Recombination, pseudorecombination Recombination, pseudorecombination and synergism of geminiviruses are and synergism of geminiviruses are determinant keys to the epidemic of determinant keys to the epidemic of

severe cassava mosaic disease in severe cassava mosaic disease in UgandaUganda

J.S. Pita, V.N.Fondong, A.Sangaré, W.Otim-Nape, J.S. Pita, V.N.Fondong, A.Sangaré, W.Otim-Nape, S.Ogwal and C.M.FauquetS.Ogwal and C.M.Fauquet

Journal of General Virology, 2001Journal of General Virology, 2001

Mosaïque du manioc (CMD)Mosaïque du manioc (CMD)

Principale maladie causant des pertes importantesPrincipale maladie causant des pertes importantes Répartition géographique:Répartition géographique: Afrique et Inde Symptomatologie : malformations, distorsions du

limbe, couleur jaunâtre Transmission : dissémination des boutures, mouche

blanche Moyens de lutte : sélection de boutures saines,

insecticide

Bemisia tabaci

Mosaïque du manioc (CMD)Mosaïque du manioc (CMD)

Agent causal : virus émergeant des plantes geminivirus• 4 virus: ACMV(African Cassava mosaic Virus) EACMV/ICMV/SACMV

Virus à ADN circulaire simple brin non enveloppé bipartite, Virus à ADN circulaire simple brin non enveloppé bipartite, encapsidéencapsidé

2 segments A et B possédant une région commune CR à 2 segments A et B possédant une région commune CR à forte homologie:forte homologie:• A = P réplication et encapsidation viralA = P réplication et encapsidation viral• B = 2P jouant un rôle dans la dissémination du virus à B = 2P jouant un rôle dans la dissémination du virus à

travers la plantetravers la plante

Mosaïque du manioc (CMD)Mosaïque du manioc (CMD)

Épidémiologie :Épidémiologie :• 1928 = 1 ère apparition de la CMD en Uganda• 1933-1944 = sévères épidémies contrôlées• 1988 = épidémie sévère progressant rapidement du

nord vers le sud => faminesEtude pcdte =>Corrélation entre la présence du nv virus

recombinant ACMV+EACMV et la sévérité de l’épidémie

Objectif de l’étudeObjectif de l’étude

Meilleur compréhension des dynamiques de l’épidémieMeilleur compréhension des dynamiques de l’épidémie A partir de l’observation des plantes récoltées ainsi que A partir de l’observation des plantes récoltées ainsi que

celles obtenues en serres et des résultats de PCR et de celles obtenues en serres et des résultats de PCR et de southern blotsouthern blot

Recueil d’échantillonsRecueil d’échantillons

80 sites (sud ouest, centre et nord), 183 80 sites (sud ouest, centre et nord), 183 prélèvements avec symptômes sévères (90%) et prélèvements avec symptômes sévères (90%) et béninsbénins

9 cultivars9 cultivars Mouches blanchesMouches blanches

1/Reproduction des symptômes 1/Reproduction des symptômes dans un environnement contrôlédans un environnement contrôlé

70.5% de succès70.5% de succès L’échec de la culture n’est pas lié à la sévérité des L’échec de la culture n’est pas lié à la sévérité des

symptômessymptômes Seules les boutures développant les mêmes symptômes Seules les boutures développant les mêmes symptômes

dans les 2 conditions de cultures sont conservées pour dans les 2 conditions de cultures sont conservées pour l’étude après 70 jl’étude après 70 j

Les symptômesLes symptômes ≠ ≠ de sensibilité selon de sensibilité selon

les cultivars : 8 à 32% les cultivars : 8 à 32% de mortde mort

léger

Sévère

2/Caractérisation moléculaire des 2/Caractérisation moléculaire des geminivirus par PCRgeminivirus par PCR

Utilisation de primers Utilisation de primers permettant d’amplifier le permettant d’amplifier le gène codant pour CPgène codant pour CP

Nv geminivirus EACMV-Nv geminivirus EACMV-UG3UG3

Pas d’infection par ICMV et Pas d’infection par ICMV et SACMV en UgandaSACMV en Uganda

48%

28%

7%

8%9%

EACMV-UG2

ACMV-UG

les 2

les 2+ EACMV-UG1

EACMV-UG3

3/Relation entre CMV, sévérité des 3/Relation entre CMV, sévérité des symptômes et accumulation d’ADNsymptômes et accumulation d’ADN

Relation CMV/sévérité des Relation CMV/sévérité des symptômessymptômes• Action synergique entre les 2 Action synergique entre les 2

espèces de virusespèces de virus• Sélection du cultivar Sélection du cultivar

Ebwanatereka pour la suite Ebwanatereka pour la suite de l’étudede l’étude

Reproduction des symptômes Reproduction des symptômes chez chez N.benthamianaN.benthamiana • Extraction de sève puis Extraction de sève puis

inoculation à inoculation à ≠ ≠ concentrations, contrôlée par concentrations, contrôlée par PCR PCR

