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Submitted on 1 Jan 2001

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La biosynthèse d’exopolysaccharide par des souches depediococcus damnosus isolées du vin : mise au point

d’outils moléculaires de détectionÉmilie Walling, Emmanuel Gindreau, Aline Lonvaud-Funel

To cite this version:Émilie Walling, Emmanuel Gindreau, Aline Lonvaud-Funel. La biosynthèse d’exopolysaccharide pardes souches de pediococcus damnosus isolées du vin : mise au point d’outils moléculaires de détection.Le Lait, INRA Editions, 2001, 81 (1-2), pp.289-300. <10.1051/lait:2001132>. <hal-00895481>

Évolution, biodiversité, taxonomie

La biosynthèse d’exopolysaccharide par des souchesde Pediococcus damnosusisolées du vin :

mise au point d’outils moléculaires de détection

Émilie WALLING , Emmanuel GINDREAU, Aline LONVAUD-FUNEL*

Faculté d’Œnologie, Laboratoire de Biotechnologie et Microbiologie Appliquée,Unité associée INRA-Université Victor Ségalen Bordeaux 2,

351 cours de la Libération, 33405 Talence, France

Abstract — Exopolysaccharide biosynthesis by Pediococcus damnosusstrains isolated fromwine: elaboration of molecular detection tools.Lactic acid bacteria synthesize exopolysaccha-rides (EPS). These carbohydrate polymers excreted or produced at the cell membrane can drasti-cally increase viscosity of the medium. In dairy industry, this property is used to improve the textureof yoghurts for example. Other microbial EPS are currently under study for their possible use infood processes or in medicine. However, cider, beer and wine are spoiled by the presence of EPS. In“ropy wines”, particular strains of Pediococcus damnosusare responsible for the production of aβ-D-glucan. For P. damnosusstrains isolated from ropy wines, glucan production is linked to a plas-mid of approximately 5 500 bp. The ropy phenotype disappears when the plasmid is lost. This plas-mid is currently being sequenced and several open reading frames (ORF) have already been revealed.The amino acid sequence of the first ORF has high identity scores with a plasmid mobilization pro-tein of Lactobacillus casei. The second ORF contains several motifs characterized on a glucosyl-transferase from Streptococcus pneumoniaetype 37 which produces the same polysaccharide as thePediococcusstrains isolated from ropy wines. From the partial sequence of the plasmid, moleculartools for detection of spoiling strains in wine were obtained. They involve PCR, Southern blot andcolony hybridization. A new probe called “GT probe” has been isolated, making it possible to dif-ferentiate ropy from non-ropy strains. This probe could be used directly in colony hybridization.Two oligonucleotides (PF5 and PF6) were also selected for PCR experiments. A plasmid fragmentfrom the ropy strains was specifically amplified. PCR was performed using whole cells from labo-ratory cultures and preliminary results obtained with a protocol for direct PCR on wine samples arepresented. Wine quality depends on the availability of such detection tools. In fact, wines generallybecome ropy during storage in tanks, barrels and most of the time in bottles. In the latter case, no fur-ther treatment is possible. Therefore, detection of ropy strains before bottling can help the wine-maker predict the risks of spoilage with ropy P. damnosusand treat the wine in time.

exopolysaccharide (EPS) / Pediococcus damnosus/ plasmid / detection / wine

Lait 81 (2001) 289–300 289© INRA, EDP Sciences, 2001

* Correspondance et tirés-à-partTél. : (33) 5 56 84 64 66 ; fax : (33) 5 56 84 64 68 ; e-mail : aline.lonvaud@oenologie.u-bordeaux2.fr

É. Walling et al.

1. INTRODUCTION

Il arrive que le vin devienne visqueux,pendant son stockage en cuves, en barriquesou en bouteilles. Cette altération bactériennedes vins, appelée « maladie de la graisse »ou « maladie des vins filants », a été décritedès 1866 par Pasteur [19]. Ce phénomène,également observé dans la bière [2] et lecidre [28], provient d’une production impor-tante d’exopolysaccharides (EPS) dans lemilieu par différentes espèces de bactérieslactiques. Les EPS augmentent excessive-ment la viscosité des boissons, ce qui lesrend impropres à la commercialisation.

Les EPS sont libérés dans le milieu etforment parfois un réseau serré autour descellules (capsules) ou libre (mucilage, bio-film). Leur présence assure de nombreusesfonctions : virulence des bactéries patho-gènes, interactions plantes-microbes, pro-tection contre la dessiccation ou les attaquesphagiques et les composés toxiques [8].D’un point de vue technologique, les EPSmicrobiens sont exploités dans de nombreuxdomaines et sont de plus en plus convoités

pour leurs propriétés physiques particulières[20, 22]. Dans le cas de l’industrie laitière,la capacité des bactéries lactiques à produiredes EPS influence directement la texturedes produits laitiers fermentés [8]. Lessouches de bactéries lactiques utilisées lorsdes fermentations sont donc en partie sélec-tionnées en fonction de cette propriété [3].

