JUL.-SEP.

VoL. 5, n.º 31 9 9 8

La carambola: un nuevo fruto tropical en el mercado españolI. Costabeber, M.ª M. Borrego Carrión, P.J. Ibáñez Malagón, R.

Angulo Lucena, M. Jodral Villarejo

Situación nutricional de la infanciaA. Nogales

Fisiología de la digestión y absorción de los hidratos de carbonoI. Polanco Allué

Noticias

Desarrollo y utilización de anticuerpos policlonales y monoclonales frente a bacteriocinas producidas por bacterias lácticasA. M.ª Suárez Gea

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Jefe de Redacción:Dra. Ana Sastre

Secretaria de RedacciónDra. Clotilde Vázquez

ALIMENTACIÓN NUTRICIÓN Y SALUD

S U M A R I O

VOL. 5 JULIO-SEPTIEMBRE 1998 N.º 3

OriginalLa carambola: un nuevo fruto tropical en el mercado españolI. Costabeber, M.ª M. Borrego Carrión, P. J. Ibáñez Malagón, R. AnguloLucena, M. Jodral Villarejo 59

RevisionesSituación nutricional de la infanciaA. Nogales 65

Fisiología de la digestión y absorción de los hidratos de carbonoI. Polanco Allué 74

Trabajos Científicos y Becas. Instituto DanoneDesarrollo y utilización de anticuerpos policlonales y monoclonalesfrente a bacteriocinas producidas por bacterias lácticasA. M.ª Suárez Gea 80

La carambola es un fruto tropical de recienteintroducción en el mercado español. Cualidades sen-soriales como su extraordinario sabor y su especta-cular presentación, con la sección en forma de estre-lla, la hacen particularmente atractiva para elconsumidor. Así, no es de extrañar que haya au-mentado de forma importante el interés por su culti-vo y comercialización. Pero, las cualidades de esta"desconocida" fruta tropical no se agotan en lo pura-mente sensorial. Su abundante contenido en vitami-na C y A, sus múltiples posibilidades de procesadoen la industria alimentaria, y sus interesantes propie-dades medicinales son sólo algunas más de las pro-piedades que ostenta este exótico fruto.

Uno de los principales problemas que se achaca-ba al fruto de la carambola y que incidía directamen-te sobre su consumo era la acidez de éste. Ello cons-tituía un serio obstáculo que empañaba su valorcomercial. Sin embargo, la reciente obtención de va-riedades comerciales dulces, unido a su novedad yexotismo, ha disparado todas las expectativas entorno a la carambola, convirtiéndola en el fruto tro-pical con mayor proyección de mercado. A pesar deello, la carambola sigue siendo una fruta bastantedesconocida.

En este trabajo revisaremos aspectos de la caram-bola tales como su valor nutritivo, origen, varieda-des, alteraciones y usos, entre otros. En dichos as-pectos se constatan otras cualidades y propiedadesde este fruto, al margen de su interés meramenteeconómico o de mercado.

Orden: Geraniales

Familia: Oxalidaceae

Hutchison (1959), la incluyó dentro de una nuevafamilia, Averrhoaceae, pero lo cierto es que la ma-yoría de los botánicos no consideran esta familia conentidad propia dentro del orden Geraniales, e inclu-so algunos la incluyen dentro de la familia Oxalida-ceae. Dentro de esta familia se encuadran de 7 a 8géneros y unas 900 especies que crecen sobre todoen las zonas tropicales y subtropicales.

Género: Averrhoa

Averrhoa junto con Sarcotheca son los dos úni-cos géneros arbóreos que existen en esta familia.

El género Averrhoa debe su nombre al médico yfilósofo Averroes, que vivió en el siglo XII.

Especie: Averrhoa carambola L

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1136-4815/98/59ALIMENTACION, NUTRICION Y SALUD ALIM. NUTRI. SALUDCopyright © 1998 INSTITUTO DANONE Vol. 5, N.º 3, pp. 59-64, 1998

La carambola: un nuevo fruto tropical en el mercadoespañol

I. Costabeber, M.ª M. Borrego Carrión, P. J. Ibáñez Malagón. R. Angulo Lucena,

M. Jodral Villarejo

DEPARTAMENTO DE BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS. FACULTAD DE VETERINA-RIA. UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

FAMILIA BOTÁNICA

Foto 1. Fruto de Averrhoa carambola L. Su color amarillo nosindica que ya ha alcanzado la madurez necesaria para el con-sumo.

Planta

La planta de la carambola es un árbol tropical, decrecimiento lento y no mucha altura puesto que no

suele pasar de los 8-9 metros (Ostes y Martín Prevel,1987). Cuando es joven posee un porte piramidalpero luego adopta una copa generalmente redonday simétrica. Su tronco es corto, a veces torcido y lacorteza de color grisáceo.

Siempre está verde, entra rápidamente en pro-ducción (1 año después de la plantación) y hacia los25 años aproximadamente llega al fin del períodode vida económica útil.

Tiene la característica de presentar un número va-riable de floraciones, que pueden ocurrir de formacontinua en el caso de que se den condiciones tropi-cales adecuadas.

Sistema radicular

Es un sistema bastante ramificado, con raíces muygruesas, tanto las laterales superficiales como las deanclaje. Estas raíces, tanto lateralmente como enprofundidad, tienen un gran poder de penetración.

Hojas

Son compuestas, dispuestas de forma alterna, pe-cioladas, pinnadas, de color rojo bronceado cuandojóvenes y verde pálido a oscuro cuando adultas. Pue-den llegar a los 20 cm de longitud. Posee un raquistriangular de color café o morado verdoso y recu-bierto de pelos sobre el que se disponen de 2-11 pa-res de foliolos, los cuales son sensibles a la luz y a losgolpes.

Flores

Poseen un colorido rosa-rojizo, son perfectas, de5-12 mm de largo. Aparecen en panícula, portadasen ramitas delgadas ramificadas desde la base queaparecen principalmente en las axilas de las hojas.Se disponen fundamentalmente hacia la periferia dela copa del árbol.

Fruto

Se produce sobre todo en las porciones de laplanta expuesta a la luz solar directa.

Es una baya carnosa, de forma ovoide a elipsoi-dal, con un tamaño que varía entre 50-250 mm. delargo y 30-100 mm. de diámetro. Cuando está listopara la venta suele pesar entre 100 y 250 g. Poseegeneralmente cinco costillas longitudinales que ledotan de una típica sección en forma de estrella.

La carambola madura es de color verde o amarilloaunque puede presentar a veces un color blanqueci-no, pálido marrón dorado o naranja incluso.

I. COSTABEBER ET AL ALIM. NUTRI. SALUD

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DESCRIPCIÓN

Foto 2. Las cinco costillas que recorren a la carambola en todasu longitud les da una sección en estrella, ideal para adornarplatos y bebidas.

Foto 3. Sección transversal de carambola donde podemosapreciar su pulpa y la presencia de semillas de forma ovoide

La piel se consume junto con la pulpa, es translú-cida, delgada, suave y posee una cutícula cerosa.Por su parte, la pulpa es translúcida, muy jugosa ysu textura varía desde blanda a firme y crujiente.

Cuando madura en el árbol tiene un sabor másagradable, pero es más susceptible a sufrir dañosque cuando se recogen algo verdes para que madu-ren posteriormente. Pero, en todo caso, es un frutodelicado que ha de manipularse con sumo cuidado.

A partir de la floración, los frutos alcanzan la ma-durez hacia los 2-3 meses (en condiciones tropicales)y hacia los 3-5 meses (en condiciones subtropicales).

Semillas

Son de color marrón claro y con forma ovoide yaplanada. Suele haber entre 0-3 por celda aunque loideal es que su número sea lo más reducido posible.Estas semillas suelen perder su viabilidad pocos díasdespués de su separación del fruto.

Estudios sobre la composición nutritiva de la ca-rambola, como los realizados por Joseph y Mendon-ca (1989) o por Matthews (1989), revelan su granimportancia dietética.

Agua

Es el constituyente más abundante. Representa el90% en peso seco.

Azúcar

El contenido oscila entre 3,5 y 15%. Los azúcaresprincipales son la fructosa y la glucosa (Campbell yKoch, 1989).

Proteínas

Su contenido es muy reducido, cifrándose enaproximadamente 0,5 g/100 g de pulpa (Galán yMenini, 1991).

Valor calórico

Esta fruta aporta un valor calórico no muy eleva-do, de 35 cal/100 g (Galán y Menini, 1991).

Vitaminas

Es una fuente apreciable de vitamina C, con canti-dades que pueden llegar a los 90 mg/100 g (Galán yMenini, 1991). Es, sin duda, un valor elevado, compa-rable al de otras frutas, como la naranja que se sitúa entorno a 50 mg/100 g o el kiwi con 100 mg/100 g defruto comestible (Borrego et al., 1996). Con 100 g decarambola fresca se atiende el 70-95% de las necesi-dades diarias de vitamina C requeridas por un organis-mo adulto normal (García, 1983).

También es una buena fuente de vitamina A, convalores en torno a 560 µg/100 g (Galán y Menini,1991), frente a los 298 µg/100 g del albaricoque, los100 µg/100 g del melón, los 242 µg/100 g del kaki olos 125 µg/100 g de la papaya (Elmadfa, 1994).

Fibra bruta

Posee un contenido considerable, 0,7-0,9 %, loque dado su bajo valor calórico la convierte en inte-resante para algunos regímenes dietéticos (Galán yMenini, 1991).

Aminoácidos

Se han aislado 17, siendo los principales la Seri-na, el Acido Glutámico y la Alanina (Samson,1986).

Minerales

El Potasio es el mineral de mayor importancia.Posee 200 mg/100 g, por lo que se considera unaimportante fuente de este elemento.

Otros componentes

Poseen niveles abundantes de Ácido Oxálico, convalores en torno a los 0,04 y 0,7 g/100 g de jugo(Galán y Menini, 1991). Hasta hace poco se consi-deraba como alto su contenido en este ácido. Sinembargo, recientes investigaciones han detectadoque no es tan elevada esta cantidad, de hecho, nollega ni a la mitad del nivel detectado en una verduratan conocida y consumida como la espinaca (Wilsonet al., 1982). Todo ello junto con la aparición de cul-tivos dulces, de bajo contenido en este ácido, es loque ha aumentado su interés comercial.

La carambola, cuando está verde, posee ademásuna considerable cantidad de Ácido tartárico que,sin embargo, desaparece casi totalmente cuando elfruto madura (Vines y Grierson, 1966).

Vol. 5, N.º 3, 1998 LA CARAMBOLA: UN NUEVO FRUTO TROPICAL EN EL MERCADO ESPAÑOL

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VALOR NUTRITIVO

Su lugar de origen no está claro pero general-mente la mayoría de los autores aceptan que la es-pecie se originó en la zona de Indochina e Indone-sia, en lo que se conoce como Centro de origen deAsia-Tropical (Zewen y De Wet, 1982). Desde ahí, ytodavía en tiempos prehistóricos se distribuyó aáreas vecinas, como Filipinas o India.

Sin embargo, su difusión por el resto del mundoes bastante reciente. Así, en Australia no se la cono-ce prácticamente hasta finales del siglo XIX (Watsonet al., 1988).

Es posible que esta especie se difundiera desde elárea de origen hasta el continente americano a tra-vés del archipiélago de las Hawai. La introducciónen el continente americano se produce hacia finalesdel siglo XVIII (Ríos-Castaño y Vásquez, 1972) y yaa finales del siglo XIX, se encuentra presente en Flo-rida (Knight, 1969) y probablemente en toda el áreadel Caribe. Su introducción en otras zonas del conti-nente americano, como Colombia y otras áreas deloeste de América tropical, ocurre a lo largo del sigloXX. Se tiene noticia de que pudo penetrar en el con-tinente africano hacia el siglo XIX (Galán, 1987),procedente de la India. Su introducción en Europase produjo a través de Málaga (España) en 1988,siendo importada desde Australia.

Actualmente la carambola se encuentra presenteen numerosos lugares de los trópicos y subtrópicos,aunque no es tan apreciada esta fruta en Sudaméri-ca o África como en el Sudeste de Asia (Galán y Me-nini, 1991).

El porqué de la lenta difusión de esta fruta quizáhaya que buscarlo, por un lado en la escasa viabili-dad de su semilla, limitada a muy pocos días en con-diciones naturales y por otro en la elevada acidezque contienen la mayoría de los frutos de carambolaprocedentes de plantas sin injertar. Ha sido la selec-ción de variedades dulces y la facilidad de su propa-gación por injerto, lo que han motivado un repenti-no interés por esta fruta (Galán y Menini, 1991).

El principal país productor de Carambola es Tai-wan. La mayor parte de la producción la consume elmismo país, aunque también exporta a países talescomo Japón, China y Canadá.

El segundo país productor es Malasia, que tam-bién exporta a otros países, sobre todo Hong-Kongy países europeos.

Brasil es el tercer país en lo que a producción deeste fruto se refiere.

Otras zonas de cultivo son Florida, Guyana, Aus-tralia, Tailandia, Israel, Filipinas, Indonesia, Trini-dad-Tobago y Surinam.

Para Galán y Menini (1991) las principales varie-dades son Golden Star, Arkim, Cheng Tsey, B-2, B-10 y B-17. Estas tres últimas variedades son mala-yas y la letra B que poseen antes del número serefiere a la inicial de la palabra Belimbing (carambo-la en malayo).

