Lentiviral Vector for Gene Transfer

A Versatile Tool for Regulated Gene Expression, GeneSilencing and Progenitor Cell Therapies

Doctoral dissertation

To be presented by permission of the Faculty of Natural and Environmental

Sciences of the University of Kuopio for public examination in

Auditorium, Tietoteknia building, University of Kuopio,

on Saturday 19th April 2008, at 1 p.m.

Department of Biotechnology and Molecular MedicineA.I. Virtanen Institute for Molecular Sciences

University of Kuopio

JONNA KOPONEN

JOKAKUOPIO 2008

KUOPION YLIOPISTON JULKAISUJA G. - A.I. VIRTANEN -INSTITUUTTI 60KUOPIO UNIVERSITY PUBLICATIONS G.

A.I. VIRTANEN INSTITUTE FOR MOLECULAR SCIENCES 60

Distributor : Kuopio University Library P.O. Box 1627 FI-70211 KUOPIO FINLAND Tel. +358 17 163 430 Fax +358 17 163 410 http://www.uku.fi/kirjasto/julkaisutoiminta/julkmyyn.html

Series Editors: Research Director Olli Gröhn, Ph.D. Department of Neurobiology A.I . Virtanen Institute for Molecular Sciences

Research Director Michael Courtney, Ph.D. Department of Neurobiology A.I . Virtanen Institute for Molecular Sciences

Author’s address: Department of Biotechnology and Molecular Medicine A.I . Virtanen Institute for Molecular Sciences University of Kuopio, Bioteknia 1 P.O. Box 1627 FI-70211 KUOPIO FINLAND E-mail : Jonna.Koponen@uku.fi

Supervisors: Professor Seppo-Ylä-Herttuala, M.D., Ph.D. Department of Biotechnology and Molecular Medicine A.I . Virtanen Institute for Molecular Sciences University of Kuopio

Docent Jarmo Wahlfors, Ph.D. Department of Biotechnology and Molecular Medicine A.I . Virtanen Institute for Molecular Sciences University of Kuopio

Reviewers: Docent Ari Hinkkanen, Ph.D. Department of Biochemistry and Pharmacy Åbo Akademi University

Pauli ina Lehtolainen, Ph.D. Centre for Cardiovascular Biology and Medicine University College London

Opponent: Professor Akseli Hemminki, M.D., Ph.D. Molecular Cancer Biology Program and Institute of Biomedicine, Biomedicum Helsinki University of Helsinki

ISBN 978-951-27-0619-8ISBN 978-951-27-1101-7 (PDF)ISSN 1458-7335

KopijyväKuopio 2008Finland

Koponen, Jonna. Lentiviral Vector for Gene Transfer – A Versatile Tool for Regulated GeneExpression, Gene Silencing and Progenitor Cell Therapies. Kuopio University PublicationsG. – A.I.Virtanen Institute for Molecular Sciences 60. 2008. 71 p.

ISBN 978­951­27­0619­8ISBN 978­951­27­1101­7 (PDF)ISSN 1458­7335

ABSTRACT

Gene  therapy holds promise  to  improve  the  treatment options of both  inherited and acquireddiseases like cardiovascular diseases. There is still a need for optimal gene delivery vectors forenhanced  efficacy  and  safety.  The  aim  of  this  research  was  to  apply  the  humanimmunodeficiency virus­1 (HIV­1) derived lentiviral vector (LV) for different approaches of genetherapy. LVs have  the ability  to  integrate  into  the host cell genome and are  thus suitable  forapplications  requiring  long­term  expression  of  the  therapeutic  gene.  However,  in  suchapplications, there is a need to regulate the level of therapeutic protein expression. During thisresearch,  a  LV  system  was  developed  and  its  efficacy  tested  for  the  capacity  to  adjust  theamount  of  protein  expressed  or  to  switch  the  expression  on  and  off  by  the  addition  of  theantibiotic, doxycycline. This study demonstrates the ability to fine­tune the expression of a LVdelivered therapeutic gene by adjusting the concentration of doxycycline within a range whichcan be achieved by oral administration. It also shows the functionality of the system in vivo inrat  brain.  Another  approach  for  therapeutic  gene  regulation  is  to  utilize  an  endogenous,pathophysiological stimulus of  the target  tissue. We designed a series of vectors exploiting anovel  approach,  oxidative  stress  induced  gene  regulation.  This  is  an  alluring  concept  forcardiovascular  gene  therapy  applications,  since  oxidative  stress  plays  a  role  in  a  number  ofcardiovascular  diseases.  Our  results  showed  that  antioxidant  response  elements  introducedinto LVs can be used for oxidative stress induced gene expression. Also, we studied whetherLVs can be applied in a gene knock­down approach exploiting a small hairpin RNA (shRNA) –based method. Our results demonstrate efficient, long­term gene silencing by LV­shRNA bothin cell culture and mouse brain. As a potential therapeutic application for LVs, we studied theirability to transduce cord blood (CB) derived progenitor cells and found that these cells could beefficiently  transduced  by  LVs.  CB  is  a  unique  source  for  hematopoietic  stem  cells  and  otherprogenitor cells, which can be exploited for novel cell therapy approaches. We also assessedthe therapeutic potential of progenitor cells in a nude mouse model of hindlimb ischemia. Wedid not detect engraftment of progenitor cells into the target tissue. However, our results showenhanced  regeneration of  the  ischemic muscle  by  progenitor  cell  injections. Based  on  theseresults, we suggest that progenitor cells may be beneficial in the recovery of injured tissue byindirect mechanisms. Taken together, this study demonstrates the applicability of HIV­1 basedvectors as a basic  research  tool and a potential gene  therapy vector, particularly  for ex vivoapproaches such as progenitor cell therapies.

National Library of Medicine Classification: QU 470, QU 475, QZ 52, QW 168.5.H6, QU 325Medical Subject Headings: Gene Therapy; Gene Transfer Techniques; Genetic Vectors;Lentivirus; HIV­1; Gene Expression Regulation; Gene Silencing; Doxycycline; Brain; Rats;Oxidative Stress; Umbilical Cord; Blood; Stem Cells; Transduction, Genetic; CardiovascularDiseases/therapy; Ischemia; Muscle, Skeletal; Mice

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was done at the Department of Molecular Medicine, A.I.Virtanen Institute, Universityof  Kuopio,  during  the  years  2000  –  2008.  To  carry  out  this  work,  I  have  been  helped  bynumerous people. It is their contribution I wish to acknowledge.

Firstly, I would like to thank my supervisor Prof. Seppo Ylä­Herttuala for his guidance and theopportunity  to  be  a  part  of  his  research  group.  I  feel  privileged  that  I  have  been  able  to  doresearch  in  a  setting  with  great  facilities.  My  second  supervisor,  Docent  Jarmo  Wahlfors,deserves thanks for helping me get started with the design of the lentiviral vectors.

I  owe  my  sincere  thanks  to  the  official  reviewers  of  this  thesis,  Docent  Ari  Hinkkanen  andPauliina Lehtolainen, PhD,  for  their  careful  revision and valuable comments  in  improving  thethesis. I am thankful to Roseanne Girnary, PhD, for kindly reviewing the language of the thesis.

These  studies  would  not  have  been  completed  without  collaboration.  I  am  grateful  to  Prof.Hermann  Bujard  and  Prof.  Wolfgang  Hillen  for  providing  the  improved  tetracyclinetransactivator.  I want  to  thank people  from  the Finnish  Red  Cross  Blood Service  for  sharingtheir expertise on cord blood progenitor cell techniques. I especially thank Tuija Kekarainen forher important role in this research, and for her friendship. Prof. Jari Koistinaho and Tarja Malmdeserve thanks for helping with  the mouse brain  injection  techniques. I wish  to  thank DocentAnna­Liisa Levonen for rewarding co­work and for sharing her professional outlook on scientificmatters.

I  deeply  value  the  indispensable  effort  of my  co­authors.  I  owe  my special  thanks  to  HannaKankkonen  for  introducing  the  lentivirus  techniques  to  me.  Without  her  knowledge  andexperience  many  things  would  have  been  more  complicated.  During  my  thesis  work,  I  waspleased to supervise the MSc theses of Petri Mäkinen and Hanna Hurttila. I wish to sincerelythank the momentous and skillful contribution of these two co­authors in my thesis work. I amthankful to Suvi Heinonen for performing the mouse ischemia surgery of this research, and forher  friendship during the years we have shared an office. Anna­Mari Kärkkäinen, a co­authorand a friend, deserves warm thanks. In addition to co­authors, many people have participatedin  the  unpublished  animal  experiments  presented  in  this  thesis.  I  want  to  thank  JohannaMarkkanen, Tuomas Rissanen, Marcin Gruchala, Tommi Heikura and Juha Rutanen  for theirkind and unselfish help. The skilled assistance of all the SYH­group lab technicians has beenessential for this research to be carried out. I specially want to emphasize the invaluable help ofMervi  Nieminen  and  Anne  Martikainen.  Also,  I  am  grateful  to  Marja  Poikolainen  and  HelenaPernu for their good­hearted secretarial help.

Since  research  is  teamwork,  I  want  to  acknowledge  all  the  former  and  present  SYH­groupmembers for creating a prosperous team. I have been privileged to work as a member of thisteam, together with researchers who own a vast variety of expertise and research interests.  Itruly appreciate this. I am thankful for all the generous help that I have received for numerousissues during these years. Besides being a top class research group, I will remember the SYH­group as a group full of fun people. I thank these people for the enjoyable times!

During my PhD –study years, I have been more than happy to have relaxing leisure activities toboot my personal hard drive. I congratulate myself for having non­academic interests and thankall my friends who have been involved in these truly essential moments!

I owe thanks to my parents Maarit and Antero and sister Tiina for all their support and help.

I am fortunate enough to share my life with four extreme dudes, who I simply admire. I want toacknowledge my four­legged physical and mental coaches, Otto and Sisu, for always having aspirit­raising  effect  on  me.  I  envy  their  attitude.  Finally,  my  warmest  thanks  and  highestappreciation go to Juha and little Veikka.

Kuopio, April 2008

Jonna Koponen

This study was supported by grants  from the Academy of Finland, The National TechnologyAgency  of  Finland  (TEKES),  Finnish  Cultural  Foundation  of  Northern  Savo,  Aarne  KoskeloFoundation, Orion­Farmos Research Foundation, Emil Aaltonen Foundation, Kuopio UniversityFoundation, Aarne and Aili Turunen Foundation, and Instrumentarium Foundation.

ABBREVIATIONS

AAV adeno­associated virusAIDS acquired immunodeficiency

syndromeALS amyotrophic lateral sclerosisARE antioxidant responsive

elementBMC bone marrow mononuclear

cellCB cord bloodCMV cytomegalovirusCNS central nervous systemDEM diethyl maleateDox doxycyclinedsRNA double stranded RNAEIAV equine infectious anemia

virusELISA enzyme linked

immunosorbent assayEPC endothelial progenitor cellESC embryonic stem cellFGF fibroblast growth factorFKBP12 FK506­binding protein of 12

kDaFRAP FKBP rapamycin­associated

proteinFRB FKBP rapamycin­bindingFH familial

hypercholesterolemiaFIV feline immunodeficiency

virusGAPDH glyceraldehyde­3­phosphateHGF hepatocyte growth factorHIF hypoxia inducible factorHIV­1 human immunodeficiency

virus 1HO­1 heme oxygenase 1HSC hematopoietic stem cellHSV­tk herpes simplex virus

thymidine kinaseIHC immunohistochemistryKRAB Kruppel­Associated BoxLDL low density lipoproteinLTR long terminal repeatLV lentiviral vectorLVEF left ventricular ejection

fractionMACS magnet activated cell sortingMCP­1 monocyte chemoattractant

protein­1 geneMCS mesenchymal stem cell

MOI multiplicity of infectionmiRNA microRNAMLV murine leukemia virusOas­1a 2’,5’­oligoadenylate

synthetase 1a genePCR polymerase chain reactionPDGF platelet derived growth

factorPol III RNA polymerase IIIpiRNA Piwi interacting RNAsRISC RNA­induced silencing

complexRNAi RNA interferenceROS reactive oxygen speciesRT­PCR reverse transcription

polymerase chain reactionrtTA reverse tetracycline

transactivatorshRNA small hairpin RNAsiRNA small interfering RNASIN self­inactivatingSIV simian immunodeficiency

virusssRNA single stranded RNATet tetracyclinetetO tetracycline operatorTetR tetracycline repressor

proteinTNF­ tumor necrosis factor alfaTRE tetracycline­response

elementtTA tetracycline transcriptional

activatortTS tetracycline trans­silencerTU transducing unitsVCAM­1 vascular cell adhesion

molecule 1VEGF vascular endothelial growth

factorVSV­G vesicular stomatitis virus G­

proteinqPCR quantitative polymerase

chain reactionqRT­PCR quantitative reverse

transcription polymerasechain reaction

ZFHD1 zinc­finger homeodomainfusion 1

LIST OF ORIGINAL PUBLICATIONS

I Jonna K. Koponen, Hanna Kankkonen, Jani Kannasto, Thomas Wirth,Wolfgang Hillen, Hermann Bujard and Seppo Ylä­Herttuala.Doxycycline­regulated lentiviral vector system with a novel reversetransactivator rtTA2S­M2 shows a tight control of gene expression in vitro andin vivo.Gene Therapy 2003 Mar;10(6):459­66.

II Hanna Hurttila, Jonna K. Koponen, Emilia Kansanen, Henna­Kaisa Jyrkkänen,Annukka M. Kivelä, Riina Kylätie, Seppo Ylä­Herttuala and Anna­LiisaLevonen.Oxidative stress inducible lentiviral vectors for gene therapy.Gene Therapy in press

III Jonna K. Koponen, Tuija Kekarainen, Suvi E. Heinonen, Anita Laitinen,Johanna Nystedt , Jarmo Laine and Seppo Ylä­Herttuala.Umbilical cord blood­derived progenitor cells enhance muscle regeneration  inmouse hindlimb ischemia model.Molecular Therapy 2007 Dec;15(12):2172­7.

IV Petri I. Mäkinen, Jonna K. Koponen*, Anna­Mari Kärkkäinen*, Tarja M. Malm,Kati H. Pulkkinen, Jari Koistinaho, Mikko P. Turunen and Seppo Ylä­Herttuala.Stable RNA interference: comparison of U6 and H1 promoters in endothelialcells and in mouse brain.Journal of Gene Medicine 2006 Apr;8(4):433­41.

V Jonna K. Koponen*, Anna­Mari Turunen*, and Seppo Ylä­Herttuala.Escherichia coli DNA contamination in AmpliTaq Gold polymerase interfereswith TaqMan analysis of lacZ.Molecular Therapy 2002 Mar;5(3):220­2.

* Authors with equal contribution. Also some unpublished data is presented.

CONTENTS

INTRODUCTION… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 13

REVIEW OF THE LITERATURE… … … … … … … … … … … … … … … … … …  14

GENE THERAPY … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …  14General concept… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 14Cardiovascular diseases… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 14Other targets… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 14

  GENE TRANSFER VECTORS… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 15Overview of vectors… … … … … … … .… … … … … … … … … … … … … … … … …  15

Principles of gene transfer… … … … … … … … … … … … … … … … … .15Nonviral gene transfer vectors… … … … … … … … … … … … … … … .. 15Viral gene transfer vectors… … … … … … … … … … … … … … … … … . 16Vectors based on DNA viruses… … … … … … … … … … … … … … … . 16Vectors based on RNA viruses… … … … … … … … … … … … … … … . 16

Lentiviral HIV­1 derived vectors… … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 17HIV­1 biology and genome… … … … … … … … … … … … … … … … …  17The HIV­1 life cycle… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 18The development of HIV­1 derived gene transfer vectors… … … …  21Applications of HIV­1 derived gene transfer vectors… … … … … … . 22

CELL THERAPIES FOR CARDIOVASCULAR DISEASES… … … … … … … … . 25General concept… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 25Cell types and sources… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …  25Cell therapy combined with gene therapy… … … … … … … … … … … … … … …  27Clinical trials and future prospects… … … … … … … … … … … … … … … … … …  28

GENE TRANSFER VECTORS WITH REGULATED GENE EXPRESSION… ..28General concept… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 28Tetracycline­regulated gene expression… … … … … … … … … … … … … … … .. 29Steroid hormone receptor ­based regulated gene expression… … … … … … . 31Rapamycin­regulated gene expression … … … … … … … … … … … … … … … .. 31Physiologically regulated gene expression… … … … … … … … … … … … … … .. 32Radiation induced gene expression… … … … … … … … … … … … … … … … … .. 32

  GENE EXPRESSION KNOCK­DOWN BY RNA INTERFERENCE (RNAi)… … 33Introduction to RNAi… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … …  33The mechanism of RNAi… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 33shRNA delivery by gene transfer vectors… … … … … … … … … … … … … … … . 34RNAi applications… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 35

AIMS OF THE STUDY… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..37

MATERIALS AND METHODS… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .38

SUMMARY OF THE MATERIALS AND METHODS… … … … … … … … … … … ..38Methods of assessing HIV­1 lentiviral vector efficacy in animal modelsof cardiovascular gene therapy (unpublished studies)… … … … … … … … … .. 43

General methodology… … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 43Intraluminal and periadventitial approach for lentiviral vector administration into rabbit carotid artery… … … … … … … … … … … .. 43Intramuscular injection of lentiviral vector in rabbit skeletal muscle… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...43Intramyocardial injection of lentiviral vector in porcine myocardium… … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 44

RESULTS AND DISCUSSION… … … … … … … … … … … … … … … … … … … 45

Doxycycline regulated lentiviral vector system (I)… … … … … … … … … … … .. 45Oxidative stress inducible lentiviral vector (II)… … … … … … … … … … … … … . 46The performance of lentiviral HIV­1 derived vector incardiovascular gene therapy applications (unpublished data)… … … … … … . 47Cord­blood derived progenitor cells in a mouse model forskeletal muscle ischemia (III)… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 51A lentiviral vector for gene silencing by RNAi (IV)… … … … … … … … … … … .. 54A real­time quantitative PCR ­approach for the analysis of lacZmarker gene expression (V)… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 56

CONCLUSIONS AND FUTURE PERSPECTIVES… … … … … … … … … … ..57

REFERENCES… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 59

APPENDIX: Original publications I­V

13

INTRODUCTION

The concept of gene therapy, an approach totreat  disease  by  either  modifying  the  geneexpression or correction of abnormal genes,has been around since the first gene therapyapplications  were  introduced  in  the  early1980s. By administration of DNA rather thana drug, many different diseases are currentlybeing  investigated  as  candidates  for  genetherapy.  This  has  been  influenced  by  therapidly  increasing  knowledge  of  the  humangenome  and  its  regulatory  mechanisms.However, the success of clinical therapies isstill  limited  due  to  the  lack  of  optimal  genetransfer  vectors.  Rather  than  aiming  at  asingle  vector  that  is  suitable  for  all  genetictherapies,  different  vectors  with  qualitiestailored for each application is the objective.The  most  important  features  andrequirements  should  be  taken  into  account.These  include  the vector  tissue  tropism, theduration  of  gene  expression,  the  possiblegenomic  integration  ability,  the  feasibility  toswitch off gene expression or to  regulate  itsexpression, the expected immune responseselicited  by  the  vector,  the  possible  need  torepeated  vector  administrations,  and  safetyand  ethical  considerations.  Adenoviralvectors  have  been  extensively  andsuccessfully  used  both  in  experimental  andclinical  settings  and  may  be  considered  as

the  standard  vector  of  choice  for  manyapplications that need short­term therapeuticgene  expression.  However,  for  therapiesrequiring  long­term  therapeutic  geneexpression,  there  is  not  such  a  standardvector.  Also,  when  long­term  expression  ofthe  therapeutic  gene  is  desired,  distinctsafety  and  efficacy  concerns  need  to  beconsidered,  such  as  the  ability  to  regulatetherapeutic  gene  expression  within  thetherapeutic window,  to switch off expressionwhen  required  and  the  possibility  ofinsertional  mutagenesis  in  the  case  ofintegrating  vectors.  The  increased  data  onHIV­1 molecular biology has been applied togene therapy research to enable HIV­1 to beused as a gene therapy vector with a featureof  stable  integration  into  the  target  cellgenome.  With  the  latest  generation  HIV­1vectors, only a minute proportion of the viralgenome  is exploited, both  in  the vector andthe  production  system,  resulting  in  a  vectorwhich does not transfer any viral genes, thusattenuating safety concerns. This thesis hasfocused  on  the  development  and  applianceof  HIV­1  derived  lentiviral  gene  transfervectors  for  regulated  expression,  genesilencing and progenitor cell therapies. Also,the  efficacy  of  LV  in  animal  models  ofcardiovascular diseases is evaluated.

14

REVIEW OF THE LITERATURE

GENE THERAPY

General concept

The  basic  concept  of  gene  therapy  is  toinsert  genes  into  the  somatic  cells  of  anindividual  in  order  to  treat  a  disease,  eitherinherited  or  acquired.  Hereditary  diseasestargeted by gene  therapy usually aim at  thecorrection  of  the  function  of  one  abnormalgene.  However,  in  acquired  diseases  theactivity of several genes is disturbed and thedisease  caused  by  these  combined  effectsmakes the gene therapy approaches of suchdiseases less straightforward.

Cardiovascular diseases

Despite  major  advances  in  therapies,cardiovascular diseases  are still  the  leadingcause of death in the Western world and aretherefore attractive targets for gene therapy.Gene  therapy  approaches  have  beendirected  to  hyperlipidemias,  promotion  oftherapeutic angiogenesis in myocardium andskeletal muscle, post­angioplasty restenosis,hypertension, heart failure, the prevention ofthrombosis and the protection of vascular by­pass grafts (reviewed by Ylä­Herttuala et al.,2000,  Rissanen  et  al.,  2007,  Vincent  et  al.,2007).

To  date,  the  promotion  of  blood  vesselgrowth,  that  is,  therapeutic  angiogenesis,has  been  the  most  studied  aspect  ofcardiovascular  gene  therapy.  Gene  transferfor  therapeutic  angiogenesis  has  beentargeted  to  both  myocardial  and  lower  limbischemia,  which  are  induced  byatherosclerosis.  Genes  for  vascularendothelial growth factors (VEGFs) (Mack etal.,  1998, Gowdak  et  al.,  2000,  Arsic  et  al.,2003,  Rutanen  et  al.,  2004,  Stewart  et  al.,2006),  fibroblast  growth  factors  (FGFs)(Giordano  et  al.,  1996,  Ueno  et  al.,  1997,

Rissanen  et  al.,  2003a),  platelet­derivedgrowth  factors  (PDGFs)  (Richardson  et  al.,2001, Cao et al., 2003, Li et al., 2005b), andangiopoietins  (Arsic et  al., 2003, Cho et al.,2005)  have  been  the  mostly  usedtherapeutic  genes.  Several  clinical  trials  fortherapeutic angiogenesis  have  been  carriedout (Rissanen et al., 2007).

For  genetic  cardiovascular  diseases,  genetherapy  is  a  conceivable  treatment  optionespecially  for  familial  hypercholesterolemia(FH),  which  is  caused  by  the  lack  offunctional  LDL­receptor.  This  results  inserious  hyperlipidemia,  especially  inindividuals whose both alleles are defective.Promising  results  have  been  attained  withLDL­receptor  gene  transfer  targeted  to  theliver  in  animal  models  (Pakkanen  et  al.,1999, Kankkonen et al., 2004, Lebherz et al.,2004).

Other targets

Other  genetic  disorders  are  also  potentialcandidates  for  gene  therapy.  Probably  themost known gene  therapy studies are  thosedirected  to  the  primary  immunodeficiencydisorder  SCID/ADA  (Blaese  et  al.,  1995,Muul  et  al.,  2003).  Other  candidates  withpublished  gene  therapy  research  includecystic  fibrosis  (Flotte  et  al.,  2007),  inheritedmetabolic  disorders  like  phenylketonuria(Ding  et  al.,  2006),  lysosomal  storagedisorders  like  Gaucher’s  disease  (Sands  etal.,  2006),  hematological  disorders  likehemophilias,  hemoglobinopathies,  anemiasand  thalassemias  (Nathwani  et  al.,  2005)and  muscular  dystrophies  (Foster  et  al.,2006).

Cancer  gene  therapy  covers  a  number  ofalluring  treatment  options  for  different  typesof cancer. These applications can be dividedinto  three  subgroups:  immunotherapy,oncolytic therapy and gene transfer therapy.Immunotherapy  covers  the  studies  in  whicha cancer vaccine is produced by engineering

15

cancer cells to be more recognizable by theimmune  system.  This  can  occur  by  the invitro  transfer  of  gene  producing  moleculeswhich  are  pro­inflammatory  (Simons  et  al.,2006).  Oncolytic  gene  therapy  vectors  areviruses  which  are  modified  to  infect  cancercells  and  induce  cell  death  through  thepropagation  of  the  virus,  expression  ofcytotoxic proteins and cell  lysis  (Rein et al.,2005).  The  gene  transfer  concept  involvesthe  transfer  of  suicide  genes  (genes  thatcause  cellular  death  when  expressed)(Rasmussen  et  al.,  2002),  antiangiogenesisgenes  (Ohlfest  et  al.,  2005)  and  cellularstasis genes (Eastham et al., 2000). Suicidegene  therapy,  utilizing  herpes  simplex  virusthymidine kinase (HSV­tk) gene transfer to atumor followed by ganciclovir  treatment, hasshown  potential  in  the  treatment  of  themalignant  brain  tumor,  glioblastoma(Immonen et al., 2004).

In  addition  to  genetic  disorders  andglioblastoma,  there  are  a  number  of  otherpathologies  which  make  the  brain  animportant  gene  therapy  target  tissue.  Genetherapy  treatments  have  been  engineeredfor  neurodegenerative  disorders  likeAlzheimer’s  disease,  amyotrophic  lateralsclerosis,  Parkinson’s  disease  (Cardone,2007)  and  for  multiple  sclerosis  (Martino,2003),  CNS  injuries  (Murray  et  al.,  2001),epilepsy  (Noe'  et  al.,  2007)  andcerebrovascular diseases like stroke (Jacobset al., 2005).

Gene  therapy has also been studied  for thetreatment  of  viral  infections,  mostly  for  theHIV­1  infection  (Dropulic  et  al.,  2006).  Interms of endocrine and metabolic disorders,diabetes  is  probably  the  most  abundantlystudied (D'Anneo et al., 2006).

GENE TRANSFER VECTORS

Overview of vectors

Principles of gene transfer

Gene transfer aims at the delivery of nucleicacids across the cell membrane and into thenucleus  of  target  cells.  These  genes  areintroduced  into  the  cells  in  vectors.  Theefficiency  of  therapeutic  gene  transfer  isdependent  on  the  ability  of  the  vector  todeliver  the gene  into  target  cells and on thetransgene  expression  level.  Different  targettissues and cells require vectors with distinctproperties.  Also,  the  vector  choice  isdependent  on  the  application,  for  example,on  the desired duration of expression of  thetherapeutic  gene.  The  development  ofoptimal  gene  transfer  vectors  is  one  of  thekey issues in determining the applicability ofgene therapy in clinical settings.

Nonviral gene transfer vectors

The concept of nonviral gene transfer coversplasmid  vectors  or  oligonucleotides  whichare introduced into the cells either as nakedDNA or by chemical or physical approaches.Early  experiments  suggested  that  a  simpleinjection of naked DNA produced remarkablegene transfer efficiency  in the muscle (Wolffet al., 1990), liver (Hickman et al.,1994) andskin  (Choate  et  al.,1997).    However,  genetransfer  by  naked  plasmids  has  not  provenefficient  enough  for in  vivo  applications.  Interms  of  chemical  approaches,  DNA  isformulated  into  condensed  particles  byusing, for example; cationic lipids (Liu et al.,2003a)  or  polymers  (Neu  et  al.,  2005)  ascarriers.  These  compounds  are  useful  forenhanced  gene  transfer  efficiency in  vitro.Physical  approaches  for  gene  transferutilizing  mechanical  (particle  bombardmentor  gene  gun),  electric  (electroporation),ultrasonic,  hydrodynamic  or  laser­basedenergy to penetrate the cell membrane havebeen  explored  (Gao  et  al.,  2007).  Although

16

these methods may be efficient in vitro, theyhave not shown remarkable potency in vivo.In  conclusion,  nonviral  vectors  have  notbeen able to  improve upon the performanceof viral vectors to date.

Viral gene transfer vectors

In  viral  vectors,  parts  of  the  native  viralgenome have been deleted and replaced bygenetic elements needed  for  the expressionof the therapeutic gene. Genetic engineeringhas meant that viral vectors do not carry thegenetic elements needed for the formation ofall  the  essential  components  of  a  virusparticle such as viral structural proteins andenzymes.  Therefore,  they  are  not  able  toreplicate  and  are  not  infectious.    Elementsfor viral vectors are provided in trans by virusproducing systems such as helper constructsor packaging cell lines, increasing the safetyof  the  vectors.  The  tropism  of  viral  vectors,that  is  the  ability  to  transduce  cells  ofdifferent tissue types or animal species, maybe modified by coating the viral particle withenvelope  proteins  from  another  virus  withknown specificity.

Vectors based on DNA viruses

Adenoviral  vectors  are  non­enveloped,double stranded DNA vectors, which delivergenes  efficiently  into  a  wide  variety  of  cellsboth in  vitro  and in  vivo,  and  are  the  mostwidely  used  viral  vectors  so  far.  Wild­typehuman adenoviruses are a general cause ofbenign  respiratory  and  other  infections  inhumans.  Approximately  50  serotypes  ofadenovirus  have  been  identified  and  genetherapy  vectors  derived  from  serotypes  2and 5 are most commonly used. Adenoviralvectors  are  able  to  transduce  both  dividingand  non­dividing  cells.  Their  genomeremains  extrachromosomal  in  the  host  cellresulting  in  a  transient  expression  of  thetherapeutic  gene.  Conditionally  replicatingadenoviral  vectors  have  shown  promise  incancer  gene  therapy  (Carette  et  al.,  2007,

Ranki  et  al.,  2007).  However,  a  majorproblem  of  adenoviral  vectors  is  theirimmunogenicity  and  toxicity  (Liu  et  al.,2003b).  In  fact,  on  one  occasion,  genetherapy  using  adenoviral  vector  deliverycaused  the death  of  a  patient  involved  in  aclinical  trial  for  the  treatment  of  ornithinetranscarbamylase  deficiency  due  to  a  hugeimmune  response  triggered  by  the  vector(Marshall, 1999).

