution des Anthropoïdes, point de départ de l’aventurehumaine. Nous avons démontré que le berceau des Anthropoïdes était situé enAsie du SE et non en Afrique, mais aussi que la première migration de l’Asie versl’Afrique a eu lieu vers 37 Ma, et non à 60 Ma. Enfin, la mise en évidence sur lesdents de lignes d’arrêt de croissance suggère qu’un climat à forte saisonnalitéexistait dès cette époque en Asie du SE. Ces résultats conduisent à de nouvellesquestions : qui étaient les premiers anthropoïdes ? Les caractères modernes sont-ils adaptatifs vis-à-vis du climat ?

Résumé

Evolution humaine : de l’origine des premiersprimates anthropoïdes à l’emergence des

hominidés. Evolutions et paleoenvironnements

Michel Brunet

25

le programmeblanc

Acronyme EVOLUTION HUMAINE Edition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 450 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 668,6



Mots clés • Hominidés• Anthropoïdes• Origine• Evolution• Paléoenvironnements

BRUNET Michel, Laboratoire de Géobiologie, Biochronologie et Paléontologie Humaine UMR 6046 C.N.R.S. Université de Poitiers - JAEGER Jean-Jacques, Laboratoire de Paléontologie-ISE-M, Institut des Sciences de l’Evolution UMR 5554 C.N.R.S - Université Montpellier II

Secteur fossilifère de Toros-Menalla (Nord Tchad), campagne de terrain 2004. © MPFT 2004

26

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursDes avancées significatives, disciplinaires et technologiques ont été faites durant ce projet. Certaines questions restent pourtant toujours en suspens. Parmi elles, le rôle duclimat sur l'émergence des Hominidés et sur la dispersion des Anthropoïdes et des Hominidés reste une question fondamentale à laquelle nous devrions pouvoir répondredans les années qui viennent. Enfin, il ne peut y avoir d'avancées dans ce domaine de recherche que si l'on peut collecter de nouvelles données sur le terrain. La mise enplace de missions dans des conditions extrêmes nécessite une logistique opérationnelle lourde. Pourtant, le système de gestion des finances n'est pas parfaitement adaptéaux contraintes logistiques liées aux milieux extrêmes en pays étranger.

Résultats majeursDe nombreux résultats ont été publiés (plus de 60 articles dans des revues à comité de lecture). Parmi eux, la forme de la mandibule d'A. bahrelghazali du Pliocène inférieur(3.58 Ma) tchadien confirme la réalité biologique de l’existence de cette nouvelle espèce (Guy et al., JHE, 2008). Nous avons montré l'existence d'une provincepaléobiogéographique (fluvio-lacustre) Tchado / Libyenne au Miocène sup. [3] ; que le paléosahara existe au moins depuis 7 Ma [5] ; modélisé le rôle du Rift Est-Africaindans les modifications climatiques au cours du Miocène sup. [6] et publié une nouvelle méthode de datation radiochronologique [2] pour les fossiles tchadiens. En Asie duSE, de nouveaux primates éocènes et miocènes ont été décrits en Thaïlande ([1], Marivaux et al., AJPA, 2006, etc.) et au Myanmar [4].

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ces• CHAIMANEE, Y., YAMEE, C., TIAN, P., KHAOWISET, K., MARANDAT, B., TAFFOREAU, P.,

NEMOZ, C. & JAEGER, J.-J. (2006) - Khoratpithecus piriyai, a Late Miocene hominoid ofThailand. Amer. J. Phys. Anthrop., 131, 3 : 311-323.

• LEBATARD A.E., D.L. BOURLÈS, P. DURINGER, M. JOLIVET, R. BRAUCHER, J. CARCAILLET, M.SCHUSTER, N. ARNAUD, P. MONIE, F. LIHOREAU, A. LIKIUS, H.T. MACKAYE, P. VIGNAUD &M. BRUNET (2008) - Cosmogenic nuclide dating of Sahelanthropus tchadensis andAustralopithecus bahrelghazali : Mio-Pliocene hominids from Chad. Proc. Nat. Acad. Sci.USA., 105, 9: 3226-3231.

• LIHOREAU F., BOISSERIE J.-R., VIRIOT L., COPPENS Y., LIKIUS A., MACKAYE H. T.,TAFFOREAU P., VIGNAUD P. & BRUNET M., - Anthracothere dental anatomy reveals a lateMiocene Chado-Libyan bioprovince. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 23 : 8763-8767.

• MARIVAUX L., BEARD C.K., CHAIMANEE Y., JAEGER J.J., MARANDAT B., SOE A.N., TUN S.T.,AUNG H.H. & HTOON W. (2008) – Anatomy of the bony pelvis of a relatively large-bodiedstrepsirrhine primate from the middle Eocene Pondaung Formation (central Myanmar).Journal of Human Evolution. 54: 391-404.

• SCHUSTER M., DURINGER P., GHIENNE J.F., VIGNAUD P., MACKAYE H.T., LIKIUS A. &BRUNET M. – The Age of the Sahara Desert. Science, 311 : 821.

• SEPULCHRE P., RAMSTEIN G., FLUTEAU F., SCHUSTER M., TIERCELIN J.-J., BRUNET M.(2006) - Tectonic Uplift and East Africa Aridification. Science. 313 : 1419-1423.

Invitées•Colloque CNRS, Programme "ECLIPSE 2", Colloque de

restitution, Auditorium Marie Curie CNRS Paris, 15-17Octobre 2007

•Third International Conference on the Geology of the Tethys,8-11 January, 2008, South Valley University – AswanTown, Egypte.

•International Conference on Paleoanthropology, Paleontologyand Archaeology in Ethiopia. January 12-14, 2008.Economic Commission for Africa, ECA, Addis Ababa, Ethiopia.

•EGU annual meeting (Vienna, april 2008).•Analytic Working Group - Carnivora. Project NSF/RHOI

(Collaboration HERC University of California, Berkeley):Revealing Hominid Origins Initiative (RHOI); Workshop inthe University of Poitiers: May 20th to May 23rd 2008;

•Sedimentary Basins of Libya, Fourth Symposium, Geology ofSouthern Libya, Tripoli, Libya, November 17-20, 2008

Colloques : plus de 50 colloques


T emperature is one of the principal parameters to which living organisms needto adapt. Bacteria grow in the entire range of temperatures at which water

remains a liquid. Remarkably, many cold-adapted (psychrophilic) bacteria growat 0-10°C nearly as fast as their mesophilic cousins at 30-40°C. Many reactionsinvolving RNA require the interconversion of structures that are separated byelevated energetic barriers. In the absence of RNA helicases, theseinterconversions would be extremely slow. In this respect, research over the pastfifteen years has demonstrated the importance of DEAD-box RNA helicases, aubiquitous family of RNA-dependent ATPases, in nearly all reactions involvingRNA. We have demonstrated previously in mesophilic bacteria the importance of

these enzymes in two fundamental processes; the degradation of mRNA and thebiogenesis of the ribosome. We have now investigated these processes inpsychrophilic bacteria to learn how RNA metabolism is adapted to the cold. Wehave characterized the RNA degradosome, a ribonucleoltyic complex containingan RNA helicase, in a psychrophilic bacterium. We have analyzed the enzymaticproperties of psychrophilic RNA helicases and compared them to their mesophilichomologs. Until now, this area of research has been largely unexplored despitethe obvious economic and ecological interest in psychrophilic bacteria.

Résumé

Cold-Adapted RNA Metabolism

Agamemnon Carpousis

27

le programmeblanc

Acronyme CARMaEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 450 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 102



Mots clés • Psychrophilic bacteria• Cold adaptation• DEAD-box RNA helicase• MRNA degradation• Translation

CARPOUSIS Agamemnon, UMR5100, CNRS et Université Paul Sabatier, ToulouseDREYFUS Marc, UMR8541, CNRS et Ecole Normale Supérieure, ParisBOCKELMANN Ulrich, UMR7038, CNRS et École Supérieure de Physique et de Chimie Industrielles, ParisBIZEBARD Thierry, UPR9073, CNRS, Institut de Biologie Physico-Chimique, Paris

Cellular localization of YFP-tagged RNase E: wild type (wt) and mutants disrupting micro-domain A.

28

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursThe usual difficulties related to manipulating new species of bacteria (establishing growth conditions and efficient transformation/conjugation protocols) or to setting up newexperimental systems (design of optical tweezers for single molecule experiments). An additional difficulty that were have for most part overcome is the handling ofpsychrophilic enzymes, which are thermally denatured at lower temperatures than their mesophilic homologs and in some cases are more sensitive to proteolysis during thepreparation of cell extracts and protein purification.

Résultats majeurs- Characterization of the RNA degradosome of Pseudoalteromonas haloplanktis.- Identification of phylogenetically conserved microdomains in RNase E required for protein-protein interactions in the RNA degradosome and for binding to lipid membranes.- Characterization of the enzymatic properties of DEAD-box RNA helicases from Pseudoalteromonas haloplanktis and Colwellia psychrerythraea.- Comparative analyses of translation initiation in mesophilic vs. psychropilic bacteria in the cold.- Construction of a novel optical tweezers for single molecule studies of RNA helicases.- Synthesis of a RNA substrates for single molecule studies of RNA helicases.

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ces• Iost, I. and Dreyfus, M. (2006) DEAD-box RNA helicases in Escherichia coli. Nucleic Acids

Res 34:4189-4197.• Skorski, P., Leroy, P., Fayet, O., Dreyfus, M. and Hermann-Le Denmat, S. (2006) The

highly efficient translation initiation region from the Escherichia coli rpsA gene lacks aShine-Dalgarno element. J Bacteriol 188:6277-6285.

• Mangeol, P., Cote, D., Bizebard, T., Legrand, O., and Bockelmann, U. (2006) Probing DNA andRNA single molecules with a double optical tweezer. Eur Phys J E Soft Matter 19: 311-317.

• Carpousis, A.J. (2007) The RNA degradosome of Escherichia coli: a multiprotein mRNA-degrading machine assembled on RNase E. Annu Rev Microbiol 61:71-87.

• Skorski, P., Proux, F., Cheraiti, C., Dreyfus, M. and Denmat, S.H. (2007) The deleteriouseffect of an insertion sequence removing the last twenty percent of the essential Escherichiacoli rpsA gene is due to mRNA destabilization, not protein truncation. J Bacteriol189:6205-6212.

• Khemici, V., Poljak, L., Luisi, B.F. and Carpousis, A.J. (2008) The RNase E of Escherichiacoli is a membrane binding protein. Mol Microbiol 70, 799-813.

Brevets : 2

Invitées•A. Carpousis, FASEB Summer Research Conference,

2008, Post-transcriptional Control of Gene Expression:Mechanisms of mRNA Decay, Lucca, Italy.

•A. Carpousis, EMBO Conference on MolecularMicrobiology, Heidelberg, Germany, October 19-23,2006 (principal organizer).

•A. Carpousis, FASEB Summer Research Conference,2006, Post-transcriptional Control of Gene Expression:Mechanisms of mRNA Decay, Snowmass, Colorado,USA.

Colloques : 12


Les gènes des groupes Polycomb et trithorax (PcG et trxG) sont des régulateurschromatiniens responsables du maintien des états d'expression des gènes

homéotiques, ainsi que d'autres gènes développementaux. Le trxG maintien l'étatactif d'expression, alors que le PcG maintien l'état silencieux. Cette fonction de"mémoire cellulaire" implique une régulation des structures chromatiniennesd'ordre supérieur. Nous avons travaillé sur ces aspects en parallèle. Nous avons étudié le rôle des facteurs du PcG dans la régulation de l'organisationnucléaire. En particulier, nous analysons le rôle fonctionnel des associationsnucléaires de deux loci des gènes homéotiques. Nous avons aussi mis au point unetechnique nommée chromosome conformation capture ou 3C dans le laboratoire.

Nous avons cartographié la distribution des protéines du du PcG dans la totalitédu génome chez les embryons de drosophile grâce à la combinaison del'immunoprécipitation de chromatine et les puces à ADN (ChIP on chip). Nousavons ainsi cartographié les protéines PC, PH, GAF, ainsi que les marques demodification des histone H3K27me3 et H3K4me3. Nous sommes en train decartographier la protéine Trx, ainsi que des facteurs qui pourraient intervenir dansle recrutement des protéines du PcG, telles que Pho, Pho-like et Dsp1.

Résumé

Epigenetic regulation of genome function and nuclear architecture : the role

of Polycomb Group proteins

Giacomo Cavalli

29

le programmeblanc

Acronyme Epigénome3DEdition 2005Durée du projet 39 moisFinancement 360 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 35

Autres IT : 19,5Recrutés :


Mots clés • Développement• Biologie moléculaire• Biologie cellulaire

Institut de Génétique Humaine, UPR 1142, CNRS

Comparison of genome-wide mapping of PcG proteins in embryos versus S2 cells

30

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursIl a été difficile, dans un premier temps, d'organiser l'analyse bioinformatique des données génomiques. Désormais ce problème est résolu grâce à l'embauche d'un étudiantde thèse en bioinformatique et à l'attribution d'un poste d'IE en bioinformatique du CNRS en 2008

Résultats majeurs• Nous avons une liste définitive des gènes cibles des protéines du PcG. • Nous avons trouvé que les deux complexes codant pour les gènes Hox établissent un contact dans les noyaux des cellules où ils sont co-réprimé par les protéines• Polycomb. Nous avons prouvé que ces contacts augmentent l’efficacité de répression transcriptionnelle. Nous essayons de cartographier ces contacts via une technique appelée 3C. • Nous avons mis au point une nouvelle version de cette technique 3C qui augmente considérablement la résolution de cartographie des contacts. Nous allons appliquercette technique afin d’identifier les régions responsables de ces contacts géniques fonctionnels.

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ces• Schuettengruber, B., Ganapathi, M., Leblanc, B., Portoso, M., Jaschek, R., Tolhuis, B., van

Lohuizen, M., Tanay, A., and Cavalli, G. (2008). Functional Anatomy of Polycomb andTrithorax Chromatin Landscapes in Drosophila Embryos. PloS Biol, in press

• Schuettengruber, B., Chourrout, D, Vervoort, M., Leblanc, B., and Cavalli, G. (2007).Genome Regulation by Polycomb and Trithorax Proteins. Cell, 128, 735-745.

• Comet, I., Savitskaya, E., Schuettengruber, B., Negre, N., Lavrov, S., Parshikov, A., Juge,F., Gracheva, E., Georgiev, P., and Cavalli, G. (2006). PRE-Mediated Bypass of Two Su(Hw)Insulators Targets PcG Proteins to a Downstream Promoter. Dev Cell 11, 117-124

• Nègre N, Hennetin J, Sun LV, Lavrov S, Bellis M, White, KP, and Cavalli, G. (2006)Chromosomal distribution of PcG proteins during Drosophila development. PLoS Biol 4(6):e170. DOI: 10.1371/journal.pbio.0040170.

• Grimaud, C., Bantignies, F., Pal-Bhadra, M., Ghana, P., Bhadra, U., and Cavalli, G. (2006).RNAi Components Are Required for Nuclear Clustering of Polycomb Group ResponseElements. Cell 124, 957-971.

• Martinez AM, Colomb S, Dejardin J, Bantignies F, Cavalli G (2006) Polycomb group-dependent Cyclin A repression in Drosophila. Genes Dev 20(4): 501-513.

Invitées•Polycomb group proteins and chromatin insulators.

Dynamic Organization of Nuclear Function, Cold SpringHarbor Laboratory, NY, USA, 2006

•Polycomb proteins, chromatin insulators and gene silencing.FASEB Summer Research Conference on Chromatin andTranscription, Snowmass, Colorado, USA., 2007

•Polycomb proteins and the cell nucleus. EMBO Conference serieson nuclear structure and dynamics. Montpellier, France, 2007

•Polycomb proteins and nuclear organization. 20th EuropeanDrosophila Research Conference. Vienna, Austria, 2007

•Talk Polycomb proteins and nuclear organization indevelopmental regulation. Cantoblanco Workshop onChromatin at the Nexus of Cell Division andDifferentiation, Madrid, Spain. 2008

•Chair of the “Nuclear Architecture in Gene Regulation” sessionat the upcoming Keystone meeting “Chromatin Dynamics andHigher Order Structure”, to be held from February 25 toMarch 2, 2009, Coeur d'Alene, Idaho, USA, 2009

Colloques :


Les Eléments Génétiques Mobiles ont fourni une profusion d'exemples nouveauxet sophistiqués de mécanismes de régulation pour limiter les dommages qu'ils

peuvent causer aux génomes hôtes. Les régulations peuvent s'opérer à différentsniveaux: transcriptionnel, traductionnel, post-traductionnel, reconnaissance par latransposase des extrémités, et catalyse. Les séquences d'insertion bactériennes dela famille IS3, possèdent un réseau de régulation particulièrement riche à tous cesniveaux ainsi que d'autres (formation de promoteurs transitoires assurant lasynthèse de la transposase à une étape particulière du cycle transpositionnel).Nous étudions ces régulations dans la famille IS3, et notamment chez IS911,paradigme de la transposition: occlusion des signaux d'initiation traductionnels,

empêchant l'activation fortuite du transposon; décalage de phase traductionnel -1, générant la transposase en tant que protéine de fusion et également uneprotéine régulatrice; par fixation de la transposase naissante avant la fin de satraduction (fixation co-traductionnelle) ce qui limiterait son espace d'activité, carune fois libérée dans la cellule, elle perd son activité; par multimérisation co-traductionnelle entre protéine régulatrice et transposase ce qui pourrait modifierson activité; et, enfin, par un phénomène récemment mis en évidence, la synthèsecontrôlée de formes de transposase tronquées qui inhibent l'activité de latransposase. Pour ceci nous avons employé une combinaison d'approchesgénétiques, biochimiques et biophysiques.

Résumé

Translation Control in Transposable Elements

Michael Chandler

31

le programmeblanc

Acronyme TECONEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancementPersonnels (H-m) C + EC + IR : 77,4

Autres IT : 34Recrutés : 25,5


Mots clés • Transposition procaryotes• Régulation• Traduction• Décalage de phase programmé• Activité en cis

CHANDLER Michael, Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaire - CNRS Organisation d'IS911

32


Résultats majeurs1) Contrôle de l'expression des protéines OrfA (régulatrice) et OrfAB (transposase) d'IS911 par occlusion de la région d'initiation de traduction. 2) Identification, positionnement et activité de motifs d'ARN impliqués dans le décalage de phase programmé (phasage de d'éléments en aval de sites de fixation desribosomes; codons "glissants"; pseudonoeud d'IS3411). 3) implication des protéines ribosomales S5 et S12. 4) fixation co-traductionnelle de la transposase aux niveaux des extrémités in vitro. 5) Modulation du niveau de formes régulatrices de la transposase (formes tronquées). 6) Mise en évidence de structures protéiques potentielles régulatrices de la conformation d'OrfAB (ß-turns conservés presque dans toute la famille IS3) 7) Multimérisation co-traductionnelle d'OrfAB.

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ces•Gueguen, E., Rousseau,P., Duval-Valentin G. and Chandler. M. (2005) The transpososome:

control of transposition at the level of catalysis. TIG. 13: 543-49•Gueguen E, Rousseau P, Duval-Valentin G, and Chandler M. Truncated forms of IS911

transposase downregulate transposition. Mol Microbiol. (2006);62(4):1102-16.•Baranov P. V., Fayet O., Hendrix R. W., Atkins J. F.. 2006. Recoding in bacteriophages and

bacterial IS elements. TIG, 22: 174-181.•Mazauric MH, Licznar P, Prère MF, Canal I, Fayet O. 2008. Apical loop-internal loop RNA

pseudoknots: a new type of stimulator of -1 translational frameshifting in bacteria. J BiolChem. 2008 283:20421-20432.

•chapitre pour livre "Recoding" (editeurs: Gesteland R and Atkins J) devant être publié en2009 par les éditions Springer

Invitées•Mobile Genetic Elements (ASM, Banff) Canada February

2006•Transposition and site-specific recombination, Oxford,

England September 2006•CAMST - Oslo Mobile Elements Symposium, Oslo

Norway December 2006•“Replication, Recombination…” Keystone , Santa Fe,

USA February 2008•International Congress on Transposable Elements, St.

Malo, France, May 2008

Colloques : 7


Conséquences structurales et fonctionnelles des duplications globales de génomes :

étude chez le modèle Paramecium tetraurelia

Jean Cohen

33

le programmeblanc

Acronyme DUPLIGENEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 450 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 196,2


Discipline Biologie et SantéMots clés • Duplications globales de génomes

• Rétention préférentielle de gènesaprès duplication

• Expression du génome• Contrôle traductionnel de

l’épissage des introns• Spéciation

Cohen Jean, Centre de Génétique Moléculaire,CNRS - MEYER Eric, Ecole Normale Supérieure, UMR 8541, Paris - DURET Laurent, LBBE, UMR 5558, Université Lyon 1, Lyon

paramecie.tif

Notre projet a été conçu pour l’étude de l’impact évolutif et fonctionnel desduplications globales de génome en utilisant Paramecium tetraurelia comme

système modèle. Ce génome, qui avait révélé une duplication récente au momentdu séquençage, a en fait subi au moins trois duplications successives dans sonhistoire évolutive. Nous avons montré que lors des pertes de gènes suivant lesduplications, une fraction de gènes restaient en duplicats, entre autres les gènessoumis à des contraintes de dosage. De façon intéressante, nos donnéesd’expression indiquent cependant que la probabilité de rétention des gènesdupliqués est principalement corrélée au taux d'expression de ces gènes ; unnouveau modèle, baptisé ‘Cost of Expression’, permet d’expliquer cette

corrélation. L’apparition de 15 espèces de paramécies, juste après la duplicationla plus récente, semble vérifier l’hypothèse que les duplications globales degénomes peuvent conduire à une spéciation par pertes de gènes sur des copiesdifférentes des chromosomes dupliqués (incompatibilité de Dobzhansky-Muller).L’analyse de la séquence des très courts introns de la paramécie a permis demettre en évidence un biais génomique, présent dans tous les génomes riches enintrons bien que jusqu’alors insoupçonné, qui suggère que l’épissage estrelativement inefficace et que les cellules dépendent étroitement de la traductionet du ‘Nonsense-mediated mRNA Decay’ pour contrôler les profils d’épissage.

Résumé

34

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLa paramécie, comme tous les ciliés possède une lignée nucléaire germinale (micronoyau) et une lignée nucléaire somatique optimisée pour l’expression des gènes(macronoyau) qui dérive de la première par réarrangements programmés de tout le génome. Une question était de savoir s’il existait des pseudogènes en voie de disparition,présents dans le micronoyau mais reconnus comme séquences à éliminer lors du développement du macronoyau, mais le projet de séquençage du génome micronucléairene fait que démarrer, aussi n’avons nous pas encore pu aborder cet aspect très important.

Résultats majeurs1) Le génome de la paramécie a subi trois duplications globales de génome au cours de son évolution. 2) Après chaque duplication, la majorité des gènes retournent à l’état de gène unique par pseudogénisation et perte de gène. 3) La rétention de gènes en duplicats ne se fait pas au hasard, mais dépend du niveau d’expression du gène et de contraintes de dosage des produits codés (protéinesimpliquées dans des complexes à stoechiométrie contrainte). 4) La duplication de génome la plus récente est à l’origine de la spéciation en 15 espèces de paramécies. 5) L’épissage des introns est sous contrôle traductionnel et implique la machinerie de surveillance (NMD).

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ces•Aury, J.M., Jaillon, O., Duret, L., Noel, B.,, Jubin, C., Porcel, B.M., Ségurens, B., Daubin, V.,

Anthouard, V., Aiach, N., Arnaiz, O., Billaut, A., Beisson, J., Blanc, I., Bouhouche, K., Câmara,F., Duharcourt, S., Guigo, R., Gogendeau D., Katinka, M., Keller, A.M., Kissmehl, R., Klotz, C.,Koll, F., Le Mouël, A., Lepère, G., Malinsky, S., Nowacki, M., Nowak, J.K., Plattner, H., Poulain,J., Ruiz, F., Serrano, V., Zagulski, M., Dessen, P., Bétermier, M., Weissenbach, J., Scarpelli, C.,Schächter, V., Sperling, L., Meyer, E., Cohen, J. & Wincker, P. 2006. Global trends of whole-genome duplications revealed by the ciliate Paramecium tetraurelia. Nature 444 171-178.

•Arnaiz O, Cain S, Cohen J. & Sperling, L. 2007.ParameciumDB: a community resource thatintegrates the Paramecium tetraurelia genome sequence with genetic data. Nucl. Acids Res.35, D439-D444.

•Gogendeau, D., Catherine Klotz, C., Arnaiz, O., Malinowska, A., Dadlez, M., Garreau deLoubresse, N., Ruiz, F., Koll, F., & Beisson, J. 2008. Functional diversification of centrinsand cell morphological complexity. J. Cell Science 121, 65-74.

•Jaillon*, O, Bouhouch*, K., Goût, J.F., Aury, J.M., Nöel, B., Saudemont, B., Nowacki, M.,Serrano, V., Porcel, B.M., Ségurens, B., Le Mouël, A. , Lepère, G., Schächter, V., Bétermier,M., Cohen, J., Wincker, P., Sperling, L., Duret, L. & Meyer, E. 2008. Translational control ofintron splicing in eukaryotes. Nature 451, 359-362.

Invitées•Sperling L. (2007). Paramecium genome landscape :

a somatic view of the germline. Conférence invitée auFASEB meeting : Ciliate Molecular Biology. Tucson(USA) 21-27 juillet.

•Bétermier, M. (2007) Precise exicision of internal sequences(IES) in Paramecium involves developmentally programmeddouble-strand breaks and a crosstalk between IESboundaries. Conférence invitée au FASEB meeting on CiliateMolecular Biology. Tucson, Arizona, USA (21-26 Juillet).

•Meyer, E. (2007) Recognition of intervening sequenceswith weak consensus signals: RNA and DNA splicing in theciliate Paramecium. Conférence invitée au meeting‘Mechanisms of Genome Evolution’ de l’American GeneticsAssociation. Bloomington, IN (USA) 11-13 juillet.

Colloques : 52


Décryptage des réseaux de régulationtranscriptionnels gouvernant la prolifération,

la différenciation et l’identité des cellules murinesIrwin Davidson

35

le programmeblanc

DAVIDSON Irwin, Institut Génie Moléculaire Biologie Cellulaire, IGBMC, CNRS, StrasbourgSAMARUT Jacques/FLAMENT Frédéric, Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule, ENS Lyon - FERRIER Pierre, Centre d'Immunologie de Marseille Luminy (CIML) 0-KHOCHBIN Saadi, Biologie Moléculaire et Cellulaire de la Différenciation. Institut Albert Boniot Grenoble - GIRARD Jean-Philippe, Laboratory of Vascular Biology. Institutde Pharmacologie et Biologie Structurale Toulouse - WERNER Michel, Service de Biochimie et de Génétique Moléculaire. CEA Saclay - GERARD Matthieu, Service de BiologieMoléculaire Systémique CEA Saclay.

Cell specific binding of the RAR to the Wnt10b-Wnt1 locus.

T he human and murine genomes encode more than 2000 transcription factors(TFs). Cell phenotype is ultimately determined by the pattern of gene

expression which in turn reflects the set of expressed TFs and the DNA regulatorysites with which they interact. However, the transcriptional networks and themolecular mechanisms that regulate the proliferation and differentiation ofdifferent cell types are poorly understood. The aim of this project is to describe transcription regulatory nodes and networksthat control mouse embryonic stem (ES) cell physiology and to understand howthese are modulated during neural differentiation of mouse ES. To achieve this

goal, we have used genome wide chromatin immunoprecipitation to identifybinding sites and target genes of multiple transcription factors in undifferentiatedand differentiating ES cells and have begun using bioinformatics to integrate thisdata with transcriptome information with the aim to provide a description of theregulatory networks that control neuronal ES cell differentiation. This level ofunderstanding is critical for furthering the therapeutic use of ES cells and forunderstanding tissue differentiation and various pathological states.

Résumé

Acronyme The RegulomeEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 1 200 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 380



Mots clés • Transcription regulatory networks• Transcription factors• Chromatin• Embryonic stem cells• Differentiation

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursThis project involved various technological challenges. We had first to choose a tandem affinity tag (TAP-tag) combination for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP)and protein purification. We had to establish recombineering technologies to facilitate rapid homologous recombination in ES cells to introduce the TAP-Tag at the C-terminusof the selected transcription factors. We had to set up the culture and neuronal differentiation of ES cells. The project also required the implementation of genome-wide ChIPtechnologies. We have established both ChIP-chip and ChIP-seq techniques along with the novel bioinformatics challenges involved in collecting and analysing such largedata sets.

Résultats majeursWe have generated more than 25 ES cell lines where the genes encoding site-specific and general RNA polymerase II transcription factors, subunits of chromatin remodellingcomplexes and components of the RNA polymerase III machinery have been modified to carry a TAP-tag. ChIP-chip and ChIP-seq are in progress and for several lines havebeen successfully used to map the genomic binding sites of these factors in undifferentiated ES cells. For example, neuronal differentiation of ES cells is initiated in vitro usingretinoic acid (RA). We have therefore mapped RAR (RA-receptor) target genes in ES cells. Comparison with transcriptome data identifies a set of rapidly induced target genesinvolved in neuronal differentiation. This data is being integrated with that of other factors such as chromatin modification and remodelling complexes to understand thespectrum factors and events at the regulated promoters.

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ces•Fadloun, A., Kobi, D., Pointud, J-C., Kumar, I., Teletin, M., Bole-Feysot, C., Testoni, B.,

Mantovani, R., Metzger, D., Mengus, G., and Davidson, I. (2007) The TFIID subunit TAF4regulates keratinocyte proliferation and has cell-autonomous and non-cell-autonomoustumour suppressor activity in mouse epidermis. Development. 134(16):2947-58.

•Quignodon L, Vincent S, Winter H, Samarut J, Flamant F. A point mutation in the activationfunction 2 domain of thyroid hormone receptor alpha1 expressed after CRE-mediatedrecombination partially recapitulates hypothyroidism. Mol Endocrinol. 2007 Oct;21(10):2350-60.

•Mugnier B, Nal B, Verthuy C, Boyer C, Lam D, Chasson L, Nieoullon V, Chazal G, Guo XJ, HeHT, Rueff-Juy D, Alcover A, Ferrier P. Coronin-1A links cytoskeleton dynamics to TCR alphabeta-induced cell signaling. PLoS ONE. 2008;3(10):e3467.

•Govin J, Escoffier E, Rousseaux S, Kuhn L, Ferro M, Thévenon J, Catena R, Davidson I, GarinJ, Khochbin S, and Caron C. (2006). Pericentric heterochromatin reprogramming by newhistone variants during mouse spermiogenesis. J. Cell Biol, 176(3):283-94.

•Cayrol C, Lacroix C, Mathe C, Ecochard V, Ceribelli M, Loreau E, Lazar V, Dessen P, Mantovani R,Aguilar L, Girard JP. The THAP-zinc finger protein THAP1 regulates endothelial cell proliferationthrough modulation of pRB/E2F cell-cycle target genes. Blood. 2007 109(2):584-94.

Brevets : 1

Invitées•Davidson : Heidelberg transcription meeting,

co-organiser 2006, invitee 2008.•Ferrier/Andrau Transcription meeting, August 2008,

Heidelberg, Germany, Chromatin plasticity meetingnetwork, January 2008, Lisbon, Portugal

•Khochbin : FASEB Summer Conference on Chromatin & Transcription, July 7-12, 2007 in Snowmass Village,Colorado, USA.

•Werner : Heidelberg transcription meeting, 2006 and2008.

•Gérard. EuroSTELLS Workshop Exploring Chromatin inStem Cells Jan. 23-24, 2007. Montpellier, France

Colloques : 15


Les télomères et les sites fragiles sont des loci dont la réplication pose desproblèmes spécifiques, susceptibles de compromettre la duplication fidèle du

génome. Basé sur des modèles originaux de cellules de mammifères et surl’utilisation d'une méthode de visualisation de fourches de réplication sur desmolécules d'ADN peignées, notre projet vise à étudier la dynamique de réplicationdans ces régions et son impact sur la stabilité des chromosomes. Il est établiqu’une fraction seulement des d’origines de réplication potentielles est activée aucours d'une phase S donnée. La fréquence de déclenchement de chaque origine,qui définit son efficacité, semble strictement régulée dans un type cellulaire

donné, de même que le moment où chacune se déclenche au cours de la phase S. Les facteurs qui régulent ces caractéristiques sont encore très malcompris et une partie importante de notre travail visait à les élucider, ainsi qu’àdéterminer comment le programme spatio-temporel et l’efficacité d'activation desorigines influence la stabilité des sites fragiles communs et des télomèreshumains. Nous avons également étudié les réactions de réparation couplées à laréplication de ces régions particulières.

Résumé

Dynamics of DNA Replication in Mammalian Cells :Impact on Chromosome Stability

Michelle Debatisse

37

le programmeblanc

Acronyme DDRMC/ICSEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 480 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 255,6


Discipline Biologie et SantéMots clés • Régulation de l’initiation

de la Réplication • Contrôle de la progression

des fourches de réplication • Instabilité chromosomique • Sites fragiles communs • Télomères

DEBATISSE Michelle, UMR7147 CNRS/Institut Curie Des fibres avec l'ADN nouvellement synthétisé marqué, par l'IdU (en bleu) et le CldU (envert) et hybridées avec des sondes spécifiques de la région AMPD2 (en rouge) identifientun site d'initiation spécifique.

38


Résultats majeursNous avons montré - que la vitesse de progression des fourches de réplication détermine la densité des évènements d’initiation, et donc la taille des réplicons - que la tailledes réplicons est inversement corrélée à la taille des boucles de la chromatine - que les origines associées aux pieds de ces boucles sont préférentiellement activées. Nousavons enfin montré que les pools de déoxyribonucléotides jouent un rôle majeur dans l’établissement de la dynamique de réplication. Nous avons d’autre part montré - queles télomères se répliquent tout au long de la phase S, avec une dynamique très régulée et conservée entre les types cellulaires et entre différents individus - que cetteréplication des télomères requirt des protéines particulières comme l’hélicase WRN dont l’absence conduit à découpler la réplication du brin précoce de celle du brin retardé,sans activation de checkpoint.

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ces•Courbet S., Gay S., Arnoult N., Wronka G., Anglana M., Brison O., and Debatisse M. (2008)

Replication fork movement sets chromatin loop size and origin choice in mammalian cells.Nature, 455, 557-560.

•Daboussi, F., Courbet, S., Benhamou, S., Kannouche P., Zdzienicka M.Z., Debatisse M., andLopez B.S. (2008) A homologous recombination defect affects replication-fork progressionin mammalian cells. J Cell Sci., 121, 162-166.

•Debatisse,M., El Achkar,E., and Dutrillaux,B. (2006). Common fragile sites nested at theinterfaces of early and late-replicating chromosome bands: cis acting components of theG2/M checkpoint? Cell Cycle, 5, 578-581.

•Arnoult,N., Shin-Ia, K., Londono-Vallejo,J.A. (2008). Studying telomere replication by Q-CO-FISH: the effect of telomestatin, a potent G-quadrupex ligand. Cytogenet Genome Res122. Sous presse.

•Zhdanova,N.S., Minina,J.M., Karamisheva,T.V., Draskovic,I., Rubtsov,N.B., and Londono-Vallejo,J.A. (2007). The very long telomeres in Sorex granarius (Soricidae, Eulipothyphla)contain ribosomal DNA. Chromosome. Res. 15, 881-890.

•Graakjaer J., Der-Sarkissian H., Schmitz,A., Bayer J., Thomas G., Kolvraa,S., and Londono-Vallejo J.A. (2006). Allele-specific relative telomere lengths are inherited. Hum. Genet.119, 344-350.