Veamos brevemente, la descripción de cada unade las variedades citadas.

Golden Star

Originaria de Florida (Estados Unidos). Frutoovoide o elipsoide de tamaño medio. De color ama-rillo dorado, siendo sin duda la variedad que presen-ta un mayor atractivo visual. Su pulpa muy jugosa ycrujiente. Posee alta resistencia a daños mecánicos ya daños por frío en el almacén.

Arkim

También procede de Florida. Posee un tamañomedio. En la madurez, su color pasa de amarillo do-rado a amarillo naranja. Tiene una excelente texturay su sabor es dulce y de baja acidez. Se puede em-plear tanto para fruta fresca como para procesado.Presenta alta resistencia a daños mecánicos y porfrío.

Cheng Tsey

Originario de Taiwan. Junto con B-10 y merced auna serie de prácticas agrícolas (aclareo), es el quemayor tamaño alcanza. De color naranja cuando es-tá madura es bastante dulce y tiene una acidez baja.

B-2

Procedente de Malasia, al igual que B-10 y B-17.Fruto algo alargado, con un tamaño medio. Poseecolor amarillo cuando madura totalmente. Relativa-mente resistente al transporte. Se puede considerarcomo dulce; es útil tanto para fruta fresca como pa-

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VARIEDADES EXISTENTES:DESCRIPCIÓN

PAISES PRODUCTORES

ORIGEN

ra procesado. Su capacidad de almacenamiento noes muy larga. Presenta susceptibilidad moderada ha-cia la mosca de la fruta.

B-10

Fruto grande. Color desde amarillo hasta doradorojizo o naranja. Posee escasa acidez, es jugoso yútil tanto para fruta fresca como para procesado. Noes muy resistente a la mosca de la fruta.

B-17

Fruto grande y cilíndrico. Presenta un color ama-rillo dorado. Posee una textura crujiente. Es el másdulce de las variedades citadas, hasta el punto deque se le conoce como "carambola de miel".

Quizás la plaga que más seriamente puede atacara la carambola en los campos de cultivo es la moscade la fruta (Dacus dorsalis), llegando en algunos ca-sos a dañar la totalidad de la plantación con la consi-guiente pérdida económica.

También en los campos de cultivo de carambola,pueden ocurrir otras plagas y enfermedades que, engeneral, no suelen suponer graves problemas paralas plantaciones de este fruto (Galán y Menini,1991).

Una vez ha sido cosechado el producto, éstepuede ser afectado por diversos géneros dehongos que lo colonizan aprovechando heridasexistentes producidas por insectos o por unamala manipulación. Estos hongos producenmanchas sobre el fruto dando así lugar a unaapariencia anómala y a su total depreciación. Elhongo que más frecuentemente aparece es elgénero Colletotrichum gloesporioides (Watsonet al., 1988).

La refrigeración y el lavado son algunas de lasmedidas que pueden tomarse para el control y elimi-nación de estos hongos. A todo esto añadir, que laresistencia a estos hongos puede variar según la va-riedad de carambola de que se trate (Galán y Menini,1991)

Las bajas temperaturas durante el período de al-macenamiento producen encogimiento del fruto ypérdida de coloración, si bien la carambola es me-nos sensible a este problema que otros muchos fru-tos tropicales (Campbell, 1989).

En el mercado español, hoy por hoy, la carambo-la suele aparecer en algunos establecimientos co-merciales y solamente en los inicios de la Primavera,aunque poco a poco va extendiéndose. La que hayen el mercado procede de Brasil y África tropicalprincipalmente.

Sin embargo, características de este producto ta-les como versatilidad, atractivo, larga vida comercialy producción a lo largo de todo el año, suponengrandes ventajas de cara a la futura comercializaciónde este producto, tanto en nuestro país como en elresto de Europa. Todas estas cualidades no hacen si-no resaltar el magnífico potencial de mercado de es-te fruto.

Si a ello unimos su rapidez de entrada en los dife-rentes circuitos comerciales, sin duda la carambolatiene todas las características para ser uno de los fru-tales con mayor incremento de producción y consu-mo a lo largo de los próximos años.

Este fruto puede consumirse en fresco, o tras unproceso de transformación.

Para el consumo en fresco se emplean las Caram-bolas dulces, recientemente seleccionadas por elhombre. Sin embargo no se recomienda su uso paraplatos cocinados. En Surinam, se prepara vino conlos tipos dulces (Lewis y Groeizam, 1989).

Por su parte, los tipos ácidos de carambola antesde consumirse, han de sufrir un proceso de transfor-mación. Ofrecen grandes posibilidades culinarias.En Guyana (Ramsammy, 1989) se emplean para lapreparación de productos de limpieza casera y vina-gre.

La pulpa de la fruta puede consumirse en almíbar,en forma de jugos, o en forma de licor (Ramsammy,1989).

La carambola puede someterse a desecación, cono sin adición de azúcar, como lo hacen en China(Watson et al., 1988). También puede cortarse enrodajas y secarlas al aire caliente (Berry et al.,1977).

En algunos países se emplea como condimentopara hortalizas, carnes y también se adiciona ensala-das.

Los brotes y hojas molidos se usan como remediopara varicela, lombrices y dolor de cabeza. El frutose emplea como laxante, antiescorbútico, estimulan-

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ALTERACIONES MÁS FRECUENTES

POSIBILIDADES DE MERCADO

USOS Y APLICACIONES

te del apetito y antidisentérico. Las semillas, conve-nientemente preparadas, poseen propiedades abor-tivas (administradas en dosis elevadas). También seles reconocen poderes narcóticos y eméticos; ade-más, se emplean en infusión para el alivio del asmay de cólicos (Coronel, 1983).

En China, la carambola se recomiendan como an-pirético y, sobre todo, contra la Polidipsia (Sedgley,1983).

Jabbar et al. (1994) reseñan la utilidad de la ca-rambola como tónico digestivo, antidiarreico, antidi-sentérico, antihelmíntico y como alivio contra las he-morragias provocadas por hemorroides u otrosdesórdenes internos.

Aún se encuentra en fase de experimentación elempaquetado al vacío de rodajas frescas de caram-bola; si ello prosperara, sería posible aprovechar fru-ta de segunda categoría, y tendría una buena de-manda, sobre todo en restaurantes (Mathews,1989).

La carambola también se usa para adornar ensa-ladas, bebidas y platos de comida dada la típica for-ma en estrella de sus rodajas, que la hace ideal paraeste uso.

Asimismo, Watson et al. (1988) señalan su utili-dad como componente de paquetes de regalos, co-mo por ejemplo pueden ser cestas de frutas�

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Teniendo en cuenta la heterogeneidad de lasmúltiples circunstancias culturales, socio-políticas yeconómicas de los distintos países, y con objeto depoder manejar datos e indicadores nutricionales ysanitarios cuyo significado se mueva dentro de ran-

gos comparables, se han reunido los países en 9grupos, según se detalla en la tabla I, en donde, co-mo puede observarse, los seis primeros grupos co-rresponden a localizaciones geográficas y los otrostres a grado de desarrollo, teniendo en cuenta queel último grupo está comprendido en el anterior(Países en desarrollo) y está constituido por los másatrasados países del mundo (Países menos adelanta-dos).

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1136-4815/98/65ALIMENTACION, NUTRICION Y SALUD ALIM. NUTRI. SALUDCopyright © 1998 INSTITUTO DANONE Vol. 5, N.º 3, pp. 65-73, 1998

Situación nutricional de la infancia

A. Nogales

DEPARTAMENTO DE PEDIATRÍA. HOSPITAL UNIVERSITARIO 12 DE OCTUBRE. MADRID

SITUACIÓN A NIVEL MUNDIAL

TABLA I

GRUPOS DE PAÍSES

Africa subsahariana (AS)

Angola Etiopía Malawi SenegalBenin Gabón Malí Sierra Leona

Botswana Gambia Mauricio SomaliaBurkina Faso Ghana Mauritania Sudáfrica

Burundi Guinea Mozambique Rep. TanzaniaCamerún Guinea-Bissau Namibia TogoCongo Kenya Níger Uganda

Côte d’Ivoire Lesotho Nigeria ZaireChad Liberia Rp. CentroafricanaEritrea Madagascar Rwanda

Oriente Medio y Africa Septentrional (OM-AS)

Argelia Iran, Rep.Islámica de Líbano SudánArabia Saudita Iraq Libia Siria, República Arabe

Egipto Jordania Marruecos TúnezEmiratos Arabes Unidos Kuwait Omán Yemen

Asia Meridional (AM)

Afganistan Bhután Nepal Sri LankaBangladesh India Pakistán

A. NOGALES ALIM. NUTRI. SALUD

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Asia Oriental y Pacífico (AO-P)

Camboya Filipinas Malasia SingapurCorea, Rep. Hong Kong Mongolia Tailandia

Corea. Rep.P. Dem. Indonesia MyanmarChina Lao. Rep. Dem. Pop. Papua Nueva Guinea

América Latina y el Caribe (AL-C)

Argentina Chile Jamaica República DominicanaBolivia Ecuador México Trinidad y TabagoBrasil El Salvador Nicaragua Uruguay

Colombia Guatemala Panamá Venezuela.Costa Rica Haití Paraguay

Cuba Honduras Perú

Europa Central y del Este, Comunidad de Estados Independientes y Países Bálticos (ECE-CEI-PB).

Albania Eslovenia Macedonia TurquíaArmenia Estonia Moldova Ucrania

Azerbaiyán Georgia Polonia UzbekistánBielorrusia Hungría República Checa Yugoslavia.

Bosnia y Herzegovina Kazakstán RumaniaBulgaria Kirguistán Rusia, FederaciónCroacia Letonia Tayikistán

Eslovaquia Lituania Turkmenistán

Países industrializados (PI)

Alemania España Israel SueciaAustralia Estados Unidos Italia SuizaAustria Finlandia JapónBélgica Francia NoruegaCanadá Grecia Portugal

Dinamarca Irlanda Reino Unido

Países en desarrollo (PD)

Afganistán El Salvador Líbano Arabia SauditaAngola Emiratos Arabes Líberua SenegalArgelia Unidos Libia Sierra Leona

Argentina Eritrea Madagascar SingapurArmenia Etiopía Malasia Siria, Rep. Arabe

Azerbaiyán Filipinas Malawi SomaliaBangladesh Gabón Malí Sri Lanka

Benin Gambia Marruecos SudáfricaBhután Georgia Mauricio SudánBolivia Ghana Mauritania Tailandia

Botswana Guatemala México TayikistánBrasil Guinea Mongolia Tanzania, Rep. Unida de

Burkina Faso Guinea-Bissau Mozambique TogoBurundi Haití Myanmar Trinidad y TabagoCamboya Honduras Namibia TúnezCamerún Hong Kong Nepal TurkmenistánColombia India Nicaragua Turquía

Los datos demográficos que utilizaremos seguida-mente son los publicados por UNICEF para 1997 (1).En una población mundial de 5.696 millones, sonmenores de 11 años 2.106 millones, y 633 millonestienen menos de 5 años. Sólo 191 millones menoresde 18 años, y 53 millones con menos de 5 años seencuentran en los países industrializados. Así pues, losgrandes problemas mundiales de la infancia a nivelcuantitativo, y en la gran mayoría de los casos tam-bién cualitativo, no son propios de nuestro país, ni delgrupo de países de nuestro nivel socio-económico.

Los aspectos nutritivos son, por razones ob-vias, de la mayor importancia en la infancia; enla tabla II aparecen datos realmente llamativossobre la frecuencia del bajo peso al nacimiento,que en los países industrializados es de 6 por100 nacimientos y en Asia meridional de 33. Enrelación con la malnutrición se encuentran datosde tal calibre, como que el 52% de los niños delAsia del Sur tengan una deficiencia de peso mo-derada-grave y un 53%, una cortedad de tallamoderada-grave.

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Congo Indonesia Níger UgandaCorea, Rep.Pop.Dem Irán Nigeria UzbekistánCorea, República de Iraq Omán Venezuela

Costa Rica Jamaica Pakistán Viet NamCôte d’Ivoire Jordania Panamá Yemen

Cuba Kazakstán Papua Nueva Guinea ZaireChad Kenya Paraguay ZimbabweChile Kuwait PerúChina Kirguistán Rep. CentroafricanaEcuador Lao, Rep. Dem. Pop. Rep. DominicanaEgipto Lesotho Rwanda

Países menos adelantados (PMA)

Afganistán Etiopía Malí SomaliaAngola Gambia Mauritania Sudán

Bangladesh Guinea Mozambique Tanzanía, Rep.UnidaBenin Guinea-Bissau Myanmar TogoBhután Haití Nepal Uganda

Burkina Faso Lao, Rep.Dem.Pop. Níger YemenBurundi Lesotho República ZaireCamboya Liberia Centroafricana ZambiaChad Madagascar RwandaEritrea Malawi Sierra Leona

TABLA II

AS OM AO AL EC MUN-(*) AS AM P C CI PI PD PM DO

PB A

Nacimientos con bajo peso 16 11 33 11 10 — 6 19 23 18(%)

Niños con lactancia 29 43 46 — 21 — — 42 43 42exclusiva

0-3 meses (%)Niños lactantes con 64 45 31 — 41 — — 45 53 45

alimentacióncomplementaria, 6-9

meses (%)Niños lactantes, 20-23 48 — 68 — 20 — — 52 57 52

meses(%)

En la Cumbre Mundial de la Alimentación (2) ce-lebrada en Roma en Noviembre de 1996 se afirmóque en América Latina existían 64 millones de per-sonas subalimentadas y 12,7 millones de niños confalta de medro. En Asia (especialmente India y Ban-gladesh), 534 millones de personas están subalimen-tadas, y en Africa son 235 millones los que se en-cuentran en esta situación. Se informó igualmenteque el 20% de la población de los países en desarro-llo está subalimentada (unos 840 millones de perso-nas).

