jorge martínez quesada - alergomurcia · mt cedar, cherry, apple, pepper pr8 chitinase latex...

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Dr Martínez QuesadaFebrero 2007

www.alergomurcia.com

Alérgenos recombinantes: disponibilidad y manejo

Jorge Martínez Quesada

Departamento de Inmunología, Microbiología y ParasitologíaFacultad de Farmacia. Universidad del País Vasco

ySweden Diagnostics Spain S.L. (a Phadia Company). Barcelona (España)



La aplicación de los métodos de biología molecular a la caracterización de las moléculas alergénicas, está permitiendo revelar la naturaleza y estructura molecular de dichas moléculas, así como la función biológica de muchas de ellas.

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Identificación de nuevos alergenos en los últimos 40 años. La línea de puntos se corresponde con el número de alergenos identificados acumulados (eje Y izquierdo). Elárea gris representa el número de alergenos identificado año a años (eje Y derecho). Datos extraídos de www.allergome.org. (A. Mari, Int Arch Allergy Immunol. 2005)

Primer recombinante



Estos nuevos datos nos permiten establecer relaciones entre diferentes componentes alergénicos estableciendo el grado de significación clínica que poseen las diferentes familias de proteínas en el fenómeno de hipersensibilidad y su manejo rutinario.

PROSITE is a database of protein familiesand domains. It consists of biologicallysignificant sites, patterns and profiles that helpto reliably identify to which known proteinfamily (if any) a new sequence belongs(www.expasy.org)

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Número de publicacines internacionales anuales que tratan al menos un aspecto básico o clínico de un alergeno definido. Datos extraídos de www.allergome.org. (A. Mari, Int Arch Allergy Immunol. 2005)



En la actualidad y relación con la alergia, cada vez se hace más evidente la transición desde los conceptos de la sistemática y la taxonomía clásicas aplicadas a los fenómenos de la hipersensibilidad (incluyendo la reactividad cruzada, la polisensibilización y el co-reconocimiento) ...

N Pasquato y cols. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of thefamily of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. J Mol Biol. 2006. 24;356:684-94.

N. Mothes y cols. Transition from a botanical to a molecular classification in tree pollenallergy: implications for diagnosis and therapy. Int Arch Allergy Immunol. 2004. 135:357-73.

R. Valenta and D. Kraft. From allergen structure to new forms of allergen-specificimmunotherapy.Curr Opin Immunol. 2002. 14: 717-727

De la taxonomía …

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SolanaceaeLycopersicum esculentim (tomate)Solanum tuberosum (patata)

Ericales ApialesOrden

Reino Viridiplantae (plantas)Phylum Tracheophyta (plantas vasculares)

Spermatophyta (con semillas)Magnoliophyta (plantas con flores)Eucotiledons

Clase Asterids

Lamiales Solanales

LecythidaceaeBertholletia excelsa (nuez del Brasil)

ActinidiaceaeActinida deliciosa (kiwi)

PedaliaceaeSesamum indicum

ApiaceaeApium graveolensFamilias




RosaceaePrunus salicina (ciruela)Prunus dulcis (almendra)Prunus armeniaca (albaricoque)Prunus avium (cereza)Prunus persica (melocoton)Malus domestica (manzana)Pyrus comunis (pera)Fragaria ananassa (fresa)Rubus urticifolius (mora)

LauraceaePersea americana (aguacate)

Rosales FagalesOrden

Reino ViridiplantaePhylum Tracheophyta

SpermatophytaMagnoliophytaEucotiledons

Clase Rosids

Fabales Laurales

FabaceaeArachis hypogea (cacahuete)Glycine (soja)Phaseolus vulgaris (judías)Pisum sativum (guisante)Lens culinaris (lenteja)Cicer arietinum (garbanzo)

FagaceaeCastaneaFagusQuercus

BetulaceaeCorylusBetula Alnus

Familias

Reino ViridiplantaePhylum Tracheophyta

SpermatophytaMagnoliophyta

Clase


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… hasta los derivados de la biología molecular (naturaleza, estructura y función de las proteínas) y sus implicaciones al diagnóstico y la terapia de dichos fenómenos.

