interleukin 3-specific tyrosine phosphorylation of a membrane.pdf

8/14/2019 Interleukin 3-specific tyrosine phosphorylation of a membrane.pdf

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T h e EMBO J o u r n a l v o l . 6 n o . 1 3 p p . 3 9 7 9 - 3 9 8 4 , 1 9 8 7

I n t e r l e u k i n 3 - s p e c i f i c t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f a membraneg l y c o p r o t e i n o f Mr 1 5 0 0 0 0 i n m u l t i - f a c t o r - d e p e n d e n t m y e l o i d c e l ll i n e s

S h i g e o K o y a s u l , A r i n o b u T o j o 2 , A t s u s h i M i y a j i m a 3 ,T e t s u A k i y a m a 4 , M a s a t o K a s u g a 2 , A k i o U r a b e 2 , J o l a n d aS c h r e u r s 3 , K e n - i c h i A r a i 3 , Fumimaro T a k a k u 2 a n dI c h i r o Y a h a r a l D e p a r t m e n t o f C e l l B i o l o g y , T he T o k y o M e t r o p o l i t a n I n s t i t u t e o f M ed i c a lS c i e n c e , 3 - 1 8 - 2 2 H o n k o m a g o m e , B u n k y o - k u , T o k y o 1 1 3 , 2 T h e 3 r dD e p a r t m e n t o f I n t e r n a l M e d i c i n e , F a c u l t y o f M e di c i n e, U n i v e r s i t y o fT o k y o , 7 - 3 - 1 H o n g o , B u n k y o - k u , T o k y o 1 1 3 , J a p a n , 3DNAX R e s e a r c hI n s t i t u t e o f M o le c ul a r a n d C e l l u l a r B i o l o g y , 9 0 1 C a l i f o r n i a A v e n u e , P a l oA l t o , CA 9 4 3 0 4 - 1 1 0 4 , USA a n d 4 D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y , I n s t i t u t e f o rV i r u s R e s e a r c h , K y o t o U n i v e r s i t y , K a w a h a r a - c h o , S h og o i n , S a k y o- ku ,K y o t o 6 0 6 , J a p a nC o m m u n i c a t e d b y J . S c h l e s s i n g e rT y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f c e l l u l a r p r o t e i n s i n d u c e d b y v a r i -o u s h em a t o p o i e t i c g r o w t h f a c t o r s s u c h a s i n t e r l e u k i n 3 1 L 3 ) ,g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y - s m u l a t i n g f a c t o r ( G M - C S F )a n d i n t e r l e u k i n 4 I I A ) w a s s t u d i e d i n s e v e r a l m u l t i - f a c t o r -d e p e n d e n t m y e l o i d c e l l l i n e s . Among t h e g r o w t h f a c t o r s , 1 1 3s p e c i f i c a l l y i n d u c e d r a p i d t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f a mem-b r a n e g l y c o p r o t e i n o f m o l . w t 1 5 0 k d g p p l 5 O ) i n t h e 1 L 3 -d e p e n d e n t c e l l l i n e s , I C 2 a n d D A - 1 . T h e 1 1 3 - i n d u c e d t y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o n o f g p p l 5 O w a s d e t e c t e d w i t h i n 3 0 s , r e a c h e da maximum a t 3 m i n a n d d e c r e a s e d t h e r e a f t e r . T h e c o n c e n -t r a t i o n o f I L 3 r e q u i r e d f o r h a l f - m a x i m u m s t i m u l a t i o n o fg p p l 5 0 t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n w i t h 2 . 