Certaines bactéries lactiques produisentdes hétéropolysaccharides. Les systèmesenzymatiques impliqués sont complexes.Les gènes déterminant les enzymes partici-pant à la synthèse d’EPS et de polysaccha-rides capsulaires sont organisés en un opé-ron eps, cps oucap[23]. Une région centraleoccupée par des gènes de glycosyltransfé-rases est encadrée par les gènes nécessairesà la régulation, la polymérisation, et l’exportdu polysaccharide [5, 14]. Cet opéron peutêtre soit chromosomique, soit porté par unplasmide. Ainsi, l’opéron epsde Lactococ-cus lactisNIZO B40 [25] est localisé surun plasmide de 40 kb comprenant égale-ment quatre réplicons fonctionnels, desgènes de mobilisation et trois origines detransfert [26]. L’opéron epsest composé de

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Résumé — La production d’exopolysaccharides (EPS) par les bactéries lactiques est un phénomènefavorable à de nombreux processus industriels alimentaires. Au contraire, dans le cidre, la bière oule vin, la synthèse d’EPS provoque une altération grave. Des souches de Pediococcus damnosussont capables de synthétiser un β-D-glucane dans le vin, à l’origine de la « maladie de la graisse » oudes « vins filants ». Chez cette bactérie, la production d’EPS est liée à la présence d’un plasmide de5 500 pb environ. Le séquençage de ce plasmide est en cours. L’un des cadres ouverts de lecture iden-tifié pourrait coder une protéine dont la séquence contient des motifs conservés de glycosyltransfé-rases. Elle est aussi très similaire à la séquence de la glucosyltransférase de Streptococcus pneumo-niaetype 37, produisant le même glucane que celui des souches de P. damnosusisolées du vin. Laséquence du plasmide a permis l’élaboration d’outils pour la détection des souches d’altération desvins. Une sonde, ciblant le gène potentiel de la glucosyltransférase permet de différencier les souchesde P. damnosusproductrices de glucane des souches n’en produisant pas. D’autre part, deux amorcesnucléotidiques qui amplifient spécifiquement une région du plasmide porté par les souches produc-trices d’EPS ont été sélectionnées. Elles sont utilisables pour des réactions de PCR réalisées directementsur la microflore présente dans le vin. La maladie de la graisse se déclare le plus souvent lors de laconservation des vins en bouteille, alors qu’il est trop tard pour envisager tout traitement. Les outilsde détection utilisés sur des échantillons de vins en cuve permettront de sensibiliser le vinificateur surles risques que présente son vin quant à l’apparition de souches de P. damnosusd’altération et de pré-voir les traitements en conséquence.

exopolysaccharide(EPS) / Pediococcus damnosus/ plasmide/ détection/ vin

Exopolysaccharide de Pediococcus damnosus

Les souches de P. damnosusproductricesd’EPS isolées du vin possèdent un ou plu-sieurs plasmides. Elles ont toutes en communun plasmide d’environ 5500 pb nommé pF(Fig. 1a). Le repiquage successif des souches

14 gènes regroupés à la suite d’une séquenced’insertion iso-IS982 [24]. Chez Strepto-coccus salivariusssp. thermophilusNCBF2393 [11] ou Streptococcus pneumo-niae [10], les opérons eps et cap (ou cps)respectivement sont localisés sur le chro-mosome et sont organisés de manière simi-laire [8]. À l’inverse, les gènes d’enzymesresponsables de la formation d’homopoly-saccharides (dextranes, glucanes, fructanes)ne font pas partie d’opérons. Ces enzymessont extracellulaires ou placées sur la faceexterne de la membrane cytoplasmique. Lasynthèse de dextrane par la dextrane sucrasede Leuconostoc mesenteroides a été la plusamplement décrite. Elle catalyse, à partir desaccharose, la polymérisation de moléculesde glucose en α (1→6) principalement, aveclibération de fructose.

Le polysaccharide produit par P. dam-nosusdans le vin est un homopolymère. Ils’agit de β-glucane composé d’une chaîneprincipale liée en β-(1→3) avec des rami-fications en β-(1→2) [15]. Des souches deP. damnosusisolées de cidre produisent éga-lement ce type glucane [9] ainsi qu’unesouche de Streptococcus pneumoniae pro-duisant le polysaccharide capsulaire de type37 [18].