En el conjunto de los países en desarrollo, casiuna tercera parte de los niños menores de 5 años(unos 165 millones) sufren desnutrición moderada ograve (3).De los más de 12 millones de estos niñosque mueren anualmente, la desnutrición es el factordeterminante de más de la mitad de los casos. Escierto, sin embargo, que mediante grandes esfuerzoscomunitarios se están reduciendo los niveles de des-nutrición a escala mundial, pero aún existen datosrealmente escalofriantes al respecto; así, en un re-ciente trabajo (4) se ha llegado a la conclusión deque la mitad de los niños del mundo no están ade-cuadamente nutridos. Según el nivel económico decada país puede calcularse el porcentaje de desnutri-ción infantil esperable; la diferencia entre esta cifra yel nivel real de la desnutrición constituye la “brechaen los resultados nutricionales” (BRN). En algunospaíses la brecha es positiva (hay menos desnutriciónde la esperable según el PNB); entre ellos se encuen-tran Uganda, Tanzania, Egipto, Jordania, Paraguay,Bolivia, Jamaica, Marruecos, República Dominica-na, Malawi, Mongolia y Sierra Leona. En otros paí-ses la BRN es negativa, lo que sucede en Níger, Ni-

geria, Yemen, Viet Nam, Pakistán, Filipinas, Mauri-tania, Bangladesh e India.

Debido a una información errónea y a la comer-cialización exagerada de sucedáneos de leche mater-na, muchos niños en regiones sanitariamente depri-midas no reciben lactancia natural. Se calcula quemás de un millón de niños mueren anualmente ymuchos millones más se desarrollan deficientementedebido a que no son amamantados de forma ade-cuada. A nivel mundial se están desarrollando fuer-tes campañas a favor de la lactancia materna, entreellas la OMS y el UNICEF establecieron en 1988 elprograma de los “Hospitales Amigos de los Niños”,en el que se formulaba el reconocimiento de aque-llos centros que siguen los “Diez pasos para conse-guir una feliz lactancia natural”:

1.- Disponer de una política escrita sobre lactan-cia natural, que sistemáticamente se ponga en cono-cimiento de todo el personal de salud.

2.- Capacitar a todo el personal de salud de formaque esté en condiciones de poner en práctica estapolítica.

3.- Informar a todas las embarazadas de los bene-ficios que ofrece la lactancia natural y la forma deponerla en práctica.

4.- Ayudar a las madres a iniciar la lactancia du-rante la media hora siguiente al parto.

5.- Mostrar a las madres cómo se debe dar de ma-mar al niño y cómo mantener la lactancia, incluso sihan de separarse de sus hijos.

6.- No dar a los recién nacidos más que la leche

A. NOGALES ALIM. NUTRI. SALUD

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TABLA II (CONT.)

AS OM AO AL EC MUN-(*) AS AM P C CI PI PD PM DO

PB A

Niños con insuficiencia de 30 16 52 23 11 — — 32 42 32peso moderada-grave (%)Niños con insuficiencia de 9 4 20 4 2 — — 10 14 10

peso grave (%)Niños con emaciación, 8 7 16 5 3 — — 9 10 9moderada grave (%)

Niños con cortedad de 41 24 53 34 20 — — 39 50 39talla, moderada, grave (%)Prevalencia de bocio (%) 16 20 13 13 15 20 — 15 19 14

Hogares que consumen sal 47 75 58 48 80 26 — 55 33 54yodada (%)

Consumo de calorías en 93 123 99 112 114 128 134 107 90 112relacion nivel requerido

(%)

(*) Nota: Las abreviaturas corresponden a grupos de países, según se especifica en la tabla I.

materna, sin ningún otro alimento o bebida, a no serque estén médicamente indicados.

7.- Facilitar la cohabitación de las madres y los ni-ños durante las 24 horas del día.

8.- Fomentar la lactancia natural cada vez que sesolicite.

9.- No dar a los niños alimentados al pecho chu-padores o chupetes artificiales.

10.- Fomentar el establecimiento de grupos deapoyo a la lactancia natural y procurar que las ma-dres se pongan en contacto con ellos a la salida delhospital o clínica.

En la actualidad se estima que el amamantamien-to previene anualmente más de seis millones demuertes infantiles. Hasta el momento cerca de 5000hospitales han obtenido el certificado de “amigos delos niños”, como expresión de que siguen las nor-mas propugnadas por UNICEF para una lactanciaadecuada.

Por otra parte, la carencia de algún micronutrien-te, como yodo, vitamina A e hierro, afecta a unos2000 millones de personas, en su mayoría niños ymujeres de los países en desarrollo. El déficit de yo-do es la principal causa mundial de retraso mentalprevenible, y supone una amenaza para 1600 millo-nes de personas (1/3 de la población mundial) queviven en regiones donde el yodo es escaso. Unos5,7 millones de personas han nacido con cretinismopor deficiencia materna en yodo durante la gesta-ción, y unos 50 millones sufren algún problema desalud por déficit de yodo. Ahora bien, en este cam-po se han realizado grandes progresos, lo que hasalvado a 750 millones del peligro de la carencia deyodo. Sin embargo, no se trata de un problema re-suelto, ni siquiera en los países industrializados, queen este sentido se han divido en cuatro grupos (5):

Países en que el 70% de sal destinada al consumoestá enriquecida con yodo: Austria, Canadá, Finlan-dia, Eslovaquia, República Checa, Suiza.

Países que realizan esfuerzos importantes paraconseguir la yodación de la sal que utilizan: Bulgaria,Hungría, Polonia y Rumania.

Países que han elaborado planes para la yodaciónde la sal, pero aún no los han aplicado: Francia.

Países donde se ha comprobado que la deficien-cia de yodo constituye un problema de salud pública,o es probable que lo sea, pero que aún no han esta-blecido planes nacionales para la yodación de todala sal del consumo: Albania, Alemania, España, Gre-cia, Italia, Portugal.

Países donde está comprobado, o se supone, quela deficiencia de yodo no constituye un problema desalud pública: Australia, Bélgica, Dinamarca, EEUU,Irlanda, Israel, Japón, Noruega, Nueva Zelanda, Paí-ses Bajos, Reino Unido, Suecia.

Por lo que respecta a la vitamina A, por lo menos250 millones de niños menores de 5 años están ex-puestos a su carencia, que provoca ceguera perma-nente en unos 250.000 niños por año en países endesarrollo. Esta carencia es un factor importante enun 20-30% de los menores de 5 años. La ayuda y laeducación sanitaria a los países más necesitados haconseguido que de los 85 países donde los niños es-taban amenazados por esta carencia, 58 superaranesta situación en 1995 (3).

En Centroamérica se enriquece el azúcar con vita-mina A. Y en muchos países de Asia se distribuyencápsulas de esta vitamina, aprovechando el sistemade inmunizaciones.

La anemia por carencia de hierro afecta a más de1000 millones de personas, en la mitad de los casosmujeres embarazadas y niños preescolares. Esta caren-cia es la causa principal de un 20% de las muertes ma-ternas a nivel mundial (3). La región más afectada es elAfrica meridional, en donde se estima que un 60% delas embarazadas presentan anemia ferropénica.

En los países en desarrollo, 1100 millones de per-sonas carecen de acceso al agua potable y 2900 mi-llones no cuentan con un sistema de saneamiento,siendo las enfermedades relacionadas con el agua lacausa de casi cuatro millones de muertes infantiles alaño.

En la Cumbre Mundial en favor de la Infancia de1990 se propuso alcanzar 27 grandes metas en fa-vor del desarrollo de la infancia antes del año 2000.Entre ellas figuraban el acceso universal al agua po-table y a medios sanitarios de eliminación de excre-mentos. Más de 150 países han suscrito ya estasmetas (6).En el Programa 21 del plan mundial de ac-ción adoptado en 1992 en la Cumbre para la Tierrade la Conferencia de las Naciones Unidas para elMedio Ambiente y el Desarrollo se definió una estra-tegia realista para hacer frente a las necesidades delagua y saneamiento.

Finalmente queremos exponer los datos económi-cos referidos a la renta per capita, tasa anual de in-flación, población por debajo de la pobreza absoluta(aquélla cuyos ingresos no le permiten obtener unadieta mínima adecuada y otros bienes esenciales noalimentarios), junto a los gastos de los gobiernos ensalud, educación y defensa que aparecen en la tablaIII, y que se encuentran estrechamente relacionadoscon la situación sanitaria y nutricional de la pobla-ción, en general, y de la infancia en particular.

Únicamente querríamos destacar que la renta percapita de los países industrializados es de 24.300dólares, y durante el período 1985-94 ha crecido enun 1,9% anual. Los países menos adelantados tie-nen una renta de 233, con una tasa de crecimientoanual durante 1985-94 de -0,1; en estos países lapoblación por debajo de la pobreza absoluta es un70% en el campo y un 55% en las ciudades.

Vol. 5, N.º 3, 1998 SITUACION NUTRICIONAL DE LA INFANCIA

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El informe sobre el Desarrollo Humano 1996 delas Naciones Unidas pone de manifiesto datos muyreveladores sobre la situación económica a nivelmundial (7). Así, expresa que 1600 millones de per-sonas y 89 países están en peor situación que hace10 o más años. En 70 países, los niveles de ingresosson inferiores a los que tuvieron en los años sesentay setenta.

Sin embargo, entre 1975 y 1985 el Producto Na-cional Bruto mundial creció un 40%, aunque este in-cremento se concentró en un número mínimo depaíses, y la cantidad de pobres aumentó en el mun-do en un 17%. Actualmente el patrimonio de las358 personas que superan los 1000 millones de dó-lares es mayor que el total de los ingresos anuales delos países en que vive casi la mitad de la poblaciónmundial.

Pese a todo, en la mayoría de los países se haproducido un considerable progreso en materia edu-cacional y de salud, acceso al agua limpia y planifi-cación familiar. En los últimos 30 años la esperanzade vida en los países en desarrollo aumentó en un30% y la matrícula en la enseñanza primaria pasódel 48 al 77% (7).

Sin embargo, se necesita un desarrollo muchomás rápido de los países atrasados para evitar que, apesar de todo, las diferencias con los países ricos se-an cada vez mayores. En el Congreso Social de Co-penhague de 1995 se formuló una propuesta avala-da por la ONU de un “pacto 20/20”, por el cual lospaíses en desarrollo destinarían el 20% del gasto pú-

blico a servicios sociales básicos, y los países indus-trializados dedicarían el 20% a ayuda externa paraactividades centradas en la población. Ello ayudaríagrandemente a equilibrar de forma paulatina el cre-cimiento y desarrollo humano tanto a nivel nacionalcomo internacional (7).

Nos gustaría comentar seguidamente en formabreve algunos aspectos importantes de la alimenta-ción infantil en nuestro país. Nuestra sociedad fuereacia a seguir las orientaciones sanitarias sobre laalimentación de los lactantes a partir de los años 50,llegando a minusvalorar la lactancia materna y so-brevalorando, en muchas ocasiones, beneficios sóloaparentes de la artificial.

En Madrid observamos la evolución de la lactan-cia materna desde 1950, y como podemos ver enla representación de la Fig. 1, tanto el inicio en laadministración del pecho materno, como el tiempode lactancia fue disminuyendo paulatinamente hastael bienio 1976-77. A partir de entonces, comenzósu recuperación (8).

Diversos estudios en nuestro medio han valoradola situación actual de la lactancia materna en dife-

A. NOGALES ALIM. NUTRI. SALUD

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TABLA III

AS OM AO AL EC MUN-(*) AS AM P C CI PI PD PMA DO

PB

PNB percápita(dólares) 503 1662 325 962 3139 2121 24300 1023 233 4498Tasaanual crecimiento 2.7 3.1 1.5 4.9 4.0 — 2.9 3.7 -0.1 3.1

PNB per cápita 1965-80Tasa anual crecimiento -0.9 -0.7 2.6 7.1 0.9 -3.1 1,9 2.9 -0.1 1.9PNB per cápita 1985-94Tasa anual inflación (%) 16 15 10 9 392 103 3 139 22 30

Población por debajo nivel — — 33 — 18 — — 27 55 —pobreza absoluta (%)

urbanaPoblación por debajo nivel 62 — 39 16 48 — — 31 70 —pobreza absoluta (%) ruralGasto del gobierno en salud 4 6 2 2 5 — 12 4 5 10

(%)Gasto del gobierno en 13 15 3 12 10 — 4 11 12 6

educación (%)Gasto del gobierno en 11 21 17 17 5 — 10 13 19 10

defensa (%)

(*) Nota: Las abreviaturas corresponden a grupos de países, según se especifica en la tabla I.

ALIMENTACIÓN DE LOS NIÑOS ENNUESTRO PAÍS

rentes áreas del país (9-17), con resultados relativa-mente distintos, siendo muy difícil obtener una vi-sión sintética de la incidencia de la lactancia maternaen el conjunto de la población española.

