j. bacteriol.-1980-ingram-481-8

8/2/2019 J. Bacteriol.-1980-Ingram-481-8

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J O U R N A L O F B A C T E R I O L O G Y , N o v . 1 9 8 0 , p . 4 8 1 - 4 8 80 0 2 1 - 9 1 9 3 / 8 0 / 1 1 - 0 4 8 1 / 0 8 $ 0 2 . 0 0 / 0 V o l . 1 4 4 , N o . 2

D i f f e r e n t i a l E f f e c t s o f E t h a n o l a n d H e x a n o l o n t h eE s c h e r i c h i a c o l i C e l l E n v e l o p e tL . 0 . INGRAM* AND N . S . VREELAND

D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y and C e l l S c i e n c e , U n i v e r s i t y o f F l o r i d a , G a i n e s v i l l e , F l o r i d a 3 2 6 1 1B o t h e t h a n o l a n d h e x a n o l i n h i b i t e d t h e g r o w t h o f E s c h e r i c h i a c o l i , b u t t h e i re f f e c t s o n t h e o r g a n i z a t i o n a n d c o m p o s i t i o n o f t h e c e l l e n v e l o p e w e r e q u i t ed i f f e r e n t . H e x a n o l ( 7 . 8 x 1 0 - 3 mM) i n c r e a s e d m e m b r a n e f l u i d i t y , w h e r e a s e t h a n o l( 0 . 6 7 M) h a d l i t t l e e f f e c t . D u r i n g g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l , t h e p r o p o r t i o no f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s i n c r e a s e d . T h e o p p o s i t e c h a n g e w a s i n d u c e d b y h e x a n o l .U n l i k e h e x a n o l , g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l r e s u l t e d i n t h e p r o d u c t i o n o fu n - c r o s s - l i n k e d p e p t i d o g l y c a n w i t h s u b s e q u e n t l y s i s . S a l t ( 0 . 3 M) p r o t e c t e d c e l l sa g a i n s t e t h a n o l - i n d u c e d l y s i s b u t p o t e n t i a t e d g r o w t h i n h i b i t i o n b y h e x a n o l .M u t a n t s i s o l a t e d f o r r e s i s t a n c e t o e t h a n o l - i n d u c e d l y s i s s y n t h e s i z e d c r o s s - l i n k e dp e p t i d o g l y c a n d u r i n g g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l b u t r e m a i n e d s e n s i t i v e t oh e x a n o l . A g e n e r a l h y p o t h e s i s w a s p r e s e n t e d t o e x p l a i n t h e d i f f e r e n t i a l e f f e c t s o fe t h a n o l a n d h e x a n o l . A l l a l c o h o l s a r e v i e w e d a s s i n m i l a r i n h a v i n g b o t h a n a p o l a rc h a i n c a p a b l e o f i n t e r a c t i n g w i t h h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t s a n d a h y d r o x y lf u n c t i o n c a p a b l e o f h y d r o g e n b o n d i n g . T h e d i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f s h o r t - c h a i na l c o h o l s ma y r e p r e s e n t e f f e c t s d u e t o t h e h i g h m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f h y d r o g e nb o n d i n g g r o u p s w i t h a n a p o l a r e n d w i t h i n t h e e n v i r o n m e n t . T h e s e ma y r e p l a c eb o u n d w a t e r i n s o m e c a s e s . W i t h l o n g e r - c h a i n a l c o h o l s s u c h a s h e x a n o l , t h ee f f e c t s o f t h e a c y l c h a i n w o u l d d o m i n a t e , a n d l i m i t a t i o n s o f s o l u b i l i t y a n d c e l l u l a ri n t e g r i t y w o u l d m a s k t h e s e h y d r o x y l e f f e c t s .

A l c o h o l s a r e a m p h i p a t h i c m o l e c u l e s t h a t a l t e rb o t h p o l a r a n d a p o l a r e n v i r o n m e n t s . A l c o h o l sh a v e b e e n s h o w n t o a f f e c t n u m e r o u s b i o l o g i c a lp r o c e s s e s , many o f w h i c h a r e a s s o c i a t e d w i t ht h e c e l l m e m b r a n e ( 1 2 , 1 4 , 1 5 , 2 7 , 4 1 ) . The p o -t e n c y o f a l c o h o l s i n e l i c i t i n g t h e s e c h a n g e s i sd i r e c t l y r e l a t e d t o t h e i r l i p i d s o l u b i l i t y , i n d i c a t -i n g a h y d r o p h o b i c s i t e o f a c t i o n ( 2 4 , 3 0 , 3 3 , 3 5 ) .E t h a n o l i s a m a j o r f e r m e n t a t i o n p r o d u c t o fE s c h e r i c h i a c o l i ( 5 ) a n d a c o m p o u n d t o w h i c ht h i s o r g a n i s m may h a v e e v o l ve d a n a d a p t i v er e s p o n s e . T h e l i p i d c o m p o s i t i o n o f E . c o l i i se x t e n s i v e l y r e g u l a t e d ( 3 4 , 3 6 ) . I n p r e v i o u s s t u d -i e s i n o u r l a b o r a t o r y , t h e c h a n g e s i n l i p i d c o m -p o s i t i o n i n E . c o l i w h i c h o c c u r d u r i n g g r o w t h i nt h e p r e s e n c e o f e t h a n o l a n d o t h e r a l c o h o l s h a v eb e e n e x a m i n e d ( 1 , 1 6 , 1 8 ) . The e f f e c t i v e n e s s o fa l c o h o l s i n i n d u c i n g t h e s e c h a n g e s i s d i r e c t l yr e l a t e d t o c h a i n l e n g t h o r h y d r o p h o b i c i t y .G r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f a l c o h o l s o f u p t o n i n ec a r b o n s i n l e n g t h a n d p h e n e t h y l a l c o h o l ( 3 1 )r e s u l t s i n t h e s y n t h e s i s o f l i p i d s c o n t a i n i n g a ni n c r e a s e d a b u n d a n c e o f a n i o n i c p h o s p h o l i p i d sr e l a t i v e t o p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( 1 8 ) , a n dt h e s e c h a n g e s ma y b e p a r t o f a n a d a p t i v e r e -t F l o r i d a A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n p u b l i c a t i o n n o .2 3 5 6 .