Adeno­associated  virus  (AAV)  derivedvectors  are  single­stranded  DNA  vectors.The  prototype  of  AAV gene  therapy  vectorsis  based  on  serotype  2.  However,  recentdata  from  mouse  experiments  has  shownthat  vectors  derived  from  AAV  serotype  8show superior tropism for the liver (Nakai etal.,  2005)  and  those  from  serotype  6  forcardiac and skeletal muscles  (Gregorevic etal.,  2004).  Also,  serotype  9  vectors  havebeen  shown  to  transduce  the  myocardiummore  efficiently  than  serotype  8  vectors(Inagaki et  al., 2006). AAV vectors are ableto  transduce  both  dividing  and  quiescentcells  and  although  they  remainextrachromosomal,  long­term  geneexpression  is  achieved.  In  one  clinical  trial,the duration  of  therapeutic  gene  expressionfor  up  to  several  years  has  been  reported(Jiang  et  al.,  2006).  Native  AAV  is  aparvovirus that is non­pathogenic in humans.In  addition,  AAV  vectors  are  considered  tobe rather low in immunogenicity. However, amajor  drawback  is  the  cumbersome  virusproduction  procedure,  which  is  extremelydifficult to upscale (Xiao et al., 1998).

Other  less  frequently  used  gene  transfervectors derived from DNA viruses are  thosefrom  baculovirus  (Lehtolainen  et  al.,  2002),herpex simplex virus  (Gao et al., 2006) andEpstein­Barr ­virus (Hellebrand et al., 2006).

Vectors based on RNA viruses

Retroviral  vectors  are  based  on  RNAviruses. The most extensively used retroviral

17

vectors are  those derived  from oncoviruses,such  as  murine  leukemia  virus  (MLV)  orlentiviruses  (LV),  such  as  humanimmunodeficiency  virus­1  (HIV­1),  simian(SIV),  equine  (EIAV)  or  feline  (FIV)immunodeficiency  viruses  (reviewed  by(Sinn  et  al.  2005)).  Retroviral  vectors  carrytheir genetic information in the form of singlestranded  RNA  (ssRNA).  In  the  target  cell,viral  RNA  is  reverse­transcribed  into doublestranded DNA, which  is  then  integrated  intothe  host  cell  genome  resulting  in  long­termtransgene  expression.  The  prototype  ofretroviral  gene  transfer  vectors  is  derivedfrom MLV (Mann et al., 1983). MLV vectorsare only able to transduce dividing cells andthey have been used for both ex vivo and invivo  applications.  In  clinical  trials,  MLVvectors have been used for the treatment ofcancer,  inherited  and  acquired  monogenicdisorders  and  AIDS.  However,  in  a  trial  forthe treatment of X­linked SCID patients withMLV  vector  gene  transfer  to  hematopoieticstem cells ex vivo, vector induced leukemiaswere  reported  raising  safety  concerns(Hacein­Bey­Abina et al., 2003).  In contrast,there  have  been  no  reports  of  insertionalmutagenesis  in  ADA/SCID  patients  treatedwith  MLV  vector  gene  transfer  tohematopoietic stem cells  (Aiuti et al., 2007).Thus,  the  risks  of  insertional  mutagenesismay  depend  on  the  vector  system,  thetargeted cell types, the site of integration, thetransgene and the underlyingimmunodeficiency,  as  suggested  by  themolecular  analysis  of  the  three  affectedpatients’ cells from the X­SCID trial (Hacein­Bey­Abina et al., 2003).

In contrast to MLV vectors,  lentiviral vectors(LVs)  are  able  to  transduce  both  quiescentand dividing cells, which is an advantage formany  experimental  and  clinical  settings.  Ofthe lentiviruses used for gene transfer, HIV­1derived  vectors are  the most advanced  andowing  to  species­specific  restrictions,  it  islikely that they are more efficient than animalLVs  for  the  transduction  of  many  types  of

human  cells.  HIV­1  derived  vectors  aredescribed in detail in the next chapter.

Lentiviral HIV­1 derived vectors

HIV­1 biology and genome

In  the  late  1970s  and  early  1980s,  a  newsyndrome,  with  symptoms  of  immunologicdysfunction, was discovered in United Statesand Europe. A connective  laboratory  findingwas the depletion of CD4+ T­lymphocytes inaffected individuals. The disease was termedacquired  immunodeficiency  syndrome(AIDS). Later, a new retrovirus was isolatedfrom  both  AIDS  patients  and  infected,asymptomatic  individuals  from  various  riskgroups.  The  new  retrovirus  causing  a  slow,progressive  disease  affecting  the  immunesystem  and  exhibiting  morphologic  andgenetic  characteristics  typical  of  thelentivirus  genus  (Lentivirinae),  was  namedhuman immunodeficiency virus  (HIV)  (Coffinet al., 1986) and subsequently HIV­1. Otherlentiviruses  include  HIV­2  and  nonhumanlentiviruses  such  as  the  felineimmunodeficiency virus (FIV) of cats, simianimmunodeficiency  virus  (SIV)  of  monkeys,bovine  immunodeficiency  virus  (BIV)  ofcattle, equine infectious anemia virus (EIAV)of  horses,  Maedi/Visna  virus  and  caprinearthritis  encephalitis  virus  of  sheep  andgoats.

Retroviral  virion  particles  are  spherical  inshape and surrounded by a  lipid membranebilayer  envelope  with  projections  ofglycoproteins.  There  is  a  spherical  layer  ofprotein under the membrane and an internalnucleocapsid whose shape varies from virusto virus. The members of the lentivirus genusare  complex  retroviruses  with  themorphology of cylindrical or conical cores.

Typically,  all  retroviruses  carry  three  majorgenes that are critical for retroviral replicationand assembly, gag, pol  and env.  The morecomplex  retroviruses  contain  accessory

18

genes  that  are  essential  or  contribute  toefficient  virus  replication  and  persistence.HIV­1 encodes six additional genes: tat, rev,vif, vpu, vpr,  and nef.  (Figure  1  and Table1). The HIV­1 virion has a diameter of ~110nm.  The  viral  SU  and  TM  glycoproteins  areinserted into the lipid membrane surroundingthe  nucleocapsid.  Proteins  within  the  innershell  of  a  mature  virion  are  cleavageproducts  of  the  Pr55gag  and  Pr160gag­pol

polyproteins.  The  condensed  inner  core  isformed  by  the  capsid  protein  (CA),  p24.Between  inner  core and the  lipid membraneis  the  matrix  protein  (MA),  p17,  whichremains associated with the lipid membrane.The  virion  core  contains  two  copies  of  thesingle­stranded  genomic  RNA  to  which  the

NC protein is bound. Also packaged into thevirion  are  the  host  transfer  RNA;  tRNA3

Lys,and  the  viral  proteins  RT,  PR,  IN,  Vif  andVpr. (Haseltine, 1991)

The HIV­1 life cycle

The HIV­1  replication cycle, started with  theviral  genome  integrated  into  a  hostchromosome,  leads  to  expression  of  viralgene  products,  production  of  new  virusparticles,  infection  of  a  new  cell  andreintegration of  the viral genome. The HIV­1life cycle may be split  into 15 steps (Frankelet al., 1998). These are illustrated in Figure2 and are described below.

Figure 1. Diagram of  the HIV­1 genome and virion structure. The genome is flanked by  longterminal  repeat  (LTR).  Nine  genes  (gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu  and nef)  encode  15proteins, see Table 1 for descriptions. Modified from Frankel et al., 1998.

19

Figure 2. The HIV­1 life cycle. Details for the numbered steps can be found in the text. Picturemodified from Frankel et al., 1998.

Viral  transcripts  are  expressed  from  thepromoter  located  in  the  5’  long  terminalrepeat  (LTR)  (1),  with  Tat  greatlyenhancing  the  rate  of  transcription.  ViralRNAs  are  then  transported  from  thenucleus into the cytoplasm where they canbe translated or packaged (2). This step isregulated  by  Rev.  Some  viral  RNAs  aretranslated  by  ribosomes  in  the  cytoplasmto  form  Gag  and  Gag­Pol  polyproteins,which  localize  to  the  cell  membrane  (3).The  Env  mRNA  is  translated  at  theendoplasmic  reticulum  and  formscomplexes  with  the  co­expressed  HIV­1cell­surface  receptor CD4. The virion coreparticle  is  constructed  from  the  Gag  andGag­Pol  polyproteins  which  are  laterprocessed  into  subunits  (see Table1),accessory  proteins  Vif,  Vpr  and  Nef,  andthe genomic RNA (4). The immature virionbegins  to  bud  from  the  cell  surface.  Toprovide  surface  (SU)  and  transmembrane(TM)  proteins  for  the  virion  outer

membrane,  the  Env  polyprotein  must  bereleased from the complexes it has formedwith  CD4.  Vpu  assists  this  process  bypromoting  CD4  degradation  (5).  Env  istransported  to  the  cell  surface,  where  itmust be protected from binding to CD4 (6).Nef promotes endocytosis and degradationof  surface  CD4  (7).  As  the  virion  particlebuds  and  is  released  from  the  host  cellsurface  (8),  it  undergoes  maturationinvolving proteolytic processing of the Gagand Gag­Pol polyproteins by protease (PR)and Vif (9). After budding, the mature virionis  ready  to  infect  another  cell.  This  isinduced  by  interactions  between  surfaceprotein  SU  and  CD4  receptor  and  CC  orCXC  chemokine  coreceptors  of  the  targetcell  (10). After binding,  the TM undergoesa  conformational  change  that  promotesvirus­cell  membrane  fusion  therebyallowing entry of the core into the cell (11).The virion core is then uncoated to exposea  viral  nucleoprotein  complex  containing

20

the  viral  proteins  matrix  (MA),  reversetranscriptase (RT), integrase (IN), Vpr andviral  RNA  (12).  During  the  microtubulebased  nuclear  transport  of  this  pre­integration  complex,  the  viral  single­stranded  RNA  genome  is  reverse

transcribed into double­stranded RNA (13).The viral replication cycle  is completed byIN  catalyzing  the  integration  of  the  viralDNA into a host chromosome (14).

Table 1. HIV­1 genes, gene products and their function. Modified from (Ramezani et al., 2002)

Gene Encoded protein(s) Function

Regulatory genes

tat Tat Trans­activation of geneexpressionNuclear export of late mRNAs

rev Rev Promotion of polysomalbinding to RRE­containingRNAs

Accessory genes

vif Vif Enhancement of virustransmissionNuclear transport of viralnucleoprotein complex

vpr VprInduction of G2 arrest individing cellsCD4 degradationvpu Vpu Virus maturation and releaseCD4 and MHC­1 down­regulationnef Nef Enhancement of virusreplication

Structural genes polyproteinscleaved into subunits

Formation of viral particlesgag

Pr55gag:matrix MA (p17), capsidCA (p24), nucleocapsidNC (p9), p6

Packaging of viral genomicRNA

Reverse transcription

Integrationpol

Pr160gag­pol:protease PR (p10),reverse transcriptase RT(p61/p52), integrase IN(p31) Virus maturation

env

gp160:surface SU (gp120),transmembrane TM(gp41)

Binding and entry into the hostcell

21

The  development  of  HIV­1  derivedgene transfer vectors

Like in any other viral gene transfer vectors,the  generation  of  replication­defective  LVsrequires  splitting  the cis­acting  sequences(vector  sequences)  needed  for  the  transferand expression of a transgene in target cellsand  the trans­acting  sequences  (packagingsequences)  encoding  the  essential  viralstructural  and  enzyme  proteins,  ontoseparate  genetic  units.  The  tropism  of  viralvectors  is  broadened  by  pseudotyping;  viaencapsidation  of  the  viral  particle  with  theenvelope  of  another  virus.  LVs  are  mostlypseudotyped  with  vesicular  stomatitis  virusG­protein  (VSV­G),  which  is  pantropic  andhighly stable. The  transfer vector plasmid iscotransfected  with  the  packaging  andenvelope  plasmids  into  a  cell  line  wherevirions are produced. Virions are assembledof  viral  proteins  encapsidating  thereplication­defective transfer vector RNA.

The  HIV­1  derived  transfer  vector cis­actingsequences  include  viral  LTRs,  the  primerbinding  site,  the  packaging  signal,  the  Revresponsive  element,  and  an  internalpromoter  linked  to  a  transgene  of  interestconstituting  a  transcriptional  unit  (Naldini  etal.,  1996).  The  genetic  elements  derivedfrom  HIV­1  are  required  for  viralencapsidation,  reverse  transcription  andintegration. Like MLV retroviral vectors, HIV­1  vectors  do  not  transfer  viral  codingsequences  into  target  cells,  meaning  thatcells transduced with the HIV­1 vector do notexpress any viral proteins.

HIV­1  transfer  vectors  have  been  modifiedby  introducing  various  internal  promotersdriving  transgene  expression,  and  by  theinclusion  of  genetic  elements  such  as  thecentral DNA flap and the post­transcriptionalelement.  The  central  DNA  flap  is  a  99nucleotide­long  overlap  formed  after  nativeHIV­1 reverse transcription and it is involved

in  the  import  of  the  HIV­1  preintegrationcomplex  into  the nucleus. The sequence  forthis  element,  the  central  polypurine  tract(cPPT),  was  omitted  from  early  generationHIV­1  vectors  but  has  been  routinelyincluded  in  current  vector  designs  becauseof  its  beneficial  effect  on  gene  transferefficiency  (Follenzi  et  al.,  2000).  Thewoodchuck  hepatitis  virus  post­transcriptional  regulatory  element  (WPRE)sequence  is  also  commonly  included  incurrent  HIV­1  vectors.  This  element  hasbeen  shown  to  enhance  transgeneexpression  from  several  types  of  promoters(Deglon  et  al.,  2000)  by augmenting mRNA3’­end processing and polyadenylation.

The  HIV­1  vector  packaging  systems  havebeen  extensively  developed.  The  first­generation  packaging  systems  comprisedthree  expression  plasmids:  the  transfervector,  the  plasmid  for  VSV­G  envelopeprotein  production  and  the  packagingconstruct  (Naldini  et  al.,  1996).  In  thissystem,  only  two  of  the  nine  native  HIV­1genes, vpu  and env,  were  deleted.Subsequently, it was shown that none of thefour  HIV­1  accessory  genes vif, vpr, vpu  ornef  were  required  for  efficient  production  ofVSV­G  pseudotyped  vector  particles(Zufferey  et  al.,  1997).  Therefore,  thesecond­generation  packaging  system  onlyutilized  HIV­1 gag, pol, rev  and tat  genes,which further attenuated the potential for thegeneration of replication­competent viruses.

For the currently used third­generation HIV­1vector  system,  several  additionalmodifications have been made to ensure thesafety  of  these  vectors.  Firstly,  they  havebeen  modified  to  self­inactivate  (SIN)  bydeleting  the  promoter  sequences  of  the  U3region  of  the  3’LTR  (Miyoshi  et  al.,  1998).Since the U3 region of the 3’LTR serves as atemplate  for  the  U3  regions  of  both  LTRs,the provirus carries the deletion in both LTRsafter  reverse  transcription.  As  a  result,  the

22

LTRs  of  the  integrated  vector  are  almostcompletely  inactivated.  The  inability  totranscribe  full­length  vector  RNA  minimizesthe  chance  of  replication­competent  virusgeneration  and  reduces  the  potential  ofoncogene  activation  by  promoter  insertionalmutagenesis.  To  avoid  the  reconstitution  ofdeleted  U3  sequences  by  homologousrecombination with intact 5’ LTR during viralvector  production,  the  U3  region  of  the  5’LTR  is  replaced  with  a  heterologouspromoter,  usually  a  cytomegalovirus  (CMV)promoter.  Since  the  LTR  promoter  isdependent on Tat interaction, the use of  theCMV promoter  allows tat  gene  independentproduction  of  viral  vectors.  Therefore,  fromthe  third­generation  HIV­1  vector  packagingsystem, tat  is  deleted.  This  has  enabledfurther  refinement  of  the  packaging  systemfor increased safety, such as the expressionof gag­pol and rev genes from two separatenonoverlapping  plasmids.  With  40%  of  thewild­type  virus  genome  (three  out  of  ninegenes)  left,  the  parental  virus  can  not  bereconstituted  from  such  an  extensivelydeleted  packaging  system.  Also,  in  theabsence  of  overlapping  viral  sequences  therisk  of  recombination  events  betweencomponents of the viral production system isabolished,  further  limiting  the  possibility  toyield replication­competent vectors. To date,replication­competent  vector  production  hasnot  been  associated  with  the  production  ofHIV­1 lentiviral vectors.

Applications  of  HIV­1  derived  genetransfer vectors

HIV­1  derived  gene  transfer  vectors  showefficient  delivery,  integration  and  long­termexpression  of  transgenes  in  both  dividingand  nondividing  cells,  thus  making  themexcellent  vehicles  for  basic  studies  of  geneoverexpression  and  knockdown.  As  such,they  represent  an  attractive  tool  for  mostpotential  targets  of  gene  therapy,  whetherthe targets are early precursors or terminallydifferentiated  cells.  While  third  generation

HIV­1 vectors are able to  transduce virtuallyall  types  of  cells in  vitro,  it  seems  that  theaccessory  protein,  Vpr,  is  important  for  thetransduction  of  macrophages  andhepatocytes (Naldini et al., 1996, Kafri et al.,1997).  Also,  although  HIV­1  vectors  do  notrequire  cell  division,  like  the  native  HIV­1virus,  they  are  unable  to  successfullytransduce T lymphocytes during the G0 stageof the cell cycle. This is due to blocks at thelevels  of  reverse  transcription  and  nuclearimport.  However,  HIV­1  vectors  mediateefficient  stable  transduction  of  many  celltypes  which  are  poorly  transduced  by  othervectors.  For  example,  gene  transfer  toprogenitor and stem cells is one of the mostimportant  applications  of  HIV­1  derivedvectors.

Embryonic  stem  cells  (ESCs)  are  cellsderived  from the  inner cell mass of an earlyembryo.  They  can  be  maintained  in  anundifferentiated state indefinitely and can begenetically  manipulated in vitro  withoutlosing  their  differentiation  potential.  Thisunique property of ESCs suggests that  theymay  provide  a  useful  tool  to  analyzedevelopmental  pathways  and  are  apromising  cell  source  for  transplantationtherapies.  Efficient  genetic  manipulation  ofESCs  is  critical  for  both  development,biology  research  and  for  maximizing  thetherapeutic potential of ESCs. HIV­1 derivedvectors have been shown to efficiently drivetransgene  expression  in  mouse  (Kosaka  etal.,  2004)  and  human  (Gropp  et  al.,  2003)ESCs. ´

Of  all  blood  cell  types,  only  hematopoieticstem  cells  (HSC)  can  self­renew,  persistthroughout  a  lifetime  and  reconstitute  thewhole  lympho­hematopoietic  system  of  anindividual.  HIV­1  LVs  can  efficientlytransduce ex vivo mouse (Moreau­Gaudry etal.,  2001),  non­human  primate  (Horn  et  al.,2002)  and  human  (Miyoshi  et  al.,  1999)HSCs in the absence of cytokine stimulationand  cell  cycle  induction.  This  is  important

23

because  culture  conditions  which  facilitatethe proliferation of HSCs without  the  loss oftheir  stem  cell  capacity  have  not  beenidentified.  HIV­1  derived  LVs  efficientlytransduce  human  CD34+  cells,  aheterogenous  population  of  HSCs  andprogenitor  cells.  The  LV­transduced  CD34+

cells  are  capable  of  engraftment  and  multi­lineage  differentiation  in  NOD/SCID  (non­obese  diabetic/severe  combinedimmunodeficient) mice (Miyoshi et al., 1999).Such  genetically  modified  cells  can  bepassed  to  secondary  transplants  (Woods  etal.,  2000)  which  further  confirms  thetransduction  of  true  HSCs  and  not  only  themultipotent progenitor cells.

The  stereotactic  injection  of  HIV­1  LV  wasthe model initially used to illustrate the abilityof these vectors to transduce nondiving cellsin  vivo  (Naldini  et  al.,  1996).  Numerousstudies have reported successful long­lastingand  efficient  transgene  expression  interminally  differentiated  neurons  of  rodentbrain  after  a  single  injection  of  only  a  fewmicroliters  of  high  titer  (magnitude  of  109

TU/ml)  vector  stock.  In  addition  to  neurons,LVs  are  able  to  transduce  most  cell­typeswithin  the CNS in vivo,  including astrocytes,oligodendrocytes,  adult  neuronal  stem  cellsand  glioma  cells  (Jakobsson  et  al.,  2003,Consiglio  et  al.,  2004,  Miletic  et  al.,  2004).LVs  have  a  property  of  highly  efficientretrograde  transport  providing  access  to  awide area of the brain after a single injection,thus  enabling  potential  therapy  for  widelydisseminating  neurological  disorders.  Also,the delivery of ex vivo LV transduced HSCstrafficking  to  the  CNS  has  been  exploited.Promising  therapeutic  effects  of  HIV­1  LVmediated  gene  transfer  has  beendocumented in animal models of Alzheimer’sdisease  (Dodart  et  al.,  2005),  Huntington’sdisease  (de  Almeida  et  al.,  2001),Parkinson’s disease (Kordower et al., 2000),amyotrophic  lateral sclerosis (ALS, Raoul etal.,  2005a)  and  lysosomal storage diseases(Biffi et al., 2004). Also, LV gene transfer has

been  utilized  in  the  development  of  newanimal  models  of  Huntington’s  (Regulier  etal.,  2003)  and  Parkinson’s  disease  (LoBianco  et  al.,  2002).  In  these  models  LVgene  transfer  has  been  used  to  induceoverexpression  of  the  mutated  form  ofprotein present in these diseases.

The  liver  is  an  important  target  tissue  forgene  therapy  because  of  the  numerousgenetic  defects  that  cause  defects  in  liverfunction  resulting  in  severe  disorders  suchas  hemophilia  A  and  B  and  FH.  Also,  theliver  is  a  target  of  chronic  virus  infectionssuch  as  hepatitis  B  and  C.  Despite  theregeneration  capacity  of  the  liver,hepatocytes  divide  only  occasionally  in  theadult. Several studies have reported that LVscan  transduce  nondividing  rodent  andhuman hepatocytes, both ex vivo and in vivo(Kafri  et  al.,  1997,  Nguyen  et  al.,  2002,VandenDriessche et al., 2002, Follenzi et al.,2004). However, mouse studies have shownhigher  LV  gene  transfer  efficiency  inneonates  and  after  partial  hepactomy  (Parket al., 2000, Ohashi et al., 2002, Park et al.,2003),  suggesting  that  proliferatinghepatocytes  are  more  prone  to  LVtransduction.  Some  properties  of  thearchitecture  of  the  hepatic  lobule  or  thetightness of the endothelial barrier in hepaticblood  vessels  may  be  influenced  by  livergrowth  or  regeneration,  thus  favouring  viralentry.  Alternatively,  it  has  been  suggestedthat the HIV­1 accessory protein Vpr, absentfrom  later  generation  LVs,  can  enhancehepatocyte  transduction  (Kafri  et  al.,  1997).However,  in  a  study  of  LV  mediated  LDL­receptor gene transfer in rabbit model of FH,a  long  term  therapeutic  effect  withouthepactomy  was reported (Kankkonen  et  al.,2004). Although only a modest gene transferefficiency  of  0.01%  of  the  liver  cells  wasachieved,  the  results  showed  a  significant(44%)  decrease  in  the  serum  cholesterollevel  of  the  treatment  group  at  a  one  yeartimepoint  compared  to  controls.  These

24

results  support  further  research  of  LVmediated liver gene therapy.When  the  early  generations  of  HIV­1  LVswere  developed,  high  expectations  of  theirperformance  in in  vivo  gene  therapyapplications  were  raised.  So  far,  theseexpectations  have  been  fulfilled  only  in  thetargets of the central nervous system (CNS),lympho­hematopoietic  system  and  to  alesser  extent  in  the  liver.  More  work  isneeded  to  evaluate  the  true  utility  of LVs  intargeting  tissues  such  as  skeletal  muscleand  the  myocardium.  The  first  clinical  trialutilizing HIV­1 LV  for the  treatment of HIV­1infection is currently in process (Levine et al.,2006).  In  this study, an  antisense  approachagainst  the  HIV­1  envelope  was  utilized  byex  vivo  transduction  of  the patients’  T­cells.A  LV  with  wild­type  LTRs  was  used  andtherefore,  expression  of  the  antisensesequence  was  up­regulated  upon  the  wild­type  HIV­1  infection  of  the  vector  bearingcell.  The  results  demonstrate  safe  andefficient gene delivery and good persistencein  vivo  and  also,  an  improvement  of  theimmune  function  in  four out of  five patients.However,  the use  of  LV  in patients  infectedwith wild­type HIV­1 presents a problem, thepotential of the wild­type virus to infect a cellmodified by the vector. As a result,  the wild­type virus infection would mobilize the vectorgenome by packaging it and transferring it tonew cell. For HIV­1 patients, such a spreadof  the  vector  might  actually  be  beneficial.However,  it  poses  complex  biosafety  andethical problems and should be avoided. Thepatients  from  this  trial  were  monitored  forover  one  year  (Levine  et  al.,  2006).  Only  along­term follow­up after at least three yearswill reveal the true safety of such treatment.Nonetheless,  based  on  the  results  from  thefirst  clinical  trial  with  LV,  it  possesses  thepotential  to  be  used  for  the  therapiesinvolving prior ex vivo genetic modification ofcells of the lympho­hematopoietic system.

A  few  years  ago,  lentiviral  HIV­1  derivedvectors  made  a  breakthrough  in  the

generation  of  transgenic  animals  (reviewedin Park, 2007). Previously, transgenesis hasbeen  achieved  by  pronuclear  injection  ofnaked  DNA.  This  is  a  rather  inefficient  andtricky  technique  requiring  a  clearly  visibleoocyte  pronucleus  mostly  inapplicable  tospecies  other  than  mouse.  Also,  mousetransgenesis  utilizing  MLV  retroviral  vectorsfailed  as  a  result  of  transgene  silencingduring  development  (Cherry  et  al.,  2000).HIV­1  LVs  have  been  successfully  used  togenerate  transgenic  mice  and  rats  by  thetransduction  of  single­cell  embryos,  earlyblastocysts or embryonic stem cells  (Lois etal.,  2002,  Pfeifer  et  al.,  2002).  In  theseexperiments,  LV  mediated  transgenesisresulted  in  very  high  embryo  viability  with80%  of  mice  carrying  the  provirus.  UnlikeMLV retroviral vectors, HIV­1 LVs appear toescape  epigenetic  silencing.  The  reason  forthis remains unknown but might be linked todifferent  integration  site  preferences.  MLVvectors  have  been  found  to  integratepredominantly  close  to  transcriptional  startregions  and  CpG  islands  (Wu  et  al.,  2003).In  contrast,  LVs,  studied  to  date,  integrateacross  the  entire  transcribed  gene  regionwith  no  preference  to  the  proximity  to  thetranscriptional  start  site.  Also,  LV  genomescontain fewer CpG dinucleotides susceptibleto  cytosine  methylation  than  the  onco­retroviral vectors, which may partially explainthe  finding  that  they  are  less  prone  tosilencing.  Successful  LV­mediatedtransgenesis  has  also  been  extended  tolarger  animal  species  including  cattle(Hofmann et al., 2004) and pig (Hofmann etal., 2003).    In addition  to offering models ofhuman diseases, especially large transgenicanimals  may  find  applications  in  futurebioindustry  for  example  as  producers  ofhuman proteins for drug use or as a potentialsource  of  humanized  organs  fortransplantation.

25

CELL THERAPIES FORCARDIOVASCULAR DISEASES

General concept

Among  treatment  options  for  cardiovasculardiseases,  there  is  a  definite  need  foralternative  therapies,  particularly  foradvanced and severe disease. Experimentalstudies  have  indicated  that  progenitor  orstem  cells  derived  from  different  sourcespossess  regenerative  capacity  in  the  heartand  vasculature,  which  has  raisedexpectations  of  clinically  applicable  celltherapy  for  tissue  repair  in  cardiovasculardiseases.  The  initial  concept  for  thisresearch  was  based  on  the  cell  plasticity­hypothesis,  which  suggests  that  progenitorcells  can  transdifferentiate in  vivo  acrossgenerally  agreed  tissue  lineage  boundaries.The concept of plasticity has, however, beenchallenged by data proposing that HSCs arecommitted  to  differentiate  into  cells  ofhematopoietic  lineages  and  do  not  own  thecapacity  to  transdifferentiate  (Wagers  et  al.,2002). Cell  fusion has since been proposedas  an  alternative  explanation  for  observedtransdifferentiation  events.  On  the  otherhand,  by  secretion  of  paracrine  factors,progenitor cells might affect vasculogenesis,tissue  repair  and  remodelling  without  theneed  to  undergo  transdifferentiation  or  cellfusion.  Also,  stem  cell  niches  have  beenidentified  from  myocardium.  The  concept  ofstem  cell  niche  covers  the  local  tissueenvironments of surrounding cells which areimportant  for  the  regulation  of  stem  cellscontrolling  and  balancing  self­renewal  anddifferentiation  (Moore  et  al.,  2006,  Morrisonet  al.,  2008).  There  is  evidence  of  nestingcardiac  stem  cells  and  progenitors  that  areconnected  structurally  and  functionally  tomyocytes  and  fibroblasts  by  junctional  and

adhesion  proteins,  such  as  connexins  andcadherins  (Urbanek  et  al.,  2006).  A  novelfascinating  mechanism  proposed  to  play  arole in cell therapy is the putative stimulationof endogenous tissue repair pathways whichmight  contribute  to  the  regeneration of stemcell niches (Mazhari et al., 2007).

With  the  evolving  experimental  data,  theconcept  of  cell  therapy  for  cardiovasculardiseases has shifted from the original idea ofprogenitor  cells  taking  part  in  theregeneration  of  injured  myocardium  orskeletal  muscle  or  playing  a  part  in  theinduction  of  angiogenesis  by  the  directinvolvement  of  progenitor  cells  into  newlyforming  vessels.  Instead,  a  broaderhypothesis  suggests  that  cell  therapy  mightin  fact  facilitate  complementary  aspects  oftissue repair (Figure 3). These effects mightinclude  augmentation  of  cell  survival  (forexample,  in  limiting  apoptosis),  tissueoxygenation  by  angiogenesis  orimprovement  in  positive  tissue  remodelling.The  most  potent  target  diseases  for  celltherapy  include  myocardial  infarction,ischemic  cardiomyopathy  and  peripheralvascular  disease  causing  skeletal  muscleischemia in lower limbs.

Cell types and sources

Several  sources  of  progenitor  cells  forcardiovascular  cell  therapy  exist  in  adults,including  unfractioned  or  fractionedhematopoietic  and  mesenchymal  stem  cellsfrom  bone  marrow,  circulating  progenitorcells,  skeletal  myoblasts  and  residentprogenitor  cells  for  example,  from  adiposetissue.  Also,  cord  blood  HSCs  andcardiomyocytes  derived  from  embryonicstem cells have been used in animal models.

26

Figure 3. A working hypothesis of cell therapy for myocardial and skeletal muscle regeneration.Cell  therapy  can  have  a  favourable  impact  on  tissue  healing  by  alternative  mechanismspresented  in  the  figure.  Stem  and  progenitor  cell  numbers  and  functional  capacity  areinfluenced by a patient’s age, gender, cardiovascular risk factors and underlying disease statewhich  all  contribute  to  the  natural  response  in  the  injured  tissue  and  also  to  preparation  ofautologous cell preparations for therapy. Figure modified from Wollert et al., 2005.