En nuestro medio, en Madrid, sí podemos afirmarque la mínima incidencia de la misma ocurrió, comohemos ya indicado, en el bienio 1976-77. A partirde entonces, la intención de administrar el pechomaterno se ha ido incrementando de modo que enla actualidad cerca del 90% de los recién nacidosson aplicados al pecho de sus madres. Sin embargo,la lactancia natural se abandona pronto, de modoque en Madrid capital sólo el 52% de los niños to-man pecho a la edad de 3 meses, y el 5% a los 6meses.

En las ciudades-dormitorio y en la periferia indus-trial de Madrid, a la edad de 3 meses sólo toman lac-tancia materna del 36 al 40% de los niños.

Muy pocos lactantes reciben pecho materno a finalesdel primer año y desde luego, ninguno durante el segun-do año, según se aconseja en las normas de la OMS.

Otro hecho a tener en cuenta y que debe corre-

girse, puesto que dificulta la normal instauración ydesarrollo de la lactancia natural, es la aplicación tar-día tras el nacimiento de los recién nacidos al pechomaterno; pocos son aplicados en las dos primerashoras de vida, y casi ninguno en la primera mediahora, que es el tiempo indicado para hacerlo (16).

En nuestro medio hemos observado que los facto-res que se relacionan negativamente con la lactanciamaterna son los siguientes (17):

—Mal conocimiento de las ventajas de la lactanciamaterna para el niño y la madre.

—Promoción insuficiente de la lactancia materna.

—Edad de la madre superior a 29 años.

—Buena opinión del padre sobre la lactancia arti-ficial.

—Separación madre-hijo tras el parto superior a1 hora.

—Aplicación al pecho después de 1 hora tras elnacimiento.

—Pausas nocturnas prolongadas en menores de3 meses.

—Opinión de la madre de tener leche insuficienteo “inadecuada”.

—Introducción precoz de algún biberón.

—Uso de chupete.

Por el contrario, hemos encontrado relación posi-tiva con el éxito de la lactancia materna (17) cuandoexiste:

—Decisión de lactar tomada por la madre antesdel parto.

—Decisión de la madre de seguir una lactanciaprolongada tras el nacimiento del hijo.

Todos esto hechos deben tenerse en cuenta paraactivar, en cuanto esté de nuestra parte, la promo-ción de la lactancia natural (18-28).

En cuanto a la administración de la alimentacióncomplementaria del lactante, hemos apreciado ennuestro medio una tendencia a su introducción pre-coz, que comenzó ya en 1980; en bastantes casosse inicia durante el primer trimestre. Cereales, pes-cado, huevo, leche de vaca y derivados empezabana administrarse precozmente en algunos casos, lomismo que hemos observado un inadecuado y tem-prano aporte de azúcar y sal en dicha alimentacióncomplementaria (16). En cualquier caso, nuestra im-presión es que en los últimos años se está retrasan-do la introducción de la alimentación complementa-ria, a edades cada vez más adecuadas, próximas alos 4-6 meses.

En el capítulo de la alimentación del niño, quere-mos hacer referencia a la del preescolar, que ennuestro medio hemos visto que reúne ciertas carac-

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Fig. 1. Lactancia materna en Madrid 1950-1979.

terísticas, algunas de las cuales no son las más acon-sejables, y debe tenderse a su corrección (17):

—La ingesta energética diaria a la edad de 2 y 3años es, aproximadamente, la adecuada. Sin embar-go, a los 4 y 5 años resulta discretamente escasa.

—En cuanto a la distribución del aporte energéti-co diario en las principales comidas, resulta algo ba-jo en el desayuno y cena, y demasiado elevado en lacomida del mediodía y merienda.

—Del conjunto de la energía aportada por los prin-cipios inmediatos, la de los hidratos de carbono sueleser algo inferior a la recomendada, mientras supera aésta la de las proteínas y lípidos, que a su vez poseenun deficiente contenido en ácidos grasos poliinsatura-dos, y excesivo de saturados y monoinsaturados.

Por lo que respecta a la alimentación del escolar,un reciente estudio realizado en Madrid (29) puso demanifiesto que el consumo de hidratos de carbono yproteínas está dentro de los límites recomendados, yel de grasas es ligeramente superior, con una pro-porción excesivamente elevada de ácidos grasos sa-turados y baja de insaturados.

En nuestra adolescencia, de cuyas dietas se hanpublicado diversos trabajos (30,31) parece existir, engeneral, un aporte excesivo de energía, con cantida-des elevadas de grasas, ácidos grasos saturados y co-lesterol; igualmente, alta ingesta de sodio, frente aun déficit de hidratos de carbono complejos y vege-tales ricos en fibra. Esta dieta se asocia a un riesgoincrementado de enfermedades crónicas, como dia-betes, obesidad, cáncer, hipertensión y enfermeda-des cardio-vasculares ( 32,33). También es propiode esta edad la irregularidad en las comidas, obser-vándose, por ejemplo, un importante porcentaje deadolescentes que no toman desayuno o que desayu-nan de modo insuficiente.

Uno de los problemas nutricionales de los paísesricos es la obesidad infantil. En nuestro medio cier-tamente no se trata aún de una situación alarmante,pero debe ser tenida en cuenta, sobre todo en ordena su prevención. Las cifras de prevalencia de la mis-ma, que exponemos en la tabla IV, corresponden alestudio PAIDOS ‘84 realizado en nuestro país (34).

Otros problemas nutricionales de carácter social queen nuestro medio han adquirido importancia crecienteson los trastornos de la conducta alimentaria, que aun-que ya eran conocidos desde la antiguedad, se iniciaroncomo un real problema social hace unos 30 años.Comprenden la anorexia nerviosa, la bulimia nerviosa,y una serie de cuadros mixtos o intermedios que, enconjunto afectan sobre todo a la población adolescente,con un claro predominio del sexo femenino.

En la anorexia nerviosa se está observando, junto alincremento de su frecuencia, el inicio a edades cadavez más tempranas, incluso prepuberales, y de la afec-tación de un número de varones también creciente.

Se acepta una prevalencia general de la anorexianerviosa de alrededor de un 0,2 a 0,8 % de la pobla-ción general y entre un 1 a 2% de los muchachosadolescentes; y para la bulimia nerviosa, de un 1 aun 5% también a estas edades. Estos procesos suelenpresentarse con una frecuencia 10 veces superior enel sexo femenino (35) aunque como ya hemos co-mentado, la prevalencia entre varones aumenta, node forma rápida, pero sí consistentemente.

En un estudio realizado en Madrid por MorandéG, Casas J y Celada J (36) se puso de manifiestoque la prevalencia de la anorexia nerviosa en adoles-centes femeninos de 15 años pasó de 0,3% en1985-86 a 0,68% en 1993-94, siendo las cifras co-rrespondientes a la bulimia nerviosa las de 0,6% y1,23%, respectivamente. Cuando estos autores su-man cuadros completos y parciales, un 4,75% de

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TABLA IV

EDAD EN TOTAL % TOTAL % VARONES % NIÑASAÑOS NIÑOS OBESOS OBESAS

OBESOS

6 202 4,5 3,8 5,17 620 5,3 5,2 5,48 661 6,1 7,6 4,29 685 5,3 4,9 5,7

10 714 4,3 4,4 4,311 671 4,2 3,9 4,412 538 3,9 4,2 3,513 111 5,4 5,9 4,714 22 4,5 9,1 —15 7 14,3 16,7 —

Total 4.231 4,9 5,1 4,0

las adolescentes femeninas y 0,85% de los adoles-centes varones presentan estos trastornos alimenta-rios.

Los problemas de los trastornos de la conductaalimentaria son propios de países ricos, de modoque en EE.UU., mas del 60% de las adolescentes seconsideran gruesas y hacen dieta, y en Madrid, estemismo hecho ocurre en el 43% de las chicas de 15años (36).

Como vemos, la situación nutricional de la infan-cia y adolescencia en nuestro medio, aunque pre-senta algunas carencias, generalmente cualitativas,nada tiene que ver con la que hemos descrito en lospaíses en desarrollo y especialmente en los menosdesarrollados, que en algunos aspectos es verdade-ramente catastrófica.

Es cierto que existe un aumento de la sensibilidadde los países ricos hacia las necesidades de los po-bres, y es previsible que en los próximos años laayuda de los primeros hacia los segundos se incre-mente, aunque resulta dudoso que un prudente re-parto de la riqueza se realice con la rapidez suficien-te para establecer un aceptable equilibriosocio-económico (que naturalmente no significaría,ni mucho menos, una situación igualitaria) en unplazo de tiempo aceptable.

Ojalá que las diferencias económicas y socialesentre los niños del mundo se vayan acortando paula-tinamente durante los próximos años; ello sólo ocu-rrirá si los países avanzados son capaces, por fin, deactuar de forma razonable con los menos desarrolla-dos (34) �

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BIBLIOGRAFIA

74

Los hidratos de carbono (HC) forman una parte im-portante de la dieta humana. Para su utilización deben serdigeridos a monosacáridos y posteriormente absorbidos.

Su digestión se lleva a cabo en dos fases: intraluminal(hidrólisis del almidón por las alfa-amilasas) y parietal (porlos enzimas del epitelio del intestino delgado).

En su absorción tiene especial importancia el transpor-te de glucosa sodio-dependiente, que constituye el factorlimitante en la digestión de los carbohidratos.

Finalmente, el colon juega un importante papel por suactuación frente a los HC que no han sido previamenteabsorbidos, rescatando parte de la energía procedente desu fermentación bacteriana.

Palabras clave: Digestión. Absorción. Carbohidratos.Fisiología.

Carbohydrates (CHO) represent an important shareof human diet. To be assimilated they must first be brokendown to monosaccharides and then be absorbed.

Fundamentally, two steps can be distinguished in CHOdigestión: intraluminal (cleavage of starch by alpha-amila-se) and parietal (by membrane bound enzymes of theepithelium of the small intestine).

It is specially important glucose Na-dependent trans-port which is the rate-limiting step of CHO absorption.

Finally, colon plays an important function because ofthe use of not previously absorbed CHO, salving energyfrom CHO bacterial fermentation.

Key words: Digestión. Absorption. Carbohydrates.Physiology.

1136-4815/98/74ALIMENTACIÓN, NUTRICION Y SALUD ALIM. NUTRI. SALUDCopyright © 1998 INSTITUTO DANONE Vol. 5, N.º 3, pp. 74-79, 1998

Fisiología de la digestión y absorción de los hidratosde carbono

I. Polanco Allué

DEPARTAMENTO DE PEDIATRÍA. SERVICIO DE GASTROENTEROLOGÍA Y NUTRICIÓN. HOSPITALUNIVERSITARIO INFANTIL LA PAZ. MADRID

RESUMEN SUMMARY

La absorción de HC consiste en el transporte delos mismos desde la luz intestinal hasta la sangre osistema linfático a través de las células epiteliales dela mucosa intestinal. Para que este proceso sea posi-ble es necesaria la digestión previa de los HC ya queéstos se ingieren fundamentalmente en forma de po-límeros mientras que la absorción se lleva a cabo enforma de sus monómeros constitutivos.

El intestino delgado, lugar fundamental para laabsorción de nutrientes, está estructurado morfológi-camente de tal forma que se obtiene la máxima su-perficie absortiva (Figura 1):

—Pliegues mucosos de Kerckring o válvulas con-niventes (pliegues transversales en forma de semilu-na que hacen prominencia hacia la luz intestinal).

—Vellosidades intestinales.

—Microvellosidades, presentes a lo largo de toda

la superficie luminal de los enterocitos, formando elribete en cepillo.

Con esta estructura se consigue un aumento, dehasta 600 veces, de la superficie de absorción dispo-nible a nivel del intestino delgado respecto a un cilin-dro simple de igual tamaño (1).

Los hidratos de carbono (HC) representan la ma-yor parte de la dieta humana. Como mono, oligo, oprincipalmente polisacáridos, forman no sólo granparte cuantitativamente, sino también la principalfuente de energía suministrada. Durante la lactancia elHC fundamental es la lactosa, mientras que después

HIDRATOS DE CARBONO EN LA DIETA

de la introducción de la alimentación complementa-ria, a partir del primer año de vida, los HC fundamen-tales son los polisacáridos (almidones), siguiendo enimportancia los oligosacáridos (fundamentalmente lasacarosa) y jugando un papel poco importante comocomponentes de la dieta los monosacáridos (1).

1.- Polisacáridos:

El fundamental es el almidón, ampliamente di-fundido en la naturaleza (semillas, granos de cerea-les, tubérculos, frutas y raíces). Está constituido por:

—Amilosa: cadena lineal de moléculas de glucosaunidas por enlaces alfa (l-4). Formada por 25-2.000unidades de glucosa.

—Amilopectina: moléculas de glucosa unidas porenlaces alfa (1-4) y cada 20-25 unidades de glucosapresenta enlaces alfa (1-6) formando ramificaciones.Representa aproximadamente el 80% del almidóningerido, aunque esta proporción es variable segúnsu origen.

Otros polisacáridos utilizados en alimentación in-fantil son:

El almidón modificado de maíz o tapioca que esun componente de muchas fórmulas especiales y ali-mentos infantiles, con el objeto de mejorar el apro-vechamiento y estabilidad y facilitar la suspensión denutrientes insolubles.

La dextrinomaltosa o polímeros de glucosa que seobtiene de la hidrólisis ácida o enzimática del almi-dón de maíz. Son almidones de bajo peso molecular,generalmente formados por cadenas rectas, sin ra-mificaciones. Se utilizan como aditivos hidrocarbo-nados en las fórmulas lácteas comerciales, reducien-do su carga osmótica.

