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Calcolo dell’incertezza di misura

nell’analisi delle micotossine

Istituto Superiore di SanitàCentro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari

Reparto - OGM e Micotossine

La problematica delle micotossine nella filiera agro-alimentare:

stato dell’arte e prospettive

14-15 novembre 2007

1BARBARA DE SANTIS

ISS 14-15 novembre

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SOMMARIO

• Introduzione

– cos‟è l‟incertezza?

– perché è necessaria?

• Stima dell‟incertezza

– approccio Bottom-up

– approccio Top-down

• Presentazione dei risultati

2BARBARA DE SANTIS

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L‟incertezza è un parametro associato

con il risultato di una misura e

caratterizza la dispersione dei valori

che possono essere ragionevolmente

attribuiti al misurando

Cos‟è l‟incertezza: definizione

ISO, International vocabulary of basic and general terms in metrology;

Geneva: International Organization for Standardization; 1993.

3BARBARA DE SANTIS

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Perché è necessaria?

• Limiti legali

• Fuori specifica

• Trovare un valore

certificato

• Due risultati in

disaccordo

Risultato Conclusione Azione

permit granted

ri-lavorare il batch

esattezza del metodo

trovare il risultato

corretto

4BARBARA DE SANTIS

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STANDING COMMITTEE ON THE FOOD CHAIN AND ANIMAL HEALTH

Section on Toxicological Safety of the Food Chain Summary record of 6h

meeting- July 17th 2003

• measurement uncertainty has to be taken into

account in checking compliance against

maximum levels.

• A consignment is considered non-complying and

official measures (such as rejection) are applied

only when the analytical result is beyond

reasonable doubt above the legal limit. -

5BARBARA DE SANTIS

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Attualmente in Europa i tenori massimi

delle micotossine nei prodotti alimentari

sono definiti nel REGOLAMENTO (CE) N.

1881/2006

Ovviamente il processo di definizione

dell‟incertezza di misura è riferibile a

rilevazioni di tipo quantitativo e non qualitativo

6BARBARA DE SANTIS

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Come: metodi di calcolo dell‟incertezza

validazione del metodo

normal reliability applies

Il metodo mostra prestazioni normali?

Conoscere la normale fattibilità del metodo

Risultato e sua incertezza

Conoscere il metodo nel dettaglio

Quantificare le influenze

Conoscere tutte le influenze sul risultato

Top-down

Bottom-up

7BARBARA DE SANTIS

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DEFINIZIONI I Incertezza Standard [ u minuscola ]: è una

deviazione standard

Grado di dubbio riguardo la correttezza del

risultato di misura

Incertezza Estesa [ U maiuscola ]: intervallo

che sicuramente include il valore vero

– se l‟intervallo è incorrettamente troppo piccolo: si arriva a conclusioni sbagliate

– se l‟intervallo è incorrettamente troppo ampio: risultato privo di utilità

8BARBARA DE SANTIS

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In generale, nel corso di un processo o di una

prova, le grandezze in gioco, ciascuna con il suo

contributo d‟incertezza, possono essere

numerose.

L’incertezza composta:

è uno scarto tipo stimato come radice quadrata

positiva della varianza totale, ottenuta

combinando tutte le componenti dell‟incertezza

individuate

9BARBARA DE SANTIS

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DEFINIZIONI II

L’incertezza estesa:

definisce un intervallo all‟interno del quale si può

ritenere si trovi il valore del misurando ad un certo

livello di fiducia.

