Journal of Computer-Aided Molecular Design Journal of Computer-Aided Molecular Design 17: 17: 673–686, 2003.673–686, 2003.© 2004 © 2004 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.

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Sampling and convergence in free energy Sampling and convergence in free energy calculations of protein-ligandcalculations of protein-ligand

interactions: The binding of triphenoxypyridine interactions: The binding of triphenoxypyridine derivatives to factor Xaderivatives to factor Xa

and trypsinand trypsin

Alessandra Villa, Ronen Zangi, Gilles Pieffet & Alan E. MarkAlessandra Villa, Ronen Zangi, Gilles Pieffet & Alan E. MarkThe Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, The Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute,

Department of Biophysical Chemistry,Department of Biophysical Chemistry,University of Groningen, Nijenborgh 4, 9747 AG Groningen, The University of Groningen, Nijenborgh 4, 9747 AG Groningen, The

NetherlandsNetherlandsReceived 21 July 2003; Accepted in revised form 26 September 2003Received 21 July 2003; Accepted in revised form 26 September 2003

Union de 10 derivados de trifenoxipiridina a dos Union de 10 derivados de trifenoxipiridina a dos serinproteasas( factor Xa y tripsina) fueron usadas serinproteasas( factor Xa y tripsina) fueron usadas para analizar factores relacionados al calculo de la para analizar factores relacionados al calculo de la energia libre basandose en dinamica molecularenergia libre basandose en dinamica molecular

Desafio del uso de estos inhibidores: calculo de Desafio del uso de estos inhibidores: calculo de energia explicita, la mutacion de un componente a energia explicita, la mutacion de un componente a otro involucra a 19 atomos, los diversos modos de otro involucra a 19 atomos, los diversos modos de union alternativosunion alternativos

► En este estudio se demostro que era posible la obtencion de En este estudio se demostro que era posible la obtencion de resultados con una alta convergencia(5 – 10 kj/mol) en un resultados con una alta convergencia(5 – 10 kj/mol) en un tiempo de nanosegundostiempo de nanosegundos

► Esto es posible usando potenciales que faciliten la creacion y Esto es posible usando potenciales que faciliten la creacion y delecion de atomos por eleccion muy cuidadosa del camino delecion de atomos por eleccion muy cuidadosa del camino de la mutacionde la mutacion

► Se demuestra que a pesar de que los recursos informaticos Se demuestra que a pesar de que los recursos informaticos estan lejanos de ser los mas adecuados los calculos de estan lejanos de ser los mas adecuados los calculos de energia explicita pueden ser exitosamente aplicados en el energia explicita pueden ser exitosamente aplicados en el disenio de drogasdisenio de drogas

► La estimacion de las diferencias en energia libre es central en el La estimacion de las diferencias en energia libre es central en el proceso de un disenio molecular factibleproceso de un disenio molecular factible

► Comportamiento de fasesComportamiento de fases► Constante de asociacionConstante de asociacion► Constante de disociacionConstante de disociacion► SolubilidadSolubilidad► Coeficiente de AdsorcionCoeficiente de Adsorcion► Equilibrio conformacionalEquilibrio conformacional

► Las diferencias entre energia libre estan relacionadas con la Las diferencias entre energia libre estan relacionadas con la probabilidad relativa de encontrar un sistema en un estado probabilidad relativa de encontrar un sistema en un estado microscopico dadomicroscopico dado

► Muchos acercamientos empiricos han sido desarrollados para estimar Muchos acercamientos empiricos han sido desarrollados para estimar la interaccion o energias libres de union entre proteinas y sus la interaccion o energias libres de union entre proteinas y sus ligandosligandos

► Pueden ayudar a diferenciar las energias libres entre dos estadios de Pueden ayudar a diferenciar las energias libres entre dos estadios de un sistema estimando los valores de estas directamenteun sistema estimando los valores de estas directamente

► Dificultad: alto costo computacional, requerimientos de una alta Dificultad: alto costo computacional, requerimientos de una alta tecnologiatecnologia

► Se evaluaron las afinidades relativas de union de los 10 inhibidores Se evaluaron las afinidades relativas de union de los 10 inhibidores de 2 serin proteasas factorXa y tripsina que compartian secuencias y de 2 serin proteasas factorXa y tripsina que compartian secuencias y homologia estructuralhomologia estructural

► Es importante que los inhibidores ha ser estudiados se unan de Es importante que los inhibidores ha ser estudiados se unan de forma altamente selectiva al factor Xa y no a otras serin proteasasforma altamente selectiva al factor Xa y no a otras serin proteasas

► Templado:Trifenoxipiridina , los inhibidores producidos difieren en el Templado:Trifenoxipiridina , los inhibidores producidos difieren en el numero y tipo de sustituyentes de dos de los tres grupos fenilnumero y tipo de sustituyentes de dos de los tres grupos fenil

