Simplified flow cytometric immunophenotyping panel

for multiple myeloma, CD56/CD19/CD138(CD38)/CD 45,

to differentiate neoplastic myeloma cells from reactive plasma cells

Tae-­‐dong  Jeong,Chan-­‐Jeong  Park,  Hyoeun  Shim,  Seongsoo  Jang,  et  al  

Jurnal Hematologi I

Korean  Journal  of  hematology    2012;47:260-­‐266  

Verna B / Paulus B. N Senin,16 September 2013

1

Pendahuluan

2  

Mieloma multipel ( MM ) : neoplasma klonal sel B --> hasil akumulasi dari sel plasma neoplastik di sumsum tulang ( BM )

Mayoritas kasus MM memproduksi protein monoklonal : paraprotein abnormal

Diagnosis MM = adanya sel plasma neoplastik di BM , terdeteksinya protein monoklonal di darah atau urine.

....Pendahuluan

3  

Mayoritas sel plasma pada penderita MM: - sel mieloma neoplastik, - sel plasma normal atau reaktif : % sedikit

--> dimana bertanggung jawab untuk menjaga fungsi sistem imun.

Flowsitometri ( FCM) : dasar dari imunofenotipe, telah menjadi alat diagnostik utama untuk membedakan sel plasma neoplastik dengan sel plasma reaktif secara laboratoris

....Pendahuluan  

4  

Penelitian sebelumnya : Antigen pada sel plasma diekspresikan secara bervariasi --> CD19, CD20, CD27, CD33, CD38, CD45, CD56,CD117 dan CD 138

Profil immunophenotypic : sel plasma neoplastik dan sel plasma reaktif berbeda

....Pendahuluan  

5  

Sel plasma reaktif

Sel plasma neoplastik

Forward / Side Scatter (FSC/SCC) rendah ;

CD 19 +/CD 56-

CD 38: ekspresi tinggi

FSC/SCC tinggi ; CD 19 - / CD 56 +

CD 38: ekspresi relatif rendah

....Pendahuluan  •  The European Myeloma Network (EMN)

merekomendasikan penggunaan antigen yang paling berguna untuk mendeteksi plasma sel aberrant di MM

•  Rekomendasi terdiri dari 3 klasifikasi : 1. “ essential “ : CD19 dan CD 56 2. “ recommended “ : CD117, CD20, CD28, CD27 3. “suggested “ : CD 81 dan CD 200 diagnosis dan monitoring

6  

Tujuan  PeneliGan    

•  Mengevaluasi panel yang disederhanakan dari CD 56 / CD19/ CD138( CD38 ) / CD45 untuk menganalisis mieloma multiple.

7  

Bahan  dan  Metode  •  Jumlah sampel : 70 penderita -  62 penderita yang baru terdiagnosis MM ( blm diterapi ) -  8 penderita telah dilakukan analisis BM, sebagai

pemantauan terapi MM. •  April 2010 – Juli 2011 •  Diagnosis MM berdasarkan klasifikasi WHO •  Penelitian ini disetujui oleh Asan medical center dan

semua penderita dilakukan informed concent sebelum pengambilan spesimen BM

8  

FCM  immunophenotyping  •  FCM   immunophenotyping secara multiparameter

menggunakan antibodi monoklonal terhadap CD56, CD19, CD138 (CD38), dan CD45.

9  

Aspirat BM + EDTA

Cuci dgn Phosphate –

Buffered Saline ( PBS )

Resuspensi dalam PBS + 1 % serum

bovin albumin

WBC 1-2 x 10 6/mL

....  FCM immunophenotyping 10  

100 µl BM yg telah dicuci, vortek 3 dtk

Anti CD 138 dikonjugasi dgn PerCP

Anti CD 19 dikonjugasi dgn PE

10  μl  

Anti CD 56

dikonjugasi dgn FITC

Anti CD 38 dikonjugasi dgn PerCP

Anti CD 45 dikonjugasi dgn APC

Inkubasi selama 25 menit , suhu kamar, di ruang

gelap

+ Lysis Solution, vortek segera 10 menit, inkubasi 10 menit , di ruang gelap

Cuci dgn PBS, sel difiksasi dgn +

500 µl PBS formaldehyde 1%

....  FCM immunophenotyping

•  Didapatkan    50.000  sel  berinG  dan  analisis  dengan  menggunakan  FACS  Canto  II  flowsitometri  (BD  Bioscience,  San  Jose,  CA,  USA)  