For  cardiovascular  gene  therapy,  bonemarrow  has  been  proposed  as  a  source  ofhematopoietic,  vasculogenic  andmesenchymal stem cells. Initial experimentalevidence  suggested  a  significant  degree  ofmyocardial  regeneration  by theadministration of lineage negative c­kit+ bonemarrow  mononuclear  cells  (BMCs)  into  amurine model  of myocardial  infarction  (Orlicet  al.,  2001).  However,  this  has  beenquestioned  by  subsequent  studies  showinglittle  or no  tissue  integration  of  these  BMCsin  similar  animal  models  (Balsam  et  al.,2004,  Murry  et  al.,  2004).  These  findingschallenged  the  paradigm  of  BMCtransdifferentiation, although did not excludethe possibility that such cells could potentiatemyocardial  repair  by  other  mechanisms.Bone  marrow  mesenchymal  stem  cells

(MSCs) are a component of marrow stroma.They  are  self­renewing,  clonal  precursors,which  expand  easily  in  culture,  exhibitmultipotency  and  have  also  been  shown  todifferentiate  to  cardiomyocytes and vascularcells  (Jiang  et  al.,  2002).  Endothelialprogenitor cells (EPCs) have been proposedto  induce  angiogenesis  and  re­endothelization  in  the  models  of  ischemiaand  vascular  injury  (Madeddu  et  al.,  2004,Nowak et al., 2004). Mechanisms suggestedfor  EPC­mediated  angiogenesis  includeintegration  of  the  EPC  into  newly  formedmicro­  and  macrovessels  and  the  secretionof  growth,  survival  and  cell­modulatoryfactors.  EPCs  have  been  identified  andenriched  from  bone  marrow  and  peripheralblood by the expression of  surface antigenssuch as CD31, CD133, VEGFR­2 and Tie­2.

27

Whether  these  cells,  exhibiting  endothelialplasticity,  offer  a  significant  therapeuticadvantage remains unclear in the absence ofconvincing data.

Skeletal  myoblasts  are  satellite  progenitorcells in muscle. In response to muscle injury,they  are  able  to  proliferate  and  fuse  toregenerate  new  multinucleated  cells.  Thepotential  advantage  of  using  these  cells  incell  therapy  applications  include  theirautologous  origin,  ease  of  isolation,  high invitro  proliferative  capacity, in  vivo  ischemictolerance  and  myocyte  restricted  lineagecommitment  which  limits  the  risk  ofoncogenetic  transformation  (Deasy  et  al.,2004).  In  animal  models  of  myocardialischemia,  autologous  skeletal  myoblastsaugmented contractile function (Taylor et al.,1998)  and  findings  from  clinical  studiessuggested  that  implanted  myoblastsengrafted  viably  in  scarred  myocardium(Pagani  et  al.,  2003).  The  enthusiasm  formyoblast  therapy  has  faded  by  the  lack  ofevidence for cardiomyocyte differentiation ofmyoblasts  and  further,  due  to  arrhytmiasobserved  in  a  clinical  trial,  presumablycaused  by  the  inability  of  myoblasts  tointegrate  into  the  conduction  system  of  theheart  (Menasche  et  al.,  2003).  Recently,  apopulation  of  myoendothelial  cells  withmultilineage  capacity,  including  skeletal  andcardiac  muscle  regenerative  potential,  hasbeen identified within human skeletal muscle(Zheng  et  al.,  2007).  Further  research  willshow whether these cells, showing myogenicand  endothelial  properties,  can  beenvisioned as a therapy for muscle diseases.

The  ability  of  human  embryonic  stem  cell(ESC)  derived  cardiomyocytes  to  surviveand  integrate  structurally  and  functionallyinto  healthy  and  post­infarct  cardiac  tissuehas  been  demonstrated  in  animal  models(Kehat  et  al.,  2004,  Laflamme  et  al.,  2005,Xue  et  al.,  2005,  Caspi  et  al.,  2007).  Therecent  breakthrough  findings  show  thatmouse  and  human  fibroblasts  can  be

reprogrammed  to  pluripotent  ESC­like  cellsby  the  transfer  of  three  to  four  transcriptionfactor  genes  (Takahashi  et  al.,  2006,Takahashi et  al., 2007, Wernig et al., 2007,Yu et al., 2007, Nakagawa et al., 2008).  Theresulting induced pluripotent stem cells havethe potential  to be used in future treatmentsfor cardiovascular diseases.

For  cell  therapy  research  of  cardiovasculardiseases  to  date,  bone  marrow  derivedprogenitor  cells  are  the  most  commonlyused.  An  important  issue  complicating  theinterpretation  and  comparison  of  bothexperimental  and  clinical  data  is  theheterogeneity of cell preparations, since bothunfractioned  mononuclear  cells  andfractioned  preparations  selected  for  CD34+

or CD133+ have been used.

Cell  therapy  combined  with  genetherapy

Gene  therapy  has  been  widely  applied  forthe therapy of cardiovascular diseases, mostpopularly  in  the  concept  of  angiogenicgrowth  factor  therapy  for  ischemicmyocardium or skeletal muscle. Although thebiological  effects  of such growth  factors  arewell  understood,  these  therapies  have  notproven  efficient  in  clinical  trials  presumablydue  to  the  limited  efficacy  of  current  genetransfer  technology.  One  approach  toimprove the delivery of growth  factors mightbe the combination of cell and gene therapyto utilize progenitor cells as carriers. After atransgene  is  introduced,  these  engineeredprogenitor  cells  would  home  into  the  targetarea and secrete  therapeutic proteins. Also,by gene  transfer,  the chemokine expressionprofile of the progenitor cell might be alteredto improve homing of endogenous progenitorcells  into  the  injured  area  (Askari  et  al.,2003).  Another  approach  using  cell  basedgene  therapy  is  to engineer  progenitor  cellsto  express  a  protein  which  is  not  secretedbut  modifies  the  biology  of  the  cell  itself.Such  a modification might  aim  at  improving

28

cell  survival  by  inhibiting  apoptosis  forexample  (Mangi  et  al.,  2003),  or  bystrengthening  resistance  to  ischemia  orscavenging free radicals.

Clinical trials and future prospects

Small  clinical  trials  have  focused  on  thesafety  and  feasibility  of  progenitor  celltherapy in cardiovascular diseases, includingischemic  cardiomyopathy  (Fuchs  et  al.,2003,  Perin  et  al.,  2003,  Tse  et  al.,  2003),peripheral  vascular  disease  (Tateishi­Yuyama  et  al.,  2002b)  and  myocardialinfarction (Strauer et al., 2002, Britten et al.,2003, Fernandez­Aviles et al., 2004, Wollertet al., 2004). While the safety of cell therapyhas  been  demonstrated  it  has  been  difficultto compare data because of variations in themethods  used.  These  include  variations  inroutes  of  cell  delivery,  preparation  of  cellsand chosen endpoint parameters for efficacyevaluation.  To  date,  several  randomized,controlled  trials  of  intracoronary  applicationof bone marrow cells for patients with acutemyocardial  infarction  have  been  reported(Chen  et  al.,  2004,  Bartunek  et  al.,  2005,Erbs  et  al.,  2005,  Hendrikx  et  al.,  2006,Janssens  et  al.,  2006,  Kang  et  al.,  2006,Meyer et al., 2006, Cleland et al., 2007). Thechange  in  the  left  venctricular  ejectionfraction  (LVEF)  after  cell  therapy  has  beenassessed  by  angiography,  magneticresonance  imaging  or  ultrasound  andcompared  to  a  control  group.  Statisticallysignificant  LVEF  improvements  have  beenobtained in some of the studies (Chen et al.,2004,  Erbs  et  al.,  2005,  Hendrikx  et  al.,2006,  Kang  et  al.,  2006,  Cleland  et  al.,2007). Nevertheless, it has been pointed outthat  these  improvements  in  myocardialfunction  are  not  likely  to  be  significant  in  aclinical context.  In fact, experts have agreedthat  before  pursuing  further  clinical  trials  abetter  understanding  of  the  mechanisms  ofprogenitor  cell  mediated  therapy,  themethods used to produce the therapeutic cellpreparations,  the  application  route,  the

timing  of  treatment  and  patient  selectionneeds to be attained (Bartunek et al., 2006).This will show the true potential of progenitorcell  therapy  as  a  clinical  treatment  forcardiovascular diseases.

GENE TRANSFER VECTORSWITH REGULATED GENEEXPRESSION

General concept

In  terms  of  both  experimental  and  clinicalgene  therapy  applications,  one  of  the  keyissues  is  the  ability  to  regulate  theexpression of a therapeutic gene, in order toproduce levels of protein within a therapeuticwindow,  and  to  switch  off  the  expression  ifdesired. Regulated gene  expression vectorsare  based  on  the  insertion  of  sequencesbinding  to  transcriptional  activatorspreceding  the  minimal  promoter.  Theseactivators  will  bind,  and  thus,  activate  geneexpression  when  a  particular  inducercompound  is  present.  Binding  is  eitherachieved  subsequent  to  a  conformationalchange  in  the  activator  or  byheterodimerization  of  two  distinct  factors,one  that  is  responsible  for  specific  DNAbinding  and  the  other  for  transcriptionactivation.  Regulated  gene  expressionsystems  consist  of  at  least  two  separateexpression  cassettes:  one  that  contains  thetranscriptional  activator  under  the  control  ofeither  a  constitutive  or  a  tissue  specificpromoter,  and  the  other  contains  atransgene under the control of the regulated,transcriptional activator responsive promoter.To  deliver  these  expression  cassettes  intotarget  cells,  either  two  separate  genetransfer vectors are used or, all the elementsare combined  into  a  single  vector.  To  date,tetracycline­dependent  gene  regulationsystems are the most utilized and advanced.These  and  some  other  commonly  appliedsystems  are  introduced  in  the  followingsections.  A  direct  comparison  of  different

29

regulation  systems  is  difficult  and  therefore,each system should be selected according tothe  requirements  of  the  particularapplication.  When  regulatable  geneexpression  is  used  in  clinical  applications,the pharmacology  of  the  inducer  drug playsa key role in selection of the system.

Tetracycline­regulated geneexpression

Tetracycline  (Tet)  –regulated  transcriptionalexpression systems have been adapted fromstudies  of  the E.coli  tetracycline  resistancemechanism (Hillen et  al., 1994).  In bacteria,the TetR  protein  inhibits  the  transcription  ofgenes  in  the  tetracycline­resistance  operonpresent  in  the  Tn10  transposon  by  dockingto  the Tet operator  (tetO) sequences,  in theabsence  of  tetracycline.  Therefore,  thetranscription  of  the  genes  needed  tometabolize  Tet  is  inhibited  by  TetR  in  theabsence  of  Tet.  When  Tet  is  present,  it  isbound  by  TetR,  inducing  a  conformationalchange, which results in the release of TetRfrom  tetO,  allowing  transcription.  In  the Tet­off  system  (Figure  4),  TetR  is  modified  tofunction  as  a  transcriptional  activator  byfusion  with  a  viral  protein  domain  VP16,  aeukaryotic  transactivator  derived  fromherpes  simplex  virus  type  1.  As  a  result,TetR  is  converted  from  a  transcriptionalrepressor  to an activator, and is  termed  theTet  transactivator  (tTA).  The  tTA  isexpressed  independently  of  the  tetracyclineresponse  element  (TRE,  a  framework  ofseven  tandem  sequences  upstream  of  aminimal  CMV  promoter)  ­driven  transgeneencoding cassette. In the absence of Tet thetTA  binds  to  the  TRE,  and  activatestranscription  of  the  transgene  from  anotherwise silent minimal promoter. When Tet

is  present,  it  binds  to  tTA,  which  is  thenreleased  from  tetO  and  transcription  is  nolonger  continued.  Thus,  Tet­off  systemdriven  gene  expression  is  switched  on  andoff  in  the  absence  or  presence  of  theinducer,  respectively.  As  an  inducing  drug,the  Tet  analog  doxycycline  (Dox)  is  oftenused.

When  mutations  were  randomly  introducedinto  the  TetR  part  of  the  tTA  a  separateprotein  was  produced  which  exhibitedopposite  binding  properties  and  led  to  thedevelopment  of  the  Tet­on  system  (Figure4). The mutant of tTA,  termed rtTA, triggerstranscription  by  activating  the  TRE  in  thepresence  of  the  inducer  Tet.  The  Tet­ongene  regulation  system,  that  utilizes  rtTA,has  been  widely  applied,  but  the  system  issomewhat  limited  with  respect  to  theprecision  of  regulation.  The  rtTA  has  beenfound  to  also  show  some  degree  of  affinityfor  tetO  sequences  in  the  absence  of  Tet,therefore  inducing a low basal  level of geneexpression  in  the  off  state.  To  furtherimprove  the Tet­on system,  the  inventors ofthe  system  screened  for  mutant  rtTAmolecules  in yeast to obtain a transactivatorwith  more  specific  binding  properties.  Onemutant  with  superior  features was  identifiedand  this  novel  transcriptional  activator  wasnamed  rtTA2SM2.  The  Tet­on  system  withrtTA2SM2  showed  negligible  basalexpression and was fully induced with a 10­fold  lower  Dox  concentration  than  rtTA(Urlinger et al., 2000). To date, the rtTA2SM2has been successfully used in a wide varietyof  applications  (Lamartina  et  al.,  2002,Chenuaud  et  al.,  2004,  Vogel  et  al.,  2004,Pluta et al., 2005).

30

Figure  4. Components  of  the  Tet­off  and  Tet­on  gene  expression  regulation  system.  Bothsystems  consist  of  two  transcriptional  units:  one  for  the  expression  of  transactivator  (tTA  orrtTA) and the other has the regulated transgene under the control of the transactivator bindingpromoter. The transactivator consists of the tetracycline operon (TetO) binding domain fused tothe  transactivation domain  VP16 originating  from  HSV  virus.  In  the Tet­off  system  the TetObinding domain, tetracycline repressor (TetR) is able to bind in the absence of tetracycline or itsderivative, doxycycline (Dox) and thus, transcription is activated by the VP16 domain of the tTAin the absence of Dox. When Dox is present, it binds to the tTA and induces a conformationalchange,  releasing  tTA  from  TetO  and  deactivating  transcription.  In  the  Tet­on  system  thebinding  properties  of  TetR  are  mutated  for  reversed  binding  properties.  Thus,  the  resultingtransactivator, rtTA induces transcription in the presence of Dox.

In  addition  to  its  tight  regulation  and  thepossibility  to  strictly  adjust  the  transgeneexpression  level  dose­dependently,  thetetracycline­regulated  gene  expressionsystem  has  several  advantages  over  othersystems. The inducer drug has been used asan antibiotic  for decades and  thus, has wellcharacterized  pharmacological  properties  ina clinical setting. Doxycycline is non­toxic atdoses  required  for  gene  induction  and  thetissue  concentrations  needed  are  achievedby  oral  administration  of  the  drug.Doxycycline is lipophilic and hence efficientlyabsorbed  by  cells.    It  is  also  rapidlymetabolized  and  cleared  from  the  bodymaking  it  an  ideal  drug  for  rapid  induction

and  repression  of  gene  expression.  Thecomponents of the Tet­on system recognizeunique sequences of DNA, thus reducing therisk  of  side  effects.  However,  because  thetransactivator protein has both bacterial andviral  protein  components,  an  immuneresponse  is  possible.  In  fact,  theimmunogenicity  of  rtTA2SM2  transactivatorhas been reduced by humanized amino acidcodon optimization (Urlinger et al., 2000).

31

Steroid  hormone  receptor  ­basedregulated gene expression

Steroid hormones can easily cross epithelialbarriers  and  plasma  membranes.Endogenously,  steroid  hormones  bind  totheir  receptors  in  the  cytoplasm  and  thesecomplexes  are  then  translocated  to  thenucleus where they bind to DNA to regulategene  expression.  Thus,  steroid  hormonereceptor  ligands  bear  the  potential  to  beutilized as soluble drugs for the regulation oftransgenes in therapy applications.

A  gene  regulation  system  exploiting  atruncated  form  of  the  ligand­binding  domainof  the  human  progesterone  receptor  hasbeen  developed  (Wang  et  al.,  1994).  Thissystem  relies  on  the  ability  of  the  modifiedligand­binding  domain  to  bind  to  syntheticantiprogestins as agonists. An antiprogestin­dependent,  site­specific chimerictranscription factor was generated by  linkingthe  modified  ligand­binding  domain  to  aheterologous  DNA­binding  domain,  yeastGAL4,  and  to  a  transcription  activationdomain, NF­  p65 subunit. In the presenceof an antiprogestin, such as mifepristone, thechimeric  transactivator  binds  to  its  targetsequence,  the  17­mer  GAL4  sequencepositioned  upstream  of  the  minimalpromoter,  to  activate  transcription  of  thetransgene.  Mifepristone  regulated  geneexpression  has  been  used  both  in in  vitroand in vivo applications  (Wang et al., 1997,Oligino  et  al.,1998,  Burcin  et  al.,  1999).  Anadvantage  of  the  antiprogestin  generegulation system is that it mostly comprisesof modified human proteins and thus, shouldbe  less  immunogenic. However,  inducers ofthe  system  are  generally  able  to  activatenative  steroid  hormone  receptors,  whichcreates  a  risk  of  side  effects.  In  fact,mifepristone  is  a  drug  which  is  used  toinduce  abortion  in  women,  although  with  adose  well  above  that  is  sufficient  fortransgene  regulation.  These  concentrationsof  mifepristone  are  similar  to  those  in

estrogen replacement  therapies used duringmenopause  (Wang  et  al.,  1994)  and  thus,known to have biological effect.

Another  strategy  to  utilize  steroid  hormoneregulation  is  the  use  of  a  non­mammaliansteroid  hormone  receptor,  such  as  theecdysone  receptor.  The  ecdysone  receptoris  of  insect  origin,  and  is  involved  intriggering  metamorphosis  in Drosophila.Ecdysone  regulated  gene  expressionsystems  consist  of  a  chimeric  transactivatorprotein  composed  of  the  VP16  activationdomain  fused to  the ecdysone  receptor withaltered  DNA­binding specificity and  with  theability  to  hetorodimerize  with  the  retinoid  Xreceptor.  The  response  element,  which  iscombined  to  the  transgene,  is synthetic andnot  recognized by natural nuclear receptors.The presence of an ecdysone analog elicitsheterodimerization  of  the  transactivatorleading  to  transgene  expression.  Ecdysoneregulated  gene  expression  has  beensuccessfully applied in animal models (Johnset al., 1999, Karns et al., 2001, Galimi et al.,2005).  As  gene  expression  inducers,ecdysteroids  have  certain  advantagescompared  to  human  steroids.  Ecdysteroidshave  short  half­lives,  which  aids  in  precisegene  induction.  Also,  they  are  consideredrelatively  non­toxic  and  do  not  appear  toaffect  mammalian  physiology  (No  et  al.,1996).  However,  a  disadvantage  of  thesystem  is  that  expression of  insect  proteinsin  vivo  may  induce  an  immune  response  inthe host.

Rapamycin­regulated geneexpression

Rapamycin­regulated  gene  expressionsystems  are  based  on  the  ability  of  theimmunosuppressant  drug  rapamycin  todimerize  two  cellular  proteins,  immunophilinFKBP12  (FK506­binding  protein  of  12  kDa)and  FRAP  (FKBP  rapamycin­associatedprotein).  The  system  utilizes  two  fusionproteins. The first is a fusion of the FKBP12

32

domain and a synthetic DNA­binding domainZFHD1  (zinc­finger  homeodomain  fusion  1).The second protein is a fusion of a domain ofFRAP,  called  FRB  (FKBP  rapamycin­binding)  and  a  transcriptional  activationdomain  of  the  p65  subunit  from  the  NF­ .Rapamycin  induced  dimerization  is  able  toconstitute  a  functional  transcriptionalactivator  which  binds  to  the  ZFHD1recognition  site  located  upstream  of  thetransgene  cassette  containing  a  minimalpromoter  and  thus,  induce  transcriptionwhen  rapamycin  is  present  (Rivera  et  al.,1996).  Rapamycin­regulated  geneexpression  has  been  applied  in  animalmodels  for  erythropoietin  expression  andcancer  therapy  (Crittenden  et  al.,  2003,Rivera et al., 2005, Nguyen et al., 2007). Anadvantage  of  the  rapamycin­regulated  geneexpression  system  is  that  it  is  free  ofbacterial  and  viral  protein  components.However,  the  immunosuppressive activity ofthe  inducer  drug  rapamycin  limits  itspotential use in clinical applications.

Physiologically regulated geneexpression

Instead  of  controlling  transgene  expressionby dosing of a drug, gene expression may beregulated  by  an  endogenous  physiologicalstimulus.  A  prototype  of  such  a  “vigilantvector”  is  the  hypoxia  regulated  vector,which  has  potential  in  gene  therapy  ofmyocardial and skeletal muscle  ischemia. Inits  current  form,  hypoxia­induced  generegulation  is  achieved  by  an  oxygensensitive  transcription  activator,  which  iscomposed  of  the  oxygen  degradationdomain of hypoxia­inducible  factor  1   fusedto  the  transcriptional  activation  domain  p65and  to  the DNA binding domain GAL4. Thisengineered  transcription  factor  is  degradedin  normoxic  conditions,  but  in  hypoxia  it  isable  to  bind  to  its  GAL4  target  sequence,placed  upstream  of  the  transgene,  andactivate  transcription  (Tang  et  al.,  2005).Other pathophysiological stimuli which might

be  utilized  in  therapeutic  transgeneregulation  are  vascular  shear  stress  andoxidative  stress.  Oxidative  stress  has  beenimplicated  to  play  a  role  in  a  number  ofcardiovascular  pathologies  includinghypertension,  atherosclerosis,  myocardialinfarction,  reperfusion  injury  and  restenosis(Levonen et al., in press) and thus, oxidativestress  induced  gene  regulation  could  beexploited  in  a  variety  of  potential  genetherapy  applications.  Therapeutic  geneexpression  regulation  by  a  physiologicalstimulus typical for the targeted pathology isan  alluring  concept and  presumably,  will  beincreasingly applied in future therapies.

Radiation induced gene expression

Genetic  radiotherapy  was  introduced  basedon the finding that a specific sequence of theearly  growth  factor  response­1  genepromoter,  called  the  CArG  element,mediates  ionizing  radiation­induced  genetranscription  (Hallahan  et  al.,  1995).  Thisapplication  to  cancer  therapy  is  based  on  avector  where  tumor  necrosis  factor­   (TNF­

)  expression  is  under  the  control  of  theCArG  elements  and  combines  both  thespatial  and  temporal  control  of  therapeuticgene  expression.  By  using  an  adenoviralvector,  radiation  induced  TNF­   expressionhas  resulted  in  high  intratumoral  TNF­concentration  and  produced  antitumoreffects  in  animal  models  of  human  cancersand has been tested in phase I clinical trialsfor  the  treatment  of  advanced  solid  tumors(reviewed by Mezhir et al., 2006).

33

GENE  EXPRESSION  KNOCK­DOWN  BY  RNA  INTERFERENCE(RNAi)

Introduction to RNAi

The Nobel Prize awarded discovery in 1998,showed  that  long  double­stranded  RNA(dsRNA)  could  silence  gene  expression  inthe  nematode Caenorhabditis  elegans  (Fireet al.,1998). This was followed by the findingin  2001,  that  showed  that  short  syntheticRNAs  could  induce  the  same  phenomenonin  mammalian  cells  (Elbashir  et  al.,  2001).These  findings  have  led  to  an  increasingamount  of  information  of  the  role  of  smallRNAs in gene regulation and the subsequentuse  of  RNAi  based  therapeutics  inpreliminary  clinical  trials.  To  date,  severalsmall  regulatory  RNAs  have  beendiscovered.  These  include  short  interferingRNAs  (siRNAs),  microRNAs  (miRNAs)  andPiwi­interacting  RNAs  (piRNAs).  In  additionto  uncovering  new  mechanisms  of  genesilencing  and  revolutionizing  theunderstanding  of  endogenous  mechanismsof  gene  regulation,  the  discovery  of  RNAihas  provided  a  powerful  new  tool  forbiological  research  and  a  potentialtherapeutic  approach  for  the in  vivoinactivation  of  proteins  linked  to  humandisease progression and pathology.

The mechanism of RNAi

In  the  RNA­guided  gene­silencing  pathwaydiscovered  thus  far,  dsRNA  is  the  triggermolecule.  Long  dsRNA  can  derive  fromvarious  sources,  such  as  simultaneoussense and antisense transcription of specificgenomic  loci  or  from  viral  replicationintermediates.  However,  the  predominantform of dsRNA in mammalian cells is derivedfrom  endogenously  expressed  miRNAs.miRNAs are derived  from  imperfectly pairednon­coding  hairpin  RNA  structures  and  areencoded within introns. They are transcribed

by a RNA polymerase II enzyme, processedin  the  nucleus  by  the  Drosha  enzymecomplex  and  exported  to  the  cytoplasm  asprecursor  molecules  called  pre­microRNAs.In  the  cytoplasm,  the  pre­microRNAs  arefurther  shortened  and  processed  by  anRNAse  III  endonuclease  enzyme  calledDicer  to  produce  imperfectly  matched,double­stranded  miRNAs.  Similarly,  Dicerprocesses  long,  perfectly  matched  dsRNAsinto shorter siRNAs. In the next step, a multi­enzyme complex,  including the Argonaute 2–protein  and  the  RNA­induced  silencingcomplex  (RISC),  binds  to  miRNA  or  siRNAduplex  and  discards  one  strand,  to  form  anactivated  complex  containing  the  guide  orantisense  strand.  If  complementarity  of  thestrands  is  imperfect,  as  with  a  miRNA  andmRNA,  the  enzyme  complex  blockstranslation. When complementarity is perfector nearly perfect, such as with a siRNA andmRNA,  the  complex  degrades  the  RNAstrand  in  a  guided  fashion.  In  both  cases,translation  of  the  target  mRNA  is  inhibited,either  by  translational  repression  or  mRNAcleavage. (Kim et al., 2007). The principle ofsiRNA and miRNA function in the cytoplasmof  mammalian  cells  is  presented  in  theFigure 5.

The  goal  of  RNAi­based  researchapplications  and  therapies  is  to  activateselective  mRNA  cleavage  for  efficient  genesilencing.  It  is  possible  to  harness  theendogenous pathway in two ways: either byusing  a  gene  transfer  vector  to  express  ashort hairpin RNA (shRNA) that resembles amicro­RNA  precursor,  or  by  introducingsynthetic  siRNAs  into  the  cytoplasm  thatreadily mimic the Dicer cleavage product. Todate,  only  synthetic  siRNAs  have  beenutilized  in  clinical  RNAi  therapeutics,  whilevector  mediated  shRNA­based  approachesare  widely  used  in  basic  research  and  pre­clinical gene therapy applications.

34

Figure 5. Mechanisms of siRNA and miRNA pathways  in  the cytoplasm of mammalian cells.Cytoplasmic dsRNAs or pre­miRNAs are processed by an enzyme complex consisting of Dicer,TAR  RNA­binding  protein  (TRBP)  and  protein  activator  of  protein  kinase  PKR  (PACT)  intosiRNAs or miRNAs which are loaded into Argonaute 2 (AGO2) and the RNA­induced silencingcomplex (RISC). The siRNA guide strand recognizes the target sites to direct mRNA cleavage,which is carried out by the catalytic domain of AGO2. In the case of the miRNA­pathway, themature miRNA recognizes target sites in the 3’ untranslated region (3’ UTR) of mRNAs to directtranslational  inhibition  and  mRNA  degradation  in  processing  P­bodies  that  contain  thedecapping enzymes DCP1 and DCP2. ORF: open reading frame. Figure modified from Kim etal., 2007.

shRNA delivery by gene transfervector

Vector mediated shRNA delivery is based onDNA­based  cassettes  expressing  shRNAsfrom RNA polymerase  III  (Pol  III) promoters(Brummelkamp  et  al.,  2002).  Thesepromoters include the human ribonuclease PRNA component H1 or the human or mouseU6 small nuclear RNA promoter. They havewell  defined  transcriptional  initiation  andprecise termination sites, and have thereforebecome  a  popular  choice  for  vector  basedgene  silencing.  The  minimal  shRNAexpression  cassette  includes  a  Pol  IIIpromoter,  directly  followed  by  at  least  19nucleotides of  the sense target sequence, aloop of 4­10 nucleotides, the complementaryantisense  target  sequence,  and  a stretch of

four to six uridylates as a terminator (Figure6).  The  duplex  shRNAs  are  substrates  fornuclear  export  by  the  exportin­5  pathway,and  they  are  further  processed  by  Dicer  toyield functional siRNA duplexes. In contrast,the  siRNAs  enter  the  RISC  directly.  Themost  critical  factor  in  determining  thesuccess of RNAi mediated gene silencing isthe  choice  of  target  sequence.  Despite  thepresence  of  different  algorithms  predictingthe  performance  of  a  particular  sequence,not all predicted sequences result in efficientsilencing. Thus, each siRNA or shRNA mustbe  tested  independently.  The  expressioncassettes  for  shRNAs  may  be  introducedinto  cells  within  a  plasmid  vector  or,  forimproved  efficiency  and  stable  expression,within  a  viral  vector  such  as  an  adenoviralvector (Shen et al., 2003), a retroviral vector

35

Figure  6. A  diagram  of  a  polymerase  III  (Pol  III)  driven  shRNA  hairpin  expression  cassetteused  in  gene  transfer  vectors.  Expression  cassette  consists  of  a  Pol  III  promoter,  a  hairpinforming  sequence  and  a  termination  sequence  of  thymidines  (T)  and  the  resulting  shRNAmolecule after transcription.

 (Barton  et  al.,  2002),  a  lentiviral  vector(Rubinson  et  al.,  2003)  or  an  AAV­vector(Han  et  al.,  2004).  The  LV­mediatedapproach has proven efficient in the deliveryof  shRNAs  into  stem  cells  and  in  thedevelopment  of  gene­knockdown  in  pre­implantation  mouse  embryos  (Rubinson  etal., 2003, Tiscornia et al., 2003).