È ricavata dall‟incertezza composta moltiplicandola per un

fattore di copertura (k)

k=2 definisce un intervallo di fiducia approssimativamente

del 95%

k=3 e definisce un intervallo avente livello di fiducia

approssimativamente del 99%

10BARBARA DE SANTIS

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DEFINIZIONI III

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Bottom-up approach EURACHEM (EA 4/02)

-approccio classico metrologico-

Definisce tutte le possibili fonti di incertezza che

sono rilevanti e le considera separatamente nel

contributo al calcolo dell‟incertezza totale

•Definizione del modello della misurazione

y = f (x1, x2, ..., xi, ..., xn),

•Identificazione di tutte le sorgenti d’incertezza

•Definizione delle operazioni necessarie, associando ad

ognuna di esse una variabilità

•Valutazione delle incertezze delle grandezze d’ingresso,

tipo A e B

•Combinazione delle incertezze11

Le diverse componenti di incertezza sono

espresse in termini di deviazioni standard (s)

Tutte le componenti vengono combinate

insieme sotto forma di incertezze relative

quadratiche per dare l‟incertezza totale

o incertezza composta

12BARBARA DE SANTIS

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2

relu

BARBARA DE SANTIS

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incertezza di tipo A

basata su qualsiasi valido metodo statistico, stimata per il

misurando q come media di n osservazioni ripetute.

Incertezza standard: deviazione standard della media

13



nssukqqq /2

Le singole componenti dell‟incertezza sono divise in:

incertezze di tipo A

incertezze di tipo B

Incertezza di ripetibilità

Si eseguono almeno 10 analisi al livello y:

y1, y2, y3, ..., yn con i=1,2,….., n, numero di analisi indipendenti

Si calcola:

• Valore medio

• Deviazione Standard

• Deviazione Standard della media

• Incertezza di Ripetibilità

• Incertezza di Ripetibilità relativa

(u rip.rel)2 = contributo quadratico

n

surip

1

)( 2

nn

yy

s

mi

m

1

)( 2

n

yy

s

mi

m

relripyn

su

1.

14BARBARA DE SANTIS

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-approccio classico metrologico- contributo di tipo A

n

y

y

n

i

i

m

1

Incertezza della curva di taratura

Poiché lo strumento di misura utilizzato presuppone la

costruzione di una retta di taratura e poiché la stessa retta

viene utilizzata per il calcolo del misurando, viene considerato

anche il contribuito dell‟incertezza della retta di taratura. (UNI

CEI ENV 13005)

Incertezza relativa

al livello di calibrazione

15BARBARA DE SANTIS ISS 14-15

novembre [email protected]



n

x

x

xx

n

1

m

1

b

S

u

2

i

2

2

i

imp r e dy

x

ta r

p re d

ta rta r .r e l

x

uu

Incertezza della curva di taratura

• (S x/y)= [(yobs – ypred)2/(n-2)]

• ypred = b + a xi

• xpred = (yobs – b)/a

• a = slope

• b= intercetta

• yobs = valore del segnale sperimentale

• ypred= valore del segnale sperimentale dalla curva di taratura

• xi = valore convenzionale dello standard per I diversi livelli di taratura

• xpred = valore del misurando ottenuto dalla curva

• xim = valore medio dei valori convenzionali del materiale di riferimento relativi

ai diversi livelli di taratura;

• n = numero dei livelli di taratura (generalmente n=5)

• m = numero delle misurazioni replicate per ogni livello (generalmente m=10)16

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incertezza di tipo Bbasata su giudizi scientifici utilizzando tutte le

informazioni rilevanti disponibili:• certificati (CRMs, taratura bilance, …)

• manufacturer’s specifications (bilances, volumetric flasks, …)

• misurazioni precedenti (dati di validazione, …)

• uncertainties of reference data

• esperieza, conoscenze generali

• ...

se sono disponibili come incertezze standard, vengono usate come tali,

altrimenti, si usano appropriati fattori di conversione

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17



Incertezza del materiale di riferimento (RM)

È ottenuta dividendo l‟incertezza estesa indicata nel certificato per il

fattore di copertura indicato:

uRM= Udeclared/K

•In alcuni casi, l‟incertezza indicata come un intervallo di confidenza

del 95 % della media delle medie di laboratorio. In questo caso, è il

fattore t calcolato in tabella (per un intervallo di confidenza del 95 %

con n-1 gradi di libertà, con n il numero di laboratori) il dividendo

dell‟Incertezza

uRM = Udeclared/t (n-1)