2. - Trisacáridos

—Maltotriosa: formada por tres moléculas deglucosa unidas por enlaces alfa (l-4). Se encuentraen las uvas, pero fundamentalmente es un productointermedio en la hidrólisis del almidón.

—Rafinosa: formada por glucosa, fructosa y ga-lactosa. Se encuentra en las legumbres. Puede con-siderarse como metabólicamente inerte ya que aun-que puede ser parcialmente hidrolizada la mayorparte es fermentada por las bacterias en el colon.

3.- Disacáridos

—Lactosa: constituye el 7-8% de la leche huma-na y de las fórmulas lácteas comerciales, lo que re-presenta el 35-40% del total de las calorías. Es elHC fundamental en la dieta del recién nacido y dellactante pequeño.

—Sacarosa: es el único azúcar no reductor. Seencuentra en frutas, legumbres, verduras y miel.

—Maltosa: se encuentra en estado natural en algu-nas frutas, pero la mayor parte proviene de la diges-tión del almidón y de los sólidos de los jarabes de maíz.

—Isomaltosa: no existe en estado libre en la na-turaleza, sino como producto intermedio en la hidró-lisis del almidón.

—Trehalosa: únicamente se encuentra en las setas.

4.- Monosacáridos

—Glucosa: se encuentra en estado natural en lamiel y en muchas frutas, verduras y legumbres.

—Fructosa: es el segundo monosácarido en fre-cuencia en estado natural. Es más dulce, soluble ymenos cariogénica que la sacarosa. Se usa comoaditivo en muchos alimentos para lactantes.

—Galactosa: se encuentra en la leche, formandoparte de la lactosa (2) (Figura 2).

La degradación enzimática de los oligosacáridos ypolisacáridos es indispensable para su absorción.Tiene lugar en dos etapas:

—Hidrólisis de almidón por las alfa-amilasas, quetiene lugar nivel intraluminal.

Vol. 5, N.º 3, 1998 FISIOLOGIA DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

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Fig. 1: Estructura morfológica de la mucosa de intestino del-gado. Debido a la presencia de los plieges de Kerckring, vello-sidades y microvellosidades se consigue la máxima superficiede contacto entre los alimentos y los elementos funcionales dela membrana del borde en cepillo (tomado de la referencia 1).

DIGESTIÓN DE LOS HIDRATOS DECARBONO

—Hidrólisis de los oligosacáridos resultantes de lafase anterior y de los que forman parte de la dieta, quetiene lugar a nivel del epitelio del intestino delgado.

1.- Digestión intraluminal del almidón

Comienza a nivel de la boca por la acción de la al-fa-amilasa salival durante la masticación. Su acción,excepto en neonatos, es limitada por el escaso tiem-po de contacto antes de llegar al estómago donde seinactiva por el pH ácido gástrico. Por ello, la mayorparte del almidón alcanza el duodeno sin hidrolizar yallí por acción de la alfa-amilasa pancreática es don-de se lleva a cabo la casi totalidad de su digestión.también existe una importante actividad alfa-amilasa

en la leche humana. Ambas amilasas actúan comoendoamilasas que rompen los enlaces alfa (1-4) delas cadenas glucosídicas de la amilasa y la amilopec-tina que se sitúan alejados de los extremos y de lospuntos de ramificación. Por su acción se liberan:

—Maltosa y maltotriosa (representan el 70% delos HC intraluminales).

—Residuos de más alto peso molecular: dextrinaslímite (formadas por 5-10 unidades de glucosa, ra-mificadas si el sustrato es la amilopectina).

La cantidad de glucosa libre que originan es muyescasa debido a que no actúan en los extremos.

La capacidad para digerir y absorber el almidón es li-mitada en menores de 4 meses, mientras que la hidróli-sis luminal es completa en los mayores de 6 meses (2).

2.- Digestión a nivel de las oligosacaridasas de lapared intestinal

Las oligosacaridasas parietales hidrolizan tantolos disacáridos obtenidos a partir de la hidrólisis delalmidón como aquellos ingeridos como tales con ladieta.

a) Estructura y biosíntesis de las oligosacaridasas

La sacarasa-isomaltasa (SI) es un heterodímerocomplejo compuesto por dos subunidades: sacarasa eisomaltasa. Está anclada a la bicapa lipídica de la mem-brana de las microvellosidades del enterocito, de la cualforma parte (representa un 5-8% del total de las proteí-nas membranarias), a través de la subunidad isomaltasa.El segmento de anclaje se sitúa próximo al N-termino yla mayor parte de la masa proteica de la isomaltasaprotruye hacia la luz intestinal. La subunidad sacarasainteracciona con la membrana del borde en cepillo úni-camente a través de la subunidad isomaltasa (Figura 3).El complejo SI es sintetizado como un único precursora partir del N-término de la isomaltasa. Un alineamien-

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Figura 2: Principales hidratos de carbono de la dieta.

Fig. 3: Posición de la Sacarasa-Isomaltasa y de la ProSacara-sa-Isomaltasa en la membrana del borde en cepillo (tomadode la referencia 10).

to óptimo de las dos subunidades revela un alto gradode homología entre las porciones sacarasa e isomaltasa(41% de identidad de aminoácidos) indicando que seorigina por duplicación genética parcial (3). El gen codi-ficante del enzima humano se encuentra en el cromo-soma 3 (4). La SI se sintetiza en el enterocito, primero anivel del retículo endoplásmico rugoso (RER) donde seorigina una cadena polipeptídica precursora de alto pe-so molecular, que es almacenada incorporándose a lamembrana de las vesículas de dicho RER donde es gli-cosilada de forma primitiva (formas ricas en manosa). Acontinuación adquiere sus radicales complejos definiti-vos a nivel del aparato de Golgi y desde ahí es transferi-da a la membrana del borde en cepillo en las pequeñasvesículas de transporte (Figura 4) (5). Así, al final de susíntesis se encuentra anclada a la membrana y sobresa-liendo hacia la luz intestinal donde el precursor es rotopor las proteasas pancreáticas en sus dos subunidadesquedando así activado (6,7).

La Glucoamilasa, heterodímero compuesto pordos subunidades, tiene una posición similar a nivel dela membrana del enterocito. Se sintetiza como unaunica cadena polipeptídica que se rompe en sus dossubunidades por las proteasas pancreáticas. Su gencodificante se encuentra en el cromosoma 2 (4).

La Lactasa a diferencia de las anteriores estácompuesta por una única cadena polipeptídica y susdos actividades enzimáticas están asociadas en dife-rentes dominios de la misma. Su biosíntesis tambiénes en forma de un polipéptido precursor que sufre

complejos procesos de proteolisis llevados a cabopor peptidasas intrínsecas del enterocito.

b) Función digestiva, desarrollo y distribución dela actividad oligosacaridasa. Las oligosacaridasaspueden dividirse en dos grupos: alfa-glucosidasas ybeta-glucosidasas.

—Alfa-glucosidasas: Hidrolizan la sacarosa y losoligosacáridos procedentes de la hidrólisis del almi-dón. Incluyen:

-Sacarasa-Isomaltasa. Lleva a cabo el 75-80% dela actividad hidrolítica de la mucosa frente a la malta-sa (actividad maltásica), la casi totalidad de la activi-dad frente a la isomaltasa (actividad isomaltásica) y latotalidad de la actividad frente a la sacarosa (activi-dad sacarásica).

La subunidad portadora de la actividad sacarásicahidroliza también la maltosa (25-30% de la actividadmaltásica total) y la maltotriosa. La subunidad isomal-tásica hidroliza también la maltosa (50% de la activi-dad maltásica total) y la maltotriosa Ninguna de lasdos subunidades puede hidrolizar oligosacáridos line-ales de 4 unidades de glucosa o más (8). Su actividaden el momento del nacimiento tiene valores similaresal adulto. La SI es un enzima inducible por la sacaro-sa y la fructosa, tanto en el hombre como en otrasespecies (en algunos días tras introducir sacarosa ofructosa en proporción importante en una dieta quepreviamente no las contenía, se dobla su actividad.Inversamente su actividad disminuye tras eliminarlas).

-Glucoamilasa: Realiza el 20-25% de la actividadmaltásica total, una actividad isomaltásica mínima(2%) y la totalidad de actividad frente a los oligosacári-dos lineales de 4 residuos de glucosa o más, origina-dos por la amilasa pancreática. Frente a estos oligosa-cáridos se comporta como una exoamilasa, liberandouna a una las moléculas de glucosa de su extremo noreductor. Tiene mayor afinidad por los oligómeros de4-9 residuos de glucosa que por los de mayor tama-ño. Su alto nivel en el recién nacido sugiere que éstees capaz de hidrolizar polímeros de glucosa.

—Beta-Glucosidasa. Incluye:

-Lactasa: lleva a cabo la casi totalidad de la activi-dad lactásica de la mucosa. Su actividad no es indu-cida por el sustrato ni en el hombre ni en los anima-les (9). La actividad lactasa aparece durante el tercermes de la gestación, permaneciendo en niveles ba-jos hasta el sexto mes, aumentando durante el tercertrimestre y alcanzando sus valores máximos en tor-no al nacimiento.

La estructura y por lo tanto la actividad disacaridási-ca están en función del pronóstico de vida del enteroci-to y de su continua síntesis y degradación por enzimasproteolíticos (10). Mostrando el grado de diferencia-ción de los enterocitos a lo largo de la vellosidad, la ac-tividad disacaridásica es mínima o nula a nivel de lascriptas y aumenta a medida que el enterocito migra

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Fig. 4: Síntesis, glicosilación y localización de la Sacarasa-so-maltasa a nivel de la membrana del borde en cepillo (tomadode la referencia 8).

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hacia el ápex. La lactasa es el enzima de localizaciónmás apical en la vellosidad, lo que explica su mayorsusceptibilidad a las lesiones agudas de la mucosa co-mo ocurre en las gastroenteritis virales (11).

Las actividades SI y lactasa alcanzan su máximo anivel de las primeras asas yeyunales y decrecen ensentido proximal y distal, mientras que la glucoami-lasa aumenta en sentido distal alcanzando su máxi-ma actividad a nivel del íleon terminal (12).

En todo el proceso de digestión y absorción de lac-tosa, la hidrólisis por la lactasa es el factor limitante.La actividad de las alfa-glucosidasas es sin embargosiempre más alta que la capacidad de transporte delos monosacáridos constitutivos. Al término de la ac-tuación de las oligosacaridasas, los azúcares ingeridosquedan reducidos a sus monosacáridos constitutivos:glucosa, fructosa y galactosa, única forma en que lamucosa intestinal es capaz de absorber los azúcares.

1.- La GLUCOSA y la GALACTOSA son trans-portadas por un mismo sistema: proceso mediadopor un transportador, dependiente del sodio y queconsume energía. Este transportador ha sido aisladorecientemente (13), tratándose de un polipéptido de70-80 KDa.

Mediante estudios inmunohistoquímicos se ha lo-calizado a nivel de la membrana microvellositaria,desde las criptas hasta el ápice de las vellosidades.Su concentración es máxima a nivel del yeyuno (4).Presenta dos lugares de unión: uno para la glucosa yotro para el sodio, de forma que cuando el sodio sefija en su lugar de unión se produce un cambio con-formacional del transportador que aumenta su afini-dad por la glucosa, transfiriendo una molécula deglucosa y dos iones sodio al interior de la célula (14).La energía necesaria para que este transportadorfuncione adecuadamente se obtiene del gradienteelectroquímico del sodio (la concentración de sodiointracelular es de 15-30 mmol/l y la extracelular de

130-140 mmol/1, y la diferencia de potencial entreel interior y el exterior de la célula es de 30-40 mV,negativo en el interior) que favorece la entrada delmismo en la célula. La Na-K ATPasa de la membra-na basolateral del enterocito es la encargada demantener el gradiente electroquímico del sodio.

Se ha identificado a nivel de la membrana basola-teral del enterocito un sistema de transportesodio-independiente, histoquímicamente distinto delanterior, cuya actividad parece ser mayor en el fipi-ce de la vellosidad. La activación del cotransporta-dor de glucosa dependiente del sodio se ha asociadocon una disminución de las uniones intercelulares,condicionando un aumento del transporte paracelu-lar de pequeñas moléculas, pudiendo constituir éstauna ruta importante para el transporte de glucosa yotros nutrientes como oligopéptidos, tras una comi-da (15,16).

2.- El transporte de FRUCTOSA a través de lamucosa intestinal tiene lugar por difusión facilitada(precisa un transportador, pero no utiliza energía). Laadministración simultánea de glucosa o galactosa jun-to a la fructosa aumentan la absorción de ésta, lo quesugiere que utilizan un sistema de transporte relacio-nado con las disacaridasas, como si se tratara de susproductos de hidrólisis, mientras que la fructosa ad-ministrada sola no puede utilizar este sistema (17).