RNAi applications

In addition to in vitro applications of RNAi  ithas  also  been  exploited  in  transgenesisusing  lentiviral  vectors  (Singer  et  al., 2006).In  comparison  to  the  standard  method  ofgenerating  knock­down  rodents,  that  is  theinduction of  targeted deletions in the mousegenome via homologous recombination, LV­mediated  RNAi  has  proven  efficient  in  bothloss­of­function  analysis  and  theestablishment  of  disease  models.  As  atherapeutic  approach,  RNAi  has  enormouspotential in a vast range of pathologies. Viraldiseases are potent targets of RNAi, and theefficacy  of  this  approach  has  beendemonstrated  against  the  HIV  infection  bysuccessful  targeting of most viral  transcriptsin cells infected with HIV (reviewed by Rossi,2006).  Clinical  trials  for  the  treatment  ofrespiratory  syncytial  virus  infection  and  ofHIV  infection  were  scheduled  to  begin  inyear  2007.  Also,  RNAi  therapeuticapproaches  directed  to  ocular  disease  andage­related  macular  degeneration,  are

currently in progress. These trials are basedon  the  intraocular  delivery  of  siRNAstargeting  VEGF  and  VEGF­receptor  1.  Forcancer  therapy,  various molecular pathwaysmay  be  intervened  by  the  employment  ofRNAi,  and  antiproliferative  or  proapoptoticeffects  have  been  reported  in  cell  culturestudies or animal models (reviewed by Pai etal.,  2006).  Suggested  targets  for  cancertherapy  include  gene  products  involved  incarcinogenesis,  e.g.  cell  cycle  regulators,molecules of oncogenesis pathways and cellsenescence  factors.  Also,  molecules  crucialfor  tumor­host  interactions,  factors  involvedin  tumor  resistance  to  chemo­  orradiotherapy  and  molecules  related  to  DNArepair  mechanisms  represent  potentialtargets  for  RNAi  mediated  cancer  therapy.RNAi  based  gene  therapy  has  also  beenstudied  in  animal  models  ofneurodegenerative  diseases.  For  example,the  delivery  of  a  shRNA  against  mutantataxin­1 by AAV vector into the brain of micerepresenting  the  pathology  ofspinocerebellar  ataxia  type  1,  led  to  abeneficial effect on neuronal cells (Xia et al.,2004).  Also,  in a mouse model  of  ALS, LV­mediated  delivery  of  shRNA  against  themutant superoxide  dismutase  1  led  to  long­term,  stable  gene  silencing  along  withimproved  survival  of  motor  neurons  and  adelayed  onset  of  the  disease  phenotype  inmice  (Ralph  et  al.,  2005,  Raoul  et  al.,2005a).

36

Although  RNAi  holds  a  clear  potential  fortherapeutic  applications,  the  currenttechnology  has  its  limitations.  Due  tosimilarities  in  nucleic  acid  sequences,  RNAimediated  therapy  may  mediate  off­targeteffects  (Jackson  et  al.,  2006).  Also,  non­specific  immune  stimulation,  such  asinterferon  response  and  dendritic  cellactivation  through  toll­like  receptors,  hasbeen  observed  (Judge  et  al.,  2005).However,  it  is  likely  that  a  greaterunderstanding  of  the  selection  criteria  foroptimal  siRNA  or  shRNA  sequence  will  atleast partly overcome these issues. As in thecase of gene  therapy,  the potential successof  RNAi  therapy  is  much  dependent  on  thedevelopment  of  improved  delivery  methods,relating both to synthetic siRNA delivery andtransfer vector based shRNA delivery.

37

AIMS OF THE STUDY

The aim of  this study was  to develop HIV­1derived  lentiviral  gene  transfer  vectors  forgene therapy, mainly for applications of genetherapy  for  cardiovascular  diseases.  SinceLVs  are  able  to  integrate  into  the  host  cellgenome, there is a requirement for regulatedtherapeutic  gene  expression.  Therefore,approaches  to  regulate  LV­mediated  geneexpression  were  explored  in  this  study.During  the  recent  years  two  noveltechnologies,  RNA  interference  andprogenitor  cell  therapy,  have  emerged.  Weaimed  at  combining  these  approaches  tolentiviral gene transfer technology.

More  specifically,  the  following  objectiveswere addressed:

The design of an exogenouslyregulated lentiviral vector system (I)

For  regulated  gene  expression  byadministration  of  an  orally  available  drug,can the novel transactivator rtTA2SM2 for theTet­on system be successfully applied to theHIV­1 derived vector system?

The design of an oxidative stressinduced lentiviral vector (II)

Can the antioxidant response element (ARE)sequence  be  utilized  for  an  oxidative  stressinducible gene transfer vector? Which of thestudied  ARE­elements  are  the  most  potentand what is  the most effective combination?Is the HIV­1 derived lentiviral vector suitablefor oxidative stress induced gene expressionapplications?

Long­term therapeutic geneexpression in cardiovascular genetherapy applications (unpublished)

Is  the HIV­1 based  lentiviral vector effectivefor in vivo gene transfer to the rabbit carotidartery  by  intraluminal  or  periadventitialapproach,  rabbit  skeletal  muscle  byintramuscular  injection  and  to  the  porcinemyocardium by intramyocardial injection?

Cord blood derived progenitor celltherapy in skeletal muscle ischemia(III)

Do HIV­1 derived lentiviral vectors efficientlytransduce  different  subfractions  of  humanCB  derived  progenitor  cells?  Do  CBprogenitor  cells  possess  therapeuticpotential  in  the  mouse  model  of  skeletalmuscle  ischemia?    Does  lentiviraltransduction  of  the  VEGF­D C  growthfactor gene to progenitor cells enhance theirtherapeutic potential?

The design of a lentiviral vector forgene silencing by RNA­interference(IV)

May  HIV­1  derived  lentiviral  vector  beutilized  for  long­term  gene  silencing  byRNAi? Which  RNA polymerase  III  promoteris more powerful for efficient silencing; U6 orH1?

Real­time quantitative PCR ­approach for the analysis of lacZmarker gene expression (V)

Can a real­time quantitative PCR method bedeveloped  for  the  accurate  quantification  oflacZ marker gene transcription?

38

MATERIALS AND METHODS

SUMMARY OF THE MATERIALSAND METHODS

The  materials  and  methods  used  in  thisstudy are summarized in the following tablesand  described  in  detail  in  the  original

publications  (I,  III­V)  and  in  the  manuscript(II).  The  methods  used  for  assessinglentiviral  vector  efficacy  in  animal  modelsthat  are  not  intended  for  publishing  aredescribed below.

Table 2. A summary of the prime methods used for this study.

Principal method Description Used in

DNA cloning Vector construction I, II, IVFuGENER transfection ICalcium phosphate transfection II, III, IVProduction of lentiviral vectorsUltracentifugation for virus concentration I, II, III, IV,

up.Titer determination by p24 ELISA I, II, III, IVAnalysis of lentiviral vector

quality Titer determination by FACS IIIFACS III, IVFluorescence microscopy III, IVLuminescent  ­galactosidase assay ILuciferase assay IIChemical induction of oxidative stress byDEM or 15dPGJ2

II

hCB cell subfraction isolation III

Cell biology methods

Progenitor cell differentiation assays IIIPCR I, II, III, up.DNA­based analysis methods Southern blot IVRT­PCR I, III, up.RNA­based analysis methods Quantitative real­time PCR (qPCR) IV, VImmunocytochemistry III, IVImmunohistochemistry III, IV, up.ELISA I, II, III, IVWestern blot II

Immunological methods

MACS III

Tissue sample processing Fixation, embedding, sectioning, liquidnitrogen freezing I, III, IV

X­gal staining for  ­galactosidase activity I, up.Hematoxylin­eosin ­staining IIIMorphometric analysis III

Other analysis methods ontissue samples

Miles assay up.

Abbreviations  used:  up.:  unpublished  results,  FACS:  fluorescence  activated  cell  sorting,  ELISA:  enzymelinked  immunosorbent  assay,  DEM:  diethyl  maleate,  15  dPGJ2:  15­deoxy­12­14­prostaglandin  J2,  PCR:polymerase chain reaction, MACS: magnet activated cell sorting

39

Table 3. Plasmids used in this study.

Plasmid Description Origin Used in

pCMV­G VSV­G envelope expression plasmid T. Friedmann, USCD, LaJolla, CA, USA

I, II, III,IV

pMDLg/pRRE HIV­1 Gag­Pol encoding packagingplasmid

I. Verma, Salk Institute,La Jolla, CA, USA

I, II, III,IV

pRSV­Rev HIV­1 Rev encoding packaging plasmid I. Verma I, II, III,IV

pHIV­CS Third generation HIV­1 vector plasmid,SIN­vector due to deletion in 3’ LTR I. Verma I

pUHrT61­1 hCMV­rtTA2SM2 encoding plasmid H. Bujard, ZMBH,Heidelberg, Germany I

pHIV­rtTA2 SM2 HIV­CS based vector encoding rtTA2SM2 J. Koponen, University ofKuopio, Finland I

pTRE2­LacZPlasmid with lacZ cDNA under the controlof tetracycline responsive elementcontaining promoter

Clontech I

pHIV­TRE­LacZ pHIV­CS based vector with TRE­LacZ J. Koponen I

pGL3­Promoter Plasmid luciferase cDNA under theminimal SV40 promoter Promega II

pGL­hNQO1,pGL­hGCLM,pGL­mHO1

Luciferase reporter constructs withantioxidant response elements (AREs) ofrespective genes in combinations of of 1,2 and 3 copies of each element

H. Hurttila, University ofKuopio, Finland II

pLV­hNQO1,pLV­hGCLM,pLV­mHO1

Lentiviral plasmid vectors of ARE reporterconstructs, vectors with 1 and 2 copies ofeach element

H. Hurttila II

pLV­PGK­GFP

Third generation HIV­1 SIN­vector withcPPT and WPRE elements. Human PGKpromoter driving the expression of theGFP marker gene.

L. Naldini, IRCC, Turin,Italy III

pLV­PGK­VEGF­D C

As pLV­PGK­GFP, but GFP replaced withVEGF­D C cDNA

P. Mäkinen, University ofKuopio, Finland III

pBluescriptII Cloning vector Stratagene IVpLV­PGK­

NGFRAs pLV­PGK­GFP, but GFP replaced with

NGFR marker gene cDNA L. Naldini IV

pLV­U6shGFP,pLV­H1shGFP,pLV­U6shGFP­H1shGFP

shGFP vectors with U6 or H1 promoter orboth, based on pLV­PGK­  NGFR P. Mäkinen IV

pLV­U6shGAPDH,pLV­H1shGAPDH,pLV­U6shGAPDH­H1shGAPDH

shGAPDH vectors with U6 or H1promoter or both, based on pLV­PGK­

NGFRP. Mäkinen IV

pRRLThird generation HIV­1 SIN­vector withcPPT and WPRE elements. CMVpromoter for transgene expression.

W. Osborne, University ofWashington, Seattle, WA,USA

up.

pRRL­ VEGF­D C

pRRL­based vector encoding VEGF­D C P. Mäkinen up.

pRRL­LacZ pRRL based vector encoding lacZ P. Mäkinen up.

40

Table 4. Cell lines and primary cell types used in this study.

Cell line or type Description Origin Used in

293THuman embryonic kidneyepithelial cell line expressingSV40 large T antigen

American type culturecollection (ATCC),Manasass, VA, USA

I, II, III, IV

CHO Chinese hamster ovary cell line  ATCC I

EAhy926 Human endothelial hybridomacell line

C.J. Edgell, UNC,Chapel Hill, NC, USA I

HUVEC Human umbilical veinendothelial cells

Primary cells isolatedfrom umbilical cord II

hCB CD133+ andCD34+ MNCs

Human CD133+ and CD34+

MACS­purified mononuclear cellsubfractions

Primary cells isolatedfrom cord blood III

hCB MSCs Human mesenchymal stem cells Primary cells isolatedfrom cord blood III

c166­GFPMouse endothelial cell line withstable expression of GFPmarker gene

ATCC IV

HeLa Human cervicaladenocarcinoma cell line ATCC IV

PA317Mouse fibroblast cell line withstable expression of LacZmarker gene

T. Friedmann, USCD, LaJolla, CA, USA V

Table 5. Primary antibodies used in this study.

Antibody Description Application Distributor Used in

CD34 andCD133

Mouse anti­humanantibodies conjugated withmagnetic microbeads

MACS, FACS  Miltenyi Biotec III

CD34, CD133,CD13, CD29,CD44, CD49e,CD73, CD90,CD105, HLA­ABC, CD14,CD45, HLA­DR

Mouse anti­humanantibodies for the detectionof cell surface antigensconjugated withfluorochromes

FACS BD Biosciences III

CD34Rat anti­mouse antibody forthe detection of bloodvessel endothelium

IHC HyCult Biotechnology III

mMQRabbit anti­mouse antibodyfor the detection ofmacrophages

IHC Accurate Chemical andScientific III

VEGF­D Mouse anti­human antibody  ELISA R&D Systems III

NGFR

Mouse anti­human PE­conjugated and non­conjugated antibodytargeted to NGFR

FACS, IHC BD Biosciences IV

HO­1 Rabbit anti­humanpolyclonal antibody WB Stressgen II

GCLM Rabbit anti­humanpolyclonal antibody WB

T. Kavanagh, Universityof Washington, WA,Seattle, USA

II

­actin Rabbit anti­humanpolyclonal antibody WB Cell Signaling II

Abbreviations used: MACS: magnetic activated cell sorting, FACS: fluorescence activated cell sorting, PE:phycoerythrin,  NGFR:  nerve  growth  factor  receptor,  IHC:  immunohistochemistry,  ELISA:  enzyme­linkedimmunosorbent assay, WB: western blotting, GCLM: glutamate­cysteine ligase modifier subunit

41

Table 6. HIV­1 lentiviral vectors and their properties used in this study.

Vector Promoter Transgene Additionalelements Origin Used

in

HIV­rtTA2 SM2 CMV

Reversetetracyclinetransactivator rtTA2 SM2

J. Koponen,University ofKuopio,Finland

I

HIV­TRE­LacZ

MinimalCMV withsevencopies ofTRE

LacZ markergene encoding for

­galactosideJ. Koponen I

LV­hNQO1­Luc,LV­hGCLM­Luc,LV­hGCLM­HO­1

AREelements (1or 2 copies)ofrespectivegenescombinedwithminimalSV40

Luciferase orheme oxygenase1

cPPT,WPRE

H. Hurttila,University ofKuopio,Finland

II

LV­PGK­GFP HumanPGK GFP marker gene cPPT,

WPRE

L.Naldini,IRCC, Turin,Italy

III

LV­PGK­VEGF­D C

HumanPGK VEGF­D C cPPT,

WPRE

P. Mäkinen,University ofKuopio,Finland

III

LV­U6shGFP, LV­H1shGFP, LV­U6shGFP­H1shGFP

Human U6or/and H1and PGK

small hairpin RNAtargeting GFP;shGFP,  NGFRmarker gene

cPPT,WPRE P. Mäkinen IV

LV­U6shGAPDH,LV­H1shGAPDH,LV­U6shGAPDH­H1shGAPDH

Human U6or/and H1and PGK

small hairpin RNAtargeting mouseGAPDH;shGAPDH,

NGFR markergene

cPPT,WPRE P. Mäkinen IV

RRL­ VEGF­D C  CMV VEGF­D C cPPT,WPRE P. Mäkinen up.

RRL­LacZ CMV LacZ markergene

cPPT,WPRE P. Mäkinen up.

Abbreviations  used:  CMV:  cytomegalovirus,  TRE:  tetracycline  responsive  element,  hNQO1:  humanNAD(P)H  quinone  oxidoreductase,  hGCLM:  human  glutamate­cysteine  ligase  modifier  subunit,  HO­1:heme  oxygenase  1,  ARE:  antioxidant  response  element,  PGK:  phosphoglycerate  kinase,  GFP:  greenfluorescent  protein,  cPPT:  central  polypurine  tract, WPRE:  woodchuck  hepatitis  virus  post­transcriptionalelement,  NGFR:  truncated  form  of  nerve  growth  factor  receptor,  GAPDH:  glyceraldehyde­3­phosphatedehydrogenase, up.: unpublished results

42

Table 7. PCR­methods used in this study.Target gene or region Application Used in

Beta­galactosidase (lacZ) gPCR, RT­PCR,qPCR

I, V, u.p.

Tetracycline reverse transactivator rtTA2 SM2 gPCR, RT­PCR IhNQO1, hGCLM AREs PCR cloning IIhHO1 qPCR IIHuman chromosome 17  ­satellite region gPCR IIIHuman U6 and H1 promoter PCR cloning IVGreen fluorescent protein (GFP) qPCR IVRodent GAPDH qPCR IVMouse Oas­1a, MCP­1, VEGF­A, PDGF­ qPCR IVEukaryotic ribosomal 18S RNA qPCR IV, VHuman VEGF­D C RT­PCR up.

Abbreviations used:  gPCR:  genomic PCR, RT­PCR:  reverse­transcription PCR,  qPCR:  quantitative  PCR,hNQO1:  human  NAD(P)H  quinone  oxidoreductase,  hGCLM:  human  glutamate­cysteine  ligase  modifiersubunit,  ARE:  antioxidant  response  element,  hHO1:  human  heme  oxygenase  ­1,  Oas­1a:  2’,5’­oligoadenylate synthetase ­1a, MCP­1: monocyte chemoattractant protein­1, VEGF­A: vascular endothelialgrowth factor ­A, PDGF­  : platelet derived growth factor –  , up: unpublished results

Table 8. Animal models used in this study.

Animal Model Used in n

Rat Intracerebral injection of lentiviral vector I 20

Mouse Hindlimb ischemia model, intramuscular injection of progenitorcells III 40

Intracerebral injection of lentiviral vector IV 28

Rabbit Intraluminal administration of lentiviral vector into carotidartery up. 4

Periadventitial administration of lentiviral vector into carotidartery 4

Intramuscular injection of lentiviral vector up. 9Pig Intramyocardial injection of lentiviral vector up. 3

Abbreviations used: n: number of animals, up: unpublished

43

Methods of assessing HIV­1lentiviral vector efficacy in animalmodels of cardiovascular genetherapy (unpublished)

General methodology

Pilot animal studies  to assess  the efficacyof  third  generation  lentiviral  gene  transfervector  in  previously  established  animalmodels  are  described  below.  For  thesestudies  RRL­LacZ,  RRL­VEGF­D C  orLV­PGK­VEGF­D C  vector  preparationswith viral titers of 7×108­1×109 TU/ml wereused.

Intraluminal and periadventitialapproach for lentiviral vectoradministration into the rabbitcarotid artery

Intraluminal  administration  of  the  viralvector  in  to  the  rabbit  carotid  artery  wasperformed  as  previously  described(Gruchala  et  al.,  2004).  New  ZealandWhite  (NZW)  rabbits  (n=2)  were  used.Briefly,  a  segment  of  exposed  carotidartery  was  isolated  between  atraumaticvascular  clamps,  and  two  cannulas  wereintroduced  into  the  vessel  lumen  throughproximal  and  distal  arteriotomies.  Thelumen  of  the  vessel  was  flushed  withsaline,  and  a  volume  of  100  l  of  RRL­LacZ  vector  was  administered  into  thevessel  lumen  and  allowed  to  dwell  for  20min.  After  the  incubation,  blood  flow  wasrestored.  In  a  subgroup  of  rabbits  (n=2),the carotid artery was mechanically injured4  days  before  gene  transfer.  Injury  wasdone by introducing an angioplasty ballooncatheter into the artery and passing it threetimes  to denude  the endothelial  layer  anddisrupt the internal elastic  lamina. Animalswere  sacrificed  7  days  after  viral  vectoradministration  and  artery  samplescollected  for lacZ  gene  expressiondetermination by X­gal, RT­PCR and PCR.

Periadventitial  administration  of  the  viralvector  was  done  with  the  extravascularmodel  taking advantage of a silastic collarpositioned around the rabbit carotid artery(n=4)  (Laitinen  et  al.,  1997).  Briefly,  acollar  (2  cm  in  length,  Ark  Therapeutics,Kuopio,  Finland)  was  placed  around  theexposed carotid artery. The vector solution(300  l)  was  administered  into  the  collarand tissue glue was used to seal the collar.The animals were sacrificed 10 (n=2) or 28(n=2) days after viral vector administrationand  samples  collected  for  lacZ  geneexpression  determination  by  X­gal,  RT­PCR and PCR.

Intramuscular  injection  of  lentiviralvector in rabbit skeletal muscle

Intramuscular injection of the RRL­LacZ LVin  non­ischemic  NZW rabbitsemimembranosus thigh muscle (n=3) wasperformed  as  previously  described(Rissanen et al., 2003a). A total volume of1  ml  of  vector  stock  was  divided  into  10separate  injections.  Seven  days  after  theinjections, the animals were sacrificed andmuscle  samples  collected  for  lacZ  geneexpression analysis by X­gal staining, PCRand RT­PCR.

The  angiogenic  potency  of  RRL­VEGF­D C  was  studied  by  skeletal  muscleinjections. Also, the potential gene transferefficiency enhancing effect of bupivacaine,a myotoxic  local  anaesthetic,  was  studiedby bupivacaine pre­treatment of muscle (5mg/ml,  10  injections  0.1  ml  each)  3  daysbefore  vector  injections.  Lentiviral  vectorsRRL­LacZ  (n=2,  of  which  one  rabbit  waspre­treated  with  bupivacaine)  and  RRL­VEGF­D C (n=4, of which 2 rabbits werepre­treated  with  bupivacaine)  wereinjected.  Contrast  enhanced  ultrasoundimaging  was  used  to  asses  muscleperfusion  7  and  21  days  after  vectoradministration.  Animals  were  sacrificedafter 21 days and samples collected for X­

44

gal  staining,  PCR  and  RT­PCR.  Toanalyse  the  angiogenic  effect,  sampleswere  subjected  to  immunohistochemicalstaining  of  capillary  vessels  and  vascularpermeability  by  the  Miles  assay  aspreviously  described  (Rissanen  et  al.,2003a).

Intramyocardial injection oflentiviral vector in porcinemyocardium

The  efficacy  of  RRL­VEGF­D C  inporcine myocardium (n=3)  was studied byutilizing  a  NOGA  electromechanicalmapping  and  injection  system  offering  apercutaneous  route  of  intramyocardialinjection as previously described (Rutanenet  al.,  2004).  Briefly,  electromechanicalmapping of the left ventricle was performedwith  the  NOGA  system  and  injectioncatheter.  After  mapping,  ten  myocardialinjections  of  the  RRL­VEGF­D C  vector(0.2  ml  per  injection,  total  volume  2  ml)were  performed  to  the  anterolateral  wall.Six  days  after  the  injections,  myocardialperfusion  was  studied  with  contrastechocardiography.  The  animals  weresacrificed  14  days  after  vectoradministration and samples collected for aMiles  permeability  assay  and  histologicalanalyses.

45

RESULTS AND DISCUSSION

Doxycycline regulated lentiviralvector system (I)

A lentiviral vector system utilizing the revisedtetracycline  transactivator,  rtTA2SM2,showed  a  tight  regulation  of  lacZ  geneexpression  with  negligible  basal  level  in  thenon­induced  stage.  The  gene  expressionlevel  could  be  adjusted  by  the  dosing  ofdoxycycline,  and  expression  could  berepeatedly  switched  on  and  off.  Theseresults  were  obtained  by in  vitrocotransduction of two LVs, one encoding thertTA2SM2  and  the  other  the  lacZ  markergene  under  the  control  of  the  tetracyclineresponsive promoter. By cotransducing CHOand  EAhy926  cell  lines  at  a  low  viralmultiplicity  of  infection  (MOI  1  forHIV/TRE/LacZ  and  MOI  2  for  HIV/rtTA2SM2), a 132 and 17 –fold induction in  ­galactosidase  activity,  respectively,  wasdetected.  During  long­term  culture  of  co­transduced  CHO  cells,  the  lacZ  gene  couldbe  repeatedly  switched  on  and  off  by  theaddition  and  withdrawal  of  doxycycline.Importantly,  the  induction  level  was  dose­dependent and full induction was achieved ata  doxycycline  concentration  of  500  ng/ml,which  can  be  obtained  by  oraladministration.  LVs  efficiently  transduceseveral cell types of brain. Also, doxycyclineis known to penetrate the blood­brain barrier.Therefore, as proof of  the principle of the invivo  functionality  of  the  vector  system,vectors  were  injected  into  the  rat  brain.Following cotransduction of viral vectors intothe  rat  striatum  (n=20),  RT­PCR  revealedthat doxycycline induced lacZ transcription in5  out  of  7  rats  and  not  in  the 3  rats  wheredoxycycline  was  not  administred.  Ten  ratswere  used  for  X­gal  staining  to  study  ­galactosidase  activity  in  frozen  brainsections.  In  all  rats  which  receiveddoxycycline  (n=5)  X­gal  positive  cells  weredetected.  No  positive  cells  were  seen  insamples  from  rats  without  doxycycline

treatment  (n=5),  further  confirming  thetightness  of  gene  induction  with  our  vectorsystem.  DNA  PCR  confirmed  the  presenceof both vectors  in  the brain of every animal.However,  this  does  not  confirm  thatcotransduction  of  both  vectors  targeted  thesame cells.

The  use  of  rtTA2SM2  for  tight  doxycyclinedependent    regulation  has  also  beenreported  by  others,  for  example,  in  thegeneration  of  conditionally  transgenicanimals (Michalon et al., 2005, Katsantoni etal.,  2007)  and  in in  vivo  gene  transferapproaches with AAV­vectors  in mouse andnonhuman  primate  muscle  and  retina(Chenuaud et al., 2004, Stieger et al., 2006).However,  dose­response  experiments  havedemonstrated  that  tightness  of  control  maybe  partially  lost  at  higher  vector  doses(Lamartina  et  al.,  2002).  These  findingsstress  the  importance  of  specifying  anoptimal vector dose for each application.

There  are  specific  advantages  achieved  byintroducing  the  elements  for  doxycyclineregulated gene expression into two separatevectors.  The  first,  is  the  ability  to adjust  theproportion  of  each  transcriptional  unit  bysimply  changing  the  ratio  and  amount  ofvector  particles  applied  for  optimal  generegulation.  Secondly,  in  the  two  vectorsystem  the  transcriptional  units  are  not  inclose  proximity  and  therefore,  the  regulatedpromoter  is  not  disturbed  by  promoterinterference  from  an  adjacent  promoterconstitutively  expressing  the  transactivator,an  apparent  disadvantage  of  the  singlevector system (Bornkamm et al., 2005). Thetwo vector ­system enables the generation oftransgenic  animals  with  induced  transgeneexpression  accomplished  by  first  generatingseparate  mouse  lines  that  contain  thetransactivator  and  target  constructs,  andthen producing double transgenic animals bybreeding. Since lentiviral vectors are provento  be  exceptionally  powerful  tools  intransgenesis,  our  vector  system  shows  the

46

potential to be exploited in the generation ofconditionally transgenic animals.

Despite  the  advantages  of  a  two­vectorsystem,  there  are  numerous  applicationswhere  repeatable  transfer  of  thetranscriptional  units  required  for  regulatedgene expression  require  the use of a singlevector.  These  include  all in  vivo  genetransfer  procedures.  Vogel  and  coworkershave described a HIV­1 based single­vectorsystem,  in  which  the  transcriptional  unit  forrtTA2SM2 has been inserted in the antisenseorientation  and  separated  from  theregulatable  unit  by  the  chicken  ­globininsulator  (Vogel  et  al.,  2004).  The  authorsreport transgene expression regulation in therat striatum over two orders of magnitude bythe  addition  or  withdrawal  of  doxycycline.The  latest  and  most  advanced  versions  ofthe Tet­on system where all components areon  a  single  vector  combine  the  rtTA2SM2with  the  use  of  a  transrepressing  factor,doxycycline­dependent  trans­silencer  calledtTS. tTS is a fusion protein consisting of theKRAB  (Kruppel­Associated  Box)transrepressing  domain  of  the  human  Kid­1protein  fused  to  the wild­type  TetR  (Salucciet  al.,  2002,  Lamartina  et  al.,  2003,Epanchintsev  et  al.,  2006).  The  KRAB­domain  can  induce  transcriptional  silencingto  within  3  kb  of  its  binding  site.  In  theabsence  of  doxycycline,  tTS  binds  to  thetetO  target  sequence  and  inhibits  basaltranscription.  As  doxycycline  is  added,  thetTS  dissociates  allowing  rtTA2SM2  to  bindand  trigger  activation.  This  design  ispreferred  in  single­vector  applications  sincethe  transrepressing  factor,  that  ensures  theinactivity of the regulated promoter in the off­state,  abolishes  any  potential  promoterinterference. It may also reduce interferencefrom  genomic  elements  which  come  intoproximity  after  integration  when  integratingvectors  are  used  to  deliver  the  regulatorysystem.  However,  a  disadvantage  of  usingthe tTS means the inclusion of an additionaltranscriptional  unit,  which  complicates  the

vector  system  and  increases  the  size  ofgenomic  material  to  be  inserted  into  thetransfer vectors.

Overall,  particularly  from  a  clinical  point  ofview,  the  doxycycline  system  has  a  clearpharmacological advantage over other generegulation  systems  like  mifepristone  orrapamycin.  Namely,  that  doxycycline  has  ahalf­life  of  14­22  h,  has  excellent  tissuepenetration due to its lipophilic nature and iswell tolerated. The most serious side effect isa  dose­dependent  photosensitivity  that  mayoccur  in  1­3%  of  patients  after  prolongedadministration (Klein et al., 2001). The latestversions  of  the  Tet­on  system  can  be  fullyinduced  in  rodents  and  monkeys  bydoxycycline  at  doses  comparable  to  thosecommonly  used  for  antibiotic  therapy(Lamartina et  al., 2003). The major  concernwith  respect  to  the  use  of  an  antibiotic­induced  regulatory  system  is  the  possibilityof  raising  resistance  to  the  antibiotic  itself.Although  tetracycline  derivatives  are  lessused  than  in  the  past,  they  may  stillrepresent the treatment of choice for certaininfectious  diseases  such  as  Lyme  disease(Klein  et  al.,  2001).  Thus,  the generation ofTet­system  compatible,  non­antibioticdoxycycline analogs would be desirable.

Oxidative stress inducible lentiviralvector (II)

We  studied  if  the  antioxidant  responseelement  (ARE), a cis­acting sequence foundin  the  promoters  of  the  genes  induced  byoxidative  stress,  can  be  utilized  for  geneinduction  in  a  transfer  vector.  The  AREsequences  of  three  genes,  human  NADPHquinine  oxidoreductase  1  (NQO1),  humanglutamate­cysteine  ligase  modifier  subunit(GCLM) and mouse heme oxygenase 1 (HO­1),  were  subcloned  into  a  reporter  plasmidvector  in combination with one,  two or  threecopies  of  the  ARE  sequence,  upstream  ofthe  minimal  promoter.  After  plasmidtransfections, oxidative stress was mimicked

47

by  the addition  of  a  chemical,  either  diethylmaleate  (DEM)  or 15­deoxy12,14­prostaglandin  J2  (15­dPGJ2),  and  luciferaseactivity of  the cell cultures was analysed.  Inall constructs, luciferase activity was inducedupon  chemical  induction  of  oxidative  stress.However,  there was some basal expressionof  luciferase  without  induction  and  theexpression  increased  in  relation  to  thenumber  of  ARE  elements  in  the  constructs.The  basal  expression  level  could  be  due  toreactive  oxygen  species  and  oxidativeproducts  of  macromolecules  produced  bynormal  cell  respiration  and  thus  cannot  beavoided.  Also,  it  should  be  noted  that  theoxygen levels in cell culture conditions (21%)are much higher than the naturally occurringlevels in most tissues (Roy et al., 2003), andit  is  likely  that  basal  ARE­activity  would  belower in an in vivo situation. In our study, formore  efficient  and  long­lasting  expression,the  reporter  constructs  with  one  and  twocopies  of  AREs  from  hNQO1  or  hGCLMgenes  were  cloned  into  LVs  and  theirefficacy  for  oxidative  stress  induced  geneexpression  studied  in  human  umbilical  veinendothelial cells (HUVECs). Endothelial cellsrepresent  a  potential  target  for  antioxidantgene therapies (Levonen et al., in press) andwere  therefore  selected  for  these  studies.Upon chemical  induction of oxidative stress,a  clear  induction  of  luciferase  activity  wasseen  with  all  lentiviral  constructs.  WhenHUVECs  were  transduced  at  the  MOI  of  5,the  highest  induction  in  luciferase  activity(nine fold activity compared to the uninducedstate) was seen with a construct carrying twocopies  of  hGCLM  ARE.  Thus,  this  vectorwas used for the following studies. When theluciferase  reporter  gene  was  replaced  withthe  potential  therapeutic  gene,  hemeoxygenase  1  (HO­1),  a  10­fold  induction  ofgene  expression  was  seen.  This  is  asignificant  result,  as    the  most  advancedhypoxia­induced  vector  system  yield  sevenfold  induction  in  gene  expression  uponhypoxia in cell culture (Tang et al., 2005). Inaddition,  we  used  TNF­   to  mimic  vascular

inflammation  in  HUVECs  and  studied  theeffect  of  ARE­induced  HO­1  therapeuticgene  expression  on  the  expression  of  theproinflammatory factor, VCAM­1. Our resultsshowed  that  ARE  induced  HO­1  geneexpression  was  able  to  decrease  theexpression of VCAM­1 and thus, the systemholds  potential  for  the  therapy  of  oxidativestress.