s p o n s e . C l a r k a n d B e a r d ( 7 ) h a v e r e c e n t l y i s o -l a t e d e t h a n o l - r e s i s t a n t m u t a n t s w h i c h o v e r p r o -d u c e a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s . I s o l a t e d m e m b r a n e sf r o m t h e s e m u t a n t s e x h i b i t e d a n i n c r e a s e d r e -s i s t a n c e t o d i s r u p t i o n b y e t h a n o l ( 7 ) . A l t h o u g ht h e e f f e c t s o f a l l a l c o h o l s a r e s i m i l a r w i t h r e s p e c tt o p h o s p h o l i p i d c o m p o s i t i o n , t h e i r e f f e c t s o nf a t t y a c i d c o m p o s i t i o n a r e n o t a s s i m p l e . A l c o -h o l s o f u p t o f o u r c a r b o n s i n l e n g t h i n d u c e l a r g ec h a n g e s i n f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n w h i c h a r e t h eo p p o s i t e o f t h o s e i n d u c e d b y t h e p r e s e n c e o fl o n g e r - c h a i n a l c o h o l s ( 1 6 , 3 8 ) . D u r i n g g r o w t hw i t h t h e s h o r t e r - c h a i n a l c o h o l s , c e l l s s y n t h e s i z ee l e v a t e d l e v e l s o f p h o s p h o l i p i d s c o n t a i n i n g t w ou n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( 1 ) . D u r i n g g r o w t h w i t ht h e l o n g e r - c h a i n a l c o h o l s s u c h a s h e x a n o l , c e l l ss y n t h e s i z e p h o s p h o l i p i d s c o n t a i n i n g o n e u n s a t -u r a t e d a n d o n e s a t u r a t e d f a t t y a c i d ( 1 ) . T h e s ec h a n g e s i n a c y l c h a i n s h a v e a l s o b e e n p r o p o s e da s p a r t o f a n a d a p t i v e r e s p o n s e ( 1 6 ) . O t h e r c e l -l u l a r p r o c e s s e s h a v e b e e n o b s e r v e d i n w h i c hl o n g - c h a i n a n d s h o r t - c h a i n a l c o h o l s d i f f e r i nt h e i r a c t i o n s . F o r e x a m p l e , p e r m e a s e - m e d i a t e df i - g a l a c t o s i d e u p t a k e i s i n h i b i t e d b y s h o r t - c h a i na l c o h o l s ( 1 2 , 1 9 ) a n d i s s t i m u l a t e d b y l o n g - c h a i na l c o h o l s ( 1 9 , 3 9 ) . I n t h i s p a p e r , we i n v e s t i g a t e dd i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f e t h a n o l a n d h e x a n o l o n c e l lg r o w t h a n d t h e c e l l e n v e l o p e o f s t r a i n T B 4 .4 8 1

onFebruary16,2012byguest

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rg/

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4 8 2 INGRAM AND VREELANDMATERIALS AND METHODSS t r a i n s a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . E . c o l i K - 1 2s t r a i n T B4 i s a f a d E d e r i v a t i v e o f s t r a i n CSH2 ( 3 ) a n dr e q u i r e s t h i a m i n e a n d t y r o s i n e f o r g r o w t h . C u l t u r e sw e r e g r o w n i n L u r i a b r o t h ( 2 9 ) c o n t a i n i n g g l u c o s e ( 2g / l i t e r ) , y e a s t e x t r a c t ( 5 g / l i t e r ) , t r y p t o n e ( 1 0 g / l i t e r ) ,N a C l ( 5 g / l i t e r ) , a n d 2 N NaOH ( 1 . 1 m l / l i t e r ) , u n l e s ss t a t e d o t h e r w i s e . F l a s k c u l t u r e s ( 5 0 m l o f b r o t h p e r2 5 0 - m l f l a s k ) w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 0 C i n a r e c i p r o c a t i n gw a t e r b a t h s h a k e r . G r o w t h w a s m o n i t o r e d b y m e a s u r -i n g o p t i c a l d e n s i t y a t 5 5 0 nm i n a B a u s c h & LombS p e c t r o n i c 7 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r . C e l l m o r p h o l o g i e sw e r e e x a m i n e d a n d p h o t o g r a p h e d w i t h a Z e i s s p h a s e -

c o n t r a s t m i c r o s c o p e .F l u o r e s c e n c e d e p o l a r i z a t i o n . T h e f l u o r e s c e n c ed e p o l a r i z a t i o n o f 1 , 6 - d i p h e n y l - 1 , 3 , 5 - h e x a t r i e n e ( A l d -r i c h C h e m i c a l C o . , M i l w a u k e e , W i s . ) was u s e d a s ac o m p a r a t i v e m e a s u r e o f t h e f l u i d i t y o f m e m b r a n e s( 1 1 ) . I n i t i a l l y , t w o d i f f e r e n t m e t h o d s o f m e m b r a n ep r e p a r a t i o n w e r e e x a m i n e d : u l t r a s o n i c d i s r u p t i o n f o l -l o w e d b y g r a d i e n t s e p a r a t i o n o f i n n e r a n d o u t e r mem-b r a n e s a s d e s c r i b e d b y I t o e t a l . ( 2 2 ) a n d t h e f r e e z e -t h a w m e t h o d o f D i R i e n z o a n d I n o u y e ( 9 ) . I n o u rh a n d s , t h e f r e e z e - t h a w p r e p a r a t i o n s w h i c h c o n t a i n e db o t h i n n e r a n d o u t e r m e m b r a n e s y i e l d e d much morer e p r o d u c i b l e v a l u e s , a n d t h i s m e t h o d was u s e d i n t h i ss t u d y . M e m b r a n e s w e r e s u s p e n d e d i n T r i s - h y d r o c h l o -r i d e b u f f e r ( 0 . 0 1 M , pH 7 . 5 ) a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f1 0 0 , u g o f p r o t e i n p e r m l . P r o t e i n w a s m e a s u r e d b y t h em e t h o d o f L o w r y e t a l . ( 2 6 , 2 8 ) . 1 , 6 - D i p h e n y l - 1 , 3 , 5 -h e x a t r i e n e w a s d i s s o l v e d i n t e t r a h y d r o f u r a n ( 2 m M ) .A m i c r o c r y s t a l l i n e d i s p e r s i o n o f 1 , 6 - d i p h e n y l - 1 , 3 , 5 -h e x a t r i e n e w a s p r o d u c e d b y i n j e c t i n g 1 p l / m l i n t ob u f f e r w i t h a s y r i n g e . T h e m e m b r a n e s u s p e n s i o n a n db u f f e r d i s p e r s i o n w e r e m i x e d i n e q u a l v o l u m e s a n di n c u b a t e d i n t h e d a r k f o r 2 h i n a r e c i p r o c a t i n g w a t e rb a t h s h a k e r t o a l l o w p r o b e i n s e r t i o n . S a m p l e s w e r em e a s u r e d w i t h a n SLM s e r i e s 4 0 0 0 p o l a r i z a t i o n f l u o -r o m e t e r ( e x c i t a t i o n a t 3 6 0 nm a n d e m i s s i o n a b o v e 4 7 0n m ) . T h i s i n s t r u m e n t s i m u l t a n e o u s l y m e a s u r e s p a r a l -l e l a n d p e r p e n d i c u l a r e m i s s i o n s , a v e r a g i n g 1 0 d i s c r e t em e a s u r e m e n t a p e r o u t p u t r e a d i n g . P o l a r i z a t i o n w a sc o m p u t e d a s d e s c r i b e d b y C h e n a n d Bowman ( 4 ) .S a m p l e t e m p e r a t u r e w a s c o n t r o l l e d w i t h a N e s l a bt h e r m o r e g u l a t o r a n d w a s m o n i t o r e d w i t h i n t h e c u -v e t t e w i t h a t h e r m o c o u p l e . E t h a n o l w a s a d d e d i ni n c r e m e n t s b y s y r i n g e a n d w a s a l l o w e d t o e q u i l i b r a t ef o r 2 m i n b e f o r e m e a s u r e m e n t . F o r m e a s u r e m e n t sw i t h h e x a n o l , t h e m e m b r a n e s a n d p r o b e w e r e p r e -p a r e d a s a 2x c o n c e n t r a t e . H e x a n o l c o n c e n t r a t i o n sw e r e o b t a i n e d b y d i l u t i n g t h i s c o n c e n t r a t e w i t h b u f f e ra n d a s t o c k s o l u t i o n o f h e x a n o l ( 3 . 9 x 1 0 - 2 M ) i nb u f f e r .A n a l y s i s o f l i p i d s . C e l i w e r e h a r v e s t e d a t a no p t i c a l d e n s i t y ( 5 5 0 n m ) o f 0 . 4 ( 1 0 ' c e l l s p e r m l ) ,i n a c t i v a t e d w i t h t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( 5 % ) , a n d e x -t r a c t e d i n c h l o r o f o r m - m e t h a n o l ( 2 : 1 , v o l / v o l ) . T h ef a t t y a c i d c o m p o s i t i o n o f b u l k l i p i d s w a s d e t e r m i n e db y g a s c h r o m a t o g r a p h y ( 1 6 ) . P h o s p h o l i p i d s w e r e a n -a l y z e d b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( 1 8 ) . S p o t s c o r -r e s p o n d i n g t o t h e m a j o r p h o s p h o l i p i d s w e r e s c r a p e da n d c o u n t e d i n a B e c k m a n s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r .. A n a l y s i s o f p e p t i d o g l y e a n c r o s s - l i n k i n g . L y -s o z y m e d i g e s t i o n p r o d u c t s o f h e a t - a c t i v a t e d c e l l s w e r e