5 x 1 0 6 / m l c e l l s w a s- 2 0 0 p M , w h i c h i s t h e s a m e a s t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r 2 5 I - l a b e l e d I L 3 b i n d i n g . g p p l 5 0 was c o n s t i t u t i v e l yp h o s p h o r y l a t e d o n t y r o s i n e r e s i d u e s ) i n g r o w t h f a c t o r i n -d e p e n d e n t v a r i a n t s , I C 2 T r a n d D A - l T r , d e r i v e d f r o m I C 2a n d D A - 1 r e s p e c t i v e l y . N e i t h e r v a r i a n t s y n t h e s i z e d H L 3 . T h ep r e s e n t r m d i n g s s u g g e s t t h a t t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o fg p p l 5 0 i s a c r i t i c a l e v e n t i n v o l v e d i n b o t h 1 L 3 - d e p e n d e n t a n d- i n de pe nd en t g r o w t h .K e y w o r d s : g r o w t h f a c t o r / h e m a t o p o i e s i s / i n t e r l e u k i n / r e c e p t o r /s i g n a l t r a n s d u c t i o nI n t r o d u c t i o nI n t e r l e u k i n 3 I L 3 ) i s a T - c e l l - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r w h i c h h a sb e e n s h o w n i n v i t r o t o s u p p o r t t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o fh e m a t o p o i e t i c c e l l s a n d t o g e n e r a t e m u l t i - l i n e a g e c o l o n i e s f r o mb o n e m a r r o w c e l l s i n c l u d i n g g r a n u l o c y t e , m a c r o p h a g e , e r y t h r o i d ,m e g a k a r y o c y t e a n d m a s t c e l l c o l o n i e s D e x t e r e t a l . , 1 9 8 0 ;S c h r a d e r e t a l . , 1 9 8 1 ; T e r t i a n e t a l . , 1 9 8 1 ; I h l e a n d W e i n s t e i n ,1 9 8 6 ; S c h r a d e r , 1 9 8 6 ) . A n u m b e r o f c e l l l i n e s w h i c h g r o w i nr e s p o n s e t o I L 3 h a v e b ee n e s t a b l i s h e d a n d m a n y o f t h e s e I L 3 -d e p e n d e n t c e l l l i n e s a l s o r e s p o n d t o a n o t h e r h e m a t o p o i e t i c g r o w t hf a c t o r , g r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g e c o l o n y - s t i m u l a t i n g f a c t o r ( G M -C S F ) H a p e l e t a l . , 1 9 8 4 ; W a l k e r a n d B u r g e s s , 1 9 8 5 ) . I n a d -d i t i o n , r e c e n t w o r k h a s r e v e a l e d t h a t i n t e r l e u k i n 4 I L 4 o r B S F - 1 )a l s o a f f e c t s t h e g r o w t h o f I L 3 - d e p e n d e n t c e l l l i n e s L e e e t a l . ,1 9 8 6 ; Mosmann e t a l . , 1 9 8 6 ; S i d e r a s a n d P a l a c i o s , 1 9 8 7 ) . I na c c o r d a n c e w i t h t h e s e r e s u l t s , e x p e r i m e n t s u s i n g r a d i o l a b e l e df a c t o r s r e v e a l e d t h a t I L 3 - d e p e n d e n t c e l l l i n e s e x p r e s s s p e c i f i c