•  Sel  plasma  awalnya  diidenGfikasi  CD138  dan  side  sca4er,  kemudian  sel  di  gated  dgn  CD138  +  dan    dianalisis  untuk  CD56,  CD19,  dan  CD45  

11  

Fig 1.Typical laboratory protocol for distinguishing neoplastic plasma cells (CD56+or-/CD19-/CD138+/CD45-) from reactive plasma cells (CD56-/CD19+/CD138+/CD45+) in patients with multiple myeloma.

12  

....  FCM immunophenotyping

•  Kasus  CD  138  -­‐,  BM  dilabel  kembali  dengan  panel  CD  56/CD  19  /  CD38/  CD  45.    

•  Sel  plasma  di  ga6ng  menggunakan  CD  38  dan  side  sca4er.  

•  Sel  CD  38  +  dengan  low  side  sca4er  dilakukan  ga6ng  ulang  untuk  hasil  ekspresi  CD  45  negaGf  atau  intermediate      

13  

Fig.2 Flow cytometric immunophenotyping of 2 cases (A and B) with CD138-negative neoplastic plasma cells.Plasma cell were gated with CD38+ and low side scatter, followed by selectionof CD 45-dim(A) and CD45-negative(B)cells. In both cases ( A and B), neoplastic plasma cell showed CD 19- and CD 56+ expression( A,dim and B, intermediate )

14  

•  Definisi : -  CD 138 : deteksi sel neoplastik dan reaktif -  Sel plasma neoplastik : CD 138+ / CD56 - atau + / CD

19 - / CD 45 - -  Sel plasma reaktif : CD 138 +/ CD 56 - / CD 19 + / CD

45+ •  Komponen monoklonal serum ( Komponen M ) -  Konfirmasi protein monoklonal --> elektroforesis

protein -  Persentase dari protein monoklonal diukur dgn

densitometer -  Konsentrasi absolut dari protein monoklonal dihitung

dgn total konsentrasi protein serum

15  

Analisis  staGsGk    •  Data kontinu : mean ± SD dan dibandingkan dengan

tes Mann-Whitney U . •  Data kategori : tes Fischer’s exact •  Analisis korelasi : identifikasi kuatnya hubungan

antara komponen monoklonal dan fraksi sel plasma neoplastik atau proporsi sel berinti dari BM seperti yg telah ditentukan oleh flowsitometri.

•  Semua analisis : SPSS 18.0 , P< 0.05 = signifikan

16  

Hasil    17  

Table 1. Patient Demographics

Table 2. Comparison of overall positive expression rates for CD56, CD19, CD138, and CD45 in neoplastic myeloma cells between the untreated and treated patients. 18  

Table 3. Clinical and laboratory characteristics of 2 cases with CD138-negative neoplastic plasma cells according to FCM immunophenotyping.

19  

Table 4. Comparison of the proportion of neoplastic plasma cells between the untreated and treated patients.

20  

Fig 3. Comparison of the monoclonal immunoglobulin component (M-component) and the tumor burden of neoplastic plasma cells (PCs) in bone marrow (BM) aspirates according to flow cytometry (FCM).

21  

(A) A weak positive correlation (r=0.15) was noted between the fraction of neoplastic PCs according to FCM and the M-component, but this was not statistical significant (P=0.245). (B) The proportion of neoplastic PCs in BM aspirates, i.e., fraction of neoplastic

PCs according to FCM×percentage of PCs among the total number of nucleated cells in the BM aspirates according to differential cell count, showed a statistically significant positive correlation with the M-component (r=0.26, P=0.045).

