john r. clay et al- phase resetting of the rhythmic activity of embryonic heart cell aggregates:...

8/3/2019 John R. Clay et al- Phase Resetting of the Rhythmic Activity of Embryonic Heart Cell Aggregates: Experiment and T

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PHASE RESETTING OF THE RHYTHMIC ACTIVITY OFEMBRYONIC HEART CELL AGGREGATESE x p e r i m e n t a n d T h e o r y

JOHN R . CLAYL a b o r a t o r y o f B i o p h y s i c s , I n t r a m u r a l R e s e a r c h P r o g r a m , N a t i o n a l I n s t i t u t e o f N e u r o l o g i c a l a n dC o m m u n i c a t i v e D i s o r d e r s a n d S t r o k e , N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h a t t h e M a r i n e B i o l o g i c a lL a b o r a t o r y , W o o d s H o l e , M a s s a c h u s e t t s 0 2 5 4 3M I C H A E L R . GUEVARA AND A L V I N S H R I E RD e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y , M c G i l l U n i v e r s i t y , M o n t r e a l , Q u e b e c , C a n a d a H 3G I Y 6A B S T R A C T I n j e c t i o n o f a c u r r e n t p u l s e o f b r i e f d u r a t i o n i n t o a n a g g r e g a t e o f s p o n t a n e o u s l y b e a t i n g c h i c k e m b r y o n i ch e a r t c e l l s r e s e t s t h e p h a s e o f t h e a c t i v i t y b y e i t h e r a d v a n c i n g o r d e l a y i n g t h e t i m e o f o c c u r r e n c e o f t h e s p o n t a n e o u s b e a ts u b s e q u e n t t o c u r r e n t i n j e c t i o n . T h i s e f f e c t d e p e n d s u p o n t h e p o l a r i t y , a m p l i t u d e , a n d d u r a t i o n o f t h e c u r r e n t p u l s e , a sw e l l a s o n t h e t i m e o f i n j e c t i o n o f t h e p u l s e . T h e t r a n s i t i o n f r o m p r o l o n g a t i o n t o s h o r t e n i n g o f t h e i n t e r b e a t i n t e r v a la p p e a r s e x p e r i m e n t a l l y t o b e d i s c o n t i n u o u s f o r s o m e s t i m u l u s c o n d i t i o n s . T h e s e o b s e r v a t i o n s a r e a n a l y z e d b y n u m e r i c a li n v e s t i g a t i o n o f a m o d e l o f t h e i o n i c c u r r e n t s t h a t u n d e r l i e s p o n t a n e o u s a c t i v i t y i n t h e s e p r e p a r a t i o n s . T h e m o d e l c o n s i s t so f : I , w h i c h u n d e r l i e s t h e r e p o l a r i z a t i o n p h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l , I K 2 ' a t i m e - d e p e n d e n t p o t a s s i u m i o n p a c e m a k e rc u r r e n t , I b g , a b a c k g r o u n d o r t i m e - i n d e p e n d e n t c u r r e n t , a n d I N a , a n i n w a r d s o d i u m i o n c u r r e n t t h a t u n d e r l i e s t h eu p s t r o k e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l . T h e s t e a d y s t a t e a m p l i t u d e o f t h e sum o f t h e s e c u r r e n t s i s a n N - s h a p e d f u n c t i o n o fp o t e n t i a l . S l i g h t s h i f t s i n t h e p o s i t i o n o f t h i s c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n a l o n g t h e c u r r e n t a x i s c a n p r o d u c e e i t h e r o n e , t w o ,o r t h r e e i n t e r s e c t i o n s w i t h t h e v o l t a g e a x i s . T h e n u m b e r o f t h e s e e q u i l i b r i u m p o i n t s a n d t h e v o l t a g e d e p e n d e n c e o f I N ac o n t r i b u t e t o a p p a r e n t d i s c o n t i n u i t i e s o f p h a s e r e s e t t i n g . A c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n w i t h t h r e e e q u i l i b r i u m p o i n t s h a s as a d d l e p o i n t i n t h e p a c e m a k e r v o l t a g e r a n g e . C e r t a i n c o m b i n a t i o n s o f c u r r e n t - p u l s e p a r a m e t e r s a n d t i m i n g o f i n j e c t i o nc a n s h i f t t h e s t a t e p o i n t n e a r t h i s s a d d l e p o i n t a n d l e a d t o a n i n t e r b e a t i n t e r v a l t h a t i s u n b o u n d e d . A c t i v a t i o n o f I N a i ss t e e p l y v o l t a g e d e p e n d e n t . T h i s r e s u l t s i n a p p a r e n t l y d i s c o n t i n u o u s p h a s e r e s e t t i n g b e h a v i o r f o r s u f f i c i e n t l y l a r g e p u l s ea m p l i t u d e s r e g a r d l e s s o f t h e n u m b e r o f e q u i l i b r i u m p o i n t s . H o w e v e r , p ha s e r e s e t t i n g i s f u n d a m e n t a l l y a c o n t i n u o u sf u n c t i o n o f t h e t i m e o f p u l s e i n j e c t i o n f o r t h e s e c o n d i t i o n s . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e t h e i o n i c b a s i s o f p h a s e r e s e t t i n ga n d p r o v i d e a f r a m e w o r k f o r t o p o l o g i c a l a n a l y s i s o f t h i s p h e n o m e n o n i n c h i c k e m b r y o n i c h e a r t c e l l a g g r e g a t e s .

INTROD UCTIONC o n s i d e r a b l e i n t e r e s t h a s c e n t e r e d i n r e c e n t y e a r s o n t h ep e r t u r b i n g i n f l u e n c e s o f b r i e f d u r a t i o n e l e c t r i c a l s t i m u l i o nt h e s p o n t a n e o u s r h y t h m i c a c t i v i t y o f n e r v e a n d c a r d i a cc e l l s ( P e r k e l e t a l . , 1 9 6 4 ; H a r t l i n e , 1 9 7 6 ; A y e r s a n dS e l v e r s t o n , 1 9 7 7 ; W i n f r e e , 1 9 7 7 ; P i n s k e r , 1 9 7 7 ; G u t t m a ne t a l . , 1 9 8 0 ; U s h i y a m a a n d B r o o k s , 1 9 7 4 ; J a l i f e a n d M o e ,1 9 7 6 ; S a n o e t a l . , 1 9 7 8 ; J a l i f e a n d A n t z e l e v i t c h , 1 9 7 9 ,1 9 8 0 ; J a l i f e e t a l . , 1 9 8 0 ; G u e v a r a e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e r e p o r t so n c a r d i a c p r e p a r a t i o n s h a v e a m p l i f i e d t h e o r i g i n a l o b s e r -v a t i o n s o f W e i d m a n n ( 1 9 5 1 ) c o n c e r n i n g t h e e f f e c t s o fi n d i v i d u a l c u r r e n t p u l s e s o n t h e r h y t h m i c b e h a v i o r o fs p o n t a n e o u s l y a c t i v e c a r d i a c P u r k i n j e f i b e r s . T h e s e e x p e r i -m e n t s h a v e s e v e r a l f e a t u r e s i n c o m m o n . F o r e x a mp l e , ac u r r e n t p u l s e s t i m u l u s a p p l i e d s o m e t i m e a f t e r t h e o c c u r -r e n c e o f a c a r d i a c a c t i o n p o t e n t i a l e i t h e r a d v a n c e s o r

p o t e n t i a l e v e n t d e p e n d i n g u p o n t h e p o l a r i t y , t h e a m p l i t u d e ,a n d t h e d u r a t i o n o f t h e p u l s e , a n d t h e t i m e a t w h i c h i t w a sa p p l i e d . I n g e n e r a l , a d e p o l a r i z i n g p u l s e o f g i v e n a m p l i t u d ea n d d u r a t i o n d e l a y s t h e t i m e o f o c c u r r e n c e o f t h e n e x te v e n t w h e n a p p l i e d r e l a t i v e l y e a r l y i n t h e c y c l e , w h e r e a s i ta d v a n c e s t h e t i m e o f t h e n e x t e v e n t w h e n a p p l i e d l a t e r i nt h e c y c l e . T h e e f f e c t i s r e v e r s e d f o r h y p e r p o l a r i z i n g p u l s e s .T h e t r a n s i t i o n p o i n t a t w h i c h a d e p o l a r i z i n g p u l s e p r o d u c e sn e i t h e r a d e l a y n o r a n a d v a n c e m o v e s t o e a r l i e r t i m e s i n t h ec y c l e a s t h e a m p l i t u d e o f t h e p u l s e i s i n c r e a s e d . M o r e o v e r ,t h e r a n g e o f t i m e s o f t h e d e l i v e r y o f t h e p u l s e f o r w h i c h t h et r a n s i t i o n t f r o m d e l a y t o a d v a n c e c a n b e c l e a r l y d i s c e r n e d ,n a r r o w s c o n s i d e r a b l y a s t h e p u l s e a m p l i t u d e i s i n c r e a s e d .I n f a c t , t h e t r a n s i t i o n i s a p p a r e n t l y d i s c o n t i n u o u s f o rs u f f i c i e n t l y l a r g e p u l s e a m p l i t u d e s o r p u l s e d u r a t i o n s ( J a l -i f e a n d M o e , 1 9 7 6 ; S a n o e t a l . , 1 9 7 8 ; S c o t t , 1 9 7 9 ; J a l i f e e ta l . , 1 9 8 0 ; G u e v a r a e t a l . , 1 9 8 1 ) .

B I O P H Y S . J . O B i o p h y s i c a l S o c i e t y - 0 0 0 8 - 3 4 9 5 / 8 4 / 0 4 / 6 9 9 / 1 6 $ 1 . 0 0V o l u m e 4 5 A p r i l 1 9 8 4 6 9 9 - 7 1 4 6 9 9


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T h e a b o v e o b s e r v a t i o n s h a v e p r o m p t e d a n u m b e r o ft h e o r e t i c a l i n v e s t i g a t i o n s c o n c e r n i n g t h e r e s p o n s e o f s i m p l el i m i t c y c l e o s c i l l a t o r s t o p e r t u r b a t i o n s o f b r i e f d u r a t i o n( S c o t t , 1 9 7 9 ; W i n f r e e , 1 9 8 0 ; G u e v a r a a n d G l a s s , 1 9 8 2 ;G u e v a r a e t a l . , 1 9 8 3 ) . M o r e o v e r , s e v e r a l a u t h o r s h a v ei n v e s t i g a t e d p h a s e r e s e t t i n g i n i o n i c m o d e l s o f n e r v e a n dc a r d i a c c e l l m e m b r a n e s ( M c A l l i s t e r e t a l . , 1 9 7 5 ; B e s t ,1 9 7 9 ; G u t t m a n e t a l . , 1 9 8 0 ; D i F r a n c e s c o a n d N o b l e ,1 9 8 2 a ; G u e v a r a e t a l . , 1 9 8 2 ; B r i s t o w a n d C l a r k , 1 9 8 2 ;G u e v a r a e t a l . , 1 9 8 3 ) . H o w e v e r , i n o u r v i e w , t h e r e h a s n o ta s y e t a p p e a r e d a d e t a i l e d r e p o r t d e s c r i b i n g t h e r e l a t i o n -s h i p b e t w e e n s p e c i f i c p h e n o m e n a t h a t o c c u r d u r i n g p h a s er e s e t t i n g a n d t h e u n d e r l y i n g i o n i c c u r r e n t s , p a r t i c u l a r l yw i t h r e f e r e n c e t o t h e a p p a r e n t d i s c o n t i n u i t y o f p h a s er e s e t t i n g . We h a v e a t t e m p t e d s u c h a s t u d y u s i n g a g g r e -g a t e s o f c e l l s d e r i v e d w i t h t i s s u e c u l t u r e t e c h n i q u e s f r o mt h e h e a r t s o f c h i c k e m b r y o s . T h e s e p r e p a r a t i o n s b e a ts p o n t a n e o u s l y a n d r h y t h m i c a l l y u n d e r a p p r o p r i a t e e x p e r i -m e n t a l c o n d i t i o n s ( s e e M e t h od s ) . A g g r e g a t e s a r e a s u i t -a b l e c h o i c e f o r t h i s i n v e s t i g a t i o n e v e n t h o u g h t h e y a r em u l t i c e l l u l a r p r e p a r a t i o n s , b e c a u s e t h e i r s m a l l s i z e , t h e i rs p h e r i c a l g e o m e t r y , a n d t h e t i g h t e l e c t r i c a l c o u p l i n g o fc e l l s w i t h i n a n a g g r e g a t e l e a d t o a v i r t u a l l y i s o p o t e n t i a lp r e p a r a t i o n ( D e H a a n a n d F o z z a r d , 1 9 7 5 ; D e F e l i c e a n dD e H a a n , 1 9 7 7 ; C l a y e t a l . , 1 9 7 9 ; C l a p h a m , 1 9 7 9 ; M a t h i a se t a l . , 1 9 8 1 ) . S e v e r a l i n v e s t i g a t o r s h a v e u s e d t h i s p r e p a r a -t i o n f o r p h a s e r e s e t t i n g s t u d i e s ( S c o t t , 1 9 7 9 ; G u e v a r a e ta l . , 1 9 8 1 ; Y p e y e t a l . , 1 9 8 2 ) . M o r e o v e r , t h e m e m b r a n ec u r r e n t s u n d e r l y i n g p a c e m a k i n g i n a g g r e g a t e s h a v er e c e n t l y b e e n m e a s u r e d w i t h t h e v o l t a g e c l a m p t e c h n i q u e( N a t h a n a n d D e H a a n , 1 9 7 9 ; S h r i e r a n d C l a y , 1 9 8 0 ;E b i h a r a e t a l . , 1 9 8 0 ; E b i h a r a a n d J o h n s o n , 1 9 8 0 ; C l ay a n dS h r i e r , 1 9 8 1 a , b ; S h r i e r a n d C l a y , 1 9 8 2 ; J o s e p h s o n a n dS p e r e l a k i s , 1 9 8 2 ) . T h e r e f o r e , a n a n a l y s i s o f p h a s e r e s e t t i n gu s i n g t h e s e v o l t a g e c l a m p r e s u l t s f o r h e a r t c e l l a g g r e g a t e ss e e m s t i m e l y .

m i c r o e l e c t r o d e s f i l l e d w i t h 3 M K C I . C u r r e n t p u l s e s w e r e i n j e c t e dt h r o u g h t h e s i n g l e v o l t a g e r e c o r d i n g e l e c t r o d e . T h e a m p l i t u d e o f t h e p u l s ew a s m e a s u r e d w i t h a v i r t u a l g r o u n d c u r r e n t - t o - v o l t a g e c o n v e r t e r .