Based  on  our  results  the  genetic  AREelements,  induced  cytoprotective  genes  byoxidative  stress,  and  can  be  exploited  ingene transfer vectors. Since oxidative stresscan  not  be  completely  mimicked  in  cellculture  conditions,  the  true  performance  ofour  ARE  vectors  need  to  be  defined  inanimal  models.  Considering  the  lentiviralvector  tropism  for  brain  tissue,  anexperimental  model  of  stroke  might  beoptimal  for  these  studies.  Also,  for  thepromotion  of  cell  survival  in  oxidativeconditions  in  progenitor  cell  therapyapproaches,  our  lentiviral  ARE  constructsmay  be  readily  applicable.  As  oxidativestress  plays  a  role  in  atherosclerosis,restenosis and ischemia­reperfusion injury ofmyocardium  and  skeletal  muscle,  the  AREinduced  expression  of  therapeutic  genesusing  AAV  vector,  which  has  proved  to  bemore  effective  at  the  transduction  of  thesetissues, is an appealing concept.

The performance of lentiviral HIV­1derived vector in cardiovasculargene therapy applications(unpublished data)

Most  of  the  previous  gene  therapyapplications  for  cardiovascular  diseaseshave  used  adenoviruses.  Despite  theirefficiency,  only  short­term  transgeneexpression  is  achieved;  maximal  proteinexpression  is  achieved  after  four  days  andthis  declines  to  below  detection  level  aftertwo  weeks  in  most  applications.  Severalcardiovascular  applications  would  benefitfrom long­term therapeutic gene expression.

48

Therefore,  we  tested  the  efficiency  of  theHIV­1  derived,  third  generation  self­inactivating LV to transduce skeletal muscle,blood vessel and myocardium and mediate atherapeutic  effect. The  results  of  these  pilotstudies are summarized in Table 9.

The intraluminal approach may be performedsimultaneously  with  angioplasty  and  is  apotential  choice  for  the  administration  ofvectors  for  gene  therapy  of  restenosis.  Westudied the efficacy of LV in the blood vesselby  intraluminal  administration  in  a  rabbitmodel (Gruchala et al., 2004). In a subgroupof  rabbits,  mechanical  injury  by  ballooncatheter  was  performed  simultaneously  todisrupt  the  endothelial  cell  layer  and  theinternal elastic  lamina of the blood vessel  inorder  to  model  balloon  angioplastyrevascularization  procedure.  As a  result,  noLacZ gene expression was detected by X­galstaining  or  RT­PCR  in  arterial  samples  ofrabbits  sacrificed  seven  days  after  vectoradministration  into  the  lumen  of  intactarteries, whereas in the samples of denudedarteries  LacZ  gene  expression  could  bedetected  with  RT­PCR.  However,  ­galactosidase  positive  cells  were  notdetectable  by  X­gal  staining,  suggesting  alow  level  of  transgene  expression  onlydetectable  with  the  sensitive  RT­PCRmethod.  LacZ  expression  present  only  inarteries  preconditioned  with  balloon

denudation  may  be  due  to  the  abolishmentof  the  endothelial  cell  layer  or,  inducedproliferation  of  endothelial  and  smoothmuscle  cells  due  to  injury,  thus  facilitatingthe  viral  transduction.  In  intraluminal  genetransfer  of  the  rabbit  carotid  artery,  the useof AAV and adenoviral vectors have resultedin  effective  transduction  (Gruchala  et  al.,2004).  AAV  vectors  showed  efficienttransduction  of  smooth  muscle  cells  lastingfor  at  least  100  days  and  therefore,  can  beregarded  as  more  potent  arterial  genetransfer  vehicles  than  LVs  for  prolongedtherapeutic gene expression.

To study whether adventitial exposure of LVwould  result  in  a  significant  gene  transferefficiency into the blood vessel, we assesseda  model  of  periadventitial  administration  ofvector making use of a silastic collar placedaround  the  rabbit  carotid  artery  (Laitinen  etal., 1997). Ten days after LV administration,transgene expression could be detected withRT­PCR,  while  X­gal  staining  did  not  showthe  presence  of  positive  cells  suggesting  avery  low  efficacy  of  gene  transfer.  28  daysafter LV administration, LacZ expression wasno  longer detectable by RT­PCR. Based onthese  results,  we  concluded  LV  is  not  anideal  vector  for  periadventitial  arterial  genetransfer  requiring  long­term  transgeneexpression.

49

Tabl

e 9.

 Pilo

t stu

dies

 for t

he e

valu

atio

n of

 LV 

gene

 tran

sfer

 effi

cacy

 for c

ardi

ovas

cula

r gen

e th

erap

y

Anim

alM

odel

Vect

orn

Follo

w­

up (day

s)

Anal

ysis

 met

hods

 and

 resu

lts fo

r LV

gene

 tran

sfer

Car

otid

 arte

ry, i

ntra

lum

inal

 adm

inis

tratio

n (G

ruch

ala

et a

l 200

4)R

RL­

LacZ

2 7

X­ga

l sta

inin

g (­)

, RT­

PCR

 (­)

Car

otid

 arte

ry, i

ntra

lum

inal

 adm

inis

tratio

n,pr

econ

ditio

ned 

with

 bal

loon

 ang

iopl

asty

 (Gru

chal

aet

al 2

004)

RR

L­La

cZ2 

7X­

gal s

tain

ing 

(­), R

T­PC

R (+

)

Car

otid

 arte

ry, p

eria

dven

tital

 adm

inis

tratio

n w

ithsi

last

ic c

olla

r (La

itine

net

 al 1

997)

RR

L­La

cZ2 2

10 28X­

gal s

tain

ing 

(­), R

T­PC

R (+

)X­

gal s

tain

ing 

(­), R

T­PC

R (­

)

Skel

etal

 mus

cle,

 intra

mus

cula

r inj

ectio

n (R

issa

nen

et a

l 200

3)

RR

L­La

cZ

RR

L­VE

GF­

D

3 4 2

7 21 21

X­ga

l sta

inin

g (­)

, RT­

PCR

 (+), 

PCR

 (+)

X­ga

l sta

inin

g (­)

, RT­

PCR

 (­), 

PCR

 (­),

perfu

sion

 (­)

RT­

PCR

 (­), 

PCR

 (­), 

Mile

s as

say 

(­),

perfu

sion

 (­), 

IHC

 (­)

Rab

bit

Skel

etal

 mus

cle,

 intra

mus

cula

r inj

ectio

n,pr

econ

ditio

ned 

with

 bup

ivac

aine

 (Ris

sane

net

 al

2003

)

RR

L­La

cZ

RR

L­VE

GF­

D

1 2

21 21

X­ga

l sta

inin

g (­)

, RT­

PCR

 (­), 

PCR

 (­),

perfu

sion

 (­)

RT­

PCR

 (­), 

PCR

 (­), 

Mile

s as

say 

(­),

perfu

sion

 (­), 

IHC

 (­)

Pig

Intra

myo

card

ial i

njec

tion 

(Rut

anen

et a

l 200

4)R

RL­

VEG

F­D

 3 

14pe

rfusi

on (­

), M

iles 

assa

y (­)

, IH

C (­

)

Abbr

evia

tions

 use

d in

 the 

tabl

e: L

acZ:

 ­g

alac

tosi

dase

, VEG

F­D

: vas

cula

r end

othe

lial g

row

th fa

ctor

­D, R

T­PC

R: r

ever

se tr

ansc

riptio

n po

lym

eras

ech

ain 

reac

tion,

 IHC

: im

mun

ohis

toch

emis

try

50

The efficacy of LV gene transfer was studiedin  rabbit  skeletal  muscle  to  assess  itspotential  to  be  utilized  in  long­term  genetherapy applications in a rabbit model of hindlimb  ischemia.  Seven  days  afterintramuscular  injections,  LacZ  geneexpression and LV vector presence could bedetected  by  RT­PCR  or  genomic  PCR.However,  in  tissue  sections,  transgeneexpression  was  not  detectable  by  X­galstaining.  Three  weeks  after  LV  injections,transgene  expression  or  vector  presencecould  not  be  detected  with  RT­PCR  orgenomic PCR. Also, in animals injected withLV­VEGF­D C,  the  effects  typical  for  thisgrowth  factor  could  not  be  detected,including  enhanced  blood  perfusionassessed  with  ultrasound,  increasedextravasated  plasma  proteins  from  newlyformed  vessels  within  the  tissue  measuredby Miles assay or, promoted capillary vesselformation detected by immunohistochemistry(Rissanen  et  al.,  2003b).  In  a  subgroup  ofanimals,  we  studied  if  LV  transfer  efficiencycould  be  increased  by  musclepreconditioning  with  injections  of  localanaesthetic,  bupivacaine,  which  isconsidered  myotoxic  and  therefore  mightenhance proliferative activity of muscle cells(Wells,  1993).  As  studied  21  days  after  LVinjections,  bupivacaine  pretreatment  ofmuscle  was  not  seen  to  promote  LVtransduction.

In  our  hands,  LV mediated gene  transfer  inrabbit models of cardiovascular gene therapydid  not  show  potency.  Supporting  ourfinding,  there  are  reports  suggesting  thatrabbit  cells  are  to  some  extent  resistant  totransduction  by  HIV­1  derived,  VSV­Gpseudotyped  LVs in  vitro  (Hofmann  et  al.,1999,  Ikeda  et  al.,  2002).  According  to  theresults  of  Hofmann et  al,  human,  hamsterand pig cell lines are most prone to HIV­1 LVtransduction,  while  mouse,  rat  and  rabbitcells  lines  are  less  efficiently  transduced,listed  in  order  of  reducing  transductionefficiency.  This  is  in  line  with  our  own

observations  that  human  primary  cells  andcell  lines  are  very  efficiently  transduced invitro  even  with  low  multiplicities  of  infection(MOI)  of  the  viral  vector,  while  mouse,  ratand  rabbit  cell  lines  require higher MOIs  forefficient  transduction  (Koponen  JK  andMäkinen  P,  unpublished  data).  Theseobservations  may  be  explained  by  species­specific  host  cellular  factors  that  limit  thepost­entry events of the viral vector, such asthe  nuclear  translocation  (Hofmann  et  al.,1999). Based on the in vitro results showingHIV­1 being more  prone  to  the  transductionof human cell lines, it is impossible to predictif LVs could mediate efficient gene transfer inhuman tissues.

The  myocardium  is  an  important  targettissue  for  cardiovascular  gene  therapyincluding many applications where sustainedexpression of the therapeutic gene would beessential.  We  studied  the  efficacy  of  LV  inpig  myocardium  by  the  intramyocardialapproach.  We  assessed  a  gene  transfervector  injection  technique  readily  applicablefor clinical use, the NOGA­catheter ­assistedinjections with electromechanical mapping ofthe myocardium (Rutanen et al., 2004). Afterinjections  of  LV­  VEGF­D C  we  searchedfor the effects of the growth factor previouslyseen  in  both  skeletal  muscle  (Rissanen  etal., 2003b) and myocardium (Rutanen et al.,2004). We were unable  to  see VEGF­D C

mediated effect by ultrasound measurementof  blood  perfusion  (6  days  after  injections),or  by  Miles  assay  for  the  detection  ofextravasated  proteins  from  newly  formedcapillary  vessel  or  induced  capillaryangiogenesis  in  immunohistochemicalstainings  (14  days  after  the  injections).Therefore,  we  concluded  LV  gene  transferinsufficient to trigger therapeutic effect in pigmyocardium.

As  the  pilot  animal  studies  with  LVs,performed  in  our  previously  establishedanimal  models  of  cardiovascular  genetherapy,  and  described  in  this  thesis,

51

resulted  in  no  positive  LV  transduced  cells(as  detected  by  histological  methods)  andwas  inefficient  in  terms  of  the  effect  oftransgene expression, we concluded that thegene  transfer  efficiency  was  below  what  isrequired  for  a  therapeutic  effect.  In  fact,  atleast  in  their  current  form,  LVs  seemcomparatively  poor  at  delivering  genes  intothe  liver  and  muscle.  Despite  someencouraging  results  originally  obtained  withHIV­1  LVs  (Kafri  et  al.,  1997),  furtherexperiments  have  generally  revealed  lowefficacies,  at  least  in  adult  animals.  In  aprevious  study  from  our  research  group,  amodest  LV  gene  transfer  efficiency  of  lessthan  0.01%  of  the  liver  cells  has  beenreported in a rabbit model of FH (Kankkonenet al., 2004). However, in this model even alow level of LDL receptor gene  transfer wassufficient  to  produce  a  long­term  serumcholesterol  reducing  effect  probably  due  tothe fact that even a low number of cells witha  functional  LDL  receptor  are  adequate  forsuch  an  effect.  In  terms  of  gene  transferefficiency,  it  appears  that  adenoviral  andAAV  vectors  are  better  suited  for  therapiestargeted to the liver or muscle, which seemsto apply to blood vessel as well (Gruchala etal.,  2004).  Nevertheless,  LVs  still  showexcellent  performance  in  gene  delivery  intothe central nervous system, retinal cells andinto  the  cells  of  lympho­hematopoieticsystem.  In  relation  to  cardiovascular  genetherapy, the ability of LVs to transduce HSCsmay hold therapeutic potential. For example,ex  vivo  genetic  manipulation  of  progenitorcells  of  the  monocyte  lineage  could  beutilized  to modify  the effect of macrophagesin the development of atherosclerotic lesionsor  restenosis  or,  to  take  advantage  of  therecruitment  of  macrophages  into  areas  ofpathology  where  they  could  express  thetherapeutic  protein.  Also,  geneticmodification of stem and progenitor cells  forcombined  gene  and  cell  therapy  forcardiovascular  diseases  like  myocardialischemia is a  fascinating prospect for which

HIV­1 LV would be a highly potent vector ofchoice.

Cord blood­derived progenitor cellsin a mouse model for skeletalmuscle ischemia (III)

Progenitor  cell  therapy  is  a  novel  approachwhich  may  be  utilized  for  the  treatment  ofischemia  in  the  myocardium  and  skeletalmuscle.  Combining  gene  therapy  with  celltherapy  applications  allows  for  themodification  of  progenitor  cell  properties,such  as  cytokine  release,  surface  receptorexpression and factors potentially promotingcell  survival  in  conditions  like  ischemia  oroxidative  stress.  LVs  have  enabled  thegenetic modification of HSCs and embryonicstem cells that were nonpermissive to earliervectors,  especially  in  the  quiescent  state.Cytokines, for example, stem cell  factor andinterleukins, may be used to stimulate HSCsto  proliferate  and  facilitate  transduction.However,  as  it  is  important  to  precludeunwanted  differentiation  of  the  cells  bycytokine  induction,  an  efficient  transductionmethod for unstimulated cells  is essential.  Ithas  been  reported  that  cytokine  pre­treatment  of  human  CD34+  cells  reducestheir  long­term  engraftment  ability  in  miceindicating a defect  in cell survival or homingto  bone  marrow  (Ahmed  et  al.,  2004,  Wulf­Goldenberg  et  al.,  2007).  In  our  study,  weassessed  whether  cord  blood  derived  HSCsubfractions of CD34+ and CD133+ cells canbe  efficiently  transduced  by  LV  without  theneed  for cytokine  induced proliferation. At aLV  MOI  of  100,  we  achieved  comparabletransduction  efficiencies  with  and  withoutcytokine induction of both CD34+ (57.0% and52.5%,  respectively)  and  CD133+ (53.0%and 52.5%) cell subfractions as judged fromFACS  detecting  GFP  marker  genefluorescence.  Also,  we  used  cell  cycleanalysis  to  confirm  that  cytokines  inducedcell cycling in HSCs (data not shown). In themajority  of  published  reports  utilizing  LVgene transfer into HSCs, cytokine stimulation

52

has  been  used.  However,  to  excludecytokine  induced  effects, optimaltransduction  conditions  requiring  minimalmodifications  of  the  HSCs  should  bedetermined for each application. By a colonyforming  assay,  we  were  able  to  show  thatthe  ability  of  CD34+  and  CD133+ cells  todifferentiate  into  cells  of  the  hematopoieticlineage  was not altered by  LV  transduction,suggesting that their progenitor capacity wasnot affected. Also, we were able to efficientlytransduce  MSCs  and  as  detected  byadipogenic  and  osteogenic  differentiationassays, the transduced MSCs did retain theirdifferentiation ability.

Cord  blood  (CB)  is  an  excellent  source  ofprogenitor  cells  in  terms  of  a  highpercentage of stem cells and the presence ofimmature  HSCs  derived  from  a  youngindividual.  We  assessed  the  therapeuticpotential of two sub­populations of progenitorcells,  CD133+  and  MSCs,  in  a  nude  mousemodel  of  hind  limb  ischemia.  Cells  weretransduced  with  a  LV  vector  encoding  theGFP marker gene or the VEGF­D C growthfactor gene. Due to the more primitive natureof  CD133+  compared  to  CD34+ cells(Hemmoranta  et  al.,  2006),  the  CD133+

subpopulation  was  selected  to  be  tested  inthe  animal  model.  Also,  since  CD133+

antigen  expression  has  been  connected  toendothelial  progenitor  cells  (Gehling  et  al.,2000),  and  CB  derived  CD133+  cells  havebeen reported to be capable of differentiationinto endothelial and cardiomyocyte­like cellsin vitro (Bonanno et al., 2007), we wanted tosee  if  these  cells  could  incorporate  intonewly  forming  vessels  or  regeneratingmuscle.  MSCs  have  been  shown  to  becapable  of  multilineage  differentiation,  forexample into skeletal muscle cells (Pittengeret  al.,  1999)  and  therefore,  might  havetherapeutical  potential  in  the  regenerationprocess of ischemic muscle.

Because  of  the  contradictory  resultspublished  earlier,  mostly  concerning  cell

therapy  of  myocardial  ischemia,  we  alsoanalysed  whether  progenitor  cell  therapymight  mediate  a  therapeutic  effect  withoutcells directly participating in the regenerationprocess.  As  a  model  of  progenitor  cellmediated  gene  therapy,  we  also  assessedwhether  CB  cell  subfractions  expressingVEGF­D C  could  mediate  an  angiogeniceffect,  previously  shown  to  be  induced  bythis particular growth factor (Rissanen et al.,2003b, Rutanen et al., 2004, Kholova et al.,2007).  In  our  model,  we  injected  progenitorcell  suspensions  (total  cell  number  ~1×105)intramuscularly into the left hindlimb musclesof  nude  mice,  for  which  unilateral  hind  limbischemia  was  induced  by  femoral  arteryligation  immediately  before  injections.Animals were sacrificed 3, 7 or 21 days afterthe operation. We  were unable  to  show  thepresence  of  progenitor  cells  byimmunohistochemistry  at  any  of  the  timepoints,  as  studied  by  GFP­  or  human  cellmitochondrial  or  cytoskeleton  ­specificantibodies  in  immunohistochemistry  (datanot  shown).  By  human  chromosome  17  ­satellite  region  specific  PCR,  we  were  ableto  show  the  presence  of  human  geneticmaterial  in  the  injected  muscles  three  daysafter  injection.  However,  seven  days  post­injection human DNA was no longer present.Also, PCR­based detection does not indicateif the cells are alive. Our result is in line withthe  previous  observation  by  Tateno  et  al.,who have shown that mouse bone marrow ­derived mononuclear cells disappeared frommouse  ischemic  muscle  three  days  afterimplantation  (Tateno  et  al.,  2006).  It  isunknown,  whether  these  observations  aredue to the general inability of progenitor cellsto  engraft  or  are  attributed  to  ischemicconditions of the muscle, presumably limitingcell  survival.  By  counting  capillary  vessels,we  did  not  observe  enhanced  capillaryangiogenesis  in  mice  groups  injected  withCD133+ cells or MSCs  transduced with LV­VEGF­D C or LV­GFP, when compared tothe control group. Since  the  typical effect ofVEGF­D C  was  not  seen,  we  concluded

53

that the injected cells did not secrete enoughgrowth  factor  to  induce  therapeuticangiogenesis.  This  might  be  due  to  a  tooshort  survival  time  of  the  cells  in  theischemic muscle. The direct incorporation ofbone  marrow  derived  progenitor  cells  intonew  or  remodelling  blood  vessels  in  theischemic  myocardium  and  skeletal  musclehas  been  previously  reported.  Themagnitude  of  cellular  incorporation  highlyvaries  between  studies.  Although  a  highoccurrence  of  capillaries  containingtransplanted  cells  has  been  depicted  insome  studies  (Asahara  et  al.,  1997, Kocheret al., 2001, Kawamoto et  al., 2003), only asingle  transplanted cell  in the circumferenceof  the  capillary  vessel  is  required  for  thevessel  to  be  counted  as  positive.  This  maylimit the interpretation of the true effect of cellincorporation  into  structures  of  a  vascularbead.  Furthermore,  some  studies  havereported  only  small  numbers  of  positivevessels, despite impressive improvements inblood  perfusion  (Tomita  et  al.,  1999, Wanget al., 2001, Iba et al., 2002), suggesting theexistence  of  alternative  mechanisms  to  thedirect  cellular  incorporation  mediating  theeffects.

In  our  study,  we  observed  increasedregeneration  of  ischemic  muscle  byprogenitor  cell  injections  (regeneratingmuscle area 86.7% ­ 93.8% in progenitor cellinjected  groups versus  73.2%  in  the controlgroup)  as  measured  from  the  histologysections  21  days  after  the  operation.  Ourresults  suggest  that  both  CB  CD133+  andMSC  –progenitor  cells  increase  theregeneration capacity of ischemic muscle bya  mechanism  unrelated  to  progenitor  cellengraftment.  As  an  alternative  mechanismfor  progenitor  cell  ­mediated  therapeuticresponse  in  ischemic  skeletal  muscle,  aparacrine  effect  has  been  suggested(Kinnaird  et  al.,  2004,  Ziegelhoeffer  et  al.,2004,  Tateno  et  al.,  2006).  This  might  bemediated  either  by  the  factors  released  bythe  progenitor  cells  themselves  or  by  tissue

resident  cells  stimulated  by  the  progenitorcells.  Immunohistochemical  staining  formacrophages  showed  a  higher  count  ofinfiltrated macrophages in the progenitor cellinjected  muscles.  In  fact,  impairedmacrophage  recruitment  has  been  reportedto  cause  delayed  recovery  of  hind  limbfunction,  increased  muscle  atrophy  andfibrosis  in  a  hind  limb  ischemia  model  inCD4­knock­out  mice  (Stabile  et  al.,  2003).Therefore,  the  regenerative  effect  ofprogenitor  cell  injection  might  be  explainedby their attraction of monocytes resulting in ahigher  number  of  infiltrating  macrophages,which  might  further  stimulate  regenerationfor  example  by  the  release  of  cytokines.However, as we studied the effects of humanCB cells in mouse skeletal muscle ischemia,an immune deficient nude mouse model wasrequired,  limiting  the  interpretation of  issuesconcerning inflammatory mechanisms.

Overall,  the  mechanisms  of  progenitor  cellmediated  response  in  ischemic myocardiumand  skeletal  muscle  require  furtherevaluation.  Therefore,  new  experimentalstudies  are  warranted.  Clinical  trials  havebeen focused mostly on myocardial ischemia(Wollert  et  al.,  2005)  rather  than  skeletalmuscle  ischemia  (Tateishi­Yuyama  et  al.,2002a,  Ishida  et  al.,  2005).  Nevertheless,skeletal  muscle  ischemia  might  be  a  morepotent  candidate  for  progenitor  celltherapies,  since  there  is  no  need  forelectrical  coupling  of  engrafting  cells  andbecause  of  the  presumed  easieradministration  of  the  cell  preparation  in  theskeletal  muscle  compared  to  themyocardium. Also, the most potent subtypesand  sources  of  progenitor  cells  need  to  beidentified.  CB  is  enriched  with  HSCs  ascompared to other sources like bone marrowor  peripheral  blood.  A  world­wide  CBbanking  system  provides  rapid  supply  toHLA­typed CB tested for infectious agents asthe material can be shipped easily anywhere(Brunstein  et  al.,  2006).  This  makes  cordblood  an  optimal  source  for  progenitor  cell

54

preparations  for  clinical  use.  Thus,  thepotential  of  CB  derived  cells  in  differenttherapies is worth studying.

A  lentiviral vector  for  gene silencingby RNAi (IV)

A  wide  range  of  experimental  andtherapeutic  applications  would  benefit  fromsustained  RNAi­mediated  gene  silencing,which  is  not  achieved  by  introducingsynthetic  siRNA  oligonucleotides.  In  thesesituations  shRNA­mediated  silencingdelivered  into  a  target  cell  within  a  transfervector  is  applicable.  However,  specificconstructs  are required for each application.Pol  III  promoters  have  well­definedtranscriptional  start  sites  and  they  produceRNA  transcripts  lacking  a  polyadenylationtail  and  are  therefore  ideally  suited  for  theproduction  of  shRNAs.  We  compared  theefficiency  of  two  widely  used  Pol  IIIpromoters,  the  human  U6  small  nuclearpromoter  and  the  human  H1  promoter  fortheir  effects  on  gene  silencing  after  LVmediated  transfer of a shRNA against GFP.We chose the marker gene GFP as a targetgene because  it  is easily detected by FACSand fluorescence microscopy. Also, cell lineswith  stable  GFP  expression,  such  as  themouse  endothelial  cell  line  c166­GFP,  andGFP  transgenic  mice  are  commerciallyavailable.  Our  results  showed  that  by  LVmediated  transduction,  the  U6  promoter  ismore powerful than the H1 promoter for GFPmarker  gene  expression  silencing in  vitro  ina  GFP  expressing  endothelial  cell  line  asjudged  at  the  protein  level  by  FACS  (94%and  86%  silencing  for  U6  and  H1,respectively)  and  at  the  RNA  level  byquantitative RT­PCR (88% and 71%). Similarresults were obtained in vivo, in mouse brainas  revealed by  immunohistochemistry. Also,the  U6  promoter  was  found  to  be  moreeffective  than  the  H1  promoter  in  thesilencing of  the GAPDH housekeeping geneas  studied  by  RT­qPCR  (35%  and  22%).Compared  to  the  silencing  effect  of  the  U6

promoter  driven  vectors,  we  did  not  findenhanced silencing of GFP or GAPDH by avector  with  two  shRNA  cassettes  driven  byboth  promoters.  This  might  be  due  tomaximal  loading  of  the  small  RNA­guidedgene­silencing  pathway  in  the  transducedcells  achieved  by  strong  transcription  fromthe  U6  promoter.  The  fact  that  we  reachedfar more  efficient maximal  silencing  of GFPthan GAPDH gene transcription (88% versus35%)  might  be  due  to  tight  regulation  andhigher  expression  levels  of  the  GAPDHhousekeeping  gene  and  more  likely,  a  lessefficient RNAi target sequence. By assessingviral  vector  copy  number  in  the  genome  oftransduced  cells  by  southern  blot  we  wereable  to  confirm  the  more  powerful  effect  ofthe  U6  LVs  compared  to  the  H1  LVs.Namely, in comparison to a single copy of aU6 LV, a higher copy number of H1 LV (5­10copies)  was  required  for  an  equal  80%silencing  effect.  The  powerful  knock­downeffect obtained with a single  integrated copyof U6 LV suggests that our vector design hasthe  potential  for in  vivo  applications  andRNAi  applications  in  cells  which  are  noteasily transduced in vitro, including stem andprogenitor  cells  and  thus,  has  theapplicability  in  the  generation  of  transgenicmice.

We  also  studied  long­term  gene  silencingmediated by  LVs in  vitro  and in  vivo.  Sincethe silencing  of  the GFP marker  gene  doesnot  lead  to  a  loss  of  function  ­effect,  it  is  apotential  target  for  studying  long­termsilencing.  Our in  vitro results  showed  thatwith  all  constructs,  silencing  of  GFP  lastedup  to  28  weeks  and  remained  at  constantlevel,  as  assessed  by  FACS.  Further,stereotactic  injection of LV­U6shGFP or LV­H1shGFP  vectors  into  the  brain  of  GFPtransgenic mice showed GFP gene silencingfor  up  to  9  months  as  studied  byfluorescence  microscopy  of  frozen  brainsections.  The  merged  images  of  GFPfluorescence  and  immunohistochemicalstainings  with  a  fluorescent  signal  to  detect

55

marker gene  NGFR expression showed theco­localization  of  diminished  GFPfluorescence and the expression of  NGFR,further  confirming  vector­mediated  GFPsilencing.  This  suggests  the  usefulness  ofour  vector  in  the  field  of  brain  research,  forexample,  in  developing  either  models  ortherapeutic  tools  for  neurodegenerativediseases.

Originally,  siRNA  induced  gene  silencingwas  introduced  as  a  mechanism  which  canbe  utilized  without  inducing  a  type  1interferon response when dsRNA sequencesshorter  than 30 bp are used (Elbashir et al.,2001).  However,  it  has  been  shown  thatdsRNA  molecules  mediating  RNAi  maytrigger an  interferon  response by alternativepathways, like via Toll­like receptors (Seth etal.,  2006).  Therefore,  the  possibility  ofevoking an  interferon response needs  to beevaluated  for each application.  In our  study,we  used  RT­qPCR  to  study  the  potentialinduction of the mouse Oas­1a gene, whoseexpression  is  upregulated  by  an  interferonresponse. We found  that LV­mediated RNAidid not induce Oas­1a gene expression andthus  did  not  evoke  an  interferon  response.RNAi  induced off­target effects also need  tobe  assessed  for  each  application.  For  this,we analyzed the expression levels of MCP­1,VEGF­A and PDGFR­  genes, which are allexpressed  in  endothelial  cells.  We  foundthem  unaffected  by  shRNA  expressing  LVtransductions.  Despite  the  limited  geneexpression  array  analysis,  the  unchangedexpression  of  these  representative  genessuggests  a  lack  of  widespread  off­targeteffects by our vector design.