Les seules données génétiques dispo-nibles à ce jour sur la biosynthèse de ce typede glucane concernent Streptococcus pneu-moniae. L’opéron cap du sérotype 37 arécemment été décrit [18], mais il présentela particularité de ne pas être fonctionnel.En revanche, un seul gène (tts), localisé endehors de cette région « silencieuse », déter-mine la synthèse du polysaccharide detype 37. Lorsque ce gène est utilisé pourtransformer des souches de Streptococcuspneumoniaesans capsule, celles ci devien-nent capables de synthétiser la capsule detype 37 [18]. Il est possible que l’identitéstructurale des glucanes produits par Strep-tococcuset Pediococcusse reflète au niveaugénétique. Ainsi, un gène isolé pourraitdéclencher la production de polysaccharideschez les pédiocoques.

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Figure 1. (a) Électrophorèse en gel d’agarosed’extractions d’ADN génomique de souches deP. damnosusproductrices d’EPS et non produc-trices. Piste 1 : Marqueur de poids moléculaireλHindIII (Promega). ADN génomique dessouches « filantes » IŒB 8415 (piste 2), IŒB8514 (piste 3), IŒB 8801 (piste 4), IŒB 9820(piste 5) et de quatre souches « non-filantes » :IŒB 9820.1 (V1, piste 6), IŒB Ja2 (piste 7),ATCC 25248 (piste 8), IŒB 9816 (piste 9). Lessouches productrices d’EPS portent toutes unplasmide de 5500 pb environ, pF. (b) Résultatd’hybridation de la membrane obtenue par trans-fert du gel décrit dans la figure 1a, hybridée avecla sonde GT.Figure 1. (a) Agarose gel electrophoresis ofgenomic DNA extractions of P. damnosusEPSproducing and non producing strains. Lane 1:λHindIII molecular weight marker (Promega).Genomic DNA from ropy strains IŒB 8415(lane 2), IŒB 8514 (lane 3), IŒB 8801 (lane 4),IŒB 9820 (lane 5) and from four non ropystrains: IŒB 9820.1 (V1, lane 6), IŒB Ja2(lane 7), ATCC 25248 (lane 8), IŒB 9816(lane 9). All EPS producing strains have a com-mon plasmid, pF, around 5500 bp. (b) Hybridiza-tion results of the membrane obtained afterSouthern blot of the gel described in figure 1a,using the GT probe.

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É. Walling et al.

au phénotype « filant » en milieu synthé-tique dépourvu d’éthanol entraîne la pertedu plasmide pF et la disparition du phéno-type filant. La présence d’un déterminantgénétique localisé sur le plasmide pF et laproduction d’EPS semblent donc liées. Cetteobservation a permis d’obtenir une premièresonde nucléique capable de caractériser lessouches porteuses du plasmide [17].

Après avoir caractérisé le phénomène deproduction d’EPS par des mesures de vis-cosité, nous avons cherché à expliquer lerôle du plasmide dans la production de glu-cane. Cette étude a permis la mise au pointde nouveaux outils moléculaires de détectiondes souches de contamination dans le vin.

2. DESCRIPTION DES SOUCHESDE P. DAMNOSUSPRODUCTRICES D’EPS

Les souches de P. damnosusétudiées ontété isolées de vins atteints de la maladie dela graisse. Certaines de ces souches,lorsqu’elles sont cultivées en MRS liquide[7], rendent le milieu extrêmement visqueux.Les mesures de viscosité permettent dequantifier ce phénomène et de caractériserplus précisément les souches de phénotype« filant ».

Les mesures sont effectuées avec un vis-cosimètre à tube Ubbelhode selon un pro-tocole précédemment décrit [16]. Les3 souches étudiées pour l’augmentation deviscosité sont P. damnosusIŒB (Collec-tion de la Faculté d’Œnologie) 9820, IŒB9820.1 notée V1 pour plus de clarté etATCC 25248. IŒB 9820 est une soucheisolée d’un vin filant en 1998. Elle présenteclairement le phénotype filant lors de sa cul-ture en milieu liquide. V1 est un variant deIŒB 9820, obtenu par repiquages succes-sifs en milieu dépourvu d’éthanol. La soucheP. damnosusde référence de l’ATCC (Ame-rican Type Culture Collection) ne présentepas le phénotype filant.

Chaque souche a été ensemencée dansdes milieux (MRS) contenant 3 concentra-tions croissantes de glucose (0, 5 et 20 g.L–1),afin d’observer l’effet de la concentrationdu glucose sur la viscosité du milieu. Lesmesures ont été effectuées au bout de 2 j deculture. Les résultats sont présentés dans lafigure 2. La croissance des cultures est sui-vie grâce à la mesure de densité optique à600 nm et par dénombrements de coloniessur boîtes. Elle est du même ordre de gran-deur pour les 3 souches dans chaque condi-tion de culture. La consommation de glu-cose est suivie par dosages enzymatiques.Les souches cultivées en présence de glu-cose à 5 ou 20 g.L–1 de concentration ini-tiale, en ont consommé environ 5 g.L–1.