T h e o r e t i c a lO v e r v i e w o f I o n i c C u r r e n t s . V o l t a g e c l a m p a n a l y s i so f 7 - d - o l d c h i c k e m b r y o n i c v e n t r i c u l a r c e l l s h a s r e v e a l e d f o u r i o n i c

c u r r e n t c o m p o n e n t s t h a t c o n t r i b u t e t o t h e t o t a l m e m b r a n e c u r r e n tt h r o u g h o u t t h e r a n g e o f m e m b r a n e p a c e m a k e r p o t e n t i a l s , - 1 0 0 t o -6 0mV ( S h r i e r a n d C l a y , 1 9 8 2 ) . T h e s e c o m p o n e n t s a r e ( a ) a t i m e - d e p e n d e n tp o t a s s i u m i o n c u r r e n t , I K 2 ' w i t h s l o w v o l t a g e - d e p e n d e n t k i n e t i c s h a v i n gt i m e c o n s t a n t s o f a c t i v a t i o n t y p i c a l l y i n t h e 0 . 1 t o 1 . 0 s r a n g e ; ( b ) at i m e - i n d e p e n d e n t o r b a c k g r o u n d c u r r e n t , I b g , w h i c h a p p e a r s t o b e c a r r i e db y a m i x t u r e o f i o n i c s p e c i e s , m o s t n o t a b l y s o d i u m , I N a b , a n d p o t a s s i u m ,I K , ; ( c ) a t i m e - d e p e n d e n t c u r r e n t , I K or l , w h i c h p r i m a r i l y d e t e r m i n e s t h er a t e o f r e p o l a r i z a t i o n ; a n d ( d ) a s o d i u m i o n c u r r e n t , I N a , w i t h m i l l i s e c o n dk i n e t i c s t h a t p r i m a r i l y c o n t r o l s t h e m a x i m a l r a t e o f r i s e o f t h e u p s t r o k e o ft h e a c t i o n p o t e n t i a l ( V m a x ) . T h e I K 2 c o m p o n e n t h a s a l s o b e e n r e p o r t e d f o rm a m m a l i a n c a r d i a c P u r k i n j e f i b e r s b y N o b l e a n d T s i e n ( 1 9 6 8 ) , a l t h o u g hD i F r a n c e s c o ( 1 9 8 1 ) a n d D i F r a n c e s c o a n d N o b l e ( 1 9 82 a ) h av e r e c e n t l yr e i n t e r p r e t e d t h i s c u r r e n t i n P u r k i n j e f i b e r s a s a n i n w a rd c u r r e n t , w h i c ht h e y h a v e t e r m e d I f . D i F r a n c e s c o a n d N o b l e ( 1 9 8 2 b ) h a v e a l s o s u g g e s t e dt h a t t h e I f m o d e l may p r o v i d e a n a l t e r n a t i v e r e p r e s e n t a t i o n f o r t h e C l a ya n d S h r i e r ( 1 9 8 1 a , b ) v o l t a g e c l a m p m e a s u r e m e n t s . H o w e v e r , t h ep a c e m a k e r c u r r e n t k i n e t i c s i n v o l t a g e - c l a m p e d a g g r e g a t e s n e a r t h ep o t a s s i u m e q u i l i b r i u m p o t e n t i a l , E K , t o g e t h e r w i t h t h e d e v e l o p m e n t a lc h a n g e s i n p a c e m a k e r c u r r e n t s t h a t o c c u r a f t e r d a y 7 a p p e a r t o r e q u i r et h e o r i g i n a l I K 2 r a t h e r t h a n t h e I f m o d e l ( C l a y a n d S h r i e r , 1 9 8 l a , b ; 1 9 8 3 ) .M o r e o v e r , t h e b e ha vi or o f t h e r e f o r m u l a t e d m o d e l o f c a rd ia c P u r k i n j ef i b e r i n r e s p o n s e t o c u r r e n t p u l s e s t i m u l a t i o n d o e s n o t a p p e a r t o b ea p p r e c i a b l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e e a r l i e r M c A l l i s t e r e t a l . ( 1 9 7 5 )m o d e l i n w h i c h ' K 2 i s t h e p a c e m a k e r c o m p o n e n t ( D i F r a n c e s c o a n d N o b l e ,1 9 8 2 a ) .

M a t h e m a t i c a l R e p r e s e n t a i t o n o f I o n i c C u r -r e n t s . M e a s u r e m e n t s o f I K 2 f o r 7 - d v e n t r i c u l a r a g g r e g a t e s a r e g i v e n i nS h r i e r a n d C l a y ( 1 9 8 0 ) a n d C l a y a n d S h r i e r ( 1 9 8 1 a ) . T h e l a t t e r p a p e ra l s o c o n t a i n s a m a t h e m a t i c a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e I K 2 r e s u l t s , w h i c h i sg i v e n b y

I K 2 ( V , t ) = s ( V , t ) I o 2 K2 ( V ) , ( 1 )MET HODSE x p e r i m e n t a l

A f u l l a c c o u n t o f o u r e x p e r i m e n t a l m e t h o d s h a s b e e n g i v e n e l s e w h e r e( S a c h s a n d D e H a a n , 1 9 7 3 ; C l a y e t a l . , 1 9 7 9 ; C l a y a n d S h r i e r , 1 9 8 1 a ) . Ab r i e f a c c o u n t i s a s f o l l o w s . I n d i v i d u a l c e l l s w e r e d i s s o c i a t e d a t a m b i e n tt e m p e r a t u r e f r o m t h e a p i c a l p o r t i o n s o f t h e v e n t r i c l e s o f 7 - d o l d c h i c ke m b r y o n i c h e a r t s u s i n g t r y p s i n . T h e c e l l s w e r e t r a n s f e r r e d t o a f l a s kc o n t a i n i n g t i s s u e c u l t u r e m e d i u m ( 8 1 8 A ) h a v i n g a p o t a s s i u m i o n - c o n c e n -t r a t i o n o f 1 . 3 mM. T h e f l a s k w a s p l a c e d o n a g y r a t o r y s h a k e r f o r 4 8 - 9 6 h .D u r i n g s l o w g y r a t i o n c e l l s a g g r e g a t e i n t o s m a l l s p h e r i c a l c l u s t e r s 1 0 0 -2 5 0 , u m i n d i a m e t e r . T h e a g g r e g a t e s w e r e t r a n s f e r r e d t o a t i s s u e c u l t u r ed i s h c o n t a i n i n g c u l t u r e m e d i u m f o r e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e c o r d i n g . T h emedium w a s g a s s e d w i t h a 5% C 0 2 , 1 0 % 0 2 , a n d 85% N 2 g a s m i x t u r ed u r i n g g y r a t i o n c u l t u r e a n d d u r i n g e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e c o r d i n g s . T h et e m p e r a t u r e w a s m a i n t a i n e d c o n s t a n t a t 3 5 0 + 0 . 5 0 C . A g g r e g a t e d i a m e -t e r s w e r e m e a s u r e d w i t h a n o c u l a r r e t i c l e w h o s e s m a l l e s t d i v i s i o nr e p r e s e n t e d 1 8 , m . M e a s u r e m e n t s c o u l d b e m a d e t o a b o u t h a l f a d i v i s i o n .U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s a g g r e g a t e s b e a t s p o n t a n e o u s l y a n d r h y t h m i c a l l yw i t h a r a n g e o f i n t e r b e a t i n t e r v a l s ( I B I ) t y p i c a l l y b e t w e e n 0 . 5 a n d 1 s .I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g s o f s p o n t a n e o u s a c t i v i t y w e r e m a d e w i t h g l a s s

w h e r e V i s t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d t h e a c t i v a t i o n p a r a m e t e r , s , i sg o v e r n e d b y t h e e q u a t i o n

d s ( V , t ) / d t = - [ a s ( V ) + I s ( V ) ] * s ( V , t ) + a , ( V ) , ( 2 )w h e r e t h e r a t e c o n s t a n t s , a , a n d f 3 . , a r e g i v e n ( i n i n v e r s e s e c o n d s ) b y

a , ( V ) = a o - ( V + E 2 ) / { I - e x p [ - a ' - (V+ E 2 ) ] } ( 3 )( 4 )

I K 2 i s a c o n s t a n t a n df K 2 ( V ) =X (p+-p_)/(l+x+x2)

w i t hx = p _ / p + ,

( 5 )

( 6 )p + = 1 / { 1 + e x p [ q ( V - E K ) / k T ] } , ( 7 )

B I O P H Y S I C A L JOURNAL V O L UME 4 5 1 9 8 4

# , , ( V ) =X - e x p [ - # ' - (V + E 2 ) 1 -

7 0 0


3/16

a n dp _ =1 - p + . ( 8 )

T h e v a l u e s o f t h e v a r i o u s p a r a m e t e r s i n t h e a b o v e e x p r e s s i o n s t h a td e s c r i b e t h e t y p i c a l r e s u l t s i n C l a y a n d S h r i e r ( 1 9 8 I a ) a r e a o = 1 . 0 5 so = 0 . 0 9 5 s ' , a = 0 . 2 m V - , , ' = 0 . 0 7 5 m V - ' , E 2 5 8 m V , I 2= 5 4 5n A , a n d t h e p o t a s s i u m e q u i l i b r i u m p o t e n t i a l , E K - - 1 2 4 m V . T h ec o n s t a n t s q , k , a n d T i n E q . 7 a r e , r e s p e c t i v e l y , t h e u n i t e l e c t r o n i c c h a r g e ,t h e B o l t z m a n n c o n s t a n t , a n d t h e a b s o l u t e t e m p e r a t u r e . A t T = 3 5 0 C ,k T / q = 2 6 . 6 m V . We h a v e u s e d k T / q = 2 5 mV t h r o u g h o u t t h i s s t u d y .

T h e a m p l i t u d e o f I 2 a n d a l l o t h e r c u r r e n t s g i v e n b e l o w h a v e b e e n s c a l e df o r a 2 0 0 gm d i a m ( D ) a g g r e g a t e u s i n g t h e o b s e r v a t i o n o f C l a y e t a l .( 1 9 7 9 ) t h a t t h e e l e c t r i c a l p a r a m e t e r s o f a g g r e g a t e s o f d i f f e r e n t s i z e s s c a l ea c c o r d i n g t o D 3 .T h e m o t i v a t i o n f o r t h e a b o v e e x p r e s s i o n s i s t h a t t i m e - d e p e n d e n tc h a n g e i n c u r r e n t f o l l o w i n g v o l t a g e c l a m p s t e p s i n t h e p a c e m a k e r v o l t a g e