Invitées•Columbia University, Department of Genetics and

Development. New york, USA, Sept 9 (2008).•International Meeting of the Brazilian Biochemistry

Society, Salvador of Bahia, Brazil, May 21-25 (2007).•10th European Workshop of Molecular Cytogenetics in

Human Solid Tumors, La Grande Motte, Montpellier,France, 8-11 juin (2006).

•Conference on Telomeres and Telomerase in CancerResearch, Tai Pei, Taiwan, 26-29 mars (2006). Invitedlecture: Telomere-Driven Genome Instability Can Lead toFull Tumorigenicity of ER-SV40-Transformed Cells.

Colloques : 12


Our research was concentrated on two main directions: (i) The role of Cdk1activity and the structural maintenance of chromosome (SMC) protein family

for mitosis progression. We were also interested in the identification of inhibitorsof human mitotic kinesin Eg5. (ii) Protein Passenger Complex and Aurora Bkinase. We aimed to understand the structure and mitotic functions of the

passenger protein complex. We were particularly interested to determine the roleof the different members of the complex and their individual domains for thespecific cell cycle localization of the complex. One of the major goals of theproposal was the identification of small molecules acting as novel inhibitors of theoncogenic Aurora kinases.

Résumé

Mitotic chromosomal checkpoint control mechanisms

Stefan Dimitrov

39

le programmeblanc

Acronyme PASPROTEINESEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 400 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 138,2

Autres IT : 95,2Recrutés :


Mots clés • Mitosis• Checkpoints• Aurora kinases• Kinetochore• Passenger proteins

DIMITROV Stefan, Institut Albert Bonniot, INSERM U823 - Institut de Biologie Structurale, JP Ebel, CEA, CNRS, UJF, UMR5075

Colocalization of tubulin, Aurora B and DNA (first row) and tubulin, survivin and DNA(second row)

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Résultats majeurs(i) A single residue substitution transforms human Aurora A into correctly localized and functional Aurora B (ii) Human Kinesin MKLP-2 Impairs the Relocation of Aurora B and Survivin from Centromeres to the Central Spindle.(iii) Benzo[e]pyridoindoles are novel inhibitors of the Aurora kinases(iv) Mitosis persists in the absence of Cdk1 activity when either APC/C dependent proteolysis or protein phosphatase activity is suppressed(V) A distinct SMC5 complex is required for chromatid cohesion and mitotic progression

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ces•Skoufias, D.A., R.L. Indorato, F. Lacroix, A. Panopoulos, and R.L. Margolis (2007) Mitosis

persists in the absence of Cdk1 activity when proteolysis or protein phosphatase activity issuppressed. J Cell Biol. 179:671-85.

•Delacour-Larose, M, Nhung, H., Dimitrov, S. & Molla, A. (2007) “Role of Survivinphosphorylation by Aurora B in mitosis”, Cell Cycle 6(15), 1878-1885

•Rannou Y., Troadec MB., Petretti C., Hans F., Dutertre S., Dimitrov S. and C. Prigent(2008). Localization of aurora A and aurora B kinases during interphase. Role of the N-terminal domain. Cell Cycle 7:19, 3012-3020;

•Kozielski, F., D.A. Skoufias, R.L. Indorato, Y. Saoudi, P.R. Jungblut, H.K. Hustoft,M.Strozynski, and B. Thiede (2008). Proteome analysis of apoptosis signaling by S-trityl-L-cysteine, a potent reversible inhibitor of human mitotic kinesin Eg5. Proteomics. 8:289-300

Brevets : Human Kinesin MKPL-2 inhibitors, methods for preparing sames, usesthere of as medicines and pharmaceuticals compounds containing same

Invitées•Dimitrios A. Skoufias Cell Cycle and Cancer March 25-

28, 2008, Toulouse •S. Behlke-Steinert Cell Cycle and Cancer March 25-28,

2008, Toulouse •Dimitrios A. Skoufias Plasticité et Instabilité des

Génomes Novembre 13-14, 2008 Fontenay-aux-Roses

Colloques : 6


L'originalité de ce projet consiste dans l’intrication étroite entre les travaux degénomique comparative in silico, qui s'appuient essentiellement sur les

séquences génomiques de levures hémiascomycètes, et les travaux expérimentauxqui bénéficient largement de la sophistication des outils génétique chez la levureS. cerevisiae. Les travaux ont été poursuivis simultanément sur l'ensemble desquestions scientifiques posées, à savoir: - 1- l’évolution des gènes des ARN noncodants ; - 2 - l’évolution des gènes d'ARN de transfert ; - 3 - la contribution desintrons à l’évolution des génomes ; - 4 - la formation et la signification desminisatellites ; - 5 - la formation et la signification des gènes en tandems ; - 6 -le rôle des duplications segmentaires ; et - 7 - la contribution des pseudogènes

dans l'évolution. Toutes ces questions se concentrent sur l’origine et la formationdes gènes dans les génomes eucaryotes en prenant les levures comme modèles.Toutes les catégories de gènes sont étudiées, ceux dont les produits sont desprotéines comme ceux dont les produits sont des ARN non-codants, et leurpropriétés sont comparées. Outre les méthodes expérimentales de la biologiemoléculaire, ces travaux reposent sur une ressource informatique communecontenant une partie ouverte au public et une partie réservée aux membres duprésent projet. La partie ouverte au public présente les résultats du ConsortiumGénolevures (GDR 2354) sur les séquences annotées de différents génomes delevures et offre un navigateur, une recherche par Blast et une recherche par mots-

Résumé

How do genes arise ? Lessons and questionsfrom the evolution of yeast genomes

Bernard Dujon

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le programmeblanc

Acronyme GENARISEEdition 2005Durée du projet 40 moisFinancement 450 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 440



Mots clés • Génomique • Évolution• Gène• Levures• ARN

DUJON Bernard, Génétique moléculaire des levures, Institut Pasteur, URA CNRS2171, Université Pierre et Marie Curie, UFR927 - GAILLARDIN Claude, AgroParisTech, UMR INRA1238 / CNRS2585

Les levures hémiascomycètes dont les génomes sont séquencés et leurs surprises

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursCoordination étroite entre biologistes expérimentaux spécialisés dans l’étude des ARN ou celle de la dynamique des génomes, et informaticiens, spécialisés dans lamodélisation mathématique.

Résultats majeursNous avons établi un catalogue comparatif des gènes d’ARN non-codants des levures hémiascomycètes, à partir duquel nous avons découverts des mécanismes d’expansionde séquence et, pour les transcrits de la polymérase III, de fusions transcriptionnelles que nous avons caractérisées expérimentalement. Nous avons découvert des régulationsde l’expression des gènes par épissage alternatif chez Y. lipolytica. A l’aide de mutants de S. cerevisiae, nous avons réussi à proposer un mécanisme moléculaire de formationdes duplications segmentaires spontanées qui jouent un rôle important dans la dynamique et l’évolution des génomes eucaryotes. Nous avons établi les principes d’évolutiondes gènes par fusion de domaines ou fissions. Nous avons identifié une nouvelle catégorie de séquences répétées (mégasatellites) jouant probablement un rôle dansl’adaptation des levures à leur environnement. Enfin, nous avons découvert que le transfert d’ADN mitochondrial dans les chromosomes nucléaires de levure se fait parenvahissement massif de petits fragments, formant des mosaïques aléatoires ayant la propriété intrinsèque de créer de nouvelles séquences.

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ces•Nikolski M., Sherman DJ. (2007) Family relationships: should consensus reign? - consensus

clustering for protein families. Bioinformatics 23(2):e71-e76•Tourrette Y, Schacherer J, Fritsch E, Potier S, Souciet JL, de Montigny J. (2007) Spontaneous

deletions and reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae: influence of ploidy. MolMicrobiol. 64(2):382-95.

•Acker J, Ozanne C, Kachouri-Lafond R, Gaillardin C, Neuvéglise, C, Marck C. (2008)Dicistronic tRNA-5S rRNA genes in Yarrowia lipolytica: an alternative TFIIIA-independentway for expression of 5S rRNA genes. Nucleic Acids Res. 36(18):5832-5844.

•Durrens P, Nikolski M, Sherman DJ. (2008) Fusion and fission of genes define a metricbetween fungal genomes. PLoS Comput Biol. 4(10):e1000200.

•Payen C, Koszul R, Dujon B, Fischer G. (2008) Segmental duplications arise from PoI32-dependent repair of broken forks through two alternative replication-based mechanisms.PloS Genetics 4(9): e1000175

•Thierry A, Bouchier C, Dujon B, Richard GF. (2008) Megasatellites: a peculiar class of giantminisatellites in genes involved in cell adhesion and pathogenicity in Candida glabrata.Nucleic Acids Res. 36(18):5970-5982

Invitées•International Specialized symposum on Yeasts ISSY25,

Hansaari, Espoo, Finland (18-21 Juin 2006) Bernard DujonYeast illustrate the mechanisms of eukaryotic genome evolution

•Linnaeus 300- the future of his science, KNAW, Amsterdam,The Netherlands (1-2 Octobre 2007) Bernard Dujon Genomeevolution and the understanding of biodiversity of yeasts

•International Symposium Yeast Biology at the Turn of the21st Century, Madrid, Spain (27- 28 novembre 2007)Claude Gaillardin Genome evolution of yeasts, from S.cerevisiae to non conventional yeasts

•The 2007 Annual Conference of Japanese Society forBioinformatics, Tokyo, Japon (17-19 decembre 2007) EricWesthof RNA Structural Bioinformatics : from non-Watson-CrickBase Pairs to RNA Motifs & RNA Networks.

Colloques : Plus de 30


La musculature du corps est responsable du mouvement, alors que celle de latête permet la prise de nourriture. La formation de chaque catégorie de muscles

(axiaux, membres et cranio-faciaux) est sous le contrôle de réseaux génétiquesdifférents, qui sont encore mal identifiés. Les gènes Sims (Single minded) codentpour des protéines de la famille des facteurs de transcription bHLH-PAS,essentielles pour le développement du système nerveux central, chez l’embryon desouris et de drosophile. Une première partie du projet consiste à comprendre lafonction des gènes Sim1 et Sim2 dans la formation des muscles, au niveau desmembres et de la tête en utilisant les modèles poulet et souris.

En plus des cascades de gènes nécessaires pour la formation des muscles, lesmuscles doivent être attachés correctement aux os, par l’intermédiaire destendons, afin de pouvoir fonctionner. Les expériences d’embryologie classiquechez l’embryon d’oiseau ont mis en évidence des interactions réciproques entre lestendons et les muscles, au cours du développement. Nous voulons utiliser notreexpertise acquise lors de nos études de la formation des muscles et des tendonsau niveau des membres, pour étudier les interactions muscle-tendon au niveau dela tête et d’identifier les facteurs moléculaires impliqués dans ces intéractions

Résumé

Formation des muscles au cours dudéveloppement : interactions avec les tendons

Delphine Duprez

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le programmeblanc

Acronyme TENDONMUSCLEEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 210 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 54



Mots clés • Muscle• Tendon• Embryon• Poulet• Souris

UMPC, CNRS UMR 7622Expression des gènes Sim dans les membres d’embryons de poulet et de souris

44


Résultats majeursDes expériences de perte de fonction en utilisant les modèles poulet et souris nous ont permis de montrer que le gène Sim1 serait impliqué dans la migration des précurseursmyogéniques au niveau des membres et que le gène Sim2 maintiendrait les cellules myogéniques dans un état indifférencié.

Nous avons cartographié les tendons de la tête en utilisant le marqueur Scleraxis chez l’embryon de poulet. Nous avons étudié les relations entre les cellules de crêtes neurales(donnant les tendons) et les progéniteurs musculaires au niveau céphalique et mis en évidence deux phases pour la formation des tendons : une phase indépendante desmuscles et une autre dépendante des muscles

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ces•Pascal Coumailleau and Delphine Duprez (2008) Sim1 and Sim2 expression during chick

and mouse limb development International Journal of Developmental Biology, sous presse•Grifone, R., Jarry, T.,, Grenier, J., Duprez, D., Robert G. Kelly R.G. (2008) Properties of

branchiomeric and somite-derived muscle development in Tbx1 mutant embryos.Developmental Dynamics. 237, 3071-3078.

•Pascoal, S., Carvalho, C. R., Rodriguez-Leon, J., Delfini, M. C., Duprez, D., Thorsteinsdottir,S. and Palmeirim, I. (2007). A molecular clock operates during chick autopod proximal-distal outgrowth. J Mol Biol 368, 303-9.

•Lejard, V., Brideau, G., Blais, F., Salingcarnboriboon, R., Wagner, G., Roehrl, M. H., Noda,M., Duprez, D., Houillier, P. and Rossert, J. (2007). Scleraxis and NFATc Regulate theExpression of the Pro-{alpha}1(I) Collagen Gene in Tendon Fibroblasts. J Biol Chem 282,17665-75.

•Tozer, S., Bonnin, M. A., Relaix, F., Di Savino, S., Garcia-Villalba, P., Coumailleau, P. andDuprez, D. (2007). Involvement of vessels and PDGFB in muscle splitting during chick limbdevelopment. Development 134, 2579-91.

Invitées•International chick meeting, Barcelona, Espagne

11-14 AVRIL 2007 Delphine Duprez Vasculature-derived PDGF-B is involved in muscle splittingduring chick limb development

•Embo Workshop on the Molecular and CellularMechanisms underlying Skeletal Muscle Formationand Repair, Abbaye Royale de Fontevraud,Saumur France, Septembre 2005 Delphine DuprezInvolvement of vessels in limb muscle spliting

Colloques : 4


Les basophiles et les cellules iNKT constituent deux populationsimmunorégulatrices dont la contribution à la réponse allergique a été bien

démontrée. Elles partagent la capacité de produire rapidement et massivement del’IL-4 qui leur confère un rôle important dans l’établissement de cette réponseTh2. Partant de ces données, nous avons cherché à mieux connaître lesmécanismes qui régulent la production de cette cytokine par ces deux typescellulaires, dans la perspective de développer une stratégie thérapeutique pour

atténuer la réponse allergique. Elle a été évaluée dans deux modèlesexpérimentaux murins qui impliquent les cellules iNKT et/ou les basophiles,notamment l’asthme allergique et la réponse Th2-dépendante des basophiles enréponse à l’injection de protéases comme la papaïne. Nous utilisons des sourisdéficientes pour OCT3 ou le récepteur H4 pour valider le rôle du transporteur oudu récepteur dans ces modèles.

Résumé

Immunoregulatory functions of histamine throughOrganic Cation Transporter 3 (OCT3) and H4 receptors

(H4R) : new targets for anti-allergic treatment ?

Michel Dy

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le programmeblanc

Acronyme IHOHEdition 2005Durée du projet 40 moisFinancement 240 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 52,20



Mots clés • Cytokines• Basophiles• Allergie• Histamine• Cellules NKT

CNRS UMR 8147 - CNRS

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursDéveloppement de lignées de souris déficientes pour OCT3 et le récepteur H4 sur un fond génétique homogène.

Résultats majeurs• La production de cytokines par les basophiles dont l'IL-4, indispensable à la différenciation Th2, est régulée par le taux intracytosolique de bioamines comme l'histamine

et la sérotonine. • Ces amines sont internalisés par l'intermédiaire du transporteur bidirectionnel OCT3 à forte concentration extracellulaire et exercent un contrôle négatif sur les activités

basophiles quand elles atteignent un seuil critique.• Mise en évidence de molécules qui partagent avec les monoamines la capacité d'inhiber les fonctions basophiles sans en avoir les activités physiologiques. • Démonstration d'une activation directe des basophiles par l'IL-33.

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ces•Leite De Moraes Mc, Diem S, Michel Ml, Ohtsu H., Thurmond R.L., Schneider E., Dy M.

Histamine receptor H4 activation positively regulates in vivo IL-4 and IFN-Á production byinvariant natural killer T cells. J. Immunol. 2009 (sous presse).

•Schneider E., Bertron-Petit A.F., Levasseur M., Bricard R., Ramadan A., Girard J.P., HerbelinA., Dy M. IL-33 activates unprimed murine basophils directly in vitro and induces theirexpansion in vivo indirectly through hematopoietic growth factors. Soumis.

Invitées•Dy M.- Histamine and histamine receptors. 5th MCCID

Meeting 2008. Stuttgart, Allemagne – 4-5 Juillet 2008.•Dy M. Le basophile et la réponse immunitaire de type

Th2. Congrès Euro-Africain d'Asthmologie, d'Allergologieet d'Immunologie. Alger, Algérie – 18-21 Juin 2008.

•Massot B., Michel M.L., Dy M., Leite-de-Moraes M.C.Iloprost modules the functional properties of iNKT cells.11e Colloque Cytokines du Croisic, France. 5-7 May 2008.

•Petit-Bertron A.F., Levasseur M., Ribac R., Ramadan A.,Girard J.P., Herbelin A., Schneider E., Dy M. The ST2 ligandIL-33 activates murine basophils and increases theirincidence in vivo. 11e Colloque Cytokines du Croisic, France.

Colloques : 3


De nombreux processus biologiques présentent une robustesse du produit finalen dépit du bruit interne au système et de variations de son environnement.

Cette robustesse peut permettre des changements évolutifs des mécanismes sous-jacents. Nous avons exploré la robustesse du développement de la vulve dunématode Caenorhabditis elegans, un système simple et bien connu. On a examiné les destinées des cellules vulvaires de nombreux animaux desouches naturelles de Caenorhabditis dans différents environnements afin dedéterminer les taux et types d’«erreurs» les plus fréquentes. On étudie si larelâchement de la sélection dans des lignées d’accumulation de mutationsprovoque une chute de la robustesse du système et quels sont les processus les

plus enclins à l’erreur. Dans le réseau de signalisation moléculaire, on établit descourbes dose-réponse, en conjonction avec une modélisation informatique desinteractions entre voies EGF/Ras et Notch. On visualise quantitativementl’activation des voies moléculaires dans les différentes cellules avec des gènesrapporteurs fluorescents. On révéle des variations génétiques cryptiques endéplaçant le système hors de sa zone «tamponnée», en mesurant l’effet d’unemutation, en éliminant des cellules signalisatrices avec un laser ou ensurexprimant la molécule inductrice (LIN-3/EGF), dans différentes souchesnaturelles de C. elegans ou différentes espèces de Caenorhabditis.

Résumé

Robustness and evolution of the molecularnetwork underlying C. elegans vulva development

Marie-Anne Félix

47

le programmeblanc

Acronyme ROBUSTNESSEdition 2005Durée du projet 40 moisFinancement 200 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 140



Mots clés • Robustesse• Développement• Évolution• C. elegans• Vulve

Institut Jacques Monod, UMR7592 CNRS - Universités de Paris 7 et 6Développement canonique de la vulve de Caenorhabditis (haut) et une rare déviation

développementale (bas).

48


Résultats majeursNous avons montré que le fond génétique et l'environnement influencent le type de déviations (erreurs) rares produites par le système. L'accumulation spontanée de mutationsréduit la robustesse du système. Ces déviations font apparaître les pressions de sélection et des mécanismes de rattrapage du système. L'environnement et le fond génétiquesauvage modifient le réseau de signalisation, en n'affectant pas le produit final; ils semblent au moins en partie agir de manière tissu-spécifique. Dans les espèces prochesde C. elegans, les différentes branches du réseau de signalisation évoluent aussi de manière quantitative. Dans les espèces plus éloignées, l'architecture du réseau sembleévoluer, avec une induction tardive de la destinée vulvaire centrale par la cellule ancre.

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ces•Félix, M.-A. (2007). Cryptic quantitative evolution of the vulva intercellular network in

Caenorhabditis. Curr. Biol. 17, 103-114 (long-format research article).•Kiontke, K., Barrière, A., Kolotuev, I., Podbilewicz, B., Sommer, R., Fitch, D.H.A. and Félix, M.-

A. (2007). Evolution of development in the nematode vulva system: trends, stasis and drift.Curr. Biol. 17, 1925-1937 (long-format). different environments. Dev. Cell 15, 714-724.

•Milloz, J., Duveau, F., Nuez, I. and Félix, M.-A. (2008). Intraspecific evolution of the intercellularsignaling network underlying a robust developmental system. Genes Dev. 22, 3064-3075.

•Braendle, C. and Félix, M.-A. (2008). Plasticity and errors of a robust developmentalsystem in different environments. Dev. Cell 15, 714-724.

•Félix, M.-A. and Wagner, A. (2008). Robustness and evolution: concepts, insights, andchallenges from a developmental model system. Heredity 100, 132-140.

•Troemel, E.R., Félix, M.-A., Whiteman, N.K., Barrière, A. and Ausubel, F.M. (2008).Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode C. elegans. PLoS Biol. 6, e309.

Invitées•Gordon Conference “Biology of Aging”, Ventura,

California, USA, Janvier 2006•5th Okazaki Biology Conference “Speciation and

adaptation”, Okazaki-Kakegawa, Japon, Mars 2007•Gordon Conference "Ecological and evolutionary

genomics", Newport, Rhode Island, USA, Juillet 2007•American Society for Cell Biology Annual Meeting

(session plénière), Washington, USA, Décembre 2007•Society for Molecular Biology and Evolution Meeting,

Barcelona, Espagne, Juin 2008.

Colloques : environ 30


L’objectif de ce projet était la détermination de la structure de l’ectodomaine dela glycoprotéine (G) des rhabdovirus. Les deux prototypes de cette famille de

virus enveloppés sont le virus de la rage et le virus de la stomatite vésiculaire(VSV). G est impliquée dans les premières étapes du cycle viral : elle reconnaît unrécepteur à la surface de la cellule hôte puis, après endocytose du virion, elle vapermettre la fusion de la membrane virale avec celle de l’endosome. Cette fusionest déclenchée par l’acidification de l’endosome qui permet le changement deconformation de G depuis sa forme préfusion vers sa forme post-fusion. Celui-cise traduit par l’exposition de résidus hydrophobes qui vont s’insérer dans lamembrane cible et la déstabiliser.

Les propriétés de G sont notablement différentes des autres protéines de fusionvirale dont la structure avait déjà été déterminée. En particulier, alors que pourtoutes les autres protéines de fusion, la forme préfusion est métastable, leschangements de conformation de G induits à bas pH sont parfaitementréversibles : il existe un équilibre dépendant du pH entre les différents étatsstructuraux de la protéine.Nous pensions donc que la détermination de la structure de G permettrait demieux comprendre le fonctionnement des machines virales impliquées dansl’entrée des virus enveloppés.

Résumé

Structure et propriétés de fusion de laglycoprotéine G des rhabdovirus

Yves Gaudin

49

le programmeblanc

Acronyme GRhabStrucEdition 2005Durée du projet 24 moisFinancement 210 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 24



Mots clés • Rhabdovirus • Glycoprotéine• Fusion• Membrane • Structure

Laboratoire de Virologie Moléculaire et Structurale, UMR-CNRS 2472, UMR-INRA 1157Structures pré- et post-fusion de la glycoprotéine G du VSV

50

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLa difficulté majeure du projet consistait à obtenir une forme de la glycoprotéine soluble afin de la cristalliser. Ceci était particulièrement délicat dans notre cas car G est uneprotéine transmembranaire. Nous devions donc réussir à éliminer le domaine transmembranaire en espérant que cela n’affecte pas la structure de l’ectodomaine.

Résultats majeursPar protéolyse ménagée, nous avons obtenu l’ectodomaine de G de VSV sous une forme soluble qui a été cristallisée. Les cristaux obtenus nous ont permis de déterminer àla fois les formes pré- et postfusion de la glycoprotéine G. Ces structures nous ont permis (i) de localiser les sites antigéniques de G, (ii) de situer les boucles de fusion, (iii)de suggérer un mode d’interaction de celles-ci avec la membrane cible, (iv) d’identifier des résidus jouant le rôle d’interrupteurs sensibles au pH et de proposer un cheminpour la transition structurale. Enfin, la structure a révélé un lien évolutif inattendu entre G et la glycoprotéine gB des herpesvirus mettant en évidence l’existence de transfertsde gènes jusque là insoupçonnés.

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ces•Roche S, Albertini AA, Lepault J, Bressanelli S, Gaudin Y. Structures of vesicular stomatitis

virus glycoprotein: membrane fusion revisited. Cell Mol Life Sci. 2008. 65 : 1716-28. •Weissenhorn W, Hinz A, Gaudin Y. Virus membrane fusion. FEBS Lett. 2007. 581 : 2150-5.

Review.•Roche S, Rey FA, Gaudin Y, Bressanelli S. Structure of the prefusion form of the vesicular

stomatitis virus glycoprotein G. Science. 2007. 315 : 843-8.•Roche S, Bressanelli S, Rey FA, Gaudin Y. Crystal structure of the low-pH form of the

vesicular stomatitis virus glycoprotein G. Science. 2006. 313 : 187-91

Invitées•VIIème Congrès de la SFM « Structure-Function Studies of

Viruses ». (Nantes, May 31, 2007). Crystal structure ofvesicular stomatitis virus glycoprotein G and its implicationsfor protein function and evolution.

•Gordon Research Conference « Cell-Cell Fusion ». (Colby-SawyerCollege, New London, USA, July 1-6, 2007). Structure of thevesicular stomatitis virus glycoprotein G in both its pre- andpost-fusion conformation. Implications for membrane fusion.

•150 years of microbiology. (Institut pasteur, Lille, December10-13, 2007). Structural studies on vesicular stomatitis virusG glycoprotein : viral evolution and membrane fusion revisited.

•Keystone symposium : Cell Biology of Virus Entry,Replication and Pathogenesis. (Victoria, Canada, April, 13-18, 2008). Structural Studies on the Vesicular StomatitisGlycoprotein G: Membrane Fusion Revisited.

•XIV International Congress of Virology. (Istambul, Turkey,August 10-15, 2008). Session plénière : Structures of vesicularstomatitis virus glycoprotein: membrane fusion revisited.

Colloques : 5


Bien qu’elles remplissent toutes une fonction de barrière entre le sang et lestissus, les cellules endothéliales ne sont pas toutes équivalentes et l’on

distingue une grande diversité de phénotypes endothéliaux. L’un des plusfrappants est représenté par les cellules endothéliales cuboïdales des organeslymphoïdes et des tissus subissant une inflammation chronique (polyarthriterhumatoïde, maladie de Crohn, …), qui ont une morphologie arrondie et sontspécialisées dans la capture des lymphocytes circulant dans le sang. L’objectif denotre projet ANR était la caractérisation moléculaire et fonctionnelle du phénotypeendothélial cuboïdal par trois approches complémentaires : 1) une approche degénomique cellulaire appliquée aux cellules endothéliales cuboïdales purifiées à

partir de tissus humains, afin d’identifier les gènes perdus lors de la dé-différenciation de ces cellules ex vivo; 2) une approche de génomiquefonctionnelle chez la souris (KO conditionnels spécifiques des cellulesendothéliales cuboïdales) couplée à l’analyse par microscopie intravitale(microscopie réalisée in vivo sur animal vivant); 3) une approche de biologiemoléculaire et cellulaire (interférence ARN dans les cellules endothélialesprimaires humaines) et de génomique fonctionnelle (KO conditionnel) visant àcaractériser la fonction dans les cellules endothéliales, de la protéine THAP1, unnouveau facteur nucléaire de liaison à l’ADN.

Résumé

Diversité des cellules endothéliales:Caractérisation moléculaire et fonctionnelle du phénotype cuboïdal lié à l’inflammation

Jean-Philippe Girard

51

le programmeblanc

Acronyme CUBOÏDALEEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 300 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 170



Mots clés • Cellule endothéliale• Facteur nucléaire• Cytokine• Inflammation• Angiogenèse

Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, IPBS-CNRS-Université de Toulouse III

Visualisation de l’interleukine-33 (en rouge) dans le noyau des cellules endothélialescuboïdales (en vert) sur une coupe d’amygdale humaine.

52

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursObjectif 1 : Perte rapide du phénotype endothélial cuboïdal ex vivo : nécessité de travailler avec des cellules endothéliales cuboïdales fraichement purifiées sans aucune étapede culture in vitro Objectif 2 : Recombinaison homologue site-spécifique dans les cellules endothéliales cuboïdales jamais réalisée auparavant (pas de promoteur spécifique décrit)Objectif 3 : Rôles et fonctions des protéines THAP (12 nouvelles protéines chez l’homme) inconnues chez les mammifères

Résultats majeursObjectif 1 : gènes caractéristiques du phénotype endothélial cuboïdal in vivo: découverte de la protéine double fonction, IL-33/NF-HEV, qui est à la fois une cytokine de typeIL-1 et un facteur nucléaire associé à la chromatine dans le noyau des cellules endothéliales cuboïdales in vivoObjectif 2 : une lignée transgénique HEV-Cre a été développée qui permet l’inactivation spécifique de gènes d’intérêt au niveau des cellules endothéliales cuboïdales chezl’animal adulte. C’est la première fois au monde qu’une recombinaison homologue site-spécifique a pu être réalisée dans les cellules endothéliales cuboïdales. Objectif 3 : le rôle clé de la protéine à doigt de zinc THAP1 dans la régulation de la prolifération des cellules endothéliales a pu être démontré et son premier gène cible invivo a été identifié (RRM1).

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ces•Cayrol C, Lacroix C, Mathe C, Ecochard V, Loreau E, Lazar V, Dessen P, Mantovani R, Aguilar

L and Girard JP. The THAP zinc finger protein THAP1 regulates endothelial cell proliferationthrough modulation of pRB/E2F cell cycle target genes. Blood, 2007, 109:584-594

•Carriere V, Roussel L, Ortega N, Lacorre DA, Americh L, Aguilar L, Bouche G and Girard JP.Interleukin-33, the IL-1-like ligand for ST2 receptor, is a chromatin associated nuclearfactor in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104 :282-287

•Bessière D*, Lacroix C*, Campagne S, Ecochard V, Guillet V, Mourey L, Lopez F, Czaplicki J,Demange P, Milon A,, Girard JP# and Gervais V#. Structure-function analysis of theTHAP-zinc finger of THAP1, a large C2CH DNA-binding module linked to Rb/E2F pathways.J Biol Chem, 2008, 283 :4352-4363 (#Co-corresponding authors)

•Roussel L, Erard M, Cayrol C and Girard JP. Molecular mimicry between IL-33 and KSHV forattachment to chromatin through H2A-H2B acidic pocket. EMBO Reports, 2008, 9:1006-1012.

•Flaishon L*, Hart G*, Zelman E*, Moussion C*, Grabovsky V, Lapidot Tal G, Feigelson S, Margalit R,Harmelin A, Avin-Wittenberg T, Shoseyov D, Alon R, Girard JP and Shachar I. Anti-inflammatoryeffects of an inflammatory chemokine: CCL2 inhibits lymphocyte homing by modulation of CCL21triggered integrin-mediated adhesions. Blood, 2008, in press. (* Co-first authors)

Brevets : US PTO n° 2007 04 2978 (22/02/07)

Invitées•Functional characterization of NF-HEV, a nuclear factor from

high endothelial venules (HEV). MAIN Network of ExcellenceAnnual Meeting (Milan, Italie, 1-2 Octobre 2005)

•THAP zinc finger proteins in the control of endothelial cellproliferation. Inserm International Meeting « Toulouse-Dundee Cancer Alliance », (Toulouse, 23-25 Mars 2006)

•IL-33, the IL-1 like cytokine ligand for receptor ST2, is achromatin-associated nuclear factor in vivo. InternationalCytokine Meeting (Le Croisic, 14-16 Mai 2007)

•NF-HEV/IL-33: chromatin-associated cytokines and theHEV phenotype. MAIN Network of Excellence AnnualMeeting (Madrid, Spain, 18-20 October 2007)

•The THAP-zinc finger protein THAP1, a noveltranscriptional regulator of pRB/E2F cell cycle targetgenes in endothelial cells and development.International meeting « Cell cycle and Cancer »(Toulouse, 25-28 mars 2008)

Colloques : 10


Focal adhesion kinase (FAK) et proline-rich tyrosine kinase 2 (PYK2) forment ungroupe original de tyrosines kinases non récepteurs qui jouent un rôle

fondamental dans l'adhérence, la survie et la motilité des cellules, ledéveloppement et le fonctionnement de nombreux tissus y compris nerveux danslequel elles interviennent dans le développement et la plasticité neuronale. Ellessont impliquées dans des situations pathologiques allant de l'invasion tumoraleet des métastases cancéreuses à l'ischémie cérébrale. L'étape clé de leur mise en

jeu est une autophosphorylation déclenchée par des récepteurs membranaires(FAK) ou une augmentation du Ca2+ cytosolique (PYK2). Ces processusaccompagnent la translocation de FAK dans les contacts focaux et, commel'indiquent nos données récentes, celle de PYK2 dans le noyau. Ce projet a pourbut de déterminer les bases structurales de l'activation et de la localisationintracellulaire de FAK et PYK2 et de développer des inhibiteurs spécifiques.

Résumé

Tyrosines kinases de la famille de FAK : bases structurales de la régulationet de la localisation intracellulaire

Jean-Antoine Girault

53

le programmeblanc

Acronyme FAKsEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 400 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 128

Autres IT : 36Recrutés : 45Autres : 252


Mots clés • Protéines kinases• Transduction du signal• Neurones• Cancer• Adhésion cellulaire

UMR-S839INSERM Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) AROLD Stefan, Centre de Biochimie Structurale, UMR CNRS5048 INSERM 554 - MAIGRET Bernard, UMR 7565 CNRS - GARBAY Christiane, INSERM U648

Translocation nucléaire de PYK2 dans des coupes d'hippocampe (Corvol, Girault)

54

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursNous avons eu des difficultés dans la production de souris mutantes déficientes pour certaines isoformes d'épissage de FAK pour lesquelles nous n'avons pas pu obtenir delignée. Certaines expériences de biologie structurale (SAXS) ont été retardées par manque d'accessibilité à un cyclotron.

Résultats majeursPar des approches convergentes de biochimie et de biologie structurale, combinées à la modélisation in silico et la dynamique moléculaire, nous avons montré que FAK existeen équilibre entre des formes mono- et dimériques et élucidé en grande partie le mécanisme de son activation. En produisant des souris mutantes nous avons montré que l'autophosphorylation de FAK est essentielle in vivo mais qu'il existe des fonctions indépendantes de celle-ci. Nous avons montré que dans les cellules neuronales l'activation de PYK2 s'accompagne d'une translocation nucléaire dépendante de la calcineurine.Nous avons développé une nouvelle famille d'inhibiteurs actifs sur ces enzymes.

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ces•Faure C, Corvol JC, Toutant M, Valjent E, Hvalby O, Jensen V, El Messari S, Corsi JM, Kadaré

G, Girault JA. Calcineurin is essential for depolarization-induced nuclear translocation andtyrosine phosphorylation of PYK2 in neurons. J Cell Sci. 2007 Sep 1;120(Pt 17):3034-44.

•Bonnon C, Bel C, Goutebroze L, Maigret B, Girault JA, Faivre-Sarrailh C. PGY repeats and N-glycans govern the trafficking of paranodin and its selective association with contactin andneurofascin-155. Mol Biol Cell. 2007 Jan;18(1):229-41.

•Corsi JM, Rouer E, Girault JA, Enslen H. Organization and post-transcriptional processing offocal adhesion kinase gene. BMC Genomics. 2006 Aug 4;7:198.

•Garron ML, Arthos J, Guichou JF, McNally J, Cicala C, Arold ST. Structural basis for theinteraction between focal adhesion kinase and CD4. J Mol Biol. 2008 Feb 1;375(5):1320-8.

•Schmalzigaug R, Garron ML, Roseman JT, Xing Y, Davidson CE, Arold ST, Premont RT. GIT1utilizes a focal adhesion targeting-homology domain to bind paxillin. Cell Signal. 2007Aug;19(8):1733-44.