i n i t i a l l y p u r i f i e d o n a n E C T E O L A - c e l l u l o s e c o l u m n( 4 2 ) . T h e p u r i f i e d d i g e s t i o n p r o d u c t s ( 0 . 2 m l ) w e r es e p a r a t e d b y u s i n g a S e p h a d e x G - 2 5 c o l u m n ( 6 0 b y 0 . 9c m ) a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 1 ) . F r a c t i o n s w e r e a n a -l y z e d f o r t o t a l r e d u c i n g s u g a r b y t h e m e t h o d o f P a r ka n d J o h n s o n ( 3 2 ) a s m o d i f i e d b y G h u y s e n e t a l . ( 1 3 )w i t h N - a c e t y l g l u c o s a m i n e a s a s t a n d a r d .RESULTS

D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f e t h a n o l and h e x -a n o l on g r o w t h . F i g u r e 1 s h o w s t h e e f f e c t s o fe t h a n o l a n d h e x a n o l o n t h e g r o w t h o f s t r a i n T B4a t 3 7 0 C . I n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f a l c o h o lp r o g r e s s i v e l y i n h i b i t e d i n i t i a l g r o w t h a s p r e v i -o u s l y r e p o r t e d ( 1 2 , 1 6 ) . H e x a n o l was a muchm o r e p o t e n t i n h i b i t o r o f g r o w t h t h a n wase t h a n o l . A f t e r a b o u t 2 . 5 h o f g r o w t h i n t h ep r e s e n c e o f 0 . 5 1 a n d 0 . 6 7 M e t h a n o l , g r o w t hc e a s e d a n d t h e o p t i c a l d e n s i t y b e g a n t o d e c r e a s e .A t t h i s t i m e , r o u n d e d a n d s w o l l e n c e l l s w e r eo b s e r v e d b y p h a s e - c o n t r a s t m i c r o s c o p y . A f t e r 4h , e x t e n s i v e l y s i s a n d d e b r i s w e r e o b s e r v e d . Nol y s i s w a s o b s e r v e d d u r i n g g r o w t h i n t h e p r e s e n c eo f h e x a n o l .T h e p o s s i b i l i t y o f a u t o l y s i n a c t i v a t i o n w a si n v e s t i g a t e d a s a m e c h a n i s m f o r e t h a n o l - i n d u c e dl y s i s . N o n g r o w i n g c e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r 6 a n d1 2 h a t 3 7 0 C i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f 0 . 6 7M e t h a n o l . T h r e e t y p e s o f n o n g r o w i n g c e l l s w e r ee x a m i n e d : e x p o n e n t i a l c e l l s w h i c h w e r e w a s h e da n d s u s p e n d e d i n 0 . 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r( p H 7 . 2 ) , e x p o n e n t i a l c e l l s t o w h i c h s o d i u m a z i d e( 1 mM) a n d c h l o r a m p h e n i c o l ( 5 0 , u g / m l ) w e r ea d d e d , a n d s t a t i o n a r y - p h a s e c e l l s . No d e c r e a s ei n t u r b i d i t y o r l y s i s w a s o b s e r v e d u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s . M i c r o s c o p i c a l l y , c e l l s r e t a i n e d t h e i rr o d - s h a p e d m o r p h o l o g y ( d a t a n o t s h o w n ) .I n p r e v i o u s s t u d i e s b y F r i e d a n d N o v i c k ( 1 2 )w i t h a m i n e r a l s a l t s m e d i u m , e t h a n o l - i n d u c e dl y s i s w a s n o t r e p o r t e d . S i n c e L u r i a b r o t h c o n -t a i n s l o w e r l e v e l s o f e l e c t r o l y t e s , t h e e f f e c t s o fs a l t o n e t h a n o l - i n d u c e d l y s i s w e r e i n v e s t i g a t e d .E l e v a t e d c o n c e n t r a t i o n s o f s o d i u m c h l o r i d e p r o -t e c t e d t h e c e l l s a g a i n s t l y s i s d u r i n g g r o w t h i nt h e p r e s e n c e o f e t h a n o l . S o d i u m c h l o r i d e a t f i n a lc o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 2 a n d 0 . 3 M w a s a d e q u a t ef o r p r o t e c t i o n , w h e r e a s l o w e r c o n c e n t r a t i o n sp e r m i t t e d l y s i s . The p r e s e n c e o f s o d i u m c h l o r i d ed i d n o t r e l i e v e t h e i n i t i a l r e d u c t i o n i n g r o w t hr a t e c a u s e d b y e t h a n o l . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n so f s o d i u m c h l o r i d e a l s o r e s u l t e d i n s l o w e rg r o w t h .P o t a s s i u m c h l o r i d e , p o t a s s i u m s u l f a t e , a n d s o -d i u m c h l o r i d e w e r e e q u a l l y e f f e c t i v e i n p r o t e c t -i n g c e l l s a g a i n s t l y s i s , w h e r e a s n e i t h e r e q u i m o l a rn o r e q u i o s m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f s u c r o s e p r o -v i d e d c o m p l e t e p r o te c t i on a g a i n s t l y s i s . T h e f a i l -u r e o f s u c r o s e t o p r o v i d e c o m p l e t e p r o t e c t i o n

J . B A C T E R I O L .


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DIFFERENTIAL EF FEC T S OF ALCOHOLS2 0 r A

0 . 5 0E

' C ,_0

0 0 . 1 0 k

0 . 0 2

0 1 2TIME ( h r ) 3 4 2TIME ( h r )F I G . 1 . E f f e c t o f a l c o h o l s o n t h e g r o w t h o f s t r a i n T B 4 . ( A ) E t h a n o l . S y m r b o l s : * , n o n e ; 0 , 0 . 3 4 M; A , 0 . 5 1 M;A , 0 . 6 7 M ; O : , 0 . 8 3 M . ( B ) H e x a n o l . S y m r b o l s : 0 , n o n e ; 0 , 3 . 9 mM; A , 5 . 5 mM; 4 , 7 . 8 mM; , 1 0 m M ; C , 1 . 2 m M .O . D . , O p t i c a l d e n s i t y .

s u g g e s t e d t h a t t h e e f f e c t s o f s a l t s ( 0 . 3 M) mayn o t r e s u l t f r o m o s m o t i c s t a b i l i z a t i o n a l o n e . I fo s m o t i c p r o t e c t i o n a l o n e were r e s p o n s i b l e , t h ea d d i t i o n o f s a l t ( 0 . 3 M) a t any t i m e b e f o r e l y s i ss h o u l d h a v e b e e n s u f f i c i e n t t o b l o c k i t s o c c u r -r e n c e . T h e a d d i t i o n o f s a l t a f t e r 3 0 m i n o f g r o w t ha f f o r d e d c o m p l e t e p r o t e c t i o n . H o w e v e r , t h e a d -d i t i o n o f s a l t a f t e r 1 h o f g r o w t h i n t h e p r e s e n c eo f e t h a n o l ( 0 . 6 7 M) p r o v i d e d no p r o t e c t i o n .T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t c e l l d a m a g e o c c u r sd u r i n g g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l , w h i c hi s n o t r e a d i l y r e p a i r e d a f t e r s a l t a d d i t i o n .T h e i n c l u s i o n o f s o d i u m c h l o r i d e ( 0 . 3 M) i n -c r e a s e d t h e d e g r e e o f g r o w t h i n h i b i t i o n c a u s e db y h e x a n o l ( c o m p a r e F i g . 1 B a n d 2 ) . S i m i l a rr e s u l t s were o b t a i n e d w i t h p o t a s s i u m c h l o r i d ea n d s o d i u m s u l f a t e .