r a n g e f o l l o w s a s i n g l e e x p o n e n t i a l t i m e c o u r s e . H e n c e , w e h a v e r e p r e -s e n t e d t h e t i m e d e p e n d e n c e o f I K ? b y a s i n g l e p a r a m e t e r , s , w h i c h o b e y sf i r s t - o r d e r k i n e t i c s . T h e t i m e c o n s t a n t T , ( V ) = ( a d [ V ] + # 3 [ V ] ) i s ,t h e r e f o r e , a d i r e c t e x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n . T h e v o l t a g e d e p e n d e n c e o f; d e s c r i b e s a b e l l - s h a p e d c u r v e h a vi n g a maximum v a l u e o f - 1 s a t v t-80 m V , a n d s m a l l e r v a l u e s e i t h e r a b o v e o r b e l o w 8 0 m V . F o re x a m p l e , r , - 0 . 5 s f o r V = - 1 0 0 mV a n d r s_ - 0 . 2 s f o r V -60 mV. T h es t e a d y s t a t e v a l u e o f t h e v a r i a b l e f o r a c t i v a t i o n o f I K 2 s S = a , ( V ) /( a s [ V J + # 3 j V ] ) , i s a l s o d i r e c t l y m e a s u r e d f r o m t h e a m p l i t u d e o f t h e t a i lc u r r e n t s f o l l o w i n g r e t u r n o f t h e v o l t a g e t o h o l d i n g p o t e n t i a l ( C l a y a n dS h r i e r , 1 9 8 I a ) . T h e s e m e a s u r e m e n t s f o r T s a n d s _ w e r e f i t t e d w i t h t h ef o r m s o f a , ( V ) a n d # , , ( V ) g i v e n i n E q s . 3 a n d 4 , w h i c h a r e s i m i l a r t o t h o s eu s e d b y H o d g k i n a n d H u x l e y ( 1 9 5 2 ) t o e m p i r i c a l l y d e s c r i b e t h e i r v o l t a g ec l a m p m e a s u r e m e n t s o f p o t a s s i u m c u r r e n t i n s q u i d g i a n t a x o n s . T h e f u l l ya c t i v a t e d c u r r e n t , I O - K 2 ( V ) , i . e . , t h e p a c e m a k e r c u r r e n t t h a t f l o w sa c r o s s t h e m e m b r a n e w h e n s = 1 , i s a l s o d e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l y ,u s i n g t h e r a t i o o f t h e t i m e - d e p e n d e n t c u r r e n t d u r i n g a c l a m p s t e p t o t h et i m e - d e p e n d e n t ( t a i l ) c u r r e n t f o l l o w i n g r e t u r n t o h o l d i n g p o t e n t i a l ( N o -b l e a n d T s i e n , 1 9 6 8 ; C l a y a n d S h r i e r , 1 9 8 1 a ) . T h e s p e c i f i c f u n c t i o n a lf o r m f o r f K 2 ( V ) i n E q . 5 i s m o t i v a t e d b y t h e w i d e l y a c c e p t e d v i e w o f t h ei o n p e r m e a t i o n p r o c e s s i n b i o l o g i c a l m e m b r a n e s . I o n s a r e b e l i e v e d t om o v e i n s i n g l e f i l e t h r o u g h n a r r o w p o r e s o r c h a n n e l s w i d e l y s p a c e dt h r o u g h o u t t h e m e m b r a n e . E a c h c h a n n e l i s g u a r d e d b y a g a t e m o l e c u l et h a t i s e i t h e r o p e n , t h e r e b y a l l o w i n g i o n f l o w , o r c l o s e d , t h e r e b y p r e v e n t -i n g i o n f l o w . T h e s p a r a m e t e r i n E q s . 1 a n d 2 d e s c r i b e s t h i s g a t i n g p r o c e s sf o r I K 2 c h a n n e l s . T h a t i s , s c a n b e v i e w ed e i t h e r a s t h e p r o b a b i l i t y t h a t a n ys i n g l e c h a n n e l i s o p e n o r a s t h e f r a c t i o n o f o p e n I K 2 c h a n n e l s t h r o u g h o u ta n a g g r e g a t e . T h e f K 2 ( V ) t e r m i n E q . 5 c a n b e v i ew e d a s d e s c r i b i n g t h ev o l t a g e d e p e n d e n c e o f c u r r e n t f l o w t h r o u g h a n o p e n c h a n n e l . I f t h ec h a n n e l i s o h m i c , f K 2 ( V ) i s s i m p l y p r o p o r t i o n a l t o ( V - E K ) , t h e d r i v i n gf o r c e . H o w e v e r , p o t a s s i u m c h a n n e l s i n m u s c l e m e m b r a n e s a r e , i n g e n e r a l ,n o n o h m i c . T h e y a l l o w c u r r e n t t o f l o w m o r e r e a d i l y i n t h e i n w a r d t h a n t h eo u t w a r d d i r e c t i o n , a p r o c e s s t h a t i s t e r m e d i n w a r d r e c t i f i c a t i o n ( K a t z ,1 9 4 9 ) . T h e I K 2 c h a n n e l s i n t h e a g g r e g a t e a r e s t r o n g i n w a r d r e c t i f i e r s w h e nt h e e x t e r n a l p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n i s 1 . 3 mM. T h a t i s , f K 2 ( V ) r e a c h e sa m a x i m a l o u t w a r d v a l u e 1 5 - 2 0 mV p o s i t i v e t o E K . I t d e c l i n e s t o w a r dz e r o a t m o r e p o s i t i v e p o t e n t i a l s n e a r l y r e a c h i n g a z e r o v a l u e f o r V 2 -50mV. C o n s e q u e n t l y , f K 2 ( V ) h a s a n e g a t i v e s l o p e t h r o u g h o u t t h e p a c e -m a k e r p o t e n t i a l r a n g e . T h i s p r o c e s s i s m o d e l e d i n E q . 5 b y a t w o s i t e ,s i n g l e f i l e c h an n el w i th a m e m b r a n e b o u n d b l o c k i n g p a r t i c l e t h a t i s k e p to u t o f t h e c h a n n e l b y i n w a r d c u r r e n t f l o w a n d i s k n o c k e d i n t o t h e c h a n n e lb y o u t w a r d c u r r e n t f l o w ( C l a y a n d S h l e s i n g e r , 1 9 7 7 , 1 9 8 3 ; C l a y a n dS h r i e r , 1 9 8 l a ) .T h e b a c k g r o u n d c u r r e n t , I b g . , i s d e t e r m i n e d i n C l a y a n d S h r i e r ( 1 9 8 1 a )b y s u b t r a c t i n g t h e s t e a d y s t a t e v a l u e o f I K 2 ' K 2 ( V I t c ) = S - ' K 2f K 2 ( V ) , f r o m t h e t o t a l c u r r e n t . T h a t i s , I b g c o n s i s t s o f n o n g a t e d c h a n n e l s ,c h a n n e l s t h a t a r e o p e n a t a l l p o t e n t i a l s . T h i s c o m p o n e n t a l s o d i s p l a y si n w a r d r e c t i f i c a t i o n . M o r e o v e r , b e c a u s e i t s r e v e r s a l p o t e n t i a l , - 4 0 m V ,d o e s n o t c o r r e s p o n d t o t h e N e r n s t e q u i l i b r i u m p o t e n t i a l o f a n y o f t h e i o n i c

s p e c i e s t h a t p e r m e a t e t h e m e m b r a n e , i t a p p e a r s t o b e a m i x t u r e o f i n w a r da n d o u tw a rd c u r r e n t c o m p o n e n t s . C o n s e q u e n t l y , I b g i s m o d e l e d i n C l a ya n d S h r i e r ( 1 9 8 l a ) b y t w o c o m p o n e n t s , an i n w a r d l y r e c t i f y i n g , o u t w a r dc u r r e n t , I K , c a r r i e d p r i m a r i l y b y p o t a s s i u m i o n s a n d an o h m i c , i n w a r dc u r r e n t , I N a b , c a r r i e d b y s o d i u m i o n s . T h a t i s ,I b g = I K I + G N a , b * (V - E N a ) -

T h i s e x p r e s s i o n w a s f i t t e d t o t h e I b g e x p e r i m e n t a l r e s u l t s u s i n gI K I = I K I Y ( - E 1 ) / { 1 + y + Y -Y 3 + /I )

G K(V -E 1 ) I -e x p [ - q ( V -E , ) k T ] I ,w h e r e

y =pP - +p ' = 1 / { 1 + e x p [ q ( V - E 3 ) / k T ] } ,

p 1 = 1 - p + .

( 9 )

( 1 0 )( 1 1 )( 1 2 )( 1 3 )

T h e l e f t - h a n d t e r m i n E q . 1 0 i s s i m i l a r t o f K 2 ( V ) i n E q . 5 , e x c e p t t h a t i tc o r r e s p o n d s t o a c h a n n e l w i t h f o u r i o n - s e l e c t i v e s i t e s r a t h e r t h a n t w o . T h i sf o r m f o r I K , w a s u s e d b e c a u s e t h e r a n g e o f p o t e n t i a l s o v e r w h i c hr e c t i f i c a t i o n o c c u r s f o r I K , i s n a r r o w e r t h a n t h e r a n g e o f r e c t i f i c a t i o n o f I K 2( C l a y a n d S h r i e r , 1 9 8 1 a ) . T h e I K I r e s u l t s f u r t h e r d i f f e r f r o m I K 2 i n t h a tt h e y e x h i b i t a s e c o n d a r y i n c r e a s e o f o u t w a r d c u r r e n t f o r V >> E K . T h i se f f e c t i s m o d e l e d b y t h e s e c o n d t e r m i n E q . 1 0 , w h o s e f u n c t i o n a l f o r m wast a k e n d i r e c t l y f r o m t h e m o d e l o f I K , i n c a r d i a c P u r k i n j e f i b e r s o fM c A l l i s t e r e t a l . ( 1 9 7 5 ) . T h e v a l u e s o f t h e v a r i o u s p a r a m e t e r s i n E q s .9 - 1 3 t h a t p r o v i d e a f a i r r e p r e s e n t a t i o n o f t h e t y p i c a l r e s u l t s i n C l a y a n dS h r i e r ( 1 9 8 1 a ) a r e I = 2 2 0 n A, G N X b = 0 . 2 1 5 , u S , E N = 4 0 m V , y =0 . 5 8 , Go= 1 . 2 u S , E l = -40mV,andE3= -90mV.T h e l x c o m p o n e n t i s a t i m e - d e p e n d e n t c h a n n e l t h a t i s a c t i v a t e d a t V 2-50 m V . I t d e c a y s t o z e r o i n t h e p a c e m a k e r r a n g e o f p o t e n t i a l s . T h ec u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n o f t h e I % c h a n n e l i s a p p r o x i m a t e l y i n d e p e n d e n t o fv o l t a g e f o r - 9 0 - V -55 m V a n d i t s k i n e t i c s a r e d e s c r i b e d b y a s i n g l ep a r a m e t e r , s x , h a v i n g f i r s t - o r d e r k i n e t i c s . I t s t i m e c o n s t a n t , T , , a s af u n c t i o n o f p o t e n t i a l , i s d e s c r i b e d b y a b e l l - s h a p e d c u r v e h a v i n g am a x i m a l v a l u e o f a p p r o x i m a t e l y 3 s a t V =- 35 m V . I n t h e p a c e m a k e rr a n g e o f p o t e n t i a l s , T r i s m u c h l e s s t h a n T s ( C l a y a n d S h r i e r , 1 9 8 1 a ; S h r i e ra n d C l a y , 1 9 8 2 ; J . R . C l a y a n d A . S h r i e r , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . We h a v em o d e l e d t h e s e r e s u l t s w i t h

i x = I . S(V t ) , ( 1 4 )w i t h

d s . ( V , t ) / d t =-a . ( V ) + # . ( V ) ] - s x ( V , t ) + a . ( V ) ,w h e r e

a . ( V ) = a ' - ( V + E x ) / { 1 - e x p [ - a ' - ( V + E x ) ] 1 ,O x ( V ) = 3 x * e x p [ - # 3 * ( V + E x ) ] ,

( 1 5 )

( 1 6 )( 1 7 )

w i t h 1 = 7 5 n A , a c = 0 . 0 4 s - ' , - 0 . 0 1 s - ' ; a ' = 0 . 1 n i V - ' , I 3 ' = 0 . 1m V - ' , a n d E x =-10 m V . We n o t e t h a t t h i s i s a p r e l i m i n a r y m o d e l o f I x ,w h i c h u n d o u b t e d l y w i l l u n d e r g o r e v i s i o n w h e n f u r t h e r e x p e r i m e n t a lr e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d . H o w e v e r , E q s . 1 4 - 1 7 p r o v i d e a n a d e q u a t er e p r e s e n t a t i o n o f I x i n t h e - 9 0 t o - 5 5 mV r a n g e o f p o t e n t i a l s a t a ne x t e r n a l p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 3 mM.

T h e I N a c o m p o n e n t h a s b ee n m e a s u r e d i n e m b r y o n i c h e a r t c e l l s b yE b i h a r a e t a l . ( 1 9 8 0 ) a n d E b i h a r a a n d J o h n s o n ( 1 9 8 0 ) . We h a v e u s e d t h em a t h e m a t i c a l f o r m u l a t i o n o f t h e s e r e s u l t s g i v e n b y t h e l a t t e r a u t h o r sI N a = G N a * m ( V , t ) - h ( V , t ) - (V- E N a ) , ( 1 8 )

CLAY E T A L . P h a s e R e s e t t i n g o f H e a r t C e l l A c t i v i t y 7 0 1


4/16

w h e r ed m ( V , t ) / d t = - [ a m ( V ) + 1 . m W ( V ) ] * m ( V , t ) + a m ( V ) , ( 1 9 )d h ( V , t ) / d t = - [ a h ( V ) + f l h ( V ) I * h ( V , t ) + a h ( V ) , ( 2 0 )

w i t h r a t e c o n s t a n t s ( i n i n v e r s e s e c o n d s ) g i v e n b ya m ( V ) = -320(V + 4 7 . 1 3 ) / { e x p [ - 0 . I ( V + 4 7 . 1 3 ) ] - 1 1 ( 2 1 )

m W ( V ) = 8 0 e x p ( - V / I 1 ) ( 2 2 )a h ( V ) = 1 3 5 e x p [ - ( V + 8 0 ) / 6 . 8 ] ( 2 3 )

, B h ( V ) = 3 . 5 6 1 0 3 e x p ( 0 . 0 7 9 * V )+ 3 . 1 . 1 0 8 e x p ( 0 . 3 5 * V ) ( 2 4 )

a n d G N . = 5 0 0 A S , E N a = 4 0 m V . E b i h a r a e t a l . ( 1 9 8 0 ) a n d E b i h a r a a n dJ o h n s o n ( 1 9 8 0 ) m e a s u r e d I N a f r o m 1 1 - d - o l d h e a r t c e l l a g g r e g a t e s . Weh a v e a s s u m e d t h a t t h e i r r e s u l t s a r e a l s o a p p r o p r i a t e f o r 7 - d - o l d h e a r t sb a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n t h a t V . . , o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l a p p e a r s t o b e t h es a m e a t b o t h s t a g e s ( C l a y a n d S h r i e r , 1 9 8 l b ) .

T h e a b o v e e x p r e s s i o n s f o r I K 2 I b g , I , a n d I N . c o m p r i s e w h a t weh e r e a f t e r t e r m M o d e l I ( R e s u l t s ) . M o d e l I I i s t h e s a m e a s M o d e l I e x c e p tf o r t w o c h an g e s i n t h e b a c k g r o u n d c u r r e n t : G N a , b = 0 . 1 6 u S a n d G C K I = 0 . 9i S , r a t h e r t h a n G N a , b = 0 . 2 1 5 A S a n d G C K = 1 . 2 A S .C o m p u t e r S i m u l a t i o n s o f P a c e m a k e r V o l t a g eC h a n g e s . T h e m e m b r a n e p o t e n t i a l , V , w a s d e t e r m i n e d f r o m t h ei o n i c c u r r e n t s i n t h e s t a n d a r d w a y , b y n u m e r i c a l l y i n t e g r a t i n g t h ee q u a t i o n

d V / d t = - ( I j o n i c + I s t i m ) / C i , ( 2 5 )w h e r e I i . i c = I K 2 + I b g + I ' + I N a , I s t i m i s t h e e x t e r n a l l y a p p l i e d c u r r e n t a n dC i i s t h e i n p u t c a p a c i t a n c e o f a n a g g r e g a t e . We h a v e u s e d C , = 0 . 0 2 3 M F ,w h i c h i s a p p r o p r i a t e f o r a 2 0 0 ,m d i a m a g g r e g a t e ( C l a y e t a l . , 1 9 7 9 ) . T h ei n i t i a l c o n d i t i o n s , w h i c h we u s e d f o r a l l s i m u l a t i o n s , w e r e V = -70 m V ,s = 1 , s x = 1 , m = 0 , a n d h = 1 . T h e s e v a l u e s a p p r o x i m a t e t h e s t a t e o f t h eI K 2 ' I . , a n d I N a g a t i n g p a r a m e t e r s b e f o r e t h e l a t e r p h a s e o f r e p o l a r i z a t i o n .We a s s u m e t h a t I K 2 a n d I x a r e f u l l y a c t i v a t e d b y t h e e n d o f t h e p l a t e a up h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l , a n d t h a t s a n d s 5 r e m a i n e s s e n t i a l l yu n c h a n g e d d u r i n g r e p o l a r i z a t i o n b e f o r e t h e t i m e a t w h i c h V = -70 mV .T h e i n i t i a l s t a r t i n g t i m e f o r a l l s i m u l a t i o n s w a s c h o s e n t o b e t = 1 5 0 m s ,w h i c h r o u g h l y c o r r e s p o n d s t o t h e d u r a t i o n o f t h e a c t i o n p o t e n t i a lp r e c e d i n g V = - 7 0 mV o n t h e r e p o l a r i z a t i o n p h a s e . E q . 2 5 w a si n t e g r a t e d i n d o u b l e p r e c i s i o n u s i n g a n E u l e r f i x e d - s t e p i m p l e m e n t a t i o no f t h e R u s h a n d L a r s e n ( 1 9 7 8 ) a l g o r i t h m t o d e t e r m i n e t h e p o t e n t i a lc h a n g e s u b s e q u e n t t o t = 1 5 0 m s . An i n t e g r a t i o n t i m e s t e p o f 5 0 , u s w a su s e d f o r m o s t o f o u r s i m u l a t i o n s . A s m a l l e r s t e p ( a s s m a l l a s 1 M s ) w a su s e d t o i n v e s t i g a t e t h e c r i t i c a l r e g i o n o f t h e p h a s e r e s e t t i n g c u r v e( R e s u l t s ) . A c u r r e n t p u l s e o f 2 0 - m s d u r a t i o n w a s a p p l i e d a t v a r i o u s p o i n t si n t h e u n p e r t u r b e d p a c e m a k e r c y c l e . T h e s i m u l a t i o n s w e r e s t o p p e d w h e nt h e p o t e n t i a l r e a c h e d t h e t h r e s h o l d o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l , w h i c h w a sa r b i t r a r i l y c h o s e n t o b e V = - 5 5 mV.