Les cultures dans le milieu à 5 g.L–1 deglucose permettent de différencier plus clai-rement les 3 souches. La viscosité du milieuensemencé avec IŒB 9820 est la plus élevée(1.31 cST), alors que V1 génère une visco-sité intermédiaire (1.17 cST), supérieure àcelle du milieu cultivé avec ATCC 25248(1.02 cST). Les milieux à 0 et 20 g.L–1 deglucose présentent aussi des viscosités dif-férentes selon les souches utilisées, mais lesécarts sont moins flagrants. L’influence dela concentration de glucose sur la productiond’EPS ne pourra être clairement expliquéequ’après dosage direct du polysaccharideproduit et la détermination du bilan des pro-duits de la fermentation du glucose.

La viscosité intermédiaire de V1 à 5 g.L–1,entre la souche témoin « non-filante » et lasouche IŒB 9820 est intéressante. Elle peutsignifier une capacité moindre, mais nonnulle de V1 à produire le polysaccharide.Alors il faut supposer que la perte seule duplasmide n’entraîne peut être pas une éra-dication totale de la production d’EPS. Desdéterminants génétiques fonctionnels et dif-férents de ceux portés par le plasmide pour-raient être présents sur le chromosome. Dansce cas, le plasmide ne contrôlerait pas à luiseul la production de glucane, mais il ampli-fierait excessivement une production de basecommandée par un système de gènes chro-mosomiques.

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Exopolysaccharide de Pediococcus damnosus

de croissance, et par la présence d’éthanol etd’acide malique dans le milieu. Les condi-tions optimales sont rassemblées dans lesvins n’ayant pas réalisé totalement la fer-mentation malolactique et dans les vins issusde moûts altérés par Botrytis cinereaquistimule la croissance des bactéries lactiquesou provoque une déviation de leur métabo-lisme [16].

3. CARACTÉRISATIONDU PLASMIDE LIÉÀ LA BIOSYNTHÈSEDE GLUCANE

3.1. Séquençage

Étant donné les difficultés à extraire etpurifier le plasmide pF, d’une part, et à ledigérer par des enzymes de restrictionsd’autre part, la stratégie de séquençage

Outre la viscosité élevée des cultures desouches filantes, les pédiocoques isolés devins filants porteurs du plasmide pF sontcaractérisés par leur meilleure adaptationau milieu extrême qu’est le vin. En effet, ila été observé [16] que les souches filantesrésistaient mieux à un pH acide (3,5) et àl’éthanol (10 %) que des souches nonfilantes. De plus, ces dernières sont détruitessous l’action de 30 mg.L–1 de SO2 alors quela croissance des souches filantes est légè-rement retardée, mais finit par atteindre unniveau normal.

Bien que les souches filantes puissentproduire des EPS à partir de nombreuxsucres (glucose, fructose, arabinose etxylose), le rendement de la biosynthèse estsupérieur lorsque le glucose sert directe-ment de substrat. Cela paraît logique comptetenu de la nature glucosidique du polymère.La production de polysaccharide est égale-ment accrue lors de la phase exponentielle

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Figure 2.Viscosité relative des cultures de P. damnosusATCC 25248, IŒB 9820.1 (V1) et IŒB 9820en milieu nutritif, avec des concentrations croissantes de glucose (0, 5, 20 g.L–1). La viscosité de chaquemilieu non ensemencé représente 100 %. Les milieux non ensemencés à 0, 5, et 10 g.L–1 de glu-cose ont des viscosités respectives de 1,05 cST, 1,02 cST, et 1,08 cST.Figure 2. Relative viscosity of the strains P. damnosusATCC 25248, IŒB 9820.1 (V1) and IŒB 9820cultivated in a rich medium containing increasing concentrations of glucose (0, 5 and 20 g.L–1). Theviscosity of each medium before inoculation represents 100%. The viscosity of the non-inoculatedmedia at 0, 5 and 20 g.L–1 are 1.05 cST, 1.02 cST and 1.08 cST respectively.

É. Walling et al.

consiste en l’amplification par PCR defragments spécifiques du plasmide. Laséquence du fragment du clone SURE 2 n° 14(1 241 pb) a été utilisée pour sélectionnerde nouvelles amorces [17]. L’amplificationde régions spécifiques du plasmide s’estrévélée difficile car de nombreux fragmentssont générés, même dans des conditions deréactions stringentes. Ceci est expliqué parla présence fréquente de séquences directesrépétées sur le plasmide. De plus, la soucheétudiée dans cette partie, IŒB 8801, contientplusieurs plasmides qui hybrident entre eux,suggérant la présence de séquences simi-laires sur les différents plasmides. De cefait, les oligonucléotides destinés à amplifierdes régions de pF8801 pourraient égalementhybrider sur un autre plasmide. En consé-quence, les qualités de PCR ont été amélio-rées en utilisant le plasmide purifié commematrice. À ce jour, 3 981 pb du plasmideont été séquencées. Il est possible de pro-poser une carte préliminaire du plasmide(Fig. 3).