LV­mediated  shRNA  delivery  has  beensuccessfully  applied  by  others  in  variousapplications in vitro (Li et al., 2005a), in vivo(Raoul et al., 2005b, Pfeifer et al., 2006) andex vivo (Anderson et al., 2007, Ohmori et al.,2007)  and  also,  in  the generation  of  knock­out mice  (Tiscornia et al., 2003). Combiningthe  efficient  LV­mediated  generation  of

transgenic  mice  with  the  shRNA  approachresults  in  a  feasible  tool.  In  fact,  we  havealso  used  our  U6 driven  shRNA  LVs  in  thegeneration  of  knock­down  mice,  and  theanalysis  of  the  generated  mouse  lines  iscurrently  in  progress  (Hämäläinen et  al,unpublished data).

To  date,  the  advantages  of  utilizing  Pol  IIIpromoters  in  inducing  RNAi  have  beenclearly  demonstrated.  However,  one  majorlimitation of Pol III promoters  is  their  lack oftissue specificity. Therefore, Pol II promotershave also been utilized in RNAi vectors. ThePol  II  based  systems  mimic  miRNA­basedsilencing  (Zeng  et  al.,  2005),  meaning  thatthe transcript needs additional processing bythe  cellular  enzyme  Drosha  to  produce  ashRNA before Dicer­mediated processing toyield  siRNAs.  Because  this  system  mimicsthe  natural  miRNA  pathway,  it  might  proveadvantageous.  However,  it  adds  a  level  ofcomplexity  which  may  be  detrimental  insome settings. In addition, Pol II based RNAisystems  may  directly  utilize  regulatorysystems,  such  as  the  tetracycline  systems.In  fact,  several  systems  have  beendeveloped  for  both  Pol  II  and  Pol  III  basedRNAi  regulation,  either  reversibly  bydoxycycline or irreversibly by Cre­Lox basedsystems  (reviewed  in  Wiznerowicz  et  al.,2006).  Conditional  knock­down  approachesare  useful  for  therapeutic  applications  thatrequire  long­term  silencing,  fordevelopmental  research,  when  the  effect  ofknockdown of  lethal genes  is desired or,  formodelling  human  pathologies  in  animalmodels,  that  is  to  induce  and  revert  theshutoff  of a disease affecting gene, such asan  oncogene  or  tumor  suppressor  gene.Although using Pol II promoters for RNAi hascertain  advantages,  a  more  systematiccomparison  of  the  levels  of  RNAi  obtainedwith  Pol  III­driven  shRNAs  versus  Pol  II­driven  miRNA­based  shRNA  is  needed.Finally,  it  is  likely  that  for RNAi  applicationsranging from screening of shRNA libraries to

56

gene­based therapies, both systems may beuseful.

A real­time quantitative PCR ­approach for the analysis of lacZmarker gene expression (V)

Quantitative reverse transcription PCR (qRT­PCR)  is  a  method  for  quantitativedetermination of gene  expression. The  real­time ­method, a method monitoring the PCRreaction  in  the  thermal  cycler  as  itprogresses,  has  been  extensively  utilizedsince  first  discovered  (Gibson  et  al.,  1996).The real­time method utilizes 5’ exonucleaseactivity  of  Taq­DNA  polymerase  enzymethrough  the  use  of  sequence­specificfluorogenic  hydrolysis  (TaqMan®­chemistry).During  the  amplification  stage  of  the  PCRcycle, a probe that is specific to the amplifiedregion will bind, and as the DNA­polymerasesynthesizes  the  complementary  strand,  its5’­exonuclease  activity  degrades  the  boundprobe.  As  a  result,  once  the  fluorescentmolecules,  that  are  tagged  to  the  5’­end  ofthe  probe  are  released  from  the  closeproximity of the 3’­end fluorescent quenchingmolecules,  a  fluorescence  signal  isgenerated.  This  signal  fluorescence  can  bemeasured  and  it  is  proportional  to  theamplified product amount,  and thus,  relativeto  the amount of  starting material.  qPCR orqRT­PCR  methods  taking  advantage  of  thesequence  specific  probe  are  sensitive,specific  and  enable  quantitativedetermination  of  traces  of  sample  DNA  orvery low levels of target gene expression.

We assessed whether a  real­time qRT­PCRmethod  utilizing  TaqMan®­chemistry  wouldbe  suitable  for  the  quantification  of  LacZmarker  gene  expression.  This  method  wasintended  for  determining  the  LacZ  geneexpression level in our doxycycline regulatedLV­constructs and for assaying gene transferefficiency  and  biodistribution  of  various  viralvectors  in animal models.  However,  despitethe appropriate design of primers and probe,

qRT­PCR  analysis  constantly  resulted  in  astrong amplification  signal  from  the controlswhich  did  not  include  any  sample.  Further,we  did  not  observe  a  signal  in  the negativecontrols  for  18S  RNA  amplification,  anendogenous  control  used  to  normalize  theresults.  Since  the  possibility  of  externalcontamination of reagents was also ruled outby testing several aliquots, we reasoned thatthe amplified genetic material was originatingfrom  the  commercial  reagents  used.  TheLacZ  gene,  encoding  for  the  bacterial  ­galactosidase  enzyme,  origins  from E.coli.Unfortunately,  there  is  contaminatingbacterial DNA present in the Taq polymerase(Bottger,  1990,  Rand  et  al.,  1990),  whichgave rise to the strong amplification signal inour  qRT­PCR  method.  The  enzyme(AmpliTaq  Gold  DNA  polymerase®)  iscommercially  synthesized  in E.coli  as  arecombinant  protein,  and  the  incompletepurification of the enzyme results in traces ofbacterial  DNA  in  the  preparation.  In  ourhands,  the  amplification  of  the  controlsample  without  sample  resulted  in  a  strongamplification  signal  with  a  relatively  lowthreshold  cycle  (Ct=32),  indicating  aremarkable  amount  of  contaminatingsequence. The  resultant amplification of  thenegative  control  could  not  be  ruled  out  bymathematical  elimination,  since  theamplification  of  low concentrations  of  targetDNA  or  RNA would  presumably  be maskedby the contamination at this level. Therefore,we  concluded  that  our  method  was  notapplicable  for  the  intended  use.  Also,  if  thedetection  of  other  bacterial  genes  isperformed  with  a  comparable  method,adequate  controls  should  be  included  ineach  run to  rule out amplification originatingfrom  the  DNA  polymerase.  Today,commercial  DNA  polymerase  enzymes  ofgreater purity are available.  In  fact, Tondeuret al reported  that  the qRT­PCR method  forLacZ  gene  expression  designed  by  us  canbe  successfully  utilized  by  using  apolymerase  of  higher  purity,  AmpliTaq  GoldDNA polymerase low DNA®, or alternatively,

57

by treating the standard AmpliTaq Gold DNApolymerase®  with  DNAse  enzyme  prior  touse (Tondeur et al., 2004). This observationenables  the use of our qRT­PCR design  forthe  quantification  of  LacZ  gene  expressionand  detection  of  the  LacZ  encoding  vectorDNA.

CONCLUSIONS  AND  FUTUREPERSPECTIVES

Studies  included  in  this  thesis  indicate  theversatile  applicability  of  HIV­1  derived  LVs.In  our  studies,  third  generation  LVs  weresuccessfully used as a platform for regulatedgene  expression  induced  by  the  orallyavailable  drug,  doxycycline  or  anendogenous  pathophysiological  stimulus,oxidative  stress.  The  SIN­design  of  thirdgeneration  LVs,  whereby  after  vectorintegration  into  host  cell  genome  nopromoter activities are left in the LTR regionsflanking the integrated sequence, means thatpossible  promoter  interference  with  theregulated promoter is abolished and, may beone  key  factor  in  successful  transgeneregulation. In fact, inactive LTRs flanking thetransgene  cassette  might  also  operate  asgenomic  insulators  and  hinder  theinterference  of  genomic  promoters  near  theintegration  site  with  transgene  promoterregulation.  Also,  LVs  exploited  for  RNAiresulted  in  powerful,  long­term  genesilencing.  The in  vivo  performance  of  LV  incardiovascular  disease  gene  therapymodels,  whereby  the  rabbit  skeletal  muscleand blood vessel and pig myocardium wereused  as  target  tissues,  did  not  prove  to  beefficient.  However,  as  shown  by  us  andothers, LVs are valued because of their hightransduction  efficiency  into  the  stem  andprogenitor  cells  such  as  HCSs  and  ESCsand  are  thus,  excellent  candidates  for  genetransfer  vectors  in  progenitor  cell  therapiesand the generation of transgenic animals. Inour  studies,  we  also  took  advantage  of  thehigh  transduction  efficiency  of  LVs  into  thebrain  tissue.  In  their  current  form,  LVs

represent  excellent  tools  for  long­termgenetic  modification  of  the  cells  of  thelympho­hematopoietic  and  central  nervoussystem.  From  the  viewpoint  of  experimentalresearch,  third  generation  HIV­1  LVs  areeasy to produce by a simple co­transductionprotocol of four separate plasmids. However,for  the  clinical  use  of  LVs,  a  stableproduction  of  vectors  would  be  desirable.Safety issues regarding the use of HIV­1 LVsin clinical treatments are of concern. Herein,it should be noticed that third generation LVsdo not  transfer any viral genes into  the hostcell  genome  and,  the  packaging  system  isdeleted  of  genes  that  are  not  absolutelynecessary for vector production. Given thesemodifications  HIV­1  LVs  can  be  consideredas  highly  safe  for  experimental  use.However,  the  use  of  integrating  vectors  inclinical  gene  therapy  trials  is  under  thespotlight  because  of  the  lymphomas  thatoccurred  in  the  trial  for  the  treatment  of  X­linked SCID. It can not be predicted if  theseserious  adverse  effects  could  have  beenruled  out  with  the  use  of  SIN­vectorpossessing  inactive  LTRs.  It  may  beproposed  that  the  risk  of  insertionalmutagenesis  might  have  been  reduced  bythe  use  of  SIN­vectors.  The  results  of  thefirst  clinical  trial  with  the  HIV­1  LV  for  thetreatment of the HIV­1 infection suggest thatex vivo modification of autologous T­cells byLV is safe and efficient and transduced cellspersist in  vivo.  Moreover,  based  on  thisstudy,  LVs  hold  promise  for  efficient  genetransfer  into  cells  of  the  lympho­hematopoietic  system,  and  thus,  may  beutilized in a variety of therapies, for examplein combating viral infections, in the treatmentof  blood­cell  disorders  such  ashemoglobinopathies,  storage  and  metabolicdiseases, immunodeficiencies and cancer. Inthe design  of  these  therapies  the possibilityto  use  the  LV  as  a  platform  for  regulatedtransgene expression is of an advantage.

The  concept  of  progenitor  and  stem  celltherapies has shifted from the original idea of

58

cells taking part  in the regeneration processthrough  mechanisms  such  astransdifferentiation  or  cell  fusion,  into  abroader  hypothesis  that  cell  therapy  mightfacilitate  complementary  aspects  of  tissuerepair.  The  beneficial  effects,  althougharguable,  that  have  been  observed  in  theclinical  cell  therapy  trials  for  myocardialinfarction,  may  be  explained  by  theinvolvement of indirect mechanisms such asthe  secretion  of  paracrine  factors  by  thetherapy  cells,  or  by  their  effects  mediatingendogenous  regenerative  pathways  of  thetissue.  In  our  study,  we  demonstrated  abeneficial  effect  on  the  regeneratingischemic  skeletal muscle  by  the  injection ofprogenitor  cells.  As  we  could  not  detectengraftment  of  the  cells,  we  concluded  thatthe  effect  was  indirect  and  might  beassociated  with  enhanced  recruitment  ofmacrophages into the ischemic muscle area.Thus,  progenitor  cell inducedimmunostimulatory processes may also playa  role  in  cell  therapies.  In  conclusion,  abetter  understanding  of  cell  therapymechanisms  and  a critical  evaluation of  theresults  from  both  experimental  and  clinicalstudies  are  crucial  for  the  development  ofnew therapies.

Finally,  genetic  therapies,  either  alone  orcombined  with  cell  therapies,  hold  promisefor the treatment of cardiovascular diseases.The  development  of  suitable  gene  transfervectors for each specific application plays acritical  role  in  this  progress.  Along  with  theevolving  knowledge  of  the  human  genomeand  its  regulatory  mechanisms  and  themolecular  details  of  different  viruses,improved  gene  transfer  vectors  will  bedeveloped.  It  may  be  speculated  that  thefuture  gene  transfer  vectors  will  not  bedirectly  based  on  any  natural  viruses  butinstead,  will  be  based  on  engineered,synthetic  virus­like  vectors  mimickingcombined  features  of  several  differentviruses.

59

REFERENCES

Ahmed, F., Ings, S.J., Pizzey, A.R., Blundell, M.P.,Thrasher,  A.J.,  Ye,  H.T.,  Fahey,  A.,  Linch,  D.C.,and  Yong,  K.L.  (2004).  Impaired  bone  marrowhoming  of  cytokine­activated  CD34+  cells  in  theNOD/SCID model. Blood 103, 2079­2087.

Aiuti,  A.,  Cassani,  B.,  Andolfi,  G.,  Mirolo,  M.,Biasco,  L.,  Recchia,  A.,  Urbinati,  F.,  Valacca,  C.,Scaramuzza,  S.,  Aker,  M.  et  al.  (2007).Multilineage  hematopoietic  reconstitution  withoutclonal selection in ADA­SCID patients treated withstem cell gene therapy. J. Clin. Invest. 117, 2233­2240.

Anderson, J., Li, M.J., Palmer, B., Remling, L., Li,S.,  Yam,  P.,  Yee,  J.K.,  Rossi,  J.,  Zaia,  J.,  andAkkina,  R.  (2007).  Safety  and  efficacy  of  alentiviral  vector  containing  three  anti­HIV  genes­­CCR5 ribozyme, tat­rev siRNA, and TAR decoy­­inSCID­hu  mouse­derived  T  cells.  Mol.  Ther. 15,1182­1188.

Arsic,  N.,  Zentilin,  L.,  Zacchigna,  S.,  Santoro,  D.,Stanta, G., Salvi,  A., Sinagra, G.,  and Giacca,  M.(2003).  Induction  of  functional  neovascularizationby  combined  VEGF  and  angiopoietin­1  genetransfer using AAV vectors. Mol. Ther. 7, 450­459.

Asahara, T., Murohara, T., Sullivan, A., Silver, M.,van  der  Zee,  R.,  Li,  T.,  Witzenbichler,  B.,Schatteman,  G.,  and  Isner,  J.M.  (1997).  Isolationof  putative  progenitor  endothelial  cells  forangiogenesis. Science 275, 964­967.

Askari,  A.T.,  Unzek,  S.,  Popovic,  Z.B.,  Goldman,C.K., Forudi,  F., Kiedrowski,  M., Rovner, A., Ellis,S.G.,  Thomas,  J.D.,  DiCorleto,  P.E.,  Topol,  E.J.,and  Penn,  M.S.  (2003).  Effect  of  stromal­cell­derived  factor  1  on  stem­cell  homing  and  tissueregeneration in ischaemic cardiomyopathy. Lancet362, 697­703.

Balsam,  L.B.,  Wagers,  A.J.,  Christensen,  J.L.,Kofidis,  T.,  Weissman,  I.L.,  and  Robbins,  R.C.(2004).  Haematopoietic  stem  cells  adopt  maturehaematopoietic  fates  in  ischaemic  myocardium.Nature 428, 668­673.

Barton, G.M., and Medzhitov, R. (2002). Retroviraldelivery of small interfering RNA into primary cells.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 14943­14945.

Bartunek,  J.,  Dimmeler,  S.,  Drexler,  H.,Fernandez­Aviles,  F.,  Galinanes,  M.,  Janssens,S., Martin, J., Mathur, A., Menasche, P., Priori, S.et  al.  (2006).  The  consensus  of  the  task  force  of

the  European  Society  of  Cardiology  concerningthe  clinical  investigation  of  the  use  of  autologousadult  stem cells  for  repair  of  the  heart. Eur. HeartJ. 27, 1338­1340.

Bartunek, J., Vanderheyden, M., Vandekerckhove,B., Mansour, S., De Bruyne, B., De Bondt, P., VanHaute,  I., Lootens, N., Heyndrickx, G.,  and Wijns,W.  (2005).  Intracoronary  injection  of  CD133­positive  enriched  bone  marrow  progenitor  cellspromotes cardiac recovery after recent myocardialinfarction:  feasibility  and  safety.  Circulation 112,I178­83.

Biffi, A., De Palma, M., Quattrini, A., Del Carro, U.,Amadio,  S.,  Visigalli,  I.,  Sessa,  M.,  Fasano,  S.,Brambilla,  R.,  Marchesini,  S.,  Bordignon,  C.,  andNaldini,  L.  (2004).  Correction  of  metachromaticleukodystrophy  in  the  mouse  model  bytransplantation  of  genetically  modifiedhematopoietic  stem  cells.  J.  Clin.  Invest. 113,1118­1129.

Blaese,  R.M.,  Culver,  K.W.,  Miller,  A.D.,  Carter,C.S., Fleisher, T., Clerici, M., Shearer, G., Chang,L.,  Chiang,  Y.,  Tolstoshev,  P.  et  al.  (1995).  Tlymphocyte­directed gene therapy for ADA­ SCID:initial trial results after 4 years. Science 270, 475­480.

Bonanno, G.,  Mariotti, A., Procoli, A., Corallo, M.,Rutella,  S.,  Pessina,  G.,  Scambia,  G.,  Mancuso,S.,  and  Pierelli,  L.  (2007).  Human  cord  bloodCD133+ cells  immunoselected by  a clinical­gradeapparatus differentiate in vitro into endothelial­ andcardiomyocyte­like cells. Transfusion 47, 280­289.

Bornkamm,  G.W.,  Berens,  C.,  Kuklik­Roos,  C.,Bechet, J.M., Laux, G., Bachl, J., Korndoerfer, M.,Schlee,  M.,  Holzel,  M.,  Malamoussi,  A.  et  al.(2005). Stringent doxycycline­dependent control ofgene  activities  using  an  episomal  one­vectorsystem. Nucleic Acids Res. 33, e137.

Bottger,  E.C.  (1990).  Frequent  contamination  ofTaq polymerase with DNA. Clin. Chem. 36, 1258­1259.

Britten,  M.B.,  Abolmaali,  N.D.,  Assmus,  B.,Lehmann,  R.,  Honold,  J.,  Schmitt,  J.,  Vogl,  T.J.,Martin,  H.,  Schachinger,  V.,  Dimmeler,  S.,  andZeiher,  A.M.  (2003).  Infarct  remodeling  afterintracoronary  progenitor  cell  treatment  in  patientswith acute myocardial  infarction (TOPCARE­AMI):mechanistic insights from serial contrast­enhancedmagnetic  resonance  imaging.  Circulation 108,2212­2218.

60

Brummelkamp, T.R., Bernards, R., and Agami, R.(2002).  A  system  for  stable  expression  of  shortinterfering RNAs in mammalian cells. Science 296,550­553.

Brunstein,  C.G.,  and  Wagner,  J.E.  (2006).Umbilical  cord  blood  transplantation  and  banking.Annu. Rev. Med. 57, 403­417.

Burcin,  M.M.,  Schiedner,  G.,  Kochanek,  S.,  Tsai,S.Y.,  and  O'Malley,  B.W.  (1999).  Adenovirus­mediated regulable target gene expression in vivo.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 355­360.

Cao, R., Brakenhielm, E., Pawliuk, R., Wariaro, D.,Post,  M.J.,  Wahlberg,  E.,  Leboulch,  P.,  and  Cao,Y. (2003). Angiogenic synergism, vascular stabilityand  improvement  of  hind­limb  ischemia  by  acombination of PDGF­BB and FGF­2. Nat. Med. 9,604­613.

Cardone, M. (2007). Prospects for gene therapy ininherited neurodegenerative diseases. Curr. Opin.Neurol. 20, 151­158.

Carette,  J.E.,  Graat,  H.C.,  Schagen,  F.H.,Mastenbroek,  D.C.,  Rots,  M.G.,  Haisma,  H.J.,Groothuis, G.M., Schaap, G.R., Bras, J., Kaspers,G.J.  et  al.  (2007).  A  conditionally  replicatingadenovirus  with  strict  selectivity  in  killing  cellsexpressing  epidermal  growth  factor  receptor.Virology 361, 56­67.

Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G.,Gepstein,  A.,  Yankelson,  L.,  Aronson,  D.,  Beyar,R.,  and  Gepstein,  L.  (2007).  Transplantation  ofhuman  embryonic  stem  cell­derivedcardiomyocytes improves myocardial performancein  infarcted  rat  hearts.  J.  Am.  Coll.  Cardiol. 50,1884­1893.

Chen, S.L., Fang, W.W., Ye, F., Liu, Y.H., Qian, J.,Shan, S.J., Zhang, J.J., Chunhua, R.Z., Liao, L.M.,Lin,  S.,  and  Sun,  J.P.  (2004).  Effect  on  leftventricular function of intracoronary transplantationof  autologous  bone  marrow  mesenchymal  stemcell  in  patients  with  acute  myocardial  infarction.Am. J. Cardiol. 94, 92­95.

Chenuaud,  P.,  Larcher,  T.,  Rabinowitz,  J.E.,Provost,  N.,  Joussemet,  B.,  Bujard,  H.,  Samulski,R.J.,  Favre,  D.,  and  Moullier,  P.  (2004).  Optimaldesign  of  a  single  recombinant  adeno­associatedvirus  derived  from  serotypes  1  and  2  to  achievemore  tightly  regulated  transgene  expression  fromnonhuman primate muscle. Mol. Ther. 9, 410­418.

Cherry,  S.R.,  Biniszkiewicz,  D.,  van  Parijs,  L.,Baltimore, D.,  and Jaenisch, R.  (2000). Retroviralexpression  in  embryonic  stem  cells  and

hematopoietic stem cells. Mol. Cell. Biol. 20, 7419­7426.

Cho,  C.H.,  Kim,  K.E.,  Byun,  J.,  Jang,  H.S.,  Kim,D.K.,  Baluk, P., Baffert, F., Lee, G.M., Mochizuki,N., Kim, J. et al. (2005). Long­term and sustainedCOMP­Ang1  induces  long­lasting  vascularenlargement  and  enhanced  blood  flow. Circ. Res.97, 86­94.

Choate,  K.A.,  and  Khavari,  P.A.  (1997).  Directcutaneous  gene delivery  in  a  human genetic skindisease. Hum. Gene Ther. 8, 1659­1665.

Cleland, J.G., Coletta, A.P., Abdellah, A.T., Nasir,M.,  Hobson,  N.,  Freemantle,  N.,  and  Clark,  A.L.(2007).  Clinical  trials  update  from  the  AmericanHeart  Association  2006:  OAT,  SALT  1  and  2,MAGIC, ABCD, PABA­CHF,  IMPROVE­CHF,  andpercutaneous  mitral  annuloplasty.  Eur.  J.  HeartFail. 9, 92­97.

Coffin,  J.,  Haase,  A.,  Levy,  J.A.,  Montagnier,  L.,Oroszlan, S., Teich, N., Temin, H., Toyoshima, K.,Varmus, H., and Vogt, P. (1986). What to call  theAIDS virus? Nature 321, 10.

Consiglio,  A.,  Gritti,  A.,  Dolcetta,  D.,  Follenzi,  A.,Bordignon,  C.,  Gage,  F.H.,  Vescovi,  A.L.,  andNaldini,  L.  (2004).  Robust  in  vivo  gene  transferinto  adult  mammalian  neural  stem  cells  bylentiviral  vectors.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.101, 14835­14840.

Crittenden, M., Gough, M., Chester, J., Kottke, T.,Thompson, J., Ruchatz, A., Clackson, T., Cosset,F.L.,  Chong,  H.,  Diaz,  R.M.  et  al.  (2003).Pharmacologically  regulated  production  oftargeted  retrovirus  from  T  cells  for  systemicantitumor  gene  therapy.  Cancer  Res. 63, 3173­3180.

D'Anneo,  A., Rood, P., Bottino, R.,  Balamurugan,A.N.,  He,  J.,  and  Giannoukakis,  N.  (2006).  Genetherapy  for  type  1  diabetes:  is  it  ready  for  theclinic? Immunol. Res. 36, 83­89.

de  Almeida,  L.P.,  Zala,  D.,  Aebischer,  P.,  andDeglon,  N.  (2001).  Neuroprotective  effect  of  aCNTF­expressing  lentiviral  vector  in  the quinolinicacid rat model of Huntington's disease. Neurobiol.Dis. 8, 433­446.

Deasy, B.M.,  Li,  Y.,  and Huard, J.  (2004). Tissueengineering  with  muscle­derived  stem  cells.  Curr.Opin. Biotechnol. 15, 419­423.

Deglon,  N.,  Tseng,  J.L.,  Bensadoun,  J.C.,  Zurn,A.D.,  Arsenijevic,  Y.,  Pereira  de  Almeida,  L.,Zufferey, R., Trono, D., and Aebischer, P. (2000).

61

Self­inactivating  lentiviral  vectors  with  enhancedtransgene  expression  as  potential  gene  transfersystem  in  Parkinson's  disease.  Hum.  Gene  Ther.11, 179­190.

Ding,  Z.,  Georgiev,  P.,  and  Thony,  B.  (2006).Administration­route  and  gender­independentlong­term  therapeutic  correction  ofphenylketonuria  (PKU)  in  a  mouse  model  byrecombinant  adeno­associated  virus  8pseudotyped vector­mediated gene transfer. GeneTher. 13, 587­593.

Dodart,  J.C.,  Marr,  R.A.,  Koistinaho,  M.,Gregersen,  B.M.,  Malkani,  S.,  Verma,  I.M.,  andPaul,  S.M.  (2005).  Gene  delivery  of  humanapolipoprotein  E  alters  brain  Abeta  burden  in  amouse  model  of  Alzheimer's  disease.  Proc.  Natl.Acad. Sci. U. S. A. 102, 1211­1216.

Dropulic,  B.,  and  June,  C.H.  (2006).  Gene­basedimmunotherapy for human immunodeficiency virusinfection  and  acquired  immunodeficiencysyndrome. Hum. Gene Ther. 17, 577­588.

Eastham,  J.A.,  Grafton,  W.,  Martin,  C.M.,  andWilliams,  B.J.  (2000).  Suppression  of  primarytumor  growth  and  the  progression  to  metastasiswith p53  adenovirus  in human prostate cancer. J.Urol. 164, 814­819.

Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin,A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001). Duplexes of21­nucleotide  RNAs  mediate  RNA  interference  incultured mammalian cells. Nature 411, 494­498.

Epanchintsev,  A.,  Jung,  P.,  Menssen,  A.,  andHermeking,  H.  (2006).  Inducible  microRNAexpression  by  an  all­in­one  episomal  vectorsystem. Nucleic Acids Res. 34, e119.

Erbs,  S.,  Linke,  A.,  Adams,  V.,  Lenk,  K.,  Thiele,H.,  Diederich,  K.W.,  Emmrich,  F.,  Kluge,  R.,Kendziorra,  K.,  Sabri,  O.,  Schuler,  G.,  andHambrecht,  R.  (2005).  Transplantation  of  blood­derived  progenitor  cells  after  recanalization  ofchronic coronary artery occlusion: first randomizedand  placebo­controlled  study.  Circ.  Res. 97, 756­762.

Fernandez­Aviles,  F.,  San  Roman,  J.A.,  Garcia­Frade,  J.,  Fernandez,  M.E.,  Penarrubia,  M.J.,  dela  Fuente,  L.,  Gomez­Bueno,  M.,  Cantalapiedra,A.,  Fernandez,  J.,  Gutierrez,  O.  et  al.  (2004).Experimental and clinical regenerative capability ofhuman  bone  marrow  cells  after  myocardialinfarction. Circ. Res. 95, 742­748.

Fire,  A.,  Xu,  S.,  Montgomery, M.K.,  Kostas,  S.A.,Driver,  S.E.,  and  Mello,  C.C.  (1998).  Potent  and

specific  genetic  interference  by  double­strandedRNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806­811.

Flotte,  T.R.,  Ng,  P.,  Dylla,  D.E.,  McCray,  P.B.,Jr,Wang,  G.,  Kolls,  J.K.,  and  Hu,  J.  (2007).  Viralvector­mediated  and  cell­based  therapies  fortreatment  of  cystic  fibrosis.  Mol.  Ther. 15, 229­241.

Follenzi,  A.,  Ailles,  L.E.,  Bakovic,  S.,  Geuna,  M.,and  Naldini,  L.  (2000).  Gene  transfer  by  lentiviralvectors  is  limited  by  nuclear  translocation  andrescued by HIV­1 pol sequences. Nat. Genet. 25,217­222.

Follenzi,  A.,  Battaglia,  M.,  Lombardo,  A.,  Annoni,A.,  Roncarolo,  M.G.,  and  Naldini,  L.  (2004).Targeting  lentiviral  vector  expression  tohepatocytes  limits  transgene­specific  immuneresponse and establishes long­term expression ofhuman  antihemophilic  factor  IX  in  mice.  Blood103, 3700­3709.

Foster,  K.,  Foster,  H.,  and  Dickson,  J.G.  (2006).Gene  therapy  progress  and prospects: Duchennemuscular dystrophy. Gene Ther. 13, 1677­1685.

Frankel,  A.D.,  and  Young,  J.A.  (1998).  HIV­1:fifteen proteins and an RNA. Annu. Rev. Biochem.67, 1­25.

Fuchs,  S.,  Satler,  L.F.,  Kornowski,  R.,  Okubagzi,P.,  Weisz,  G.,  Baffour,  R.,  Waksman,  R.,Weissman,  N.J.,  Cerqueira,  M.,  Leon,  M.B.,  andEpstein,  S.E.  (2003).  Catheter­based  autologousbone  marrow  myocardial  injection  in  no­optionpatients with advanced coronary artery disease: afeasibility  study.  J.  Am.  Coll.  Cardiol. 41, 1721­1724.

Galimi, F., Saez, E., Gall, J., Hoong, N., Cho, G.,Evans,  R.M.,  and  Verma,  I.M.  (2005).Development  of  ecdysone­regulated  lentiviralvectors. Mol. Ther. 11, 142­148.

Gao,  Q.,  Sun,  M.,  Wang,  X.,  Zhang,  G.R.,  andGeller, A.I. (2006). Long­term inducible expressionin  striatal  neurons  from  helper  virus­free  HSV­1vectors  that  contain  the  tetracycline­induciblepromoter system. Brain Res. 1083, 1­13.

Gao,  X.,  Kim,  K.S.,  and  Liu,  D.  (2007).  Nonviralgene  delivery:  what  we  know  and  what  is  next.AAPS J. 9, E92­104.