•Martin L, Catherinot V, Labesse G. kinDOCK: a tool for comparative docking of protein kinaseligands. Nucleic Acids Res. 2006 Jul 1;34(Web Server issue):W325-9.

Colloques : 1 en préparation

Invitées•14-03-06 J.A. Girault, Rockefeller University, New

York, USA. •05-06-06 J.A. Girault, EBI- Sanger Center, Cambridge,

UK.•12-10-06 J.A. Girault, Euroconference « Protein kinase

inhibitors » Institut Pasteur, Paris.•25-06-07 S.T. Arold, Queen Mary University of London,

UK.•10-10-07 S.T. Arold, Structural Genomics Consortium,

Toronto, Canada.

Colloques : plus de 20


Plusieurs types principaux de mort cellulaire ont été décrits, l'apoptose, lanécrose, et la mort autophagique. Ces morts non-apoptotiques semblent jouer

un rôle important en particulier dans des contextes pathologiques. Elles peuventêtre plus accessibles expérimentalement dans des modèles biologiques plussimples que les modèles animaux habituels. Les mécanismes correspondantspeuvent être phylogénétiquement conservés, permettant l'extension des résultatsaux eukaryotes supérieurs.Nous étudions les morts caspase-indépendantes dans Dictyostelium discoideum,prenant avantage des propriétés génétiques et de biologie cellulaire

exceptionnellement favorables de cet organisme. Un stimulus développementalentraine chez des cellules de Dictyostelium sauvages une mort cellulairevacuolaire, que nous étudions en détail. Nous avons montré récemment que descellules de Dictyostelium mutantes pour le gène d'autophagie atg1, soumises aumême stimulus, subissent une mort non-vacuolaire. Des résultats préliminairesindiquent que cette mort présente certains aspects de la mort nécrotique chez descellules animales. Ce projet vise à mettre en évidence les mécanismesmoléculaires de ces morts caspase-indépendantes chez Dictyostelium.

Résumé

Studying cell death in the alternative modelorganism Dictyostelium discoideum

Pierre Golstein

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le programmeblanc

Acronyme DictyDeathEdition 2005Durée du projet 39 moisFinancement 250 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 120



Mots clés • Mort cellulaire• Autophagie• Nécrose• Dictyostelium• Évolution

GOLSTEIN Pierre, Centre d'Immunologie INSERM/CNRS/Univ.Medit. de Marseille-Luminy - SATRE Michel, CEA-Grenoble

Mort cellulaire autophagique dans Dictyostelium

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLe problème majeur n'est pas scientifique (ce projet avance correctement), mais économique: il devient apparemment de plus en plus difficile d'obtenir un soutien financierpour un projet de recherche fondamentale faisant appel à un organisme modèle non-animal...

Résultats majeursDans le modèle Dictyostelium, nous avons pu étudier deux types de morts cellulaires, autophagique et nécrotique, et montrer que ces morts se produisent dans ce systèmeen l'absence de caspases et de membres de la famille bcl-2 ; qu'elles peuvent être déclenchées par différents motifs du facteur de différenciation DIF-1 ; que la mortautophagique, étudiée par mutagénèse insertionnelle, implique en particulier le récepteur de l' IP3 et un dérivé de UDP-glucose, et d'autres mutations sont en coursd'analyse ; que la mort cellulaire nécrotique débute par un découplage mitochondrial causal, suivi de lésions lysosomales. Ces études bénéficient pleinement des avantagesgénétiques et analytiques marqués de ce modèle.

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ces•Laporte, C, Kosta, A, Klein, G, Aubry, L, Lam, D, Tresse, E, Luciani, M-F and Golstein, P.

(2007). A necrotic cell death model in a protist. Cell Death Differ. 14, 266-274.•Lam D, JP Levraud, MF Luciani and P Golstein (2007) Autophagic or necrotic cell death in

the absence of caspase and bcl-2 family members. Biochem.Biophys.Res.Com., 363, 536-541.

•Lam, D., Kosta, A., Luciani M.-F. and Golstein, P. (2008) The IP3 Receptor is Required toSignal Autophagic Cell Death, Molecular Biol. Cell, 19, 691-700.

•Tresse, E., Kosta, A., Giusti, C., Luciani, M.-F. and Golstein, P. (2008). A UDP-glucosederivative is required for vacuolar autophagic cell death. Autophagy, 4, 680-691.

•Giusti C., Luciani M.F., Klein G., Aubry L., Tresse E., Kosta A. and Golstein P. (2009).Necrotic cell death : from reversible mitochondrial uncoupling to irreversible lysosomalpermeabilization. Exptl Cell Res. in press

•Luciani MF, Y Kubohara, H Kikuchi, Y Oshima and P Golstein (2009). Autophagic or necroticcell death triggered by distinct motifs of the differentiation factor DIF-1. Cell Death andDifferentiation, in press.

Invitées•Cell Death Meeting, ESH, Cascais Portugal, Octobre

2006 •Keystone Cell Death Meeting, Monterey, April 2007 •ECDO Meeting, Portoroz, Slovenia, Oct. 2007 •Meeting Apoptosis 2008, Luxemburg, Jan. 2008 •ECDO Meeting, Bern, Sept. 2008

Colloques : 29


La mise en place des formes et des organes au cours du développement et del’évolution est une question centrale en biologie. L’importance des gènes Hox

dans la définition du plan du corps chez les animaux est aujourd’hui bien établie.Cependant, les modalités selon lesquelles les protéines Hox contrôlentl’organogenèse et agissent comme facteurs de transcription sont encore mal

définies. Ce programme de recherche a pour objet d’étudier ces questions, enanalysant la fonction des protéines Hox à trois niveaux : l’organe, la cellule et lesmécanismes moléculaires (transcription).

Résumé

Investigating Hox protein Function at theOrganogenetic, Cellular and Transcriptional levels

Yacine Graba

57

le programmeblanc

Acronyme Hox FunctionEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 330 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 232



Mots clés • Développement• Transcription• Morphogenèse• Hox• MED

Yacine GRABA, IBDML, UMR6216, CNRS Université de la Méditerrannée. Marseille - David CRIBBS, CBD, UMR 5547, CNRS Université Paul Sabatier, ToulouseMotifs protéiques, cofacteurs et diversité fonctionnelle des protéines Hox

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Résultats majeurs• Rôle de la régulation spatiale et temporelle de l’activité de voies de signalisation cellulaire dans le contrôle homéotique de la morphogenèse. Ces résultats posent les bases

d’un partenariat Hox/signalisation cellulaires.• Identification des fonctions associées aux sous-unités MED du module CDK8. Ces résultats posent les bases pour analyser les interactions fonctionnelles avec les protéines

Hox.• Identification d’un nouveau mode d’interaction Hox/Pbx. Ce résultat a des implications au regard de la spécificité et diversité de fonction des protéines Hox au cours des

processus développementaux et évolutifs

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ces•S. Diop, K. Bertaux, D. Vasanthi, A. Sarkeshik, B. Goirand, D. Aragnol, N. S. Tolwinski, M.

D. Cole, J. Pradel, J. R.Yates III, R. K. Mishra, Y. Graba* and A. J. Saurin* (2008).EMBOreport, 9 (3), 260-6. (* corresponding authors).

•Lebreton Gaëlle, Faucher christian, Cribbs David L and Benassayag Corinne (2008).Development 135(13):2301-9.

•Merabet S, Saadaoui M, Sambrani N, Hudry B, Pradel J, Affolter M, Graba Y. (2007). ProcNatl Acad Sci U S A. Oct 23;104(43):16946-51.

•Loncle N., Boube M., Joulia L., Boschiero C., Werner M., Cribbs D.L., Bourbon H-M. (2007).Distinct roles for Mediator Cdk8 module subunits in Drosophila development EMBO J, 26 :1045-1054.)

•Miotto, B., Sagnier, T., Berenger, H., Bohmann, D., Pradel, J., Graba, Y (2006). Genes andDevelopment. 2006 Jan 1;20(1):101-121.

•Joulia L, Deutsch J, Bourbon HM, Cribbs DL (2006). Dev Genes Evol. Jul-Aug;216(7-8):431-42.

Invitées•Hox genes in development and evolution.

Fondation des Treilles •Cell signalling in development and disease, EMBO

Workshop•Homeodomain meeting, SFG•Upstream and downstream of Hox Genes, EMBO

Workshop•Nuclear architecture and chromatin dynamics,

Hyderabad.

Colloques : 11


Les microARNs (miRNAs) sont de courts RNA double brins (20-25 nt) qui jouentun rôle essentiel dans le développement chez les organismes inférieurs (C

elegans, Drosophila etc.). An niveau moléculaire, la plupart des miRNAs inhibentspecifiquement l’expression de gènes cibles, soit en induisant la dégradation duRNA messager, soit en bloquant sa traduction. An niveau cellulaire, les miRNASinfluencent la balance entre prolifération, différenciation et mort cellulaire.Environ 200 miRNAs ont été caractérisés à ce jour chez les mammifères, mais leurfonction est encore très mal connue.

Le but de notre projet est 1. d’établir les profils d’expression des miRNAs dans plusieurs modèles importantsde différenciation chez les mammifères, une différenciation de type endodermique(foie) , une différenciation de type mésodermique (muscle) et une différenciationde type ectodermique (système nerveux). 2. d’analyser au niveau fonctionnel les miRNAs exprimés, en utilisant l’approcheque nous avons mis au point et qui utilise des oligonucléotides antisens modifiés.3. d’analyser le mécanisme d’action des miRNAs, en caractérisant les gènescibles, soit par une approche « gène candidat » basée sur les prédictions in silicopubliées, soit par une approche biochimique globale.

Résumé

MicroRNAs in mammalian cell differentiation

Annick Harel-Bellan

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le programmeblanc

Acronyme MiRNAEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancementPersonnels (H-m) C + EC + IR : 90



Mots clés • Différenciation• Muscle• Neurone• Hépatocyte• MicroARNs

Annick HAREL-BELLAN, FRE 2944 Epigénétique et Cancer, CNRS - Odile KELLERMANN, FRE 2937, CNRS - Anne WEBER, INSERMDifférenciation neuronale

60

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursOrganisationnel : Défection de l’entreprise AbCys, qui a du être remplacée par un laboratoire académique (Dr. David C ; Hay, MRC Center for régénérative médicine,Edimburgh, UK). Techniques : 1- Utilisation des puces pour le profiling des miRNAs, qui se sont avérées très peu fiables ; remplacement par les TLDA , qui n’ont été disponibles qu’en 2007.2- Disponibilité de la banque d’antisens pour l’analyse fonctionnelle des miRNAs ‘obtenue en septembre 2008).

Résultats majeursRôle de miR-181 et miR-125 dans la différenciation musculaire- Rôle des miRNAs dans la différenciation des neurones dopaminergiques et dans le contrôle de l’expression des récepteurs- Profil d’expression des miRNAs au cours de la différenciation hépatocytaires de ES humaines.

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ces•NAGUIBNEVA, I, AMEYAR, M, POLESSKAYA, A, AIT-SI-ALI, A., SOUIDI, M, ROBIN, P, and

HAREL-BELLAN, A MiR-181 targets the homeobox protein Hox-A11 on skeletal muscle celldifferentiation. Nat. Cell Biol, 8, 278-284, 2006

•NAGUIBNEVA I, AMEYAR-ZAZOUA M, NONNE N, POLESSKAYA A, AIT-SI-ALI S, GROISMANR, SOUIDI M, PRITCHARD LL, HAREL-BELLAN A. An LNA-based loss-of-function assay formicro-RNAs. Biomed Pharmacother. 2006 Aug 28; [Epub ahead of print]

•POLESSKAYA, A., DUQUET, A., CUVELLIER, S., NAGUIBNEVA, I. MOSS, E. G. and HAREL-BELLAN, A. Lin-28 Binds IGF-2 mRNA and Participates in Skeletal Myogenesis by IncreasingTranslation Efficiency. 2007, Genes & Dev., 21, 1125-1138.

•NAGUIBNEVA I, POLESSKAYA A, AMEYAR-ZAZOUA M, SOUIDI M, GROISMAN R, CUVELLIERS, AIT-SI-ALI S, PRITCHARD LL, HAREL-BELLAN A. Micro-RNAs and muscle differentiation. JSoc Biol. 2007;201(4):367-76. Epub 2008 Mar 5

•AMEYAR-ZAZOUA, M., NAGUIBNEVA, I., PRITCHARD, L.L. AND HAREL-BELLAN, A, HomeoticmiRNAs: from development to pathologies in “Current Research and Perspectives inMicroRNAs”, Springer Biomedical Sciences ed., in press.

Invitées

Colloques : 5


Nous avons montré que les protéines d’enveloppe des rétrovirus possèdent unedouble activité : celle d’opérer la fusion entre virus et cellule cible, et une

activité jusqu’à présent méconnue et pourtant fondamentale pour la « pénétrance» virale : la propriété d’immunosuppression. L’objectif premier du projet consistaità caractériser cette fonction, identifier les domaines protéiques des protéinesd’enveloppe porteurs de la fonction, caractériser les mécanismes cellullaires etmoléculaires par lesquels cette fonction conduit à l’inhibition de la réponseimmune de l’hôte, pour à terme développer d’une part des molécules dirigéescontre le domaine identifié et ayant donc potentiellement des propriétés

antivirales et thérapeutiques, et d’autre part des approches vaccinales basées surle développement d’antigènes optimisés, dans lesquels les domainesimmunosuppresseurs identifiés auront été inactivés par mutagenèse pour lafonction immunosuppressive –sans altération de la structure des antigènes- afind’augmenter l’immunogénicité des préparations vaccinales. Les modèlesexpérimentaux proposés sont constitués d’une part du couple souris/rétrovirusleucémogène de Friend (F-MLV) et d’autre part du couple macaque/rétroviruslentiviral de l’immunodéficience SIV.

Résumé

Domaines immunosuppresseurs des protéinesd’enveloppe rétrovirale : développement de nouvellesapproches vaccinales et de molécules thérapeutiques

Thierry Heidmann

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le programmeblanc

Acronyme VIRO-ISUEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 360 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 90



Mots clés • Rétrovirus• Enveloppe• Immunosuppression• Molécules thérapeutiques• Approches vaccinales

HEIDMANN Thierry, UMR 8122 CNRS, Institut Gustave Roussy

domaine immunosuppresseur (en bleu) d’une enveloppe de rétrovirus endogène humain(syncytine-1) et d’un rétrovirus infectieux de primate (MPM), et acides aminés critiquespour la fonction ISU (cf Mangeney et al 2007)

62

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLes difficultés tiennent à la longueur des expériences dont la plupart sont menées in vivo, sur le modèle souris d’une part et surtout sur le modèle macaque. Les durées desphases d’immunisation, d’établissement de réponses immunes suffisament fortes pour les tests d’épreuve (challenge viral) et de suivi post-challenge se comptent ensemestres. Une prolongation de six mois du programme a été accordée pour achever les expérimentations et les publications.

Résultats majeursCaractérisation des domaines «immunosuppresseurs» (ISU) des protéines d’enveloppe des rétrovirus infectieux et des rétrovirus endogènes, et rôle de ces domaines dans troissituations physiologiques et/ou physiopathologiques étudiées dans le cadre du programme : i) dans la capacité des rétrovirus infectieux à envahir leur hôte via une inhibitionde la réponse immune (réponse innée et réponse adaptative), ii) dans la formation du placenta et la tolérance materno-fétale (e.g. souris knocked-out), et iii) dans laprogression tumorale, via une inhibition de la réponse immune anti-tumorale. Production d’antigènes vaccinaux optimisés par perte de la fonction ISU générant des domainesdont l’immunogénicité est très fortement augmentée (10-100 fois).

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ces•Pothlichet, J., Heidmann, T. & Mangeney, M. A recombinant endogenous retrovirus

amplified in a mouse neuroblastoma is involved in tumor growth in vivo. Int J Cancer,2006, 119, 815-22.

•Pothlichet, J., Mangeney, M. & Heidmann, T. Mobility and integration sites of a murineC57BL/6 melanoma endogenous retrovirus involved in tumor progression in vivo. Int. J.Cancer, 2006, 119, 1869-77.

•Dewannieux, M., Harper, F., Richaud, A., Letzelter, C., Ribet, D., Pierron, G. & Heidmann,T. Identification of an infectious progenitor for the multiple-copy HERV-K humanendogenous retroelements. Genome Res. 2006, 16, 1548-56.

•Mangeney, M., Renard, M., Schlecht-Louf, G., Bouallaga, I., Heidmann, O, Letzelter, C.,Richaud, A., Ducos, B. and Heidmann, T. Placental syncytins: Genetic disjunction betweenthe fusogenic and immunosuppressive activity of retroviral envelope proteins. Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 2007, 104, 20534-39.

•Esnault, C., Priet, S., Ribet, D., Heidmann, O., Heidmann, T. Restriction by APOBEC3proteins of endogenous retroviruses with an extracellular life cycle: ex vivo effects and invivo “traces” on the murine IAPE and human HERV-K elements. Retrovirology, 2008, 5:75.

•Esnault, C., Priet, S., Ribet, D., Vernochet, C., Bruls, T., Lavialle, C.,Weissenbach, J.,Heidmann, T. A placenta-specific receptor for the fusogenic, endogenous retrovirus-derived,human syncytin-2. PNAS, 2008, 105, 17532-37.

Brevets : PCT/EP2006/008907 - PCT/IB2006/000921

Invitées• « Workshop on endogenous retroviruses and

retroelements », Mystic CT, USA (September 7-9,2006).

•« 2007 FASEB Meeting on mobile elements inmammalian genomes », Tucson AR, USA (June 2-72007).

•« CROI 2007, 14th Conference on retroviruses andopportunistic infections», Los Angeles CA, USA February25-28

•« CROI 2009, 16th Conference on retroviruses andopportunistic infections», Montreal , Canada, February8-11.

Colloques : 1


We have discovered a new class of extremely unstable non-coding transcriptsin the genome of S. cerevisiae that we have named CUTs (Cryptic Unstable

Transcripts). They are efficiently degraded by a new nuclear pathway involving apolyadenylation-dependent mechanism. The aim of this project was to investigatethe mechanisms underlying CUTs transcription and degradation. In particular thequestion that have been addressed are:

i) the mechanism responsible for targeting CUTs to degradation, ii) a better characterization of the cellular machinery responsible for there veryrapid elimination, iii) their genomic organization and distribution, iv) their possible roles in new regulatory mechanisms.

Résumé

Cryptic Unstable Transcripts and post-transcriptionnal quality control of

transcription in eukaryotes

Alain Jacquier

63

le programmeblanc

Acronyme CUTsEdition 2005Durée du projet 42 moisFinancement 450 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 156,2



Mots clés • RNA quality control• RNA degradation machinery• Pervasive transcription• Divergent promoters• RNA mediated regulation of gene expression

Alain JACQUIER, Unité de Génétique des Interactions Macromoléculaire (Institut Pasteur - CNRS-URA 2171) - Domenico LIBRI, Bertrand SERAPHIN, (Centre de Génétique Moléculaire - CNRS-UPR 2167)

RNA quality control mechanism

64

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLarge scale, genome-wide characterization of transcripts remains laborious. We are developing technical strategies that will make a better use of the newest deep sequencingtechnologies.Characterization of the biochemical activities involved in CUTs degradation is made difficult by low expression/poor purification of some complexes in sufficient quantities.

Résultats majeursWe have shown that: i) the yeast exosome core exonuclease activity is carried by a single subunit, Dis3, ii) this subunit carries an additional endonuclease activity, iii) CUTsrapid degradation by the exosome is coupled to their transcription termination, which follows a mode similar to that of snoRNAs and differs from that of mRNAs, iv) this modeof termination is only active during the first hundred nucleotides of transcription and is regulated by the phosphorylation status of the CTD of the large PolII subunit, v) genomewide identification of CUTs showed that they are extremely widespread, very often result from divergent transcription from mRNA promoters that happen to be intrinsicallybidirectional and can be involved in new types of regulation mechanisms.

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ces•Neil H, Malabat C., d'Aubenton-Carafa Y., Xu Z., Steinmetz L.M. and Jacquier A. (2009) Widespread

bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast. Nature, In Press•Lebreton A., Tomecki R., Dziembowski A., Séraphin B. (2008) Endonucleolytic RNA

cleavage by a eukaryotic exosome. Nature, 2008 Dec 7. [Epub ahead of print]•Rougemaille M., Dieppois G., Kisseleva-Romanova E., Gudipati R.K., Lemoine S., Blugeon

C., Boulay J., Jensen T.H., Stutz F., Devaux F., Libri D. (2008) THO/Sub2p functions tocoordinate 3'-end processing with gene-nuclear pore association. Cell, 135, 308-321.

•4 Gudipati, R. K., Villa, T., Boulay, J. and Libri, D. (2008) Phosphorylation of RNApolymerase CTD dictates transcription termination choice. Nat Str Mol Biol, 15, 786-794

•Thiebaut, M., Colin, J., Neil, H., Jacquier, A., Seraphin, B., Lacroute, F., Libri, D. (2008)Futile cycle of transcription initiation and termination modulates the response to nucleotidesshortage in S. cerevisiae. Mol Cell, 31, 671-82.

•Rougemaille, M., Gudipati, R.K., Olesen, J.R., Thomsen, R., Séraphin, B., Libri, D.,Jensen, T.H. (2007) Dissecting mechanisms of nuclear mRNA surveillance in THO/sub2complex mutants. EMBO J, 26, 2317-2326.

•Dziembowski, A., Lorentzen, E., Conti, E., Séraphin, B. (2007) A single subunit, Dis3, isessentially responsible for yeast exosome core activity. Nat Struct Mol Biol, 14, 15-22.

•Thiebaut, M., Kisseleva-Romanova, E., Rougemaille, M. Boulay, J. and Libri, D (2006)Transcription termination and nuclear degradation of cryptic unstable transcripts: a role forthe Nrd1-Nab3 pathway in genome surveillance. Mol Cell, 23, 853-64.

Invitées•ESF RNAQuality Meeting, Granada (Spain), 11-13 June

2008. "Novel endonuclease activity of the exosomecontributes to digestion of its physiological substrates"

•ESF RNAQuality Meeting, Granada (Spain), 11-13 June2008. "The complete map of CUTs in Saccharomycescerevisiae: implications for CUTs metabolism andfunctions"

•ESF RNAQuality Meeting, Granada (Spain), 11-13 June2008. "From transcriptional noise to the sound ofregulation"

•EMBO workshop – Gene Transcription in Yeast – SantFeliu (Spain), 21-26 June 2008. "From transcriptionalnoise to the sound of regulation"

•Advanced Workshop Structure and Function of mRNP,University of Aahrus (Danemark) August 4-8, 2008,« RNA 3’-ends and the control of RNA stability »

Colloques : > 20


T his complex research project focused on the understanding of the biogenesis,structure, function and intracellular trafficking of small nuclear RNPs (snRNPs)

which accumulate mainly in the nucleolus (small nucleolar RNPs, snoRNPs) orCajal bodies (small Cajal body-specific RNPs, scaRNPs). All snRNPs are composedof a stable small RNA (snRNA, snoRNA or scaRNA) and a set of associated RNPproteins. The snoRNPs/scaRNPs fall into two structurally and functionally well-defined classes. SnoRNAs and scaRNAs carrying the conserved box C and Delements function mainly as guides in the site-specific 2’-O-methylation, whereas

box H/ACA snoRNAs direct the pseudouridylation of rRNAs and other cellularRNAs. To form functional snoRNPs/scaRNPs, the mature box C/D RNAs associatewith fibrillarin, 15.5 kDa, Nop56 and Nop58 proteins, whereas the box H/ACARNAs form complexes with dyskerin, Nop10, Nhp2 and Gar1 proteins. During thecourse of this research program, we also came across with and became interestedin studying of the function and biogenesis of additional fascinating small RNPs,such as microRNPs and 7SK snRNP.

Résumé

Biosynthesis and function of nucleolar and Cajalbody-specific small ribonucleoproteins

Tamás Kiss

65

le programmeblanc

Acronyme SNOSCAEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 350 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 414,8



Mots clés • Small nucleolar RNA• Small Cajal body RNA• Ribonucleoprotein• Noncoding RNA• Regulatory RNA

Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote du CNRS, UMR5099

Models for coupling intronic small nucleolar ribonucleoprotein (snoRNP) assembly withpre-messenger RNA transcription and splicing.

66

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursWe attempted to achieve in vitro assembly of eukaryotic box H/ACA snoRNPs. This proved the most frustrating part of our work, mainly due to the difficulty in purifyingrecombinant yeast Cbf5p. We finally achieved purification of a recombinant C-terminally deleted version of yeast Cbf5p from inclusion bodies by a denaturation followed bya slow refolding procedure. However, the yields and purity of the protein were insufficient for structural studies and for most biochemical experiments. Hence this project wasabandoned.

Résultats majeursWe have demonstrated that assembly of human box H/ACA snoRNPs occurs co-transcriptionally already during synthesis of pre-mRNAs hosting intron-encoded H/ACAsnoRNAs. We showed that Naf1, an evolutionarily conserved nuclear protein, participates in the assembly of both box H/ACA snoRNPs and the telomerase scaRNP. Wedemonstrated that the human telomerase scaRNP is recruited to telomeres in a cell cycle-specific manner and showed that the terminal stem-loop structure of the 3’-hairpinof human telomerase RNA contains two functionally and structurally distinct element which direct telomerase RNA maturation and accumulation in Cajal bodies.

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ces•Hoareau-Aveilla, C., Bonoli, M., Caizergues-Ferrer, M. and Henry, Y. (2006) hNaf1 is

required for accumulation of human box H/ACA snoRNPs, scaRNPs and telomerase. RNA,12, 832-840.

•Normand, C., Capeyrou, R., Quevillon-Chéruel, S., Mougin, A., Henry, Y. and Caizergues-Ferrer, M. (2006) Analysis of the binding of the N-terminal conserved domain of yeastCbf5p to a box H/ACA snoRNA”. RNA, 12, 1868-1882.

•Jády, B.E., Richard, P., Bertand, E., and Kiss, T. (2006) Cell cycle-dependent recruitment oftelomerase RNA and Cajal bodies to human telomeres. Mol. Biol. Cell, 17, 944-954.

•Richard, P., Kiss, A.M., Darzacq, X., and Kiss, T. (2006) Cotranscriptional recognition ofhuman box H/ACA snoRNAs occurs in a splicing-independent manner. Mol. Cell. Biol., 26,2540-2549.

•Royo H., Basyuk E., Marty V., Marques M., Bertrand E. and Cavaillé, J. (2007) Bsr, anuclear retained RNA with monoallelic expression. Mol. Biol. Cell, 18, 2817-2827.

•Van Herreweghe, E., Egloff, S., Goiffon, I., Jády, B.E., Froment, C., Monsarrat, B., and Kiss,T. (2007) Dynamic remodelling of human 7SK snRNP controls the nuclear level of active P-TEFb. EMBO J., 26, 3570-3580.

Invitées•Kiss, T., Fayet, E., Jády, B.E. and Richard, P.: Box H/ACA

RNAs: An abundant group of non-coding RNAs withdiverse nuclear functions. Regulatory RNAs. The LXXICold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology.Cold Spring Harbor, New York, USA (2006).

•Kiss, T.: Cell cycle-dependent recruitment of telomraseRNA and Cajal bodies to human telomeres. “Telomeresand genome stability, Villars-sur-Ollon, Switzerland,(2006).

•Choesmel, V., Carron, C., Rouquette, J. and Gleizes, P.E.:Nuclear export and cytoplasmic maturation of pre-18SrRNAs in mammalian cells. Ribosome Synthesis 2006International Meeting. Airlie, USA (2006).

•Cavaillé, J.: Tracking the intranuclear fate of imprintedmRNA-like transcripts at the single nucleus. RNAmetabolism and associated pathologies EMBOConference on RNA and Disease. Villa Mondragone,Rome, Italy (2008).

Colloques : 23


Résumé

Structure d’un complexe kinésine-tubuline Marcel Knossow

67

le programmeblanc

Acronyme Kinésine-tubEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 167 520 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 34

Autres IT : 10Recrutés : 31,5


Mots clés • Moteurs• Microtubules• Structure• Anti mitotiques• Cancer

KNOSSOW Marcel, L.E.B.S. CNRS - ROUSSI Fanny I.C.S.N. CNRS

Phomopsine A (magenta) liée à une sous-unité ‚ de la tubuline (vert), au voisinage dunucléotide (orange).

Les kinésines sont des moteurs moléculaires qui catalysent l’hydrolyse de l’ATPet transforment l’énergie chimique libérée en un travail mécanique. La plupart

des kinésines se déplacent de manière processive et unidirectionnelle le long desmicrotubules par pas de 8 nm ; chaque pas est accompagné de l’hydrolyse d’unemolécule d’ATP. Certaines kinésines, appelées KinIs, ne se déplacent pas le longdes microtubules mais les dépolymérisent, ce qui leur confère un rôle dans lamodulation de l’instabilité dynamique des microtubules.Les structures de nombreuses kinésines ont été déterminées à résolution atomiquemais ça n’est pas le cas de complexes kinésine-tubuline. Il est par ailleurs clairque les propriétés fonctionnelles des kinésines changent considérablement lors de

l’interaction avec la tubuline. Des changements importants doivent donc seproduire lors de cette interaction et une information structurale détaillée sur uncomplexe kinésine-tubuline est nécessaire à la compréhension du mécanisme deces moteurs moléculaires.Les principaux objectifs de ce projet étaient donc : (1) de produire un complexetubuline-kinésine homogène et monodisperse ; (2) de caractériser structuralementce complexe, y compris par radiocristallographie ; (3) de caractériserfonctionnellement les kinésines produites et de relier ces données à l’informationstructurale.

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursD’un point de vue organisationnel, le point le plus difficile a été la longueur de délais de recrutement des post-doctorants impliqués dans le projet . Scientifiquement, l’aspectle plus délicat reste l’identification d’un complexe tubuline-kinésine stable et monodisperse qui se prête à l’analyse structurale.

Résultats majeursAu cours de ce projet, nous avons : (1) produit des constructions de kinIs fonctionnelles, en quantités utiles pour la biologie structurale. (2) mis en évidence des différencesclaires entre constructions monomériques et dimériques, ce qui ouvre la voie à une analyse du mécanisme de fixation des kinIs au bout des microtubules. (3) identifiéplusieurs ligands de la tubuline, endogènes ou exogènes, qui ouvrent la voie à l’obtention de complexes tubuline-kinésine homogènes, monodisperses et donc adaptés àl’étude structurale.

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ces•Cormier A., Marchand M., Ravelli R.B.G., Knossow M., Gigant B., (2008) Structural insight

into the inhibition of tubulin by vinca domain peptide ligands, EMBO Reports 9, 1101-6•B. Gigant, A. Cormier, A. Dorléans, R.B.G. Ravelli & M. Knossow (2008) Microtubule-

destabilizing agents: Structural and Mechanistic Insights from the Interaction of Colchicineand Vinblastine with Tubulin Topics in Current Chemistry, doi :10.1007/128_2008_11

•Q.A. Ngo, F. Roussi, A. Cormier, S. Thoret, M. Knossow, D. Guénard & F. Guéritte (2009)Synthesis and Biological Evaluation of Vinca Alkaloids and Phomopsin Hybrids. J. Med.Chem. accepté

Invitées•20th Pasteur-Weizmann symposium – structural biology

(Paris, juin 2006) Structural basis of the control ofmicrotubule assembly

•Colloque de l’AFC (Toulouse, juillet 2006) Conférenceplénière invitée « Assemblages de basse dimensiondans la cellule eucaryote »

•NIMR (Londres, décembre 2006) « The regulation ofmicrotubule assembly, a structural view »

•EMBO course « Studying Cytoskeletal dynamics frombiology to physics » (Gif sur Yvette, 2007) Conférenceinvitée The structuure of tubulin and the control ofmicrotubule assembly

•LMB (Cambridge, septembre 2008) « Structural insightsinto the regulation of microtubule assembly »

Colloques : 5


Notre laboratoire s’intéresse en particulier aux effets cellulaires des métauxtoxiques (cadmium, arsenite, chromate, etc ) chez la levure Saccharomyces

cerevisiae. Nos travaux, basés sur des analyses combinées de transcriptome,protéome et métabolome chez la levure ont montré l’importance majeure de lavoie métabolique des composés soufrés et de la synthèse du glutathion dans laréponse et la survie au cadmium. L’objectif ambitieux de ce projet était de

produire des données quantitatives des protéines, activités enzymatiques etmétabolites de la voie du métabolisme soufré dans les conditions physiologiquesd’intérêt (par exemple en présence de cadmium, de chromate, de méthionine oud’autres conditions susceptibles de modifier l’état métabolique de cette voie) afind’en envisager la modélisation mathématique.

Résumé

Modélisation mathématique de la voiemétabolique du soufre chez la levure

Jean Labarre

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le programmeblanc

Acronyme ModMatMetEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 300 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 65



Mots clés • Modèles mathématiques• Saccharomyces cerevisiae• Métabolisme du soufre• Métabolome• Réponse aux stress

LABARRE Jean, Laboratoire de Biologie Intégrative - iBiTec-S - CEA - JUNOT Christophe, Laboratoire d’Etude du Médicament - iBiTec-S - CEA

70

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursA l’origine, notre demande de financement prévoyait deux post-docs (un dans chaque laboratoire partenaire), mais le financement final obtenu (300 Keuros au lieu de 500)nous a obligé à fonctionner dans ce projet avec un seul post-doc réparti entre les deux équipes. Le projet a donc pris du retard en particulier sur la caractérisation d’enzymeset en conséquence sur les modélisations mathématiques, ce qui nous a conduit à abandonner certaines parties du projet prévu à l’origine.

Résultats majeursLes résultats majeurs de l’étude sont les suivants :(1) la mise au point d’une méthode de quantification absolue des concentrations intracellulaires d’enzymes,(2) la détermination des constantes catalytiques des enzymes de la voie de la transulfuration,(3) la mise au point d’une nouvelle méthode de determination des concentrations intracellulaire des acides aminés et métabolites soufrés par LC-MS ainsi qu’une méthodede quantification des pools métaboliques par la technique « Orbitrap »,(4) l’identification d’un nouveau métabolite dans la voie de biosynthèse du glutathion,(5) l’application des techniques de protéomique et métabolomique quantitative à l’étude de la réponse cellulaire de la levure aux métaux toxique : cadmium, arsenite et chromate,(6) l’utilisation d’approches de modélisation variées, globales ou ciblées, qui ont été d’une aide précieuse pour l’interprétation des résultats expérimentaux.

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ces•Baudouin-Cornu P. and Labarre J. Regulation of the cadmium stress response through SCF-

like ubiquitin ligases: comparison between Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomycespombe and mammalian cells. Biochimie. 2006; 88: 1673-1685.

•Thorsen M., Lagniel G., Kristiansson E., Junot C., Nerman O., Labarre J., and Tamás M.(2007) Quantitative transcriptome, proteome and sulfur metabolite profiling of theSaccharomyces cerevisiae response to arsenite. Physiol. Genomics. 30 : 35-43.

•Madalinski G., Godat E., Alves S., Lesage D., Genin E., Levi P., Labarre J., Tabet J.C., EzanE. and Junot C. (2008) Direct introduction of biological samples into a LTQ-Orbitrap hybridmass spectrometer as a tool for fast metabolome analysis. Anal. Chem. 80 : 3291-3303.

•Baudouin-Cornu P. (2008) St?chiométrique, mon cher Watson. Med Sci. 5 : 483-489.•Pereira Y., Lagniel G., Godat E., Baudouin-Cornu P., Junot C., and Labarre J. (2008)

Chromate causes sulfur starvation in yeast. Toxicol. Sciences 106, 400-412.