R ESU LTSC u r r e n t - V o l t a g e R e l a t i o n s ( I V )

T h e r e s p e c t i v e c o n t r i b u t i o n s o f t h e v a r i o u s i o n i c c u r r e n t s( M e t h o d s ) t o t h e t o t a l m e m b r a n e p a c e m a k e r c u r r e n t a r ei l l u s t r a t e d b y c u r v e s a - e i n F i g . 1 . C u r v e a , w h i c h i s t h es a m e f o r b o t h M o d e l I a n d I I , r e p r e s e n t s t h e sum o f t h ef u l l y a c t i v a t e d I K 2 c o m p o n e n t a n d t h e s t e a d y s t a t e a m p l i -t u d e o f I N a , i . e . , I K , - f K , ( V ) + G N a m 3 h . . ( V - E N a ) .

C u r v e b r e p r e s e n t s I K 2 f K 2 ( V ) + I b g ( V ) + G N a m2k.( V - E N a ) . C u r v e c r e p r e s e n t s t h e t o t a l s t e a d y s t a t ec u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n ( I V ) , i . e . , s J I K 2 f K 2 ( V ) + I b g ( V )+ G N a m 2 3 h . * (V - E N a ) . C u r v e d r e p r e s e n t s I b g ( V ) + G N a* m ) 3 h . . (V - E N a ) . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n c a n d d ,t h e r e f o r e , i s t h e s t e a d y s t a t e a m p l i t u d e o f I K 2 ' C u r v e er e p r e s e n t s t h e s t e a d y s t a t e I V i n t h e a b s e n c e o f I N a , i . e . ,S - I K 2 * f K 2 ( V ) + I b g ( V ) . ( T h e I , , c o m p o n e n t i s n o t s h o w ni n F i g . 1 , s i n c e t h e s t e a d y s t a t e a m p l i t u d e o f I x i s v i r t u a l l yn i l f o r p a c e m a k e r p o t e n t i a l s . ) T h e t e r m s t e a d y s t a t e i n t h i sc o n t e x t r e f e r s t o t h e m e a s u r e m e n t o f m e m b r a n e c u r r e n te i t h e r i n c o n s t a n t v o l t a g e c l a m p c o n d i t i o n s ( t - - o o ) , o r a tt h e e n d o f a v o l t a g e c l a m p p u l s e h a v i n g a d u r a t i o ns i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n t h e t i m e c o n s t a n t s o f a l l o f t h eg a t e d i o n i c c h a n n e l s t h a t c o n t r i b u t e t o t h e t o t a l c u r r e n t .C u r v e e i n M o d e l I a n d I I i s t o b e c o m p a r e d w i t h t h ee x p e r i m e n t a l I V i n F i g . 2 o f C l a y a n d S h r i e r ( 1 9 8 1 a ) f r o ma n a g g r e g a t e i n t i s s u e c u l t u r e m e d i u m c o n t a i n i n g 1 . 3 mmK o a n d t e t r o d o t o x i n ( T T X ) , a n a g e n t t h a t b l o c k s b o t h I N aa n d s p o n t a n e o u s a c t i v i t y . C u r v e s e o f b o t h M o d e l s I a n d I Il i e w e l l w i t h i n t h e r a n g e o f t h e I V ' s t h a t w e r e e x p e r i m e n -t a l l y o b s e r v e d . A f u r t h e r c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e o r y a n de x p e r i m e n t c a n b e m a d e w i t h r e g a r d t o t h e r e s t i n g p o t e n -t i a l ( E r ) o f a g g r e g a t e s i n TTX c o n d i t i o n s . E x p e r i m e n t a l l y ,E r i s a p p r o x i m a t e l y - 6 0 mV ( E , = -56 7 mV, m e a n S D , n = 1 1 , C l a y a n d S h r i e r , 1 9 8 l a ; E r =- 5 7 + 1 0 mV,m e a n S D , n = 1 2 , C o l i z z a e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e E r o f c u r v e ei n M o d e l I i s - 6 3 . 4 m V , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h t h e s eo b s e r v a t i o n s . T h e E r o f M o d e l I I i s - 7 1 . 8 mV. Somea g g r e g a t e s r e s t a s n e g a t i v e l y a s - 7 0 t o - 7 5 mV, a l t h o u g ht h i s r a n g e o f E r w a s s o m e w h a t a t y p i c a l f o r 1 . 3 mm K o( C l a y a n d S h r i e r , 1 9 8 1 a ) . T h e a d d i t i o n o f I N a t o c u r v e e i nM o d e l I r e m o v e s t h e e q u i l i b r i u m p o i n t i n t h e p a c e m a k e rr e g i o n , w h e r e a s t h e a d d i t i o n o f I N a t o c u r v e e i n M o d e l I Is h i f t s t h e e q u i l i b r i u m p o i n t s l i g h t l y i n t h e p o s i t i v e d i r e c t i o nt o - 7 0 . 8 mV. I t a l s o i n t r o d u c e s a s e c o n d i n t e r s e c t i o n o f t h eI V w i t h t h e v o l t a g e a x i s a t V = - 6 6 . 7 mV ( i n s e t o f F i g .1 B ) . T h a t i s , I N a c o n t r i b u t e s a n i n w a r d c u r r e n t t o t h es t e a d y s t a t e I V i n t h e r a n g e o f p a c e m a k e r p o t e n t i a l sp o s i t i v e t o -70 mV. T h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m o f t h i sc u r r e n t i s a s l i g h t o v e r l a p b e t w e e n t h e a c t i v a t i o n c u r v e o ft h e I N a c h a n n e l , m . , a n d t h e i n a c t i v a t i o n c u r v e , h o . T h i ss o - c a l l e d " w i n d o w c u r r e n t " ( A t t w e l l e t a l . , 1 9 7 9 ) c o n t r i b -u t e s t o t h e r e g i o n o f n e g a t i v e s l o p e i n t h e s t e a d y s t a t e I V ,b e c a u s e m 2 3 k h . i s a n i n c r e a s i n g f u n c t i o n o f p o t e n t i a l i n t h ep a c e m a k e r v o l t a g e r a n g e a n d t h e d r i v i n g f o r c e f o r s o d i u mi o n s (V - E N a ; E N a = +40 mV) i s i n w a r d f o r p o t e n t i a l s i nt h e p a c e m a k e r r a n g e . C o n s e q u e n t l y , t h e t o t a l c u r r e n t i s as i n g l e - h u m p e d f u n c t i o n o f p o t e n t i a l f o r -9 0 < V < -5 5mV t h a t m a k e s p o s s i b l e t h e e x i s t e n c e o f e i t h e r n o z e r o -c u r r e n t c r o s s i n g s o f t h e I V ( e q u i l i b r i u m p o i n t s ) i n t h ep a c e m a k e r v o l t a g e r a n g e ( M o d e l I ) o r t w o s u c h e q u i l i b -r i u m p o i n t s ( M o d e l I I , i n s e t o f F i g . 1 B ) . T h e I V c o u l d a l s oj u s t t o u c h t h e v o l t a g e a x i s , t h e r e b y g i v i n g o n e e q u i l i b r i u mp o i n t ( b i f u r c a t i o n c o n d i t i o n ) . T h e r e i s a l s o a n a d d i t i o n a lz e r o c r o s s i n g i n b o t h m o d e l s a t V -25 m V , w h i c h i s n o t

B I O P H Y S I C A L J O U R N A L VOLUME 4 5 1 9 8 40 2


5/16

s h o w n i n F i g . 1 . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n M o d e l I a n d I Ic o n c e r n i n g t h e n u m b e r o f e q u i l i b r i u m p o i n t s i s o f c r i t i c a ls i g n i f i c a n c e f o r o u r f i n a l c o n c l u s i o n ( D i s c u s s i o n ) .

P h a s e R e s e t t i n g o f M o d e l IE x p e r i m e n t a l r e c o r d s o f p h a s e r e s e t t i n g a r e s h o w n i n t h el e f t - h a n d p a n e l o f F i g . 2 f o r a n a g g r e g a t e h a v i n g a nu n p e r t u r b e d i n t e r b e a t i n t e r v a l ( I B I O ) o f - 0 . 5 s , w h i c h i sn e a r t h e l o w e r e n d o f t h e e x p e r i m e n t a l r a n g e o f I B I O . T h eq u a l i t a t i v e f e a t u r e s o f t h e d y n a m i c s d i s p l a y e d b y t h i sa g g r e g a t e i n r e s p o n s e t o d e p o l a r i z i n g p u l s e s w e r e s i m i l a r t ot h o s e o f 1 8 o t h e r p r e p a r a t i o n s w i t h v a l u e s o f I B I o r a n g i n gf r o m 4 5 0 t o 9 5 0 m s . I n 1 0 o f t h e s e p r e p a r a t i o n s a t l e a s t 5d i f f e r e n t l e v e l s o f c u r r e n t s t i m u l u s w e r e u s e d . C u r r e n tp u l s e s o f 2 0 - m s d u r a t i o n w e r e a p p l i e d a t v a r i o u s t i m e s( t s t i m ) i n t h e u n p e r t u r b e d c y c l e , a s i n d i c a t e d b y t h e s t i m u l u sa r t i f a c t . T h e a m p l i t u d e o f t h e p u l s e w a s 5 n A f o r t h er e c o r d s i n r o w A ; 8 n A f o r t h e r e c o r d s i n r o w B . T h e i n i t i a lt i m e , t s t i m = 0 , w a s a r b i t r a r i l y c h o s e n t o c o r r e s p o n d t o 0 mVo n t h e u p s t r o k e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l . When t h e p u l s e w a sa p p l i e d n e a r t o t h e t i m e o f o c c u r r e n c e o f t h e maximumd i a s t o l i c p o t e n t i a l ( M D P ) , t h e t i m e o f o c c u r r e n c e o f t h es u c c e e d i n g a c t i o n p o t e n t i a l ( I B I ) w a s d e l a y e d s l i g h t l y i nb o t h r o w A a n d B . As t s t i m w a s i n c r e a s e d , I B I i n c r e a s e d i n ag r a d u a l , c o n t i n u o u s m a n n e r f o r t h e l o w e r a m p l i t u d e s t i m u -l u s ( r o w A ) , a n d t h e n d e c r e a s e d c o n t i n u o u s l y t o v a l u e sb e l o w I B I O . T h e r e s u l t s f o r t h e h i g h e r a m p l i t u d e s t i m u l u s( r o w B ) e x h i b i t a n a b r u p t t r a n s i t i o n f r o m maximump r o l o n g a t i o n t o maximum s h o r t e n i n g o f I B I a t t s t i m 1 7 0m s .

2 ' t A .1 ' I DIM *A

0

- 2 0 o-20~~~~~6

F I G U R E 1 C u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n s ( I V ) ; A : M o d e l I ; B : M o d e l I I . ( a )S t e a d y s t a t e a m p l i t u d e o f t h e s u m o f I N . a a n d I K 2 w i t h s = 1 a t a l lp o t e n t i a l s . T h i s c u r v e i s t h e same f o r b o t h M o d e l I a n d M o d e l I I . ( b )S t e a d y s t a t e o f t h e su m o f ! N , b , a n d I K 2 w i t h s = 1 . T h i s c u r v e d i f f e r sf r o m M o d e l s I a n d I I b e c a u s e o f t h e d i f f e r e n t p a r a m e t e r s u s e d f o r I b .( M e t h o d s ) . ( c ) T o t a l s t e a d y s t a t e I V , t h a t i s , I N a + I K , + I b . , w i t h s a t i t sa p p r o p r i a t e s t e a d y s t a t e v a l u e f o r e a c h p o t e n t i a l . ( d ) S t e a d y s t a t ea m p l i t u d e o f I J g + I N . . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n c u r v e s c a n d d r e p r e s e n t st h e s t e a d y s t a t e a m p l i t u d e o f I K , . ( e ) S t e a d y s t a t e I V i n t h e a b s e n c e o f ' N a ,i . e . , I K , + I b . , w i t h s a t i t s a p p r o p r i a t e s t e a d y s t a t e v a l u e f o r e a c hp o t e n t i a l . T h i s c u r v e c o r r e s p o n d s t o a g g r e g a t e s t r e a t e d w i t h TTX ( R e -s u l t s ) . I n s e t o f p a n e l B : C u r v e c o f M o d e l I I w i t h t h e c u r r e n t a x i se x p a n d e d t o i l l u s t r a t e t h e e q u i l i b r i u m p o i n t s a t V I = - 7 0 . 8 mV a n d V 2 -- 6 6 . 7 m V . I n b o t h M o d e l s l a n d o f t h e r e i s a t h i r d e q u i l i b r i u m p o i n t a t V 3-25 m V .