Gehling,  U.M.,  Ergun,  S.,  Schumacher,  U.,Wagener,  C.,  Pantel,  K.,  Otte,  M.,  Schuch,  G.,Schafhausen, P., Mende, T., Kilic, N. et al. (2000).In  vitro  differentiation  of  endothelial  cells  from

62

AC133­positive  progenitor  cells.  Blood 95, 3106­3112.

Gibson,  U.E.,  Heid,  C.A.,  and  Williams,  P.M.(1996).  A  novel  method  for  real  time  quantitativeRT­PCR. Genome Res. 6, 995­1001.

Giordano,  F.J.,  Ping,  P.,  McKirnan,  M.D.,  Nozaki,S.,  DeMaria,  A.N.,  Dillmann,  W.H.,  Mathieu­Costello,  O.,  and  Hammond,  H.K.  (1996).Intracoronary  gene  transfer  of  fibroblast  growthfactor­5  increases  blood  flow  and  contractilefunction  in  an  ischemic  region  of  the  heart.  Nat.Med. 2, 534­539.

Gowdak,  L.H.,  Poliakova,  L.,  Wang,  X.,  Kovesdi,I.,  Fishbein,  K.W.,  Zacheo,  A.,  Palumbo,  R.,Straino,  S.,  Emanueli,  C.,  Marrocco­Trischitta,  M.et  al.  (2000).  Adenovirus­mediated  VEGF(121)gene  transfer  stimulates  angiogenesis  innormoperfused  skeletal  muscle  and  preservestissue  perfusion  after  induction  of  ischemia.Circulation 102, 565­571.

Gregorevic,  P.,  Blankinship,  M.J.,  Allen,  J.M.,Crawford,  R.W.,  Meuse,  L.,  Miller,  D.G.,  Russell,D.W.,  and  Chamberlain,  J.S.  (2004).  Systemicdelivery of genes to striated muscles using adeno­associated viral vectors. Nat. Med. 10, 828­834.

Gropp,  M.,  Itsykson,  P.,  Singer,  O.,  Ben­Hur,  T.,Reinhartz,  E.,  Galun,  E.,  and  Reubinoff,  B.E.(2003).  Stable  genetic  modification  of  humanembryonic  stem  cells  by  lentiviral  vectors.  Mol.Ther. 7, 281­287.

Gruchala, M., Bhardwaj, S., Pajusola, K., Roy, H.,Rissanen, T.T., Kokina, I., Kholova, I., Markkanen,J.E.,  Rutanen,  J.,  Heikura,  T.  et  al.  (2004).  Genetransfer  into  rabbit  arteries  with  adeno­associatedvirus  and  adenovirus  vectors.  J.  Gene  Med. 6,545­554.

Hacein­Bey­Abina, S.,  von Kalle, C., Schmidt, M.,Le  Deist,  F.,  Wulffraat,  N.,  McIntyre,  E.,  Radford,I.,  Villeval,  J.L.,  Fraser,  C.C.,  Cavazzana­Calvo,M.,  and  Fischer,  A.  (2003).  A  serious  adverseevent  after  successful  gene  therapy  for  X­linkedsevere  combined  immunodeficiency.  N.  Engl.  J.Med. 348, 255­256.

Hallahan,  D.E.,  Mauceri,  H.J.,  Seung,  L.P.,Dunphy,  E.J.,  Wayne,  J.D.,  Hanna,  N.N.,Toledano,  A.,  Hellman,  S.,  Kufe,  D.W.,  andWeichselbaum, R.R.  (1995). Spatial  and  temporalcontrol  of  gene  therapy  using  ionizing  radiation.Nat. Med. 1, 786­791.

Han,  W.,  Wind­Rotolo,  M.,  Kirkman,  R.L.,  andMorrow,  C.D.  (2004).  Inhibition  of  human

immunodeficiency  virus  type  1  replication  bysiRNA  targeted  to  the  highly  conserved  primerbinding site. Virology 330, 221­232.

Haseltine,  W.A.  (1991).  Molecular  biology  of  thehuman  immunodeficiency  virus  type  1.  FASEB  J.5, 2349­2360.

Hellebrand,  E.,  Mautner,  J.,  Reisbach,  G.,Nimmerjahn,  F.,  Hallek,  M.,  Mocikat,  R.,  andHammerschmidt,  W.  (2006).  Epstein­Barr  virusvector­mediated gene  transfer  into human B cells:potential for antitumor vaccination. Gene Ther. 13,150­162.

Hemmoranta,  H.,  Hautaniemi,  S.,  Niemi,  J.,Nicorici,  D.,  Laine,  J.,  Yli­Harja,  O.,  Partanen,  J.,and  Jaatinen,  T.  (2006).  Transcriptional  profilingreflects  shared  and  unique  characters  for  CD34+and CD133+ cells. Stem Cells Dev. 15, 839­851.

Hendrikx, M., Hensen, K., Clijsters, C., Jongen, H.,Koninckx,  R.,  Bijnens,  E.,  Ingels,  M.,  Jacobs,  A.,Geukens, R., Dendale,  P. et al.  (2006). Recoveryof  regional  but  not  global  contractile  function  bythe direct intramyocardial autologous bone marrowtransplantation:  results  from  a  randomizedcontrolled clinical trial. Circulation 114, I101­7.

Hickman,  M.A.,  Malone,  R.W.,  Lehmann­Bruinsma,  K.,  Sih,  T.R.,  Knoell,  D.,  Szoka,  F.C.,Walzem,  R.,  Carlson,  D.M.,  and  Powell,  J.S.(1994).  Gene  expression  following  direct  injectionof DNA into liver. Hum. Gene Ther. 5, 1477­1483.

Hillen,  W.,  and  Berens,  C.  (1994).  Mechanismsunderlying  expression  of  Tn10  encodedtetracycline  resistance.  Annu.  Rev.  Microbiol. 48,345­369.

Hofmann,  A.,  Kessler,  B.,  Ewerling,  S.,  Weppert,M.,  Vogg,  B.,  Ludwig,  H.,  Stojkovic,  M.,Boelhauve, M., Brem, G., Wolf, E., and Pfeifer, A.(2003).  Efficient  transgenesis  in  farm  animals  bylentiviral vectors. EMBO Rep. 4, 1054­1060.

Hofmann,  A.,  Zakhartchenko,  V.,  Weppert,  M.,Sebald,  H.,  Wenigerkind,  H.,  Brem,  G.,  Wolf,  E.,and  Pfeifer,  A.  (2004).  Generation  of  transgeniccattle by lentiviral gene transfer  into oocytes. Biol.Reprod. 71, 405­409.

Hofmann, W., Schubert, D., LaBonte, J., Munson,L.,  Gibson,  S.,  Scammell,  J.,  Ferrigno,  P.,  andSodroski,  J.  (1999).  Species­specific,  postentrybarriers  to  primate  immunodeficiency  virusinfection. J. Virol. 73, 10020­10028.

Horn, P.A., Morris, J.C., Bukovsky, A.A., Andrews,R.G., Naldini, L., Kurre, P., and Kiem, H.P. (2002).

63

Lentivirus­mediated  gene  transfer  intohematopoietic repopulating cells in baboons. GeneTher. 9, 1464­1471.

Iba, O., Matsubara, H., Nozawa, Y., Fujiyama, S.,Amano,  K.,  Mori,  Y.,  Kojima,  H.,  and  Iwasaka,  T.(2002). Angiogenesis by implantation of peripheralblood  mononuclear  cells  and  platelets  intoischemic limbs. Circulation 106, 2019­2025.

Ikeda,  Y.,  Collins,  M.K.,  Radcliffe,  P.A.,Mitrophanous,  K.A.,  and  Takeuchi,  Y.  (2002).Gene  transduction  efficiency  in  cells  of  differentspecies  by  HIV  and  EIAV  vectors.  Gene  Ther. 9,932­938.

Immonen,  A.,  Vapalahti,  M.,  Tyynela,  K.,Hurskainen,  H.,  Sandmair,  A.,  Vanninen,  R.,Langford,  G.,  Murray,  N.,  and  Yla­Herttuala,  S.(2004). AdvHSV­tk  gene  therapy  with  intravenousganciclovir  improves  survival  in  human  malignantglioma: a randomised, controlled study. Mol. Ther.10, 967­972.

Inagaki, K., Fuess, S., Storm, T.A., Gibson, G.A.,Mctiernan, C.F., Kay, M.A.,  and Nakai, H.  (2006).Robust  systemic  transduction  with  AAV9  vectorsin  mice:  efficient  global  cardiac  gene  transfersuperior to that of AAV8. Mol. Ther. 14, 45­53.

Ishida,  A.,  Ohya,  Y.,  Sakuda,  H.,  Ohshiro,  K.,Higashiuesato,  Y.,  Nakaema,  M.,  Matsubara,  S.,Yakabi,  S.,  Kakihana,  A.,  Ueda,  M.  et  al.  (2005).Autologous  peripheral  blood  mononuclear  cellimplantation  for  patients  with  peripheral  arterialdisease improves limb ischemia. Circ. J. 69, 1260­1265.

Jackson,  A.L.,  Burchard,  J.,  Schelter,  J.,  Chau,B.N., Cleary, M., Lim, L., and Linsley, P.S. (2006).Widespread siRNA  "off­target"  transcript silencingmediated  by  seed  region  sequencecomplementarity. RNA 12, 1179­1187.

Jacobs,  A.H.,  Winkler,  A.,  Castro,  M.G.,  andLowenstein,  P.  (2005).  Human  gene  therapy  andimaging  in  neurological  diseases.  Eur.  J.  Nucl.Med. Mol. Imaging 32 Suppl 2, S358­83.

Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E.,and  Lundberg,  C.  (2003).  Targeted  transgeneexpression  in  rat  brain  using  lentiviral  vectors.  J.Neurosci. Res. 73, 876­885.

Janssens, S., Dubois, C., Bogaert, J., Theunissen,K.,  Deroose,  C.,  Desmet,  W.,  Kalantzi,  M.,Herbots,  L.,  Sinnaeve,  P.,  Dens,  J.  et  al.  (2006).Autologous  bone  marrow­derived  stem­celltransfer  in  patients  with  ST­segment  elevation

myocardial  infarction:  double­blind,  randomisedcontrolled trial. Lancet 367, 113­121.

Jiang,  H.,  Pierce,  G.F.,  Ozelo,  M.C.,  de  Paula,E.V., Vargas, J.A., Smith, P., Sommer, J., Luk, A.,Manno, C.S., High, K.A., and Arruda, V.R. (2006).Evidence  of  multiyear  factor  IX  expression  byAAV­mediated gene  transfer  to skeletal  muscle  inan individual with severe hemophilia B. Mol. Ther.14, 452­455.

Jiang,  Y.,  Jahagirdar,  B.N.,  Reinhardt,  R.L.,Schwartz,  R.E.,  Keene,  C.D.,  Ortiz­Gonzalez,X.R.,  Reyes,  M.,  Lenvik,  T.,  Lund,  T.,  Blackstad,M.  et  al.  (2002).  Pluripotency  of  mesenchymalstem cells derived from adult marrow. Nature 418,41­49.

Johns, D.C., Marx, R., Mains, R.E., O'Rourke, B.,and  Marban,  E.  (1999).  Inducible  geneticsuppression  of  neuronal  excitability.  J.  Neurosci.19, 1691­1697.

Judge,  A.D.,  Sood,  V.,  Shaw,  J.R.,  Fang,  D.,McClintock,  K.,  and  MacLachlan,  I.  (2005).Sequence­dependent  stimulation  of  themammalian  innate  immune  response  by syntheticsiRNA. Nat. Biotechnol. 23, 457­462.

Kafri,  T.,  Blomer,  U.,  Peterson,  D.A.,  Gage,  F.H.,and  Verma,  I.M.  (1997).  Sustained  expression  ofgenes  delivered  directly  into  liver  and  muscle  bylentiviral vectors. Nat. Genet. 17, 314­317.

Kang,  H.J.,  Lee,  H.Y.,  Na,  S.H.,  Chang,  S.A.,Park,  K.W.,  Kim,  H.K.,  Kim,  S.Y.,  Chang,  H.J.,Lee,  W.,  Kang,  W.J.  et  al.  (2006).  Differentialeffect  of  intracoronary  infusion  of  mobilizedperipheral blood stem cells by granulocyte colony­stimulating  factor  on  left  ventricular  function  andremodeling  in  patients  with  acute  myocardialinfarction  versus  old  myocardial  infarction:  theMAGIC  Cell­3­DES  randomized,  controlled  trial.Circulation 114, I145­51.

Kankkonen,  H.M.,  Vahakangas,  E.,  Marr,  R.A.,Pakkanen,  T.,  Laurema,  A.,  Leppanen,  P.,Jalkanen,  J.,  Verma,  I.M.,  and  Yla­Herttuala,  S.(2004).  Long­term  lowering  of  plasma  cholesterollevels  in  LDL­receptor­deficient  WHHL  rabbits  bygene therapy. Mol. Ther. 9, 548­556.

Karns,  L.R.,  Kisielewski,  A.,  Gulding,  K.M.,  Seraj,J.M., and Theodorescu, D. (2001). Manipulation ofgene  expression  by  an  ecdysone­inducible  geneswitch in tumor xenografts. BMC Biotechnol. 1, 11.

Katsantoni,  E.Z.,  Anghelescu,  N.E.,  Rottier,  R.,Moerland,  M.,  Antoniou,  M.,  de  Crom,  R.,Grosveld,  F.,  and  Strouboulis,  J.  (2007).

64

Ubiquitous  expression  of  the  rtTA2S­M2  induciblesystem  in  transgenic  mice  driven  by  the  humanhnRNPA2B1/CBX3 CpG island. BMC Dev. Biol. 7,108.

Kawamoto,  A.,  Tkebuchava,  T.,  Yamaguchi,  J.,Nishimura, H., Yoon, Y.S., Milliken, C., Uchida, S.,Masuo,  O.,  Iwaguro,  H.,  Ma,  H.  et  al.  (2003).Intramyocardial  transplantation  of  autologousendothelial  progenitor  cells  for  therapeuticneovascularization  of  myocardial  ischemia.Circulation 107, 461­468.

Kehat,  I.,  Khimovich,  L.,  Caspi,  O.,  Gepstein,  A.,Shofti, R., Arbel, G., Huber,  I., Satin, J.,  Itskovitz­Eldor,  J.,  and  Gepstein,  L.  (2004).Electromechanical  integration  of  cardiomyocytesderived  from  human  embryonic  stem  cells.  Nat.Biotechnol. 22, 1282­1289.

Kholova,  I., Koota,  S.,  Kaskenpaa, N.,  Leppanen,P.,  Narvainen,  J.,  Kavec,  M.,  Rissanen,  T.T.,Hazes,  T.,  Korpisalo,  P.,  Grohn,  O.,  and  Yla­Herttuala,  S.  (2007).  Adenovirus­mediated  genetransfer  of  human  vascular  endothelial  growthfactor­d  induces  transient  angiogenic  effects  inmouse  hind  limb  muscle.  Hum.  Gene  Ther. 18,232­244.

Kim,  D.H.,  and  Rossi,  J.J.  (2007).  Strategies  forsilencing  human  disease  using  RNA  interference.Nat. Rev. Genet. 8, 173­184.

Kinnaird,  T.,  Stabile,  E.,  Burnett,  M.S.,  Shou,  M.,Lee,  C.W.,  Barr,  S.,  Fuchs,  S.,  and Epstein,  S.E.(2004).  Local  delivery  of  marrow­derived  stromalcells  augments  collateral  perfusion  throughparacrine  mechanisms.  Circulation 109, 1543­1549.

Klein, N.C., and Cunha, B.A. (2001). New uses ofolder  antibiotics.  Med.  Clin.  North  Am. 85, 125­132.

Kocher,  A.A.,  Schuster,  M.D.,  Szabolcs,  M.J.,Takuma,  S.,  Burkhoff,  D.,  Wang,  J.,  Homma,  S.,Edwards,  N.M.,  and  Itescu,  S.  (2001).Neovascularization  of  ischemic  myocardium  byhuman bone­marrow­derived angioblasts preventscardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling andimproves cardiac function. Nat. Med. 7, 430­436.

Kordower, J.H., Emborg, M.E., Bloch, J., Ma, S.Y.,Chu,  Y.,  Leventhal,  L.,  McBride,  J.,  Chen,  E.Y.,Palfi,  S.,  Roitberg,  B.Z.  et  al.  (2000).Neurodegeneration  prevented  by  lentiviral  vectordelivery of GDNF in primate models of Parkinson'sdisease. Science 290, 767­773.

Kosaka,  Y.,  Kobayashi,  N.,  Fukazawa,  T.,Totsugawa, T., Maruyama, M., Yong, C., Arata, T.,Ikeda,  H.,  Kobayashi,  K.,  Ueda,  T.,  Kurabayashi,Y.,  and Tanaka, N.  (2004). Lentivirus­based genedelivery  in  mouse  embryonic  stem  cells.  Artif.Organs 28, 271­277.

Laflamme, M.A., Gold, J., Xu, C., Hassanipour, M.,Rosler,  E.,  Police,  S.,  Muskheli,  V.,  and  Murry,C.E.  (2005).  Formation  of  human  myocardium  inthe  rat  heart  from  human  embryonic  stem  cells.Am. J. Pathol. 167, 663­671.

Laitinen, M., Pakkanen, T., Donetti, E., Baetta, R.,Luoma, J., Lehtolainen,  P.,  Viita, H.,  Agrawal, R.,Miyanohara, A., Friedmann, T. et al. (1997). Genetransfer  into the carotid artery using an adventitialcollar:  comparison  of  the  effectiveness  of  theplasmid­liposome  complexes,  retroviruses,pseudotyped  retroviruses,  and  adenoviruses.Hum. Gene Ther. 8, 1645­1650.

Lamartina,  S.,  Roscilli,  G.,  Rinaudo,  C.D.,Sporeno,  E.,  Silvi,  L.,  Hillen,  W.,  Bujard,  H.,Cortese, R., Ciliberto, G.,  and Toniatti, C.  (2002).Stringent  control  of  gene  expression  in  vivo  byusing  novel  doxycycline­dependent  trans­activators. Hum. Gene Ther. 13, 199­210.

Lamartina,  S.,  Silvi,  L.,  Roscilli,  G.,  Casimiro,  D.,Simon, A.J., Davies,  M.E., Shiver, J.W., Rinaudo,C.D.,  Zampaglione,  I.,  Fattori,  E.  et  al.  (2003).Construction  of  an  rtTA2(s)­m2/tts(kid)­basedtranscription  regulatory  switch  that  displays  nobasal  activity,  good  inducibility,  and  highresponsiveness  to  doxycycline  in  mice  and  non­human primates. Mol. Ther. 7, 271­280.

Lebherz,  C.,  Gao,  G.,  Louboutin,  J.P.,  Millar,  J.,Rader, D., and Wilson, J.M. (2004). Gene therapywith  novel  adeno­associated  virus  vectorssubstantially  diminishes  atherosclerosis  in  amurine  model  of  familial  hypercholesterolemia.  J.Gene Med. 6, 663­672.

Lehtolainen,  P.,  Tyynela,  K.,  Kannasto,  J.,Airenne,  K.J.,  and  Yla­Herttuala,  S.  (2002).Baculoviruses exhibit restricted cell type specificityin  rat  brain:  a  comparison  of  baculovirus­  andadenovirus­mediated intracerebral gene transfer invivo. Gene Ther. 9, 1693­1699.

Levine, B.L., Humeau, L.M., Boyer, J., MacGregor,R.R., Rebello, T., Lu, X., Binder, G.K., Slepushkin,V., Lemiale, F., Mascola, J.R. et  al.  (2006). Genetransfer in humans using a conditionally replicatinglentiviral  vector.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.  S.  A.103, 17372­17377.

65

Levonen,  A.L.,  Vahakangas,  E.,  Koponen,  J.K.,and Yla­Herttuala, S. Antioxidant gene therapy forcardiovascular  disease:  current  status  and  futureperspectives. Circulation in press

Li,  M.J.,  Kim,  J.,  Li,  S.,  Zaia,  J.,  Yee,  J.K.,Anderson,  J.,  Akkina,  R.,  and  Rossi,  J.J.  (2005).Long­term  inhibition  of  HIV­1  infection  in  primaryhematopoietic cells by lentiviral vector delivery of atriple  combination  of  anti­HIV  shRNA,  anti­CCR5ribozyme,  and  a  nucleolar­localizing  TAR  decoy.Mol. Ther. 12, 900­909.

Li, X., Tjwa, M., Moons, L., Fons, P., Noel, A., Ny,A., Zhou, J.M., Lennartsson, J., Li, H., Luttun, A. etal.  (2005).  Revascularization  of  ischemic  tissuesby  PDGF­CC  via  effects  on  endothelial  cells  andtheir progenitors. J. Clin. Invest. 115, 118­127.

Liu,  D.,  Ren,  T.,  and  Gao,  X.  (2003).  Cationictransfection  lipids.  Curr.  Med.  Chem. 10, 1307­1315.

Liu, Q., and Muruve, D.A. (2003). Molecular basisof  the  inflammatory  response  to  adenovirusvectors. Gene Ther. 10, 935­940.

Lo Bianco, C., Ridet, J.L., Schneider, B.L., Deglon,N.,  and  Aebischer,  P.  (2002).  alpha  ­Synucleinopathy  and  selective  dopaminergicneuron  loss  in  a  rat  lentiviral­based  model  ofParkinson's  disease.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.  S.A. 99, 10813­10818.

Lois,  C.,  Hong,  E.J.,  Pease,  S.,  Brown,  E.J.,  andBaltimore,  D.  (2002).  Germline  transmission  andtissue­specific  expression  of  transgenes deliveredby lentiviral vectors. Science 295, 868­872.

Mack,  C.A.,  Patel,  S.R.,  Schwarz,  E.A.,Zanzonico,  P.,  Hahn,  R.T.,  Ilercil,  A.,  Devereux,R.B.,  Goldsmith,  S.J.,  Christian,  T.F.,  Sanborn,T.A. et al. (1998). Biologic bypass with  the use ofadenovirus­mediated  gene  transfer  of  thecomplementary deoxyribonucleic acid for vascularendothelial growth factor 121 improves myocardialperfusion  and  function  in  the  ischemic  porcineheart.  J.  Thorac.  Cardiovasc.  Surg. 115, 168­76;discussion 176­7.

Madeddu, P., Emanueli, C., Pelosi, E., Salis, M.B.,Cerio,  A.M.,  Bonanno,  G.,  Patti,  M.,  Stassi,  G.,Condorelli,  G.,  and  Peschle,  C.  (2004).Transplantation  of  low  dose  CD34+KDR+  cellspromotes  vascular  and  muscular  regeneration  inischemic limbs. FASEB J. 18, 1737­1739.

Mangi,  A.A.,  Noiseux,  N.,  Kong,  D.,  He,  H.,Rezvani, M.,  Ingwall, J.S.,  and Dzau, V.J.  (2003).Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent

remodeling  and  restore  performance  of  infarctedhearts. Nat. Med. 9, 1195­1201.

Mann,  R.,  Mulligan,  R.C.,  and  Baltimore,  D.(1983).  Construction  of  a  retrovirus  packagingmutant  and  its  use  to  produce  helper­freedefective retrovirus. Cell 33, 153­159.

Marshall,  E.  (1999).  Gene  therapy  death  promptsreview  of  adenovirus  vector.  Science 286, 2244­2245.

Martino,  G.  (2003).  Perspectives  in  gene  therapyfor MS. Int. MS J. 10, 84­88.

Mazhari,  R.,  and  Hare,  J.M.  (2007).  Mechanismsof  action  of  mesenchymal  stem  cells  in  cardiacrepair: potential influences on the cardiac stem cellniche. Nat. Clin.  Pract. Cardiovasc. Med. 4 Suppl1, S21­6.

Menasche,  P.,  Hagege,  A.A.,  Vilquin,  J.T.,Desnos,  M.,  Abergel,  E.,  Pouzet,  B.,  Bel,  A.,Sarateanu,  S.,  Scorsin,  M.,  Schwartz,  K.  et  al.(2003).  Autologous  skeletal myoblasttransplantation  for  severe  postinfarction  leftventricular  dysfunction.  J.  Am.  Coll.  Cardiol. 41,1078­1083.

Meyer,  G.P.,  Wollert,  K.C.,  Lotz,  J.,  Steffens,  J.,Lippolt,  P., Fichtner, S., Hecker, H., Schaefer, A.,Arseniev,  L.,  Hertenstein,  B.,  Ganser,  A.,  andDrexler, H. (2006). Intracoronary bone marrow celltransfer  after  myocardial  infarction:  eighteenmonths'  follow­up  data  from  the  randomized,controlled  BOOST  (BOne  marrOw  transfer  toenhance  ST­elevation  infarct  regeneration)  trial.Circulation 113, 1287­1294.

Mezhir,  J.J.,  Smith,  K.D.,  Posner,  M.C.,  Senzer,N.,  Yamini,  B.,  Kufe,  D.W.,  and  Weichselbaum,R.R. (2006). Ionizing radiation: a genetic switch forcancer therapy. Cancer Gene Ther. 13, 1­6.

Michalon,  A.,  Koshibu,  K.,  Baumgartel,  K.,  Spirig,D.H.,  and  Mansuy,  I.M.  (2005).  Inducible  andneuron­specific  gene  expression  in  the  adultmouse brain with  the rtTA2S­M2 system. Genesis43, 205­212.

Miletic, H., Fischer, Y.H., Neumann, H., Hans, V.,Stenzel,  W.,  Giroglou,  T.,  Hermann,  M.,  Deckert,M.,  and  Von  Laer,  D.  (2004).  Selectivetransduction  of  malignant  glioma  by  lentiviralvectors  pseudotyped  with  lymphocyticchoriomeningitis  virus  glycoproteins.  Hum.  GeneTher. 15, 1091­1100.

Miyoshi,  H.,  Blomer,  U.,  Takahashi,  M.,  Gage,F.H.,  and  Verma,  I.M.  (1998).  Development  of  a

66

self­inactivating  lentivirus  vector.  J.  Virol. 72,8150­8157.

Miyoshi,  H.,  Smith,  K.A.,  Mosier,  D.E.,  Verma,I.M.,  and  Torbett,  B.E.  (1999).  Transduction  ofhuman  CD34+  cells  that  mediate  long­termengraftment  of  NOD/SCID  mice  by  HIV  vectors.Science 283, 682­686.

Moore,  K.A.,  and  Lemischka,  I.R.  (2006).  Stemcells and their niches. Science 311, 1880­1885.

Moreau­Gaudry,  F.,  Xia,  P.,  Jiang,  G.,  Perelman,N.P., Bauer, G., Ellis, J., Surinya, K.H., Mavilio, F.,Shen,  C.K.,  and  Malik,  P.  (2001).  High­levelerythroid­specific  gene  expression  in  primaryhuman  and  murine  hematopoietic  cells  with  self­inactivating  lentiviral  vectors.  Blood 98, 2664­2672.

Morrison,  S.J.,  and  Spradling,  A.C.  (2008).  Stemcells  and  niches:  mechanisms  that  promote  stemcell  maintenance  throughout  life.  Cell 132, 598­611.

Murray, M., and Fischer, I. (2001). Transplantationand gene therapy: combined approaches for repairof spinal cord injury. Neuroscientist 7, 28­41.

Murry,  C.E.,  Soonpaa,  M.H.,  Reinecke,  H.,Nakajima,  H.,  Nakajima,  H.O.,  Rubart,  M.,Pasumarthi,  K.B.,  Virag,  J.I.,  Bartelmez,  S.H.,Poppa, V. et al. (2004). Haematopoietic stem cellsdo  not  transdifferentiate  into  cardiac  myocytes  inmyocardial infarcts. Nature 428, 664­668.

Muul,  L.M.,  Tuschong,  L.M.,  Soenen,  S.L.,Jagadeesh, G.J., Ramsey, W.J., Long, Z., Carter,C.S., Garabedian, E.K., Alleyne, M., Brown, M. etal.  (2003).  Persistence  and  expression  of  theadenosine  deaminase  gene  for  12  years  andimmune  reaction  to  gene  transfer  components:long­term  results  of  the  first  clinical  gene  therapytrial. Blood 101, 2563­2569.

Nakagawa,  M.,  Koyanagi,  M.,  Tanabe,  K.,Takahashi,  K.,  Ichisaka,  T.,  Aoi,  T.,  Okita,  K.,Mochiduki,  Y.,  Takizawa,  N.,  and  Yamanaka,  S.(2008).  Generation  of  induced  pluripotent  stemcells  without  Myc  from  mouse  and  humanfibroblasts. Nat. Biotechnol. 26, 101­106.

Nakai, H., Fuess, S., Storm, T.A., Muramatsu, S.,Nara,  Y.,  and  Kay,  M.A.  (2005).  Unrestrictedhepatocyte  transduction  with  adeno­associatedvirus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214­224.

Naldini,  L.,  Blomer,  U.,  Gallay,  P.,  Ory,  D.,Mulligan, R., Gage, F.H., Verma,  I.M., and Trono,

D.  (1996).  In  vivo  gene  delivery  and  stabletransduction  of  nondividing  cells  by  a  lentiviralvector. Science 272, 263­267.

Nathwani,  A.C.,  Davidoff,  A.M.,  and  Linch,  D.C.(2005).  A  review  of  gene  therapy  forhaematological disorders. Br. J. Haematol. 128, 3­17.

Neu, M., Fischer, D., and Kissel, T. (2005). Recentadvances  in  rational  gene  transfer  vector  designbased  on  poly(ethylene  imine)  and  its derivatives.J. Gene Med. 7, 992­1009.

Nguyen,  M.,  Huan­Tu,  G.,  Gonzalez­Edick,  M.,Rivera,  V.M.,  Clackson,  T.,  Jooss,  K.U.,  andHarding, T.C. (2007). Rapamycin­regulated controlof  antiangiogenic  tumor  therapy  following  rAAV­mediated gene transfer. Mol. Ther. 15, 912­920.

Nguyen,  T.H.,  Oberholzer,  J.,  Birraux,  J.,  Majno,P., Morel, P., and Trono, D. (2002). Highly efficientlentiviral  vector­mediated  transduction  ofnondividing,  fully  reimplantable  primaryhepatocytes. Mol. Ther. 6, 199­209.

No,  D.,  Yao,  T.P.,  and  Evans,  R.M.  (1996).Ecdysone­inducible  gene  expression  inmammalian cells  and  transgenic mice. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 93, 3346­3351.

Noe',  F.,  Nissinen,  J.,  Pitkanen,  A.,  Gobbi,  M.,Sperk,  G.,  During,  M.,  and  Vezzani,  A.  (2007).Gene  therapy  in  epilepsy:  the  focus  on  NPY.Peptides 28, 377­383.

