i

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF RICE PHYLLOSPHERE

BACTERIAL ANTAGONISTSAGAINTS Xanthomonas oryzae pv. oryzae

CAUSES OF BACTERIAL LEAF BLIGHT IN RICE (Oryza sativa)

Hanna Karunia Agnita, Ari Susilowati, Ratna Setyaningsih

Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences,

Sebelas Maret University

36A Ir. Sutami Street, Kentingan, Surakarta

ABSTRACT

Bacterial leaf blight (BLB) disease caused by bacteria Xanthomonas

oryzae pv. oryzae (Xoo) commonly attacks rice crops and causes agricultural

product loss. Phyllosphere bacteria in healthy plant tissue can inhibit the growth

of pathogenic bacteria by producing bioactive compounds. This study aimed to

isolate rice phyllosphere bacteria, test its inhibition activity to Xoo pathogen, and

identify antagonist isolates that can be used as prospective biological control

agent of BLB disease.

Phyllosphere bacteria was isolated from rice leaves sample in healthy

plants among HDB-infected plants in Sukoharjo, Boyolali, and Wonogiri. It was

isolated by spread plate method in Actinomycetes agar media. Antagonist test

against Xoo was done by using plug agar method. Inhibition zone formed was

measured then. Cell morphology characters of antagonist phyllosphere bacteria

were determined by Gram staining. Species identity was determined by 16S rRNA

gene sequence analysis.

There were 42 phyllosphere bacteria isolates. Nine isolates inhibited Xoo

in weak category,that wasindicated by a clear zone around the isolates colony.

The greatest inhibition zone was in 7,4 mm apparent. Phyllosphere bacteria

antagonist Xoo obtained based on BLASTN analysis had 96% and 95% similarity

(isolate A12 and G6) indicated that these strains were new species similar to

Pseudomonas sp. and Bacillusamyloliquefaciens respectively, isolate A26 and

A28 were Pseudomonas sp. with 97% similarity, isolate H6 was Bacillus sp. with

99% similarity, and isolate E1, E3, H7, H9 were Microbacterium sp. with 98%

and 97% similarity respectively.

Keywords: phyllosphere bacteria, Xoo, antagonist, 16S rRNA

ii

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI FILOSFER PADI

ANTAGONIS Xanthomonas oryzae pv. oryzae PENYEBAB

HAWAR DAUN BAKTERI TANAMAN PADI (Oryza sativa)

Hanna Karunia Agnita, Ari Susilowati, Ratna Setyaningsih

Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Sebelas Maret

Jl. Ir. Sutami No. 36A Kentingan, Surakarta

ABSTRAK

Penyakit hawar daun bakteri (HDB) yang disebabkan oleh bakteri

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) umum menyerang tanaman padi dan

menyebabkan kerugian hasil pertanian. Bakteri filosfer di dalam jaringan tanaman

sehat dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen dengan menghasilkan

senyawa bioaktif. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri filosfer padi,

menguji aktivitasnya untuk menghambat patogen Xoo,dan mengidentifikasi isolat

antagonis sebagai penelitian awal untuk pengembangan agen pengendali hayati

penyakit HDB.

Bakteri filosfer diisolasi dari sampel daun padi tanaman sehat diantara

tanaman terinfeksi HDB di Kabupaten Sukoharjo, Boyolali, dan Wonogiri dengan

metode spread plate pada media Actinomycetes agar. Uji antagonis terhadap Xoo

menggunakan metode plug agar dan zona hambat yang terbentuk diukur.

Karakter morfologi sel bakteri filosfer antagonis ditentukan dengan pewarnaan

Gram, identitas bakteri ditentukan dengan analisis sekuen gen 16S rRNA.

Dari 42 isolat bakteri filosfer, 9 isolat mampu menghambat Xoo dengan

kategori lemah, yang ditunjukkan dengan zona bening di sekitar koloni isolat

dengan zona hambat terbesar 7,4 mm yang tampak jelas. Bakteri filosfer

antagonis Xoo yang diperoleh berdasarkan analisis BLASTN memiliki kemiripan

sebesar 96% dan 95% (isolat A12 dan G6) yang mengindikasikan bahwa strain-

strain tersebut merupakan spesies baru yang mirip dengan masing-masing

Pseudomonas sp. dan Bacillusamyloliquefaciens, isolat A26 dan A28 merupakan

Pseudomonas sp. dengan kemiripan 97%,isolat H6 merupakan Bacillus sp.

dengan kemiripan 99% dan isolat E1, E3, H7, H9 merupakan Microbacterium sp.

dengan kemiripan masing-masing98% dan 97%.