E x p e r i n m e n t5 n A 8 n A

. 6

i - o ;1 1

t s i m = 1 3 01 5 0 j > L J1 6 0 i J1 7 0 _N_1 8 0sJ\LJ1 9 0ojJ2 1 0 AL

- N L - f ~f \ J I ~ -j J - \ 1 \ ~

M o d e l2 5 n A

1 SO1 5 5 - ~1 60 iN J >~1 7 0 v1 8 01 9 0 __2 1 0 A

4 0 n A

J 4yJ X " \

B

F I G U R E 2 P h a s e r e s e t t i n g f o r a p r e p a r a t i o n w i t h I B I c 0 . 5 s . L e f t - h a n dp a n e l s : e x p e r i m e n t a l r e c o r d i n g s f r o m a p r e p a r a t i o n h a v i n g a d i a m e t e r o f1 1 4 , m a n d a n I B I o o f 0 . 4 4 s . A d e p o l a r i z i n g p u l s e o f 2 0 - m s d u r a t i o n a n de i t h e r 5 n A ( r o w A ) o r 8 n A ( r o w B ) a m pl i t ud e w a s a p p l i e d s t a r t i n g a t t h et i m e s i n d i c a t e d t o t h e l e f t o f r o w A . T h e MDP o f t h e c o n t r o l i s -8 8 m V ,maximum o v e r s h o o t p o t e n t i a l i s + 2 5 mV. T h e p e r t u r b e d i n t e r b e a ti n t e r v a l ( I B I ) i s d e f i n e d a s t h e t i m e f r o m 0 mV o n t h e u p s t r o k e p h a s e o ft h e a c t i o n p o t e n t i a l p r e c e d i n g c u r r e n t i n j e c t i o n t o t h e c o r r e s p o n d i n g t i m eo f t h e 0 mV c r o s s i n g o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l s u b s e q u e n t t o t h e p u l s e .R i g h t - h a n d p a n e l s : s i m u l a t i o n s o f p h a s e r e s e t t i n g i n M o d e l I f o r a 2 0 - m sp u l s e o f 2 5 - n A ( r o w A ) o r 4 0 - n A ( r o w B ) a m p l i t u d e a p p l i e d a t t h e t i m e si n d i c a t e d t o t h e l e f t o f r o w A . T h e a c t i o n p o t e n t i a l s ( t h i n n e r s o l i d l i n e s )a r e e x p e r i m e n t a l r e c o r d i n g s t h a t w e r e g r a f t e d o n t o t h e s i m u l a t i o n c u r v e s( t h i c k e r s o l i d l i n e s ) .

S i m u l a t i o n s u s i n g M o d e l I , w h i c h i s a p p r o p r i a t e f o r a nI B I O o f - 0 . 5 s , a r e s h o w n i n t h e r i g h t - h a n d p a n e l o f F i g . 2 .T h e u n p e r t u r b e d m o d e l p a c e m a k e r i s s h o w n a b o v e b o t hp h a s e r e s e t t i n g p a n e l s . I n a l l o f t h e s e r e c o r d s t h e t h i c k s o l i dl i n e s c o r r e s p o n d t o t h e c o m p u t e r s i m u l a t i o n s . T h e a c t i o np o t e n t i a l s i n t h e s e r e c o r d s a r e e x p e r i m e n t a l r e c o r d s t h a tw e r e g r a f t e d o n t o t h e n u m e r i c a l l y s i m u l a t e d c u r v e s . T h i sp r o c e d u r e i s n e c e s s a r y , s i n c e we h a v e a t p r e s e n t o n l y ap a r t i a l m o d e l o f v o l t a g e c h a n g e s i n a g g r e g a t e s t h a t c o v e r so n l y t h e p a c e m a k e r r a n g e o f p o t e n t i a l s . N e v e r t h e l e s s , t h em o d e l p r o v i d e s a f a i t h f u l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e u n p e r -t u r b e d p a c e m a k e r a n d c a n b e u s e d t o i n v e s t i g a t e p h a s er e s e t t i n g f o r p a c e m a k e r p o t e n t i a l s . T h e u n p e r t u r b e d m o d e lr a p i d l y h y p e r p o l a r i z e s f r o m V = -70 mV, w h i c h i s t h ei n i t i a l c o n d i t i o n , t o a n MDP o f -93 m V , f o l l o w e d b y ag r a d u a l , n e a r l y l i n e a r p a c e m a k e r d e p o l a r i z a t i o n t o t h r e s h -o l d . T h e c u r r e n t p u l s e s t i m u l u s p r o d u c e s a s l i g h t i n c r e a s eo f I B I w h e n i t i s a p p l i e d c l o s e t o MDP. I t a l s o r e d u c e s I B I ,a s t s t i m i s i n c r e a s e d , i n a g r a d u a l w a y f o r a s m a l l p u l s e ( r o wA ) a n d i n a n a p p a r e n t l y d i s c o n t i n u o u s w a y f o r a l a r g e rp u l s e ( r o w B ) , i n a m a n n e r s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e de x p e r i m e n t a l l y . H o w e v e r , t h e r e a r e s o m e a p p a r e n t q u a n t i -t a t i v e d i s c r e p a n c i e s b e t w e e n t h e e x p e r i m e n t a n d t h e m o d -e l . F o r e x a m p l e , t h e s m a l l e r p u l s e a m p l i t u d e i n t h e m o d e l i s2 5 n A a n d t h e l a r g e r p u l s e i s 4 0 n A , a s c o m p a r e d w i t h 5a n d 8 n A i n t h e e x p e r i m e n t a l r e c o r d i n g s . T h i s i s b e c a u s et h e m o d e l i s f o r m u l a t e d a s s u m i n g a n a g g r e g a t e d i a m e t e r( D ) o f 2 0 0 , m . T h e p r e p a r a t i o n o f F i g . 2 h a d a d i a m e t e r o f1 1 4 g m . S i n c e t h e m e m b r a n e a r e a o f a n a g g r e g a t e s c a l e s

CLAY E T A L . P h a s e R e s e t t i n g o f H e a r t C e l l A c t i v i t y 7 0 3


6/16

w i t h D 3 ( C l a y e t a l . , 1 9 7 9 ) , t h e m o d e l c u r r e n t s o f 2 5 n Aa n d 4 0 n A f o r a 2 0 0 , t m d i a m a g g r e g a t e a c t u a l l y c o r r e -s p o n d t o c u r r e n t s o f 4 . 6 a n d 7 . 4 n A , r e s p e c t i v e l y , f o r a 1 1 4, g m d i a m a g g r e g a t e . H o w e v e r , t h e maximum p r o l o n g a t i o no f I B I i n t h e m o d e l f o r t h e 4 0 n A p u l s e i s o n l y 3% g r e a t e rt h a n I B I O , w h e r e a s t h e e x p e r i m e n t a l v a l u e o f I B I h a s am a x i m a l v a l u e t h a t i s 25% g r e a t e r t h a n I B I O f o r t h e 8 n Ap u l s e a m p l i t u d e . T h e m o d e l d o e s s u c c e s s f u l l y m i m i c t h et r a n s i t i o n f r o m a c o n t i n u o u s t o a n a p p a r e n t l y d i s c o n t i n -u o u s I B I v s . t s t i m r e l a t i o n a s t h e p u l s e a m p l i t u d e i si n c r e a s e d . T h i s p o i n t i s f u r t h e r i l l u s t r a t e d b y t h e n o r m a l -i z e d p h a s e r e s e t t i n g c u r v e s s h o w n i n F i g . 3 b o t h f o r t h ee x p e r i m e n t o f F i g . 2 a n d f o r M o d e l I . T h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t s i n p a n e l A o f F i g . 3 a l s o i l l u s t r a t e t h a t t h e r e i s o n l y as m a l l e f f e c t o n I B I o f a 5 - 8 - n A c u r r e n t p u l s e a p p l i e dd u r i n g t h e p l a t e a u p h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l . T h ec a l c u l a t i o n s i n p a n e l B o f F i g . 3 i l l u s t r a t e p h a s e r e s e t t i n go n a f i n e r t i m e s c a l e t h a n w a s u s e d i n F i g . 2 o r F i g . 3 A .I n c r e m e n t s i n t s t i m o f 0 . 5 ms w e r e u s e d f o r b o t h t h e 2 5 n A( c u r v e a ) a n d t h e 4 0 n A s i m u l a t i o n s ( c u r v e b ) , e x c e p t f o rt h e c r i t i c a l r e g i o n o f c u r v e b f o r w h i c h 1 0 - , u s i n c r e m e n t sw e r e u s e d . T h e p o i n t s m e r g e t o g e t h e r t o g i v e t h e a p p e a r -a n c e o f a c o n t i n u o u s , s o l i d l i n e f o r c u r v e a . C u r v e b i s a l s oc o n t i n u o u s , a l t h o u g h t h e c o n t i n u i t y i s a p p a r e n t o n l y w h e n1 0 , u s o r s m a l l e r i n c r e m e n t s i n t s t i m a r e u s e d i n t h e c r i t i c a lr e g i o n ( t s t i m 1 5 8 m s ) . T h u s , M o d e l I h a s r e s e t t i n gb e h a v i o r t h a t i s c o n t i n u o u s a t e a c h o f t h e t w o c u r r e n t - p u l s ea m p l i t u d e s . I t i s d i f f i c u l t , i f n o t i m p o s s i b l e , t o s a y w h e t h e ro r n o t t h e e x p e r i m e n t a l r e s p o n s e a t h i g h e r t h a n 8 n A i sc o n t i n u o u s ( D i s c u s s i o n ) .T h e m o d e l r e s u l t s i n F i g s . 2 a n d 3 a r e f u r t h e r a m p l i f i e db y t h e c u r r e n t - v o l t a g e t r a j e c t o r i e s s h o w n i n F i g . 4 . T h e s ec u r v e s w e r e o b t a i n e d b y p l o t t i n g t h e t o t a l m e m b r a n e i o n i cc u r r e n t , I K 2 + I b g + I N a + I X . a s a f u n c t i o n o f m e m b r a n ep o t e n t i a l . T h e s o l i d l i n e t h a t s u r r o u n d s a l l o f t h e o t h e rc u r v e s i n b o t h F i g . 4 A a n d B r e p r e s e n t s t h e u n p e r t u r b e dt r a j e c t o r y . T h i s t r a j e c t o r y i s p a r t o f t h e c o m p l e t e c u r r e n t -v o l t a g e c y c l e d u r i n g s p o n t a n e o u s a c t i v i t y . T h e s l i g h t b e n d

Sn A

*1 . 0 _ h C3X 0 n. . . ' ' O S ~ 5 n A' S I / I w o 0 o

0 0 . 2 0 408.6 0 . 8* : t _ 5 g W

o f t h e c u r v e n e a r - 6 0 mV r e p r e s e n t s t h e i n i t i a l i n c r e a s e o fI N a a s s o c i a t e d w i t h t h e f a s t u p s t r o k e p h a s e o f t h e a c t i o np o t e n t i a l . T o r e p r e s e n t t h i s p a r t o f t h e c y c l e , t h e t r a j e c t o r yw o u l d b e c o n t i n u e d t o c u r r e n t - v o l t a g e p h a s e c o o r d i n a t e s o fI J - 3 , 0 0 0 n A a n d V - 2 0 mV c o r r e s p o n d i n g t o V m a x1 5 0 V / s . T h e p h a s e p o i n t w o u l d t h e n r e t u r n t o I = 0 a t V t+ 3 0 m V , w h i c h i s t h e m a x i m a l o v e r s h o o t p o t e n t i a l . I tw o u l d t h e n m o v e u p w a r d s a n d t o t h e l e f t , r e a c h i n g amaximum o u t w a r d c u r r e n t o f a b o u t 8 0 n A a t a p p r o x i -m a t e l y - 60 m V, w h i c h c o r r e s p o n d s t o V m a x o n t h e r e p o l a r -i z a t i o n p h a s e . T h e i n i t i a l p o i n t o f o u r s i m u l a t i o n s ( V =-70 mV) i s c l o s e t o t h i s V m a x p h a s e p o i n t d u r i n g r e p o l a r i -z a t i o n . T h e o t h e r l i n e s i n F i g . 4 c o r r e s p o n d t o t r a j e c t o r i e sd u r i n g c u r r e n t - p u l s e p e r t u r b a t i o n s ( d o t t e d l i n e s ) a n d a f t e rt e r m i n a t i o n o f t h e c u r r e n t p u l s e s ( s o l i d l i n e s ) . T h e s e r e s u l t sd e m o n s t r a t e t h a t t h e p a t h s f o l l o w e d b y t h e t r a j e c t o r i e s a r eq u a l i t a t i v e l y s i m i l a r f o r b o t h t h e 2 5 - a n d 4 0 - n A p u l s ea m p l i t u d e s .