Invitées•Jean Labarre : « Analyses protéomiques et métabolomiques

du métabolisme soufré chez la levure. » 7e congrès de lasociété française de Microbiologie à Nantes le 31 mai 2007.

•« Induction of glutathione synthesis pathway in response tocadmium in yeast » symposium "Glutathione and related thiolsin microorganisms and plants" in Nancy (August 26-29, 2008).

•Peggy Baudouin-Cornu :“Relation between environmentand proteomic sulfur content in species » GordonConference le 29 mai 2008 à Lucca (Italie).

•Christophe Junot : « Spectrométrie de masse à ultra-hauterésolution et analyse métabolomique : évaluation de latechnologie Orbitrap pour le profilage métabolique et pourl’identification des métabolites ». Deuxièmes journéesscientifiques du Réseau Français de Métabolomique et deFluxomique. (Saint Sauves d’Auvergnes, 13-15 Décembre 2006).

Colloques : 9


L'objectif central du projet était d'examiner l'implication des phénomènes demécano-transduction, et plus généralement des forces, en biologie du

développement, et de comprendre comment un signal mécanique peut êtreconverti en signal chimique dans un épithélium. Notre modèle d’étude estl'embryon de C. elegans, dont nous analysons l’élongation. Ce processus dépendde la contraction de filaments circonférentiels d'actomyosine dans l'épiderme. Ildépend par ailleurs de l’activité musculaire, sans que l’on comprenne pourquoi etcomment les muscles influent sur l’élongation et l’épiderme. Notre objectif étaitde mieux comprendre le mécanisme de régulation de l’actomyosine dansl’épiderme, et de savoir si les contractions musculaires pourraient contribuer à

cette régulation. Nos points de départ était l’identification au début du travaild’une RhoGAP qui semblait contrecarrer l’activité de la Rho-kinase, et par ailleursla poursuite de la caractérisation de la plakine VAB-10, un composant central deshémidesmosomes qui assurent la connections entre l’épiderme et la cuticule d’unepart, l’épiderme et les muscles d’autre part. Si les approches que nous avonsutilisées n’ont pas toujours été celles envisagées initialement, nous avons (voir ci-dessous) très largement répondu aux objectifs proposés en identifiant enparticulier une nouvelle voie de mécano-transduction.

Résumé

Analyse génétique et cellulaire de la mécanotransduction pendant

la morphogenèse embryonnaire

Michel Labouesse

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le programmeblanc

Acronyme MéKaNoTDTEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 330 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 98



Mots clés • Biologie Cellulaire • Développement• Cytosquelette• Morphogenèse• Signalisation protéine kinase

Michel LABOUESSE, IGBMC UMR 7104 - Marie-France CARLIER, LEBS - UPR 9063A - Jérôme REBOUL, Institut Paoli Calmettes - UMR599

L’absence de la RhoGAP RGA-2 induit un excès de tension dans les cellules dorsales et ven-trales de l’épiderme, ce qui se traduit par une déformation des jonctions (marquage)

72

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLa mise au point de biosenseurs facile à détecter dans des embryons en mouvement permanent s’est révélé plus difficile que prévu en raison de problèmes de seuil dedétection ou de phototoxicité et de la fréquence des mouvements de l’embryon qui excède les capacités des caméras même ultra-sensibles.Une partie des expériences prévues ont pris du retard en raison de l’absence pendant un an de la chargée de recherches devant réaliser les expériences (grossesse gémellairepuis congé parental).

Résultats majeursNos données suggèrent que la première moitié de l’élongation résulte d’une tension induite par la myosine II dans les cellules de l’épiderme latéral en réponse à l’activitédes kinases ROCK et MRCK. Ce faisant elles entraînent des changements dans les cellules de l’épiderme dorsal et ventral qui sont maintenues en état de tension relâché parune RhoGAP bloquant l’activité de ROCK. Un crible génétique nous a aussi permis d’expliquer pourquoi l’activité musculaire est requise pour la deuxième moitié del’élongation. Nous avons (i) identifié plusieurs gènes très conservés au cours de l’évolution qui contribuent au remodelage des hémidesmosomes, (ii) montré que la kinasePAK-1 leur est associée, (iii) que son activité est stimulée par une activité mécanique extérieure pour aboutir à la phosphorylation des filaments intermédiaires.

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ces•Diogon, M., Wissler, F., Quintin, S., Nagamatsu, Y., Sookhareea, S., Landmann, F., Hutter,

H., Vitale, N. and Labouesse, M. (2007) A conserved microfilament-associated RhoGAP actsas a negative regulator of LET-502/Rho-kinase during C. elegans embryonicmorphogenesis. Development 134, 2469-2479. (rated Must Read by F1000).

•Quintin S., Gally C., Labouesse M. (2008) Epithelial morphogenesis in embryos:asymmetries, motors and breaks. Trends in Genetics, 24: 221-230.

•Lecroisey C., Martin E., Mariol M.C., Granger L., Schwab Y., Labouesse M., Ségalat L.,Gieseler K. (2008) DYC-1, a protein functionally linked to dystrophin in Caenorhabditiselegans is associated with the dense body, where it interacts with the muscle LIM domainprotein ZYX-1. Molecular Biology of the Cell, 19:785-96

•Renault, L., Bugyi, B. and Carlier, M.F. (2008) Spire and Cordon-bleu: multifunctionalregulators of actin dynamics. Trends in Cell Biology 18: 494-504.

Invitées•Max Delbrück Center symposium – Berlin (Allemagne),

mai 2006•DFG Schwerpunkt « Cell Polarity » closing meeting –

Dresden (Allemagne), septembre 2006•EMBO workshop – Capri (Italie), Octobre 2006•C. elegans Development meeting – Madison (USA), juin

2008•BioMed Conference on “Morphogenesis and Cell

Behaviour” – Barcelona (Espagne), octobre 2008

Colloques :


Notre projet concerne l’étude du complexe multi-protéique EJC (Exon-JunctionComplex). L’EJC est assemblé sur les ARNm suite à la réaction d'épissage et

les accompagne du noyau vers le cytoplasme. En influant sur la traduction desARNm, leur localisation intra-cellulaire, et leur dégradation, l’EJC est considérécomme un effecteur central de la fonction des ARNm. En dépit de son importance,l'organisation structurale et fonctionnelle de l’EJC est très mal connue. Nos trois équipes avaient pour objectif de partager leurs expertises expérimentalespour analyser les propriétés structurales et fonctionnelles de l’EJC in vitro et invivo. Notre projet comporte trois volets complémentaires: (i) une étude in vitro de

l’EJC est poursuivie dans le groupe d’Hervé Le Hir, pour déterminer comment lesfacteurs de l'EJC interagissent avec le complexe cœur, récemment reconstitué.Cette partie permet également de générer des mutants de l'EJC, ayant perdus l'unou l'autre de ses composants. (ii) L’équipe de Catherine Tomasetto étudie cesinteractions protéiques in vivo par des méthodes d’histochimie et de FRET dansdes cellules humaines en culture. (iii) L’équipe d‘Edouard Bertrand détermine lerôle de l'EJC dans le transport des ARNm, du noyau vers le cytoplasme et àl’intérieur même du cytoplasme. Cette étude est réalisée dans des cellules non-polarisées et des neurones.

Résumé

Etude in vitro et in vivo de l’évolution dynamique du complexe EJC

Hervé Le Hir

73

le programmeblanc

Acronyme L’EJCEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 360 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 154



Mots clés • Génétique Moléculaire• Biologie Cellulaire• ARN messagers• Métabolisme des ARN• Complexe ARN-protéine

LE HIR Hervé, CNRS CGM UPR 2167, Gif-sur-Yvette - TOMASETTO Catherine, INSERM U596/ CNRS UMR 7104 IGBMC, Illkirch - BERTRAND Edouard, CNRS IGMM UMR 5535, Montpellier

Structure 3D de l’Exon Junction Complex

74


Résultats majeursSigne de la complémentarité des trois partenaires ainsi que de l’importance des questions de notre projet initial, les travaux effectués ont conduit à l’obtention de résultatsmajeurs dans les trois volets de notre étude. Les approches de biochimie et biologie moléculaire ont permis (i) de résoudre la structure 3D du cœur de l’EJC (ref 1 et 5), (ii)d’éclaircir les mécanismes de surveillance de l’intégrité des ARNm chez l’homme (refs 2 et 4). Les approches de biologie cellulaire ont également conduit à la mise en évidenced’une nouvelle fonction d’un composant de l’EJC associé au cancer du sein chez l’homme (ref 3).

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ces•Andersen CB*, Ballut L*, Johansen JS, Chamieh H, Nielsen KH, Oliveira CL, Pedersen JS,

Seraphin B, Le Hir H#, Andersen GR#. (2006). Structure of the Exon Junction CoreComplex with a Trapped DEAD-Box ATPase Bound to RNA. Science 313:1968-1972. (* Co-autheurs ; # corresponding authors)

•Durand, S., Cougot, N., Mahuteau-Betzer, F., Nguyen, C.H., Grierson, D.S., Bertrand, E.,Tazi, J., and Lejeune, F (2007). Inhibition of nonsense-mediated mRNA decay (NMD) by anew chemical molecule reveals the dynamic of NMD factors in P-bodies. Journal of CellBiology. 178:1145-60.

•Baguet A, Degot S, Cougot N, Bertrand E, Chenard MP, Wendling C, Kessler P, Le Hir H, RioMC, Tomasetto C. (2007). The exon-junction-complex-component metastatic lymph node 51functions in stress-granule assembly. Journal of Cell Science. 120:2774-84.

•Chamieh H, Ballut L, Bonneau F, Le Hir H. (2008). NMD factors UPF2 and UPF3 bridgeUPF1 to the exon junction complex and stimulate its RNA helicase activity. Nature Structuraland Molecular Biology 15(1):85-93.

•Le Hir H, Andersen GR. (2008). Structural insights into the exon junction complex. CurrentOpinion in Structural Biology. 18(1):112-9.

•Le Hir H & Séraphin B. (2008). The EJCs at the heart of translational control. Cell133(2):213-6.

Invitées•RNA meeting, Wildbad Kreuth (Allemagne) – 2006•Swiss RNA meeting, Bern (Suisse) – 2006•ESF Eurocore RNAQuality, Grenade (Espagne) – 2008•Gordon Research Confererence RNA, Waterville (Etats-

Unis) – 2008•Rencontres de Figeac, Figeac – 2008

Colloques : 8


T he main objectives of the present project were 1/ to identify the circulating andtissue factors whose expression is altered during prolonged fasting/refeeding

using laboratory and wild animals, 2/ to determine the structure of the moleculeslikely to control the metabolic transitions and to trigger refeeding and 3/ topinpoint endogenous and external factors (as clays) which help accelerating therestoration of energy stores during refeeding. A multi-disciplinary and integrativeapproach at the biology/chemistry interface was developed. Peptidomic andproteomic analyses allowed the peptides/proteins that are differentially expressedin rat plasma, liver, and muscles and in penguin plasma during long term fasting-

refeeding to be separated, identified and characterized. DNA microarrays weredesigned to compare the whole transcriptome of rat liver, adipose tissue, muscles,and hypothalamus between the fed and fasted states. Morpho-functional,chemical and mineralogical studies have enabled the in situ follow-up of theadaptations of the intestinal mucosal epithelium to nutritional transitions andtheir relations with food intake associated (or not) to clays. An auto-regulated freeaccess to clay enhanced lipid absorption and induced mucosa adaptation. Ourresults improved the understanding of the mechanisms that manage endogenousenergy stores and optimize the responses to prolonged fasting-refeeding.

Résumé

Régulation des réserves corporelles lors d'une dépletion / réplétion énergétiques :

approches protéomique et morpho-fonctionnelle

Yvon Le Maho

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le programmeblanc

Acronyme PROTEONUTREdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 390 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 127,8



Mots clés • Interface chimie-biologie• Physiopathologie• Biomolécules• Cibles et médicaments

Yvon LE MAHO, IPHC-DEPE, CNRS, ULP, UMR 7178 - Alain VAN DORSSELAER, IPHC-DSA LSMBO, CNRS, ULP, UMR 7178

Molecular bases of the response to fasting-refeeding

76

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursTechnical difficulties in peptidomic/proteomic analyses, i.e. detecting, identifying and characterizing a maximal number of (low-abundant) molecules, needed to developsample preparation and high-sensitive LC systems, and to adjust MS data acquisition parameters. As relevant information was expected from the analysis of plasma samplescollected in spontaneously fasting Adelie penguins, a non-sequenced organism, unclassical MS data interpretations had to be undertaken involving notably de novosequencing. Study of the biochemical implication of clays on digestive physiology was also approached originally. Close collaboration between all participants, biologists andanalysts, allowed to determine the best analytic strategies according to the aim of the study and the type of samples.

Résultats majeursTechnical developments have allowed a number of differentially-expressed peptides/proteins to be identified in response to fasting-refeeding. Specific adaptations have beendetermined from proteomics of plasma samples collected in penguins, which regularly experience periods of excess energy storage and of food deprivation without anydetrimental effect. At the molecular (mRNA, protein) level, altered steps of intermediary metabolism and factors controlling energy homeostasis, haemostasis, stress response,redox state … have been identified and/or are still currently investigated. In rats, free kaolinite ingestion has induced morphologic adaptations and lipid absorption increase(apolipoprotein A-IV surexpression, lipid droplets accumulation).

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ces•F. Bertile, C. Schaeffer, Y. Le Maho, T. Raclot and A. Van Dorsselaer. A proteomic approach

to identify differentially-expressed plasma proteins between the fed and prolonged fastedstates. Proteomics, in press.

•F. Reichardt, C. Habold, B. Chaumande, A. Ackermann, L. Ehret-Sabatier, Y. Le Maho, F. Angel,N. Liewig and J.H. Lignot. Interactions between ingested kaolinite and the intestinal mucosa inrat: proteomic and cellular evidences. Fundamental & Clinical Pharmacology, in press

•C. Habold., F. Reichardt., Y. Le Maho, F. Angel, N. Liewig, J;-H. Lignot, H. Oudart - Clayingestion enhances triglyceride hydrolysis and non-esterified fatty acids absorption. BritishJournal of Nutrition, in press

•F. Bertile and T. Raclot. 2008. Proteomics can help to gain insights into metabolic disordersaccording to body reserve availability. Current Medicinal Chemistry, 15:2545-2558.

•F. Bertile, F. Robert, V. Delval-Dubois, S. Sanglier, C. Schaeffer and A. Van Dorsselaer,2007, Improved biomarker research by a peptidomic approach that enables detection andidentification of plasma low-abundant molecules, Biomarker Insights, 2: 385-401.

•F. Bertile and T. Raclot. Sequential changes in gene expression of adipose tissue lipases inresponse to fuel partitioning in fasted rats. Submitted

Invitées•F. Bertile. 2008. Biodiversity and physiopathological

situations through the eyes of proteomics: an in-depthstudy of metabolic disorders, Nestlé Research Center –Lausanne

•F. Bertile. 2006. A peptidomic approach to identifydifferential plasma peptides between the fed andprolonged fasted states. New Perspectives in Proteomics- European Seminar Series, Sigma - Strasbourg

•M. Rautureau, J. Allègre, N. Liewig., M. Katouzian-Safadi. 2008. Géophagie: pica, pharmacophagie ounécessité vitale. 22e Réunion des Sciences de la Terre et6e Colloque du Groupe français des argiles, Nancy, 21-24 avril 2008

Colloques : 23


Résumé

Probing the mechanical properties of cells in vivo :dynamics and contractility of the

acto-myosin network in Drosophila epithelial cells

Thomas Lecuit

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le programmeblanc

Acronyme DrosActinCutEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 330 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 40

Autres IT : Recrutés : 28Doctorants : 24


Mots clés • Mécanique cellulaire • Instrumentation optique pour

la biologie• Morphogenèse• Biologie du développement• Biophysique

LECUIT Thomas, IBDML, UMR 6216, CNRS-Universtié de la Méditerranée - LENNE Pierre-François, Institut Fresnel, UMR6133, CNRS-Université d’Aix-Marseille III

Image d’embryon de Drosophile illustrant la technique d’ablation permettant de mesurerla tension aux contacts cellulaires.

Le projet DrosActinCut vise à développer des méthodes spécifiques pour mesureret déterminer le rôle des forces de tension corticale du réseau d'acto-myosine

associées à la morphogenèse tissulaire in vivo. Nous étudions l'intercalationcellulaire, un processus conservé reposant sur le remodelage polarisé des interfacesadhérentes de cellules épithéliales. Le système étudié est l'embryon précoce dedrosophile, un système remarquablement adapté aux méthodes récentesd'imagerie permettant de suivre la dynamique cellulaire et moléculaire in toto, eten raison des approches fonctionnelles génétiques propres au modèle drosophile.Le réseau d'acto-myosine gouverne la forme et le comportement dynamique descellules. Notre projet vise à étudier la dynamique et les propriétés mécaniques duréseau d'acto-myosine au cours du remodelage des interfaces cellulaires pendantl'intercalation. Nous suivrons la dynamique de l'actine (polymérisation etdépolymérisation) avec des techniques de fluorescence (Fluorescence Loss Inducedby Photobleaching et Fluorescence Recovery after Photobleaching) et à l'aide devariants fluorescents de l'actine. Cette étude nous permettra d'observer uneanisotropie possible de la dynamique de l'actine en relation avec le remodelage

des jonctions adhérentes durant l'intercalation. Par ailleurs, nous approfondironsl'étude de cdGAP, une protéine Gap régulatrice de Rac1 et Cdc42, interagissantavec le réseau d'acto-myosine et impliquée dans l'intercalation cellulaire.Pour étudier les propriétés mécaniques des jonctions adhérentes et le rôle du réseaud'acto-myosine, nous développons et utilisons des outils optiques spécifiques. Toutd'abord, nous tentons de modifier l'équilibre des forces agissant sur les jonctionsavec un système dynamique de pinces optiques. Nous cherchons à perturber labalance des forces contradictoires du réseau contractile d'acto-myosine etd'adhésion, en exerçant des forces sur plusieurs billes placées aux jonctions.Nous développons en outre un microscope pour réaliser la nanoablation du réseaud'acto-myosine, à l'aide d'impulsions laser femtosecondes dans le proche infra-rouge. L'étude du mouvement des filaments fragmentés et l'observation desrearrangements cellulaires permettent d'identifier les mécanismes moteurs del'intercalation et probablement la distribution des «générateurs» de forceresponsables du remodelage des jonctions adhérentes.

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursAnalyse quantitative d’un mouvement morphogénétique dans son ensemble.Perturbation mécanique locale à l’échelle subcellulaire.

Résultats majeursLes résultats obtenus concernent à la fois des aspects scientifiques et technologiques. Nous avons proposé et validé un modèle mécanique minimal rendant compte del’intercalation cellulaire (changement de voisinage de cellules) et de l’élongation de l’épithélium de l’embryon de Drosophile, telle qu’observées in vivo. Nous avons mis en place un système de nano-dissection laser permettant de casser localement le réseau d’acto-myosine aux interfaces cellulaires en préservant l’intégritédes membranes en contact. A l’aide de ce dispositif, il est possible de déterminer la valeur relative des tensions aux interfaces cellulaires in vivo.

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ces•Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.

Rauzi M, Verant P, Lecuit T, Lenne PF.Nat Cell Biol. 2008 Dec;10(12):1401-1410. Epub 2008 Nov 2.

•A two-tiered mechanism for stabilization and immobilization of E-cadherin.Cavey M, Rauzi M, Lenne PF, Lecuit T.Nature. 2008 Jun 5;453(7196):751-6. Epub 2008 May 14.

•Cell surface mechanics and the control of cell shape, tissue patterns and morphogenesis. Lecuit T and Lenne PF Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2007 8(8):633-44.

InvitéesPFL: •ASCB Meeting 2007

TL : Invitiation à plus de 25 conférences en 2005-2008 dont•Physics and Biology of Morphogenesis, KITP meeting,•Santa Barbara March 2008-08-12•GRC Cell adhesion. 29 June 4July 2008•Barcelona BioMed Conference. Morphogenesis 6-8 Oct 2008•Gordon Research COnference Developmental Biology in

Proctor Academy, NH, USA. 25-29 juin 2007•Plenary Lecture Drosphila Research COnference,•Philadelphia, mars 2007•Plenary Lecture ELSO meeting 2007, 2 sept 2007 in Dresden.

Colloques : 4


T ranscriptional regulatory networks are at the heart of the genetic control of cellfate and behaviour. This interdisciplinary project proposed a systems biology

approach to the reconstruction of gene regulatory networks acting during chordateearly embryonic development, with a special focus on neural lineages. We areusing the ascidian system, chosen because of its phylogenetic proximity tovertebrates, and which is emerging as one of the most powerful metazoansystems for mid-throughput cis-regulatory module analysis. To reconstruct the gene regulatory network underlying ectodermal development,the grant proposed to first establish an exhaustive list of transcription factors,

determine their individual expression profiles, identify their enhancers, determinetheir DNA binding specificity and integrate this information using a semiautomatic network builder. Further, it was proposed to use the reconstructednetwork and associated data to analyse its topology, identify its cellular effectorsand compare the vertebrate and ascidian developmental programmes.

Résumé

Chordate regulatory networksPatrick Lemaire

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le programmeblanc

Acronyme Chor-Reg-NetEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 480 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : >150

Autres IT : >80Recrutés : 96


Mots clés • Réseaux transcriptionnels• Développement• Evolution• Facteurs de transcription• Régulation en Cis

LEMAIRE Patrick, Institut de Biologie du Développement de Marseille Luminy - Christian CAMBILLAU, AFMB, Marseille, CNRS - Jean-Stéphane JOLY, DEPSN, Gif/Yvette, CNRS - Yutaka SATOU, Université Kyoto

A Ciona intestinalis larva

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursThe main challenges we were faced with were 1) to set up and perform automated SELEX procedure on a majority of Ciona transcription factors, 2) to build the IT infrasturctureto infer gene regulatory networks by the integration of various data types, 3) to improve our understanding of the code determining the regulatory potential of non-codingsequences.

Résultats majeursProduction of over 300 soluble recombinant tagged DNA-binding domains.Automated selex on all those proteinsIdentification of the DNA-binding specificity of >100 transcritpion factorsIdentification of a novel genomic code for cis-regulatory modules, based on local di-nucleotide frequencies.Identification of >60 cis-regulatory modules driving expression in ectodermal territoriesGeneration of a complex network of over 170 nodes and 350 edges covvering the entire development of Ciona intestinalis.

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s•Lamy C., Rothbächer U., Caillol D. and Lemaire P. (2006) Ci-FoxAa is the earliest zygoticdeterminant of the ascidian anterior ectoderm and directly activates Ci-SFRP1/5Development 133:2835-44.

•Rothbächer*, U., Bertrand*, V., Lamy, C., and Lemaire, P. (2007) A combinatorial code ofmaternal GATA, Ets and ß-catenin/Tcf transcription factors specifies and patterns the early ascidianectoderm. Development, 134:4023-4032 Editorial highlight and cover picture in same issue.

•Deutsch EW, Ball CA, Berman JJ, Bova GS, Brazma A, Bumgarner RE, Campbell D, CaustonHC, Christiansen JH, Daian F, Dauga D, Davidson DR, Gimenez G, Goo YA, Grimmond S,Henrich T, Herrmann BG, Johnson MH, Korb M, Mills JC, Oudes AJ, Parkinson HE, Pascal LE,Pollet N, Quackenbush J, Ramialison M, Ringwald M, Salgado D, Sansone SA, Sherlock G,Stoeckert CJ Jr, Swedlow J, Taylor RC, Walashek L, Warford A, Wilkinson DG, Zhou Y, Zon LI,Liu AY, True LD. (2008) Minimum information specification for in situ hybridization andimmunohistochemistry experiments (MISFISHIE). Nat Biotechnol. 26(3):305-12.

•Lemaire P, Smith WC, Nishida H. (2008) Ascidians and the plasticity of the chordatedevelopmental program. Current Biology 18: R620-R631

•Satou Y, Mineta K, Ogasawara M, Sasakura Y, Shoguchi E, Ueno K, Yamada L, MatsumotoJ, Wasserscheid J, Dewar K, Wiley GB, Macmil SL, Roe BA, Zeller RW, Hastings KE, LemaireP, Lindquist E, Endo T, Hotta K, Inaba K. (2008) Improved genome assembly and evidence-based global gene model set for the chordate Ciona intestinalis: new insight into intron andoperon populations. Genome Biol. 9(10):R152

Invitées•Japanese Society of Developmental Biologist (JSDB)

annual meeting (Tokushima, May 28-31)•Santa Cruz DB meeting (Santa Cruz, June 26-30,

2008) : Lemaire•Society for Developmental Biology (Philadelphia, July

26-30, 2008) : Lemaire•SFBD/JSDB Joint meeting Frontiers in developmental

biology (Hyères Oct 13-17) : organizer lemaire, invited,Satou.

•EMBO meeting on Functional genomics to systemsbiology (EMBL, Nov 15-18, 2008) : Lemaire

Colloques :


Une des découvertes biologiques les plus importantes des dernières années estque, malgré l'extraordinaire diversité morphologique des organismes

métazoaires, le contenu de leur génome est très similaire. Ceci suggère quel’utilisation d’un ensemble de gènes communs associés au sein de réseauxgénétiques différents sous-tend l'apparition de la diversité au cours de l’évolution.Comprendre l’évolution des mécanismes de développement passe donc par uneconnaissance des hiérarchies génétiques, des réseaux et des circuits de gènesresponsables de l’établissement du plan d’organisation de l’embryon chezdifférentes espèces. Ce projet propose d’identifier le réseau génétique responsablede la mise en place de l’axe dorso-ventral (oral-aboral) chez les échinodermes,

groupe phylogénétiquement proche des chordés, mais dont les mécanismes dedéveloppement sont encore très énigmatiques. Le gène nodal, représente un pointd’entrée unique pour cette étude car c’est à ce jour le gène zygotique le plusprécoce dont l’expression soit régionalisée le long de l' axe dorso-ventral. Nousproposons d’étudier la régulation de l‘expression de nodal par comparaison interespèces des séquences régulatrices en cis et par l’analyse fonctionnelle de cesséquences in vivo. Nous recherchons également les gènes activés par Nodal etBMP2/4 par différentes approches:cribles soustractifs, cribles par hybridation insitu, approches in silico.

Résumé

Réseaux génétiques contrôlant la formation de l'axe dorso-ventral et des asymétries

bilatérales chez les échinodermes Thierry Lepage

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le programmeblanc

Acronyme seaurchinEdition 2005Durée du projet 30 moisFinancement 150 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 64,8



Mots clés • Axe embryonnaire• Oursin• TGF-béta Nodal• Réseau génétique

UMR 7009 Biologie du développement, CNRS/UPMC

larve d’oursin contrôle (72h)

82


Résultats majeursAu cours des 3 dernières années et grâce au soutien de l’ANR, nous avons progressé dans plusieurs directions telles que 1. l’identification des facteurs maternels contrôlant l’expression temporelle et spatiale de nodal, 2. la découverte de gènes cibles de nodal ayant un rôle clé dans le contrôle de la morphogenèse 3. la caractérisation du mode d’action de Nodal à travers l’étude de son antagoniste Lefty.

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ces•Lefty acts as an essential modulator of Nodal activity during sea urchin oral-aboral axis

formation. Duboc V., Lapraz F., Besnardeau L. and Lepage T. (2008) Dev. Biol. 320, 49-59•Röttinger E., Saudemont A., Duboc V., Besnardeau L., McClay D. and Lepage T. (2008)

FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control morphogenesis of the skeletonand regulate gastrulation during development of the sea urchin embryo. Development 135,353-365.

•Range R., Lapraz, Quirin M., Marro S., Besnardeau L. and Lepage T (2007). Cis-regulatoryanalysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by a TGF-betarelated to Vg1. Development 134, 3649-3664.

Invitées•Meeting of the "Société Française de Biologie du

Développement” “Nodal and BMP signalling organizethe dorsal-ventral axis of the ea urchin embryo. 1st -4th October 2005, VVF Obernai, 67210

•Meeting Origins of the vertebrate body plan. April 16 -20, 2007 organized by the Center for Integrativegenomics CIG, Moorea

•Developmental Biology of the Sea Urchin XVIII. April23-26, 2008

•Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA.“Dissecting the dorsal-ventral gene regulatory network:stories upstream and downstream of Nodal”

•Joint meeting SFBD-JSDB “Frontiers in DevelopmentalBiology” Giens, September 13-17th 2008. “A Nodalexpressing ventral organizer regulates morphogenesis ofthe sea urchin larva. “

•Joint meeting SEBD-ESDB Sevilla, Spain. September23-27. A Nodal expressing ventral organizer regulatesmorphogenesis of the sea urchin larva

Colloques : 2


Dans les cellules eucaryotes, le cytosquelette de microtubules est impliqué dansdes fonctions aussi variées que le transport intracellulaire ou la ségrégation

des chromosomes lors de la mitose. Pour assurer chacune de ces fonctions, leréseau de microtubules se réarrange continuellement, sous l’influence deprotéines régulatrices. Dans les neurones, une partie substantielle desmicrotubules est stabilisée, en particulier sous l'influence de la phosphoprotéineTau et d'autres MAPs.Nous avons évalué par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) en solution laphosphorylation in vitro de Tau par différentes kinases, et avons combiné RMN etla diffraction des rayons X pour obtenir des données structurales sur le complexe

Tau-tubuline et interprété les effets de la phosphorylation de Tau. Un obstaclemajeur à l’étude structurale de la tubuline par cristallographie est son instabilitéintrinsèque et sa polydispersité. En utilisant un complexe de la tubuline avec lesdomaines de protéines qui séquestrent la tubuline, les domaines de typestathmine (SLD), nous avons vérifié que la formation de ce complexe n’empêchepas l’interaction entre Tau et la tubuline. Nous avons déterminé avec précision lefragment de Tau qui interagit avec la tubuline dans ces complexes, mais aussibien la RMN que les rayons X, ont indiqué que le fragment de tau maintient undegré de liberté important. Nous utilisons actuellement des mutants de SLDmarqués avec des nitroxides pour tracer TauF3 sur la surface de la tubuline.

Résumé

Etude structurale de l’interaction entre Tau et la tubuline

Guy Lippens

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le programmeblanc

Acronyme tubulineEdition 2005Durée du projet 42 moisFinancementPersonnels (H-m) C + EC + IR : 75



Mots clés • Tau• Tubuline• Résonance Magnétique Nucléaire• Radiocristallographie• Maladie d’Alzheimer

LIPPENS Guy, Laboratoire de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle - UMR 8576 - Université de Lille 1KNOSSOW Marcel, LEBS CNRS UPR9063, Gif-sur-Yvette - PEYROT Vincent, Faculté de Pharmacie, Université de Marseille - BUÉE Luc, Inserm U422 , Université de Lille 2

Le spectre RMN (1H, 15N HSQC) de Tau441 libre (rouge) et fixé aux microtubules (bleu)permet de voir les zones d’interaction au niveau des acides aminés individuels.

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursScientifiques : la flexibilité des fragments de tau dans le complexe avec T2R a empêché de voir la protéine par cristallographie (malgré de nombreux essais à l’ESRF).

Résultats majeursEtude de Tau fixée aux microtubules stabilisés par le taxol, par RMN, fluorescence et méthodes macroscopiques.Détermination du fragment de Tau minimal liant le complexe T2R. Phosphorylation de Tau par CDK2/CycA3 génère les épitopes reconnus par les anticorps AT8 et AT180, diagnostiques pour la maladie d’Alzheimer. Caractérisationfonctionnelle de phospho-Tau.

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ces•Hamdane M, Dourlen P, Bretteville A, Sambo AV, Ferreira S, Ando K, Kerdraon O, Bégard S,

Geay L, Lippens G, Sergeant N, Delacourte A, Maurage CA, Galas MC, Buée L. Pin1 allowsfor differential Tau dephosphorylation in neuronal cells. Mol Cell Neurosci. 32, 155-60(2006).

•Sillen A, Barbier P, Landrieu I, Lefebvre S, Wieruszeski JM, Leroy A, Peyrot V, Lippens NMRinvestigation of the interaction between the neuronal protein tau and the microtubules.G.Biochemistry. 46(11):3055-64 (2007).

•Lippens G, Sillen A, Landrieu I, Amniai L, Sibille N, Barbier P, Leroy A, Hanoulle X etWieruszeski JM. Tau Aggregation in Alzheimer's Disease: What Role for Phosphorylation?Prion. 1(1) :21-25(2007).

•Gigant, A. Cormier, A. Dorléans, R.B.G. Ravelli, M. Knossow. . Top Curr Microtubule-destabilizing agents: structural and mechanistic insights from the interaction of colchicineand vinblastine with tubulin. B. Chem (2008). DOI:10.1007/128_2008_11

•Amniai L.,. Barbier P,. Sillen A, Wieruszeski J.-M., Peyrot V., Lippens G., LandrieuI..Alzheimer Disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin butnot binding to microtubules. Faseb J. (2008), sous presse.

Invitées•“Tau function and dysfunction studied by NMR”, G.

Lippens, NMR in Biology VIII, Pasteur Paris (Février 2008).•“NMR studies of unfolded proteins : the microtubule

binding protein Tau”, G. Lippens, Inserm Workshop onunfolded proteins, Saint Raphael (Mars 2008).

•“Phosphorylation of Tau : a structural view on Alzheimersdisease”, G. Lippens, Adelson Medical Research FoundationSymposium, Las Vegas, USA (April 2008, sur invitation).

•“Liquid or solid : it is in the mind”, G. Lippens,International Conference on Magnetic Resonance inBiological Systems, San Diego, USA (Aôut 2008).

•“NMR studies of unfolded proteins : the microtubulebinding protein Tau”, G. Lippens, Instruct meeting,Hamburg, Allemagne (September 2008).

Colloques : 1


Résumé

Structural and functional studies of the SDF-1/CXCL12 interactions with heparan sulfate in

both homeostasis and Pathology Hugues Lortat-Jacob

85

le programmeblanc

Acronyme ChemoglycanEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 420 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 176,9



Mots clés • Chimiokine• Héparane sulafte• Structure• Fonction

LORTAT-JACOB Hugues, Institut de Biologie Structurale - BALEUX Françoise, Institut Pasteur - METCHA-GRIGORIOU Fatima, Institut Curie

Modèle structural de la chimiokine CXCL12-gamma

Les chimiokines sont de petites protéines, à activité chémoattractante pour lesleucocytes. Elles sont aussi impliquées dans les désordres immuns et

inflammatoires, dans les processus de morphogenèse et de réparations tissulaires,ainsi que dans le développement des tumeurs. Ces activités sont relayées par desrécepteurs couplés aux protéines G. Les chimiokines interagissent également avecles héparanes sulfates (HS), des polysaccharides complexes, présents sur lasurface de la plupart des cellules. Selon les hypothèses actuelles, les HSpermettraient de concentrer localement les chimiokines à la surface des cellules,pour stabiliser des gradients de concentration le long desquels les leucocytespeuvent migrer et s’orienter.Le but général de ce projet est de définir le rôle des HS dans les activitésphysiologiques et pathologiques de la chimiokine CXCL12 dont il existe 3isoformes (α,β‚ et γ), et de caractériser les déterminants structuraux intervenantdans ces interactions.