Una cierta parte de los HC (2-20%) ingeridos enforma de almidón alcanzan el colon sin digerir (18),al igual que ocurre con la fibra que forma parte de ladieta, constituida fundamentalmente por complejosde celulosa. Estos HC sufren un proceso de fermen-tación bacteriana, intracelular y anaerobia, quedan-do reducidos a ácidos grasos volátiles (acetato, pro-pionato y butirato) y gases (hidrógeno, anhídridocarbónico y metano). Los ácidos grasos son reabsor-bidos a nivel del colon, consiguiéndose así salvarhasta un 60-70% de la energía de los HC que lleganal colon (1) �

ABSORCIÓN DE MONOSACÁRIDOS

RESCATE COLÓNICO DE LOS HIDRATOSDE CARBONO

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El Instituto Danone y la Universidad Rey JuanCarlos han puesto en marcha la Catedra “GrandeCovián-Instituto Danone”, dedicada a Alimentación,Nutrición y Salud. La Cátedra se enmarca en unconvenio de colaboración que también contempla eldesarrollo de un título propio de la Universidad concarácter de Master en Educación Nutricional y el es-tablecimiento de un programa de becas de estudio einvestigación.

La Cátedra lleva el nombre de Grande Covián, enmemoria de una de las “grandes figuras de la histo-ria de la Nutrición en el mundo, de una gran relevan-cia científica y una calidad humana inigualable”, se-gún explicó en el acto de firma del Convenio elProfesor Manuel Serrano Ríos, Presidente del Insti-tuto Danone.

La Cátedra se asocia a la Facultad de Ciencias dela Salud, radicada en la localidad madrileña de Alcor-cón. La Universidad pondrá medios y material parael desarrollo de la Cátedra (tres años de duración co-mo mínimo), mientras que el Instituto Danone apor-tará su grupo de expertos avalados por más de cincoaños de trabajo en pos de mejorar los hábitos ali-mentarios de los ciudadanos.

Está previsto que ambas instituciones abran líneasy proyectos de investigación sobre temas de interéscomún que abarcarán medios y recursos físicos deambas instituciones. Para un mejor seguimiento delos acuerdos de colaboración se creará una comisiónmixta integrada por representates de la URJC y delInstituto Danone, encargada de coordinar las activi-dades que se deriven del desarrollo del Convenio.

El acto de la firma de Convenio tuvo lugar el pa-

sado 22 de julio, en la sede del Rectorado de la Uni-versidad Rey Juan Carlos, en Móstoles, y contó conla presencia del Sr. Guillermo Calleja, Rector de laUniversidad Rey Juan Carlos, la viuda del ProfesorGrande Covián y el Profesor Manuel Serrano Ríos,Presidente del Instituto Danone.

Durante la presentación del Convenio, GuillermoCalleja aseguró que para la Universidad era un “díagrande, porque en el Instituto Danone las cosas sehacen con ese espíritu universitario y con ese rigorcientífico que a uno le gusta encontrar siempre”.

Calleja se sintió satisfecho cuando mencionó lacreación de la Cátedra porque, según dijo: “Hare-mos esas cosas que ves que hacen las grandes uni-versidades del mundo y siempre nos quedamoscon envidia de poderlas hacer en España. Peroahora las tendremos en la Rey Juan Carlos, gra-cias al Instituto Danone”.

Guillermo Calleja aseguró que todos esperan queeste Convenio repercuta favorablemente “en la me-jor formación de los estudiantes y en el desarrollode proyectos de investigación de los que salganresultados valiosos”.

Por su parte, el Profesor Manuel Serrano Ríos,Presidente del Instituto Danone, resumió los objeti-vos del ID en “fomentar la investigación en el cam-po de la Nutrición; integrar la investigación con laeducación a nivel académico y servir de medio decomunicación entre las distintas disciplinas queconstituyen el amplio campo de la Nutrición”.

Cerró el acto la intervención de la viuda de Gran-de Covián, quien, emocionada, manifestó: “Mi ma-rido estaría muy orgulloso.”

NOTICIAS

El Instituto Danone y la Universidad Rey Juan Carloscrean una Cátedra de Alimentación, Nutrición y Salud

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La conservación de los alimentos por proce-sos fermentativos ha constituido una práctica habi-tual de procesado de los alimentos desde las épo-cas más primitivas. Inicialmente este proceso sedesarrolló de forma empírica, al observar que algu-nos alimentos durante su almacenamiento dabanlugar a nuevos productos comestibles, saludables ycon diferentes características organolépticas. Perofue a finales del siglo XIX cuando, a raíz de las in-vestigaciones de Pasteur, se descubrió que la pro-piedad de modificar las características organolépti-cas de los alimentos y de prolongar su vida útileran debidas a agentes microbianos. Actualmentese estima que el 25% de la dieta europea y el 60%de la de otros países desarrollados consiste en pro-ductos fermentados (Holzapfel, 1995). De entrelos microorganismos responsables de los procesosfermentativos, las bacterias lácticas son las más im-portantes, puesto que contribuyen a la conserva-ción de gran variedad de alimentos, entre los quedestacan ciertos productos lácteos, carnes, vegeta-les, cereales y frutas.

En los últimos años, la nueva demanda de pro-ductos de calidad, nutricionalmente sanos, menosprocesados y más naturales (libres de conservantesartificiales), ha potenciado el desarrollo de produc-tos mínimamente procesados y sin conservantesquímicos. Por estos motivos, la conservación de losalimentos por el efecto antagonista microbiano estáadquiriendo una importancia considerable en com-paración con la conservación por agentes químicos.En la actualidad el término biopreservación se em-plea para definir la prolongación de la vida útil delos alimentos y la mejora de su salubridad medianteel empleo de una microflora determinada y/o losproductos antimicrobianos que producen. En este

contexto es evidente el papel primordial que de-sempeñan las bacterias lácticas en estos fenómenosde biopreservación. De todas las sustancias antimi-crobianas sintetizadas por las bacterias lácticas, lasbacteriocinas son las más interesantes tecnológica-mente, puesto que debido a su naturaleza proteica(Tagg y col., 1976), pueden ser hidrolizadas por losjugos gástricos del estómago, por lo que su inges-tión resultará inocua para el consumidor, sin alterarla microflora intestinal normal. Además, sus carac-terísticas físico-químicas favorecen su empleo en laindustria alimentaria, porque les permiten resistirlos tratamientos térmicos y los cambios de pH quesufren muchos alimentos durante su fabricación yalmacenamiento y además su pequeño tamaño fa-vorece su difusión homogénea dentro de ellos(Piard y Desmazeaud, 1992).

Las bacteriocinas constituyen un grupo hetero-géneo de compuestos antibacterianos de naturale-za proteica que varían en su espectro de actividad,modo de acción, peso molecular, determinantesgenéticos y características bioquímicas (Klaenham-mer, 1988). Dentro de las bacterias Gram-positi-vas, la producción de bacteriocinas por las bacte-rias lácticas está muy extendida, habiéndosedescrito en microorganismos de todos los génerosde este grupo. La nisina fue la primera bacterioci-na descubierta producida por las bacterias lácticas(Rogers, 1928) y es la única cuya utilización se per-mite actualmente como agente antimicrobiano enla industria alimentaria. Hoy en día se han descritomuchas otras bacteriocinas producidas por bacte-rias lácticas (De Vuyst y Vandamme, 1994), aun-que todavía pocas de ellas se han caracterizadocompletamente.

En el Departamento de Nutrición y Bromatología IIIde la Facultad de Veterinaria de la Universidad Com-plutense de Madrid se ha procedido inicialmente al ais-lamiento e identificación de bacterias lácticas de origencárnico productoras de bacteriocinas para, posterior-

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOSDEL TRABAJO

1136-4815/98/80ALIMENTACION, NUTRICION Y SALUD ALIM. NUTRI. SALUDCopyright © 1998 INSTITUTO DANONE Vol. 5, N.º 3, pp. 80-88, 1998

Desarrollo y utilización de anticuerpos policlonalesy monoclonales frente a bacteriocinas producidaspor bacterias lácticas

A.M.ª Suárez Gea

BECARIA DE LA 1.ª CONVOCATORIA. INSTITUTO DANONE

mente, evaluar su actividad antimicrobiana frente a mi-croorganismos patógenos en los alimentos, caracteri-zando bioquímicamente las bacteriocinas más intere-santes (Sobrino y col., 1991; Sobrino y col., 1992;Rodríguez y col., 1995; Cintas y col., 1995).

En el presente trabajo se propuso la obtenciónde anticuerpos policlonales y monoclonales frentea diversas bactenocinas. Los anticuerpos genera-dos serían muy útiles en el estudio de estos com-puestos, puesto que podrían emplearse en su de-tección en los alimentos, para determinar suproducción y distribución en diversos sustratos ali-menticios, y para purificarlos en un sólo paso porcromatografía de inmunoafinidad. Para cumplir es-te objetivo general, tomamos como modelo la bac-teriocina nisina puesto que es la bacteriocina queha sido más estudiada hasta la fecha y es la únicaque se permite actualmente como conservador enla industria alimentaria, y nos planteamos los si-guientes objetivos parciales:

1) Conjugación la bacteriocina a moléculas trans-portadoras que le confirieran propiedades inmunó-genas, puesto que el pequeño tamaño de las bacte-riocinas hace que, por sí mismas, no sean capacesde desencadenar una respuesta inmune.

2) Diseñar pautas de inmunización adecuadas yevaluar la inmunogenicidad de las bacteriocinas con-jugadas produciendo anticuerpos policlonales ensuero de ratón y en líquido ascítico.

3) Desarrollar con los anticuerpos generados losmétodos inmunoenzimáticos (ELISA) más apropia-dos.

4) Producción de anticuerpos monoclonales, me-diante la fusión de linfocitos esplénicos de los rato-nes inmunizados con células de mieloma. Purifica-ción, caracterización y evaluación de los anticuerposobtenidos.

5) Determinación de la inmunoreactividad de losanticuerpos generados frente a otras bacteriocinas.

6) Detección de la nisina en los sobrenandantesde microorganismos posiblemente productores y enlos alimentos mediante las técnicas inmunoenzimáti-cas desarrolladas.

7) Utilización de los anticuerpos monoclonalesgenerados en la preparación de columnas de afini-dad, con el objeto de desarrollar un método rápido yespecífico de purificación de las bacteriocinas.

1. Preparación de los conjugados

La nisina A se conjugó a la toxina colérica (Sig-ma) (nisA-TC), a la hemocianina de Megathura

cremllata (nisA-KLH) y a la ovoalbumina (grade VII,Sigma) (nisA-OA). Los dos primeros conjugados seutilizaron como inmunógenos y el último para tapi-zar los pocillos en un inmunoensayo competitivo detipo indirecto. La conjugación de la nisina A a lastres proteínas se realizó por el método del glutaral-dehido (Avrameas y Terninck, 1969). La nisina Atambién se conjugó a la peroxidasa de rábano (Pier-ce) (nisA-HRP) por el método del periodato (Nakaney Kawoi, 1974), para realizar un inmunoensayo detipo competitivo directo.

2. Obtención de anticuerpos policlonalesen el suero de los ratones

Se emplearon ratones hembras de 6-8 semanasde edad de la estirpe BALB/c. La inmunización connisA-CT se realizó por vía intraperitoneal (i.p., n=4)y con la nisA-KLH por vía subcutánea (s.c., n=4) ei.p. (n=4). Los protocolos de inmunización se reali-zaron como se detalla a continuación: los ratones in-munizados vía i.p. y s.c. con nisA-KLH recibierontres dosis de 25 µg cada una a intervalos de dos se-manas. La primera inyección consistió en 0,3 ml delconjugado en PBS/Adyuvante Completo de Freund(Difco) (1/1; v/v), mientras que en las dosis siguien-tes el Adyuvante Completo se sustituyó por el In-completo. Los ratones inmunizados con el conjuga-do nisA-TC recibieron dosis de 10 µg vehiculadas en0,2 ml de PBS en los días 0, 10, 16 y 38. Despuésde la segunda y sucesivas inyecciones, se realizaronsangrías parciales para obtener el suero y evaluar lainmunización de los ratones.

3. Obtención de anticuerpos policlonalesen el líquido ascítico de los ratones

Para obtener una mayor cantidad de anticuerpospoliclonales, se indujo su producción en el líquidoascítico (Kurpisz y col., 1988) de ratones nuevamen-te inmunizados. Un grupo de ratones (n=4) se inmu-nizó con el conjugado nisA-KLH y los AdyuvantesCompleto e Incompleto de Freund y otro grupo(n=5) se inmunizó con el conjugado sin Adyuvantes.Los animales se inocularon por vía i.p. con 25 µgdel inmunógeno en 0,3 ml de vehículo; la pauta deinmunización fue la siguiente: en los días 0 y 14, losratones recibieron dosis de inmunógeno y en los dí-as 3 y 17, les fueron inyectados por vía i.p. 0,3 mlde “Pristane” (Sigma). En el día 21 se realizó unasangría parcial para evaluar el curso de la inmuniza-ción y en el día 28, los animales recibieron una últi-ma dosis del inmunógeno. En el día 31, los ratonesrecibieron por vía i.p. 6 x 106 células de mieloma dela estirpe P3X63-Ag.653 (línea no secretora) y apartir del día 44 se obtuvo el líquido ascítico, purifi-cando los anticuerpos presentes en el mismo, me-diante su precipitación con sulfato amónico al 50%(Hebert y col., 1973).

MATERIAL Y MÉTODOS

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4. Obtención de anticuerpos monoclonales

Para la obtención de anticuerpos monoclonales,la inmunización de los ratones se realizó adminis-trando por vía subcutánea cuatro dosis de 25 µg denisA-KLH a intervalos de 2 semanas, la pauta de in-munización fue similar a la descrita para la obten-ción de los anticuerpos policlonales.

Cuatro días antes de la fusión, los ratones quepresentaban la mejor respuesta inmunológica reci-bieron la última dosis del inmunógeno.