Pru av 3. LTP; O9M5X8 Expasy.Datos epidemiológicos (IgE específica)89% pacientes de españoles11% pacientes centroeuropeos (Alemania.Suiza)

… a la clasificación molecular …



Familia de proteínas: grupo de proteínas evolutivamente relacionadas

Pathogenesis-Related Proteins

Families Conserved, stable to heat and enzymes

PR2 β1-3 glucanases Latex Hev b 2Barley, wheat, soybean, rice, mustard, cucumber

PR3 Endochitinases Latex Hev b 6.02 (N term frag)Banana, avocado, chestnut, kiwi, peach, strawberry,citrus, rice, potato, wheat, turnip

PR4 Endochitinases Latex Hev b 6.03 (C term frag)Potato, soybean, tobacco

PR5 AntifungalMt cedar, cherry, apple, pepper

PR8 Chitinase Latex hevamineCucumber

PR10 Bet v 1 homologsPR14 LTPs (Lipid transfer proteins)


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Clasificación Biológica de los principales alergenos alimentarios de origen vegetal. Nomenclature: Act c (kiwi), Ana o (anacardo), Api g (apio), Ara h (cacahuete), Ber e (nuez del Brasil), Bra r (colza), Cas a (castaña), Cor a (avellana), Cuc m (melon), Jug r (nuez), Lyc e (tomate), Mal d (manzana), Pers a (aguacate), Pru av (cereza), Prup (melocotón), Pyr c (pera), Sec c (centeno), Ses i (sesamo), Tri a (trigo). R. Asero. Int Arch Allergy Immunol. 2005.




Caso clínico

Dra. Carmen Moreno

¡ más de un 30% de la rutina diaria !El diagnóstico molecular en la rutina

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• Episodios recurrentes de rinoconjuntivitis de 6 años de evolución (abril-junio)

• Broncoespasmo de igual estacionalidad añadido en los dos últimos

• Equivalentes atópicos familiares

• Acude a consulta en noviembre 2005Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.



Exámenes complementarios:

• Hemograma, bioquímica básica, rutinario de orina: Sin hallazgos.

• Estudio espirométrico– Basal: FVC: 86 %; IT: 80 %; MMEF: 76 %– TBD: FEV1: + 13 %

Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.

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CASO 27 años.

Estandar inhalantes prick:• Acaros (D. pteronyssinus; L. destructor; T.

putrescentiae): NEGATIVO

• Hongos (Alternaria; Aspergillus): NEGATIVO

• Epitelios (Perro; Gato; Caballo): POSITIVO a gato

Dra. Carmen Moreno



Estandar pólenes prick:

PositivosPositivos NegativosNegativosPhleum ParietariaCynodon CupresusOlea PlatanusPlantagoChenopodiumArtemisia

Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.

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IgE específica a extracto completo:

Clase Clase Phleum 4 19,2Cynodon 3 10,06Olea 4 47,8Plantago 1 0,63Chenopodium 2 3,01Artemisia 1 1,5

Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.




Clase Clase KU/lKU/lPhleum 4 19,2Cynodon 3 10,06Olea 4 47,8Plantago 1 0,63Chenopodium 2 3,01Artemisia 1 1,5

Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.

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Clase Clase KU/lKU/lPhleum 4 19,2Cynodon 3 10,06Olea 4 47,8

Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.




Clase Clase KU/lKU/lPhleum 4 19,2

3 10,06Olea 4 47,8

Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.

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Juicio Diagnóstico:• Rinoconjuntivitis y asma bronquial• Hipersensibilidad mixta (pólenes y gato)Tratamiento recomendado:• Evitación gato• Estabilizadores farmacológicos y rescate• Inmunoterapia

– Olea 50 %– Gramíneas 50 %

Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.