Les travaux réalisés ont permis une cartographie complète des domainesd’interaction (ainsi que leur contribution respective) des trois isoformes de CXCL12pour différents glycosaminoglycanes (héparine, héparane sulfate, dermatanesulfate). Pour l’isoforme gamma, un modèle de structure tridimensionnelle a puêtre proposé. Les différences d’interaction entre les différentes isoformes de lachimiokine ont pu être validées sur des modèles cellulaires, puis in vivo chez lasouris, et montrent l’importance de la liaison aux HS pour le recrutement localiséde populations cellulaires. Les résultats apportent une meilleure compréhensiondes mécanismes d’action de cette chimiokine et une preuve de concept surl’importance des interactions chimiokine/HS.CXCL12 étant essentielle dans la pathogenèse des maladies inflammatoires ettumorales, la caractérisation de l’interface CXCL12/HS permet de suggérer unenouvelle cible thérapeutique.

86


Résultats majeurs• Obtention par synthèse peptidique de la chimiokine CXCL12-gamma (98 acides aminés), et de mutants.• Identification des domaines d’interactions pour différents glycosaminoglycanes (héparine, héparane sulfate, dermatane sulfate) présents dans les chimiokines CXCL12

alpha, bêta et gamma, et analyse des contributions respectives des différents domaines.• Modèle structural de la chimiokine CXCL12 gamma, par RMN.• Analyse des profils d’expression tissulaires des différentes isoforms de CXCL12 au cours de l’embryogenèse et de la vie adultes.• Démonstration du rôle de l’interaction CXCL12/héparane sulfate, in vivo.• Obtention d’un modèle de souris transgénique pour l’étude des interactions CXCL12/héparane sulfate.

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ces•Laguri C, Sadir R, Rueda P, Baleux F, Gans P, Arenzana-Seisdedos F and Lortat-Jacob H. The

novel CXCL12Á isoform encodes an unstructured cationic domain which regulates bioactivityand interaction with both glycosaminoglycans and CXCR4. PLoS One 2, e1110 (2007).

•Laguri C, Arenzana-Seisdedos F, and Lortat-Jacob H. Relationships betweenGlycosaminoglycan and receptor binding sites in Chemokines – The CXCL12 exampleCarbohydrate research 343 2018-2023 (2008)

•Rueda P, Balabanian K, Lagane B, Staropoli I, Chow K, Levoye A, Laguri C, Sadir R,Delaunay T, Izquierdo E, Pablos J-L, Lendinez E, Caruz A, Franco D, Baleux B, Lortat-JacobH, and Arenzana-Seisdedos F. The CXCL12Á chemokine displays enhanced and sustainedfunctions in vivo that are related to an unprecedented high affinity for heparan sulfates.PLoS One 3, e2543 (2008)

Brevets : Brevet Institut Pasteur-CNRS-CEA déposé auprès de l'US Patent Office le15.09.07 sous le N° US 60/979,984

Invitées•Hugues Lortat-Jacob. Structure-function relationships of

chemokine-heparan sulfate interactions. XIVth Europeancarbohydrate conference. 2nd-7th September 2007,Lubëck, Germany

Colloques : 4


Nous proposons d’identifier les mécanismes moléculaires régissant laspécificité de substrat des glycosyltransférases (GT) qui sont responsables des

voies de biosynthèse des glycosaminoglycanes (GAG). Ces macromoléculespolysaccharidiques, dont les chondroitines et héparane-sulfates (CS, HS) sont lesplus éminents représentants, revêtent une importance biologique de plus en plusreconnue, étant donné leur rôle joué dans de nombreuses fonctions cellulaires(adhésion, migration, communication intercellulaire). Nous présentons uneapproche intégrée en considérant simultanément 6 GT différentes humainesimpliquées dans 3 étapes critiques de la biosynthèse des GAG : l’initiation auniveau de l’amorce tétrasaccharidique commune à l’ensemble des GAG,

l’orientation de la chaîne vers la formation de CS ou de HS, et leur polymérisation. Trois buts majeurs sont recherchés : 1- détermination des bases moléculaires etstructurales de la spécificité des GT vis-à-vis des substrats donneurs et accepteurs,impact de la modification de l’amorce par sulfatation et phosphorylation sur leprocessus d’assemblage et d’orientation des chaînes des GAG ; 2- évaluation del’importance et de la contribution de chaque GT dans l’initiation et l’assemblagedes GAG ; 3- capacité des GT à s’opposer à la déplétion des GAG provoquée parune cytokine pro-inflammatoire, l’IL-1‚.

Résumé

Etudes structurales et fonctionnelles des glycosyltransférases : bases moléculaires

de la biosynthèse des glycosaminoglycanes Jacques Magdalou

87

le programmeblanc

Acronyme GT-GAGEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 300 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 125



Mots clés • Glycosyltransférases• Glycosaminoglycanes• Glycomimétiques• Analyse structurale et mécanistique• Arthropathies

Jacques MAGDALOU, UMR 7561 CNRS-Université Henri Poincaré-Nancy-1 - Jean-Claude JACQUINET, Institut de Chimie Organique et Analytique, UMR 6005 CNRS-Université d’Orléans - Frédérique FAVIER, UMR 7036 CNRS-Université Henri Poincaré Nancy 1- Jean-Claude MICHALSKI, UMR 8576 CNRS

Structure des protéoglycanes et nature des glycosyltransférases impliquées dans leur biosyn-thèse : l’agrécane de la matrice extracellulaire cartilagineuse.

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs• Clonage, surexpression et purification des GT humaines• Développement de méthodes analytiques pour l’analyse cinétique des GT et des mutants• Production de cristaux et analyse RX• Glycochimie : synthèse d’analogues glycosidiques complexes• Analyse de la structure des GAG par RMN

Résultats majeurs1- Clonage, expression et purification dans Pichia pastoris des différentes GT humaines impliquées dans la biosynthèse de l’amorce tétra-saccharidique commune à l’ensembledes GAG et de la chondroitin sulfate N-acétylgalactosyltransférase : 1- qui catalyse la formation de la zone de liaison conduisant aux chondroitines sulfates. Expression etanalyse cinétique de nombreux mutants. Détermination des acides aminés impliqués dans la reconnaissance des substrats . 2- synthèses chimiques totales d’oligosaccharidespour l’étude de la spécificité de substrats des GT. 3- Développement d’un modèle moléculaire de la ‚4-GalT-7. Obtention de cristaux protéiques de taille tout à fait prometteusepour une analyse cristallographique.

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ces•L. BARRE, N. VENKATESAN, J. MAGDALOU, P. NETTER, S. FOURNEL-GIGLEUX, M. OUZZINE

Evidence of calcium-dependent pathway in the regulation of human ß1,3-glucuronosyltransferase (GlcAT-I) gene expression: a key enzyme in proteoglycan synthesis.FASEB J., 2006, 20, 963-975.

•V. LATTARD, M. FONDEUR-GELINOTTE, S. GULBERTI, J.-C. JACQUINET, J. BOUDRANT, P.NETTER, J. MAGDALOU, M. OUZZINE and S. FOURNEL-GIGLEUXPurification and characterization of a soluble forme of the recombinant human galactose-‚1,3-glucuronosyltransferase I expressed in the yeast Pichia pastoris.Protein Exp.Purif., 2006, 47, 137-143.

•M. FONDEUR-GELINOTTE, V. LATTARD, R. ORIOL, R. MOLLICONE, J.-C. JACQUINET, G.MULLIERT, P. NETTER, J. MAGDALOU, M. OUZZINE, S. FOURNEL-GIGLEUXPhylogenetic and mutational analyses reveal key residues for UDP-glucuronic acid bindingand activity of ‚1,3-glucuronosyltransferase I (GlcAT-I).Protein Sci., 2006,15, 1667-1678.

•J.-C. JACQUINET. Synthesis of a set of sulfated and/or phosphorylated oligosaccharidederivatives from the carbohydrate-protein linkage region of proteoglycansCarbohydrate Res., 2006, 341, 1630-1644.

Invitées•L’agrécane et le cartilage articulaire : apport des

glycosyltransférases dans la réparation du cartilagearthrosique. Société de Biologie, Journée Claude Bernard« Os et Cartilage », Paris, 28 Novembre 2007

•Recent insights into the structure and functions of theexpanding world of UDP-glucuronosyltransferases. 12thInternational Workshop “Glucuronidation and the UGT”,Québec, Canada (Juillet 2008)

•Aspartic and histidine residues mediate the reactionmechanism and the substrate specificity of the humanUDP-glucuronosyltransferases 1A. 12th InternationalWorkshop “Glucuronidation and the UGT”, Québec,Canada (Juillet 2008)

•"Synthesis of biotinylated chondroitin oligosaccharides".Abstracts 11th Belgian Organic Symposium, Ghent(Belgium), 2008, Jul. 13-18, P 353.

Colloques :


Mon équipe s’intéresse au développement des muscles squelettiques chez lasouris. Le projet visait à mieux comprendre le rôle joué par les complexes

transcriptionnels Six dans la genèse de la diversité des fibres musculaires et plusparticulièrement dans l’établissement du phénotype rapide/glycolytique de lafibre musculaire au cours de l’embryogenèse. Nous voulions identifier par desapproches complémentaires les cibles des gènes Six à différentes étapes dudéveloppement embryonnaire (transcriptome Affymetrix), et caractériser le rôle

des protéines Six dans l’activation de la myogenèse chez l’embryon (cascadegénétique et activation du premier déterminant myogénique, Myf5), caractériserde nouveaux cofacteurs transcriptionnels des protéines Six par une approche decrible deux hybrides dans la levure, et caractériser le rôle des cofacteurs Eya dansla genèse des progéniteurs myogéniques au cours de l’embryogenèse.

Résumé

Rôle du complexe transcriptionnel SIX/EYAdans le lignage myogénique et sa diversité

Pascal Maire

89

le programmeblanc

Acronyme SIXEYAMUSEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 210 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 36


Discipline Biologie et SantéMots clés • Développement

• Muscles squelettiques • Progéniteurs myogéniques

et diversité des fibres musculaires • Complexe transcriptionnel• Homéoprotéine Six

Institut Cochin, INSERM 567Absence de formation de jonctions neuromusculaires chez les embryons Six1-/-Six4-/-

90


Résultats majeurs• Identification du réseau de gènes sous le contrôle des gènes Six1 et Six4 au cours de la myogenèse chez l’embryon• Mise en évidence du rôle des gènes Six1 et Six4 dans l’activation du gène Myf5, premier déterminant myogénique à s’exprimmer chez l’embryon• Caractérisation de deux nouveaux cofacteurs de Six1• Mise en évidence du rôle de Six1 et Six4 dans la synaptogenèse chez l’embryon• Etablissement du rôle des cofacteurs Eya des protéines Six dans la genèse des progéniteurs myogéniques chez l’embryon

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ces•Grifone,R., Demignon,J., Houbron,C., Souil,E., Niro,C ., Seller,M., Hamard,G., Maire,P.

2005. Six1 and Six4 homeoproteins are required for Pax3 and MRF expression duringmyogenesis in the mouse embryo. Development. 132 : 2235-49.

•Zou, D., Silvius,D., Davenport,J., Grifone ,R., Maire,P., Xu,P-X. 2006. Patterning of the thirdpharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev.Biol. 293: 499-512.

•Giordani J., Bajard L., Demignon J., Daubas, P., Buckingham M., Maire P. 2007. Sixproteins regulate the activation of Myf5 expression in embryonic mouse limbs. Proc NatlAcad Sci U S A. 104(27):11310-11315

•Grifone,R., Demignon,J., Giordani,J., Niro,C., Souil,E., Bertin,F., Laclef,C., Xu,P-X., Maire,P.2007. Eya1 and Eya2 proteins are required for hypaxial somitic myogenesis in the mouseembryo. Dev.Biol. 302. 602-616

Invitées•Atelier INSERM/CONICYT, Santiago Chili. 2006•Montréal Canada. McGill. 2006•Gordon's Conference on myogenesis. 2007. Italie.•SFBD. 2007. Dourdan. France.•International AFM congress on neuromuscular disorders.

Marseille. France.2008

Colloques : 6


Résumé

Functional Memory of the Plasma Membrane :Regulating Cell Activation Thresholds

Didier Marguet

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le programmeblanc

Acronyme MnemoSigEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 420 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 120



Mots clés • Plasma membrane• Lateral diffusion• Nanodomaines• Fluorescence correlation spectroscopy• Single molecule imaging

MARGUET Didier, Centre d’Immunologie de Marseille Luminy, CNRS UMR 6102, INSERM U631, Aix-Marseille Université - RIGNEAULT Hervé, Institut Fresnel, CNRS UMR 6133,- SENS Pierre, ESPCI, CNRS UMR 7083

Exhaustive particle detection principle

MnemoSig avait pour objectif initial de comprendre comment la plasticité dela membrane plasmique intègre des stimuli successifs, et de ce fait acquière

une mémoire, qui influence l'interprétation des évènements subséquents detransduction du signal. Il s’agissait en fait d’identifier la contribution de ladynamique d’organisation de la membrane plasmique tant dans la définition duseuil de sensibilité que dans la sélectivité de la réponse induite. Cette hypothèsede travail était basée sur un certain nombre d’observations expérimentalesrapportant l’antinomie des réponses biologiques induites par un récepteur enréaction à un même stimulus. Le projet était centré autour de trois questionsmajeures :- Sur quelles échelles spatiotemporelles les hétérogénéités d’organisation de lamembrane plasmique se forment ?

- Quels sont les déterminants majeurs contribuant à structurer ces hétérogénéités ?- Ces hétérogénéités ont-elles une fonctionnalité physiologique effective ?Afin d’y répondre, les travaux ont été organisés parallèlement autour de trois axesinterdépendants:(1) expérimental, en analysant différents modèles biologiques permettant derépondre de manière appropriée à ces questions d’organisation dynamique desbiomembranes ;(2) instrumental, en développant et validant de nouvelles approches ;(3) analytique et prédictif, en modélisant différentes organisations membranaireset en simulant l’acquisition des mesures effectives afin d’aider à l’interprétationdes observations expérimentales.

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs(1) développement et validation avec la résolution spatiotemporelle appropriée d’approches expérimentales permettant d’explorer la dynamique d’organisation de lamembrane plasmique de cellules vivantes. Deux méthodes complémentaires ont pu être mises au point : la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) à rayon variableet le suivie de molécules individuelles à haute densité ;(2) mise en place d’une méthodologie permettant de modifier la composition lipidique des membranes par un traitement enzymatique ou pharmacologique. Ces méthodesont été rigoureusement contrôlées par une analyse lipidique précise par spectrométrie de masse (coll. B. Payrastre, Univ. Toulouse).

Résultats majeursGrâce à une exploration systématique et rigoureuse de différents constituants lipidiques et protéiques, nous avons apporté des éléments expérimentaux robustes identifiantl’organisation membranaire. Dans ce modèle, les molécules partitionnent entre deux espaces, l’un libre, l’autre confiné définis par l’association préférentielle avec certainsconstituants membranaires. Les hétérogénéités locales qui en découlent sont par nature de taille réduite avec une demi-vie de l’ordre de la centaine de milliseconde.Concernant l’implication des nanodomaines lipides-dépendants dans la régulation de fonctions biologiques, nous avons démontré leur implication dans l’activation de la voiede signalisation Akt-dépendante.

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ces•Lenne PF*, Wawrezinieck L*, Conchonaud F, Wurtz O, Boned A, Guo XJ, Rigneault H, He

HT, Marguet D. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomainsand the cytoskeleton meshwork. EMBO J 2006 25:3245-56 Epub 2006 Jul 6 *equalcontribution. see the Must Read Faculty of 1000 evaluation

•Wenger J, Conchonaud F, Dintinger J, Wawrezinieck L, Ebbesen T, Rigneault H, Marguet D,Lenne PF. Diffusion Analysis within Single Nanometric Apertures Reveals the Ultrafine CellMembrane Organization. Biophys J 2007 92:913-19 Epub 2006 Nov 3

•Randriamampita C, Mouchacca P, Malissen B, Marguet D, Trautmann A, Lellouch AC. Anovel ZAP-70 dependent FRET based biosensor reveals kinase activity at both theimmunological synapse and the antisynapse. PLoS ONE 2008 3:e1521 Epub 2008 Jan 30

•Sergé A, Bertaux N, Rigneault H, Marguet D. Dynamic multiple-target tracing probesspatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods 2008 5:687-94 Epub 2008Jul 6. see the Cover and the News and Views by Saxton MJ in the same issue

•Sergé A, Bertaux N, Rigneault H and Marguet D. Multiple-Target Tracing (MTT) AlgorithmProbes Molecular Dynamics at Cell Surface. Protocols Network DOI: 10.1038/nprot.2008.128

Brevets : IDDN.FR.001.270021.000.S.P.2008.000.31230

Invitées•9th Annual Linz Winter Workshop on Advances in

Single-Molecule Research for Biology & Nanoscience,Feb 2-5, 2007, Linz, Austria

•6th EBSA Congress July 14-19, 2007, London, UK•Annual Dutch meeting on molecular and cellular

biophysics, Sep 29-30th 2008, Veldhoven, Netherland•Advance Microscopy Techniques for Immunanoscopy

Symposium, Oct 15-16 2008, Barcelona, Spain•EMBO Workshop Visualizing Immune System

Complexity, Jan 15-17 2009, Marseille, France

Colloques : 10


Le projet vise à caractériser les origines de réplication et leur régulation, enrelation avec les programmes de développement et de différenciation. La mise

en place des origines de réplication, son importance dans le développement del’embryon et la différenciation, son importance dans le re-programmation denoyaux de cellules différenciées en noyaux totipotents, constituent un premierobjectif de ce projet. Un deuxième axe de recherche concerne la caractérisation etla fonction des facteurs impliqués dans la détermination des sites ORI, ainsi que

les modifications de la chromatine ou de l’organisation nucléaire liées à laréplication. Les relations ou interférences entre réplication et transcription sontégalement analysées. Le développement d’une approche génomique globale,permettant de cartographier simultanément sur des chromosomes entiers lesorigines de réplication, les facteurs qui se lient à ces origines et les modificationsde la chromatine constituent un objectif parallèle.

Résumé

Les origines de réplicationet le contrôle de l’identité cellulaire

Marcel Mechali

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le programmeblanc

Acronyme REPLICHROMEdition 2005Durée du projet 42 moisFinancement 420 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 77,4

Autres IT : 50,4Recrutés : 95Do.+ Post-Doc : 281,6


Mots clés • Réplication• Différenciation• Cellules souches• Reprogrammation• Intégrité du génome

Institut de Génétique Humaine, CNRS, UPR 1142.Division des oeufs de Xénope, 2 après fécondation, stade 4 cellules.

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs• Mise au point d’une méthode permettant la cartographie des origines de réplication à haut débit.• Mise au point des outils informatiques nécessaires au traitement des données obtenues sur les brins naissants ou par ChIP-on-chip.

Résultats majeurs• Localisation des origines de réplication sur l’ensemble du locus Hox B chez la Souris et démonstration d’un lien entre différenciation et positionnement des origines.• Cartographie à haut débit des origines de réplication du chromosome 11 chez la souris.• Cartographie des origines de réplication par ChIP-on-chip chez la levure.• Identification de site de pause de réplication à haut débit sur des cellules humaines.• Instabilité génétique due à l’interférence entre réplication et transcription.• Rôle de ORC et de la DNA topoisomerase II dans la résolution des foyers de réplication en fin de réplication.

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ces•Lemaitre, JM., Danis, E., Y Vassetzky, Y., Pasero. P., and Méchali., M. (2005) Mitotic

remodeling of the replicon and chromatin structure, Cell, 123, 787-801. Cet article a faitl’objet de 6 "Research Highlights" dans Cell, Nature, Nature Cell Biology, Nature Rev. Mol.Cell Biol., Nature Methods, J. Cell Biol. et d’une demande d’article de "Cell cycle". Il a étéclassé outstanding par The Academy of 1000.

•Maiorano, D, Cuvier, O., Danis, E., and Méchali, M. (2005) MCM8 is an MCM2-7 relatedprotein that functions as a DNA helicase during replication elongation and not initiation.Cell, 120, 315-28.

•Lutzmann, M. and M. Mechali (2008). "MCM9 binds Cdt1 and is required for the assemblyof prereplication complexes." Mol Cell 31, 190-200. This article has been recommended byThe Faculty of 1000.

•Cuvier, O., Stanojcic, S., Lemaitre, JM., Méchali, M. (2008). A Topoisomerase II-dependentmechanism for resetting replicons at the S-M phase transition. Genes and Dev. 22, 860-865.

•Luke B, Versini G, Jaquenoud M, Waris Zaidi I, Kurz T, Pintard L, Pasero, P* and Peter M*(2006) The cullin Rtt101p romotes replication fork progression through damaged DNA andnatural pause sites. Current Biology, 16, 786-792. (* corresponding authors)

•Tourriere H, Versini G, Cordon-Preciado V, Alabert C and Pasero P (2005) Mrc1p and Tof1ppromote replication fork progression and recovery of independently of Rad53p. Mol Cell, 19,699-706. Faculty of 1000: Must read

Brevets : Brevet MCM8 n° 60/651 510: demande de protectionprovisoire aux Etats-Unis du 10 février 2005. Brevet MCM9 n° 60/680,480 : protection provisoiredéposée aux Etats-Unis le 31 août 2005. "

Invitées•Plusieurs Cold Sprig Harbor Symposiums, 2 Conférences

Jacques Monod, Plusieurs EMBO Conférences.

Colloques :


Résumé

Les récepteurs à dépendance : mécanismesmoléculaires et rôles biologiques dans le

développement et l’homéostasie des mammifères Patrick Mehlen

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le programmeblanc

Acronyme RàDEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 330 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 55,8

Autres IT : 61,2Recrutés : Autres : 154,8


Mots clés • Récepteur à dépendance• Apoptose• Cancer• Signalisation• Développement

Apoptose Cancer et Développement, UMR 5238, CLB, CNRS, UCBLDRAL est impliqué dans la mort induite par Ptc in vivo

Les récepteurs à dépendance induisent la mort des cellules qui les exprimentlorsque celles-ci se développent dans un environnement dépourvu du ligand de

ces récepteurs. Plus d’une quinzaine de tels récepteurs ont été identifiés et nousavons fait l’hypothèse que la capacité de ces récepteurs à induire l’apoptose enabsence de ligand est un mécanisme qui permet la régulation de la tumorigénèsechez l’adulte et le positionnement/migration des neurones au cours dudéveloppement. Le projet proposé était alors décomposé en trois parties :-(i) la recherche des mécanismes moléculaires permettant cette doublesignalisation dépendante de l’accessibilité du ligand. Cette étude incluait une

étude de biologie cellulaire de l’apoptose et des voies classiques de signalisation,une étude de type protéomique et des modèles de cultures primaires.-(ii) une recherche horizontale visant la mise en évidence d’autres récepteurs àdépendance, -(iii) enfin la recherche de la signification biologique de ces récepteurs enparticulier en visualisant le rôle de l’activité pro-apoptotique de ces récepteurs àpartir de modèles animaux tels que des souris génétiquement modifiées(transgénique, Knock-in, Knock-out, Knock-out conditionnel) ou le pouletembryonnaire après électroporation.

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursConcept à valider et à amplifier

Résultats majeursTrois domaines de résultats : - Meilleure connaissance de la signalisation pro-apoptotique des récepteurs à dépendance (UNC5H, DCC et Ptc) et de comment le ligand bloque cette apoptosie.- Identification de nouveaux récepteurs à dépendance telle que TrkC et EPHA4- Identification de la signification biologique des récepteurs à dépendance en particulier en montrant que ces récepteurs sont des suppresseurs de tumeurs et que l’apoptoseinduite par ces récepteurs pourrait permettre de spécifier des domaines de présence/migration autorisés au cours du développement de l’organisme.

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ces•Llambi F., Calheiros F., Gozuacik D., Guix C., Pays L., Del Rio G., Kimchi A. and P. Mehlen.

(2005) The dependence receptor UNC5H2 mediates apoptosis through DAP kinase. EMBOJ., 24, 1192-1201.

•Bredesen DE, Rao RV, Mehlen P. (2006) Cell death in the nervous system. Nature 443:796-802.•Mehlen P., Puisieux A (2006). Metastasis: a question of life or death. Nature Rev. Cancer.

6, 449-458.•Tauszig-Delamasure S., Yu LY, Cabrera JR, Bouzas J., Mermet-Bouvier C., Guix C., Bordeaux

M.C, Arumae U., and P. Mehlen (2007). The TrkC receptor induces apoptosis, when thedependence receptor notion meets the neurotrophin paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA104, 13361-6.

•Furne C., Rama N., Corset V., Chédotal A. and P. Mehlen (2008). Netrin-1 is a survivalfactor during commissural neuron navigation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA In press.

•Delloye C., Brambilla E., Coissieux M.M., Guenebeaud C, Pedeux R., Firlej V., Cabon F.,Brambilla C., Mehlen P*$. and A. Bernet* (2008) Interference with Netrin-1 and TumorCell Death in Non–Small Cell Lung Cancer. J. Natl. Cancer Inst.

Brevets : Brevet US, n°00532-050, 5 Février 2006.Brevet US, n°00561-011, 28 Février 2006. Extension PCT Aout 2008.Brevet US provisoire, n°61/055.052, 28 Mai 2008 - Brevet US provisoire, n°D26632, 28Mai 2008.

Invitées•Second Dependence receptor international meeting.

Septembre 2006, Novato, USA - Mehlen P. Thedependence receptor notion : conditional tumorsuppressors and regulators of development

•The 66th Annual Meeting of the Japonese CancerAssociation. Octobre 2007, Yokohama, Japan - Mehlen P.The dependence receptor notion : when apoptosis leads totumor suppression

•15th ECDO Eurconference on Apoptosis. October 2007,Portoroz, Slovenie. - Mehlen P. The dependence receptornotion : when apoptosis leads to tumor suppression

•International Symposium of Chinese AnticancerAssociation. Janvier 2008, Shanghai, Chine. - Mehlen P.The dependence receptor notion : from a cell biologyconcept to alternative anti-cancer therapeutic strategies

•Advance in Neuroblastoma Research. Mai 2008. Chiba,Japon. - Mehlen P. The dependence receptor notion: whenapoptosis regulates neuroblastoma progression

Colloques :


Rôle des protéines de la recombinaison lors del’inactivation de la réplication bactérienne

Bénédicte Michel

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le programmeblanc

Acronyme Stabilité ADNEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 180 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 36

Autres IT : 36Autres IT : 36Doctorants : 72


Mots clés • Réplication• Recombinaison• Réparation de l’ADN• Prokaryotes

Centre de Génétique Moléculaire CNRS

Chromosome replication is not a continuous process but can be impaired byobstacles or by the inactivation of a replication protein. Such replication arrests

are a source of genetic instability. Our aim is to describe and understand thereactions that take place at inactivated replication forks in Escherichia coli. (i) Wehave studied the role of UvrD in various replication mutants, impaired for thereplicative polymerase Pol III or for the replicative accessory helicase Rep. (ii) Wehave characterized the action of the RuvAB complex at blocked replication forks.RuvA and RuvB are ubiquitous bacterial proteins that were originally discoveredand extensively studied for their action of resolution of recombinationintermediates. We have discovered a new function for the RuvAB complex: it

converts replication forks into Holliday junctions, a reaction called replication forksreversal. To better understand the features of RuvAB that allows it to perform itstwo functions, we have isolated and characterized separation-of function ruvABmutants that still promote homologous recombination but do not revert forks. (iii)We have observed that the inversion of certain regions of the E. coli chromosomerender the recombination protein RecBC essential for viability. We proposed toidentify precisely which sequences are responsible for this phenotype, todetermine whether the requirement for RecBC results from replication forkimpairment, and to define the role of recombination protein after replicationarrest caused by the presence of specific sequences in an inverted orientation.

Résumé

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Résultats majeursTASK 1 : We showed that in certain replication mutants, the helicase function of UvrD is required for its action at arrested replication forks, in others it is not. TASK 2 : We isolated separation of function ruv mutants that have lost the capacity to reverse forks but conserve the capacity to resolve recombination intermediates. TASK 3 : We tested whether the inversion of certain regions of the chromosome perturb replication to the point of rendering homologous recombination essential for viability.

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ces•Lestini R. and Michel B (2007) UvrD controls the access of recombination proteins to

blocked replication forks. EMBO J 26:3804-3814. •Baharoglu Z, Bradley A, Le Masson M., Tsaneva, I., and Michel B (2008) ruvA mutants that

resolve Holliday junctions but do not reverse replication forks. PLoS Genetics 4(3)e1000012.

•Lestini R and Michel B (2008) UvrD and UvrD252 Counteract RecQ, RecJ, and RecFOR in arep Mutant of Escherichia coli. J. Bacteriol 190 (17) 5995-6001.

•Le Masson M., Baharoglu Z. and Michel B.(2008) ruvA and ruvB mutants specificallyimpaired for replication fork reversal Mol Microbiol 70:537-548.

Invitées•2006 - EMBO Conference Molecular Microbiology:

dynamics and expression of Prokaryotic Genomes.Heidelberg Gremany.

•2007 - FASEB Summer Research Conference Geneticrecombination and genome rearrangements SnowmassVillage, CO, USA

•2007 - EMBO Members meeting Barcelone Spain •2008 - EMBO Conference Series on recombination

mechanisms. Il Ciocco Italy •2008 - EMBO Conference Series on replication and

segregation of chromosomes. Geilo Norvège

Colloques : 4


Les objectifs du projet étaient basés sur nos résultats préliminaires quimontraient : (1) que le récepteur nucléaire DHR3 agissait sur l’activité de la

kinase dS6K et non sur son expression, et (2) que l’expression des enzymes dumétabolisme des acides gras était modifiée dans les mutants dS6K. Nousprojetions d’abord de déterminer le mécanisme d’activation de dS6K par DHR3par une étude approfondie et par l’identification des gènes correspondant à des

mutations spécifiques du module DHR3/dS6K ; ces mutations se divisaient en 5groupes de complémentation. La deuxième partie visait à déterminer l’importancedu métabolisme des acides gras dans le phénotype des mutants dS6K, ainsi qu’àcaractériser les gènes correspondant chez la drosophile.

Résumé

Croissance et Métabolisme chez la drosophile : Mécanisme d’activation et cibles du module

DHR3/dS6KJacques Montagne

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le programmeblanc

Acronyme METABOLISMEEdition 2005Durée du projet 42 moisFinancement 210 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 48



Mots clés • Croissance• Lipides• Acides gras• Récepteurs nucléaires

CGM UPR 2167, Gif-sur-YvetteL’expression dans le corps gras d’un ARN interférant (cellules marquées à la GFP) contreFAS (en haut) ou ACC (en bas) diminue l’accumulation de gouttelettes lipidiques (mar-quées par le colorant des lipides Oil-Red-O).

100

Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs• Nos résultats permettent de penser que DHR3 active dS6K par un processus dit « non-génomique », mais nous ne sommes pas parvenus à le démontrer formellement.• Pour au moins 2 des groupes de complémentation qui contrecarrent l’activité du module DHR3/dS6K, nous avons identifié plusieurs mutations, suggérant que les effets

sont multigéniques, ce qui complique énormément leur étude.

Résultats majeurs• Nous avons clairement montré que DHR3 est un régulateur positif de la croissance, et qu’une isoforme dépourvue de domaine de fixation à l’ADN participe à cet effet. • Nous avons analysé plusieurs gènes impliqués directement dans le métabolisme des acides gras. Si la consommation d’acide gras est nécessaire au bon déroulement du

cycle de vie de la drosophile, il semble que l’apport alimentaire soit suffisant pour assurer les besoins du développement.• La production du malonyl-CoA, intermédiaire dans la synthèse des acides gras est par contre essentielle à la survie.• ACC, l’enzyme qui catalyse la synthèse de malonyl-CoA est essentielle dans un groupe de cellules appelées oenocytes qui possèdent des fonctions type hépatiques. Il semble

que l’absence de malonyl-CoA dans ces cellules provoque un processus similaire à celui déclenché par la carence alimentaire, en impliquant le récepteur aux lipoprotéinesLpR2.

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ces•Panic L, Montagne J, Cokaric M, Volarevic S, 2007. S6-Haploinsufficiency Activates the p53

Tumor Suppressor. Cell Cycle, 6:20-24Invitées•Séminaire CEA Grenoble, 14/06/2007•Séminaire ENS Lyon, 19/11/2007•Séminaire Faculté de Médecine Rijeka, Croatia,

07/12/2007•Séminaire IBGC Bordeaux, 25/01/2008

Colloques : 7


Etude du rôle des modifications post-traductionnelles dans le contrôle del’expression génétique par une approche structurale les mécanismes de

communication moléculaire entre les récepteurs nucléaires (NRs) et lescomposants de la machinerie transcriptionnelle afin de comprendre commentleurs fonctions sont modulées par la phosphorylation. En effet, la transcriptionrégulée par les NRs dépend non seulement du ligand mais également demodifications post-translationnelles telles que des phosphorylations. Dans le casdes isotypes alpha et gamma du récepteur à l’acide rétinoïque (RAR), le facteur

TFIIH, qui possède une activité kinase conférée par le complexecdk7/cyclinH/MAT1, participe à cette régulation. La phosphorylation du domainede fixation du ligand du RAR (AF-2) par une kinase de la voie p38/MAP facilitele recrutement de TFIIH par RAR via la cycline H, ce qui permet la phosphorylationdu domaine AB (AF-1) du RAR par la kinase cdk7 de TFIIH et active latranscription des gènes contrôlés par le RAR.

Résumé

Régulation de la transcription par les récepteursnucléaires via la phosphorylation :

étude structurale de complexes multimoléculairesDino Moras

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le programmeblanc

Acronyme PHORENUEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 430 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 84,6



Mots clés • Transcription• Phosphorylation• Récepteur aux hormones nucléaires• Biologie structurale• Complexe kinase

CNRS IGBMC UMR7104 Régulation de l’activité des récepteurs nucléaires par phosphorylation

102

Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs• production de complexes stables et homogènes, en particulier le RAR full lenght complexé au RXR et le complexe CAK• caractérisation des complexes RAR/RXR/ADN et leur association avec le complexe CAK• caractérisation biophysique de l’interaction entre le domaine de fixation du ligand du RAR et la cycline H• analyse des protéines phosphorylées in vivo et étude du recrutement du RAR et de TFIIH au niveau des promoteurs des gènes cible

Résultats majeursL’analyse du recrutement de la kinase cdk7 par le récepteur de l’acide rétinoïque via la cycline H a conduit à proposer un mécanisme de régulation allostérique. Différentesapproches ont été utilisées pour valider ce modèle. (i) La structure cristallographique d’un mutant phospho-mimétique (S371E) du domaine de fixation du ligand de RARγa été déterminée et l’interaction RAR/Cycline H caractérisée. (ii) Le complexe transitoire RAR/RXR/ADN :CAKa été caractérisé biochimiquement ; des données obtenues encryo-microscopie électronique sont en cours d’analyse.Le recrutement des complexes RAR/TFIIH aux promoteurs des gènes cibles a été étudié, ce qui a permis d’établir in vivo une nouvelle cascade d’évènements induits par l’aciderétinoïque.

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ces•Gaillard E, Bruck N, Brelivet Y, Bour G, Lalevee S, Bauer A, Poch O, Moras D, Rochette-Egly

C. Phosphorylation by PKA potentiates retinoic acid receptor alpha activity by means ofincreasing interaction with and phosphorylation by cyclin H/cdk7. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. (2006) 103:9548-53.