• Selon le virus EACMV-UG2 et Selon le virus EACMV-UG2 et ACMV-UG, sévérité des ACMV-UG, sévérité des symptômes ≠ symptômes ≠

3/Relation entre CMV, sévérité des 3/Relation entre CMV, sévérité des symptômes et accumulation d’ADNsymptômes et accumulation d’ADN

Relation accumulation ADN/sévérité des symptômesRelation accumulation ADN/sévérité des symptômes Southern blotSouthern blot

Il existe une relation positive entre l’accumulation d’ADN et Il existe une relation positive entre l’accumulation d’ADN et la sévérité des symptômesla sévérité des symptômes

EACMV-UG2/Mld

ACMV-UG +EACMV-UG2 EACMV-UG2/Svr

4/Analyse des séquences d’ADN et 4/Analyse des séquences d’ADN et comparaisoncomparaison

CPCP• Séquences très prochesSéquences très proches• Tous les EACMV-UG2 possèdent le même fragment Tous les EACMV-UG2 possèdent le même fragment

recombinant provenant de ACMVrecombinant provenant de ACMV DNA-ADNA-A

• Grande homologie de Grande homologie de

Séquence pour chaque espèceSéquence pour chaque espèce

4/Analyse des séquences d’ADN et 4/Analyse des séquences d’ADN et comparaisoncomparaison

Preuve que EACMV-UG3 provient d’une recombinaisonPreuve que EACMV-UG3 provient d’une recombinaison• Séquençage de ADN-B de EACMV-UG1 et -UG3 Séquençage de ADN-B de EACMV-UG1 et -UG3

=>comparaison du % d’identité de BC1 et BV1=>comparaison du % d’identité de BC1 et BV1• ACMV et EACMV = 2 espèces distinctsACMV et EACMV = 2 espèces distincts• BV1 a la plus grande variabilité entre les 2 espècesBV1 a la plus grande variabilité entre les 2 espèces• 97% d’homologie entre EACMV-UG1 et -UG3 97% d’homologie entre EACMV-UG1 et -UG3

BC1

BV1

4/Analyse des séquences d’ADN et 4/Analyse des séquences d’ADN et comparaisoncomparaison

% identité entre les CR de A et B% identité entre les CR de A et B• 3 importants clusters EACMV, EACMV-UG3 et ACMV3 importants clusters EACMV, EACMV-UG3 et ACMV• EACMV-UG2 et EACMV-UG3 = 60% d’homologieEACMV-UG2 et EACMV-UG3 = 60% d’homologie• EACMV-UG3 provient d’une recombinaison avec une autre EACMV-UG3 provient d’une recombinaison avec une autre

espèceespèce

5/Existence de pseudorecombinaison 5/Existence de pseudorecombinaison naturelle entre les différents geminivirus naturelle entre les différents geminivirus du maniocdu manioc

Dans la collection de plantesDans la collection de plantes• PCR, primers spécifiquesPCR, primers spécifiques• JSP 017 et JSP 018 =>ACMV DNA-BJSP 017 et JSP 018 =>ACMV DNA-B

Ts les ech contenant ACMV DNA-A ou ACMV DNA-A+EACMV-Ts les ech contenant ACMV DNA-A ou ACMV DNA-A+EACMV-UG2 DNA-A possèdent aussi ACMV DNA-BUG2 DNA-A possèdent aussi ACMV DNA-B

• Primers spécifiques de EACMV-UG3 et UG1Primers spécifiques de EACMV-UG3 et UG1 Ts les ech contenant ACMV DNA-A ou ACMV DNA-A+EACMV-Ts les ech contenant ACMV DNA-A ou ACMV DNA-A+EACMV-

UG2 DNA-A possèdent aussi EACMV-UG3 DNA-BUG2 DNA-A possèdent aussi EACMV-UG3 DNA-B Dans la collection de mouchesDans la collection de mouches

• PCR, même primersPCR, même primers• Présence de ACMV et EACMV-UG2Présence de ACMV et EACMV-UG2• Présence de mélanges Présence de mélanges

=>transmission est non spécifique=>transmission est non spécifique

5/Existence de pseudorecombinaison 5/Existence de pseudorecombinaison naturelle entre les différents geminivirus naturelle entre les différents geminivirus du maniocdu manioc

Inoculation par biolistique de clones de EACMV-UG2 et Inoculation par biolistique de clones de EACMV-UG2 et EACMV-UG3EACMV-UG3• EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B présents dans les mêmes EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B présents dans les mêmes

champs malgré leur faible identité , EACMV-UG2 A pourrait champs malgré leur faible identité , EACMV-UG2 A pourrait répliquer EACMV-UG3 B ?répliquer EACMV-UG3 B ?