Nowak,  G.,  Karrar,  A.,  Holmen,  C.,  Nava,  S.,Uzunel,  M.,  Hultenby,  K.,  and  Sumitran­Holgersson,  S.  (2004).  Expression  of  vascularendothelial  growth  factor  receptor­2  or  Tie­2  onperipheral  blood  cells  defines  functionallycompetent  cell  populations  capable  ofreendothelialization. Circulation 110, 3699­3707.

Ohashi, K., Park, F., and Kay, M.A. (2002). Role ofhepatocyte  direct  hyperplasia  in  lentivirus­mediated  liver  transduction  in  vivo.  Hum.  GeneTher. 13, 653­663.

Ohlfest,  J.R.,  Demorest,  Z.L.,  Motooka,  Y.,Vengco,  I.,  Oh,  S.,  Chen,  E.,  Scappaticci,  F.A.,Saplis, R.J., Ekker, S.C., Low, W.C., Freese, A.B.,and  Largaespada,  D.A.  (2005).  Combinatorialantiangiogenic  gene  therapy  by  nonviral  genetransfer  using  the  sleeping  beauty  transposoncauses tumor regression and  improves survival  inmice  bearing  intracranial  human  glioblastoma.Mol. Ther. 12, 778­788.

67

Ohmori,  T.,  Kashiwakura,  Y.,  Ishiwata,  A.,Madoiwa,  S.,  Mimuro,  J.,  and  Sakata,  Y.  (2007).Silencing  of  a  targeted  protein  in  in  vivo  plateletsusing  a  lentiviral  vector  delivering  short  hairpinRNA  sequence.  Arterioscler.  Thromb.  Vasc.  Biol.27, 2266­2272.

Oligino,  T.,  Poliani,  P.L.,  Wang,  Y.,  Tsai,  S.Y.,O'Malley,  B.W.,  Fink,  D.J.,  and  Glorioso,  J.C.(1998).  Drug  inducible  transgene  expression  inbrain  using  a  herpes  simplex  virus  vector.  GeneTher. 5, 491­496.

Orlic,  D.,  Kajstura,  J.,  Chimenti,  S.,  Jakoniuk,  I.,Anderson,  S.M.,  Li,  B.,  Pickel,  J.,  McKay,  R.,Nadal­Ginard,  B.,  Bodine,  D.M.,  Leri,  A.,  andAnversa, P. (2001). Bone marrow cells regenerateinfarcted myocardium. Nature 410, 701­705.

Pagani,  F.D.,  DerSimonian,  H.,  Zawadzka,  A.,Wetzel,  K.,  Edge,  A.S.,  Jacoby,  D.B.,  Dinsmore,J.H.,  Wright,  S.,  Aretz,  T.H.,  Eisen,  H.J.,  andAaronson,  K.D.  (2003).  Autologous  skeletalmyoblasts  transplanted  to  ischemia­damagedmyocardium  in  humans.  Histological  analysis  ofcell  survival  and  differentiation.  J.  Am.  Coll.Cardiol. 41, 879­888.

Pai,  S.I.,  Lin,  Y.Y.,  Macaes,  B.,  Meneshian,  A.,Hung,  C.F.,  and  Wu,  T.C.  (2006).  Prospects  ofRNA  interference  therapy  for  cancer.  Gene  Ther.13, 464­477.

Pakkanen,  T.M.,  Laitinen,  M.,  Hippelainen,  M.,Kallionpaa,  H.,  Lehtolainen,  P.,  Leppanen,  P.,Luoma,  J.S.,  Tarvainen,  R.,  Alhava,  E.,  and  Yla­Herttuala, S. (1999). Enhanced plasma cholesterollowering  effect  of  retrovirus­mediated  LDLreceptor  gene  transfer  to  WHHL  rabbit  liver  afterimproved  surgical  technique  and  stimulation  ofhepatocyte  proliferation  by  combined  partial  liverresection  and  thymidine  kinase­­ganciclovirtreatment. Gene Ther. 6, 34­41.

Park,  F.  (2007).  Lentiviral  vectors:  Are  they  thefuture of animal transgenesis? Physiol. Genomics

Park,  F.,  Ohashi,  K.,  Chiu,  W.,  Naldini,  L.,  andKay, M.A. (2000). Efficient lentiviral transduction ofliver  requires  cell  cycling  in  vivo.  Nat.  Genet. 24,49­52.

Park,  F.,  Ohashi,  K.,  and  Kay,  M.A.  (2003).  Theeffect  of  age  on  hepatic  gene  transfer  with  self­inactivating  lentiviral  vectors  in  vivo.  Mol. Ther. 8,314­323.

Perin,  E.C.,  Dohmann,  H.F.,  Borojevic,  R.,  Silva,S.A.,  Sousa,  A.L.,  Mesquita,  C.T.,  Rossi,  M.I.,Carvalho, A.C., Dutra, H.S., Dohmann, H.J. et al.

(2003).  Transendocardial,  autologous  bonemarrow  cell  transplantation  for  severe,  chronicischemic heart failure. Circulation 107, 2294­2302.

Pfeifer, A., Eigenbrod, S., Al­Khadra, S., Hofmann,A.,  Mitteregger,  G.,  Moser,  M.,  Bertsch,  U.,  andKretzschmar,  H.  (2006).  Lentivector­mediatedRNAi  efficiently  suppresses  prion  protein  andprolongs survival of scrapie­infected mice. J. Clin.Invest. 116, 3204­3210.

Pfeifer,  A.,  Ikawa,  M.,  Dayn,  Y.,  and  Verma,  I.M.(2002).  Transgenesis  by  lentiviral  vectors:  lack  ofgene  silencing  in  mammalian  embryonic  stemcells  and  preimplantation  embryos.  Proc.  Natl.Acad. Sci. U. S. A. 99, 2140­2145.

Pittenger,  M.F.,  Mackay,  A.M.,  Beck,  S.C.,Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman,M.A.,  Simonetti,  D.W.,  Craig,  S.,  and  Marshak,D.R. (1999). Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells. Science 284, 143­147.

Pluta,  K.,  Luce,  M.J.,  Bao,  L.,  Agha­Mohammadi,S.,  and  Reiser,  J.  (2005).  Tight  control  oftransgene  expression  by  lentivirus  vectorscontaining  second­generation  tetracycline­responsive promoters. J. Gene Med. 7, 803­817.

Ralph,  G.S.,  Radcliffe,  P.A.,  Day,  D.M.,  Carthy,J.M.,  Leroux,  M.A.,  Lee,  D.C.,  Wong,  L.F.,Bilsland,  L.G., Greensmith,  L., Kingsman,  S.M.  etal.  (2005).  Silencing  mutant  SOD1  using  RNAiprotects  against  neurodegeneration  and  extendssurvival in an ALS model. Nat. Med. 11, 429­433.

Ramezani, A., and Hawley, T.S. (2002). Overviewof  the  HIV­1  lentiviral  vector  system.  In  CurrentProtocols  in  Molecular Biology,  (USA: John Wiley& Sons, Inc.) pp. 16.21.1­16.21.15.

Rand,  K.H.,  and  Houck,  H.  (1990).  Taqpolymerase  contains  bacterial  DNA  of  unknownorigin. Mol. Cell. Probes 4, 445­450.

Ranki,  T.,  Sarkioja,  M.,  Hakkarainen,  T.,  vonSmitten,  K.,  Kanerva,  A.,  and  Hemminki,  A.(2007).  Systemic  efficacy  of  oncolyticadenoviruses  in  imagable  orthotopic  models  ofhormone  refractory  metastatic  breast  cancer.  Int.J. Cancer 121, 165­174.

Raoul,  C.,  Abbas­Terki,  T.,  Bensadoun,  J.C.,Guillot, S., Haase, G., Szulc, J., Henderson, C.E.,and  Aebischer,  P.  (2005a).  Lentiviral­mediatedsilencing  of  SOD1  through  RNA  interferenceretards disease onset and progression in a mousemodel of ALS. Nat. Med. 11, 423­428.

68

Raoul,  C.,  Abbas­Terki,  T.,  Bensadoun,  J.C.,Guillot, S., Haase, G., Szulc, J., Henderson, C.E.,and  Aebischer,  P.  (2005b).  Lentiviral­mediatedsilencing  of  SOD1  through  RNA  interferenceretards disease onset and progression in a mousemodel of ALS. Nat. Med. 11, 423­428.

Rasmussen,  H.,  Rasmussen,  C.,  Lempicki,  M.,Durham,  R.,  Brough,  D.,  King,  C.R.,  andWeichselbaum,  R.  (2002).  TNFerade  Biologic:preclinical toxicology of a novel adenovector with aradiation­inducible  promoter,  carrying  the  humantumor  necrosis  factor  alpha  gene.  Cancer  GeneTher. 9, 951­957.

Regulier, E., Trottier, Y., Perrin, V., Aebischer, P.,and  Deglon,  N.  (2003).  Early  and  reversibleneuropathology  induced  by  tetracycline­regulatedlentiviral overexpression of mutant huntingtin in ratstriatum. Hum. Mol. Genet. 12, 2827­2836.

Rein, D.T., Breidenbach, M., Kirby, T.O., Han, T.,Siegal,  G.P.,  Bauerschmitz,  G.J.,  Wang,  M.,Nettelbeck, D.M., Tsuruta, Y., Yamamoto, M. et al.(2005).  A  fiber­modified,  secretory  leukoproteaseinhibitor  promoter­based  conditionally  replicatingadenovirus  for  treatment  of  ovarian  cancer.  Clin.Cancer Res. 11, 1327­1335.

Richardson,  T.P.,  Peters,  M.C.,  Ennett,  A.B.,  andMooney,  D.J.  (2001).  Polymeric  system  for  dualgrowth  factor  delivery.  Nat.  Biotechnol. 19, 1029­1034.

Rissanen,  T.T.,  Markkanen,  J.E.,  Arve,  K.,Rutanen,  J.,  Kettunen,  M.I.,  Vajanto,  I.,Jauhiainen,  S.,  Cashion,  L.,  Gruchala,  M.,Narvanen,  O.  et  al.  (2003a).  Fibroblast  growthfactor  4  induces  vascular  permeability,angiogenesis  and  arteriogenesis  in  a  rabbithindlimb ischemia model. FASEB J. 17, 100­102.

Rissanen,  T.T.,  Markkanen,  J.E.,  Gruchala,  M.,Heikura, T., Puranen, A., Kettunen, M.I., Kholova,I.,  Kauppinen,  R.A.,  Achen,  M.G.,  Stacker,  S.A.,Alitalo, K., and Yla­Herttuala, S. (2003b). VEGF­Dis  the  strongest  angiogenic  and  lymphangiogeniceffector  among  VEGFs  delivered  into  skeletalmuscle  via  adenoviruses.  Circ.  Res. 92, 1098­1106.

Rissanen,  T.T.,  and  Yla­Herttuala,  S.  (2007).Current  status  of  cardiovascular  gene  therapy.Mol. Ther. 15, 1233­1247.

Rivera,  V.M.,  Clackson,  T.,  Natesan,  S.,  Pollock,R., Amara, J.F., Keenan, T., Magari, S.R., Phillips,T.,  Courage,  N.L.,  Cerasoli,  F.,Jr,  Holt,  D.A.,  andGilman,  M.  (1996).  A  humanized  system  for

pharmacologic  control  of  gene  expression.  Nat.Med. 2, 1028­1032.

Rivera,  V.M.,  Gao,  G.P.,  Grant,  R.L.,  Schnell,M.A., Zoltick, P.W., Rozamus, L.W., Clackson, T.,and  Wilson,  J.M.  (2005).  Long­termpharmacologically  regulated  expression  oferythropoietin  in primates following AAV­mediatedgene transfer. Blood 105, 1424­1430.

Rossi, J.J.  (2006). RNAi  as  a  treatment  for HIV­1infection. BioTechniques Suppl, 25­29.

Roy,  S.,  Khanna,  S.,  Bickerstaff,  A.A.,Subramanian,  S.V.,  Atalay,  M.,  Bierl,  M.,Pendyala, S., Levy, D., Sharma, N., Venojarvi, M.et  al.  (2003).  Oxygen  sensing  by  primary  cardiacfibroblasts:  a  key  role  of  p21(Waf1/Cip1/Sdi1).Circ. Res. 92, 264­271.

Rubinson,  D.A.,  Dillon,  C.P.,  Kwiatkowski,  A.V.,Sievers,  C.,  Yang,  L.,  Kopinja,  J.,  Rooney,  D.L.,Zhang,  M.,  Ihrig,  M.M.,  McManus,  M.T.  et  al.(2003).  A  lentivirus­based  system  to  functionallysilence  genes  in  primary  mammalian  cells,  stemcells  and  transgenic  mice  by  RNA  interference.Nat. Genet. 33, 401­406.

Rutanen,  J.,  Rissanen,  T.T.,  Markkanen,  J.E.,Gruchala,  M.,  Silvennoinen,  P.,  Kivela,  A.,Hedman,  A.,  Hedman,  M.,  Heikura,  T.,  Orden,M.R.  et  al.  (2004).  Adenoviral  catheter­mediatedintramyocardial  gene  transfer  using  the  matureform  of  vascular  endothelial  growth  factor­Dinduces transmural angiogenesis  in porcine heart.Circulation 109, 1029­1035.

Salucci, V., Scarito, A., Aurisicchio, L., Lamartina,S., Nicolaus, G., Giampaoli, S., Gonzalez­Paz, O.,Toniatti,  C.,  Bujard,  H.,  Hillen,  W.,  Ciliberto,  G.,and  Palombo,  F.  (2002).  Tight  control  of  geneexpression  by  a  helper­dependent  adenovirusvector  carrying  the  rtTA2(s)­M2  tetracyclinetransactivator  and  repressor  system.  Gene  Ther.9, 1415­1421.

Sands,  M.S.,  and  Davidson,  B.L.  (2006).  Genetherapy for lysosomal storage diseases. Mol. Ther.13, 839­849.

Seth,  R.B.,  Sun,  L.,  and  Chen,  Z.J.  (2006).Antiviral  innate  immunity  pathways.  Cell  Res. 16,141­147.

Shen,  C.,  Buck,  A.K.,  Liu,  X.,  Winkler,  M.,  andReske,  S.N.  (2003).  Gene  silencing  byadenovirus­delivered siRNA. FEBS Lett. 539, 111­114.

69

Simons, J.W., and Sacks, N. (2006). Granulocyte­macrophage  colony­stimulating  factor­transducedallogeneic  cancer  cellular  immunotherapy:  theGVAX  vaccine  for  prostate  cancer.  Urol.  Oncol.24, 419­424.

Singer,  O.,  Tiscornia,  G.,  Ikawa,  M.,  and  Verma,I.M.  (2006).  Rapid  generation  of  knockdowntransgenic mice by silencing lentiviral vectors. Nat.Protoc. 1, 286­292.

Sinn,  P.L.,  Sauter,  S.L.,  and  McCray,  P.B.,Jr.(2005).  Gene  therapy  progress  and  prospects:development  of  improved  lentiviral  and  retroviralvectors­­design,  biosafety,  and  production.  GeneTher. 12, 1089­1098.

Stabile,  E.,  Burnett,  M.S.,  Watkins,  C.,  Kinnaird,T.,  Bachis,  A.,  la  Sala,  A.,  Miller,  J.M.,  Shou, M.,Epstein,  S.E.,  and  Fuchs,  S.  (2003).  Impairedarteriogenic  response  to  acute  hindlimb  ischemiain CD4­knockout mice. Circulation 108, 205­210.

Stewart,  D.J., Hilton, J.D., Arnold, J.M., Gregoire,J.,  Rivard,  A.,  Archer,  S.L.,  Charbonneau,  F.,Cohen,  E.,  Curtis,  M.,  Buller,  C.E.  et  al.  (2006).Angiogenic  gene  therapy  in  patients  withnonrevascularizable  ischemic  heart  disease:  aphase  2  randomized,  controlled  trial  ofAdVEGF(121)  (AdVEGF121)  versus  maximummedical treatment. Gene Ther. 13, 1503­1511.

Stieger,  K.,  Le  Meur,  G.,  Lasne,  F.,  Weber,  M.,Deschamps, J.Y., Nivard, D., Mendes­Madeira, A.,Provost, N., Martin, L., Moullier, P., and Rolling, F.(2006).  Long­term  doxycycline­regulatedtransgene  expression  in  the  retina  of  nonhumanprimates  following  subretinal  injection  ofrecombinant AAV vectors. Mol. Ther. 13, 967­975.

Strauer, B.E., Brehm, M., Zeus, T., Kostering, M.,Hernandez,  A.,  Sorg,  R.V.,  Kogler,  G.,  andWernet, P. (2002). Repair of infarcted myocardiumby  autologous  intracoronary  mononuclear  bonemarrow cell  transplantation  in humans. Circulation106, 1913­1918.

Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M.,Ichisaka,  T.,  Tomoda,  K.,  and  Yamanaka,  S.(2007).  Induction  of  pluripotent  stem  cells  fromadult  human  fibroblasts  by  defined  factors.  Cell131, 861­872.

Takahashi,  K.,  and  Yamanaka,  S.  (2006).Induction  of  pluripotent  stem  cells  from  mouseembryonic and adult  fibroblast cultures by definedfactors. Cell 126, 663­676.

Tang, Y.L., Tang, Y., Zhang, Y.C., Qian, K., Shen,L.,  and  Phillips,  M.I.  (2005).  Improved  graft

mesenchymal stem cell survival  in  ischemic heartwith  a  hypoxia­regulated  heme  oxygenase­1vector. J. Am. Coll. Cardiol. 46, 1339­1350.

Tateishi­Yuyama, E., Matsubara, H., Murohara, T.,Ikeda,  U.,  Shintani,  S.,  Masaki,  H.,  Amano,  K.,Kishimoto,  Y.,  Yoshimoto,  K.,  Akashi,  H.  et  al.(2002a).  Therapeutic  angiogenesis  for  patientswith  limb  ischaemia by  autologous  transplantationof  bone­marrow  cells:  a  pilot  study  and  arandomised controlled trial. Lancet 360, 427­435.

Tateishi­Yuyama, E., Matsubara, H., Murohara, T.,Ikeda,  U.,  Shintani,  S.,  Masaki,  H.,  Amano,  K.,Kishimoto,  Y.,  Yoshimoto,  K.,  Akashi,  H.  et  al.(2002b).  Therapeutic  angiogenesis  for  patientswith  limb  ischaemia by  autologous  transplantationof  bone­marrow  cells:  a  pilot  study  and  arandomised controlled trial. Lancet 360, 427­435.

Tateno, K., Minamino, T., Toko, H., Akazawa, H.,Shimizu,  N.,  Takeda,  S.,  Kunieda,  T.,  Miyauchi,H., Oyama, T., Matsuura, K. et al.  (2006). Criticalroles  of  muscle­secreted  angiogenic  factors  intherapeutic  neovascularization.  Circ.  Res. 98,1194­1202.

Taylor, D.A., Atkins, B.Z., Hungspreugs, P., Jones,T.R., Reedy, M.C., Hutcheson, K.A., Glower, D.D.,and  Kraus,  W.E.  (1998).  Regenerating  functionalmyocardium:  improved  performance  after  skeletalmyoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929­933.

Tiscornia,  G.,  Singer,  O.,  Ikawa,  M.,  and  Verma,I.M.  (2003).  A  general  method  for  geneknockdown  in  mice  by  using  lentiviral  vectorsexpressing  small  interfering  RNA.  Proc.  Natl.Acad. Sci. U. S. A. 100, 1844­1848.

Tomita,  S.,  Li,  R.K.,  Weisel,  R.D.,  Mickle,  D.A.,Kim,  E.J.,  Sakai,  T.,  and  Jia,  Z.Q.  (1999).Autologous  transplantation  of  bone  marrow  cellsimproves damaged heart function. Circulation 100,II247­56.

Tondeur,  S.,  Agbulut,  O.,  Menot,  M.L.,  Larghero,J.,  Paulin,  D.,  Menasche,  P.,  Samuel,  J.L.,Chomienne,  C.,  and  Cassinat,  B.  (2004).Overcoming  bacterial  DNA  contamination  in  real­time  PCR  and  RT­PCR  reactions  for  LacZdetection  in  cell  therapy  monitoring.  Mol.  Cell.Probes 18, 437­441.

Tse,  H.F.,  Kwong,  Y.L.,  Chan,  J.K.,  Lo,  G.,  Ho,C.L.,  and  Lau,  C.P.  (2003).  Angiogenesis  inischaemic  myocardium  by  intramyocardialautologous  bone  marrow  mononuclear  cellimplantation. Lancet 361, 47­49.

70

Ueno, H., Li, J.J., Masuda, S., Qi, Z.,  Yamamoto,H.,  and  Takeshita,  A.  (1997).  Adenovirus­mediated expression of the secreted form of basicfibroblast  growth  factor  (FGF­2)  induces  cellularproliferation and angiogenesis in vivo. Arterioscler.Thromb. Vasc. Biol. 17, 2453­2460.

Urbanek,  K.,  Cesselli,  D.,  Rota,  M.,  Nascimbene,A.,  De  Angelis,  A.,  Hosoda,  T.,  Bearzi,  C.,  Boni,A., Bolli, R., Kajstura, J., Anversa, P., and Leri, A.(2006). Stem cell niches in the adult mouse heart.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 9226­9231.

Urlinger,  S.,  Baron,  U.,  Thellmann,  M.,  Hasan,M.T., Bujard, H.,  and Hillen, W.  (2000). Exploringthe  sequence  space  for  tetracycline­dependenttranscriptional  activators:  novel  mutations  yieldexpanded  range  and sensitivity. Proc. Natl. Acad.Sci. U. S. A. 97, 7963­7968.

VandenDriessche,  T.,  Thorrez,  L.,  Naldini,  L.,Follenzi, A., Moons, L., Berneman, Z., Collen, D.,and  Chuah,  M.K.  (2002).  Lentiviral  vectorscontaining  the  human  immunodeficiency  virustype­1  central  polypurine  tract  can  efficientlytransduce  nondividing  hepatocytes  and  antigen­presenting cells in vivo. Blood 100, 813­822.

Vincent,  K.A., Jiang, C., Boltje,  I.,  and Kelly, R.A.(2007).  Gene  therapy  progress  and  prospects:therapeutic  angiogenesis  for  ischemiccardiovascular disease. Gene Ther. 14, 781­789.

Vogel,  R.,  Amar,  L.,  Thi,  A.D.,  Saillour,  P.,  andMallet,  J.  (2004).  A  single  lentivirus  vectormediates  doxycycline­regulated  expression  oftransgenes in the brain. Hum. Gene Ther. 15, 157­165.

Wagers,  A.J.,  Sherwood,  R.I.,  Christensen,  J.L.,and  Weissman,  I.L.  (2002).  Little  evidence  fordevelopmental  plasticity  of  adult  hematopoieticstem cells. Science 297, 2256­2259.

Wang,  J.S.,  Shum­Tim,  D.,  Chedrawy,  E.,  andChiu,  R.C.  (2001).  The  coronary  delivery  ofmarrow stromal cells  for  myocardial  regeneration:pathophysiologic  and  therapeutic  implications.  J.Thorac. Cardiovasc. Surg. 122, 699­705.

Wang, Y., DeMayo, F.J., Tsai, S.Y., and O'Malley,B.W.  (1997).  Ligand­inducible  and  liver­specifictarget  gene  expression  in  transgenic  mice.  Nat.Biotechnol. 15, 239­243.

Wang,  Y.,  O'Malley,  B.W.,Jr,  Tsai,  S.Y.,  andO'Malley, B.W. (1994). A regulatory system for usein gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91,8180­8184.

Wells,  D.J.  (1993).  Improved  gene  transfer  bydirect  plasmid  injection  associated  withregeneration in mouse skeletal muscle. FEBS Lett.332, 179­182.

Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink,T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B.E.,  andJaenisch,  R.  (2007).  In  vitro  reprogramming  offibroblasts  into  a  pluripotent  ES­cell­like  state.Nature 448, 318­324.

Wiznerowicz,  M., Szulc, J.,  and Trono, D.  (2006).Tuning  silence:  conditional  systems  for  RNAinterference. Nat. Methods 3, 682­688.

Wolff,  J.A.,  Malone,  R.W.,  Williams,  P.,  Chong,W., Acsadi, G., Jani, A., and Felgner, P.L. (1990).Direct  gene  transfer  into  mouse  muscle  in  vivo.Science 247, 1465­1468.

Wollert,  K.C.,  and  Drexler,  H.  (2005).  Clinicalapplications of stem cells for the heart. Circ. Res.96, 151­163.

Wollert,  K.C.,  Meyer,  G.P.,  Lotz,  J.,  Ringes­Lichtenberg,  S.,  Lippolt,  P.,  Breidenbach,  C.,Fichtner, S., Korte, T., Hornig, B., Messinger, D. etal.  (2004).  Intracoronary  autologous bone­marrowcell  transfer  after  myocardial  infarction:  theBOOST randomised controlled clinical trial. Lancet364, 141­148.

Woods,  N.B.,  Fahlman,  C.,  Mikkola,  H.,Hamaguchi, I., Olsson, K., Zufferey, R., Jacobsen,S.E., Trono, D., and Karlsson, S. (2000). Lentiviralgene  transfer  into  primary  and  secondaryNOD/SCID  repopulating  cells.  Blood 96, 3725­3733.

Wu, X., Li, Y., Crise, B., and Burgess, S.M. (2003).Transcription  start  regions  in  the  human  genomeare  favored  targets  for  MLV  integration.  Science300, 1749­1751.

Wulf­Goldenberg,  A.,  Eckert,  K.,  and  Fichtner,  I.(2007).  Cytokine­pretreatment  of  CD34(+)  cordblood  stem  cells  in  vitro  reduces  long­term  cellengraftment in NOD/SCID mice. Eur. J. Cell Biol.

Xia,  H.,  Mao,  Q.,  Eliason,  S.L.,  Harper,  S.Q.,Martins,  I.H.,  Orr,  H.T.,  Paulson,  H.L.,  Yang,  L.,Kotin,  R.M.,  and  Davidson,  B.L.  (2004).  RNAisuppresses  polyglutamine­inducedneurodegeneration  in  a  model  of  spinocerebellarataxia. Nat. Med. 10, 816­820.

Xiao,  X.,  Li,  J.,  and  Samulski,  R.J.  (1998).Production  of  high­titer  recombinant  adeno­associated  virus  vectors  in  the  absence  of  helperadenovirus. J. Virol. 72, 2224­2232.

71

Xue,  T.,  Cho,  H.C.,  Akar,  F.G.,  Tsang,  S.Y.,Jones,  S.P.,  Marban,  E.,  Tomaselli,  G.F.,  and  Li,R.A.  (2005).  Functional  integration  of  electricallyactive  cardiac  derivatives  from  geneticallyengineered  human  embryonic  stem  cells  withquiescent  recipient  ventricular  cardiomyocytes:insights  into  the  development  of  cell­basedpacemakers. Circulation 111, 11­20.

Yla­Herttuala,  S.,  and  Martin,  J.F.  (2000).Cardiovascular  gene  therapy.  Lancet 355, 213­222.

Yu,  J.,  Vodyanik,  M.A.,  Smuga­Otto,  K.,Antosiewicz­Bourget, J., Frane, J.L., Tian, S., Nie,J., Jonsdottir, G.A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin,I.I., and Thomson, J.A. (2007). Induced pluripotentstem cell  lines derived  from  human somatic cells.Science 318, 1917­1920.

Zeng, Y., Cai, X., and Cullen, B.R. (2005). Use ofRNA  polymerase  II  to  transcribe  artificialmicroRNAs. Methods Enzymol. 392, 371­380.

Zheng,  B.,  Cao,  B.,  Crisan,  M.,  Sun,  B.,  Li,  G.,Logar,  A.,  Yap,  S.,  Pollett,  J.B.,  Drowley,  L.,Cassino, T. et al. (2007). Prospective identificationof  myogenic  endothelial  cells  in  human  skeletalmuscle. Nat. Biotechnol. 25, 1025­1034.

Ziegelhoeffer,  T.,  Fernandez,  B.,  Kostin,  S.,  Heil,M.,  Voswinckel,  R.,  Helisch,  A.,  and Schaper,  W.(2004).  Bone  marrow­derived  cells  do  notincorporate  into  the  adult  growing  vasculature.Circ. Res. 94, 230­238.

Zufferey,  R.,  Nagy,  D.,  Mandel,  R.J.,  Naldini,  L.,and Trono, D. (1997). Multiply attenuated lentiviralvector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat.Biotechnol. 15, 871­875.

Kuopio University Publications G. - A.I.Virtanen Institute G 43. Nairismägi, Jaak. Magnetic resonance imaging study of induced epileptogenesis in animal models of epilepsy. 2006. 77 p. Acad. Diss. G 44. Niiranen, Kirsi. Consequences of spermine synthase or spermidine/spermine N1-acetyltransferase deficiency in polyamine metabolism - Studies with gene-disrupted embryonic stem cells and mice. 2006. 72 p. Acad. Diss. G 45. Roy, Himadri. Vascular Endothelial Growth (VEGFs) - Role in Perivascular Therapeutic Angiogenesis and Diabetic Macrovascular Disease. 2006. 81 p. Acad. Diss. G 46. Räty, Jani. Baculovirus surface modifications for enhanced gene delivery and biodistribution imaging. 2006. 86 p. Acad. Diss. G 47. Tyynelä, Kristiina. Gene therapy of malignant glioma. Experimental and clinical studies. 2006. 114 p. Acad. Diss. G 48. Malm, Tarja. Glial Cells in Alzheimer's Disease Models. 2006. 118 p. Acad. Diss. G 49. Tuunanen, Pasi. Sensory Processing by Functional MRI. Correlations with MEG and the Role of Oxygen Availability. 2006. 118 p. Acad. Diss. G 50. Liimatainen, Timo. Molecular magnetic resonance imaging of gene therapy-induced apoptosis and gene transfer: a role for 1H spectroscopic imaging and iron oxide labelled viral particles. 2007. 81 p. Acad. Diss. G 51. Keinänen, Riitta et al. (eds.). The first annual post-graduate symposium of the graduate school of molecular medicine: winter school 2007. 2007. 65 p. Abstracts. G 52. Vartiainen, Suvi. Caenorhabditis elegans as a model for human synucleopathies. 2007. 94 p. Acad. Diss. G 53. Määttä, Ann-Marie. Development of gene and virotherapy against non-small cell lung cancer. 2007. 75 p. Acad. Diss. G 54. Rautsi, Outi. Hurdles and Improvements in Therapeutic Gene Transfer for Cancer. 2007. 79 p. Acad. Diss. G 55. Pehkonen, Petri. Methods for mining data from genome wide high-throughput technologies. 2007. 91 p. Acad. Diss. G 56. Hyvönen, Mervi T. Regulation of spermidine/spermine N'-acetyltransferase and its involvement in cellular proliferation and development of acute pancreatitis. 2007. 79 p. Acad. Diss. G 57. Gurevicius, Kestutis. EEG and evoked potentials as indicators of interneuron pathology in mouse models of neurological diseases. 2007. 76 p. Acad. Diss. G 58. Leppänen, Pia. Mouse models of atherosclerosis, vascular endothelial growth factors and gene therapy. 2007. 91 p. Acad. Diss.