R e l a t i o n s h i p o f N o r m a l P a c e m a k i n g t oI o n i c C u r r e n t s i n M o d e l IT h e i n d i v i d u a l c o n t r i b u t i o n s o f I x , I N a , I b g , a n d I K 2 t o t h ee v o l u t i o n o f t h e m e m b r a n e v o l t a g e d u r i n g u n p e r t u r b e da c t i v i t y ( F i g s . 2 a n d 4 ) a r e i l l u s t r a t e d i n F i g . 5 A . T h ei n i t i a l h y p e r p o l a r i z i n g p h a s e o f t h e c o n t r o l s i m u l a t i o n f r o m-70 t o -93 mV i s m a i n l y d u e t o t h e o u t w a r d I x c u r r e n t( t o p p a n e l o f F i g . 5 A ) . T h e m i d d l e p a n e l o f F i g . 6 s h o w st h a t T X i s v e r y s m a l l d u r i n g t h i s p h a s e . T h e f i r s t p a r t o fp a c e m a k e r d e p o l a r i z a t i o n f r o m 1 6 0 t o 3 5 0 ms i s a s s o c i a t e dw i t h c h a n g e s i n I K 2 a n d I b g , w i t h l i t t l e c h a n g e i n e i t h e r I x o rI N a . T h e sum o f t h e f o r m e r p a i r o f c o m p o n e n t s i s i n w a r d ,a l t h o u g h t h e y v e r y n e a r l y b a l a n c e o n e a n o t h e r s o t h a t t h e i rn e t e f f e c t i s r e l a t i v e l y s m a l l . T h i s r e s u l t i s a l s o a p p a r e n tf r o m t h e c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n s i n F i g . 1 A . T h e I b gc o m p o n e n t b e t w e e n -90 a n d -70 mV ( c u r v e d o f F i g .1 A ) i s i n w a r d . I t s I V h a s a p o s i t i v e s l o p e a n d i s a ni n s t a n t a n e o u s f u n c t i o n o f p o t e n t i a l . C o n s e q u e n t l y , t h e

r a

I _ I I I I0 Q2 0 - 4A DA

F I G U R E 3 P h a s e r e s e t t i n g c u r v e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e r e s u l t s o f F i g . 2 . L e f t - h a n d p a n e l : n o r m a l i z e d i n t e r b e a t i n t e r v a l ( I B I / I B I ) a s af u n c t i o n o f t h e r e l a t i v e t i m e i n t h e u n p e r t u r b e d c y c l e o f s t i m u l u s i n j e c t i o n ( t . t i m / I B I o ) f o r t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f F i g . 2 . P u l s e a m p l i t u d ew a s e i t h e r 5 n A ( o ) o r 8 n A ( 0 ) . R i g h t - h a n d p a n e l : p h a s e r e s e t t i n g o f M o d e l I f o r ( a ) 2 5 - n A o r ( b ) 4 0 - n A p u l s e s . T h e i n c r e m e n t i s t , 4 b m f o r c u r v ea w a s 0 . 5 m s . T h e s e r e s u l t s m e r g e t o g i v e t h e a p p e a r a n c e o f a c o n t i n u o u s c u r v e . T h e i n c r e m e n t i n t , i m f o r c u r v e s b w a s a l s o 0 . 5 m s , e x c e p t i n t h ec r i t i c a l r e g i o n f o r w h i c h a n i n c r e m e n t o f 1 0 , A s w a s u s e d .

B I O P H Y S I C A L JOURNAL V O L UME 4 5 1 9 8 47 0 4


7/16

SO A

-9 0 -80 - 7 0 -60mV

I- 9 0 -80 -70 -60

m VF I G U R E 4 C u r r e n t - v o l t a g e t r a j e c t o r i e s f o r M o d e l I . L e f t - h a n d p a n e l : 2 5 - n A c u r r e n t p u l s e s . R i g h t - h a n d p a n e l : 4 0 - n A c u r r e n t p u l s e s . T h eo u t e r m o s t s o l i d curve i n b o t h p a n e l s c o r r e s p o n d s t o t h e u n p e r t u r b e d t r a j e c t o r y , a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . T h e t i m e o f i n i t i a t i o n o f e a c h p u l s e i si n d i c a t e d a l o n g s i d e t h e u n p e r t u r b e d t r a j e c t o r y . T h e d o t t e d l i n e s ( . . . ) s h o w t h e t r a j e c t o r y d u r i n g c u r r e n t i n j e c t i o n . T h e s o l i d l i n e ( )b e g i n n i n g a t t h e e n d o f e a c h o f t h e d o t t e d l i n e s c o r r e s p o n d s t o t h e t r a j e c t o r y f o l l o w i n g t e r m i n a t i o n o f c u r r e n t i n j e c t i o n . T h e a r r o w s s h o w t h ed i r e c t i o n o f i n c r e a s i n g t i m e .

a m p l i t u d e o f I b g a t a n y g i v e n t i m e ca n b e r e a d d i r e c t l y f r o mi t s I V curve. A t - 70 m V, i t i s r e l a t i v e l y s m a l l , a n d a t -93mV i t i s r e l a t i v e l y l a r g e . T h e r e f o r e , i t s m a g n i t u d e r a p i d l yi n c r e a s e s d u r i n g t h e i n i t i a l p h a s e o f t h e s i m u l a t i o n ( F i g .5 A ) , b e c a u s e t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l r a p i d l y h y p e r p o l a r -i z e s t o w a r d MDP. I t s u b s e q u e n t l y d i m i n i s h e s i n a m p l i t u d ed u r i n g t h e p a c e m a k e r p h a s e , as t h e p o t e n t i a l s l o w l y d e p o -l a r i z e s t o w a r d t h r e s h o l d . T h e a m p l i t u d e o f I K 2 u s u a l l yc a n n o t b e r e a d d i r e c t l y f r o m i t s I V c u r v e , b e c a u s e i t i s n o ta n i n s t a n t a n e o u s f u n c t i o n o f p o t e n t i a l . T h e a c t i v a t i o n o f I K 2c h a n n e l s i s v o l t a g e a n d t i m e d e p e n d e n t ( M e t h o ds ) . T h e I K ,a c t i v a t i o n p a r a m e t e r , s , i s -0 i n s t e a d y s t a t e c o n d i t i o n s a tV =-93 mV, a l t h o u g h t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l d o e s n o tr e m a i n near V =-90 mV s u f f i c i e n t l y l o n g , r e l a t i v e t o r s ,t o e n a b l e s ( d a s h e d l i n e i n m i d d l e p a n e l o f F i g . 6 A ) t or e a c h i t s s t e a d y s t a t e v a l u e . T h e r s p a r a m e t e r w i t h t h e

m- S.

m.. . .i. .tEl.v

T - 4 - -

s p e c i f i c f o r m s o f a , a n d 3, g i v e n i n E q s . 3 a n d 4 i s ab e l l - s h a p e d , i n s t a n t a n e o u s f u n c t i o n o f a p o t e n t i a l h a v i n g amaximum v a l u e o f 1 . 2 s a t V -79 mV. A t V =-93 mV,T S = . 7 s , a t V=-70mV,Ts = 0 . 6 s , a n d a t V= - 6 0 m V ,r s = . 2 s . C o n s e q u e n t l y , r s r a p i d l y i n c r e a s e s f r o m 0 . 6 s a tt h e b e g i n n i n g o f t h e s i m u l a t i o n u p t o 1 . 2 s b y t = 1 5 5 msa n d t h e n b a c k d o w n t o 0 . 7 s a t MDP ( d a s h e d l i n e i n m i d d l ep a n e l o f F i g . 6 A ) . T h e t i m e n e e d e d f o r t h i s i n i t i a l h y p e r p o -l a r i z a t i o n t o MDP t o t a k e p l a c e ( - 1 0 m s ) i s s i g n i f i c a n t l yl e s s t h a n a n y o f t h e v a l u e s o f T s , w h i c h t h e m e m b r a n e scansas i t m o ves f r o m -70 t o -93 mV. T h e r e f o r e , s c h a n g e svery l i t t l e f r o m i t s i n i t i a l v a l u e ( s =1 ) t h r o u g h o u t t h i sp h a s e , - a s i l l u s t r a t e d b y t h e d a s h e d l i n e i n t h e t o p p a n e l o fF i g . 6 A . E i u r i n g p a c e m a k e r d e p o l a r i z a t i o n t h e m e m b r a n ed e p o l a r i z e s from- 9 3 t o -60 mV i n - 3 5 0 m s . T h r o u g h o u tt h e f i r s t p a r t o f t h i s p r o c e s s , u p u n t i l t 3 7 5 m s , t h e

UwA

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f .

'IM~~F I G U R E 5 T h e t i m e cou rse o f t h e c u r r e n t s I x . I K 2 , I b 8 . a n d I N a d u r i n g p a c e m a k i n g ( A ) , a n d p h a s e r e s e t t i n g (B-D) i n Model I , a s d e s c r i b e d i nt h e t e x t . T h e tw o b o t t o m p a n e l s r e p r e s e n t t h e c u r r e n t p u l s e a n d t h e v o l t a g e c h a n g e s d u r i n g t h e p a c e m a k e r process.

C L A Y E T A L . P h a s e R e s e t t i n g o f H e a r t C e l l A c t i v i t y

6 0n A

40

2 6

0

- 2 0 ' _ _ _ _ _I ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

% 6

7 0 5


8/16

A C o n t r l

- 5 0

250 350 450

C . 40 n A

I -

i .I - 1

K [ .. ..

. : . . I . . . .*I *I a-o uO . - - , 4 .

* L i . . : . Y.. ...

2 5 3 1 5 0 2S0 .0 - . 'mI mg

F I G U R E 6 T i m e cou rse o f s , s, rs , a n d r T d u r i n g p a c e m a k i n g ( A ) a n d p h a s e r e s e t t i n g ( B - D ) i n M o d e l I . T h e two b o t t o m r o w s o f p a n e l sr e p r e s e n t t h e c u r r e n t s t i m u l u s a n d t h e p a c e m a k e r v o l t a g e c h a n g e s .

p o t e n t i a l l i e s i n a r an ge w h e r e s - ( t h e s t e a d y s t a t e v a l u eo f s ) i s l e s s t h a n s ( t ) ( i t s i n s t a n t a n e o u s v a l u e ) . C o n s e -q u e n t l y , s d i m i n i s h e s s o m e w h a t f r o m i t s i n i t i a l v a l u e .T h r o u g h o u t t h e l a t t e r p a r t o f p a c e m a k i n g ( t > 3 7 5 m s ) , s -i s g r e a t e r t h a n s ( t ) . T h e r e f o r e , t h e s ( t ) curve b e n d s b a c k u pt o w a r d s = 1 ( d a s h e d l i n e i n t o p p a n e l o f F i g . 6 A ) .H o w e v e r , t h e d u r a t i o n o f t h e p a c e m a k e r p h a s e i n M o d e l Ii s s i g n i f i c a n t l y l e s s t h a n r , a t a l m o s t a l l m e m b r a n e p o t e n -t i a l s . C o n s e q u e n t l y , t h e o v e r a l l c h a n g e i n s f r o m i t s i n i t i a lv a l u e i s r e l a t i v e l y s m a l l . I t s minimum v a l u e i s 0 . 8 6 , w h i c hoccurs a t - t c 3 7 5 m s . I n o t h e r w o r d s , t h e p a c e m a k e rv o l t a g e c h a n g e i n M o d e l I i s so r a p i d t h a t t h e I K 2 k i n e t i c sc h a n g e very l i t t l e . A l l o f t h e I K 2 c h a n n e l s ar e i n i t i a l l y opena t V =-70 mV, a n d most o f t h e m r e m a i n open t h r o u g h -o u t t h e s u b s e q u e n t v o l t a g e c h a n g e s . C o n s e q u e n t l y , t h ea m p l i t u d e o f I K 2 ca n e s s e n t i a l l y b e r e a d f r o m i t s I V curve( g i v e n c l o s e l y b y curve a o f F i g . 1 A ) . T h a t i s , I K 2 i Sr e l a t i v e l y s m a l l i n m a g n i t u d e a t V = -7 0 mV, even t h o u g hs = 1 , b e c a u s e o f t h e r e c t i f i c a t i o n o f I K , c h a n n e l s d e s c r i b e db y f K , ( V ) ( M e t h od s ) . T h e c h a n g e i n I K 2 w i t h t i m e i sr o u g h l y m i r r o r s y m m e t r i c w i t h t h a t o f I b g , a n d I K 2 + I b g i Sa p p r o x i m a t e l y c o n s t a n t t h r o u g h o u t p a c e m a k i n g ( m i d d l ep a n e l o f F i g . 5 A ) . T h i s r e s u l t u n d e r l i e s t h e e x p e r i m e n t a la n d n u m e r i c a l o b s e r v a t i o n s t h a t t h e p a c e m a k e r v o l t a g ec h a n g e i s a p p r o x i m a t e l y a l i n e a r f u n c t i o n o f t i m e ( s e ec o n t r o l t r a c i n g s o f F i g . 2 A ) . The I N a c o m p o n e n t ( b o t t o mp a n e l o f F i g . 5 A ) i s a s s o c i a t e d w i t h t h e r a p i d u p s t r o k ep h a s e o f t h e a c t i o n p o t e n t i a l . H o w e v e r , t h i s c o m p o n e n ta l s o m a k e s a n i n c r e a s i n g l y i m p o r t a n t c o n t r i b u t i o n t o t h el a t t e r p a r t o f p a c e m a k i n g , as i l l u s t r a t e d b y t h e I N a ( t ) cu rveo f F i g . 5 A .T h e a n a l y s i s o f t h i s s e c t i o n i s f u r t h e r i l l u s t r a t e d b y F i g .

7 A , w h i c h c o n t a i n s a p a r t o f t h e c o n t r o l t r a j e c t o r y o f F i g .4 A a n d B o n a n e x p a n d e d o r d i n a t e s c a l e t o g e t h e r w i t h t h eI N a + I K 2 + I b g c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n w i t h s s e t t o i t sminimum v a l u e 0 . 8 6 a t a l l p o t e n t i a l s ( d a s h e d l i n e ) . T h ei n i t i a l p h a s e o f t h e t r a j e c t o r y f r o m 0 t o -4 n A i s a s s o c i a t e dw i t h t h e c l o s i n g o f I x c h a n n e l s . T h e r e s t o f t h e t r a j e c t o r yc l o s e l y f o l l o w s t h e s =0 . 8 6 I V curve. T h e s l i g h t d e v i a t i o no f t h i s cu rve f r o m t h e s = 0 . 8 6 I V r e l a t i o n b e t w e e n -92a n d -8 0 mV i s d u e t o t h e f a c t t h a t s i s s l i g h t l y > 0 . 8 6d u r i n g t h i s p a r t o f t h e p a c e m a k e r p r o c e s s .