Kata kunci: bakteri filosfer, Xoo, antagonis, 16S rRNA

iii

PENDAHULUAN

Tanaman padi (Oryza sativa) menjadi komoditas yang sangat pentingdi

Indonesia, karena hampir sebagian besar masyarakat mengonsumsi beras sebagai

bahan makanan pokoknya (Muharam et al., 2011). Penyakit yang umum

menyerang tanaman padi yaitu hawar daun bakteri (HDB) yang disebabkan oleh

bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) (Hop et al., 2014).Lembaran daun

yang terinfeksi mengalami perubahan warna menjadi abu-abu kecoklatan di

sepanjang pembuluh jaringan daun (Gnanamanickam et al.,

1999)dancenderungmenjadi cepat kering (Sudarma, 2013). Akibatnya,

kemampuan tanaman berfotosintesis menurun, sehingga jika terjadi pada tanaman

muda mengakibatkan mati dan jika terjadi pada tanaman fase generatif

mengakibatkan pengisian gabah menjadi kurang sempurna (Balitbangtan,

2015).Penyakit HDB di beberapa wilayah Kabupaten Sukoharjo, Boyolali, dan

Wonogiri memiliki tingkat endemisitas serangan beragam mulai dari aman,

potensial, dan sporadis.Tingkat endemisitas aman berarti tidak ditemukan

serangan HDB. Potensial berarti ditemukan serangan HDB di suatu wilayah dan

serangan berpotensi muncul kembali. Sporadis berarti ditemukan serangan HDB

di suatu wilayah dengan luasan serangan yang lebih besar dan lebih sering dari

wilayah status potensial serta serangan berpotensi muncul kembali (LPHPT

Wilayah Sukoharjo, 2015).Metode pengendalian biologi dapat menjadi alternatif

untuk melindungi tanaman budidaya dari serangan dan infeksi patogen

(Nagendran et al., 2013).Daun (filosfer) menjadi habitat yang sangat besar bagi

mikroba, terutama bakteri dan jamur (Lindow dan Brandl, 2003). Di dalam

filosfer hampir semua jaringan tanaman yang sehat, ada banyak mikroorganisme

yang sinergistik dengan inangnya dengan cara menghasilkan senyawa khusus,

seperti senyawa bioaktif, untuk melindungi inangnya dari serangan mikroba

patogen dan hama (Baskaran et al., 2012). Penelitian ini bertujuan untuk

mengisolasi bakteri filosfer dari sampel daun tanaman padi di beberapa wilayah

Kabupaten Sukoharjo, Boyolali, dan Wonogiri, menguji aktivitasnya untuk

menghambat Xanthomonas oryzae pv. oryzaemelalui uji antagonis, dan

iv

mengetahui identitas isolat bakteri filosfer padi yang dapat menghambat

Xanthomonas oryzae pv. oryzaedengan analisis sekuen gen 16S rRNA.

METODE PENELITIAN

A. Alat

Gunting, kertas bekas, erlenmeyer 100 ml, tabung reaksi, neraca analitik,

cawan petri, autoklaf, laminar air flow (LAF) cabinet, batang degalsky, jarum

ose, cork borrer, cotton bud, bunsen burner, jangka sorong, pipet tetes, gelas

benda, erlenmeyer 50 ml, microtube 1,5 ml, sentrifuge mini spin, biofotometer,

kuvet, elektroforesis horizontal (Thermo Scientific), gel doc (Vilber Lourmat).

B. Bahan

Sampel daun padi berumur 3 minggu sebanyak satu genggam dari

tanaman padi yang sehat yang berada di antara tanaman padi yang

menunjukkan gejala HDB di Kabupaten Sukoharjo (Kecamatan Gatak dan

Grogol), Kabupaten Boyolali (Kecamatan Ngemplak dan Banyudono) dan

Kabupaten Wonogiri (Kecamatan Selogiri dan Ngadirojo), NaCl, aquades,

media Actinomycetes agar, media nutrient agar, CaCO3, glukosa, yeast extract,

agar, media nutrient broth, isolat bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae dari

Laboratorium Mikrobiologi IPB, safranin, iodin, kristal violet, alkohol 95%,kit

ekstraksi bakteri PrestoTM Mini gDNA Bacteria (GeneAid), etanol absolut

dingin, agarosa, buffer TAE (Tris-Acetate-EDTA), marker DNA 1 kb, kertas

parafilm, loading dye (GeneAid), kit PCR Kapa 2G Fast Ready Mix (Kapa

Biosystem), primer 63F, primer 1387R dan ddH2O (double destilate water).

C. Cara Kerja

Isolasi Bakteri Filosfer Padi dan Pembuatan Biakan Cair Xoo

Sampel daun padi tanpa sterilisasi permukaan dicacah (Santosa et al.,

2003), ditimbang sebanyak 10 gram, dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi

100 ml larutan garam fisiologis steril dan dikocok dalam inkubator shaker

dengan kecepatan 80 rpm selama 24 jam. Suspensi bakteri diencerkan sampai

pengenceran 10-2

dan dituang pada media padat Actinomycetes agar lalu

diratakan dengan batang degalsky (spread plate). Biakan diinkubasi selama 7

v

hari pada suhu ruang. Koloni tunggal yang tumbuh dipindah kemudian

digoreskan pada media padat miring untuk kultur murni isolat dan diinkubasi

selama 7 hari pada suhu ruang (Oskay et al., 2004). Satu ose koloni bakteri

digoreskan secara rapat pada media padat Actinomycetes agardalam cawan

petri. Biakan diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Biakan cair Xoo

dibuatdalam media NB dan dikocok dalaminkubator shaker dengan kecepatan

80 rpm di suhu ruang selama 24 jam.

Uji Antagonis Bakteri Filosfer Padi dengan Xoo

Media padat NA dalam cawan petri diswab biakan cair Xoo

menggunakan cotton bud minimal 3 arah pengolesan (sebanyak 4 kali).

Pengolesan terakhir dilakukan mengelilingi tepi cawan. Media didiamkan

sebentar agar bakteri berdifusi la