I R L P r e s s L i m i t e d , O x f o r d , E n g l a n d

b i n d i n g s i t e s f o r I L 3 a n d t h e o t h e r g r o w t h f a c t o r s P a l a s z y n s k ia n d I h l e , 1 9 8 4 ; W a l k e r a n d B u r g e s s , 1 9 85 ; N i c o l a a n d M e t c a l f ,1 9 8 6 ; O h a r a a n d P a u l , 1 9 8 7 ; P a r k e t a l . , 1 9 8 7 ) .We e s t a b l i s h e d a m u l t i - f a c t o r - d e p e n d e n t c e l l l i n e , I C 2 , w h i c hi s a m a s t c e l l p r o g e n i t o r c e l l l i n e o r a P c e l l l i n e ( K o y a s u e t a l . ,1 9 8 5 ; 1 9 8 6 ) . I C 2 c e l l s a r e s t i m u l a t e d t o i n i t i a t e DNA s y n t h e s i sb y e i t h e r I L 3 , GM-CSF o r I L 4 . I C 2 c e l l s a r e a b l e t o s t a r t DNAs y n t h e s i s i n t h e a b s e n c e o f g r o w t h f a c t o r s w h e n i n c u b a t e d w i t hs o d i u m o r t h o v a n a d a t e , a p o t e n t i n h i b i t o r o f p h o s p h o t y r o s i n ep h o s p h a t a s e ( S w a r u p e t a l . , 1 9 8 2 ; T o j o e t a l . , 1 9 8 7 ) . I t h a s a l s ob e e n s h o w n t h a t s e v e r a l I L 3 - d e p e n d e n t c e l l l i n e s a r e t r a n s f o r m e db y A b e l s o n - M u L V , w h o s e o n c o g e n e , v - a b l , e n c o d e s a p r o t e i nt y r o s i n e k i n a s e ( C o o k e t a l . , 1 9 8 5 ; P i e r c e e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e s ef a c t s r a i s e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n i s i n -v o l v e d i n t h e t r a n s d u c t i o n o f g r o w t h s i g n a l s i n I C 2 c e l l s , a s i ti s f o r e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) a n d c e l l u l a r t r a n s f o r m a t i o n U s h i r o a n d C o h e n , 1 9 8 0 ; Ek e t a l . , 1 9 8 2 ; K a s u g a e t a l . , 1 9 8 2 ;J a c o b s e t a l . , 1 9 8 3 ; R u b i n e t a l . , 1 9 8 3 ; H u n t e r a n d C o o p e r , 1 9 8 5 ;K a d o w a k i e t a l . , 1 9 8 7 ) . We t h u s e x a m i n e d t y r o s i n e p h o s p h o r y l -a t i o n o f c e l l u l a r p r o t e i n s i n g r o w t h - f a c t o r - s t i m u l a t e d I C 2 c e l l s .We r e p o r t h e r e t h a t I L 3 s p e c i f i c a l l y i n d u c e s t y r o s i n e p h o s p h o r -y l a t i o n o f a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n .R e s u l t sI C 2 c e l l s r e s p o n d t o m u l t i p l e g r o w t h f a c t o r sF i g u r e 1 s h o w s t h a t I C 2 c e l l s i n i t i a t e DNA s y n t h e s i s i n r e s p o n s et o e i t h e r I L 3 , GM-CSF o r I L 4 . I L 3 a n d GM-CSF h a d a s i m i l a rc o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e i n d u c t i o n o f DNA s y n t h e -s i s i n I C 2 c e l l s . B o t h g r o w t h f a c t o r s s t i m u l a t e d 5 x 1 0 4 / m l I C 2c e l l s t o 5 0 m a x i m u m p r o l i f e r a t i o n a t - 5 p M . I L 4 a f f e c t e d I C 2

1 . 50xc

0 ) 0 . 5

1 0 - 1 4 1 0 - 1 3 1 0 - 1 2 1 0 - 1 1 1 0 - 1 0 10 - 1 04y m h o k i n e c o n c e n t r a t i o n M )

F i g . 1 . DNA s y n t h e s i s o f I C 2 c e l l s i n d u c e d b y I L 3 0 ) , GM-CSF 0 ) a n dI L 4 ( O ) . I C 2 c e l l s 1 0 4 i n 0 . 2 m l ) were i n c u b a t e d w i t h v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s o f t h e l y m p h o k i n e s f o r 2 1 h f o l l o w e d b y p u l s e - l a b e l i n g w i t h1 i C i / w e l l o f [ 3 H ] t h y m i d i n e f o r 3 h a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y K o y a s u e t a l . ,1 9 8 5 ) .