• Infectivité du pseudorecombinantInfectivité du pseudorecombinant Symptômes chez les plantesSymptômes chez les plantes Southern blot, PCRSouthern blot, PCR

=>Réplication =>Réplication

Il existe un phénomène Il existe un phénomène

de pseudorecombination de pseudorecombination

chez les geminiviruschez les geminivirus

6/Distribution géographique des 6/Distribution géographique des geminivirus en Ugandageminivirus en Uganda

EACMV-UG2/Svr DNA-A + EACMV-UG3 DNA-B (rouge)

EACMV-UG2/Mld (jaune)

ACMV-UG/Svr (bleu)

ACMV-UG/Mld (vert)

ACMV+EACMV (orange)

EACMV-UG1 DNA-A +EACMV-UG3 DNA-B

DiscussionDiscussion

Confirmation de la présence de ACMV, EACMV-UG1 (non-Confirmation de la présence de ACMV, EACMV-UG1 (non-recombinant) et UG2 et découverte de la présence d’un nv virus recombinant) et UG2 et découverte de la présence d’un nv virus EACMV-UG3EACMV-UG3

Les symptômes observés dans les champs peuvent être reproduits Les symptômes observés dans les champs peuvent être reproduits en chambre de culture et chez N.Benthamianaen chambre de culture et chez N.Benthamiana

Il existe une corrélation positive entre la sévérité des symptômes et Il existe une corrélation positive entre la sévérité des symptômes et l’accumulation d’ADN suggérant l’existence de souches plus ou l’accumulation d’ADN suggérant l’existence de souches plus ou moins virulente qui définissent des aires géographiques et explique moins virulente qui définissent des aires géographiques et explique comment l’épidémie s’est répanduecomment l’épidémie s’est répandue• ACMV /svr= régions montagneuseACMV /svr= régions montagneuse• ACMV/Mld = rives du lac Victoria (zone non atteinte lors de ACMV/Mld = rives du lac Victoria (zone non atteinte lors de

l’enquête)l’enquête)• EACMV-UG2/svr = partout, EACMV-UG2/Mld = pochesEACMV-UG2/svr = partout, EACMV-UG2/Mld = poches

PCR et séquençage confirment que EACMV-UG2 Mld et svr PCR et séquençage confirment que EACMV-UG2 Mld et svr possèdent le même fragment recombinant de ACMV sans pour possèdent le même fragment recombinant de ACMV sans pour autant exprimer les mêmes symptômes(mutation de la souche?)autant exprimer les mêmes symptômes(mutation de la souche?)

DiscussionDiscussion

Les zones de contact entre les 2 ppaux virus montre que les Les zones de contact entre les 2 ppaux virus montre que les infections mixtes proviennent de recombinaisoninfections mixtes proviennent de recombinaison

Il existe un phénomène de pseudorecombinaison entre EACMV-UG2 Il existe un phénomène de pseudorecombinaison entre EACMV-UG2 A et ACMV –UG BA et ACMV –UG B

L’intensité des symptômes peut être liée à une interaction L’intensité des symptômes peut être liée à une interaction synergique des 2 v ACMV et EACMV-UG2 s’expliquant par une plus synergique des 2 v ACMV et EACMV-UG2 s’expliquant par une plus grande accumulation d’ADNgrande accumulation d’ADN

EACMV-UG3 est dû à une recombinaison interespèceEACMV-UG3 est dû à une recombinaison interespèce Pseudorecombinant EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B est infectieux, Pseudorecombinant EACMV-UG2 A et EACMV-UG3 B est infectieux,

le + fqt car s ’acc ds feuilles jeunes cible préférentielle de la mouche le + fqt car s ’acc ds feuilles jeunes cible préférentielle de la mouche blanche.blanche.

=>clé de l’épidémie car pseudorecombinants se répliquent +, s’acc + =>clé de l’épidémie car pseudorecombinants se répliquent +, s’acc + et entraînent des sptm +svret entraînent des sptm +svr

Transmission préférentielle de v recombinant expliquerait l’émergence Transmission préférentielle de v recombinant expliquerait l’émergence de EACMV-UG2 et la EACMV-UG1de EACMV-UG2 et la EACMV-UG1

L’arrivée de EACMV-UG2 dans les zones où ACMV étaient L’arrivée de EACMV-UG2 dans les zones où ACMV étaient prédominant=>action synergique, dvpmt de l’épidémieprédominant=>action synergique, dvpmt de l’épidémie

Dynamiques de Dynamiques de l’épidémie en Ugandal’épidémie en Uganda

Synergisme entre ACMV et EACMV acc en ADN et Synergisme entre ACMV et EACMV acc en ADN et transmissiontransmission

Le fait que EACMV-UG2 soit recombinant expliquerait qu’il soit le + Le fait que EACMV-UG2 soit recombinant expliquerait qu’il soit le + répandu mais existence de souche moins virulentes possédant la répandu mais existence de souche moins virulentes possédant la même recombinaison, mutations?sélection de ces souches par les même recombinaison, mutations?sélection de ces souches par les agriculteurs?agriculteurs?

Existence de pseudorecombinants stables entre ADN-A et B des Existence de pseudorecombinants stables entre ADN-A et B des souches d’une même espèce ou d’une espèce différente souches d’une même espèce ou d’une espèce différente augmentation des possibilités de survie et source de biodiversitéaugmentation des possibilités de survie et source de biodiversité

Il faut pls événements pour provoquer une épidémieEtudes complémentaires pour une meilleur compréhension avec l’utilisation de clones maintenant disponibles