3.2. Fonctions potentielles déterminéespar le plasmide

L’analyse de la séquence partielle duplasmide avec les outils de bioinformatiquedisponibles sur l’Internet (http://www.info-biogen.fr/services/deambulum/fr/) révèle laprésence de 2 cadres de lectures (ORF). Lepremier cadre de lecture (orf185) est incom-plet, mais sur les 185 acides aminés dispo-nibles, la séquence protéique présente deforts taux d’identité (91 %) avec la partieN-terminale d’une protéine de mobilisationde Lactobacillus casei(numéro d’accès :U31333). L’ORF185 présente égalementdes identités élevées avec des protéines demobilisation d’autres espèces de bactérieslactiques, comme Lactobacillus plantarum,Lactobacillus hilgardii, Lactococcus lactis.La présence éventuelle d’un gène détermi-nant une protéine de mobilisation sur le plas-mide pF8801 peut faire penser que le plas-mide est transféré par conjugaison. Unplasmide portant un gène codant pour une

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Figure 3. Représentationschématique de l’organisa-tion génomique du plas-mide pF8801, localisationdes amorces nucléotidiqueset des sondes. Les oligonu-cléotides sont représentéspar des flèches. La positionet le sens des cadresouverts de lecture (ORF)sont indiqués. Les poin-tillés représentent la régionrestant à séquencer.Figure 3. Schematic rep-resentation of the plasmid(pF8801) genomic organi-zation including PCRprimers and nucleic acidprobes. Primers are repre-sented with arrows. Openreading frames (ORF) areindicated. Dashes representthe remaining region to besequenced.

Exopolysaccharide de Pediococcus damnosus

La polysaccharide synthase Dps deP. damnosusest vraisemblablement une pro-téine membranaire. En effet, elle compor-terait 6 domaines transmembranaires A(aa 1 à 36), qui est probablement un pep-tide signal, B (aa 57 à 82), C (aa 265 à 289),D (aa 386 à 407), E (aa 450 à 468) etF (aa 496 à 518). Une organisation similaireest retrouvée dans la Tts de Streptococcuspneumoniae, où, mis à part un peptide signalprésent dans la partie N-terminale, les5 domaines transmembranaires sont plutôtregroupés en C-terminal. Ceci laisse sup-poser que le site actif se situe au centre de laséquence primaire (Fig. 4).

En résumé, le lien entre le plasmidepF8801 de P. damnosuset la synthèse deβ-glucane est conforté par la présence dugène dpsdéterminant une glucosyltransfé-rase potentielle. Bien que les glucosyltrans-férases soient des enzymes très spécifiquesqui catalysent généralement la formationd’un seul type de liaison entre les unités desucres, il existe quelques rares exemples deglycosyltransférases bifonctionnelles chezEscherichia coli[12], Streptococcus pyo-genes[6], et Streptococcus pneumoniaetype 3 [1]. De plus, il est suspecté que laglucosyltransférase Tts de S. pneumoniae,codée par un gène n’appartenant pas à unopéron, soit également une enzyme bifonc-tionnelle. De même, dpsne faisant pas par-tie d’un opéron, il est envisageable que labiosynthèse de glucane par les pédiocoquesdu vin soit déterminée par un gène unique.

Il reste à caractériser l’activité enzyma-tique de Dps par transformation chez un hôtehétérologue (Escherichia coli, Lactococcuslactis, Streptococcus pneumoniae) car lesprotocoles de transformations de Pediococcusdamnosusne sont pas encore mis au point.

3.3. Détection des souchesde Pediococcus damnosusporteuses du plasmide pF8801

Deux types d’outils de détection dessouches de P. damnosusproductrices d’EPS

protéine de mobilisation peut être transféréen même temps qu’un plasmide conjugatif.En effet, les protéines de mobilisation ontune activité nucléasique et préparent l’ADNpour le co-transfert du plasmide. Elles agis-sent au niveau de sites spécifiques dénom-més « bom » pour « basis of mobilization »situés sur le plasmide mobilisable.