E f f e c t s o f e t h a n o l a nd h e x a n o l on p e p t i -d o g l y c a n c r o s s - l i n k i n g . T h e e x t e n t o f cross-l i n k i n g o f p e p t i d o g l y c a n was c o m p a r e d i n c e l l sgrown w i t h a n d w i t h o u t e t h a n o l ( F i g . 3 ) . Mon-omer a n d d i m e r f r a g m e n t s r e l e a s e d b y l y s o z y m ed i g e s t i o n were s e p a r a t e d b y g e l f i l t r a t i o n . I ns t r a i n T B 4 grown w i t h o u t e t h a n o l , t h e b u l k o ft h e p e p t i d o g l y c a n was i n t h e c r o s s - l i n k e d f o r ma n d e l u t e d n e a r t h e v o i d v o l u m e . A f t e r g r o w t hf o r 2 h i n medium s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 5 1 Me t h a n o l , o n l y t h e u n - c r o s s - l i n k e d monomer wasp r e s e n t . T h i s f o r m e l u t e d w i t h a K a y o f 0 . 4 , i ng o o d a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s r e s u l t s ( 2 1 , 4 2 ) .M a t e r i a l f r o m c e l l s grown i n l o w e r c o n c e n t r a -

t i o n s o f e t h a n o l c o n t a i n e d i n t e r m e d i a t e l e v e l s o ft h e monomer a n d d i m e r p e a k s . A f t e r g r o w t h i nt h e p r e s e n c e o f b o t h 0 . 5 1 M e t h a n o l a n d 0 . 3 Ms o d i u m c h l o r i d e , p a r t i a l c r o s s - l i n k i n g was r e -s t o r e d . S a l t a l o n e ( 0 . 3 M) h a d no e f f e c t on c r o s s -l i n k i n g . G r o w t h f o r 3 h i n 6 . 3 mM h e x a n o l d i dn o t a l t e r c r o s s - l i n k i n g ( d a t a n o t s h o w n ) .D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f e t h a n o l an d h e x -a n o l on membranes i n v i t r o . We c o m p a r e dt h e e f f e c t s o f e t h a n o l a n d h e x a n o l on t h e p o l a r -i z a t i o n o f 1 , 6 - d i p h e n y l - 1 , 3 , 5 - h e x a t r i e n e i n mem-b r a n e s f r o m c e l L s g r o w n u n d e r d i f f e r e n t c o n d i -t i o n s ( T a b l e 1 ) . C e l l s g r o w n i n r e g u l a r L u r i ab r o t h a n d t h o s e g r o w n i n L u r i a b r o t h c o n t a i n i n g0 . 3 M N a C l d i f f e r e d i n t h e i r i n i t i a l p o l a r i z a t i o n( T a b l e 1 ) . M e m b r a n e s f r o m c e l l s g r o w n w i t he t h a n o l a p p e a r e d s l i g h t l y more f l u i d , a n d m em -b r a n e s f r o m c e l l s g r o w n w i t h h e x a n o l a p p e a r e ds l i g h t l y more r i g i d t h a n t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o lc e l l s . H o w e v e r , t h i s s h i f t i s , a t b e s t , n e a r t h el i m i t s o f d e t e c t i o n i n a c o m p a r i s o n o f s e v e r a lb a t c h e s o f m e m b r a n e s . T he c h a n g e i n p o l a r i z a -t i o n w i t h e t h a n o l a n d h e x a n o l c o u l d b e m e a -s u r e d much more a c c u r a t e l y w i t h i n e a c h mem-b r a n e p r e p a r a t i o n . F o r c o m p a r i s o n , c o n c e n t r a -t i o n s w h i c h c a u s e a r o u g h l y e q u i v a l e n t i n h i b i -t i o n o f g r o w t h w e r e c h o s e n . H e x a n o l ( 7 . 8 mM)c a u s e d a l a r g e d e c r e a s e i n p o l a r i z a t i o n , w h e r e a se t h a n o l h a d l i t t l e e f f e c t on p o l a r i z a t i o n . Mem-b r a n e s f r o m c e l l s g r o w n w i t h e t h a n o l o r h e x a n o lr e m a i n e d s e n s i t i v e t o t h e s e a g e n t s .

4 8 3O L . 1 4 4 , 1 9 8 0


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4 8 4 INGRAM AND VREELANDMutants r e s i s t a n t t o e t h a n o l - i n d u c e dl y s i s . Ten s p o n t a n e o u s m u t a n t s w e r e i s o l a t e db y s e r i a l c u l t i v a t i o n o f s t r a i n T B4 i n 0 . 8 3 Me t h a n o l . A l l o f t h e s e g r e w e q u a l l y w e l l i n t h e

p r e s e n c e o f e t h a n o l a n d d i d n o t r o u n d u p a n d2 . 0

0.50-

0

00 . 1

0.020 1 2 3 4T I M E ( h r )F I G . 2 . E f f e c t o f h e x a n o l o n t h e g r o w t h o f s t r a i nT B4 i n L u r i a b r o t h c o n t a z i n i g 0 . 3 MN a C I . S y m b o l s :0 , n o h e x a n o l ; 0 , 3 . 9 mM h e x a n o l ; A , 5 . 5 mM h e x -a n o l ; A , 7 . 8 mM h e x a n o l ; I 1 . 0 mM h e x a n o l ; C , 12mM h e x a n o l . O . D . , O p t i c a l d e n s i t y .

30r

EN Azw-J 20

w0z0w0

U)w-J0

VO

5 1 5 2FRACTION NUMB

F I G . 3 . S e p a r a t i o n o f monomerments f r o m lysozyme d i g e s t o f s t r a0, c e l s g r o w n i n t h e a b s e n c e o fg r o w n f o r 2 h i n 0 . 5 1 M e t h a n o l ;e t h a n o l an d 0 . 3 MN a C I .