A C o n t r o l 40 n A t s t i n = 150 msn A

mV m V

F I G U R E 7 R e l a t i o n s h i p o f t r a j e c t o r i e s i n Model I t o t h e IV a p p r o p r i a t et o t h e minimum v a l u e o f s f o r e a c h o f t h e s i m u l a t i o n c o n d i t i o n s i n F i g s . 5a n d 6 . The l o w e r d a s h e d curve i n e a c h p a n e l c o r r e s p o n d t o I b g + I N a + I K 2w i t h t h e s p a r a m e t e r s e t a t t h e v a l u e s h o w n t h r o u g h o u t e a c h s i m u l a t i o n .Th e d a s h e d p o r t i o n o f t h e t r a j e c t o r i e s i n C an d D occur d u r i n g c u r r e n t -p u l s e i n j e c t i o n .


7 r . t o lI s . .M M s

j i- -,

7 0 6


9/16

R e l a t i o n s h i p o f P h a s e R e s e t t i n g t o I o n i cC u r r e n t s i n M o d e l I

T h e t i m e c o u r s e o f I x , I K 2 , b g , a n d I N a d u r i n g p h a s e r e s e t t i n gi s i l l u s t r a t e d i n F i g s . 5 B-D f o r a 4 0 - n A p u l s e a t t , t i m = 1 5 0m s , a 4 0 - n A p u l s e a t t s , i m = 1 6 0 m s , a n d a 2 5 - n A p u l s e a tt s t i m = 1 60 m s , r e s p e c t i v e l y . T h e e f f e c t o f t h e 4 0 - n A p u l s ea t t s t i m = 1 5 0 ms i s t o c o u n t e r b a l a n c e t h e o u t w a r d c u r r e n tt h r o u g h t h e 1 x c h a n n e l s . C o n s e q u e n t l y , d u r i n g t h e i n i t i a lp h a s e o f c u r r e n t i n j e c t i o n t h e r a t e o f h y p e r p o l a r i z a t i o n i sr e d u c e d , s i n c e t h e I x c h a n n e l s d e a c t i v a t e m o r e s l o w l y . T h eT X t i m e c o u r s e i s i l l u s t r a t e d i n t h e m i d d l e p a n e l o f F i g . 6 B .T h i s p a r a m e t e r i n c r e a s e s d u r i n g t h e l a t t e r p a r t o f t h e p u l s eb e c a u s e t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l b e g i n s t o d e p o l a r i z e d u r -i n g t h i s t i m e p e r i o d ( b o t t o m p a n e l o f F i g . 6 B ) . H o w e v e r ,b y t h e e n d o f t h e c u r r e n t i n j e c t i o n a t t = 1 7 0 m s , e n o u g h I xc h a n n e l s a r e s t i l l o p e n s o t h a t t h e n e t c u r r e n t i s o u t w a r da n d t h e m e m b r a n e o n c e a g a i n b e g i n s t o h y p e r p o l a r i z e .T h i s h y p e r p o l a r i z i n g p h a s e i s m o r e g r a d u a l t h a n i n t h ec o n t r o l b e c a u s e o f t h e i n c r e a s e i n T x d u r i n g a n d f o l l o w i n gt h e p u l s e ( F i g s . 6 A a n d B ) . T h e r e f o r e , t h e o v e r a l l e f f e c t o ft h e p u l s e i s t o g i v e a m o r e r o u n d e d a p p e a r a n c e t o V ( t ) n e a rMDP. T h i s r e s u l t i s e v i d e n t i n r o w B o f F i g . 2 f o r b o t h t h ee x p e r i m e n t a l ( t s t i m = 1 3 0 m s ) a n d t h e t h e o r e t i c a l r e s u l t s( t s t i m = 1 5 0 m s ) . T h e p u l s e a l s o a f f e c t s t h e b a l a n c e b e t w e e nI K 2 a n d I b g ( F i g . 5 B ) . T h e d e p o l a r i z i n g e f f e c t o f t h e p u l s ec a u s e s t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l t o l i e i n a r a n g e w h e r e t h em a g n i t u d e o f t h e s u m o f I K 2 a n d I b g i s s m a l l e r t h a n i nc o n t r o l . T h e m a g n i t u d e o f t h e s l o p e o f I b g f o r V - 9 0 mVi s g r e a t e r t h a n t h e s l o p e o f t h e f u l l y a c t i v a t e d I K 2 c u r r e n t -v o l t a g e r e l a t i o n f o r V < -90 mV ( F i g . 1 A ; c u r v e d v s .c u r v e a ) . I n o t h e r w o r d s , t h e m a g n i t u d e o f I K 2 + I b g i sg r e a t e r a t -90 mV t h a n a t -80 m V , a s i s a p p a r e n t f r o mc u r v e b i n F i g . 1 A . S i n c e t h e m e m b r a n e p o t e n t i a l i sd e p o l a r i z e d b y t h e p u l s e r e l a t i v e t o c o n t r o l , t h e a m p l i t u d eo f I K 2 + I b g i s r e d u c e d . T h e p u l s e a l s o p r o d u c e s a s u b t l ee f f e c t o n t h e s ( t ) c u r v e ( d a s h e d l i n e i n t h e t o p p a n e l o f F i g .6 B ) . I t s d e p o l a r i z i n g e f f e c t c a u s e s t h e m e m b r a n e p o t e n t i a lt o l i e i n a r a n g e w h e r e T , i s > 1 s b o t h d u r i n g a n d a f t e r p u l s ea p p l i c a t i o n ( F i g . 6 B ) . C o n s e q u e n t l y , t h e s p a r a m e t e rc h a n g e s a l i t t l e b i t m o r e s l o w l y t h a n i t d o e s i n c o n t r o l ,r e a c h i n g a m i n i m u m v a l u e o f 0 . 8 8 r a t h e r t h a n 0 . 8 6 . T h esum o f I K , + I b g i s t h e r e b y r e d u c e d e v e n f u r t h e r b y t h i se f f e c t , w h i c h p e r s i s t s t h r o u g h o u t a l m o s t t h e e n t i r e p a c e -m a k e r p h a s e . I n o t h e r w o r d s , t h e c u r r e n t p u l s e e f f e c t i v e l yr e s e t s t h e s l o p e o f p a c e m a k e r d e p o l a r i z a t i o n t o a s m a l l e rv a l u e t h r o u g h a c o m b i n a t i o n o f e f f e c t s d u e t o I x , I K 2 a n dI b g . T h e t a t i m = 1 5 0 ms r e s u l t s i n r o w B o f b o t h t h ee x p e r i m e n t a l a n d s i m u l a t e d r e c o r d s i n F i g . 2 d i s p l a y t h i se f f e c t . F i g . 7 B a g a i n i l l u s t r a t e s t h a t t h e p e r t u r b e d t r a j e c -t o r y c l o s e l y f o l l o w s t h e I V c u r v e a p p r o p r i a t e f o r s = 0 . 8 8d u r i n g t h e l a t e r p a r t o f d i a s t o l i c d e p o l a r i z a t i o n .T h e a b o v e a n a l y s i s d e m o n s t r a t e s t h a t p r o l o n g a t i o n o fI B I b y a d e p o l a r i z i n g p u l s e a p p l i e d r e l a t i v e l y e a r l y i n t h eu n p e r t u r b e d c y c l e i s p r o d u c e d b y a s l o w i n g o f I x k i n e t i c sa n d b y a d e c r e a s e i n t h e s l o p e o f p a c e m a k e r d e p o l a r i z a t i o n

d u e t o c h a n g e s i n I K , a n d I b g . H o w e v e r , b o t h e f f e c t s a r eo f f s e t t o s o m e e x t e n t b y t h e d e p o l a r i z i n g e f f e c t o f t h e p u l s ei t s e l f , w h i c h a c t i v a t e s I N a m o r e t h a n i n t h e c o n t r o l a n dt e n d s t o t a k e t h e m e m b r a n e t o t h r e s h o l d m o r e r a p i d l y t h a ni n t h e c o n t r o l .F o r a 4 0 - n A s t i m u l u s i n j e c t e d a t t a t i m = 1 6 0 m s , o r a tl a t e r t i m e s , t h r e s h o l d i s r e a c h e d m o r e r a p i d l y t h a n i n t h ec o n t r o l . T h i s i s b e c a u s e t h e n e t h y p e r p o l a r i z i n g c u r r e n t ,c a r r i e d b y I , , a t t , , i m 2 1 6 0 ms i s l e s s t h a n 4 0 n A .C o n s e q u e n t l y , t h r o u g h o u t t h e e n t i r e d u r a t i o n o f t h e p u l s e ,t h e r e i s a n e t d e p o l a r i z i n g c u r r e n t g i v e n a p p r o x i m a t e l y b yt h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e i n s t a n t a n e o u s v a l u e o f I x a n dt h e i n j e c t e d s t i m u l u s o f 4 0 n A. T h e r e s u l t i s a m o r e r a p i dr a t e o f m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n t h a n i n c o n t r o l a n d as i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n I B I . T h e t r a j e c t o r y f o r t h e s ec o n d i t i o n s w i t h s = 0 . 9 8 i s i l l u s t r a t e d i n F i g . 7 C . T h i sv a l u e o f 0 . 9 8 i s t h e minimum v a l u e o f s d u r i n g t h es i m u l a t i o n s i m p l y b e c a u s e t h e t i m e t o t h r e s h o l d i s v e r ys m a l l i n c o m p a r i s o n t o T a T h e t r a j e c t o r y i s s h o w n a s ad a s h e d l i n e t o e m p h a s i z e t h a t t h e c u r r e n t p u l s e i s b e i n ga p p l i e d . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t r a j e c t o r y a n d t h e I V

c u r v e r e p r e s e n t s t h e c o n t r i b u t i o n o f I x .T h e e f f e c t o f a d e p o l a r i z i n g p u l s e o n t h e t i m e c o u r s e o ft h e c u r r e n t s a t t s t i m 2 1 6 0 ms i s l e s s f o r a s ma l l e r p u l s ea m p l i t u d e . T h i s r e s u l t i s i l l u s t r a t e d i n F i g s . 5 D a n d 6 D f o ra 2 5 n A p u l s e a p p l i e d a t t s t i m = 1 6 0 m s . T h e a n a l y s i s f o rt h e s e c o n d i t i o n s i s s i m i l a r t o t h a t o f F i g s . 5 B a n d 6 B . T h ep u l s e s l o w s I x k i n e t i c s a n d i t r e s e t s t h e s ( t ) c u r v e s o t h a t sr e a c h e s a minimum o f 0 . 9 5 . N e v e r t h e l e s s , I B I i s r e d u c e d ,b e c a u s e t h e d e p o l a r i z i n g e f f e c t o f t h e p u l s e b r i n g s t h em e m b r a n e t o a p o t e n t i a l t h a t l i e s a b o u t h a l f w a y b e t w e e nMDP a n d t h r e s h o l d . S i n c e I N a i s n o t s i g n i f i c a n t l y a c t i v a t e da s a r e s u l t o f t h e p u l s e , t h e n e t e f f e c t i s t o s h i f t I K , + I b g i nt h e o u t w a r d d i r e c t i o n . T h u s t h e m e m b r a n e s u b s e q u e n t l yd e p o l a r i z e s t o t h r e s h o l d m o r e s l o w l y t h a n i n t h e c o n t r o l .H o w e v e r , s i n c e t h e r e i s a c o n s i d e r a b l y s m a l l e r r a n g e o fp o t e n t i a l t o c o v e r i n o r d e r t o a t t a i n t h r e s h o l d , t h e I B I i sr e d u c e d b e l o w t h e c o n t r o l v a l u e . T h e r e l a t i o n s h i p o f t h et r a j e c t o r y t o t h e I V a p p r o p r i a t e f o r s = 0 . 9 5 i s i l l u s t r a t e d i nF i g . 7 D .T h e a n a l y s i s o f t h i s s e c t i o n i l l u s t r a t e s t h a t a r e l a t i v e l yl a r g e p u l s e w o u l d d e p o l a r i z e t h e m e m b r a n e t o t h r e s h o l df o r t s t i m = 1 5 0 ms w e r e i t n o t f o r I . C o n s e q u e n t l y , t h et r a n s i t i o n a l r e g i o n b e t w e e n p r o l o n g a t i o n a n d s h o r t e n i n g o fI B I i s s h i f t e d t o e a r l i e r t i m e s i n t h e c y c l e a s p u l s e a m p l i -t u d e i s i n c r e a s e d . M o r e o v e r , t h e w i d t h o f t h e t r a n s i t i o n a lr e g i o n i s r e d u c e d f o r t h e l a r g e r p u l s e s b e c a u s e t h r e s h o l d i sr e a c h e d e a r l i e r .