Diskusi    •  Sel plasma neoplastik sebelumnya telah diidentifikasi

sesuai dengan CD38 + + / CD45- atau ekspresi dim. •  CD 38 : - petanda non-spesifik untuk sel plasma --> memiliki distribusi yang luas , ditampilkan pada permukaan sel hematopoietik dan nonhematopoietik. -  sebagian besar ekspresi pada sel limfosit B dan

limfosit T. •  Penelitian sebelumnya: mieloma mengekspresikan CD

45 +

22  

...Diskusi    •  CD138 : ü identifikasi awal sel plasma --> hanya sel plasma yg

mengekspresikannya. ü petanda untuk identifikasi dan isolasi populasi analisis

FCM. ü Gating CD138 --> identifikasi populasi sel myeloma

lebih homogen daripada gating CD38. ü digunakan untuk analisis FCM pada kedua kelompok

pasien krn tdk ada perbedaan signifikan secara imunofenotipe sel myeloma.

23  

...Diskusi    

•  Akan tetapi, ada komponen sel plasma yang tidak mengekspresikan CD 138

•  Penelitian ini : -  68 penderita ( 97.1% ) = CD 138 + -  2 penderita ( 2.9 % ) = CD 138 - , namun CD38 +

untuk kelompok ini. ü  Tak ada perbedaan profil immunophenotypic

(CD 56+/CD19-/CD45+) antara gating menggunakan CD 138 dgn CD38 + .

24  

...Diskusi    

•  EMN : CD 138 saja tidak adekuat sebagai petanda untuk peng gating primer sel plasma.

•  Deteksi simultan kedua CD 138 dan CD 38 digunakan sebagai rekomendasi --> meningkatkan presisi dan mengurangi variasi antara pengamat

•  Penelitian ini gagal mendeteksi subpopulasi sel plasma neoplastik dengan gating CD 138 saja ( ekspresi dim sampai negatif ) .

25  

...Diskusi    

•  Untuk mendeteksi sel mieloma dgn ekspresi CD 138 dim sampai negatif dapat dianalisis scr terpisah dari sel dgn CD 138 – dgn dasar ekspresi CD 38.

•  Pengating awal menggunakan CD138 diikuti oleh CD38 : - hanya untuk sampel ekspresi CD 138 dim sampai negatif --> alur kerja yang disederhanakan untuk karakterisasi MM

26  

...Diskusi    

27  

CD 38+/CD56+/CD19-  

gating ulang sel dgn ekspresi CD 45 dim sampai negatif -->

eksklusi sel NK  

Sel NK

...Diskusi    •  Semua kasus MM : -  Antigen tunggal tidak dapat digunakan. -  CD 138 terekspresikan tinggi --> tidak dapat

membedakan sel plasma neoplastik dgn sel plasma reaktif

-  CD 56 terekspresikan terutama sel plasma neoplastik walaupun tidak di semua kasus

-  CD 45 - /CD 45+ terdapat pada populasi sel plasma neoplastik

-  CD 19 --> reaktif sel plasma ; pd sel plasma neoplastik ekspresi hanya negatif sampai dim   28  

...Diskusi    

•  Mahmoud  et  al   :    Penegakkan  ekspresi  CD19  pada  sel   mieloma   manusia   akibat   dari   hambatan  pertumbuhan  dan  mengurangi  tumorigenisitas  .  

•  PeneliGan  ini  :  -­‐  CD19   Gdak   diekspresikan   dalam   sel   plasma  neoplasGk  -­‐-­‐>  jumlah  penderita  yg  terbatas  

-­‐  hilangnya   ekspresi   CD19   dalam   MM   mewakili   sel  myeloma  neoplasGk.  

-­‐   CD19  penanda  paling  berguna  untuk  membedakan  sel  plasma  neoplasGk  dari  sel  plasma  reakGf.  

29  

...Diskusi    

•  Peran  CD  45  pada  MM  masih  kontroversial  -­‐-­‐>  adanya  ekspresi  yg  berbeda-­‐beda.    