Los linfocitos esplénicos del animal seleccionadose fusionaron con células de mieloma de ratón de lalínea no secretora P3X63-Ag8.653 en una propor-ción de 7,5:1, empleando polietilenglicol comoagente fusógeno (Galfre y Milstein, 1983). A conti-nuación, las células fusionadas se resuspendieron enun medio adecuado y la suspensión celular se distri-buyó en placas de cultivo de 96 pocillos (125 µ/l po-cillo) que se incubaron a 37°C y 5% de CO2 en unaatmósfera saturada de humedad. La selección de loshibridomas se realizó con aminopterina (Koeler yMilstein, 1975). La presencia de los anticuerpos an-ti-nisina en los sobrenadantes de los hibridomas, seevaluó mediante un ELISA-CD tipo II (ver más aba-jo). Los hibridomas productores de los mejores anti-cuerpos se clonaron por el método de la dilución lí-mite a una concentración de 0,5 a 1 célula/pocillo(Goding, 1980). Los clones positivos fueron de nue-vo expandidos e isotipados y se conservaron en sue-ro fetal bovinodimetilsulfóxido (9:1) en nitrógeno lí-quido y a -80°C.

La producción masiva de anticuerpos monoclona-les se realizó bien in vitro por expansión de los clo-nes productores seleccionados en medio completo oin vivo en el líquido ascítico de ratones BALB/c,previamente sensibilizados con Pristane, a los que seinocularon por la misma vía 1 x 107 células de unclon determinado. En ambos casos, los anticuerposse purificaron y concentraron mediante su precipita-ción con sulfato amónico al 50% (Hebert y col.,1973).

5. Ensayos inmunoenzimáticos desarrollados

ELISA Indirecto: Este tipo de inmunoensayo seempleó para titular los sueros de los ratones inmu-nizados. La técnica se basa en que los antígenos fi-jados a una superficie inerte son reconocidos porlos correspondientes anticuerpos específicos y elcomplejo formado se detecta por un segundo anti-cuerpo marcado con un enzima, que reconoce co-mo antígenos a los anticuerpos específicos. La re-acción se pone de manifiesto al actuar el enzimasobre el sustrato, dando lugar a un compuesto colo-reado.

ELISA competitivo: Para determinar la especifi-cidad de los anticuerpos frente a la nisina A, se em-plearon dos inmunoensayos de tipo competitivo,uno indirecto (ELISA-CI) y otro directo (ELISACD):

En el ELISA-CI se fija una concentración conoci-da de antígeno a una superficie inerte y a continua-ción se añaden simultáneamente el anticuerpo espe-cífico y la muestra problema (de concentraciónantigénica desconocida), que competirá con el antí-geno inmovilizado por la unión al anticuerpo. A con-tinuación, se añade un anticuerpo antiespecie co-mercial marcado con un enzima. El ensayo secuantifica por la concentración de conjugado comer-cial que se une al complejo anticuerpoantígeno ad-sorbido. Cuanto mayor sea la concentración de antí-geno presente en la muestra, menor será elanticuerpo que queda unido a la placa y, por tanto,menor será el color generado.

En el ELISA-CD se fija una concentración cono-cida de anticuerpo específico a una superficie inertey a continuación, se añaden simultáneamente lamuestra problema (de concentración antigénica des-conocida) y el antígeno marcado con un enzima, enuna concentración fija y conocida, produciéndose lacompetición entre ambos por la unión al anticuerpo.El ensayo se cuantifica por la concentración de antí-geno conjugado que se ha unido al anticuerpo ad-sorbido. Cuanto mayor sea la concentración de antí-geno presente en la muestra, menor será elconjugado unido al anticuerpo adsorbido y por tan-to, menor será el color generado.

Este ensayo se realizó en dos modalidades, la pri-mera (tipo I), tapizando las placas directamente conlos anticuerpo anti-nisina y la segunda (tipo II) tapi-zando previamente con un anticuerpo que reconocíaa la fracción Fc de los anticuerpos de ratón. Este se-gundo método se empleó para la detección de loshibridomas productores de anticuerpos monoclona-les específicos y para los inmunoensayos posterioresrealizados con estos anticuerpos.

6. Inmuno-reactividad de los anticuerposfrente a otras bacteriocinas

A continuación, se analizó la capacidad de losanticuerpos generados (policlonales y monoclona-les) para reconocer la nisina A presente en los so-brenadantes de microorganismos productores;también se evaluó el comportamiento de la nisinaZ, una variante natural de la nisina A, purificada yen el sobrenadante de un cultivo productor. Por úl-timo, se evaluó la reactividad de los anticuerposfrente a los sobrenadantes de microorganismosproductores de otras bacteriocinas. En el caso delos anticuerpos policlonales, los sobrenadantes seanalizaron empleando un ELISA-CD tipo I, mien-tras con los monoclonales se empleó el ELISA CDtipo II.

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7. Aplicaciones de los anticuerpos anti-nisinadesarrollados

7.1. Evaluación del crecimiento de L. Iachs BB24y seguimiento de la producción de nisina em-pleando los anticuerpos policlonales producidosen líquido ascítico

A partir de un cultivo de L lactis BB24, desarrolla-do en caldo MRS durante 16 horas a 32°C se sem-braron aproximadamente 1 x 105 ufc/ml en una ba-tería de tubos que contenían 10 ml de caldo MRS,incubandolos a 32°C, durante tres días. Cada 2 ho-ras se tomaron dos de los tubos para determinar porduplicado el crecimiento del cultivo mediante el re-cuento de las unidades formadoras de colonias(ufc/ml), mientras la cantidad de nisina de los sobre-nadantes de los distintos tubos se determinó trasajustar su pH a 6,2 y esterilizarlos por filtración, me-diante el test de difusión en agar (Tramer y Fowler,1964) y por un ELISA competitivo directo tipo I,empleando los anticuerpos policlonales obtenidosen el líquido ascítico de los ratones inmunizados.

7.2. Detección y cuantificación de nisina en losalimentos: detección de la nisina A en queso deuntar empleando los anticuerpos monoclonales

Para evaluar la capacidad de los anticuerpos mo-noclonales obtenidos de detectar la nisina en los ali-mentos, se realizaron diversas experiencias añadien-do nisina A pura a un queso de untar comercial librede nisina. A muestras de 2,5 g de este queso se lesañadió nisina a diferentes concentraciones (0, 250,1.250 y 5.000 ng/g) y se procedió a su extracciónsiguiendo el método de Fowler et al. (1975). La de-terminación de la nisina extraída de las muestras dequeso se realizó mediante un ELISA competitivo di-recto tipo II, empleando para ello los anticuerposmonoclonales producidos por el hibridoma AD10.Con el fin de calcular el coeficiente de variacióninter- e intraensayo, el proceso de extracción se re-pitió durante tres días distintos y cada día se prepa-raron y se extrajeron triplicados de cada concentra-ción.

7.3 . Purificación de la nisina por cromatorafía deinmunoafinidad

Los anticuerpos monoclonales obtenidos frente ala nisina A también se emplearon para elaborar unacolumna de inmunoafinidad que permitiera la purifi-cación de esta bacteriocina en un Sólo paso, a partirde los sobrenadantes de los cultivos productores. Pa-ra ello, 10 mg de los anticuerpos monoclonales puri-ficados del hibridoma AD10 se conjugaron a una co-lumna HiTrap NHS-activated (Pharmacia) de 1 mlde tamaño, según las instrucciones recomendadaspor el fabricante.

Inicialmente, se comprobó la eficacia de la colum-na de afinidad inyectando alícuotas de 1 ml con con-centraciones conocidas de la nisina pura en PBS (0,

1.000 y 10.000 ng/ml) y evaluando su retención. Acontinuación, se procedió a la purificación directade la bacteriocina a partir del sobrenadante de unmicroorganismo productor. Para ello, la cepa de L.Iactis BB24 se desarrolló durante 16 h a 32°C, traslo cual se obtuvo el sobrenadante libre de células porcentrifugación del cultivo a 10.000 rpm durante 10min. a 4°C. Posteriormente el pH del sobrenadantese ajustó a 7,4 con NaOH lN y se esterilizó por fil-tración. Dos muestras de 10 ml de este sobrenadan-te se pasaron por la columna de inmunoafinidad endos días distintos a un flujo de 0,5 ml/min. Se lavóla columna con 25 ml de PBS y se eluyó la nisinacon 20 ml del tampón de elución (glicina-HCl 0,05M, NaCl 0,5 M, pH 2,7). Las fracciones de los dis-tintos estadíos de purificación se recogieron en alí-cuotas de 1 ml, determinando su absorbancia a 280,254 y 220 nm. La presencia y cuantificación de laactividad inhibidora de las fracciones se realizó me-diante un ensayo en placas microtituladoras (Rodrí-guez et al., 1995), empleando como indicador a Pe-diococcus acidilactici 347 y se cuantificó la nisinapresente mediante un ELISA competitivo directo ti-po II, tras ajustar el pH de las muestras a 7,4 conNaOH 1 N

La pureza de la nisina obtenida por cromatografíade inmunoafinidad, se comprobó en una columnaPepRPC HR 5/5 C2/Clg de fase reversa integradaen un sistema FPLC (Pharmacia). Tras la fase de la-vado, la nisina se eluyó empleando un gradiente li-neal de 10 a 60% de 0,1% TFA en 2propanol, a unflujo de 1 mVmin. Como controles internos se pasa-ron también por la columna el tampón de elución(glicina-HCl) y una muestra con una cantidad equiva-lente de nisina pura (NBS biologicals) en el tampónde glicina-HCl.

1. Producción de anticuerpos policlonalesen el suero de los ratones inmunizados

A los 15 días de iniciar la inmunización, los títulosde anticuerpos de los ratones inmunizados con nisA-TC estaban comprendidos entre 1.600 y 3.200. Es-tos valores aumentaron ligeramente, hasta 6.400,en las siguientes inmunizaciones. La presencia deanticuerpos específicos anti-nisina A en el inmuno-suero de los ratones, se puso de manifiesto con unELISA-CI, aunque su afinidad relativa fue baja. Coneste ensayo se detectó la nisina A a concentracionescomprendidas entre 1 y 5 µg/ml, mientras que lacantidad de nisina libre requerida para inhibir en un50% la unión al anticuerpo superó los 40 llg/ml. Lasensibilidad del ensayo no mejoró cuando los inmu-nosueros se analizaron en un ELISA-CD.

Después de administrarles dos dosis de inmunó-geno (21 días después de iniciarse el proceso de in-

RESULTADOS

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munización), los ratones inmunizados con nisA-KLHmostraron títulos de anticuerpos de 3.200 a 6.400,que aumentaron hasta 12.800-25.600 al inyectarlesuna dosis más del inmunógeno. El título de los ani-males inmunizados por vía i.p. fue superior al de losinmunizados por vía s.c. Cuando los inmunosuerosde ambos grupos de animales se analizaron median-te el ELISA-CI, no pudo demostrarse la presencia deanticuerpos específicos frente a la nisina A. Sin em-bargo, cuando los sueros se analizaron en un ELISA-CD, se puso de manifiesto la existencia de anticuer-pos específicos frente a la nisina A de una altaafinidad relativa. El límite de detección de este ensa-yo fue de 0,1 µg nisina/ml y la cantidad de nisina Alibre necesaria para inhibir en un 50% la unión alanticuerpo osciló entre 0,5 y 5 µg/ml. La sensibili-dad de este inmunoensayo llegó a 0,01 µg nisina/mlal emplear la nisina A vehiculada en el medio de cul-tivo MRS. La figura 1 muestra la detección de nisinaA vehiculada en PBS y en MRS, así como la de la ni-sina presente en el preparado comercial de Nisa-plin® (Aplin & Barret), empleando el suero de unode los ratones inmunizado con el conjugado nisA-KLH por vía s.c.

2. Producción de anticuerpos policlonales enel líquido ascítico de los ratones inmunizados

En el grupo de ratones inmunizados con nisA-KLH sin adyuvantes, se alcanzaron títulos de anti-

cuerpos comprendidos entre 6.400 y 12.800, perola presencia de anticuerpos específicos frente a la ni-sina A fue casi insignificante tanto en el suero comoen el líquido ascítico de los animales inmunizados.

Los animales que se inmunizaron con nisA-KLH ylos Adyuvantes Completo e Incompleto de Freund,desarrollaron anticuerpos específicos séricos (con títu-los entre 12.800 y 25.600 al final de la inmunización)y también en el líquido ascítico. El limite de detecciónde los anticuerpos purificados por precipitación consulfato amónico en un ELISA-CD fue 0,05 µg nisi-na/ml, mientras que la cantidad de nisina libre nece-saria para inhibir en un 50% la unión al anticuerpo,fue de 0,5 a 2,5 µg/ml.

3. Obtención de anticuerpos monoclonales

Todos los animales inmunizados desarrollaron an-ticuerpos específicos frente a la nisina A, procedien-do a la realización de dos fusiones con dos de losanimales que mejor título y especificidad de sueromostraban. En ambos casos, de los hibridomas obte-nidos durante la fusión, sólo se consiguió uno queproducía anticuerpos específicos frente a la nisina A(hibridomas 5G8 y 2D10, respectivamente).