PanalergenosPanalergenos

Profilina 18,44

Polcalcina 0,00Alergenos OleaAlergenos Olea

Ole e 1 122,62

Ole e 7 44,30

Ole e 9 20,02

Alergenos gramAlergenos gramííneasneas

Phl p 1 0,67

Phl p 5 0,13

Perfil de sensibilización en base a diagnóstico molecular

KU/l IgE

JUICIO DIAGNÓSTICO

Alergia a Olea

Dra. Carmen Moreno

CASO 27 años.

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Σi

= TAXONOMÍA + BIOQUÍMICA + INMUNOQUÍMICA + GENÓMICA+ PROTEÓMICA + INFORMÁTICA + “EL DEVENIR”….

Σii=1

i=1

n

SITUACIÓN ACTUAL =

n(donde i son datos pasados, presentes y futuros)



Atopia

genética(predisposición)

Alergia

síntomas

medio ambiente(alergenos, …)

otros…

inflamación

inflamación

predicción

prevención

perfiles

tratamiento

monitorización

Sensibilización:TC, POC, Screening, sIgE, …

Cuantificación sIgE

Diagnóstico molecular:cunatificación sIgE, TC, TAB, …Inflamación.Celular.

Diagnóstico molecular:cuantificación sIgE, TC, TAB, inflamación.,…

recProt., modProt, …

Σii=1

n

DIAGNÓSTICA

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Alergenos individualizados (nativos y/o recombinates)

Estandarización

Monitorización(desarrollo, IT)

Marcadores diagnósticos

Relaciones entremoléculas

Naturaleza y función perfiles



Dra. Mercè CorominasDr. Javier FernándezDr. Fernando FloridoDra. Paloma IbáñezDr. Félix LorenteDr. Alfonso MirandaDra. Celia MoralesDra. Cristina PascualDr. Antonio ValeroDra. Carmen VidalDr. Carlos ColásDr. Ignacio Dávila

Dra. Juana ChingaoDra. Mª Dolores HernándezDra. Rosa PastorDr. Raúl RamosDr. Juan José RodríguezDr. Antonio Ballesta

LA NECESIDAD DE CONSENSO

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Tyrophagus putrescentiae

ÁCAROS

Der p 1 (90% aprox)Der p 2 (90% aprox)Der p 10 (Tropomiosina) (6-10%)

Pittner y cols. Clin Exp Allergy 2004; 43: 597

Blo t 5 ( 70-100% en países tropicales)

Simpson y cols. Allergy 2003; 58: 53

Lep d; Tyr p; Gly d; Aca s ?????



Polen de gramínea

POLEN DE GRAMÍNEAS

Phl p 1 (expansina) (>80%)Phl p 5 (ribonucleasa) (>50%)Phl p 7 (polcalcina) (5-20% en países mediterráneos)Phl p 12 (profilina) (15-30% en países mediterráneos)

Simpson y cols. Allergy 2001; 56: 1180.Heiss y cols. J Invest Dermatol 1999; 113: 830Kazemi-Shirazi y cols. Int Arch Allergy Immunol 2002; 127: 259

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Bet v 1 (ribonucleasa) (>90% en países nórdicos)Bet v 2 (profilina) (10-30%)Bet v 4 (polcalcina) (5-20%)

Ole e 1 (inhibidor tripsina) (>80%), marcador de prevalenciaOle e 7 (LTP) (45-55%), marcador de severidadOle e 9 (glucanasa) (50-80%), severidad de reacciones adversas en IT

POLEN DE ÁRBOLES

Valenta y cols. Allergy 2001; 56: 1180.Heiss y cols. J Invest Dermatol 1999; 113: 830Kazemi-Shirazi y cols. Clin Exp Allergy 1999; 29: 896

Seminario-coloquio. El Escorial. Septiembre 2006

Polen de Olea



Cup a 1 (pectate lyase) (50-60%)Cup a 3 (PR-5) (50-60%) homologías con Mal d 2 y Pru av 2

Pla a 1 (inhibidor invertasa) (80%), marcador de prevalenciaPla a 2 (poligalacturonasa) (84%), Pla a 3 (LTP) ???Profilina