Le deuxième cadre de lecture, dpsdéter-mine une protéine de 567 acides aminésavec un poids moléculaire théorique de65 kg.mol–1. Lorsque cette séquence est sou-mise à la comparaison dans les banques dedonnées, elle s’aligne le plus fidèlement avecla polysaccharide synthase (Tts) de Strepto-coccus pneumoniaetype 37 qui contient509 acides aminés [18]. D’après les résul-tats obtenus avec le programme ALIGN(http://www.infobiogen.fr/services/analy-seq/cgi-bin/alignn_in.pl), les deux séquencessont identiques à 32,2 % et similaires à 34 %.Les alignements suivants de BLAST sélec-tionnent plusieurs glycosyltransférases pro-caryotes et eucaryotes, dont des cellulosesynthases. Dps semble donc appartenir à lafamille des glycosyltransférases. En effet,le programme ProfileScan (http://www.isrec.isbsib.ch/software/PFSCAN_form.html)détecte une séquence signature des glyco-syltransférases située de l’acide aminé 110 à212 de Dps. De plus, l’équipe de Lull [18] amontré, grâce à des expériences de trans-formation de souches de Streptococcus pneu-moniaesans capsule que le gène tts déter-minait la biosynthèse du polysaccharide type37. Puisque ce polysaccharide et le glucanede P. damnosusont la même structure, iln’est pas étonnant de retrouver des simili-tudes au niveau des enzymes impliquéesdans leur synthèse. Un alignement a été réa-lisé avec 5 séquences de glycosyltransfé-rases provenant de différents organismes(Fig. 4). Sur les 3 résidus acides aspartiquessupposés faire partie du site catalytique desglycosyltransférases [21], seulement 2 sontprésents chez Dps. D’autre part le motifQXXRW retrouvé dans de nombreuses gly-cosyltransférases n’est présent ni dans laséquence de Tts, ni dans celle de Dps.

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alling et al.296

Figure 4. Analyse de la séquence protéique de Dps. La partie supérieure montre la représentation schématique de la structure secondaire de Dps. Lesflèches blanches représentent les sites potentiels de coupure du peptide signal. Les régions blanches indiquent les domaines transmembranaires. Lastructure secondaire de la glucosyltransférase Tts (n° d’accès AJ131985) de Streptococcus pneumoniaeest montrée pour comparaison. La partie infé-rieure du schéma montre les alignements de certaines régions des séquences protéiques de Dps, Tts et de glycosyltransférases des espèces Haemophil-lus influenzae(HI, n° d’accès Q57022), Lactococcus lactis(LL, AJ000993), Dictyostelium discoideum(DD, AF163835) et Arabidopsis thaliana(AT,AC006266). Les résidus sur fond noir sont les acides aminés identiques dans au moins 3 des 6 séquences alignées. Les substitutions conservatives sontindiquées sur fond gris. Les flèches noires indiquent les positions des résidus Asp conservés chez les glycosyltransférases. La position du motif QXXRWest montrée par les triangles noirs.Figure 4. Dps amino acid sequence analysis. The top part shows a schematic representation of the secondary structure of Dps. White arrows are the poten-tial cleavage site for the signal peptide. White areas indicate the transmembrane regions. The secondary structure of Streptococcus pneumoniaegluco-syltransferase Tts (accession # AJ131985) is showed for comparison. The bottom part of the illustration contains the alignment of several regions fromthe proteins Dps, Tts and from glycosyltransferases of the species Haemophillus influenzae(HI, accession # Q57022), Lactococcus lactis(LL, AJ000993),Dictyostelium discoideum(DD, AF163835) and Arabidopsis thaliana(AT, AC006266). Residues on black boxes indicate amino acid residues identicalin at least 3 out of the 6 sequences aligned. Conserved amino acid substitutions are shown in gray. Black arrows indicate the position of conserved Aspresidues in glycosyltransferases. Position of motif QXXRW is shown by black triangles.

Exopolysaccharide de Pediococcus damnosus

présence de souches de P. damnosuspro-ductrices d’EPS parmi la flore totale du vin.Les colonies de pédiocoques ne produisantpas de glucane n’hybrident pas avec la sondeGT. Ceci signifie qu’il n’existe pas de copiedu gène dpssur le chromosome des souchesnon filantes.

La mise en œuvre de la techniqued’hybridation sur colonies est intéressantepour la détection et le dénombrement de lapopulation porteuse du plasmide pF8801.La méthode est cependant limitée dans lecas où ces bactéries sont peu représentéesdans la flore totale. Un autre inconvénientmajeur concerne les délais nécessairesjusqu’à l’obtention du résultat, étant don-née la croissance très lente sur milieu solidedes micro-organismes issus du vin.

3.3.2. Détection par PCR

La détection des pédiocoques d’altéra-tion par la technique de PCR devait per-mettre l’obtention plus rapide du résultat dela contamination du vin, l’étape de crois-sance préalable étant inutile. D’autre part,vue la sensibilité de la technique, on pou-vait espérer abaisser le seuil de détection.