l y s e . F i g u r e 4A s h o w s t h e g r o w t h o f o n e o f t h e s e ,s t r a i n L I - 1 , i n t h e p r e s e n c e o f a s e r i e s o f c o n c e n -t r a t i o n s o f e t h a n o l . A l t h o u g h a l l m u t a n t s w e r er e s i s t a n t t o l y s i s , t h e i r g r o w t h r a t e w a s s t i l lp r o g r e s s i v e l y i n h i b i t e d b y i n c r e a s i n g c o n c e n t r a -t i o n s o f e t h a n o l . The l e v e l o f r e s i s t a n c e t o l y s i sa c h i e v e d b y t h e s e m u t a n t s i n L u r i a b r o t h w a se q u i v a l e n t t o t h a t e x h i b i t e d b y t h e p a r e n t o r -g a n i s m d u r i n g g r o w t h i n L u r i a b r o t h c o n t a i n i n g0 . 3 M s o d i u m c h l o r i d e ( F i g . 4 B ) . S t r a i n L I - 1 w a sr e s i s t a n t t o l y s i s i n d u c e d b y a c e t o n e , m e t h a n o l ,a n d d i o x a n e , b u t d i d n o t e x h i b i t i n c r e a s e d r e -s i s t a n c e t o h e x a n o l o r t o h e x a n o l p l u s s a l t ( d a t an o t s h o w n ) . U n l i k e t h e p a r e n t , u n - c r o s s - l i n k e dmonomer d i d n o t a c c u m u l a t e d u r i n g t h e g r o w t ho f s t r a i n L I - 1 w i t h e t h a n o l ( 0 . 5 1 M ) .The a l c o h o l - i n d u c e d c h a n g e s i n t h e mem-b r a n e l i p i d s o f s t r a i n L I - 1 w e r e s i m i l a r t o t h o s eo b s ' e r v e d w i t h s t r a i n T B 4 . B o t h s t r a i n s e x h i b i t e da n i n c r e a s e i n p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( 1 4 t o 1 7 . 5 % )w h e n g r o w n w i t h e t h a n o l ( 0 . 5 1 M ) . The p r o p o r -t i o n o f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a l s o i n c r e a s e d i nb o t h s t r a i n s ( T a b l e 2 ) . S t r a i n L I - 1 e x h i b i t e d al a r g e r c h a n g e t h a n d i d s t r a i n T B4 w h e n b o t hw e r e g r o w n i n r e g u l a r L u r i a b r o t h c o n t a i n i n ga l c o h o l . H o w e v e r , i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 3 M s a l t ,t h e e t h a n o l - i n d u c e d c h a n g e s i n f a t t y a c i d c o m -p o s i t i o n w e r e i d e n t i c a l . T he p o l a r i z a t i o n i n i s o -l a t e d m e m b r a n e s f r o m s t r a i n L I - 1 w a s i d e n t i c a lt o t h a t i n i s o l a t e d m e m b r a n e s f r o m s t r a i n T B 4 .T h e a d d i t i o n o f e t h a n o l ( 0 . 6 7 M) o r h e x a n o l ( 7 . 8mM) c a u s e d a c h a n g e i n p o l a r i z a t i o n o f - 0 . 0 0 3a n d - 0 . 0 1 3 , r e s p e c t i v e l y .

DISCUSSIONA l c o h o l s a n d o t h e r a m p h i p a t h i c m o l e c u l e sh a v e l o n g b e e n u s e d a s a n t i m i c r o b i a l a g e n t s t o

p r e v e n t t h e g r o w t h o f b a c t e r i a ( 1 4 , 1 5 , 4 1 ) . I n E .c o l i , b o t h e t h a n o l a n d h e x a n o l i n h i b i t g r o w t h .A l t h o u g h t h e s e a l c o h o l s a r e c h e m i c a l l y s i m i l a r ,t h e i r m o d e s o f a c t i o n m u s t d i f f e r i n some w a y .P r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t e t h a n o l a n dh e x a n o l a f f e c t a c y l c h a i n c o m p o s i t i o n i n o p p o -s i t e f a s h i o n s ( 1 6 ) . A d d i t i o n a l d i f f e r e n c e s i n t h ee f f e c t s o f t h e s e a g e n t s o n t h e g r o w t h o f s t r a i nT B 4 w e r e a l s o f o u n d . D u r i n g g r o w t h i n L u r i ab r o t h , e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n s w h i c h c a u s e d a na p p r o x i m a t e l y 5 0 % i n h i b i t i o n o f g r o w t h r a t e a l s oV t r e s u l t e d i n s u b s e q u e n t l y s i s . O t h e r a g e n t s , w h i c h_ h a d b e e n s h o w n p r e v i o u s l y t o i n d u c e f a t t y a c i dc h a n g e s s i m i l a r t o t h o s e c a u s e d b y e t h a n o l , a l s o

2 5 3 5 i n d u c e d l y s i s . H e x a n o l d i d n o t i n d u c e l y s i s , a l -I E R t h o u g h i t was a p o t e n t i n h i b i t o r o f g r o w t h .a n d d i m e r f i r a g - L y s i s b y e t h a n o l d o e s n o t a p p e a r t o b e t h et i n T B 4 . S y m b o l s : r e s u l t o f a u t o l y s i n a c t i v a t i o n or c o m p l e t e mem-e t h a n o l ; 0 , c e l l s b r a n e d i s r u p t i o n . G r o w t h i n t h e p r e s e n c e o fc e U s g r o w n w i t h e t h a n o l w a s r e q u i r e d f o r l y s i s . The a d d i t i o n o fe l e c t r o l y t e s p r o t e c t e d c e l l s a g a i n s t e t h a n o l - i n -

J . B A C T E R I O L .


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DIFFERENTIAL EF FEC T S OF ALCOHOLST A B L E 1 . E f f e c t s o f e t h a n o l a n d h e x a n o l o n f l u o r e s c e n c e d e p o l a r i z a t i o n i n m e m b r a n e s f r o m s t r a i n T B 4 a

C h a n g e i n p o l a r i z a t i o nG r o w t h c o n d i t i o n s P o l a r i z a t i o n E t h a n o l ( 0 . 6 7 M) H f e x a n o l ( 7 . 8 mM)L u r i a b r o t h 0 . 2 7 6 1 0 . 0 0 0 6 ( 3 ) - 0 . 0 0 0 7 i 0 . 0 0 0 4 ( 8 ) - 0 . 0 1 2 1 + 0 . 0 0 2 1 ( 2 )L u r i a b r o t h p l u s h e x a n o l ( 4 0 . 2 7 7 1 0 . 0 0 4 7 ( 9 ) - 0 . 0 0 2 8 0 . 0 0 0 6 ( 4 ) - 0 . 0 1 1 0 NDb ( 1 )mM)L u r i a b r o t h w i t h 0 . 3 M N a C l 0 . 2 8 8 9 0 . 0 0 2 1 ( 6 ) - 0 . 0 0 0 9 + 0 . 0 0 0 2 ( 4 ) - 0 . 0 0 7 0 ND ( 1 )L u r i a b r o t h w i t h 0 . 3 M N a C l 0 . 2 8 2 8 0 . 0 0 0 8 ( 3 ) - 0 . 0 0 0 4 0 . 0 0 0 5 ( 2 ) - 0 . 0 1 1 7 0 . 0 0 0 7 1 2 )p l u s e t h a n o l ( 0 . 6 7 M)

a V a l u e s a r e r e p o r t e d s t a n d a r d d e v i a t i o n , w i t h t h e n u m b e r o f e x p e r i m e n t s g i v e n w i t h i n p a r e n t h e s e s .b ND, N o t d e t e r m i n e d .