POLEN DE ÁRBOLES

www.allergome.orgSeminario-coloquio. El Escorial. Septiembre 2006

Polen de Olea

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Polen de Parietaria

POLEN DE MALEZAS

Par j 2 (LTP 2) (>80%)Polcalcina (5-20% en países mediterráneos)Profilina (15-30% en países mediterráneos)

Stumvoll y cols. JACI 2003; 111: 974Rossi y cols. Int Arch Allergy Immunol 2005; 138: 105



Polen de Parietaria

POLEN DE MALEZAS

Sal k 1 (70-100%) marcador de sensibilidad

Art v 1(a) (50-75%)Art v 1 (b) (defensina) (75-100%)Art v 3 (LTP) (40-80%)

Carnes y cols. Allergy 2003; 58(11):1152-1156

Lombardero y cols.Clin Exp Allergy 2004; 34(9):1415-1421

www.allergome.org

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Alternaria alternata

HONGOS

Asp f 1 ribotoxin (sensibilización)Asp f 2 fibrinogen binding prot. (ABPA)Asp f 3 peroxisomal prot (sensibilización)Asp f 4 - (ABPA)Asp f 6 Mn Superoxidedismutase (ABPA)

Crameri et al., Int Immunol 1998, 10 (8): 1211-6

Asturias y cols. J Allergy Clin Immunol 2005; 115(6):1210-1217

Alt a 1 (97% en España); marcador de sensibilizaciónAlt a 2 (0-67%) ???Enolasa (15%); reactividad cruzada otros hongos, látex, …

Bush y cols.J Allergy Clin Immunol 1999; 104(3):665-671



Staphylococcus aureus

PRODUCTOS BACTERIANOS

Enterotoxina A de StaphylococcusEnterotoxina B de StaphylococcusEnterotoxina C de StaphylococcusEnterotoxina D de StaphylococcusEnterotoxina TSST de Staphylococcus

MO Taskapan et al. Rol of Staphilococcal superantigens in AD. Ann Allergy Astma Immunol 2000. 84: 3-10.

TM Zollner et al. Colonization with superantigen-producing S. aureus is associated with increased severity of DA. Clin Exp Allergy. 2000; 30: 994-1000.

S Higaki et al. Comparative study of staphylococci from the skin of atopic dermataitis patients and fron healthy subjects. Int J Dermatol. 1999; 38: 265-269

C. Bachert et al. IgE to Staphyloccocus aureus enterotoxins in serum is related to severity of asma. J Allergy Clin Immunol. 2003. 111: 131-132.

G. Rohde et al. Increased IgE-antibodies to Staphyloccocus aureus enterotoxins in patients with COPD. Resp Med. 2004. 98: 858-864.

• DA• EPOC• Asma• AI

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LÁTEXHevea brasiliensis

13% de los pacienteas alérgicos al látex (Plátano, aguacate, castaña,

Ficus)

Hev b 11 (qitinasa clase I)

HongosHev b 10 (mn superoxido-dismutasa)

Hongos, RicinusHev b 9 (Enolasa)

Plátano, gramíneas, betuláceas, ambrosía

Sí (>80%)Sí (30%)Hev b 8 (Profilina)

?Sí (23%)Hev b 7 (patain-like)

SíSíHev b 6 (proheveina/heveina)

Sí (56%)Sí (92%)Hev b 5 (proteína acídica)

Sí (65%)Sí (77%)Hev b 4 (micohelix)

Sí (débil)SíHev b 3 (SRPP)

SíSíHev b 2 (b-1-3-glucanasa)

Sí (54-100%)Sí (81%)Hev b 1 (fact. Elongación)

Reactividad cruzadaPacientes

Espina bífidaPacientes

Látex / Ámbito sanitarioRecombinante

Sánchez-Monje y cols, 2004www.allergome.org



LTPs (reacciones sistémicas)Pru p 3, Pru av 3, (30-100%)Art v 3 (aumento de sensibilidad)Marcador de sensibilización primaria

Profilinas (SAO) (20-40%)

