Journal Club

Diagnóstico in vitro de microARN

con analizadores de inmunoanálisis

A. Kappel, C. Backes, Y. Huang, S. Zafari,

P. Leidinger, B. Meder, H. Schwarz,

W. Gumbrecht, E. Meese, C.F. Stähler y

A. Keller

Abril de 2015

www.clinchem.org/content/61/4/600.full

© Copyright 2015 by the American Association for Clinical Chemistry

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Descripción general

Desafío• La conversión de marcadores moleculares en herramientas

clínicamente útiles requiere la normalización y simplicidad de sus mediciones.

• Los microARN están actualmente por pasar de la investigación a la aplicación

• Para la rutina clínica, se requieren métodos de laboratorio altamente automatizados y ampliamente disponibles para medir los paneles de microARN

Inmunoanálisis de microARN• Conversión de medición de los microARN de NGS/micromatriz/RCP-

RT cuantitativa a un formato de inmunoanálisis establecido• Medición de los microARN en un sistema ya instalado y usado de

forma habitual en varios laboratorios centrales

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Introducción

• Los nuevos marcadores habitualmente requieren tecnologías nuevas para la aplicación clínica.

• Los marcadores únicos se combinan cada vez más en firmas.• Los microARN actualmente están migrando de investigación

básica a aplicación.• Con frecuencia, deben evaluarse grupos de 4-20 microARN

seleccionados.• Los sistemas de pruebas respectivas (micromatriz, RCP-RT

cuantitativa, NGS) frecuentemente no están establecidos en la atención habitual.

Un formato de análisis económico, normalizado y ampliamente disponible con capacidad de multiplexación, como el inmunoanálisis, podría promover el traslado de los microARN a la atención habitual.

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Introducción - Preguntas clave

• ¿Qué tan "integrada" debe estar una prueba respectiva? ¿De la muestra de sangre al diagnóstico en un sistema?

• ¿Qué tan rápido migrarán los sistemas complejos como la NGS a la atención habitual, si ocurre la migración?

• ¿Se realizarán las pruebas respectivas en su mayoría en el centro de asistencia o en los laboratorios centrales?

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Materiales y métodos

• Material de inicio: ARN total de 2.5 ml de muestras de sangre en PAXgene• El análisis se realiza en el analizador de inmunoanálisis Advia Centaur®• Principio del análisis (Figura 1):

• El ARN total se hibrida al oligonucleótido receptor biotinilado, lo que genera heterohíbridos de ADN/ARN

• Los heterohíbridos se unen a la fase sólida con etiquetado de estreptavidina

• El anticuerpo etiquetado con éster de acridinio se agrega a los heterohíbridos de ADN/ARN

• Detección quimioluminiscente

Figura 1. Los 4 pasos principales completamente automatizados llevados a cabo en el analizador de inmunoanálisis. AE, éster de acridinio.

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Materiales y métodos - Preguntas clave

• ¿Es aceptable el tiempo de ejecución del análisis (~1 hora)?

• ¿Es aceptable el tiempo de obtención de resultados de 3 horas?

• ¿Qué grado de multiplexación se requiere/resulta aceptable?

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Resultados

Características del análisis:• Especificidad técnica: 99.4 % (panel superior derecho)• Límite de detección: 1 pmol/l (panel inferior derecho) • Rango dinámico de 4 órdenes de magnitud• Puede medirse de forma confiable el cambio del 10 % en la concentración• La medición en serie de 8 plexaciones permite la detección de perfiles de hasta 8 microARN

Figura 2. Especificidad técnica y sensibilidad analítica.

Resultados

Prueba de concepto:• Identificación de 4 microARN de la

enfermedad de Alzheimer: miR-5010-3p, miR-26a-5p, miR-151a-3p, let-7d-3p

• ABC para la detección de la enfermedad de Alzheimer: 0.92

• 40 replicaciones de 4 miARN, muestras enriquecidas, en blanco (panel superior derecho)

• 0.8 % de valores atípicos en todas las mediciones

• Correlación con RCP-RT cuantitativa de 0.994 (panel inferior derecho)

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Resultados - Preguntas clave

• ¿Son aceptables la especificidad y sensibilidad técnicas?

• ¿Es suficiente el rango dinámico?

• ¿Cuáles son los principales obstáculos restantes para la aplicación de las pruebas respectivas en la atención clínica?

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