Ec0U ' )

00

2 . 0

0 1 2 3 4 0 2 3. 4T I M E ( h r ) TIME ( h r )

F I G . 4 . E f f e c t o f e t h a n o l o n t h e g r o w t h o f s t r a i n s L I - 1 a n d T B 4 . ( A ) S t r a i n L I - 1 i n L u r i a b r o t h . S y m b o l s :0 , n o e t h a n o l ; 0 , 0 . 6 7 M e t h a n o l ; A , 0 . 8 3 e t h a n o l ; 4 ! . 2 3Me t h a n o l . ( B ) S t r a i n T B4 i n L u r i a b r o t h c o n t a i n i n g0 . 3 MN a C l . S y m b o l s : 0 , n o e t h a n o l ; 0 , 0 . 6 7 M e t h a n o l ; A , 0 . 8 3 M e t h a n o l ; 4 1 . 2 3 M e t h a n o l . O . D . , O p t i c a ld e n s i t y .TABLE 2 . E f f e c t o f e t h a n o l a n d N a C l o n f a t t y a c i dc o m p o s i t i o n

F a t t y a c i d c o m p o s i t i o n ( % )S t r a i n A d d i t i v e 1 2 : 0 1 4 : 0 1 6 : 0 1 6 : 1 + A 1 7 1 8 : 1T B4 N o n e 3 . 5 4 . 0 3 1 . 5 3 3 . 7 2 7 . 3T B4 0 . 5 1 M e t h a n o l 4 . 5 2 . 9 2 2 . 8 2 6 . 6 4 3 . 2T B4 0 . 3 M N a C l 4 . 3 3 . 8 3 2 . 0 3 3 . 5 2 6 . 4T B4 0 . 3 M N a C l p l u s 3 . 5 1 . 9 1 9 . 0 2 7 . 7 4 7 . 90 . 5 1M

e t h a n o lL I - 1 N o n e 4 . 4 4 . 1 3 1 . 4 3 3 . 9 2 6 . 2L I - i 0 . 5 1 M e t h a n o l 3 . 4 2 . 0 1 8 . 8 2 7 . 4 4 8 . 3a C o m b i n a t i o n o f p a l m i t o l e i c a c i d a n d c i u - 9 , 1 0 - m e t h y l e n e -

h e x a d e c a n o i c a c i d .d u c e d l y s i s . A l t h o u g h l y s i s p e r s e i s d r i v e n byi n t e r n a l o s m o t i c p r e s s u r e , p r o t e c t i o n by e l e c t r o -

l y t e s d i d n o t r e s u l t f r o m s i m p l e o s m o t i c s t a b i l i -z a t i o n . D u r i n g g r o w t h i n L u r i a b r o t h c o n t a i n i n ge t h a n o l , e n v e l o p e d a m a g e o c c u r r e d w h i c h w a ss u b s e q u e n t l y s h o w n t o b e p r e v e n t e d b y i n c r e a s -i n g t h e e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n o f t h e m e d i u m .P o s s i b l e d a m a g e t o e n v e l o p e p r o t e i n s a n d p e p -t i d o g l y c a n c r o s s - l i n k i n g w e r e i n v e s t i g a t e d . L y t i cc o n c e n t r a t i o n s o f e t h a n o l p r e v e n t e d t h e a s s e m -b l y o f c r o s s - l i n k e d p e p t i d o g l y c a n . I n c o n t r a s t ,g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f h e x a n o l d i d n o t i n h i b i tt h e c r o s s - l i n k i n g o f p e p t i d o g l y c a n . The e f f e c t s o fe t h a n o l o n c r o s s - l i n k i n g w e r e p a r t i a l l y r e l i e v e db y 0 . 3 M N a C l . M u t a n t s , i s o l a t e d f o r r e s i s t a n c et o e t h a n o l , p r o d u c e d h i g h l y c r o s s - l i n k e d p e p t i -d o g l y c a n d u r i n g g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o fe t h a n o l . T h u s , we c o n c l u d e t h a t e t h a n o l - i n -d u c e d l y s i s r e s u l t s f r o m t h e i n h i b i t i o n o f p e p t i -

4 8 5O L . 1 4 4 , 1 9 8 0


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4 8 6 INGRAM AND VREELANDd o g l y c a n c r o s s - l i n k i n g b y e t h a n o l .T he e f f e c t s o f e t h a n o l o n c r o s s - l i n k i n g a r es i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d f o r p e n i c i l l i n s ( 2 , 1 0 ,4 2 ) . Lo w c o n c e n t r a t i o n s o f p e n i c i l l i n h a v e b e e ns h o w n t o s e l e c t i v e l y i n h i b i t c e l l d i v i s i o n , r e s u l t -i n g i n t h e p r o d u c t i o n o f s n a k e f o r m s ( 2 0 , 3 7 ) .The s n a k e f o r m s p r e v i o u s l y o b s e r v e d b y F r i e da n d N o v i c k ( 1 2 ) d u r i n g t h e g r o w t h o f E . c o l i i nh i g h c o n c e n t r a t i o n s o f e t h a n o l ma y a l s o r e s u l tf r o m t h e e f f e c t o f e t h a n o l o n p e p t i d o g l y c a nc r o s s - l i n k i n g . E t h a n o l ma y a l t e r t h e s y n t h e s i s o fl i p o p o l y s a c c h a r i d e o r o t h e r a s p e c t s o f p e p t i d o -g l y c a n s y n t h e s i s s u c h a s c h a i n l e n g t h o r n e ts y n t h e s i s . S u c h c h a n g e s ma y a l s o b e i n v o l v e d i ne t h a n o l - i n d u c e d l y s i s b u t h a v e n o t b e e n a d -d r e s s e d i n t h i s s t u d y .A l c o h o l s a n d o t h e r a m p h i p a t h i c m o l e c u l e sh a v e b e e n s h o w n t o a l t e r a v a r i e t y o f m e m b r a n e -a s s o c i a t e d p r o c e s s e s ( 2 4 , 2 7 , 3 5 ) . The p o t e n c y o fa l c o h o l s a n d o t h e r a g e n t s i n e l i c i t i n g t h e s e e f -f e c t s i s d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e i r h y d r o p h o b i c i t yo r o c t a n o l - w a t e r p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s ( 1 6 , 3 5 ) .A l t h o u g h t h i s p r o v i d e s s t r o n g e v i d e n c e f o r ah y d r o p h o b i c s i t e ( s ) o f a c t i o n , t h e s p e c i f i c s i t e o rt y p e s o f i n t e r a c t i o n n e e d n o t b e i d e n t i c a l . Manyb i o l o g i c a l p r o c e s s e s a r e k n o w n t o c h a n g e i n as i m i l a r f a s h i o n i n r e s p o n s e t o a l c o h o l s o f c h a i nl e n g t h s o f 1 t h r o u g h 8 o r 1 0 ( 3 5 ) . F o r e x a m p l e ,t h e r a t i o o f a n i o n i c l i p i d s t o p h o s p h a t i d y l e t h a -n o l a m i n e i n c r e a s e s i n a s i m i l a r f a s h i o n d u r i n gg r o w t h w i t h a l l a l c o h o l s i n E . c o l i ( 1 8 ) . H o w e v e r ,some p r o c e s s e s a r e d i f f e r e n t i a l l y a f f e c t e d b y a l -c o h o l s o f d i f f e r e n t c h a i n l e n g t h s . P r e v i o u s s t u d -i e s b y D a g l e y e t a l . ( 8 ) r e p o r t e d d i f f e r e n c e s i nt h e e f f e c t s o f h e x a n o l a n d e t h a n o l o n t h e g r o w t ho f E n t e r o b a c t e r i n m i n i m a l m e d i u m s u p p l e -m e n t e d w i t h a m i n o a c i d s . I n E . c o l i , a l c o h o l s o fd i f f e r e n t c h a i n l e n g t h s h a v e a d i f f e r e n t i a l e f f e c to n l a c p e r m e a s e a c t i v i t y . E t h a n o l a n d o t h e rs i m p l e a l c o h o l s o f u p t o f o u r c a r b o n s i n l e n g t h( 1 2 , 1 9 ) i n h i b i t p e r m e a s e a c t i v i t y , w h e r e a sl o n g e r - c h a i n a l c o h o l s s u c h a s h e x a n o l ( 1 9 , 3 9 )s t i m u l a t e p e r m e a s e a c t i v i t y . T h e s e t w o g r o u p so f a l c o h o l s a l s o h a v e d i f f e r e n t i a l e f f e c t s o n a c y lc h a i n c o m p o s i t i o n i n E . c o l i . D u r i n g g r o w t h w i t he t h a n o L t h e p r o p o r t i o n o f u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d s ( 1 6 ) a n d o f p h o s p h o l i p i d s p e c i e s c o n t a i n i n gt w o u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( 1 ) i s i n c r e a s e d . Th eo p p o s i t e e f f e c t s o c c u r d u r i n g g r o w t h w i t h h e x -a n o l ( 1 , 1 6 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , n u m e r o u so t h e r d i f f e r e n c e s i n t h e e f f e c t s o f e t h a n o l a n dh e x a n o l w e r e f o u n d . H e x a n o l i n c r e a s e d mem-b r a n e f l u i d i t y , w h e r e a s e t h a n o l h a d l i t t l e e f f e c tw h e n c o m p a r e d a t c o n c e n t r a t i o n s c a u s i n g s i m i -l a r g r o w t h i n h i b i t i o n . G r o w t h i n t h e p r e s e n c e o fe t h a n o l r e s u l t e d i n t h e p r o d u c t i o n o f u n - c r o s s -l i n k e d p e p t i d o g l y c a n a n d s u b s e q u e n t l y s i s . I nc o n t r a s t , h e x a n o l d i d n o t a l t e r c r o s s - l i n k i n g o rc a u s e l y s i s . E t h a n o l - r e s i s t a n t m u t a n t s e x h i b i t e d