FRUTAS ROSÁCEAS

www.allergome.orgSeminario-coloquio. El Escorial. Septiembre 2006Fdez Rivas y cols. J Allergy Clin Immunol 2006; 118(2):481-488 Reuter y cols. Clin Exp Allergy 2006; 36: 815

Prunus avium

LTPsCiruela (Pru av 3)Melocotón (Pru p 3)Albaricoque (Pru ar 3)Pera (Pyr c 3)Manzana(Mald d 3)

Profilinas

Europa norte

Mediterráneo

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Tropomiosina

50-75%, alergia alimentaria a crustáceos y moluscos, y es un factor relevante en la alergia alimentaria a invertebrados.

10-30% Blomia, 6-10% Dermatophagoides, 13% Lepidoglyphus,Juega un papel menos relevante en la alergia a inhalantes (ácaros y cucarachas).

ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL

www.allergome.orgSeminario-coloquio. El Escorial. Septiembre 2006Steinman y Ruden. Native and recombinant allergen, 2006.Phadia AB

Prunus avium



Canis familiaris

EPITELIOS

Fel d 1 (95%), marcador de sensibilizaciónAlbúminas séricas de gato (Fel d 2) (17%)

Can f 1 (lipocalina) (50-80%)Can f 2 (lipocalina) (20-30%)Albúminas séricas de perro (Can f 3) (35-50%)

Albúminas séricas de vacaAlbúminas séricas de caballoAlbúminas séricas de cerdo

Van Reer y cols. JACI 1999; 104: 1223Saarelainen y cols. Clin Exp Allergy 2004; 34: 1576www.allergome.es

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Apis mellifera

VENENO DE INSECTOS

Api m 1 (Fosfolipasa A2) (70%)Api m 2 (Hialuronidasa) (100%)Api m 3 (Fosfatasa ácida) (37%)Api m 4 (Melitina) -Api m 6 (Alergeno C) (40%)Api m 7 )Serin Proteasa) -

Pol a 1 (Fosfolipasa A2) -Pol a 2 (Hialuronidasa) -Pol a 5 (Antígeno 5) -

Ves v 1 (Fosfolipasa A2) (60%)Ves v 2 (Hialuronidasa) (76%)Ves v 5 (Antígeno 5) (80%)

www.allergome.orgCross

-reac

tive C

arboh

ydra

t Dete

rmina

nts



ARRAYS

Protein microarrays in diagnosing IgE-mediated diseases: spotting allergy at the molecular levelChristian Harwanegg, Reinhard Hiller

Expert Review of Molecular Diagnostics, July 2004, Vol. 4, No. 4, Pages 539-548.

Oh! Oh!Somebody is coming!

E.I.A.

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¡LA EVOLUCIÓN ES IMPARABLE! …



En numerosas ocasiones no son más que sazonar conceptosclásicos con nuevas tecnologías …..

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PROTEÓMICANANOTECNOLOGÍAMINIATURIZACIÓN

+

MINIATURIZACIÓNLÁSER CONFOCAL

INFORMÁTICA“MICROARRAYS”

++

Σi



Poco suero …

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Buena reproducibilidad …



Excelente correlación con en método de referencia …

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Una excelente puesta en escena …



sIgE (CAP,CRD, ISAC, ….)

Marcadores de inflamación

Marcadores genéticos

Triptasa, IgE total, diagnóstico

imagen, etc

praxis

+

+

¡Ahora vamos bien!

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1953

1865

19601970s

1955

1970s

Linneo

Mendel

Watson y Crick

Werner, Nathans y Smith

Sanger

Jacob y Monod

Behring

1735

1900

Ehrlich

1908

Richet BovetMac Farlane

Edelman

Vane

Milstein

Blobel

1913 1957

1960

1972

1982

1984

1999

¿hay algo aquí de la marcha alérgica..?

RecombinaciónEnzimas restricción

antihistamínicos

IshizakaJohansson

tolerancia Estructura anticuerpos

Proteinas de señaly transporte

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