18BARBARA DE SANTIS

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-approccio classico metrologico- contributo di tipo B

Incertezza della vetreria

uglass = Udeclared/3

L‟incertezza diciarata dal produttore viene divisa per un

fattore di conversione:

• 3 corrispondente ad una distribuzione rettangolare (i

valori hanno tutti uguale probabilità)

•6 distribuzione triangolare (i valori centrali sono più

probabili, come nel caso delle burette)

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19



Possibili contributi all‟incertezza per l‟analisi in HPLC delle micotossine

• Contributo di ripetibilità (Tipo A)

• Contributo di recupero (Tipo A)

• Contributo strumentale (Tipo B)

• Contributo della retta di taratura (Tipo A)

• Contributo di taratura della vetreria (Tipo B)

• Contributo della pesata (Tipo B)

• Contributo dell‟incertezza del materiale di riferimento (Tipo B)



L’incertezza composta relativa:

i vari contributi di incertezza standard relativi vengono elevati al quadrato e sommati sotto radice

L’incertezza composta

uc = uc–rel xm Xm valore medio

2.

2

.

2

.

2

.

2

.

2

.

2

.. relpesreltarrelrecrelstrrelRMrelvetrrelriprelc uuuuuuuu

21BARBARA DE SANTIS

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Incertezza estesa

Dove t è il valore critico del t di Student per i gradi di libertà calcolati ( = n-1), eper il livello di significatività definito, generalmente = 0,05, o il livello diprobabilità level P (P = 1- = 0,95).

Quando l‟incertezza composta è derivata da diversi contributi, il valore di t èderivato sui gradi di libertà effettivi calcolati come segue (formula di WELCH-SATTERHWAITE):

dove

u(y) = incertezza standard relativa associata al misurando

u(xi) = incertezza standard associata ai contributi di tipo A

νi = gradi di libertà per ognuno dei u(xi):

• νi = n-1, per u(xi) ripetibilità, con n = numero di ripetizioni

• νi = n-2, per u(xi) taratura, con n = numero dei livelli di taratura

ii

eff

vxu

yuv

4

4

22BARBARA DE SANTIS ISS

14-15 novembre

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cutU



Il bottom-up è un approccio piuttosto

complesso nella sua realizzazione poiché

è difficile definire e quantificare tutte le

fonti di incertezza

Inoltre è piuttosto costoso

23BARBARA DE SANTIS

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Alternativamente al bottom-up per il calcolo

dell‟incertezza si può considerare il top-down

approach (olistico)

I dati utilizzati in questo tipo di metodo derivano da:

• studi di validazione di metodi

• studi interlaboratorio

• studi per il controllo della qualità

Top-down approach

24BARBARA DE SANTIS

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Si può calcolare l‟incertezza in

diversi modi

1. Avendo a disposizione i dati relativi a un metodo normato

2. Partecipando a un collaborative trial

3. Partecipando a un proficiency test

4. Utilizzando i dati di un collaborative trial

5. Analizzando un materiale di riferimento certificato

25BARBARA DE SANTIS

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BARBARA DE SANTIS

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Avendo a disposizione i dati relativi a un metodo normato si confrontano

le prestazioni del laboratorio con quelle del metodo normato

Si eseguono n (generalmente 10) repliche su un campione adatto. Si

calcola lo scarto tipo di ripetibilità sr. Si confronta sr calcolato con quello

indicato dalla norma бr. Dovrà essere:

1. Metodo Normato

sr_lab = Scarto tipo di ripetibilità calcolata dal laboratorio

бr = Scarto tipo di ripetibilità ricavato dal metodo normato

A e B = parametri scelti in funzione dei gradi di libertà ν=n-1

Nel caso in cui le condizioni operative del laboratorio siano

comparabili (A ≤ Slab/Sr ≤ B) con quelle del metodo, si può

utilizzare come stima dell‟incertezza lo scarto tipo di

riproducibilità del metodo normato

A ≤ Sr_lab/ r ≤ B

26

se m=1 e se risulta , l‟espressione del risultato sarà:

1. Metodo NormatoSe il rapporto sr/бr dovesse risultare < A, il Coordinatore di analisi

verificherà a quale fattore si deve la migliore ripetibilità del laboratorio (ad es. l‟utilizzo di uno strumento di nuova generazione).