n o i n c r e a s e i n r e s i s t a n c e t o h e x a n o l . E l e c t r o l y t e sp r o t e c t e d c e l l s a g a i n s t e t h a n o l - i n d u c e d l y s i s b u tp o t e n t i a t e d g r o w t h i n h i b i t i o n b y h e x a n o l . T h e s ed i f f e r e n c e s i n t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f s h o r t -v e r s u s l o n g - c h a i n a l c o h o l s i n d i c a t e t h a t t h e s et w o g r o u p s d i f f e r i n t h e i r s p e c i f i c i n t e r a c t i o n sw i t h b i o l o g i c a l m e m b r a n e s .I n a l l c a s e s , s m a l l , r e l a t i v e l y p o l a r c o m p o u n d ss u c h a s a c e t o n e , m e t h a n o l , a n d d i o x a n e c a u s ec h a n g e s s i m i l a r t o t h o s e c a u s e d b y s h o r t - c h a i na l c o h o l s , w h e r e a s m o r e h y d r o p h o b i c m o l e c u l e sc a u s e c h a n g e s s i m i l a r t o t h o s e c a u s e d b y h e x a n o l( 1 7 ) . H o w e v e r , s i z e a l o n e d o e s n o t a p p e a r t o b eo f m a j o r i m p o r t a n c e . We o b s e r v e d t h a t 1 , 6 - h e x -a n e d i o l i n d u c e s l y s i s a n d i n c r e a s e d s y n t h e s i s o fu n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s . S i m p l e a l c o h o l s c o n s i s to f t w o p a r t s : a h y d r o p h o b i c t a i l a n d a h y d r o x y lf u n c t i o n . T w o g e n e r a l p r o p e r t i e s a r e u s u a l l y a s -s o c i a t e d w i t h t h e s e p a r t s : a d i s r u p t i v e e f f e c t o nm e m b r a n e o r g a n i z a t i o n r e s u l t i n g f r o m t h e i n t e r -c a l a t i o n ( 6 , 2 7 ) o f t h e h y d r o p h o b i c t a i l a n d ad e h y d r a t i n g e f f e c t i n v o l v i n g h y d r o g e n b o n d i n g .T h e i n t e r c a l a t i o n o f a l l a l c o h o l s o f u p t o e i g h tc a r b o n s i n l e n g t h h a s a q u a l i t a t i v e l y s i m i l a re f f e c t o n m e m b r a n e o r g a n i z a t i o n , a d e c r e a s e i no r d e r ( 6 , 2 3 , 4 3 ) . Q u a n t i t a t i v e l y , t h e e f f e c t o fh e x a n o l o n m e m b r a n e f l u i d i t y i s 1 0 - f o l d t h a t o fe t h a n o l w h e n c o m p a r e d a t c o n c e n t r a t i o n s c a u s -i n g a s i m i l a r i n h i b i t i o n o f g r o w t h i n E . c o l i .A l t h o u g h a c h a n g e ma y b e i n v o l v e d i n some o ft h e s h a r e d e f f e c t s o f a l c o h o l s , i t c a n n o t e x p l a i nt h e d i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f a l c o h o l s . I n t h e s e c o n de f f e c t i n v o l v i n g h y d r o g e n b o n d i n g a n d p o s s i b l ew a t e r r e p l a c e m e n t , s h o r t - c h a i n a l c o h o l s a n d r e l -a t i v e l y p o l a r c o m p o u n d s w o u l d b e e x p e c t e d t ob e much more a c t i v e t h a n l o n g - c h a i n a l c o h o l s .S h o r t - c h a i n a l c o h o l s s u c h a s e t h a n o l a r e c o m -p a t i b l e w i t h b o t h h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i ce n v i r o n m e n t s a s e v i d e n c e d b y t h e i r m i s c i b i l i t yw i t h b o t h d i e t h y l e t h e r a n d w a t e r . A l l a g e n t st h u s f a r f o u n d t o c a u s e c h a n g e s s i m i l a r t o t h o s ec a u s e d b y e t h a n o l i n E . c o l i a r e c a p a b l e o fh y d r o g e n b o n d i n g . A t p h y s i o l o g i c a l l y e m p l o y e dc o n c e n t r a t i o n s , s h o r t - c h a i n a l c o h o l s a n d t h e r e l -a t i v e l y p o l a r a g e n t s a r e p r e s e n t i n h i g h c o n c e n -t r a t i o n s i n t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t , i n c o m p a r -i s o n w i t h t h e c o n c e n t r a t i o n o f h e x a n o l , a n d o f t e nc o n s t i t u t e o v e r 1 % o f t h e m o l e c u l e s p r e s e n t . T h i sh i g h c o n c e n t r a t i o n o f s h o r t - c h a i n a l c o h o l s w o u l de n h a n c e t h e o p p o r t u n i t i e s f o r w a t e r r e p l a c e -m e n t . A l l a l c o h o l s a r e t h u s v i e w e d a s s i m i l a r i na c t i v i t i e s . I n t e r c a l a t i o n i s p r o m o t e d b y l o n g e rh y d r o c a r b o n c h a i n s , w h e r e a s d e h y d r a t i o n , a s ap r o p e r t y o f t h e h y d r o x y l g r o u p ( o r h y d r o g e nb o n d i n g g r o u p ) , p r i m a r i l y r e f l e c t s m o l a r a b u n -d a n c e . W i t h t h e more p o t e n t l o n g e r - c h a i n a l c o -h o l s , t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s w o u l d b e e x p e c t e d t or e s u l t f r o m i n t e r c a l a t i o n i n t o h y d r o p h o b i c r e -g i o n s . L i m i t a t i o n s o f s o l u b i l i t y a n d c e l l i n t e g r i t y

J . B A C T r E R I O L .