•Dino Moras, "Nuclear receptor superfamily: structural insights into function" Henri Stewarttalks, janvier 2008

•Wassim Abdulrahman, Muriel Uhring, Isabelle Kolb-Cheynel, Jean-Marie Garnier, DinoMoras, Natacha Rochel, Didier Busso and Arnaud Poterszman. (2008) A set of baculovirustransfer vectors for screening of affinity tags and parallel expression strategies. AnalyticalBioChem, in press

•Nathalie Bruck et al « A coordinated phosphorylation cascade initiated by MSK1 directsRARalpha recruitment to target gene promoters » Manuscrit en révision favorable (EMBO J)

Invitées•FASEB Summer research conferences : Indian Wells, CA USA,

17-22 juin 2006. Conférence invitée par Cecile Rochette-Egly•The 10th annual Nathan S. Greenfield family

pharmacology lecture, September 25, 2007. Case WesternReserve University School of Medicine, Cleveland, USA.DinoMoras "Nuclear hormone receptors: structural basis forsome functional features"

•Bijvoet Centrum, Utrecht, the Netherlands, February 7,2008. Dino Moras "Nuclear hormone receptors: structuralbasis for some functional features"

•Symposium "membrane and cell signaling" échangesWeizmann-ULP, 11-12 février 2008, Strasbourg. DinoMoras : "Allosteric control of nuclear hormone receptorsactivity through phosphorylation"

•2nd international conference on molecular perspectives onprotein-protein interactions

Colloques :


Le but de ce projet a été d’élucider les mécanismes moléculaires mis en jeu dansla polarisation, la migration et l'invasion cellulaire. Nous proposions

d'appliquer une stratégie d'étude systématique maintenant accessible en biologiecellulaire afin d'étudier le rôle de grandes familles de protéines dans cesprocessus, et plus généralement de produire une carte d'annotation fonctionnellepour chacune de ces protéines. Les aspects de trafic intracellulaire et le lien avecle cytosquelette devaient être étudiés et de nouveaux partenaires de régulateursmajeurs du trafic devaient être recherchés. Nous avons par ailleurs étudié les

mécanismes qui contrôlent la dynamique des microtubules, réseau essentiel pourmettre en place la polarité et assurer la migration des cellules. Nous proposionsaussi de développer des systèmes d’étude de l’invasion cellulaire et de lamigration et d’étudier le rôle de l’exocyste ou de SNAREs comme TI-VAMP. L’undes enjeux était d’adapter les modèles d’étude de la migration au criblageautomatisé et de cribler afin de trouver des régulateurs de cette migration.

Résumé

Regulation of cell polarity and migration : a systematic cell biology-based RNA

interference approach Franck Perez

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le programmeblanc

Acronyme PolarHiCellEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 390 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 154,6



Mots clés • Biologie Cellulaire• Polarité cellulaire• Migration• Trafic intracellulaire• Criblage à haut débit

PEREZ Franck, CNRS UMR144, Institut Curie - CAMONIS Jacques, Inserm U528, Institut Curie - GALLI Thiery, UMR7592, Institut Jacques Monod, Université Paris 7Localisation de la tubuline-GTP dans des cellules de mammifères en culture

104

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursL’un des défis était de développer un test de migration automatisé adapté au traitement systématique par des siRNA et d’utiliser ce test pour cribler des collections de siRNAciblant les principales familles de protéines régulant la dynamique intracellulaire. Un test permettant à terme d’analyser le trafic de sécrétion dans des cellules polariséesdevait aussi être développé. Par ailleurs un nouveau test d’invasion devait être mis au point et utilisé pour tester l’activité des protéines appartenant à l’exocyste ou desSNAREs. Enfin, de nouveau tests double hybride étaient projetés afin d’identifier de nouveaux régulateurs de ces protéines déjà bien étudiées.

Résultats majeursLe test de criblage a été mis en place et utilisé. Des collections de siRNA ont été assemblées et testées et le rôle de petites protéines G apparentées à ras, des kinésines, des+TIPs, de l’exocyste, des SNAREs analysés. Les « hits » sont en cours de confirmation. La dynamique golgienne a été étudiée par nouvelle approche. Des lignées exprimantMT1-MMP-mCherry ont été établies. Ceci a permis de d’analyser sa distribution durant l’invasion dans des cellules vivantes. Le rôle de l’exocyste et de TI-VAMP durantl’invasion a été établi, de même que le rôle de TI-VAMP dans la sécrétion. Ceci a été mené en parallèle avec l’identification de nouveaux partenaires de TI-VAMP et de l’étudede la voie RalB. Par ailleurs, un nouveau modèle décrivant la dynamique des microtubules a été proposé.

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ces•Analysis of De Novo Golgi Complex Formation after Enzyme-based Inactivation. Jollivet, F., G.

Raposo, A. Dimitrov, R. Sougrat, B. Goud, and F. Perez. 2007. Mol Biol Cell. 18:4637-4647.•Distinct roles of RalA and RalB in the progression of cytokinesis are supported by distinct

RalGEFs. Cascone I, Selimoglu R, Ozdemir C, Del Nery E, Yeaman C, White M, Camonis J.EMBO J. (2008) Sep 17;27(18):2375-87.

•Capns1, a new binding partner of RasGAP-SH3 domain in K-Ras(V12) oncogenic cells:Modulation of cell survival and migration. Pamonsinlapatham P, Gril B, Dufour S, Hadj-Slimane R, Gigoux V, Pethe S, L'hoste S, Camonis J, Garbay C, Raynaud F, Vidal M. (2008)Cell Signal. Aug 13

•The interaction of IQGAP1 with the exocyst complex is required for breast tumor cell invasiondownstream of Cdc42 and RhoA. Sakurai-Yageta M., Recchi C. Le Dez G., Sibarita JB, DavietL., Camonis J., D’Souza-Schorey C. and Chavrier P. (2008) J Cell Biol 181(6): 985-98.

•MT1-MMP-dependent invasion is regulated by TI-VAMP/VAMP7. Steffen A., Le Dez G., RecchiC., Nassoy P., Rottner K., Galli T. and Chavrier P. (2008) Current Biology 18(12): 926-31.

•Detection of GTP-Tubulin Conformation in Vivo Reveals a Role for GTP Remnants inMicrotubule Rescues. Dimitrov, A., M. Quesnoit, S. Moutel, I. Cantaloube, C. Pous, and F.Perez. (2008). Science (in press, ScienceExpress le 16 Oct 2008).

Invitées•TI-VAMP regulates cell surface diffusion and endocytosis of EGFR.

Golgi 2008 Meeting, Pavia, Italy, 4-9 Septembre 2008.•Antibody Workshop – University of Braunschweig –

Allemagne– Keynote Lecture. - "Selecting conformation-specific recombinant antibodies"– 6-7 Septembre 2006

•The Ral GTPases, rising stars of cytokinesis" - MouansSartoux, 7-9 oct 2008

•Exocytose et Morphogenèse Neuronale. Symposium «Signalisation et Motilité Cellulaire », 2e ColloqueMéditerranéen de Neurosciences, Marrakech, Maroc, 13-15 décembre 2006.

•Seminar Series in Cell Biology: Subcellular Structures andCellular Dynamics. HKU-Pasteur Research Centre, HongKong University, China. Nov. 25-26, 2008. “Mechanismsof invadopodia formation and matrix remodeling byinvasive tumor cells”.

Colloques :


T he objectives of the research were to understand the biology of viruses ofhyperthermophilic archaea, explore these viruses at the molecular level by a

combined functional and structural genomics approach. Moreover, the objectivewas to exploit the extreme diversity of the archaeal virus proteomes for the

discovery of new protein folds, and to understand whether there is an enrichmentof novel folds hidden under the protein sequence universe of these unique virusescompared to those of other organisms.

Résumé

Archaeal viruses : deciphering structure andfunctions of proteins and enzymes from a new

class of extremophiles

David Prangishvili

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le programmeblanc

Acronyme Archaea-virEdition 2005Durée du projet 38 moisFinancement 318 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 177



Mots clés • Archaea• Virus• Hyperthermophile• Structural biology• Protein function

Unité de Biologie Moléculaire du Gène chez les Extrêmophiles, Institut PasteurCrystal structures of proteins of archaeal viruses (A) AFV1-99; (B) SIFV-14 ; (C) AFV1-102 ;(D) AFV1-157; (E) AFV1-300; (F) AFV3-109; (G) AFV6-100.

106

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursA significant percentage of proteins in the pipeline were insoluble, precluding their characterization, probably due to the fact that molecular mechanisms of the viruses arestrongly dependent on host proteins and on the interaction between viral and host proteins. In some cases the resolved protein structure did not suggest any specific functionswhich could be put into a biological context and verified by biological assays.

Résultats majeursIsolation of closely related groups of new archaeal viruses and detailed re-annotation of viral genomes allowed functional predictions for some of them. An example of aconvergent evolution of nature and human design has been revealed with the structures of proteins AFV-99 and SIFV-14. The crystal structures of the proteins AFV1-102,AFV1-157, AFV1-300, AFV3-109 and AFV6-100, each suggested certain biological functions some of which were verified. Combination of crystal structures of the majorstructural proteins of AFV1 and cryo-EM reconstruction of the 3D structure of the AFV1 virion, revealed similarities of DNA organization with eukaryotic nucleosomes.Immunoelectron microscopy showed involvement of the proteins 132 and 140 in DNA packaging.

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ces•Goulet, A., S. Spinelli, V. Campanacci, S. Porciero, S. Blangy, R. A. Garrett, H. van

Tilbeurgh, N. Leulliot, D. Prangishvilli, and C. Cambillau. 2006. Crystallization andPreliminary X-ray Diffraction analysis of ORF14 from Sulfolobus Islandicus FilamentousVirus (SIFV). Acta Crystallographica F, 62, 884–886.

•Prangishvili, D., R. A. Garrett, and E. V. Koonin. 2006. Evolutionary genomics of archaealviruses: unique viral genomes in the third domain of life. Virus Research, 117, 52-67.

•Prangishvili, D., G. Vestergaard, M. Häring, R. Aramayo, T. Basta, R. Rachel, and R. A.Garrett, R. A. 2006. Structural and genomic properties of the hyperthermophilic archaealvirus ATV with an extracellular stage of the reproductive cycle. Journal of Molecular Biology,359, 1203-1216.

•Keller, J. N. Leulliot, C. Cambillau, V. Campanacci, S. Porciero, D. Prangishvili, P. Forterre, D.Cortez, S. Quevillon-Cheruel, and H. van Tilbeurgh. 2007. Crystal Structure of AFV3-109, ahighly conserved protein from crenarchaeal viruses. BMC Virology Journal 4, 12.

•Peng, X., T. Basta, M. Haring, R. A. Garrett, and D. Prangishvili. 2007. Genome ofAcidianus bottle-shaped virus and insights into the replication and packaging mechanisms.Virology 364, 237-243.

•Keller, J., N. Leulliot , B. Collinet, C. Cambillau, D. Pranghisvilli, and H. van Tilbeurgh.2008. Crystal structure of AFV1-102, a protein from the Acidianus Filamentous Virus 1.Protein Science, in press

Invitées•108th General Meeting of the American Society of

Microbiology, June 2008, Boston,USA.•XIV International Congress of Virology, August 2008,

Istanbul, Turkey.•XXI Congress of the International Union of

Crystallography, August 2008, Osaka, Japan.•161st Meeting of the Society for General Microbiology,

September 2007, Edinburgh, UK •“30 years of Molecular Phylogeny”, November 2007,

Urbana, USA

Colloques :


Nous assistons aujourd’hui au développement d’une véritable «épidémiemondiale» d’obésité. L’obésité est le principal facteur de risque du diabète de

type 2, des maladies cardiovasculaires et de certaines formes de cancer. Etantdonné que l’administration de leptine aux rongeurs diminue la prise alimentaireet augmente les dépenses d’énergie, entraînant une perte de masse adipeuse, laleptine avait été initialement perçue comme un remède potentiel pour l’obésité.Cependant, à l’exception des rares patients présentant une déficience génétiqueen leptine, la leptinémie est parfaitement corrélée à l’indice de masse corporel(IMC) et à la quantité de masse graisseuse. Ainsi, les individus obèses ont un forttaux de leptine circulante, mais cette abondance de leptine est incapable

d’entraîner une perte de poids, suggérant que la majorité des cas d’obésitéhumaine présente une résistance à la leptine. En effet, même si les thérapiesconsistant à utiliser de la leptine exogène favorisent la perte de poids, les effetsde la leptine, aux doses testées, restent modestes. Nombre de mécanismes ont étéévoqués pour expliquer cette leptinorésistance ; parmi eux, un déficit du passagede la leptine dans le cerveau. Nous avons émis l’hypothèse que l’une des causesmajeures de cette résistance à la leptine réside en un déficit de la capture del’hormone par les cellules endothéliales et/ou les tanycytes de l’éminencemédiane de l’hypothalamus à partir du sang porte hypophysaire.

Résumé

Obésité et leptinorésistance : altération dutransport de la leptine dans le cerveau par

l’éminence médiane de l’hypothalamus Vincent Prévot

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le programmeblanc

Acronyme Obésité et LeptinorésistanceEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 150 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 58



Mots clés • Système nerveux• Endocrinologie• Physiologie-physiopathologie• Obésité-diabète• Leptine

U837 Inserm, Jean-Pierre AUBERT, Research Center, Université de Lille 2,Caractérisation des types cellulaires composant l’éminence médiane (ME) de l’hypothala-mus par immunofluorescence.

108

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursMême si notre projet a avancé de manière considérable sur de nombreux aspects, nous nous sommes heurtés à l’absence d’outils immunologiques permettant de détecter laleptine de manière spécifique par des techniques d’histochimie. Afin de circonvenir ce problème majeur pour l’étude du passage de la leptine entre la périphérie et le systèmenerveux central, nous envisageons l’utilisation d’approches impliquant notamment l’utilisation de radioisotopes in vivo, qui sont des méthodologie très lourdes et longues àmettre en place en France.

Résultats majeurs- Nous avons caractérisé pour la première fois par hybridation in situ l’expression de l’ARNm de la forme longue du récepteur à la leptine dans le cerveau de souris postnatale et adulte. - Nous avons entrepris la caractérisation moléculaire et fonctionnelle de la barrière hématohypothalamique dans la région du noyau arqué hypothalamique (ARH) qui est lastructure cérébrale impliquée dans la régulation de l’homéostasie énergétique et de la prise alimentaire. Nos résultats suggèrent que passage des hormones métaboliques(leptine, insuline) de la périphérie au cerveau est contrôlé par les épendymocytes particuliers de l’éminence médiane de l’hypothalamus, appelés tanycytes.

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ces•Sharif A, Duhem-Tonnelle V, Allet C, Baroncini M, Loyens A, Kerr-Conte J, Blond S, Ojeda

SR, Junier M-P, Prevot V. Differential erbB signaling in astrocytes from the cerebral cortexand the hypothalamus of the human brain. Glia in press.

•SG. Bouret, JN. Gorski, CM. Patterson, S. Chen, BE. Levin and RB. Simerly. Hypothalamicneural projections are permanently disrupted in diet-induced obese rats. Cell Metab 7:179-185, 2008. (Cover article)

•Clasadonte J, Poulain P, Beauvillain JC, Prevot V. Activation of neuronal nitric oxide releaseinhibits spontaneous firing in adult gonadotropin-releasing hormone neurons: a possiblelocal synchronizing signal. Endocrinology 149:587-596, 2008.

•D’Anglemont de Tassigny X, Campagne C, Dehouck B, Leroy D, Holstein GR, Beauvillain J-C,Buée-Scherrer V, Prevot V: Coupling of nNOS to NMDA receptors via PSD-95 depends onestrogen and contributes to the central control of adult female reproduction. J Neurosci.27:6103-6114, 2007.

•Prevot V, Dehouck B, Poulain P, Beauvillain JC, Buee-Scherrer V, Bouret SG. Neural-glial-endothelial interactions and cell plasticity in the postnatal hypothalamus: implications forthe neuroendocrine control of reproduction. Psychoneuroendocrinology, 32:S46-S51, 2007.

Invitées•Prevot V. Neuro-glial-endothelial interactions and GnRH

release in the median eminence of the hypothalamus.Symposium. 91st Annual Meeting of the EndocrineSociety. Washington, DC, USA, 2009

•Prevot V. Control of neuronal functions by theendothelium in the autonomic and neuro-endocrinebrain. Symposium. International Society for AutonomicNeuroscience 2009 (ISAN2009) Sydney, Australia, 2009

•Prevot V. Glial cell plasticity: from physiology to cancer stemcells. Symposium (Chairperson). IXth European Meeting onGlial Cell in Health and Disease (Euroglia). Paris, France, 2009.

•Prevot V. Neural plasticity in the sexual brain.Symposium. Molecular Aspects of Brain Aging andNeurological Disorders. Amritsar, India, 2008.

•Bouret SG. Wired on hormones: Developmentalprogramming of hypothalamic feeding pathways.Plenary Lecture. 9th Meeting of the French Society ofNeuroscience, Bordeaux, France, 2009

Colloques : 4


PulD secretin involved in bacterial protein secretion comprises three domains.The core (C) domain, representing about half of the polypeptide, is the integral

outer membrane part of the complex that remains multimeric after proteolyticremoval of the N-terminal (N) and C-terminal (S) domains. The c-terminal 60amino acids S domain is bound by PulS to ensure correct PulD localization. TheN-domain might be the exoprotein docking site. We aimed to obtain informationon the organization of the secretin complex, the function of individual domainsand their association with other envelope components, and the mechanismsleading to assembly. We tried to use 3D crystallization and X-ray diffractionanalysis of defined domains of PulD, PulS and co-complexes thereof, cryoelectron

microscopy and 2D crystallization of C domain multimers, in vivo studies of thelocalization of the secretin complex and its insertion into membranes, and in vitroand in vivo analysis of channel formation by the complete complex and by the Cdomain. We developed improved methods for extracting secretin from themembrane (heretofore only feasible with ionic detergents that might denature theprotein), in vitro conditions for the production of separate PulD domains and PulSand complexes thereof and in vitro methods for reconstituting PulD multimersfrom subunits. The multidisciplinary approach allowed a substantially greaterunderstanding of secretin structure and function.

Résumé

Structure and function of secretin in the bacterialtype II protein secretion system

Anthony Pugsley

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Acronyme SecretinEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancementPersonnels (H-m) C + EC + IR : 234,6


Discipline Biologie et SantéMots clés • Outer membrane protein

• Protein secretion• Protein folding and oligomerization• Membrane protein

synthesis and extraction• In vitro membrane protein assembly

PUGSLEY Anthony, Institut Pasteur, Paris - GHAZI Alexandre, Institut de biochimie et biophysique moléculaire et cellulaire, Orsay. CNRS - ENGEL Andreas, Biozentrum, Basel, University of Basel

Patches of PulD secretin obtained by in vitro synthesis in the presence of lecithin liposomes.Liposomes were freeze-fractured. Clusters are arrays of secretin particles (I. Guilvout andM.Chami, unpublished data)

110

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursDetergent extraction without secretin denaturationIn vitro expression of cloned genes and fragments thereof in the presence of liposomesRibosome display technology for cycles of affitin selectionMutagenesis of affitin binding sites

Résultats majeursWe developed novel tools, affitins, that bind to secretin. Affitins inhibted secretin multimerization and assembly in the membrane could be used as probes in in situlocalization and in western blotting and for conformational changes but, unfortunately, they do not assist in the crystalization of secretin, which remains refractory to highresolution analysis. To circumvent this problem, we have developed in vitro methods for making secretin and new detergent extraction procedures that reduce detergent-induced restructuring of the protein. In vitro synthesis of secretin in bacterial cell lysates supplemented with liposomes leads to assembly and secretin dodecamers, theirinsertion into the liposome membrane and their supermolecular assembly into packed arrays that should be suitable for 2D crystallization

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ces•I. Guilvout, M. Chami, A. Engel, A.P.Pugsley, N. Bayan. 2006. Bacterial outer membrane

secretin PulD assembles and inserts into the inner membrane in the absence of its pilotin.EMBO. J. 25: 5241-5249.

•S. Collin, I. Guilvout, M. Chami, A.P.Pugsley. 2007. YaeT-independent multimerization andouter membrane association of secretin PulD. Mol. Micro. 64: 1350-1357.

•B. Mouratou, F. Schaeffer, I. Guilvout, D. Tello-Manigne, A. P. Pugsley, P. M. Alzari,F.Pecorari. 2007. Remodeling a DNA binding protein as a specific in vivo inhibitor ofbacterial secretin PulD. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 46:17983-17988.

•I. Guilvout, M. Chami, C. Berrier, A. Ghazi, A. Engel, A.P.Pugsley, N. Bayan. 2008. In vitromiltimerization and membrane insertion of bacterial outer membrane secretin PulD. J. Mol.Biol. 382:13-23

•M. Krehenbrink, M. Chami, I. Guilvout, P. Alzari, F. Pecorari, A.P.Pugsley. 2008. Artificialbinding proteins as probles for conformational changes in secretin PulD. J. Mol. Biol.383:1058-1068

•N. Buddelmeijer, M. Krehenbrink, F. Pecorari, A.P.Pugsley. 2009. Type II secretion systemsecretin PulD localizes in clusters in the Escherichia coli outer membrane. J. Bactertiol (in press)

Invitées•EMBO protein translocation meeting, Ste Maxime,

France 2009•Society for General Microbiology Meeting on Protein

Translocation, Edinburgh, UK 2009•ASM Annual Meeting, Boston, USA. 2009•Gordon Conferenceon Signalling, Rhode Island, USA.

2008•Gordon Conference on Protein Translocation, Il Chioco,

Italy, 2008

Colloques : plus de 10


La chaîne respiratoire mitochondriale des cellules eucaryotes contient desquinones qui sont des transporteurs d’électrons mobiles capables, dans

certaines situations physiopathologiques, de contribuer fortement à la productiondes espèces activées de l’oxygène. Le projet commun des trois groupes impliquésétait de comprendre, à l’aide de différents modèles cellulaires, le rôle desquinones dans un ensemble de processus vitaux de la cellule :mitochondriogenèse , tri des électrons provenant des différentes déshydrogénaseset organisation supramoléciulaire de la chaîne respiratoire (levure),

différentiation adipocytaire (lignée de préadipocytes, T3), régulation fonctionnelledu pore de transition de perméabilité et production des espèces activés del’oxygène (différentes lignées cellulaires normales, immortalisées oucancéreuses). De plus nous avons pu définir un ensemble de relations entre étatrédox des quinones et production des espèces activées de l’oxygène dansdifférents types de mitochondries isolées.

Résumé

Plasticité de l’organisation fonctionnelle de la chaîne respiratoire et contrôle de

l’homéostasie cellulaire Michel Rigoulet

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le programmeblanc

Acronyme QuinoMitEAOEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 420 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 162



Mots clés • Quinones• Espèces activées de l’oxygène• Mitochondriogenèse• Signalisation cellulaire• Devenir cellulaire

RIGOULET Michel, Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires - CASTEILLA Louis, UMR CNRS-Université Toulouse 5018, Neurobiologie, Plasticité Tissulaire et Métabolisme Energétique - LEVERVE Xavier, Inserm 02-21 Bioénergétique fondamentale et appliquée.

Quinones et mitochondries

112

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLes verrous essentiellement méthodologiques présents au début du projet ont été pour la plupart levés.

Résultats majeursLes quinones régulent via les espèces activées de l’oxygène et des facteurs de transcription nucléaires la mitochondriogenèse (levure) ; la voie de synthèse du coenzyme Qcontrôle négativement la différentiation adipocytaire ; les quinones organisées en différents « pools » membranaires organisent le tri des électrons provenant des différentesdéshydrogénases (levure) ; la régulation du pore de transition de perméabilité et la toxicité induites par les analogues de l’ubiquinone sont fortement modifiées parl’immortalisation et/ou la cancérisation.

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ces•Balandier C., Guigas B., Detaille D., Fontaine E., Rigoulet M., Leverve X.M. (2006). The

ROS production induced by reverse-electron flux at respiratory- chain complex 1 ishampered by metformin. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 38, 33-42.

•Devin A., Dejean L., Beauvoit B., Chevtzoff C., Averet N., Bunoust O., Rigoulet M. (2006).Growth yield homeostasis in respiring yeast is due to a strict mitochondrial contentadjustment. The Journal of Biological Chemistry, 281,:26779-84.

•Devin A., Rigoulet M. (2007). Mechanisms of mitochondrial response to variations inenergy demand in eukaryotic cells. American Journal of Physiology. Cell Physiolology, 292,C52-C58.

•Clerc P., Rigoulet M., Leverve X., Fontaine E. (2007). Nitric oxide increases oxidativephosphorylation efficiency. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 39(2):158-66.

•Mourier A, Vallortigara J, Yoboue ED, Rigoulet M, Devin A.(2008). Kinetic activation ofyeast mitochondrial D-lactate dehydrogenase by carboxylic acids. Biochimica BiophysicaActa, Bioenergetics, 1777, 1283-1288.

•Leverve X.M., Taleux N., Favier R., Balandier C., Detaille D., Devin A., Fontaine E., RigouletM. (2007). Cellular energy metabolism and integrated oxidative phosphorylation, inMolecular System Bioenergetics, Saks V. editor, Wiley VCH, pp 11-27.

Invitées•« Mitochondrial ROS, adipose tissue & nutrient sensing:

from a specific view to a general concept » CongrèsFrontiers in mitochondrial research, Bertinoro (2007) ;

•« La mitochondrie: de l'énergétique à la multiplicationdes fonctions. » MeetOchondrie, Arcachon (2007) ;

•« Relationship between the supramolecular organizationof the respiratory chain and electrons competition »15thEuropean Bioenergetics Conference, Dublin (2008) ;

•” Coenzyme Q level controls adipose differenciation»IFATS 2008, octobre Toulouse

Colloques : 11


T he goal of the proposed research was to quantitatively characterize, in livecells, the interactions between nuclear receptors (NR) and their coregulator

partners with the aim of more clearly defining their functional mechanisms. Weused two photon two color cross correlation spectroscopy (TPTCCCS) as theprincipal method in this investigation. This approach allows for combining 2-photon 3D microscopy with correlation spectroscopy. By using interacting proteinpairs expressed as fusions of two different colored fluorescent proteins it is possibleto measure quantitatively the degree of interaction between the NR and theircoregulator partners in live cells. Specifically our study focussed on the NR

implicated in estrogen signaling, human estrogen receptors α and β, and theirmajor transcriptional regulatory partners, the coactivator and corepressor, Tif2 andRip140 as a function of the ligand, agonist or antagonist. We showed that itpresence of the agonist, interaction was maximal. Control experiments withmutant activation function demonstrated that the interaction was mediated viathis domain. In presence of antagonist, the interaction decreased significantly.These studies demonstrate the power of this quantitative technique for monitoringprotein interactions in vivo.

Résumé

Analysis of Nuclear Receptor CoregulatorInteractions in Live Cells by Cross

Correlation Spectroscopy Catherine Royer

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le programmeblanc

Acronyme RECOFLUOEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 280 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR :

Autres IT : Recrutés :


Mots clés • Récepteurs nucléaires• Co-régulateurs• FCCS• Deux photon• Drogueq

ROYER Catherine, Centre de Biochimie Structurale - INSERM U554 - UMR 5048 CNRS - Université - Montpellier - CAVAILLÈS Vincent, IRCM - Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier INSERM U896

Auto and Cross correlation curves for ERbeta with the coA Tif2

114

Verrous scientifiques et technologiques, ou points durs1. Construction of the microscope that was compatible with in vivo studies.2. Transfection efficiency for two constructs reaching appropriate expression levels for FCS3. analysis of large amounts of data from hundreds of cells4. Overcoming photobleaching for complexes of low mobility

Résultats majeurs1. The microscope was assembled and functions quite well now in routine at 37°C.2. We have made measurements of the protein-protein interactions in live cells under a number of conditions and for multiple different contructs.

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ces Invitées

•Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy,September 2007

•European Biophysical Society Association, 14-17 July2007

•Gordon Conference on Proteins – Section Proteins invivo – June 2009

Colloques :


Dans le cadre du projet EGG-IMPACT nous avons poursuivi nos comparaisons del’établissement et de l’ évolution des polarités embryonnaires depuis la

meiose et jusqu’aux premiers stades de différenciation chez les ascidies Phallusiamammilata, Ciona intestinalis (urochordés), l’amphibien Xenopus (vertébré) et laméduse Clytia (cnidaire). Nous avons montré chez les ascidies que les ARNcorticaux (dont le déterminant musculaire macho1) sont polarisés pendant lamaturation ovocytaire. Les déterminants macho1 et PEM1 sont associés à unréseau de Réticulum endoplasmique cortical (cER). Le cER est aussi impliqué dansle contrôle de la traduction de ces ARNs corticaux polarisés via leur association auxrégulateurs de la machinerie de traduction (MnK, S6K, 4EBP) dont la

phosphorylation change après fécondation. Chez la méduse Clytia hemisphaericanous avons mis en évidence plusieurs ARNm localisés , situés aux pôles opposésde l’œuf (CheFz1, CheFz3 et Wnt3) qui agissent comme déterminants de polarité.La localisation corticale et polarisée des ARNs de Clytia se met en place au coursde l’ovogénése et pendant la maturation ovocytaire qui semblent contrôlées pardeux formes de Mos. Utilisant les modèles Ciona et Phallusia, nous avons poursuivi l’analyse deschangements chromosomiques liés au cycle cellulaire meiotique. Nous avonsdécouvert et caractérisé un partenaire de Ci-Sgo (inhibitor 2 of proteinphosphatase 2A/Set).

Résumé

The régulation of spatial organization in oocytesand eggs and it’s impact on early development

Christian Sardet

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Acronyme EGG-IMPACTEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 420 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 146



Mots clés • Développement• Meiose / Mitose• Axes embryonnaires• Localisation/ancrage des ARN• Cycle cellulaire

UMR 7009 Biodev, CNRS / UPMC, Observatoire, Villefranche-sur-MerRNA determinants and meiosis in ascidian and hydrozoan eggs

116

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursDifficulté à attirer de bons étudiants en master et thèse dans le contexte actuel sur des sujets fondamentaux malgré une évaluation très positive de l’AERES.

Résultats majeursChez l’ascidie, les ARN déterminants macho1 et PEM1 sont ancrés au réseau de Réticulum Endoplasmique cortical(REc), polarisés avec le REc et colocalisés avec deskinases(MnK, S6K) régulant la machinerie de traduction.Chez la méduse CheFz1 et CheFz3 et Wnt3 fonctionnent comme déterminants de polarité embryonnaire et un nombre étonnant d’ARN maternels sont localisés.Au niveau du contrôle du cycle cellulaire méiotique, chez l’ascidie, nous avons découvert et analysé un partenaire de Ci-Sgo (inhibitor 2 of protein phosphatase 2A/Set) etchez la méduse nous avons découvert 2 formes maternelles de Mos traduits de façon différentielles et dont les fonctions sont distinctes.

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ces•Patalano, S., G. Pruliere, F. Prodon, A. Paix, P. Dru, C. Sardet, and J. Chenevert (2006). The

aPKC-PAR-6-PAR-3 cell polarity complex localizes to the centrosome attracting body, amacroscopic cortical structure responsible for asymmetric divisions in the early ascidianembryo J. Cell Science, 10, 1242-1252

•Levasseur, M., Carroll, M. Jones, K. T. and McDougall, A. (2007). A novel mechanismcontrols the Ca2+ oscillations triggered by activation of ascidian eggs and has an absoluterequirement for CDK1 activity. J. Cell Science. 120, 1763-1771.

•Momose, T. and Houliston, E. (2007) Two Oppositely Localised Frizzled RNAs as AxisDeterminants in a Cnidarian Embryo PloS Biology 5(4), e70

•Levasseur M, Carroll M, Jones KT, McDougall A.(2007). A novel mechanism controls theCa2+ oscillations triggered by activation of ascidian eggs and has an absolute requirementfor Cdk1 activity. J Cell Science.;120(Pt 10):1763-71.

•Momose, T., Derelle, R. and Houliston, E. (2008) A maternally localised Wnt ligand requiredfor axial patterning in the cnidarian Clytia hemisphærica. Development 135 2105-2113.

•Prodon F, Sardet C, Nishida, H (2008) Cortical and cytoplasmic flows driven by actinmicrofilaments polarize the cortical ER-mRNA domain along the a-v axis in ascidianoocytes. Developmental Biology 313, 682-99.

Invitées•Okazaki Conference on Marine Biology (Okasaki et

Miyasaki, Japon, Dec 07) : C Sardet•4th International Urochordate Meeting (Villefranche/Mer

juin 07): C Sardet (conference et organization), AMcDougall : conférencier invité.

•Gordon Conference on fertilization (July 2009, PlymouthUSA) : C Sardet (organisateur et conférencier invité,session « Polarisation of eggs and embryos »), TMomose (équipe Houliston) : conférencier invité.

•Oocyte workshop(Kyoto Japon, Mars 2008) : AMcDougall, conférencier invité

•EMBO /FASEB workshop on RNA localization( July2009, Vermont, USA): E Houliston, conférencièreinvitee.

Colloques : 6


Dans la moelle osseuse, le développement des lymphocytes B est un processushautement régulé qui permet la génération de cellules pré-B puis B, très

diversifiées et tolérantes au soi. Les récepteurs des cellules pré-B (pré-BCR) et B(BCR) exercent des points de contrôles critiques au cours de la différenciation B.Notre laboratoire (partenaire 1) a apporté une contribution majeure dans cedomaine en identifiant la galectine-1 (GAL1), membre de la famille des S-lectines, comme un ligand direct du pré-BCR, produit par les cellules stromalesmédullaires.Le but de ce projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires établispar le stroma médullaire et impliqués dans la différenciation des progéniteurs B,

voie de recherche complètement laissée pour compte au niveau national etinternational. Nous voulons : 1) renforcer nos connaissances sur la formation dela synapse pré-B/stroma conduisant à l’activation du pré-BCR, 2) déterminer lesconséquences fonctionnelles de la formation de synapse sur le développement B,3) caractériser les niches stromales médullaires GAL1+, 4) identifier les basesstructurales des interactions pré-BCR/galectines par RMN (partenaire 2) et enfin5) étudier le rôle de GAL1 sur le développement du compartiment stromal(partenaire 3).

Résumé

Rôle du stroma médullaire dans la différenciationprécoce des lymphocytes B

Claudine Schiff

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le programmeblanc

Acronyme Stroma-préBEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 360 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 54

Autres IT : Recrutés : 36Autres : 28,8


Mots clés • Immunologie• Différenciation des lymphocytes pré-B• Stroma médullaire• Interactions moléculaires• Galectine-1

SCHIFF Claudine, Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, UMR CNRS 6102, Marseille - ROCHE Philippe, Institut de Biologie Structurale et de Microbiologie, IMR FRE3083, Marseille - TARTE Karin, Fac. de Médecine de Rennes, UPRES EA 3889, Rennes

The pre-BCR colocalizes with galectin-1, VLA4 and LFA1 integrins

118

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursDifficultés : travailler sur des cellules pré-B normales, établir le rôle de GAL1 qui appartient à une famille multigénique (présence de protéines redondantes dans le phénomèneétudié), identifier des cellules mésenchymateuses spécialisées à partir de moelle osseuse, définir les bases structurales d’interactions protéine-protéine et protéine-sucre.

Résultats majeursNous avons : 1) caractérisé des interactions pré-BCR/GAL1/intégrine nécessaires au regroupement et à l’activation des pré-BCRs, 2) démontré le rôle fonctionnel de cesinteractions sur la prolifération et la différenciation des cellules pré-B, in vitro et in vivo chez la souris GAL1 déficiente et 3) mis en évidence l’existence d’une niche de cellulesstromales médullaire, spécifique des cellules pré-B. L’étude structurale du complexe GAL1/pré-BCR est en cours et nous avons déjà identifié les acides aminés du pré-BCRimpliqués dans l’interaction avec GAL1. Enfin nous montrons que l’expression de GAL1 est modulée lors de l'engagement des cellules souches mésenchymateuses dans lavoie de différenciation ostéoblastique et au cours de la maturation des ostéoblastes.