Se il rapporto sr/бr dovesse risultare > B, il Coordinatore di analisi valuterà le modalità esecutive per individuare la fonte della più scadente precisione.

Se il rapporto sr/бr risulta invece accettabile si esprime il risultato secondo la seguente formula:

Con: ym = media dei risultati delle prove routinarie

K = fattore di copertura (=2)

бL scarto tipo interlaboratorio

m numero delle prove eseguite per esprimere il risultato

m

sky r

Lm

22

222

rRL

22

rr s

2

Rm ky

2. Partecipare ad un collaborative trial

Ogni laboratorio che ne fa parte deve utilizzare lo

stesso metodo, la stessa matrice e lo stesso

parametro del quale si vuole calcolare l‟incertezza.

L‟incertezza per un dato livello corrisponde allo

scarto tipo di riproducibilità, R .

28BARBARA DE SANTIS

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Per il livello considerato nello studio collaborativo

il valore di incertezza estesa è pari a:

U=K*R

Per un dato livello prossimo a quello considerato nel trial

l‟incertezza estesa è pari a:

U=K*(R/ym )*y

ym=media dati ottenuti dal trial

y=risultato dell‟analisi eseguita dal laboratorio

R=scarto tipo di riproducibilità del trial

29BARBARA DE SANTIS

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2. Partecipare a un collaborative trial

3. Partecipare a un proficiency test (FAPAS)

nu

I laboratori che fanno parte del test utilizzano il metodo di

analisi di uso corrente

L‟incertezza corrisponde al rapporto fra la deviazione

standard robusta () e la radice del numero di dati utilizzati

per calcolare la media robusta.

[Le statistiche robuste non risentono dell’influenza dei dati anomali]

Da cui l‟incertezza estesa

uU *2



4.Utilizzare i risultati di un collaborative trial

Pur non avendo partecipato a un collaborative

trial si può utilizzare lo scarto tipo di riproducibilità

che risulta dal trial previo confronto della

ripetibilità con quella del collaborative trial

A ≤ Slab/r ≤ B

Slab = Scarto tipo di ripetibilità calcolata dal laboratorio

r = Scarto tipo di ripetibilità ricavato dal trial

A e B = parametri scelti in funzione dei gradi di libertà



Lo scarto tipo di riproducibilità di un collaborative trial può

essere utilizzato se le seguenti condizioni sono soddisfatte

• Le tipologie di campioni utilizzate nel trial sono simili a

quelle utilizzate nel laboratorio

• La ripetibilità del laboratorio è simile a quella del trial

• La riproducibilità all‟interno del laboratorio (intermedia)

non è maggiore della riproducibilità del trial

• Le analisi all‟interno del laboratorio sui materiali certificati

non evidenziano errori sistematici (bias)

• Deve essere stato assegnato un valore „vero‟

indipendentemente dai risultati del test

32BARBARA DE SANTIS

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4.Utilizzare i risultati di un collaborative trial

L‟incertezza può essere calcolata mediante l‟analisi di un materiale di riferimento in matrice certificato, se disponibile, paragonabile a quella analizzata.