El hibridoma 2D10, obtenido en la segunda fusiónse expandió y clonó con éxito, tras lo cual se selec-cionaron seis clones (AD10, BF2, BF6, AB2, AD8 yBF10) para proceder a su caracterización y análisisde su afinidad e inmunorreactividad frente a otrasbacteriocinas. Al isotipar los anticuerpos producidospor los seis clones seleccionados, así como los produ-cidos por el hibridoma 5G8, se observó que en todoslos casos se trataba de inmunoglobulinas del tipoIgG1. El limite de detección empleando el ELISA CDtipo II fue de 10 ng/ml en los mejores clones y lacantidad de nisina A libre necesaria para inhibir enun 50% la unión al anticuerpo varió entre los 900 a1.450 ng/ml. En el caso de la nisina Z, se necesita-ron de 3.000 a 5.100 ng/ml de compuesto paraconseguir el mismo efecto inhibidor, este hecho hacesospechar que el aminoácido de la posición 27, quees la única diferencia existente entre la nisina A y laZ, probablemente forma parte del epítope que reco-nocen estos anticuerpos monoclonales.

4. Inmunoreactividad de los anticuerposgenerados frente a otras bacteriocinas

Tanto los sobrenadantes de los distintos microorga-nismos productores de nisina A, como el del microor-ganismo productor de nisina Z, fueron reconocidospor los anticuerpos policlonales y monoclonales. Seobsevaron ligeras variaciones en el reconocimiento deestas cepas, debidas a la distinta producción nisina decada cepa. Los anticuerpos no reaccionaron con elsobrenadante de la cepa de L lacis no productora de

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100

80

60

40

20

01 2 3 4 5

log nisina A (ng/ml)

%In

hibici

ón

Fig. 1. Detección de la nisina A en PBS (•) y en caldo MRS (•)y en el preparado comercial Nisaplin® (∆) mediante un ELI-SA-CD realizado con el suero de uno de los animales inmuni-zado con el conjugado nisA-KLH vía s.c. Cada punto de la grá-fica representa en valor medio de las determinacionesrealizadas por triplicado en una sola pieza de ensayo.

nisina ni con los de otras cepas productoras de otrasbacteriocinas.

5. Aplicaciones de los anticuerpos anti-nisinadesarrollados

5.1. Evaluación del crecimiento de L. lacis BB24 yseguimiento de la producción de nisina emplean-do los anticuerpos policlonales producidos en ellíquido ascítico

Como se observa en la figura 2, a las 6 horas decrecimiento ya se detectaron niveles significativos denisina A con el método inmunoenzimático (ELISA)desarrollado, mientras que con el ensayo microbio-lógico se comenzaron a detectar a las 8 horas. Laproducción máxima de nisina se detectó entre las 14y las 18 horas, coincidiendo con el comienzo de lafase estacionaria. A partir de este momento la canti-dad de nisina producida disminuyó.

5,2. Detección y cuantificación de nisina en losalimentos: detección de la nisina A en queso deuntar empleando los anticuerpos monoclonales

La recuperación de nisina de las muestras de que-so, a las que se les añadió nisina A pura se muestra enla tabla I. La recuperación se estimó por un ELISA-CD al extrapolar los valores obtenidos en las muestrasen una curva patrón realizada añadiendo nisina A pu-ra a un extracto de queso libre de nisina. Los valoresmedios de recuperación fueron de 130, 120 y 98%respectivamente para las concentraciones de 250,1.250 y 5.000 ng/g. La recuperación media fue del116%, con coeficientes de variación intra- e interen-sayo de 13,3 y 14,1%, respectivamente (Tabla I).

5.3. Purificación de la nisina A por cromatografíade inmunoafinidad

Como se observa de los datos de la tabla II y en lafigura 3, la mayor parte de la bacteriocina (85,28%)se retuvo en la columna de afinidad y se recuperódurante la elución final. La nisina purificada mostróun incrementó de 10 veces su actividad específicarespecto del sobrenandante inicial. Al comprobarmediante FPLC la pureza de la nisina obtenida, seobservó un pico de absorbancia al 3% de isopropa-nol que coincidió tanto en posición como en tamañocon el pico producido por la nisina pura utilizada co-mo control.

Los métodos analiticos más empleados en la de-tección y cuantificación de las bacteriocinas se basanen la estimación de su actividad inhibidora frente aun microorganismo indicador (Tramer y Fowler,1964; Mørvedt y Nes, 1990). Aunque estas técnicashan sido de gran utilidad, presentan ciertos inconve-nientes como los de su inespecificidad, sensibilidadrelativamente pequeña y la subjetividad de su inter-pretación.

Desde el inicio de la década de los años 70 lastécnicas inmunológicas (inmunoenzimáticas princi-palmente), han experimentando un gran auge comoherramientas analíticas y actualmente, son la meto-dologia de elección en numerosos campos de laciencia. Cuando se dispone de un anticuerpo de cali-dad, los métodos inmunológicos son altamente es-pecíficos y muy sensibles. Además, son fáciles de

DISCUSIÓN

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Fig. 2. Curva de crecimiento de Lactococcus lactis BB24 en caldo MRS y producción de nisina A detectada por testde difusión en agar (♦) y por un ELISA-CD (•), empleando los anticuerpos policlonales obtenidos en líquido ascítico.UFC: unidades formadoras de colonias (•).

10

9

8

7

6

5

Log

UFC/

ml

Log

nisina

A(n

g/m

l)

0 12 24 36 48 60 72

Tiempo (h)

Activ

idad

antim

icrob

iana

(mm

2 )

4

3

2

1

0

100

75

50

25

0

ejecutar, permiten el análisis de numerosas muestrasen un breve espacio de tiempo y pueden automati-zarse, reduciendo la subjetividad. Sorprendentemen-te, el impacto de las técnicas inmunológicas en ladetección y cuantificación de las bacteriocinas ha si-do hasta el momento marginal. La bibliografía rela-cionada con este tema es escasa y los resultados ob-tenidos poco satisfactorios (Falahee and Adams1992; Falahee y col., 1990; Bhunia, 1994). Las ra-zones pueden ser múltiples, destacando, el pequeñotamaño molecular de estos compuestos (lo que lesconvierte en pobres inmunógenos), su peculiar es-tructura, así como su limitada disponibilidad. En estetrabajo, se describe un método de conjugación y deinmunización eficaz para obtener anticuerpos frentea las bacteriocinas, tomando como modelo a la nisi-na A. Con este sistema hemos sido capaces de ge-nerar, no sólo anticuerpos policlonales en el suerode ratones y en el líquido ascítico sino también anti-cuerpos monoclonales, lo que nos permite disponerde una fuente ilimitada de anticuerpos de gran ho-mogenenidad debido a su naturaleza clonal.

El método inmunoenzimático (ELISA-CD) desa-rrollado en este trabajo, constituye un método rápi-do, sensible y útil para detectar la nisina en alimen-tos, con un límite de detección de 10 ng/ml.Actualmente, la nisina se emplea en muchos paísescon unos niveles máximos que varían de 2 a 100mg/kg, hasta la no existencia de límites en algunospaíses. Se ha demostrado, además, que estos anti-cuerpos identifican los microorganismos producto-res de nisina, sin que existan posibles reaccionescruzadas con los microorganismos productores deotras bacteriocinas. Por ello, otras posibles aplica-ciones de los anticuerpos desarrollados serían suempleo para identificar rápidamente bacterias lácti-cas productoras de nisina y como herramientas en elestudio de la regulación, del mecanismo de acción yde la modificación genética de los microorganismosproductores de este lantibiótico.

Actualmente existe un gran interés en desarrollarmétodos rápidos y sencillos de purificación de lasbacteriocinas. El método aquí descrito es el primero

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TABLA I

RECUPERACIÓN DE LA NISINA A PARTIR DE MUESTRAS DE QUESO, DETERMINADA POR UN ELISA-CD

Nisina añadida % medio de(ng/g) muestraa recuperación (ng/g)b % recuperación recuperaciónc CVd CV

interensayoe

250 A 266 ± 43 106 16,2250 B 341 ± 39 137 130 11,5 13,5250 C 370 ± 113 148 30,4

1.250 A 1.274 ± 43 102 3,41.250 B 1.697 ± 36 136 120 2,2 11,61.250 C 1.528 ± 178 122 11,65.000 A 4.294 ± 548 86 12,85.000 B 6.096 ± 1.166 122 98 19,1 17,15.000 C 4.331 ± 565 87 13,0

aCada concentración se preparó por triplicado cada uno de los días (A-C) del ensayo. bRecuperación media de los triplicados de cada día.cMedia del porcentaje de recuperación de los tres días para cada concentración. dCoeficiente de variación intraensayo. eCoeficiente de va-riación interensayo para cada concentración.

TABLA II

PURIFICACIÓN DE LA NISINA POR CROMATOGRAFÍA DE INMUNOAFINIDAD A PARTIR DEL SOBRENADANTEDE UN CULTIVO DE LACTOCOCCUS LACTIS BB24a

Incremento de laFracción Volumen A220 Totalb Actividad totalc Actividad actividad Nisina totalf Rendimiento

(ml) (BU) específicad específicae (ng) (%)

Muestras (sobrenadante) 10 12,52 ± 0,12 12.228 ± 1.487 975 ± 109 1 39.152 ± 7.212 100Inyección 10 12,31 ± 0,06 846 ± 249 68,86 ± 21 0,072 ± 0,028 9.799 ± 2.137 24,87 ± 0,87Lavado 25 7,67 ± 2,18 740 ± 185 97,52 ± 4 0,10 ± 0,008 4.769 ± 580 12,88 ± 3,85Elución 20 0,69 ± 0,04 6.913 ± 1.209 9.974 ± 1.212 10,21 ± 0,095 32.475 ± 1.214 85,28 ± 12,5a Todos los datos son la media de los valores obtenidos en dos purificaciones distintas. bA220 total es la absorbancia a 220 nm multiplicadapor el volumen en mililitros. cLa actividad antimicrobiana total (UB), determinada por un ensayo de inhibición en placas microtituladoras, esel recíproco de la dilución que inhibe en un 50% el crecimiento de P.acidilactici 347, multiplicado por el volumen en mililitros. dLa activi-dad antimicrobiana específica es la actividad antimicrobiana total (UB) dividida por la A220 total. eEl incremento en la actividad específica esla actividad antimicrobiana específica de cada fracción dividida por la del sobrenadante. fDeterminada por un ELISA-CD, empleando losanticuerpos monoclonales del hibridoma AD10. Cada valor se analizó por triplicado.

hasta la fecha que emplea un sistema de cromato-grafía de inmunoafinidad. Este sistema es capaz depurificar la nisina a partir de medios complejos co-mo los empleados en el cultivo de estos microorga-nismos, de exigentes requerimientos nutricionales,sin que se produzca la adsorción inespecífica deotros compuestos no deseados. El procedimiento essimple, rápido, muy específico, reproducible, econó-mico y permite la purificación de esta bacteriocinaen un solo paso. Estas características pueden permi-tir un desarrollo a mayor escala del sistema con el finde obtener la bacteriocina en las grandes cantidadesrequeridas para su utilización en los alimentos y co-mo agente terapéutico. La posible disponibilidad depreparaciones de nisina muy puras y la potenciaciónde su actividad con compuestos quelantes hace posi-ble el desarrollo de un nuevo campo de aplicaciónde este compuesto como agente terapéutico en lostratamientos de úlceras pépticas, infecciones der-matológicas, control de la mamitis en el ganado, in-fecciones bucales, así como en el tratamiento demúltiples infecciones sistémicas resistentes a los an-tibióticos convencionales.

Es evidente el valor de los anticuerpos específicosobtenidos frente a la nisina A, así como el de los in-munoensayos desarrollados. En primer lugar, pue-den utilizarse en la detección rápida, eficaz y sensi-

ble de la presencia de nisina en los cultivos microbia-nos y sustratos alimentarios de interés. Sirven asi-mismo para identificar los microorganismos produc-tores y para estudiar la regulación y el mecanismode acción de su producción. Otra aplicación de granimportancia es el empleo de los anticuerpos anti-ni-sina A en la preparación de columnas de inmunoafi-nidad, con el objeto de purificar dicho compuesto deforma rápida y eficaz, en contraste con la metodolo-gía actual de gran laboriosidad y pequeños rendi-mientos.

Los anticuerpos generados con los procedimien-tos de conjugación e inmunización descritos en estamemoria, así como los inmunoensayos desarrolla-dos serán, sin duda alguna, de gran utilidad no sóloen la detección y cuantificación de la nisina A, sinotambién de otras bacteriocinas, dado que la metodo-logía desarrollada puede emplearse como modelo enla obtención de anticuerpos frente a otras bacterioci-nas y compuestos análogos.

El trabajo descrito ha sido posible gracias a laconcesión de una beca del Instituto Danone a AnaM. Suárez Gea, así como a la financiación proce-dente de la Comisión Interministerial de Ciencia yTecnología (Proyecto ALI94-1026) y de la Comuni-dad Europea (Contract BI02-CT94-3055) �

AGRADECIMIENTOS

CONCLUSIÓN

Vol. 5, N.º 3, 1998 DESARROLLO Y UTILIZACION DE ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES

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Fig. 3. Purificación de la nisina A por cromotografía de inmunoafinidad, a partir del sobrenadante de un cultivo de L. lactis BB24.Nisina A (ng/ml) determinada por un ELISA-CD, empleando los anticuerpos monoclonales del hibridoma AD10. Actividad inhibido-ra (BU) determinada por el ensayo de inhibición en placas microtituladoras.

A.M. SUAREZ ALIM. NUTRI. SALUD

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