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ces•Rossi B, Espeli M, Schiff C and Gauthier L. Clustering of Pre-B Cell Integrins Induces

Galectin-1-Dependent Pre-B Cell Receptor Relocalization and Activation. J Immunol., 2006,177, 796-803.

•Espeli M, Rossi B, Mancini SJC, Roche P, Gauthier L and Schiff C. Pre-B cell receptoractivation: common and distinctive features in human and mouse. Seminar Immunol.,2006, 18, 56-66.

•Espeli M, Gauthier L, Mancini SJ, Mourcin F, Rossi B and Schiff C. Galectins and integrins inpre-B cell development. Animal lectins: a functional view. Edited by G. R. Vasta and H.Ahmed, CRC Press. Galectins and integrins in pre-B cell development, 2008, 275-284.

Invitées•ESF-EMBO Symposium, Sant Feliu de Guixols, Spain,

13-17/05/2006. B cells cross the divide: from in silicoto the whole person. Early B cell differentiation in thebone marrow: the pre-B/stromal cell synapse.

•1st Joint Meeting of European National Societies ofImmunology - 16th European Congress of Immunology, Paris,06-09/09/2006. Role of galectin-1-derived bone marrowstromal cells on pre-B cell differentiation and proliferation.

•Henry Kunkel Society meeting on Immune CellDevelopment, The Rockefeller University, April 25-27,2007. Close encounters in pre-B cell development.

•Immunology Laboratory (Elisabetta Traggiai), Institute GGaslini, Genova. 27/09/2007. Close encounters in pre-B cell development.

•Department of Pulmonary Medicine (Rudi W. Hendriks).Erasmus MC Rotterdam. Rotterdam. 02/12/08.Functional role of pre-B/stromal cell interactions in thebone marrow

Colloques : 11


Proper sorting and delivery of receptors and extracellular ligands is essential tocell-cell signaling during development. Notch (N) is the receptor of a

conserved signaling pathway that regulates many cell fate decisions andpatterning events from worms to humans. Endocytosis and/or endosomal sortingof the N receptor and of its ligands Delta and Serrate/Jagged have recentlyemerged as key regulatory steps in N signaling. Endocytosis of N ligands isregulated by two distinct E3 ubiquitin ligases: Neuralized (Neur) and Mindbomb1(Mib1). Neur and Mib1 regulate distinct subsets of N signaling events. In this

project, we have investigated the role of Mib1, Neur in the regulation of thetrafficking and signaling activity of N ligands. We have also investigated thefunction of known Neur inhibitors and screened for novel genetic interactors ofMib1. Finally, we have developped new tools to study the intracellular traffickingof N in vivo.

Résumé

Role of endocytosis in Notchreceptor signaling

François Schweisguth

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le programmeblanc

Acronyme SignalNotchEdition 2005Durée du projet 41 moisFinancement 320 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 48



Mots clés • Endocytosis• Signalisation• Drosophila• Notch

SCHWEISGUTH François, Institut Pasteur, CNRS URA2578 Endocytosis of the Notch ligand Delta is regulated by Bearded and Neuralized.

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Résultats majeurs1. We have demonstrated that members of the Bearded family act redundantly to inhibit Neuralized-dependent Delta signaling in Drosophila 2. We have obtained evidence indicating that glycosphingolipids modulate the Mib1-dependent signaling in Drosophila

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ces•A. J. Bardin and F. Schweisguth (2006), Bearded family members inhibit Neuralized-

mediated endocytosis and signaling activity of Delta in Drosophila. Developmental Cell, 10,245-55. Comments in Molecular Cell (2006) 21, 450-2, and in Faculty of 1000

Invitées•London Fly Meeting, London (UK ; 2006)•Joint SFBD-ZMG meeting, Praz/Arly (2006)•The Notch Meeting, Athènes (Grèce ; 2007)

Colloques : 6


Résumé

The role of the class B scavenger receptor CD36 :a novel physiopathologic and therapeutic

approach in AMDFlorian Sennlaub

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le programmeblanc

Acronyme CD36 in AMDEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 240 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 36

Autres IT : 7,2Recrutés : 36Autres : 72


Mots clés • Scavanger receptor CD36• Microvascular degeneration• Neovascularization• Age related macular degeneration

INSERM UMRS 872Involution choroïdienne illustrée en microscopie électronique à balayage de moulageinterne de vaisseaux (A animal déficient en CD36, B animal control)

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la cause principale decécité irréversible dans le monde industrialisé. Elle est caractérisée par une

baisse sévère de l’acuité visuelle, associée à une accumulation lipidique dans lamembrane de Bruch (MB), une atrophie des photorécepteurs et de l’épithéliumpigmentaire rétinien (EPR), ainsi qu’une involution choroïdienne avec ou sansnéovascularisation. Les mécanismes moléculaires de la DMLA sont peu connus. Lerécepteur scavenger CD36 est exprimé dans l’EPR et la chorïocapillaire. Il est lerécepteur principal des low density lipoprotein (LDL) oxydes et participe à leurclairance dans l’interstitium. D’autre part, l’activation du CD36 permet laphagocytose des segments externes des bâtonnets (SE).

Nous avions proposer d’étudier les hypothèses suivantes : 1) L’hypoxie rétiniennelors de la DMLA supprime l’expression du CD36 dans l’EPR. 2) La suppression duCD36 mène à une accumulation progressive de LDL oxydes dans la MB, 3) à unephagocytose inefficace des SE et leur dégénérescence secondaire, 4) et enfin àune diminution de l’expression de la COX-2 et l’involution progressive de lachoroïde.Ce projet propose d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires dela DMLA afin d’identifier des cibles pharmacologiques et de développer unethérapie efficace contre cette grave maladie.

122


Résultats majeursNous avons démontré que la suppression in vivo du CD36 mène à une phagocytose inefficace des SE et leur dégénérescence secondaire, une diminution de l’expression dela COX-2 entraînant l’involution progressive de la choroïde et l’accumulation progressive de LDL oxydes dans la MB. Nos expériences in vitro suggèrent que le CD36 du RPErégule directement l’expression de la COX-2, qui induit le VEGF, nécessaire à la maintenance des vaisseaux choroïdien. En résumé la déficience de CD36 chez l’animal mèneà une dégénérescence similaire à la DMLA. Nous sommes actuellement en train de tester des agonistes de CD36 comme thérapeutique de la DMLA dans des modèlespréclinique.

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ces•Houssier, M., Raoul, W., Lavalette, S., Keller, N., Guillonneau, X., Baragatti B., Jonet, L.,

Jeanny, JC., Behar-Cohen F., Coceani F., Scherman D. Lachapelle P, Ong H., Chemtob S. andSennlaub F. CD36 deficiency leads to choroidal involution via COX-2 downregulation. PLoSMedecine. 2008 Feb;5(2):e39.

•Combadiere, C., Feumi, C., Raoul, W., Keller, N., Rodero, M., Pezard, A., Lavalette, S.,Houssier, M., Jonet, L., Picard, E., Debre, P., Sirinyan, M., Deterre, P., Ferroukhi, T., Cohen,S. Y., Chauvaud, D., Jeanny, J. C., Chemtob, S., Behar-Cohen, F., Sennlaub, F. 2007.CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinalfeatures of age-related macular degeneration. J Clin Invest 117:2920-2928

•Mwaikambo BR, Sennlaub F, Ong H, Chemtob S, Hardy P. Genetic ablation of CD36 inducesage-related corneal neovascularization. Cornea. 2008 Oct;27(9):1037-41

•Mwaikambo BR, Sennlaub F, Ong H, Chemtob S, Hardy P. Activation of CD36 inhibits andinduces regression of inflammatory corneal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci.2006 Oct;47(10):4356-64.

•Raoul W, Keller N, Rodéro M, Behar-Cohen F, Sennlaub F, Combadière C. Role of thechemokine receptor CX3CR1 in the mobilization of phagocytic retinal microglial cells. JNeuroimmunol. 2008 Jul 31;198(1-2):56-61. Epub 2008 May 27.

•Lejmi E, Leconte L, Pédron-Mazoyer S, Ropert S, Raoul W, Lavalette S, Bouras I, Feron JG,Maitre-Boube M, Assayag F, Feumi C, Alemany M, Jie TX, Merkulova T, Poupon MF, RuchouxMM, Tobelem G, Sennlaub F, Plouët J. Netrin-4 inhibits angiogenesis via binding toneogenin and recruitment of Unc5B. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Aug26;105(34):12491-6. Epub 2008 Aug 21. PMID: 18719102

Invitées•2007 - “CX3CR1 and Drusen development”. Swiss Eye

Week, Brunnen, Switzerland•2007 - “Possible mechanisms of AMD: 1. CD36 leads to

choroidal involution via a COX-2 downregulation; 2.CX3CR1 deficiency leads to subretinal microglial cellaccumulation and cardinal features of AMD.” Center forTransgene Technology & Gene Therapy; FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology (VIB);University of Leuven, Campus Gasthuisberg, Belgium

•2008 - “ CX3CR1 and AMD”; 1st Symposium ofFondazione Sifi - Benanti e Chines, having the title“Innate Immunity, Inflammation and Eye Diseases”Rome, Italy.

Colloques : 8


Analyse Multidisciplinaire du Processus deColonisation de Surface par les Bactéries :

Surfactine, Migration, Formation des ProfilsSimone Séror

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le programmeblanc

Simone J. SÉROR, Institut de Génétique et Microbiologie, Equipe Signalisation, Phosphoprotéome et Communautés Bactériennes, UMR 8621 CNRS - Université Paris-Sud - Olivier LAPRÉVOTE, CNRS UPR 2301 - Mathis PLAPP, CNRS UMR 7643 - Benoît PERTHAME, CNRS UMR 8533

Le processus de migration dendritique (swarming) chez Bacillus subtilis

Dans la nature, les bactéries existent sous forme de communautés de surface.Chez Bacillus subtilis, la colonisation de surface (swarming) est un processus

coopératif qui exige les flagelles et la sécrétion de surfactine. Cette migration enmasse a lieu sous forme de structures très ramifiées, les dendrites. Nous avonsidentifié au total 14 nouveaux gènes de swarming et les avons assignés à desétapes spécifiques de ce processus de développement. Les étapes initialesimpliquent une couche monocellulaire pendant plusieurs heures, permettant ainsil'analyse de l'expression génique spatio-temporelle au niveau de la celluleunique. La synthèse de surfactine (srfA-gfp) présente une expression maximale àla base et ce gradient coïncide avec le gradient de surfactine observé par

spectrométrie de masse (MALDI-TOF et ToF-SIMS). En total contraste, la synthèsede la flagelline (hag-gfp) est maximale aux extrémités des dendrites. Au moins 2autres profils d'expression distincts ont été détectés. Ces résultats indiquent unehétérogénéïté phénotypique surprenante au sein d'une population isogénique, ycompris l'existence de cellules spécialisées, les cellules "swarmers' à l'extrémitédistale de la dendrite. Avec nos collègues mathématiciens, nous avons développéun modèle simple afin d'expliquer la migration. Enfin, nos études ont révélé unevue radicalement nouvelle de la nature d'une communauté bactérienne, avec unsystème d'analyse qui, à notre avis, devrait avoir un impact dramatique dans ledomaine.

Résumé

Acronyme MACBACEdition 2005Durée du projet 30 moisFinancement 166 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 173,7

Autres IT : 7,75Recrutés : 40,5


Mots clés • SocioMicrobiologie• Communautés bactériennes• Expression génique en cellule unique• Spectrométrie de masse• Modélisation

124

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursBien que nous ayons utilisé des technologies nouvelles comme l'imagerie ToF-SIMS in situ appliquée à une communauté bactérienne, nous n'avons pas réellement rencontréde verrrou dans ce programme.Les paramètres de la migration dendritique ont été définis dans la première tentative de simulation du processus. Ceci nous a conduits à une approche plus progressive etvers un modèle plus simple que nous testerons sur le plan expérimental et avec nos collègues mathématiciens.

Résultats majeursAnalyse génétique de la migration dendritique : 14 gènes sont maintenant identifiés et assignés à 3 étapes précoces différentes. Régulation spatio-temporelle de l'expressiongénique : de manière remarquable, au moins 4 profils distincts d'expression génique ont été détectés, indiquant ainsi la présence de plusieurs types cellulaires ou sous-populations. Nous avons détecté pour srf (surfactine) une expression maximale à la base de la dendrite (gfp), qui coïncide avec le gradient de concentration de surfactineassociée au pourtour des dendrites (MALDI-TOF et ToF-SIMS) et, en contraste total, nous avons identifié, à l’extrémité de la dendrite, une sous-population de cellulesspécialisées, les "swarmers" hyper flagellées et hyper-motiles. A partir de ces résultats, nous avons développé un modèle simple avec un rôle coopératif pour au moins 2types cellulaires, les "followers" et les "swarmers".

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ces•Séror S. J. & Holland I.B. (2006) Bacterial pattern formation, a poorly understood

phenomenon controlled by a complex interplay of chemistry, fluid mechanics and genetics :can a mathematical treatment simplify the analysis ? Oberwolfach Reports, 2, 1413-1415

•Holland I. B., Julkowska D. Hamze K. & Séror S. J (2006) Bacterial Swarming, A Tale ofPhysics And Genetics, MicrobiologyToday (Quarterly Review of the Society GeneralMicrobiology, UK), 33, 68-70

•Debois D, Guérineau V, Hamzé K, Holland IB, Lopes P, Ouazzani J, Séror SJ, Brunelle A &Laprévote O, (2008), In situ localization and quantification of surfactins in a Bacillussubtilis swarming community by imaging mass spectrometry, Proteomics, 8, 3682-3691

•Hamze K, Julkowska D, Autret S, Hinc K, Nagorska K, Sekowska A, Holland IB & Séror SJ(2008) Identification of genes required for different stages of dendritic swarming in Bacillussubtilis with a novel role for phrC, Microbiology, Sous presse

•G. Nadin, B.Perthame, L. Ryzhik (2008) Traveling waves for the Keller-Segel system withFisher birth terms. Interfaces and Free Boundaries. Sous presse

Invitées•Séror SJ. BACELL Meeting, Trinity College, Dublin (Irlande),

28-29 mars 2006. "Genetic analysis of signalling systemsfor swarming in B. subtilis".

•Oberwolfach Conferences : "Mathematical Biology",Oberwolfach (Allemagne) 14 - 20 mai 2006.

•EuroConference on Bacterial Networks. Joining the Strengths ofStructural and Systems Biology to reach Synthetic Biology,San-Feliu de Guixols (Espagne), 14-19 octobre 2006.

• 55th ASMS Conference on Mass Spectrometry and AlliedTopics, Indianapolis, USA, 3-7 juin 2007.

•SJ. "4th Conference on Functional Genomics – 14thInternational Conference on Bacilli " Tirrenia, Pisa (Italie),24-28 juin 2007. "In situ analysis of gene expression intime and space during swarming in B. subtilis".

Colloques : 6


Le projet vise une ingénierie des interactions entre aminoacyl-ARNt synthétases(aaRS) et leurs substrats, les acides aminés. Les aaRS attachent un acide

aminé spécifique à un ARNt spécifique, établissant le code génétique. Nous avonspoursuivi deux objectifs: (1) ingénierie d'une aspartyl- et aspagarinyl-ARNtsynthétase (AspRS, AsnRS) avec des spécificités échangées; (2) ingénierie d'uneTyrRS acceptant comme substrat la D-Tyr au lieu de la L-Tyr, ce qui est une étapevers l'incorporation contrôlée de D-acides aminés dans les protéines. Nous avonsdéveloppé et appliqué des techniques computationnelles état-de-l'art: calculsd'énergie libre par dynamique moléculaire et évolution dirigée (ED) in silico. Lescalculs furent testés par des mesures d'affinité et d'activité, démontrant que

plusieurs mutants prédits possèdent une (faible) activité envers la D-Tyr. Nousavons également effectué une ED expérimentale. La TyrRS de levure a étémodifiée au hasard en son site actif, dans un contexte bactérien. Une sélection invivo a conduit à plusieurs TyrRS modifiées, qui aminoacylent un ARNt suppresseurambre avec la D-Tyr. Malheureusement, nous n'avons pas obtenu de mutants plusactifs pour la D-Tyr que pour la L-Tyr, ni par ED in silico, ni par ED expérimentale.L'inversion de la spécificité de la TyrRS reste donc à réaliser. En revanche, lesméthodes développées représentent un nouvel outil d'intéret général pourl'ingénierie d'enzymes.

Résumé

Vers une ingénierie du code génétique : une approche intégrant expérience et théorie

Thomas Simonson

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le programmeblanc

Acronyme EnzymatechEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 166 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 12



Mots clés • Ingénierie des protéines• Évolution dirigée• Aminoacyl-ARNt synthétases• Dynamique moléculaire• Mutagénèse dirigée

Laboratoire de Biochimie (UMR CNRS 7654)

A gauche: cycle thermodynamique comparant l'aspartyl-ARNt synthétase avec différentsligands et différents états de protonation. Chaque arête du cube relie deux états du com-plexe ayant des charges électriques différentes. A droite: vue schématique du site de fixa-tion du substrat Asp, montrée au centre (voir Thompson et al, ChemBioChem, 2006).

126

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursAmélioration de la méthode d'évolution dirigée computationnelle pour mieux prendre en compte l'effet diélectrique du solvant.Manque de puissance de calcul pour les simulations de dynamique moléculaire; insuffisance des centres de calcul nationaux.

Résultats majeursDéveloppement d'un ensemble logiciel pour l'évolution dirigée de protéines.Application de nouvelles méthodes pour le calcul d'énergies libres d'association protéine-ligand par simulations de dynamique moléculaire et validation expérimentale.Analyse de la stéréospécificité de l'aspartyl-ARNt synthétase pour la L-Asp par simulations et expériences.

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ces•D. Thompson, C. Lazennec, P. Plateau & T. Simonson (2008) Proteins, 71, 1450-1460.

Probing electrostatic interactions and ligand binding in aspartyl-tRNA synthetase throughsite-directed mutagenesis and computer simulations.

•M. Schmidt am Busch, A. Lopes, D. Mignon & T. Simonson (2008) Journal ofComputational Chemistry, 29, 1092-1102. Computational protein design: softwareimplementation, parameter optimization, and performance of a simple method.

•D. Thompson, C. Lazennec, P. Plateau & T. Simonson (2007) Journal of BiologicalChemistry, 282, 30856-30868. Ammonium scanning in an enzyme active site: the chiralspecificity of aspartyl-tRNA synthetase.

•A. Lopes, A. Aleksandrov, C. Bathelt, G. Archontis & T. Simonson (2007) Proteins, 67:853-867. Computational sidechain placement and protein mutagenesis with implicit solventmodels: implications for protein design.

•D. Thompson & T. Simonson (2006) Journal of Biological Chemistry, 281, 23792 23803.Molecular dynamics simulations show that bound Mg2+ contributes to amino acid andaminoacyl-adenylate binding specificity in aspartyl-tRNA synthetase through long rangeelectrostatic interactions.

Invitées•Gordon conference on Computer Assisted Drug Design,

Tilton, NH, USA, 2009.•Protein Electrostatics Workshop, Telluride, CO, USA,

2008.•IMPBio meeting on Protein structure, dynamics, and

function, Paris, 2007.•Institut Pasteur-Weizmann Institute Meeting on

Structural Biology, Paris, 2006.

Colloques :


Résumé

Le rôle des protéines intrinsèquement dépliéesdans l’assemblage du ribosome

Mathias Springer

127

le programmeblanc

Acronyme REPLIEMENTEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 270 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 105


Discipline Biologie et SantéMots clés • Repliement des protéines

• Repliement des ARN • Assemblage du ribosome• Contrôle traductionnel

de l'expression génique• Traduction

Mathias SPRINGER, Institut de biologie physico-chimique, Paris - Frédéric DARDEL, - UMR 8015 CNRS -Université PARIS 5 - Youri TIMSIT, Laboratoire de Biochimie Théorique - CNRS UPR 9080 - IBPC - PARIS -Catherine ROYER, Centre de Biochimie Structurale - INSERM U554 - UMR 5048 CNRS - Université - Montpellier

Co-existence dans une unité asymétrique de deux formes repliées (en violet et vert) et dedeux formes partiellement dépliées (en jaune et turquoise) de la protéine ribosomique L20d'A. aeolicus..

L'un des paradigmes fondateurs de la biologie moléculaire a été récemmentébranlé par la découverte de protéines non-structurées à l'état natif. Ces

protéines dont les gènes pourraient constituer 30 % du génome chez leseucaryotes sont généralement impliquées dans les processus régulateurs etl'assemblage de complexes supramoléculaires comme le ribosome. Le but duprojet était 1) d'identifier des protéines ribosomiques ayant de grands domainesnon-structurés ou même des protéines qui seraient entièrement dépliées à l'étatnatif alors qu'elles sont repliées dans le ribosome; 2) d'étudier l'importance ducaractère intrinsèquement déplié dans le repliement de l'ARN ribosomique etdans l'assemblage et la fonction du ribosome. Nous avons montré que la protéineribosomique L20 possédait un grand domaine N-terminal intrinsèquement déplié(environ la moitié de la protéine) qui est essentiel à l'assemblage de la grandesous-unité du ribosome. Nous avons montré que le domaine N-terminal de L20,

malgré son caractère intrinsèquement déplié en solution cristallisait sous deuxformes, l'une repliée et l'autre partiellement repliée, les deux formes coexistantdans une même unité asymétrique ce qui n'avait jamais été décrit dans lalittérature auparavant. Tout semble indiquer que le cristal a permis de piéger unintermédiaire de repliement. Nous avons aussi montré que les protéinesribosomiques S20 et L34 qui se replient sous la forme d'alpha hélices dans leribosome étaient entièrement dépliées dans les conditions classiques de tamponin vitro. Nous avons pu montrer qu'en présence d'ARN non spécifique (ARNt parexemple), ces protéines étaient capable de se replier sous forme alpha-hélicale.Ces résultats indiquent que, malgré leur caractère intrinsèquement déplié quandelles sont isolées en solution, ces protéines se replient in vivo à la sortie duribosome au contact des nombreux ARN cellulaires. Il demeure qu'elles ont unefacilité particulière de passer de l'état déplié à l'état replié.

128

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursNotre travail sur la protéine L20 nous indique que le caractère intrinsèquement déplié en solution provient de la haute densité en résidus basiques, les mêmes résidus dontla charge est neutralisée par les charges négatives de l'ARNr et qui interagissent avec lui. Les mutés change l'interaction avec l'ARNr et rend difficile toute interprétation deseffets de ces changements comme étant dus à la perte du caractère intrinsèquement déplié plutôt qu'à une perte des interactions avec l'ARN ribosomique.

Résultats majeursNotre travail a montré 1) qu'il existe des protéines ribosomiques soit partiellement soit totalement dépliées en solution mais repliées en alpha hélices dans le ribosome. 2)Ce caractère déplié est principalement dû aux charges positives qui sont neutralisées dans le ribosome mais répulsives quand la protéine est isolée. 3) Nous avons pu montrerqu'une forme repliée et une forme partiellement repliée de la protéine ribosomique L20 pouvaient co-exister dans une unité asymétrique. 4) Nous avons pu caractériser unintermédiaire de repliement de L20. 5) La protéine ribosomique L20 est aussi le régulateur de la propre synthèse et nous avons pu partiellement élucider le mécanisme decette régulation. 6) Nous avons montré que L20 avait la possibilité de rapprocher des régions distantes de l'ARN ce qui pourrait expliquer son rôle dans l'assemblage de lagrande sous-unité du ribosome.

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ces•Timsit, Y., Allemand, F., Chiaruttini, C. & Springer, M. (2006). Coexistence of two protein

folding states in the crystal structure of ribosomal protein L20. EMBO Rep 7, 1013-1018.•Allemand, F., Haentjens, J., Chiaruttini, C., Royer, C. & Springer, M. (2007). Escherichia coli

ribosomal protein L20 binds as a single monomer to its own mRNA bearing two potentialbinding sites. Nucleic Acids Res 35, 3016-3031.

•Haentjens-Sitri, J., Allemand, F., Springer, M. & Chiaruttini, C. (2008). A competitionmechanism regulates the translation of the Escherichia coli operon encoding ribosomalproteins L35 and L20. J Mol Biol 375, 612-625.

•Mitra, L., Hata, K., Kono, R., Maeno, A., Isom, D., Rouget, J.B., Winter, R., Akasaka, K., Garcia-Moreno E., B. & Royer, C.A., Vi-Value Analysis: A Pressure-Based Method for Mapping the Folding Transition State Ensemble of Proteins, JACS, 129, 14108-14109, 2007

•Krywka, C., Sternemann, C., Paulus, M., Tolan, M., Royer, C. & Winter, R. (2008) Effects ofosmolytes on pressure-induced unfolding of proteins, Chem Phys Chem ,9, 2809-2815.

•Zorrilla S, Ortega A, Chaix D, Alfonso C, Rivas G, Aymerich S, Lillo P, Declerck N, Royer CA,(2008) Characterization of the CcpN repressor by FCCS and other biophysical approaches,Biophys J. 95, 4403-4415, 2008.

Invitées•Conférence Jacques Monod: functions multiples de l'ARN dans

le contrôle génétique, Roscoff, 3-7 mai.•RNA 2006 Izu, Ohito, Japon, 3-7 décembre.•Biopolymers Gordon Conference, Salve Regina, Newport RI, June

8-13, 2008.• American Chemical Society Annual Meeting, Philadelphia PA,

Session on Protein Folding and Dynamics: Experiment andTheory, August, 17-21, 2008.

•Colloque de l’association française de cristallographie,Université de Rennes 1, Rennes 7-10 Juillet 2008

Colloques : 6


Par sa prépondérance chez les organismes multicellulaires, l’épissage alternatifcontribue à une considérable diversité protéique qui peut conduire à une

modulation qualitative et quantitative de l'expression des gènes en fonction dutype de tissu ou au cours du développement d'un organisme. Les séquences quirégulent l’épissage alternatif sont donc des éléments clefs d’un nouveau codegénétique, “ le code de l’épissage ”, agissant en amont du “ code protéique ”.Des mutations qui touchent ces séquences sont à l’origine de nombreusesmaladies génétiques chez l’homme et l’analyse systématique des transcrits issusdes gènes mutés reste le seul moyen d’identifier les séquences contribuant au “code de l’épissage ”.

Le but de ce projet est d'aborder le déchiffrage du “ code de l’épissage ” au moyende molécules chimiques qui bloquent différentes étapes de l’assemblage duspliceosome, “ l’enzyme ” ribonucléoprotéique responsable de l’excision desintrons. Cette connaissance est non seulement essentielle pour comprendre lefonctionnement de la machinerie d’épissage, mais également pour l’utilisation deces molécules comme médicaments dans le traitement de maladies virales etgénétiques résultant de l’altération des processus d’épissage.

Résumé

Des molécules chimiques pour le déchiffrage et la modulation d’un nouveau code génétique,

“le code de l’épissage”Jamal Tazi

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le programmeblanc

Acronyme splicing codeEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 450 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 185

Autres IT : 241Recrutés :


Mots clés • Epissage alternatif• Spliceosome• Protéines SR• ARN-protéine• Correction de l’épissage

TAZI Jamal, UMR5535 CNRS-UM1-UM2 - GRIERSON David, UMR 176 CNRS-Institut Curie - BRANLANT Christiane, UMR 7567 CNRS - STÉVENIN James, UMR 7104 CNRS; U596 INSERM

B52 is educating eyeless to trigger correct eye organogenesis

130

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursa) Développer de nouvelles molécules chimiques pour bloquer la formation du spliceosome à différentes étapes de l’assemblage afin de définir la composition et lesinteractions moléculaires au sein des complexes assemblés.b) Définir les stratégies permettant, grâce à des molécules chimiques, de restaurer l’épissage normal dans des systèmes cellulaires et des organismes modèles.c) Déterminer l’implication des protéines SR dans le couplage entre l’épissage et la dégradation des ARN messagers par “ Nonsense Mediated Decay ” et identifier desmolécules capables d’interférer avec ce processus.d) Réaliser, chez la Drosophile, un crible génétique visant à identifier de nouveaux régulateurs de l’épissage et déterminer les répertoires de gènes cibles des protéines SR.

Résultats majeurs• Découverte de l’IDC16, une molécule qui cible la protéine SR SF2/ASF, comme inhibiteur efficace de la multiplication du virus du SIDA. C’est l’ébauche d’une nouvelle

approche thérapeutique anti-virale. • Découverte de la première molécule inhibitrice du mécanisme de NMD (NMDI-I). Nous avons obtenu la preuve de concept que cette molécule est active in vivo sur deux

modèles de souris ce qui ouvre la voie à une nouvelle voie de traitement des maladie génétique. • Par une approche génétique, nous avons caractérisé la fonction des protéines SR au cours du développement. Nous avons, ainsi, mis en évidence de nouvelles fonctions

de ces protéines dans le contrôle de l’instabilité génomique.

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ces•A. Disset, C.F. Bourgeois, N. Benmalek, M. Claustres, J. Stévenin And S. Tuffery-Giraud (2006).

Hum. Mol. Genet. 15: 999-1013•H. Hallay, N. Locker, L. Ayadi-Ben Mena, D. Ropers, E. Guittet And C. Branlant (2006) J Biol Chem.,

281, 37159-74.•S. Durand, N. Cougot, F. Mahuteau-Betzer, A. Paillusson, O. Muhlemann, C.H. Nguyen, E.

Bertrand, D. Grierson, J. Tazi. And F. Lejeune. (2007) J. CELL BIOL 178, 1145-1160•N. Bakkour, Y. Li, S. Maire, L. Ayadi, F. Mahuteau-Betzer, C. H. Nguyen, D. Grierson, Ph. Jeanteur,

P. Corbeau C. Branlant And J. Tazi. (2007) PLoS Pathogens. e159•M. Gabut, J. Dejardin, J. Tazi And J. Soret (2007) Mol. Cell. Biol 27 , 3087-97•W. Fic, F. Juge, J. Soret And J. Tazi. (2007) PloS ONE 2: 253e

Brevets : - Brevet délivré en France N° publication 2 859 474- Demande de brevet d’invention (PCT) aux Etats-Unis d’Amérique n° 10/570,849- Demande de brevet européen (EuroPCT) n° 04787316.1-2107- Brevet déposé le 19 Février 2007, INPI n° 07 53349)- Brevet déposé le 10 Janvier 2008, n°86003-03)

Invitées•J. Tazi. First International EURASNET conference on

alternative splicing, 21-23 May 2008 Krakow, Poland•J. Tazi. Symposium 2007: from systematic to synthetic

biology university of Edinburgh, UK•J. Tazi. ICGEB meeting, Gene expression and RNA

processing, 26-30 November 2007, Bariloche,Argentina

•J. Tazi. Alternative splicing- Special Interest Groupmeeting August 2007. Vienna, Autriche

•J. Tazi, conférencier invité. SR proteins in physiologicaland pathological splicing and as a target for therapy.EMBO Conference 2007, Pre-mRNA processing anddisease. Cortina, Italie

Colloques : 24


Chez les eucaryotes, la duplication du génome démarre à de nombreusesorigines, dont la position, le contrôle et la coordination sont encore très mal

connus. Ce projet qui allie biologie cellulaire et moléculaire, bioinformatique etphysique, a pour objectifs d’identifier sur l’ensemble du génome humain un trèsgrand nombre d’origines de réplication, et d’apporter un éclairage nouveau surl’organisation spatiale et temporelle de la réplication chez les eucaryotessupérieurs. Ce projet s'appuie sur l'étude bioinformatique des asymétries demutation induites par la réplication et directement reliées à la direction depropagation des fourches de réplication, qui a permis de prédire plus de 1000origines dans le génome humain. Le projet comporte trois axes.

• Validation expérimentale des origines prédites par puces à ADN et parpeignage moléculaire. • Études in situ (FISH) de la répartition et de la dynamique des origines dans lenoyau. • Analyse bioinformatique et modélisation physique des origines de réplication.Caractérisation des déterminants liés à ces origines : étude des liens entre lesorigines de réplication et la transcription, conservation des origines chez lesmammifères, modélisation de la formation et de la dynamique des nucléosomesautour des origines, recherche de motifs conservés.

Résumé

Origines de réplication chez les métazoaires :caractérisation et nouvelles approches

à l’échelle du génomeClaude Thermes

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le programmeblanc

Acronyme HUGOREPEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 450 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 180



Mots clés • Réplication ; origines ; chronologie• Séquençage massif ; peignage moléculaire• Organisation/évolution du génome humain• Nucléosomes ; positionnement/dynamique

THERMES Claude, Centre de génétique Moléculaire, Gif. CNRS - HYRIEN Olivier, Régulation de l'expression génétique CNRS/ENS-Paris - MONGELARD Fabien, LaboratoireJoliot-Curie, UFR 3010 CNRS/ENS-Lyon - LAVERY, Richard Institut de Biologie Physico-Chimique CNRS

Profile of replication timing along N-domains, determined by massive sequencing.

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Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLa réalisation des puces à ADN couvrant une fraction importante du génome humain posait un important problème de résolution. Le problème a été surmonté en remplaçantla technique de puces à ADN par celle du séquençage massif. Nous avons dû mettre au point une technique de peignage moléculaire avec un nombre élevé de sondes (30) et avec marquage en 4 couleurs.

Résultats majeursLes 1060 origines prédites encadrent des « N-domaines » de réplication dans lesquels le génome est organisé de façon remarquable (coordination entre réplication ettranscription). Cette structure en N domaines est conservée chez les mammifères.Par séquençage massif, nous avons validé une proportion importante de ces origines et déterminé la chronologie de réplication des N-domaines : les origines sont de plusen plus tardives en allant des bords vers le centre. Au bord des N-domaines, la chromatine présente une structure ouverte particulière, favorisée par la séquence. Nous proposons un modèle spatio-temporel de réplication : la réplication démarre à des « origines maîtresses » situées au bord des N-domaines ; lors de la propagation desfourches, des origines secondaires sont ensuite activées « en domino » des bords vers le centre.

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ces•Huvet, M, Nicolay, S., Touchon, M., Audit, B., d'Aubenton-Carafa, Y., Arneodo, A. &

Thermes, C. (2007) Human gene organization driven by the coordination of replication andtranscription. Gen. Res. 17, 1278-1285.

•Audit B, Nicolay S, Huvet M, Touchon M, d'Aubenton-Carafa Y, Thermes C & Arneodo A(2007) DNA replication timing data corroborate in silico human replication originpredictions. Phys. Rev. Lett. 99, 248102.

•Goldar, A., Labit, H., Marheineke, K. & Hyrien, O. (2008) A dynamic stochastic model forDNA replication initiation in early embryos. PLoS ONE, 3, e2919.

•Deremble C., Lavery R. & Zakrzewska K. (2008) Protein–DNA recognition: Breaking thecombinatorial barrier. Comput. Phys. Comm. 179, 112-119.

•Miele V, Vaillant C, d'Aubenton-Carafa Y, Thermes C & Grange T (2008) DNA physicalproperties determine nucleosome occupancy from yeast to fly. Nucl. Acids Res. 36, 3746-3756.

•Vaillant C, Audit B & Arneodo A (2007) Experiments confirm the influence of genome long-range correlations on nucleosome positioning. Phys. Rev. Lett. 99, 218103.

Invitées• Gennetec International Conference on "Gene Regulatory

Networks : Dynamics, Spatial Organization andInference", Turin, Italie.

•Second Congress Canade-France, Montréal, Canada.•Séminaire. Mount Sinai School of Medicine, NY, USA.