Si utilizzano il valore di riferimento μ e l‟incertezza Uμ.riportata sul certificato

Lo scarto tipo sμ è ottenuto dividendo l‟incertezza estesa indicata nel certificato per il fattore di copertura indicato:

uCRM= Udeclared/K

– In alcuni casi, l‟incertezza indicata come un intervallo di confidenza del 95 % della media delle medie di laboratorio. In questo caso, è il fattore t calcolato in tabella (per un intervallo di confidenza del 95 % con n-1 gradi di libertà, con n il numero di laboratori) il dividendo dell‟Incertezza

uCRM = Udeclared/t (n-1)

5.Analisi di un materiale di riferimento certificato

– Si definisce prima lo scarto tipo di ripetibilità бr accettabile; ricavato dalla ripetibilità riportata nel metodo stesso o stabilita dal Coordinatore di analisi in funzione di altri dati disponibili (criteri di accettabilità riportati nelle norme di riferimento).

– Si esegue l‟analisi sul materiale con un numero di ripetizioni n=10. Si calcolano la media ym e lo scarto tipo di ripetibilità sr.

– Si verifica se lo scarto tipo sperimentale sr è accettabile secondo l‟espressione seguente:

• A ≤ sr/ бr ≤ B

dove A e B sono valori riportati nella tabella seguente e sono funzione del numero di gradi di libertà ν:


Se il rapporto sr/бr dovesse risultare < A, il Coordinatore di analisi verificherà a quale fattore si deve la migliore ripetibilità del laboratorio (ad es. l‟utilizzo di uno strumento di nuova generazione).

Se il rapporto sr/бr dovesse risultare > B, il Coordinatore di analisi valuterà le modalità esecutive per individuare la fonte della più scadente precisione.

Se il rapporto sr/бr risulta accettabile viene calcolato il semi intervallo di fiducia 1/2 IF della differenza tra la media ym ed il valore di riferimento μ:

coneffp

r tsn

s ;95,0

22

IF21 1

22

2

22

n

n

s

sn

s

r

r

eff


La media dei risultati è considerata accurata

se:

L‟incertezza estesa U da associare al

risultato, calcolata come media di m prove di

routine (m<n), è data dall‟espressione:

IFym2

1

effpr ts

m

sU ;95,0

22


L‟utilizzo dell‟equazione di Horwitz rappresenta un approccio temporaneo,

utile per avere una stima dell‟incertezza in attesa di raccogliere dati

necessari per una stima più accurata, e semplificato.

Poiché con l‟equazione di Horwitz per valori < a 10ug/kg si tende a

sovrastimare l‟incertezza di misura (infatti al decrescere della

concentrazione l‟incertezza estesa tende al valore del misurando),

sono accettate alcune funzioni che correggono questo effetto (ad

esempio da Thompson) e che modificano il calcolo della бR di Horwitz,

a seconda dei livelli della concentrazione della micotossina, come di

seguito riportato:

Per livelli: C < 0,12 mg/kg бR=0,22*c

Per livelli compresi fra: 0,12 mg/kg ≤ C ≤ 138 g/kg бR=0,02*c0,8495

Per livelli C > 138 g/kg бR=0,01*c1/2

6. Equazione di Horwitz

L‟incertezza viene calcolata sulla base della riproducibilità ricavata dall‟Equazione di Horwitz, per i vari livelli.

Si calcola lo scarto tipo di riproducibilità secondo Horwitz:

Log10 бR = 0,8495 log10 c – 1,6990

бR=0,02*c0,8495

dove

бR è lo scarto tipo di riproducibilità

c è la concentrazione dell‟analita espresso in unità (m/m).

Per verificare l‟applicabilità dell‟equazione nel laboratorio si deve verificare:

0,5 бR ≤ sr ≤ 0,66 бR

бR è lo scarto tipo di riproducibilità calcolato secondo Horwitz

sr è lo scarto tipo di ripetibilità sperimentale del laboratorio

Si eseguono 10 letture per ogni campione a valore noto. Si calcola sr

6. Equazione di Horwitz

si verifica che:

0,5 бR ≤ sr ≤ 0,66 бR

Se la condizione è rispettata viene calcolata l‟incertezza estesa:

dove K è il fattore di copertura corrispondente al t di Student per il numero di gradi di libertà (n-1) ed il fattore α (in genere 0,05).