P h a s e R e s e t t i n g o f Model I IE x p e r i m e n t a l r e c o r d s o f p h a s e r e s e t t i n g f r o m a p r e p a r a -t i o n h a v i n g a n I B I 0 > 1 s a r e s h o w n i n t h e l e f t - h a n d p a n e l o fF i g . 8 . T h e d i a m e t e r o f t h i s a g g r e g a t e w a s 1 7 1 g m . S i m i l a rb e h a v i o r w a s o b s e r v e d i n t w o o u t o f f o u r p r e p a r a t i o n ss t u d i e d t h a t h a d I B I O > 1 s . M o d e l I I i s a p p r o p r i a t e f o r

C L A Y E T A L . P h a s e R e s e t t i n g o f H e a r t C e l l A c t i v i t y 7 0 7


10/16

M o d e lC o n t r o l A - J \ ) -2 1 0 ms J l2 8 0 A2 9 0 AJ-J3 0 0 4 \ 43 1 0 J A

I sF I G U R E 8 P h a s e r e s e t t i n g o f a p r e p a r a t i o n h a v i n g an B l 0 >1 s . L e f t -h a n d p a n e l : e x p e r i m e n t a l r e c o r d s f r o m a n a g g r e g a t e h a v i n g a d i a m e t e r o f1 7 1 , u m a n d a n I B 1 O o f 1 . 1 s . MDP = -95 mV; maximum o v e r s h o o tp o t e n t i a l = +30 mV. A 2 0 - m s d u r a t i o n p u l s e o f 2 0 - n A a m p l i t u d e wasa p p l i e d a t t h e t i m e s i n d i c a t e d . R i g h t - h a n d p a n e l : s i m u l a t i o n s o f p h a s er e s e t t i n g o f M o d e l I I b y a 2 5 - n A p u l s e i n j e c t e d a t t h e t i m e s s h o w n . T h e s er e s u l t s were p r e p a r e d i n t h e same way as t h e m o d e l r e s u l t s i n F i g . 2 . T h et h i c k e r s o l i d l i n e s b e g i n n i n g a t -70 mV o n t h e r e p o l a r i z a t i o n o f t h e f i r s ta c t i o n p o t e n t i a l a n d e n d i n g a t -5 mV o n t h e r i s i n g p h a s e o f t h e s e c o n da c t i o n p o t e n t i a l c o r r e s p o n d t o t h e s i m u l a t i o n r e s u l t s . T h e a c t i o n p o t e n t i a l s( t h i n n e r l i n e s ) ar e e x p e r i m e n t a l t r a c e s g r a f t e d o n t o t h e s i m u l a t i o n c u r v e s .t h e s e s o m e w h a t s l o w e r b e a t i n g p r e p a r a t i o n s ; i t a l s o h a s a nI B 1 O > I s , as s h o w n b y t h e c o n t r o l s i m u l a t i o n i n t h er i g h t - h a n d p a n e l o f F i g . 8 . P e r t u r b a t i o n o f b o t h M o d e l IIa n d t h e c o r r e s p o n d i n g e x p e r i m e n t a l p r e p a r a t i o n r e v e a l e dp h a s e r e s e t t i n g c h a r a c t e r i s t i c s t h a t ar e s i m i l a r t o t h o s e o fM o d e l I f o r s m a l l p u l s e s b u t t h a t ar e f u n d a m e n t a l l yd i f f e r e n t f r o m t h e r e s u l t s i n M o d e l I f o r l a r g e r p u l s ea m p l i t u d e s . A 2 0 - n A d e p o l a r i z i n g p u l s e a p p l i e d t o t h ee x p e r i m e n t a l p r e p a r a t i o n a t t s t i m =4 9 0 ms a n d e a r l i e rp r o d u c e d s l i g h t p r o l o n g a t i o n s o f I B I c o m p a r a b l e w i t ht h o s e s h o w n i n F i g . 2 f o r a f a s t e r b e a t i n g a g g r e g a t e ( I B I O f0 . 5 s ) . H o w e v e r , a much more s u b s t a n t i a l p r o l o n g a t i o n o fI B I ( I B I / I B I O 2 . 8 ) was o b s e r v e d w h e n t h e p u l s e wasa p p l i e d a t t s , i m = 5 2 0 m s . T h i s l o n g p r o l o n g a t i o n wasa c c o m p a n i e d b y a s u b t h r e s h o l d o s c i l l a t o r y p h a s e i n t h em e m b r a n e p o t e n t i a l b e f o r e t h e s u c c e e d i n g a c t i o n p o t e n -t i a l . A 2 0 - n A p u l s e a p p l i e d 1 0 ms l a t e r d e l a y e d t h es u c c e e d i n g b e a t b y a p p r o x i m a t e l y o n e a n d o n e - h a l f c y c l e s( I B I / I B I O 2 . 4 ) . The membrane p o t e n t i a l d i d n o t e x h i b i ta s u b t h r e s h o l d o s c i l l a t i o n i n t h i s c a s e . I n t h e 1 9 f a s t e rb e a t i n g p r e p a r a t i o n s s t u d i e d , s u b t h r e s h o l d o s c i l l a t o r ya c t i v i t y w a s never o b s e r v e d . P h a s e r e s e t t i n g o f M o d e l IIw i t h a 2 5 - n A p u l s e , s h o w n i n t h e r i g h t - h a n d p a n e l o f F i g .8 , q u a l i t a t i v e l y m i m i c s most o f t h e f e a t u r e s i n t h e e x p e r i -m e n t a l r e c o r d s . S p e c i f i c a l l y , t h e I B I i s p r o l o n g e d f o rs t i m u l u s t i m e s r e l a t i v e l y e a r l y i n t h e c y c l e ; t h e a c t i o np o t e n t i a l i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g t h e p u l s e t h a t p r o d u c e dmaximum p r o l o n g a t i o n i s p r e c e d e d b y a s u b t h r e s h o l do s c i l l a t i o n ; a n d t h e r e i s an a b r u p t t r a n s i t i o n i n I B I b e t w e e nt s t i m = 2 9 0 a n d 3 0 0 m s . T h e r e ar e some d i s c r e p a n c i e sb e t w e e n t h e o r y a n d e x p e r i m e n t , most n o t a b l y i n t h e r e l a -t i v e t e m p o r a l p o s i t i o n i n t h e c y c l e o f t h i s t r a n s i t i o n a lr e g i o n . E x p e r i m e n t a l l y , t h e t r a n s i t i o n f r o m p r o l o n g a t i o n t os h o r t e n i n g o f I B I occurs near t h e m i d p o i n t o f t h e u n p e r -t u r b e d c y c l e , a b o u t two or t h r e e a c t i o n p o t e n t i a l d u r a t i o n s

r e m o v e d f r o m MDP. T h e t r a n s i t i o n i n t h e m o d e l o c c u r s-30% i n t o t h e c y c l e , a p p r o x i m a t e l y o n e a c t i o n p o t e n t i a ld u r a t i o n a f t e r MDP. T h i s r e s u l t i s n o t a n i n v a r i a n t p r e d i c -t i o n o f o u r t h e o r e t i c a l a n a l y s i s . I t d e p e n d s t o s o m e e x t e n tu p o n t h e a m p l i t u d e o f t h e c u r r e n t p u l s e . M o r e o v e r , t h et r a n s i t i o n p o i n t c a n b e s h i f t e d t o e i t h e r e a r l i e r o r l a t e rt i m e s i n t h e c y c l e b y m o d i fy i n g v a r i o u s m o d e l p a r a m e t e r s ,a l t h ou g h o u r e x p e r i e n c e h a s s u g g e s t e d t h a t i t c a n n o t b er e a d i l y s h i f t e d v e r y m u c h b e y o n d t h e 40% p o i n t , w h i c hw o u l d s t i l l b e s o m e w h a t a t o d d s w i t h t h e p r e p a r a t i o nr e p r e s e n t e d i n F i g . 8 . I n a n y c a s e , t h e m o d e l q u a l i t a t i v e l ym i m i c s t h e v o l t a g e c h a n g e s t h a t o c c u r s u b s e q u e n t t o p u l s ei n j e c t i o n .F i g . 9 p l o t s t h e p h a s e - r e s e t t i n g c u r v e s f o r M o d e l I I i nr e s p o n s e t o 1 5 - a n d 2 5 - n A p u l s e s , w i t h 1 - m s i n c r e m e n t s i nt s t i m . T h e c o m p u t e d p o i n t s f o r t h e 1 5 - n A p u l s e m e r g et o g e t h e r t o g i v e a c o n t i n u o u s c u r v e . T h e p h a s e - r e s e t t i n gc u r v e f o r t h e 2 5 - n A p u l s e i s a p p a r e n t l y d i s c o n t i n u o u s . T h i si s f u r t h e r i l l u s t r a t e d b y t h e p h a s e p l a n e a n a l y s i s d e s c r i b e di n F i g . 1 0 . T h e t w o p o i n t s i n F i g s . 1 0 B-D r e p r e s e n t e d b yt h e s y m b o l ( - ) , a n d l a b e l e d V , a n d V 2 , a r e t h e e q u i l i b r i u mp o i n t s o f t h e s t e a d y s t a t e c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n i n t h ep a c e m a k e r v o l t a g e r a n g e ( i n s e t o f F i g . 1 B ) . T h e t r a j e c t o -r i e s i n F i g . 1 0 A , B c o r r e s p o n d t o t h e u n p e r t u r b e d p a c e -m a k e r a n d t o t h e p e r t u r b a t i o n s p r o d u c e d b y a 1 5 - n Ac u r r e n t p u l s e a p p l i e d a t t h e t i m e s i n d i c a t e d o n t h e F i g u r e s .T h e s e t r a j e c t o r i e s a r e q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h o s e o fM o d e l I i n F i g . 4 . F o r e x a m p l e , t h e t r a j e c t o r y f o l l o w i n g ac u r r e n t p u l s e d e l i v e r e d a t a g i v e n t i m e l i e s t o t h e r i g h t o f at r a j e c t o r y f o l l o w i n g a c u r r e n t p u l s e d e l i v e r e d a t a n e a r l i e rt i m e . T h e 2 5 - n A p u l s e t r a j e c t o r i e s i n F i g s . 1 0 C a n d D a r ef u n d a m e n t a l l y d i f f e r e n t i n t h i s r e s p e c t . F i g . 1 0 C d e s c r i b e st r a j e c t o r i e s f o r a 2 5 n A p u l s e a p p l i e d a t t s t i m = 0 . 2 3 , 0 . 2 6 ,0 . 2 8 , o r 0 . 2 9 6 s ( s o l i d l i n e s ) o r a t t s t i m = 0 . 2 9 0 , 0 . 2 9 3 , 0 . 2 9 5s ( d o t t e d l i n e s ) . T h e t r a j e c t o r i e s d u r i n g c u r r e n t p u l s ei n j e c t i o n h a v e b e e n d e l e t e d f r o m F i g . 1 0 C . T h e d o t t e dl i n e s i n t h i s c a s e c o r r e s p o n d t o t r a j e c t o r i e s f o l l o w i n g

3 rI B I / I B I .

2

u

2 5

\ 1 5 n A

0 .5t s t i m / l B l o

F I G U R E 9 N o r m a l i z e d p h a s e r e s e t t i n g curves f o r M o d e l I I w i t h e i t h e r a1 5 or a 2 5 - n A c u r r e n t p u l s e . The i n t e r v a l b e t w e e n e a c h s i m u l a t i o n was 1m s . T h e r e s u l t s f o r t h e 1 5 - m s p u l s e merge t o g e t h e r t o g i v e a c o n t i n u o u scurve. T h e r e s u l t s f o r 2 5 n A h a v e a n a p p a r e n t d i s c o n t i n u i t y , as d e s c r i b e di n t h e t e x t .


E x p e r i m e n tt s t i m = 4 7 0 r m s Lu

4 9 0 l u u5 2 05 3 05 8 0 LU

l s

- I I I

7 0 8


11/16

M A

eV...d l 0

F I G U R E 1 0 C u r r e n t - v o l t a g e t r a j e c t o r i e s d u r i n g p h a s e r e s e t t i n g o fM o d e l I I . ( A ) U n p e r t u r b e d t r a j e c t o r y ( o u t e r c u r v e ) a n d p e r t u r b e dt r a j e c t o r i e s f o r a 1 5 - n A p u l s e a p p l i e d a t t s t , m = 0 . 1 5 o r 0 . 3 0 s . T h e d o t t e dl i n e s c o r r e s p o n d t o t h e t r a j e c t o r y d u r i n g t h e 2 0 - m s d u r a t i o n p u l s e . ( B )A d d i t i o n a l t r a j e c t o r i e s f o r a 1 5 - n A p u l s e a t t h e t i m e s i n d i c a t e d .E x p a n d e d c u r r e n t s c a l e . T h e t w o s y m b o l s ( - ) r e p r e s e n t t h e e q u i l i b r i u mp o i n t s o f M o d e l I I i n t h e p a c e m a k e r v o l t a g e r a n g e a t V I = - 7 0 . 8 a n d V 2= - 6 6 . 7 mV ( i n s e t o f F i g . 1 B ) . ( C ) T r a j e c t o r i e s f o r a 2 5 - n A p u l s eb e g i n n i n g a t t h e t i m e s i n d i c a t e d . T h e t r a j e c t o r i e s d u r i n g c u r r e n t i n j e c t i o na r e n o t s h o w n i n t h i s p a n e l . ( D ) T r a j e c t o r i e s f o r a 2 5 - n A p u l s e a p p l i e db e g i n n i n g a t t s t j m = 0 . 2 9 5 5 0 1 s ( c u r v e a ) a n d 0 . 2 9 5 5 0 2 s ( c u r v e b ) . T h e s et w o r e s u l t s e s s e n t i a l l y o v e r l a p d u r i n g t h e t i m e o f i n j e c t i o n o f t h e c u r r e n tp u l s e s ( d o t t e d l i n e ) a n d f o r a w h i l e i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g t h e p u l s e s , a st h e y a p p r o a c h V 2 . T h e y s u b s e q u e n t l y d i v e r g e f r o m t h i s p o i n t .c u r r e n t - p u l s e i n j e c t i o n i n i t i a t e d a t t h e t i m e s i n d i c a t e d .T h e r e i s a c h a n g e i n t h e d i r e c t i o n i n w h i c h t h e t r a j e c t o r i e si n M o d e l I I m o v e a s t s t i m i s i n c r e m e n t e d f o r v a l u e s o f t s t i m i nt h e t r a n s i t i o n a l r e g i o n o f t h e I B I v s . t , t i m r e l a t i o n . T h et r a j e c t o r i e s f o r t a t i m = 0 . 2 3 , 0 . 2 6 , a n d 0 . 2 8 s h a v e t h e s a m er e l a t i o n s h i p t o o n e a n o t h e r a s d o t h e t r a j e c t o r i e s i n F i g .1 0 B . H o w e v e r , t h e t s t i m = 0 . 2 9 s t r a j e c t o r y l i e s t o t h e l e f t o ft h e t s t i m = 0 . 2 8 s t r a j e c t o r y , a n d t h e t s t i m = 0 . 2 9 3 s a n d 0 . 2 9 5s t r a j e c t o r i e s l i e e v e n f a r t h e r t o t h e l e f t . T h e t r a j e c t o r i e sl a b e l e d a a n d b i n F i g . 1 0 D c o r r e s p o n d t o t s t i m = 0 . 2 9 5 5 0 1a n d 0 . 2 9 5 5 0 2 s , r e s p e c t i v e l y . T h e d o t t e d l i n e i n F i g . 1 0 D i st h e t r a j e c t o r y f o r b o t h a a n d b d u r i n g c u r r e n t - p u l s ei n j e c t i o n . T h e t r a j e c t o r i e s e s s e n t i a l l y o v e r l a p d u r i n g t h i st i m e , a s w e l l a s d u r i n g t h e t i m e i m m e d i a t e l y f o l

john r. clay et al- phase resetting of the rhythmic activity of embryonic heart cell aggregates:...

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