3 9 7 9


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S . K o y a s u e t a l .c e l l s i n a d i f f e r e n t m a n n e r . T h e maximum DNA s y n t h e s i s i n -d u c e d b y I L 4 a t a c o n c e n t r a t i o n > 1 nM w a s -50 o f t h a ti n d u c e d b y I L 3 o r GM-CSF. A l t h o u g h I C 2 c e l l s e x p r e s s I L 2r e c e p t o r s , o r m o u s e T a c m o l e c u l e s ( K o y a s u e t a l . , 1 9 8 6 ) a n di n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r I G F - I ) r e c e p t o r s u n p u b l i s h e d d a t a ) ,n e i t h e r I L 2 n o r I GF -I i n d u c e d DNA s y n t h e s i s i n I C 2 c e l l s .T y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f c e l l u l a r p r o t e i n sI C 2 c e l l s w e r e l a b e l e d w i t h [ 3 2 p ] o r t h o p h o s p h a t e i n t h e a b s e n c eo f s e r u m a n d g r o w t h f a c t o r s a n d t h e n s t i m u l a t e d w i t h v a r i o u sg r o w t h f a c t o r s f o r 3 m i n . P h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n sw e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m e x t r a c t s o f t h e s e c e l l s w i t h r a b b i ta n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t p h o s p h o t y r o s i n e a n t i - P - T y r ) K a d o -w a k i e t a l . , 1 9 8 7 ) a n d a n a l y z e d b y t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o -p h o r e s i s F i g u r e 2 ) . B e f o r e s t i m u l a t i o n , s e v e r a l m i n o rb a c k g r o u n d s p o t s w e r e o b s e r v e d p a n e l s a , c a n d e ) . A f t e rs t i m u l a t i o n w i t h 1 nM I L 3 , we d e t e c t e d t y r o s i n e p h o s p h o r y l a -t i o n i n a p r o t e i n o f m o l . w t 1 5 0 k d p p l 5 0 ) i n b o t h I C 2 a n d D A - 1c e l l s ; t h e l a t t e r i s a n o t h e r I L 3 - d e p e n d e n t c e l l l i n e p a n e l s b , da n d f ) . A s s h o w n i n F i g u r e 3 , h o w e v e r , t h i s t y r o s i n e -p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n w a s n o t d e t e c t e d i n c e l l s s t i m u l a t e d w i t h

N E H - . r :2 0K-1 1 6 K -9 3 K -

f - 7 K -0 )

- i . ) K -

t h e f o l l o w i n g a g e n t s : I L 4 p a n e l c ) , GM-CSF p a n e l d ) , 1 2 - 0 -t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - 1 3 - a c e t a t e ( T P A ) p a n e l e ) , I L 2 p a n e l f )a n d I G F - I d a t a n o t s h o w n ) . P h o s p h o p r o t e i n s o f 2 4 0 k d a n d60-70 k d w e r e o c c a s i o n a l l y b u t n o t r e p r o d u c i b l y d e t e c t e d o v e rt h e b a c k g r o u n d i n I L 3 - s t i m u l a t e d c e l l s s e e F i g u r e 6 A ) . T h e s p o to f p p l 5 0 w a s n o t d e t e c t e d i n o t h e r c e l l t y p e s i n c l u d i n g v a r i o u sI L 2 - s t i m u l a t e d T c e l l c l o n e s a n d a T c e l l l y m p h o m a , Y A C - l u n -p u b l i s h e d d a t a ) .An a r e a c o n t a i n i n g p p l S O w a s c u t o u t f r o m t h e g e l a n d s u b -j e c t e d t o p h o s p h o a m i n o a c i d a n a l y s i s . F i g u r e 4A s h o w s t h a tp p l 5 0 c o n t a i n e d p h o s p h o t y r o s i n e a n d p h o s p h o s e r i n e i n a r a t i oo f - 4 : 6 . N e x t t h e c e l l s w e r e l a b e l e d w i t h L - [ 3 5 S ] m e t h i o n i n ei n s t e a d o f [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w i t ha n t i - P - T y r w a s p e r f o r m e d . A s s h o w n i n F i g u r e 4 B , a 3 5 S -l a b e l e d p r o t e i n w h i c h c o - m i g r a t e d w i t h 3 2 P - l a b e l e d p p l 5 O w a si m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m I L 3 - s t i m u l a t e d c e l l s b u t n o t f r o m u n -s t i m u l a t e d c e l l s . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t p p l S 0 w a s n e w l yp h o s p h o r y l a t e d o n i t s t y r o s i n e r e s i d u e s ) f o l l o w i n g s t i m u l a t i o nw i t h I L 3 .p p 1 5 0 i s a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i nL y s a t e s o f I C 2 c e l l s l a b e l e d w i t h [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e a n d s t i m u -l a t e d w i t h I L 3 w e r e f r a c t i o n a t e d i n t o c y t o p l a s m a n d m e m b r a n ef r a c t i o n s b y c e n t r i f u g a t i o n . T h e r e s u l t s o f i m m u n o p r e c i p i t a t i o nw i t h a n t i - P - T y r i n d i c a t e d t h a t t h e m e m b r a n e f r a c t i o n c o n t a i n e dp p i 5 0 F i g u r e S A ) . p p l S O w a s e l u t e d f r o m t h e i m m u n o c o m p l e xb y p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e c o m p e t i t i o n a n d t h e p r o t e i n w a s s u b -j e c t e d t o w h e a t g e r m a g g l u t i n i n (WGA) - S e p h a r o s e a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y . A s s h o w n i n F i g u r e S B , p p l 5 0 b o u n d t oWGA - S e p h a r o s e . T h e s e r e s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t p p l 5 0 i sa m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n d e n o t e d a s g p p l S O i n t h e f o l l o w i n gs e c t i o n s ) .