Dans un premier temps, ce travail a néces-sité la recherche d’un couple d’amorces oli-gonucléotidiques déduit de la séquence depF8801, permettant l’amplification spéci-fique d’un fragment unique du plasmide.Parmi les 8 couples testés, seuls deux(PF8/PFU et PF5/PF6) (Fig. 3) répondaientà ces critères. Les autres couples ne per-mettaient aucune amplification, ou aucontraire, donnaient des amplifications nonspécifiques en plus du fragment attendu. Lecouple PF5/PF6 a été préféré pour la suite dutravail. En effet, la bande amplifiée contientl’extrémité 5’ du gène orf185et une partiede la région intergénique en amont. Àl’inverse, avec le couple PFU/PF8 un frag-ment interne du gène dpscodant pour uneglycosyltransférase potentielle est amplifié.Les glycosyltransférases sont des enzymestrès répandues chez les organismes vivantsmais aucun gène correspondant n’a été

ont été recherchés. Les séquences du plas-mide permettent d’une part d’envisagerl’isolement de sondes spécifiques, et d’autrepart de choisir des amorces oligonucléoti-diques utilisables en PCR pour détecter laprésence du plasmide parmi la flore bacté-rienne du vin.

3.3.1. Utilisation de sondes nucléiques

À partir des séquences présentées dansce travail, de nouvelles sondes nucléiquesont été obtenues. La sonde appelée GT,davantage centrée sur le gène dpsa été réa-lisée en marquant à la digoxygénine le frag-ment amplifié par PCR avec les amorcesPF1 et PF2 (Fig. 3). Cette sonde, longue de1 500 pb, a été hybridée avec l’ADN totalextrait de souches productrices d’EPS,séparé sur gel d’agarose. Elle a permis ladétection d’une bande correspondant àpF8801. Aucun signal d’hybridation n’a étéobservé avec l’ADN extrait de souches nonproductrices (Fig. 1b).

Après avoir vérifié la spécificité de lasonde GT, celle-ci a été utilisée pour réali-ser des hybridations sur colonies. La florebactérienne issue d’un vin suspecté contenirdes souches de P. damnosusproductricesd’EPS a été étalée sur milieu MRS solide.Après 14 j de culture en anaérobiose, 2 typesde colonies se sont développées en propor-tion équivalente : ce vin contenait une florelactique atteignant 1,6 × 106 ufc.mL–1 com-posée pour moitié de pédiocoques (petitescolonies de diamètre ≤1 mm) et pour moitiéde cellules d’Œnococcus œni(colonies plusgrosses). La sonde GT a permis la détec-tion des colonies productrices de glucane(9 % des colonies de pédiocoques). Les3 types de populations (cellules d’Œnococ-cus œni, pédiocoques n’hybridant pas avecla sonde et pédiocoques hybridant) ont étérepiqués en milieu MRS liquide. Seules lescolonies ayant hybridé avec la sonde ontprovoqué une augmentation de viscosité dumilieu de culture, attestant la productiond’EPS. La sonde GT est donc utilisable enhybridation sur colonies pour détecter la

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caractérisé à ce jour chez les bactéries lac-tiques du vin. Il paraissait délicat de baser letest PCR sur l’utilisation des amorcesPFU/PF8 qui risquaient de ne pas être spé-cifiques du plasmide pF de P. damnosus.

Le couple PF5/PF6 a été testé sur cel-lules entières en utilisant les souches depédiocoques de la collection de la Facultéd’Œnologie. Un unique amplifiat de 550 pbenviron est observé chez toutes les souchesproductrices ; au contraire, aucune ampli-fication n’est détectée chez les souches inca-pables de synthétiser le glucane. Il apparaîtdonc que le couple d’amorces PF5/PF6 estadapté à la détection des souches de P. dam-nosusproductrices d’EPS dans le vin.

L’intérêt majeur de l’utilisation de la PCRest de détecter rapidement la présence depédiocoques d’altération parmi la flore totaledu vin. Le milieu vin est complexe, ilcontient notamment des composés phéno-liques qui sont de puissants inhibiteurs dela réaction de PCR [13]. Cet inconvénient aété détourné dans le cas de la détection parPCR de cellules d’Œ. œniporteuses du gènede l’histidine décarboxylase (hdc) en effec-tuant une préculture de 48 h de la flore bac-térienne en milieu MRS [4]. Cette étape per-mettait à la fois un enrichissement de lapopulation et une dilution des composésphénoliques. La PCR effectuée directementsur les culots cellulaires permettait d’affir-mer la présence de bactéries hdc+. Cettetechnique s’est révélée inefficace dans lecas de la détection de cellules de P. dam-nosus porteuses du plasmide pF8801, peut-être en partie à cause de la présence de poly-saccharides pouvant gêner la réaction dePCR. Une étape d’extraction et de purifica-tion de l’ADN des cellules présentes dans levin s’averrait par conséquent nécessaire.Un protocole pour la détection de cellulesd’Œ. œnidans le vin [29], basé sur l’ampli-fication d’un fragment du gène de l’enzymemalolactique, rapporte l’utilisation de poly-vinylpyrrolidone (PVP) pour éliminer lescomposés phénoliques des préparationsd’ADN. D’autres pour la détection par PCR

de microorganismes du sol font intervenirle PVP dans les premières étapes, juste aprèsla lyse des cellules, afin d’éliminer les com-posés inhibiteurs en même temps que lesdébris cellulaires [27]. Ce deuxième typede protocole adapté au milieu vin a permisla détection de souches de P. damnosusd’altération (Fig. 5).