► Los Inhibidores difieren significativamente entre ellos y la Los Inhibidores difieren significativamente entre ellos y la transformacion de un compuesto blanco en otro involucra la transformacion de un compuesto blanco en otro involucra la mutacion de muchos sitios que se ven en los calculos de energia mutacion de muchos sitios que se ven en los calculos de energia librelibre

► Al no existir datos experimentales, no se puede discutir cual es el Al no existir datos experimentales, no se puede discutir cual es el error absoluto en los calculos obtenidos, solo se estudia, la error absoluto en los calculos obtenidos, solo se estudia, la consistencia de los resultados obtenidos basandose en en la energia consistencia de los resultados obtenidos basandose en en la energia libre entre dos estados, mediante estos calculos se pudo hacer un libre entre dos estados, mediante estos calculos se pudo hacer un listado de los 10 inhibidoreslistado de los 10 inhibidores

METODOLOGIAMETODOLOGIA► No se tenian datos estructurales de los 10 inhibidores unidos a factor No se tenian datos estructurales de los 10 inhibidores unidos a factor

Xa, se utilizaron las estructuras cristalograficas del factor Xa con 2,6 Xa, se utilizaron las estructuras cristalograficas del factor Xa con 2,6 difeniloxypiridina y tripsina con 1QB1difeniloxypiridina y tripsina con 1QB1

► La estructura del Xa esta compuesta por dos cadenas polipeptidicas, La estructura del Xa esta compuesta por dos cadenas polipeptidicas, sin embargo solo la cadena primaria es la que contiene el sitio de sin embargo solo la cadena primaria es la que contiene el sitio de union al inhibidor por lo tanto en los calculos realizados se utilizo union al inhibidor por lo tanto en los calculos realizados se utilizo unicamente esta cadena asi se pudo minimizar el tamanio del unicamente esta cadena asi se pudo minimizar el tamanio del sistemasistema

► La estructura inicial del factor Xa y Tripsina unida al I1 fueron La estructura inicial del factor Xa y Tripsina unida al I1 fueron construidas por superimposicion de los atomos de nitrogeno del construidas por superimposicion de los atomos de nitrogeno del grupo aminometil y los atomos de nitrogeno del grupo de imidazolil grupo aminometil y los atomos de nitrogeno del grupo de imidazolil del inhibidor en los atomos correspondientes en la estructura del del inhibidor en los atomos correspondientes en la estructura del templadotemplado

► La conformacion de I1 usado para este procedimiento fue tomado La conformacion de I1 usado para este procedimiento fue tomado por la simulacion de un inhibidor aislado en aguapor la simulacion de un inhibidor aislado en agua

► Las estructuras del factor Xa y tripsina en complejo con los Las estructuras del factor Xa y tripsina en complejo con los inhibidores I2-I10 fueron derivados del I1 por mutaciones en R1 y R2 inhibidores I2-I10 fueron derivados del I1 por mutaciones en R1 y R2 durante los calculos de energia libredurante los calculos de energia libre

MutacionesMutaciones

► Los inhibidores se dividen en 2 grupos dependiendo de la naturaleza Los inhibidores se dividen en 2 grupos dependiendo de la naturaleza de sus sustituyentes inhibidores I1-I6, tienen el mismo R2 mientras de sus sustituyentes inhibidores I1-I6, tienen el mismo R2 mientras inhibidores I2 y I7-I10 tienen el mismo R1, el I2 pertenece a ambos inhibidores I2 y I7-I10 tienen el mismo R1, el I2 pertenece a ambos grupos y fue usado como referenciagrupos y fue usado como referencia

► Las mutaciones fueron esogidas con el fin de maximizar el numero Las mutaciones fueron esogidas con el fin de maximizar el numero de posibles cierres de ciclos mientras se minimizo el tamanio mismo de posibles cierres de ciclos mientras se minimizo el tamanio mismo de la mutacion( solo mutando un grupo determinado)de la mutacion( solo mutando un grupo determinado)

► El cierre de ciclo puede proveer una importante vision del grado de El cierre de ciclo puede proveer una importante vision del grado de convergenciaconvergencia

Force field

► The GROMOS96 (43a2) force field fue usado para tanto la proteina como el inhibidor cuando los parametros no estaban disponibles en un campo de fuerza standard para la determinacion de ciertas interacciones

► Los parametros fueron obtenidos por calculos ab initio

► El principal proposito en el desarrollo de parametros adicionales era mantener la compatibilidad con el resto del campo de fuerza

► Los parametros que no estaban disponibles incluian el potencial de torsion entre el anillo fenoxy y la pyridina y el potencial definido mpor el carbono aromatico y un eter oxigeno como atomos centrales fuer determinado mediante encajar un potencial empirico al potencial energetico ab initio

► La superficie del sistema de modelo termico, p-phenylpiridine. ► Las cargas atomicas fueron derivadas mediante una escala de las

cargas atomicas obtenido mediante el fitting de RHF/6-31G* por electrostatica molecular