•  MGUS  =  distribusi  sama  pada  CD  45+  dan  CD  45-­‐  •  Persentase  sel  plasma  yg  mengekspresikan  CD  45  pd  penderita  MM  baru  atau  relap  -­‐-­‐>  ekspresi  nya  lbh  rendah  daripada  MGUS  atau  Smoldering  myeloma.  

•  PeneliGan  ini  :  >>  sel  plasma  neoplasGk  mempunyai  pola  ekspresi    CD  56  -­‐/+  dan  CD  19  -­‐  ,  dimana  intensitas  CD  45  bervariasi.  (  negaGf  sampai  bright)  

 

30  

...Diskusi    

•  Sampai   saat   ini,   Gdak   ada   kesimpulan   yang   pasG  bisa   ditarik   mengenai   CD45   ekspresi   pada   pasien  MM,  meskipun  >>  peneliGan  setuju  bahwa  fenoGpe  CD45  -­‐  mewakili  populasi  sel  plasma  neoplasGk.  

•  CD  45  :  -­‐  Pola  ekspresinya  bervariasi    -­‐  Mempunyai  keterbatasan    -­‐  Dikaitkan  dgn  hasil  klinis  yg  buruk    -­‐  Berguna  untuk  analisis  sel  plasma  dgn  FCM    

31  

...Diskusi    

•  Restriksi   sitoplasmik   imunoglobulin   rantai   ringan  terjadi  akibat  proliferasi  sel  plasma  neoplasGk    

•  Pengukuran  sitoplasmik  imunoglobulin  rantai  ringan  dgn   FCM   dapat   menunjukkan   pola   restriksi     -­‐-­‐>  diagnosis  MM.  

•  Metode   FCM   untuk   deteks i   s i top lasmik  imunoglobul in   ranta i   r ingan   mempunyai  keterbatasan  

32  

...Diskusi    

•  Metode   lain   untuk   mengukur   sitoplasmik   rantai  ringan  :    

 -­‐immunohistochemical  staining,    -­‐immunofixa6on  electrophoresis,      -­‐serum  free  light  chain  assay.    

•  PeneliGan   ini   :   dilakukan   immunohistochemical  staining  pd  spesimen  BM  untuk  rantai  ringan  kappa  dan   lambda   (data   Gdak   ditampilkan)   untuk   lebih  mendukung  idenGfikasi  sel  plasma  neoplasGk.  

33  

Simpulan    

•  Panel   ImunofenoGpe   FCM   :     CD56/CD19/CD138  (CD38)  /  CD45,  berguna  untuk  membedakan  sel-­‐sel  myeloma   neoplasGk   dari   sel   plasma   reakGf   pada  saat   diagnosis   dan   selama   pemantauan   penderita  MM  

•  CD19  merupakan  anGgen  yang  paling  penGng  untuk  mengidenGfikasi   sel   myeloma   neoplasGk   pada  penderita    MM  

34  

35  

Terimakasih

•  CD  19.ppt  •  CD138.ppt  •  CD56_natural  killer  cell.ppt  •  Consensus  internaGonal  myeloma  (2).ppt  •  cyyoplasmic  imunoglobulin.ppt  •  enforced  cd  19.ppt  •  EssenGal  monoclonal  gammopathy(  MGUS).ppt  •  flowsitometri  imunophenotyphing.ppt  •  imunohistokimia.ppt  •  MM.ppt  •  phenotypic  plasma  cell  1.ppt  •  ReacGve  VS  neoplasGc  plasma  cell.ppt  •  ImmunofixaGon.pptx  •  Serum-­‐free  light-­‐chain  measurement.pptx  •  CD45  expression  by  bone  marrow  plasma  cells  in.pptx  •  -­‐PRINSIP  PEMERIKSAAN    FLOWCYTOMETRY  PADA  IMUNOPHENOTYPING.ppt  

36  

37  

38  

Atypical plasma cell infiltrate with both Russell (cytoplasmic) and Dutcher (nuclear) bodies.

39