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488 INGRAM AND VREELAND5 5 1 - 5 5 9 .2 3 . J a i n , M . K . , J . G l a s e r , A . U p r e t i , an d G . C . U p r e t i .1 9 7 8 . I n t r i n s i c p e r t u r b i n g a b i l i t y o f a l k a n o l s i n l i p i db i l a y e r s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 0 9 : 1 - 8 .2 4 . J a i n , M . K . , a n d N . M . Wu . 1 9 7 7 . E f f e c t o f s m a l l m o l e -c u l e s on t h e d i p a l n i t o y l l e c i t h i n l i p o s o m a l l a y e r . m.P h a s e t r a n s i t i o n i n l i p i d b i l a y e r . J . M e m b r . B i o l . 3 4 :1 5 7 - 2 0 1 .2 5 . K o z a r i c h , J . W . , and J . L S t r o m i n g e r . 1 9 7 8 . A mem-b r a n e enzyme f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s w h i c h c a t -a l y z e s t r a n s p e p t i d a s e , c a r b o x y p e p t i d a s e , a n d p e n i c i l l i n -a s e a c t i v i t i e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 : 1 2 7 2 - 1 2 7 8 .2 6 . L a y n e , E . 1 9 5 7 . S p e c t r o p h o t o m e t r i c a n d t u r b i d o m e t r i cm e t h o d s f o r m e a s u r i n g p r o t e i n s . M e t h o d s E n z y m o l . 3 :4 4 7 - 4 5 4 .2 7 . L e e , A . G . 1 9 7 6 . I n t e r a c t i o n b e t w e e n a n a e s t h e t i c s a n dl i p i d m i x t u r e s : n o r m a l a l c o h o l s . B i o c h e m i s t r y 1 5 : 2 4 4 8 -2 4 5 4 .2 8 . L o w r y , 0. H., N . J . R o s e b r o u g h , A . L F a r r , and R . J .R a n d a l l . 1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i np h e n o l r e a g e n t . J . B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .

2 9 . L u r i a , S. E . , and M . D e l b r u c k . 1 9 4 3 . M u t a t i o n s o fb a c t e r i a f r o m v i r u s s e n s i t i v i t y t o v i r u s r e s i s t a n c e . G e -n e t i c s 2 8 : 4 9 1 - 5 1 1 .3 0 . M a c D o n a l d , A . G . 1 9 7 8 . A d i l a t o m e t r i c i n v e s t i g a t i o n o ft h e e f f e c t s o f g e n e r a l a n a e s t h e t i c s , a l c o h o l s a n d h y d r o -s t a t i c pressure on t h e p h a s e t r a n s i t i o n i n s m e c t i c me -s o p h a s e s o f d i p a l m i t o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e . B i o c h i m .B i o p h y s . A c t a 5 0 7 : 2 6 - 3 7 .3 1 . N u n n , W. D . 1 9 7 5 . T h e i n h i b i t i o n o f p h o s p h o l i p i d syn-t h e s i s i n E s c h e r i c h i a c o l i b y p h e n e t h y l a l c o h o l .B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 3 8 0 : 4 0 3 - 4 1 3 .3 2 . P a r k , J . T . , and M . J . J o h n s o n . 1 9 4 9 . A s u b m i c r o d e t e r -m i n a t i o n o f g l u c o s e . J . B i o l . C h e m . 1 8 1 : 1 4 9 - 1 5 1 .3 3 . P a t e r s o n , S. J . , K . W. B u t l e r , P . H u a n g , J . L a b e l l e , L .C . P . S m i t h , and H . S c h n e i d e r . 1 9 7 2 . The e f f e c t s o f

J . B A C T E R I O L .a l c o h o l s o n l i p i d b i l a y e r s : a s p i n l a b e l s t u d y . B i o c h i m .B i o p h y s . A c t a 2 6 6 : 5 9 7 - 6 0 2 .3 4 . R a e t z , C . R . 1 9 7 8 . E n z y m o l o g y , g e n e t i c s , a n d r e g u l a t i o no f m e m b r a n e p h o s p h o l i p i d s y n t h e s i s i n E s c h e r i c h i ac o l i . M i c r o b i o l . R e v . 4 2 : 6 1 4 - 6 5 9 .3 5 . S e e m a n , P . 1 9 7 2 . T h e m e m b r a n e a c t i o n s o f a n a e s t h e t i c sa n d t r a n q u i l i z e r s . P h a r m a c o l . R e v . 2 4 : 5 8 3 - 6 5 5 .3 6 . S i l b e r t , D . F . 1 9 7 0 . A r r a n g e m e n t o f f a t t y a c y l g r o u p s i np h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e f r o m a f a t t y a c i d a u x o t r o p ho f E s c h e r i c h i a c o l i . B i o c h e m i s t r y 9 : 3 6 3 1 - 3 6 4 0 .3 7 . S t a r k a , J . , and J . M o r a v o v a . 1 9 6 7 . C e l l u l a r d i v i s i o n o fp e n i c i l l i n i n d u c e d f i l a m e n t s o f E s c h e r i c h i a c o l . F o l i aM i c r o b i o l . ( P r a g u e ) 1 2 : 2 4 0 - 2 4 7 .3 8 . S u l l i v a n , K . H . , G . D . H e g e m a n , a n d E . H . C o r d e s .1 9 7 9 . A l t e r a t i o n o f t h e f a t t y a c i d c o m p o s i t i o n o f E s c h -e r i c h i a c o l i b y g r o w t h i n t h e p r e s e n c e o f n o r m a l a l c o -h o l s . J . B a c t e r i o l . 1 3 8 : 1 3 3 - 1 3 8 .3 9 . S u l l i v a n , K . H . , M . K . J a i n , a n d A . L K o c h . 1 9 7 4 .A c t i v a t i o n o f t h e , B - g a l a c t o s i d e t r a n s p o r t s y s t e m i nE s c h e r i c h i a c o l i ML 3 0 8 b y n - a l l c a n o l s . B i o c h i m . B i o -p h y s . A c t a 3 5 2 : 2 8 7 - 2 9 7 .

4 0 . T a m u r a , T . , Y . I m a e , a n d J . L S t r o m i n g e r . 1 9 7 6 .P u r i f i c a t i o n t o h o m o g e n e i t y a n d p r o p e r t i e s o f t w o D -a l a n i n e c a r b o x y p e p t i d a s e I f r o m E . c o l i . J . B i o l . C h e m .2 5 1 : 4 1 4 - 4 2 3 .4 1 . T i l l e y , F . W . , a n d J . M . S h a f f e r . 1 9 2 6 . R e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h e c h e m i c a l c o n s t i t u t i o n a n d g e r m i c i d a l a c t i v -i t y o f t h e m o n o h y d r i c a l c o h o l s a n d p h e n o l s . J . B a c t e r i o l .1 2 : 3 0 3 - 3 0 9 .4 2 . T i p p e r , D . J . , a n d J . L S t r o m i n g e r . 1 9 6 8 . B i o s y n t h e s i so f t h e p e p t i d o g l y c a n o f b a c t e r i a l c e l l w a l l s . J . B i o l .C h e m . 2 4 3 : 3 1 6 9 - 3 1 7 9 .4 3 . V a n d e r o o i , J . M . , R I B a n d e s b e r g , H .elick, and G .M c D o n a l d . 1 9 7 7 . I n t e r a c t i o n o f g e n e r a l a n a e s t h e t i c sw i t h p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s a n d b i o l o g i c a l m e m b r a n e s .B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 6 4 : 1 - 1 6 .


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