Colloques : 24


Résumé

Mécanismes d’Activation de Bax au cours de l’Apoptose

François Vallette

133

le programmeblanc

Acronyme MABAEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 340 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 161



Mots clés • Apoptose• Mitochondrie• Bax• Prostaglandine• RMN

VALLETTE François, Centre INSERM U892, Université de Nantes - MANON Stephen, UMR CNRS 5095,Université de Bordeaux 2 - BECHINGER Burkhard, UMR CNRS 7177, Université de Strasbourg

modélisation de l’interaction Bax PGE2 (Lalier et al. en préparation)

L’apoptose est un programme de mort cellulaire impliqué dans l’homéostasiecellulaire normale comme dans de nombreuses pathologies dont le cancer. Ce

programme est régulé par une famille de protéines présentant une homologie deséquence avec la protéine Bcl-2. Ces protéines qui sont soient anti-apoptotiques(Bcl-2, Bcl-Xl…) soient pro-apoptotiques (Bax, Bak), interagissent entre ellesBcl-2 inhibant l’apoptose declenchée par Bax et Bak. Cette interaction est elle-même régulée par une série de protéines dont l’homologie avec Bcl-2 est limitéeau seul domaine BH3. Ces protéines agissent soit en interagissant directementavec Bax soit en inhibant l’action anti-apoptotique des protéines comme Bcl-2 ouBcl-Xl. Au cours de l’induction de l’apoptose, Bax est transloquée du cytosol versla mitochondrie à la suite d’un changement de conformation par des mécanismes

mal connus. Une fois insérée dans la membrane externe, Bax entraîne lamodification de la perméabilité mitochondriale, libérant ainsi des protéinesapoptogéniques (Lalier et al., 2007). Plusieurs questions sont en suspend quantaux mécanismes moléculaires qui président l’activité de Bax au cours del’apoptose : la nature des agents activateurs de sa translocation, les partenairesimpliquées dans l’association et l’insertion de Bax dans la mitochondrie et latopologie membranaire des protéines de la famille Bcl-2. Le but de notre projetétait de déterminer la nature des acteurs et des domaines impliqués dans le rôlede Bax au cours de l’apoptose. Il s’agissait aussi de définir par RMN solide lastructure membranaire des protéines Bax et Bcl-2.

134

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLe verrou majeur a été d’obtenir pour l’analyse en RMN de quantités suffisantes de protéines natives complètes. Les raisons majeures à ce problème sont liées àl’hydrophobicité et la toxicité de ces protéines. Nous avons mis au point des méthodes permettant de purifier la protéine Bax native mais la limite majeure est maintenantla quantité de milieux de cultures nécessaire pour obtenir cette protéine en quantité suffisante pour l’analyse structurelle.

Résultats majeursAu cours de ce projet nous avons montré que 1) 2 prostaglandines, PGE2 et PGD2 sont respectivement activateur et inhibiteur de Bax, 2) Bax a pour récepteur mitochondrialTOM22, une protéine de la famille de l’appareil de translocation des protéines mitochondriales codées par le noyau, 3) par l’analyse RMN de Bcl-2, nous avons pu déterminerque BCL-2 possédait une topologie membranaire unique.Nous avons pu déterminer que l’effet des prostaglandines est additif mais non coopératif à celui des protéines à BH3 seules. L’effet du récepteur TOM22 pourrait être nonseulement de servir de récepteur mitochondrial de Bax mais aussi à accélérer son insertion membranaire.

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ces•Cartron PF, Bellot G, Oliver L, Grandier-Vazeille X, Manon S, Vallette FM. (2008) Bax inserts

into the mitochondrial outer membrane through different mechanisms. FEBS Lett. 582 :3045-3051

•Svetlana Nedelkina, Helen Ridlley, Isa Gokce, Thierry Magnin, Francois Vallette, FrancPattus, Jeremy Lakey, Burkhard Bechinger (2008) High-yield expression and purification ofsoluble form of anti-apoptotic proteins Bcl-xL and Bcl-2 as a TolAIII- fusion proteins. ProteinExpression and Purification 29, 1633-1644

•Aisenbrey, C., Sudheendra U.S., Ridley, H., Bertani, P., Marquette, A., Nedelkina, S., Lakey,J., & Bechinger, B.(2007) Helix orientations in membrane-associated Bcl-xL determined by15N solid-state NMR spectroscopy European Biophysics Journal 36, 451-460

•Arokium H, Ouerfelli H, Velours G, Camougrand N, Vallette FM, Manon S. (2007)Substitutions of potentially phosphorylatable serine residues of Bax reveal how they mayregulate its interaction with mitochondria. J Biol Chem. 282:35104-12.

•Lalier, L., Cartron, P.-F., Juin, P., Nedelkina, S., Manon, S., Bechinger, B., Vallette, F (2007)Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis. Apoptosis, 12: 887-896

•Lalier L, Cartron PF, Pedelaborde F, Olivier C, Loussouarn D, Martin SA, Meflah K, MenanteauJ, Vallette FM (2007) Increase in PGE2 biosynthesis induces a Bax dependent apoptosiscorrelated to patients’ survival in glioblastoma multiforme. Oncogene 26: 4999-5009.

Invitées•Bari International Symposium on Mitochondrial Physiology

and Pathology (dec. 2005) •3rd Apoptosis and mitochondria from normal to pathological

signalling. Versailles (Feb. 08)•6th International Meeting on Yeast Apoptosis (Leuwen,

Belgium, May 2008)•Gordon conference on antimicrobial peptides’, Italy, 24.

April - 2. May 2007 Spring Meeting of the AmericanChemical Society, New Orleans, LA, USA, 6.-10. April2008

Colloques : 12


Role of insulin-degrading enzyme in processingof MHC class I-presented antigens and in cellular

protein metabolism Peter Van Endert

135

le programmeblanc

Acronyme IDEPROCESSEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 210 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 18

Autres IT : Recrutés : 36Autres : 45


Mots clés • Protéase• Présentation antigénique• Insuline• Diabète insulinodépendant• MHC

VAN ENDERT Peter, Inserm U580 - Université Paris Descartes - FRANCESCONI Stefania, CNRS UMR2027 - Institut Curie

Cellule HeLa exprimant la pré-proinsuline colorée pour l’insuline (vert) et l’IDE (rouge)

Les peptides présentés par les molécules de classe I du complexe majeurd’histocompatibilité (CMH-I) sont issus de la dégradation de protéines par le

protéasome cytosolique. Cependant, la présentation de certains antigènes sembleimpliquer d’autres voies protéolytiques. Nous avons trouvé que la présentation dela proinsuline (PI), autoantigène principal dans le diabète insulinodépendant,implique l’insulin-degrading enzyme (IDE) une protéase cytosolique hautementconservée. Étant donné le rôle de la PI dans le diabète, nous avons examiné l’effetde l’invalidation de l’IDE sur le diabète spontané développé par les souris NOD.Les souris NOD IDE ko sont protégées du diabète et montrent des réponsesautoréactives T lymphocytaires atténuées vis-à-vis des cellules bêta du pancréas,

ainsi qu’une production diminuée de cytokines inflammatoires associées à lamaladie. Le mécanisme de cette protection, vraisemblablement lié à laprésentation de la PI dans le thymus et/ou par les cellules bêta, est sous étude.Des études parallèles ont démontré que l’IDE est également responsable del’apprêtement d’un antigène tumoral. Enfin, du fait de la conservation de l’IDE,nous avons examiné le rôle d’une protéine homologue à l’IDE (Irp1) dans lemétabolisme de la levure S. pombe. Ces études, qui sont actuellementpoursuivies, montrent que Irp1, ainsi que, après transfection dans la levure, IDEsont impliquées dans la réponse au stress du réticulum endoplasmique.

Résumé

136

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursDans ce projet, nous avons rencontré plusieurs points durs. D’une part, il semble que l’IDE peut contribue à la production d’épitopes de la PI mais peut aussi détruire certainsépitopes, ce qui rend l’analyse de son rôle complexe. En plus, nous avons observé que l’inhibition pharmacologique ou par siRNA de protéases peut inhiber l’expression dela PI, ajoutant encore à la complexité de l’approche expérimentale. Enfin, notre observation, faite dans le système de la levure, d’un lien entre l’IDE et la réponse au stressRE fait penser à des interprétations supplémentaires du rôle de l’IDE dans le diabète, étant donné que les cellules bêta sont particulièrement sensibles aux perturbations decette réponse.

Résultats majeurs1) La présentation mais aussi la production intracellulaire de la PI est modulée par l’IDE ainsi que par le protéasome.2) L’invalidation de l’IDE atténue la pathologie autoimmune chez la souris non obèse diabétique et protège du diabète insulino-dépendant3) L’IDE est requise pour la présentation d’un antigène tumoral4) L’IDE semble être impliquée dans la réponse au stress du RE5) Cette fonction est hautement conservée (de la levure aux mammifères)

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ces•Van Endert P. Role of tripeptidyl peptidase II in MHC class I antigen processing – the end of

controversies? Eur. J. Immunol. 38 (2008): 609-13•Huai J, Firat E, Nil A, Million D, Gaedicke S, Kanzler B, Freudenberg M, van Endert P,

Kohler G, Pahl H, Aichele P, Niedermann G. Activation of cellular death programs associatedwith immunosenescence-like phenotype in TPPII knockout mice. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 105 (2008): 5177-82

Invitées•Annual Meeting of the French Society for Immunology,

Toulouse, France, November 15 – 18, 2005

Colloques :


Notre équipe a récemment identifié la nature de l’hormone réglantl’homéostasie du fer dans l’organisme : il s’agit de l’hepcidine, codée par un

gène exprimé dans le foie sous le contrôle de l’inflammation, de l’hypoxie et desstocks en fer. Toutes les surcharges en fer connues à ce jour semblent impliquerune diminution de la sécrétion d’hepcidine. A l’inverse, l’hypersécrétiond’hepcidine semble jouer un rôle déterminant dans les anémies inflammatoires.Toutes ces maladies concernent des dizaines de millions de personnes dans lemonde. Si le rôle biologique de l’hepcidine commence à être compris, il n’en estpas de même des mécanismes d’action de l’hormone qui restent à préciser. Demême, si la structure du peptide (25 aa structurés par 4 ponts disulfures) semble

déterminante pour son activité, peu de données existent sur la nature réelle dupeptide. Notre objectif est de définir la structure du peptide biologiquement actif,de produire des molécules à visées thérapeutiques, de type agonistes etantagonistes de l’hepcidine (hepcidine sauvage, mutante, pro-hepcidine,hepcidine cyclisée …), et de développer des anticorps (AC) contre l’hepcidinehumaine à des fins thérapeutiques et diagnostiques. Nous recherchons à validerun modèle de neutralisation de l’hepcidine circulante par vaccination avec unehepcidine mutante. Enfin, sous souhaitons mieux comprendre les mécanismesmoléculaires de régulation de la production de l’hormone et son mode d’actionau niveau cellulaire.

Résumé

Nature et mode d’action de l’hepcidine,une nouvelle hormone impliquée dans le

métabolisme du fer et ses pathologies Sophie Vaulont

137

le programmeblanc

Acronyme HEPCIFEREdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 300 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 57,2



Mots clés • Métabolisme du fer• Hepcidine• Maladies métaboliques• Anticorps

VAULONT Sophie, Institut Cochin, Inserm. Unité 567, UMR 8104/CNRS - SARI Marie-Agnès,Laboratoire de Chimie et biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques CNRS UMR 8601 - Université Paris 5-ABINA Amine NOKAD Entreprise

Révélation par immunomarquage de la furine à la membrane des macrophages (en vert):cette enzyme va assurer le clivage du précurseur circulant, la pro-hepcidine, en hepcidineactive. Le noyau des cellules est marqué en bleu.

138

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursPour la stratégie d’invalidation de l’hepcidine par vaccination adénovirale chez la souris et le rat, l’apparition d’un phénotype de neutralisation avec les versions mutantesd’hepcidine (rendus antigéniques grâce aux outils bioinformatique développé par NOKAD) contraste avec les faibles taux d’AC détectés chez les animaux vaccinés. L’hypothèsed’un complexe entre l’hepcidine circulante et les AC générés (de ce fait indétectables en ELISA) a récemment été validée dans un système modèle ou, après acidification dessera et séparation par colonne d’exclusion de taille, les AC neutralisants, indétectables au départ, ont été révélés à des titres élevés chez les animaux testés.

Résultats majeursNous avons pu produire différentes formes d’hepcidine synthétiques et recombinantes biologiquement actives. Nous avons également généré, en collaboration avec HuguesGascan, un anticorps monoclonal neutralisant de très bonne affinité pour l’hepcidine. Ces outils vont permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques pourtraiter les surcharges en fer et les anémies inflammatoires, respectivement et l’AC mettre au point un dosage ELISA pour mesurer l’hepcidine sérique. Les modèles murinsd’étude sont en cours de production. Dans un second volet, la combinaison de différentes approches en culture et in vivo a permis de mieux comprendre les voies de régulationde la production de l’hormone. Enfin de nouveaux acteurs impliqués dans le métabolisme du fer ont été caractérisés.

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ces•Pro-hepcidin, unless maturated by a furin-dependent process, is unable to degrade the iron

exporter ferroportin. Gagliardo B, Kubat N, Faye A, Jaouen M, Durel B, Deschemin J-C,Canonne-Hergaux F, Sari M-A and Vaulont S. Journal of hepatology, 2009 sous presse,doi:10.1016/j.hep.2008.09.018

•Production of biologically active forms of recombinant hepcidin, the iron-regulatoryhormone. Gagliardo B, Faye A, Jaouen M, Deschemin JC, Canonne-Hergaux F, Vaulont S,Sari MA. FEBS J. 2008 275(15):3793-803

•Haptoglobin is degraded by iron in C57BL/6 mice: a possible link with endoplasmic reticulumstress. Faye A, Ramey G, Foretz M, Vaulont S. Blood Cells Mol Dis. 2007 39(3):229-37

•Iron overload in Hepc1(-/-) mice is not impairing glucose homeostasis. Ramey G, Faye A,Durel B, Viollet B, Vaulont S. FEBS Lett. 2007 581(5):1053-7.

•Chronic hepcidin induction causes hyposideremia and alters the pattern of cellular ironaccumulation in hemochromatotic mice. Viatte L, Nicolas G, Lou DQ, Bennoun M, Lesbordes-Brion JC, Canonne-Hergaux F, Schönig K, Bujard H, Kahn A, Andrews NC, Vaulont S. Blood.2006 107(7):2952-8.

Brevets : European patent application in October 2007 assigned to INSERM (EP 07 291 196.9)

Invitées•9es rencontre Franco-Américaines en endocrinologie,

Hopital de Bobigny, Février 2006•9th European Congress of Endocrinology, Budapest,

Hungary, April 2007•American Association for the Study of Liver Disease,

Atlanta, USA, September 2007•International conference “Metals and Genetics”, Paris,

Juillet 2008•Ehrlich II, 2nd world conference on Magic Bullets,

Nuremberg, October 2008

Colloques : 4


Nous nous intéressons à la formation des gamètes femelles chez la souris. Noussouhaitons comprendre les mécanismes sous-tendant l’asymétrie des

divisions méiotiques: expulsion de petits globules polaires dépourvus de réserves.Ces divisions sont le résultat d’une migration du fuseau de division au cortex del’ovocyte impliquant les microfilaments d’actine. La Formine 2, qui régule lanucléation de filaments droits d’actine, semble impliquée dans la migration dufuseau au cortex. Nous souhaitions vérifier cette hypothèse, déterminer le rôle dela Formine 2 et identifier ses éventuels partenaires. D’autre part, nous souhaitons

identifier les facteurs participant au contrôle de l’arrêt des ovocytes en métaphaseII (arrêt lié à une activité CSF, CytoStatic Factor). Durant l’arrêt CSF, le fuseau demétaphase II reste stable pendant plusieurs heures en position sous-corticale avecdes chromosomes alignés sur la plaque métaphasique. Nous voulions caractériserla dynamique des microtubules au sein du fuseau de MII afin d’appréhender lemode d’action de deux substrats physiologiques (MISS et DOC1R) de la MAPKdans la voie de stabilisation du fuseau de métaphase II lors de l’arrêt CSF.

Résumé

Contrôle des divisions asymétriques et de l’arrêt CSF lors de la maturation méiotique

des ovocytes de souris Marie-Hélène Verlhac

139

le programmeblanc

Acronyme MéioseEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 240 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 40



Mots clés • Biologie Cellulaire• Biologie du Développement • Méiose • Ovocyte • Souris

UMR7622, CNRS/Université Pierre et Marie Curie

Accumulation de p-TACC3 aux pôles des fuseaux méiotiques acentriolaires (p-TACC3 enrouge, microtubules en vert, chromosomes en bleu)

140

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursUne grande partie du projet (suivi de la dynamique du fuseau méiotique in vivo) reposait sur l’acquisition d’un système de spining disk (imagerie confocale in vivo) qui n’apu être acquis qu’en fin de financement (financement fractionné). Il est aujourd’hui opérationnel... en fin de projet !

Résultats majeursNous avons montré que la Formine 2, un nucléateur de filaments droits d’actine, était nécessaire à la migration du fuseau au cortex. A l'aide d'une sonde spécifique desmicrofilaments d'actine, nous avons détecté in vivo le réseau de microfilaments d'actine qui assure la migration des chromosomes au cortex ovocytaire. Par ailleurs, en utilisantune sonde actine-YFP et la méthode de FRAP nous avons montré que ce réseau d'actine, nucléé par la Formine 2 était très dynamique et que des changements couplés dedynamique et d'organisation assurent le succès des divisions méiotiques asymétriques.Nous avons montré qu’en MII, il est indispensable de maintenir une accumulation locale de RanGTP au niveau des chromosomes puisqu’en cas contraire, l’organisation desfuseaux s’en trouve perturbée. Chez les vertébrés, la voie Ran est compensée en méiose I par l’existence d’autres voies permettant la formation de fuseaux fonctionnels. Afinde comprendre cette différence de sensibilité aux variations du gradient de RanGTP entre la formation des fuseaux en méiose I et II, nous avons étudié une cible de Ran,TPX2. De manière surprenante, TPX2 est indétectable dans les ovocytes immatures et s'accumule après reprise de la méiose. En utilisant une approche RNAi, nous avonsmontré que TPX2 est essentielle à l'assemblage des fuseaux méiotiques d'ovocytes de souris en permettant l'activation locale de TACC3 aux pôles acentriolaires des fuseauxméiotiques, assurant ainsi la cohésion des pôles. Nous montrons que, dans l'ovocyte de souris, c'est la régulation de certaines cibles de RanGTP, comme TPX2, qui estimportante plutôt que la régulation du gradient de RanGTP.

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ces•Brunet S., Dumont J., Lee K. W., Kinoshita K., Hikal P., Gruss O., Maro B. and Verlhac.M.-H.

2008. Meiotic regulation of TPX2 protein levels governs cell cycle progression in mouseoocytes. PLos One, 3: e3338.

•Azoury J., Lee K.W., Georget V., Rassinier P., Leader B. and Verlhac M.-H. 2008. Spindlepositioning in mouse oocytes relies on a dynamic meshwork of actin filaments. CurrentBiology, 18: 1514-1519

•Dumont J., Petri S., Pellegrin F., Terret M.-E., Bohnsack M.T. , Rassinier P., Georget V., KalabP., Gruss O. J. and Verlhac M.-H. 2007. A centriole and RanGTP independent spindle assemblypathway in meiosis I of vertebrate oocytes. The Journal of Cell Biology, 176: 295-305

•Dumont J., Million K., Sunderland K., Rassinier P., Lim H., Leader B. and Verlhac M.-H.2007. Formin-2 is required for spindle migration and for the late steps of cytokinesis inmouse oocytes. Dev. Biol , 301: 254-265

•M.-H. Verlhac and J. Dumont. 2008. Interactions between chromosomes, microfilaments andmicrotubules revealed by the study of small GTPases in a big cell, the vertebrate oocyte.Molecular and Cellular Endocrinology, 282 :12-17.

• Azoury J., Verlhac M.-H. and J. Dumont. 2008. Actin filaments, key players in the control ofasymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell, in press.

Invitées•Congrés « VIème Colloque "Petites Protéines G" organisé

par la SBCF, Mouans-Sartoux, Octobre 2008•Congrés « Cell Cycle and Cancer » organisé par la SBCF,

Toulouse, Mars 2008•« 8th European Meiosis Meeting in Japan”, Kanagawa,

Japon, Sept 2007•« Conference on Reproductive and Developmental

Biology”, Prague, République Tchèque, Juin 2007•« XIII congrès international de la Société de Biologie

Cellulaire Brésilienne », Buzios, Brésil, Juil. 2006

Colloques :


Vesicular trafficking and membrane fusion is the basis of a large range ofcellular activities. SNARE proteins play fundamental roles in the molecular

machinery that drive two membranes in close proximity. However the fusionprocess itself is still poorly understood and many questions concerning theunderlying molecular mechanisms, their specificity and kinetics remainunanswered. Our hypothesis is that regulation of the lipid composition at fusionsites by phospholipase D (PLD) critically regulates fusogenic events. PLDhydrolyzes phosphatidylcholine into choline and phosphatidic acid (PA). PA hasbeen proposed to serve as a protein attachment/activating site or to promote

negative membrane curvature and membrane fusion. Our goal is to establishwhether PA plays a direct role in membrane fusion by studying its implications intwo classical cellular processes involving fusion steps, namely regulated exocytosisand phagocytosis. Our hypothesis is based on the observations that PLD activityfacilitates exocytosis and phagocytosis whereas extinction of endogenous PLDstrongly blocks these cellular functions. Moreover, PLD is under the control ofseveral kinases and GTPases and is therefore an ideal candidate to integratesignaling pathways to the level of membrane fusion.

Résumé

Phospholipase D-derived lipids in biologicalmembrane fusion

Nicolas Vitale

141

le programmeblanc

Acronyme PA in FusionEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 300 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 90



Mots clés • Biologie cellulaire• Hormone• Neurotransmetteur• Exocytose• Lipide

CNRS UPR-2356 Laboratoire neurotransmission et sécrétion neuroendocrine. Devenu CNRS UMR-7168 Institut des neurosciences cellulaires et intégratives.

Phosphatidic acid synthesis at the vesicle fusion site in chromaffin cells revealed by electronicmicroscopy and immunogold labelling.

142

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursWe had to set up siRNA-based knockdown of PLD isoforms in various cell types and species.Visualization of PA synthesis in living cells needed to generate specific molecular tools. These tools were also helpful to characterize the sub-cellular localization of PA at theexocytotic sites in neuroendocrine cells.

Résultats majeursUsing neuronal and endocrine cell models to study regulated exocytosis and macrophages to study phagocytosis, we have shown that phosphatidic acid (PA), a fusogeniclipid, is actually produced by phospholipase D (PLD) at fusion sites. A close correlation between the levels of PLD-derived PA and membrane fusion (exocytosis andphagocytosis) was found. Reconstitution experiments in PLD1-depleted cells suggested that PA mainly favors changes in the topology of membranes. We have also begun tounravel the targeting mechanisms of PLD to specific sub-cellular fusion sites, and the identification of molecular partners/regulators required in the course of fusion.

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ces•Corrotte M., Chasserot-Golaz S. , Hunang P. , Du G., Ktistakis N.T.., Frohman M.A., Bader

M-F., Vitale N., & Grant N. Dynamics and function of phospholipase D and phosphatidicacid during phagocytosis. Traffic, 2006, 7, 365-377.

•Zeniou M. Déliot N., Chasserot-Golaz S., Premont R., Bader M-F. & Vitale N. Regulation ofneuroendocrine exocytosis by the ARF6 GTPase-activating protein GIT1. J. Biol. Chem, 2006,281, 7919-7926.

•Gambino F., Pavlowsky A., Begle A., Dupont J-L., Bahi N, Courjaret R., Gardette R.,Hadjkacem H., Poulain B., Chelly J., Vitale N. & Humeau Y. Interaction of NCS-1 withIL1RAPL, a protein involved in cognitive functions, inhibits N-type Ca2+-channel activityand neurite elongation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104, 9063-9068.

•Zeniou-Meyer M. Zabari N., Ashery U., Chasserot-Golaz S., Haeberlé A-M., Bailly Y.,Nakanishi H., Neiman A-M., Du G., Frohman M A., Bader M-F. & Vitale N. PLD1 productionof phosphatidic acid at the plasma membrane promotes exocytosis of large dense-coregranule at a late stage. J. Biol. Chem., 2007, 282, 21746-21757.

•Lam AD, Tryoen-Toth P, Tsai B, Vitale N, Stuenkel EL. SNARE-catalyzed Fusion Events AreRegulated by Syntaxin1A Lipid Interactions. Mol Biol Cell., 2008, 19, 485-497.

•Zeniou-Meyer M. Liu Y., Béglé A., Olanish M., Hanauer A., Becherer U., Rettig J., Bader M-F. & Vitale N. The Coffin-Lowry syndrome-associated protein RSK2 is implicated in calcium-regulated exocytosis through the regulation of PLD1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105,8434-8439

Invitées•" American Society for Biochemistry and Molecular

Biology annual meeting, San Diego (USA), avril 2006.•“Congrès Synapse, Paris, 29-31 mai 2006.•2e Colloque Méditerranéen des Neurosciences.

Marrakech, Maroc. 13-15 décembre 2006.•FASEB meeting on ARF family GTPases, Il Ciocco, Italie,

22-27 juin 2007.•The 14th International Symposium on Chromaffin Cell

Biology, Sestri Levante, Italie, 11-15 octobre 2007.

Colloques : 25


Embryogenesis in chordates leads to the generation of a tadpole-likeorganisation, which is characterised by a central notochord and a dorsal

hollow neural tube. Comparison of the pre-gastrula fate maps of differentchordates reveals a high degree of topological similarity. This similarity ismaintained through gastrulation, when embryonic territories are extensivelyrearranged and the basic tissue organisation of the chordate body plan isestablished. Remarkably, high conservation at the morphological level does notnecessarily reflect an equally strong conservation of the underlying molecularmechanisms. Despite this, the tadpole-like body plan appears to be an immenselyrobust outcome of chordate embryogenesis. We study ascidian embryogenesis as

a chordate model, which, due to its overall simplicity, offers an unprecedentedopportunity to dissect the entire developmental processes that generate the basicchordate body plan. We focus on two chordate specific structures, notochord andneural tube. In ascidian embryos, the anterior notochord cells and caudal neuralplate cells originate from common precursors located in the dorsal marginal zoneof the embryo. The aim of this ANR project was to reveal the molecularmechanisms controlling the birth of the notochord and neural precursors via anasymmetric cell division and subsequent patterning of the resultant caudal neurallineages along the medial-lateral and anterior-posterior axes.

Résumé

Generation of cellular diversity during chordate embryogenesis

Hitoyoshi Yasuo

143

le programmeblanc

Acronyme Cell fateEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 190 000 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 72



Mots clés • Biologie du développement• Destin cellulaire• Chordés• Qscidies

UMR 7009 CNRS - Villefranche-sur-MerTwo successive rounds of asymmetric cell divisions resulting in production of one notochord,one neural and two endoderm precursors

144

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursThe mitotic spindle of the notochord/neural mother cell exhibits a 90° rotation to align along the anterior-posterior axis of embryos. In order to visualise the dynamics ofmicrotubules, we used an ensconsin-3xEGFP probe which was injected as RNA into eggs of Ciona intestinalis. However, it turned out that translational activity in Ciona eggsand early embryos is too low to produce a sufficient amount of the fluorescent probe to visualise the spindle rotation. The problem is now overcome by using another ascidianspecies, Phallusia mamillata, which possesses a high translational activity in eggs. Using this ascidian species, we are observing the dynamics of microtubules and actinfilaments during the spindle rotation of the noto/neural mother cell.

Résultats majeursOur major achievements in this ANR project include a discovery of a novel molecular mechanism that controls an asymmetric cell division generating one notochord and onecaudal neural precursors and a detailed description of the signalling events leading to the patterning of the caudal neural plate. We have revealed that ephrin signals, actingas a directional signal, functionally polarise notochord/neural mother cells, which results in attenuation of FGF-mediated activation of ERK1/2 specifically in neural-fateddaughter cells. As to the neural plate patterning, we have found that sequential and combinatorial inputs of Nodal, Notch/Delta and FGF/ERK signals define each of the totaleight cell identities in the caudal neural plate.

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ces•Hudson C and Yasuo H. (2006). A signalling relay involving Nodal and Delta ligands acts

during secondary notochord induction in Ciona embryos. Development, 133, 2855-2864.•Yasuo H. and Hudson C. (2007). FGF8/17/18 functions together with FGF9/16/20 during

formation of the notochord in Ciona embryos. Dev Biol. 302, 92-103.•Meedel T, Chang P and Yasuo H. (2007). Muscle development in Ciona intestinalis requires

the b-HLH myogenic regulatory factor gene Ci-MRF. Dev Biol. 302, 333-344. •Picco V, Hudson C and Yasuo H. (2007). Ephrin-Eph signalling drives the asymmetric

division of notochord/neural precursors in Ciona embryos. Development 134:1491-7. *Citedin ‘Highlight’ of Development and in ‘Faculty of 1000’ (obtained 6.6 point).

•Hudson C, Lotito S and Yasuo H. (2007). Sequential and combinatorial inputs from Nodal,Delta2/Notch and FGF/MEK/ERK signalling pathways establish a grid like organisation ofdistinct cell identities in the ascidian neural plate. Development 134, 3527-3537. *Cited in‘Highlight’ of Development.

Invitées•National Institute for Medical Research (NIMR), Mill

Hill, Angleterre, 8 mai 2007.•Institute of Toxicology and Genetics, Karlsruhe,

Allemagne, 23 juin 2007.•Sars International Centre for Marine Molecular Biology,

Bergen Norvège, 18 juin 2007.•Société Française de Biologie du Développement

(SFBD), Dourdan, France, 31 août – 3 septembre2007.

Colloques : 8


Résumé

Rôle des microdomaines lipidiques (ou rafts)dans les mécanismes d’adressage apical des

protéines glypiées (protéines GPI) dans lescellules épithéliales

Chiara Zurzolo

145

le programmeblanc

Acronyme Tri apicalEdition 2005Durée du projet 36 moisFinancement 230 769 €Personnels (H-m) C + EC + IR : 93,6



Mots clés • Biologie cellulaire• Imagerie• Rafts• Protéine glypiées• Tri apical

Institut Pasteur - Unité Postulante « Trafic Membranaire et Pathogénèse »Cellules MDCK polarisées exprimant une protéine associée aux rafts GFP-FR au niveau dela membrane plasmique apicale A ou au niveau de l’appareil de Golgi B

Les rafts sont des microdomaines lipidiques membranaires enrichis englycosphingolipides (GSL) et en cholestérol. Ces domaines rafts sont impliqués

dans de nombreux processus cellulaires comme le transport des protéines et deslipides vers la membrane apicale. On trouve associé à ces domaines rafts desprotéines glypiées, transmembranaires et acétylées. La présence de protéinesglypiées au sein des domaines rafts a été mise en évidence par des techniquesbiochimiques. La taille putative de ces domaines membranaires rafts étantinférieure à la résolution optique classique, il nous faut utiliser des techniquesd’imagerie spécifiques (Time laps, FRET et FRAP) afin de déterminer comment cesprotéines glypiées sont associées aux rafts et le rôle de ces domaines dansl’adressage apical des protéines. En particulier on doit définir quel élément

détermine l’association des protéines glypiées aux rafts ? Existe-t-il différentstypes de rafts pour différentes protéines glypiées ? Existe-t-il un récepteurresponsable du tri des protéines vers différentes vésicules de transport à la sortiedu TGN ? Dans ce projet, nous avons utilisé des approches microscopiquesavancées pour analyser le rôle des rafts dans le tri et le trafic des protéines GPI.En parallèle, une approche protéomique et de spectrométrie de masse ont étéutilisées pour analyser la composition en lipides et en protéines de cesmicrodomaines. Cette approche multidisciplinaire a permis de clarifier le rôle des“ rafts ”, du cholestérol, de l’ancre GPI et de l’ectodomaine des proteines dans letri apical des protéines glypiées.

146

Verrous scientifiques et technologiques, ou points dursLes verrous scientifiques que nous avons dû surmonter étaient l’adaptation de nos modèles cellulaires exprimant nos protéines de fusion avec les exigences des différentssystèmes d’imagerie. On a mis au point un système de culture cellulaire ou nos cellules se polarisent en étant « upside down » permettant d’imager le pôle apical dansconditions optimales dans des cellules vivantes. De plus nous avons développé des techniques de FRAP et FRET au niveau des membranes plasmiques apicales et basolatéralesainsi qu’au niveau de l’appareil de Golgi dans des cellules épithéliales polarisées.

Résultats majeurs1) Les protéines glypiées sont directement adressées à la membrane plasmique apicale des cellules épithéliales2) Les domaines rafts apicaux et basolatéraux sont de même composition lipidique avec plus de cholestérol au niveau des « rafts » basolatéral en comparaison avec les « rafts » apical3) Les protéines glypiées pour être triées à la membrane apicale doivent former des complexes de haut poids moléculaires de façon concomitante à leur association auxdomaines rafts ou DRMs (domaines résistant aux détergents) au sein de l’appareil de Golgi4) La N et la O-glycosylation ne sont pas impliquées de façon directe dans l’adressage apical des protéines glypiées5) Les domaines rafts existent à la membrane apicale et basolatérale des cellules épithéliales ainsi qu’au niveau de l’appareil de Golgi. Les protéines apicales et basolatéralesdans l’appareil de Golgi sont déjà ségrégées dans deux compartiments distincts.6) Différents signaux d’attachements des ancres GPI fusionnés à la GFP suffisent à modifier l’adressage des protéines de fusion. De plus, le cholestérol joue un rôleprépondérant dans le tri apical des protéines.

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ces•Paladino S, Lebreton S, Tivodar S, Campana V, Tempre R, Zurzolo C. Different GPI-attachment signals

modulate GPI-anchored proteins oligomerization and apical sorting. Journal of Cell Science, in press•Lebreton S, Paladino S, Zurzolo C. Selective roles for cholesterol and actin in

compartmentalisation of different proteins in golgi and plasma membrane of polarized cells.J Biol Chem. 2008 Oct 24;283(43):29545-53

•Catino MA, Paladino S, Tivodar S, Pocard T, Zurzolo C. N- and O- glycans are not directly involved inthe oligomerization and apical sorting of GPI proteins. Traffic. 2008 Sep 6. [Epub ahead of print]

•Pocard T, Le Bivic A, Galli T, Zurzolo C. Distinct v-SNAREs regulate direct and indirect apicaldelivery in polarized epithelial cells. J Cell Sci. 2007 Sep 15;120(Pt 18):3309-20.

•Paladino S, Sarnataro D, Tivodar S, Zurzolo C. Oligomerization is a specific requirement forapical sorting of glycosyl-phosphatidylinositol-anchored proteins but not for non-raft-associated apical proteins. Traffic. 2007 Mar;8(3):251-8.

•Tivodar S, Paladino S, Pillich R, Prinetti A, Chigorno V, van Meer G, Sonnino S, Zurzolo C.Analysis of detergent-resistant membranes associated with apical and basolateral GPI-anchored proteins in polarized epithelial cells. FEBS Lett. 2006 Oct 16;580(24):5705-12.

Invitées•EMBO/FEBS workshop on endocytic systems Villars-sur-

Ollon, Switzerland, September 18-23, 2007 •KEYSTONE Symposia,, Big Sky (Montana, USA),

January 12, 2008 – January 17, 2008•GORDON CONFERENCE: Colby Sawyer College , USA,

July 13-18, 2008•ELSO Meeting, Nice August 30-September 2, 2008 •EIMID meeting, Arc et Senans, 1st-4th October 2008

Colloques : 10


U S A Runité support de l’ANR

CNRS USAR3 rue Michel Ange

75794 Paris CEDEX 16

le progr bammelanc - centre national de la recherche ... and dynamics of the e. coli ... origines de...

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