Quando non è disponibile un criterio di accettabilità per l‟incertezza, il valore calcolato con l‟equazione di Horwitz può essere considerato come il valore massimo accettabile.

RKU

Il top-down approach è nettamente più

semplice da implementare rispetto al

bottom-up approach.

Inoltre per applicarlo non sono

necessarie grandi risorse economiche.



Confrontato con il bottom-up

tendenzialmente però il top-down fornisce

valori più elevati di incertezza.

Il metodo top-down richiede, in tutti i casi

in cui è applicato, un‟analisi di

adeguatezza dei dati che si hanno a

disposizione.



Espressione dell’incertezza nel rapporto di

prova

Il valore dell‟incertezza estesa da associare al risultato della prove nel rapporto di prova, corrisponde al valore calcolato in fase di validazione per il livello di concentrazione più vicino al valore ottenuto nell‟analisi del materiale di saggio corretto per tenere conto del numero di prove di routine

L‟incertezza estesa viene quindi espressa nella stessa unità di misura del risultato di analisi.

La correzione che tiene conto del numero di prove di routine viene effettuata secondo quanto di seguito riportato:

Con

uA l‟incertezza di tipo A, ottenute della media di n determinazioni replicate eseguite in fase di convalida (n=10),

m=2 le repliche di routine per l‟analisi di un campione

uB i contributi ottenuti da valutazioni di categoria B (vetreria tarata, materiali di riferimento, ecc).

2222

2

10BABA uuku

m

nukU

Linea guida:

Report on the relationship between analytical results, measurement

uncertainty, recovery factors and provisions of EU food and feed

legislation, with particular reference to community legislation concerning

http://ec.europa.eu/food/food/chemicalsafety/contaminants

/report-sampling_analysis_2004_en.pdf



BARBARA DE SANTIS ISS 14-15


REGOLAMENTO (CE) N. 401/2006

Al di là di un ragionevole dubbio: incertezza

44

Attenzione al

“FITTNESS FOR PURPOSE”

CHE VUOL DIRE CHIEDERSI

Tutta questa attività è adeguata allo

scopo per cui viene fatta?

•Norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2000 “Requisiti generali per la competenza dei laboratori di

prova e taratura”

•Norma ISO/IEC 17025:2005 “General requirements for the competence of testing and calibration laboratories”

•DG 0007 “Requisiti generali per l‟accreditamento dei laboratori di prova”

•Norma UNI CEI ENV 13005:2000 “Guida all‟espressione dell‟incertezza di misura”

•Guida EURACHEM / CITAC CG 4:2000 “Quantifying Uncertainty in Analytical Measurements”

•Rapporti ISTISAN 03/30 “Quantificazione dell‟incertezza nelle misure analitiche”, traduzione italiana

della Guida EURACHEM / CITAC CG 4:2000

•DT 0002 “Guida per la valutazione e la espressione dell‟incertezza nelle misurazioni”

•DT-0002/3 “Avvertenze per la valutazione dell‟incertezza nel campo dell'analisi chimica”

•Documento Sinal “Verifica della qualità del risultato di prove chimiche e microbiologiche”, incontro con gli

ispettori, Milano, 5 luglio 2002

•ARPA Emilia-Romagna “Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo

dell‟incertezza di misura”, Bologna 2003

•IUPAC/ISO/AOAC INTERNATIONAL/EURACHEM “Harmonised guidelines for the use of

recovery information in analytical measurement”

•EA 4/02 “Expression of the Uncertainty of Measurement in Calibration”

•SIT: Doc-519 “Introduzione ai criteri di valutazione della incertezza di misura nelle tarature”

•UNI EN 30012:1993, parte 1a “Requisiti di assicurazione della qualità relativi agli apparecchi per

misurazioni. Sistema di conferma metrologica di apparecchi per misurazioni”

RIFERIMENTI

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