Les expérimentations ont été réalisées enutilisant un vin contenant des cellules deP. damnosusproductrices d’EPS. Le dénom-brement des microorganismes contenus dansce vin a donné les résultats suivants : levu-res : 3,3 × 105 ufc.mL–1, bactéries acétiques :1,3 × 104 ufc.mL–1, bactéries lactiques :2,4 × 105 ufc.mL–1 (dont 4 × 104 ufc.mL–1

d’Œ. œni et 2 × 105 ufc.mL–1 de P. damno-sus). Parmi les cellules de P. damnosus,1 × 103 ufc.mL–1 (0,5 %) sont des coloniesdonnant un signal après hybridation avec lasonde spécifique GT, et se sont révélées êtredes souches productrices d’EPS. Le proto-cole de PCR directe sur le vin est appliquésur 1 mL d’échantillon du même vin. Il apermis l’amplification du fragment attendu.Ainsi, 1 × 103 cellules, représentant moinsde 0,2 % de la population totale traitée sontsuffisantes pour permettre la détection duplasmide filant. La mesure plus précise duseuil de détection a été recherchée en diluantle vin contaminé dans ce même vin stéri-lisé par filtration. L’amplification a été obte-nue pour les échantillons non dilué et diluéau 1/10e (Fig. 5). Le seuil de détection descellules porteuses du plasmide filant estdonc de 1 × 102 ufc.mL–1. Ce seuil démontrela sensibilité de la technique qui permettra deprévoir une éventuelle altération d’un vinavant que les populations responsables nepuissent se développer.

4. CONCLUSION

Certaines souches de P. damnosusiso-lées de vins atteints de la maladie de lagraisse présentent clairement un phénotype« filant » lorsqu’elles sont cultivées enmilieu nutritif de laboratoire. Ceci est dû à

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Exopolysaccharide de Pediococcus damnosus

séquence protéique de Dps affiche d’impor-tantes similitudes avec la protéine Tts deStreptococcus pneumoniae, capable de diri-ger la synthèse du polysaccharide capsu-laire du sérotype 37 chez cette bactérie. Lepolysaccharide de type 37 possédant lamême structure que le β-glucane de P. dam-nosus, il est probable que Dps permette lasynthèse d’EPS chez P. damnosus. Il n’estpas exclu que d’autres déterminants géné-tiques situés en dehors du plasmide pF par-ticipent à la biosynthèse du glucane auniveau de la régulation et de l’export, parexemple. L’activité enzymatique de Dpsdevra être caractérisée. Il reste aussi à déter-miner précisément les facteurs déclenchantla production d’EPS dans certains vins.

Enfin, pour prévoir les risques d’altéra-tion des vins par des pédiocoques produc-teurs d’EPS, plusieurs outils de détectionsont proposés. Ils sont basés sur les don-nées génétiques décrites dans ce travail etmettent en œuvre des techniques de biologiemoléculaire. La PCR est utilisée pour détec-ter les souches de contamination à un niveaude population très faible et les sondesnucléiques spécifiques permettent de quan-tifier la proportion de ces souches d’altéra-tion parmi la flore totale du vin.

REMERCIEMENTS

E.W. bénéficie d’une bourse MENRT. Unepartie de ce travail est financée par le CIVB(Conseil Interprofessionnel des Vins deBordeaux).

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La production d’EPS a été corrélée à laprésence du plasmide pF. Le séquençage amontré la présence d’un gène (dps) codantpour une glucosyltransférase potentielle. La

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Figure 5. Détection par PCR des souches deP. damnosusproductrices d’EPS. Piste 1 : mar-queur de poids moléculaire 100 pb (Promega).La PCR est réalisée en utilisant comme matricel’ADN issu d’une extraction plasmidique de lasouche IŒB 8801 (témoin positif d’amplifica-tion, piste 2), les cellules issues du vin après pré-culture de 48 h en milieu MRS (piste 3) ; l’ADNdes cellules présentes dans 1 mL de vin (piste 4),dans 1 mL de vin dilué au 1/10e (piste 5), dans1 mL de vin dilué au 1/100e (piste 6). Piste 7 :témoin négatif d’amplification.Figure 5. PCR detection of P. damnosusstrainsproducing EPS. Lane 1: molecular weight marker100 bp (Promega). PCR is done using DNAfrom : a plasmid extraction of strain IŒB 8801(positive control of reaction, lane 2), wine cellscultivated 48 h in MRS medium (lane 3), DNAfrom the cells in 1 mL of wine (lane 4), in 1 mLof a 1/10 dilution of wine (lane 5), in 1 mL of a1/100 dilution of wine (lane 6). Lane 7: nega-tive control of the reaction.

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