; K -

c

L L I LC D 1 1 9 3 K -U / )

0 ) _ _

e f

2 0 K -

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1 O 6 K -9 3 VK -

6 D - 7S L L0n f -r ) F 1 t -o r i c n i i - - r oC / )0 P d f

1 M 1 K -116K-9 3 K -

f - ; 6 K --

L t

F i g . 2 . A n a l y s i s o f t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f c e l l u l a r p r o t e i n s . I C 2 ( a - d )a n d D A - 1 c e l l s e , f ) l a b e l e d w i t h [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e w e r e i n c u b a t e d w i t hs a l i n e a , c , e ) o r 1 nM I L 3 b , d , f ) f o r 3 m i n . P r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a e dw i t h a n t i - P - T y r w e r e a n a l y z e d b y 2D-NEPHGE/SDS-PAGE. T e n p e r c e n t a , b ) a n d 5 ( c - f ) a c r y l a m i d e g e l s w e r e u s e d f o r t h e s e c o n d d i m e n s i o n .N u m b e r s o n t h e l e f t s i d e i n d i c a t e t h e p o s i t i o n s o f m o l . w t m a r k e r s .

t r o n i f -

F i g . 3 . I C 2 c e l l s l a b e l e d w i t h [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e w e r e i n c u b a t e d w i t hs a l i n e a ) , 1 nM I L 3 b ) , 1 0 0 nM I L 4 ( c ) . 1 nM GM-CSF d ) , 1 0 n g / m lTP A e ) o r 5 0 nM I L 2 ( f ) f o r 3 m i n . P r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h a n t i -P - T y r w e r e a n a l y z e d b y 2D-NEPHGE/SDS-PAGE.

3 9 8 0

a _ b


3/6

E L 3 - s p e c i f i c t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o nA

4;S. . . - ;W

Ba b

2 00 K - -

1 1 6 K -93K-67K-

I. 4

F i g . 4 . A ) P h o s p h o a m i n o a c i d a n a l y s i s o f p p l 5 0 . D o t t e d c i r c l e s i n d i c a t e t h ep o s i t i o n s o f s t a n d a r d p h o s p h o a m i n o a c i d s i d e n t i f i e d b y r e a c t i o n w i t hn i n h y d r i n . B ) I C 2 c e l l s l a b e l e d w i t h L - [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e w e r e i n c u b a t e d w i t hs a l i n e a ) o r 1 nM I L 3 b ) f o r 3 m i n . P r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t ha n t i - P - T y r w e r e a n a l y z e d b y 2D-NEPHGE/SDS-PAGE. An a r r o w h e a di n d i c a t e s p p l 5 0 .

A

K i n e t i c s o f t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f g p p 1 5 0I C 2 c e l l s w e r e s t i m u l a t e d w i t h 1 nM I L 3 f o r v a r i o u s l e n g t h s o ft i m e a f t e r l a b e l i n g w i t h [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e t o e x a m i n e t h ek i n e t i c s o f p h o s p h o r y l a t i o n o f g p p l S 0 F i g u r e 6 ) . P h o s p h o r y l a t i o no f g p p l 5 O w a s d e t e c t a b l e w i t h i n 3 0 s , r e a c h e d a maximum a t 3m i n a n d d e c r e a s e d t h e r e a f t e r F i g u r e 6 B ) . g p p 1 5 0 a p p e a r e d t os p l i t i n t o t w o a d j a c e n t s p o t s a s s h o w n i n F i g u r e 6 . T h e p h o s p h o -p e p t i d e m a p s o f t h e t w o s p o t s w e r e s i m i l a r u n p u b l i s h e d d a t a ) .D u r i n g e a r l y p e r i o d s f o l l o w i n g s t i m u l a t i o n , t h e h i g h e r m o b i l i t ys p e c i e s w a s p r e d o m i n a n t . T h e l o w e r m o b i l i t y s p e c i e s o f g p p l 5 Oi n c r e a s e d g r a d u a l l y a s t h e I C 2 c e l l s w e r e s t i m u l a t e d f u r t h e r .

T y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n i n g p p l 5 O d e p e n d e d o n t h e c o n c e n -t r a t i o n o f I L 3 u s e d i n t h e s t i m u l a t i o n F i g u r e 7 ) . T y r o s i n e p h o s -p h o r y l a t i o n o f g p p l S O w a s d e t e c t a b l e a t 1 0 pM I L 3 a n d t h emaximum l e v e l o f p h o s p h o r y l a t i o n w a s o b s e r v e d a t 1 nM I L 3 .H a l f - m a x i m u m s t i m u l a t i o n b y I L 3 w a s a t 2 0 0 - 3 0 0 pM w i t h 2 . 5x 1 0 6 / m l I C 2 c e l l s . T h e r a t i o o f h i g h e r a n d l o w e r m o b i l i t ys p e c i e s o f g p p l 5 0 a p p e a r e d t o b e c o n s t a n t a t a n y c o n c e n t r a t i o no f I L 3 F i g u r e 7 , i n s e t s ) .T y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f g p p 1 5 0 i n g r o w t h - f a c t o r - i n d e p e n d e n tv a r i a n t sWe i s o l a t e d t w o s p o n t a n e o u s t r a n s f o r m a n t s , I C 2 T r a n d D A - l T r ,f r o m I C 2 a n d D A - l r e s p e c t i v e l y . B o t h o f t h e v a r i a n t s c o u l d g r o wc o n t i n u o u s l y i n t h e a b s e n c e o f t h e g r o w t h f a c t o r s , I L 3 , GM-CSFo r I L 4 . C u l t u r e s u p e m a t a n t s o f t h e s e v a r i a n t s d i d n o t c o n t a i na n y d e t e c t a b l e g r o w t h f a c t o r a c t i v i t y a s d e t e r m i n e d b y s t i m u l a t i o na s s a y s o f t h e I L 3 - d e p e n d e n t I C 2 c e l l s . We a l s o c o u l d n o t d e t e c tI L 3 mRNA i n t h e s e v a r i a n t s b y N o r t h e r n b l o t t i n g a n a l y s i s u n -p u b l i s h e d d a t a ) . I t i s t h u s u n l i k e l y t h a t t h e s e v a r i a n t s g r e w i na n a u t o c r i n e m a n n e r . T h e t r a n s f o r m a n t s w e r e l a b e l e d w i t h [ 3 2 p ] _o r t h o p h o s p h a t e w i t h o u t a n y s t i m u l a t i o n b y I L 3 a n d p h o s p h o -t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s w e r e a n a l y z e d F i g u r e 8 A ) . I n t h e s et r a n s f o r m a n t s , g p p l S O w a s c o n s t i t u t i v e l y p h o s p h o r y l a t e d . P h o s -p h o - p e p t i d e m a p s o f g p p l 5 O f r o m I L 3 - s t i m u l a t e d I C 2 c e l l s a n dt h o s e f r o m I C 2 T r w e r e e s s e n t i a l l y t h e s a m e F i g u r e 8 B ) . A d -

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....

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4/6

A) n Y u n . mmf ln n I - : l I .j

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F i g . 6 . T i m e course o f t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f g p p l 5 O . A ) I C 2 c e l l sl a b e l e d w i t h [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e w e r e s t i m u l a t e d w i t h 1 nM I L 3 f o ri n d i c a t e d p e r i o d s a n d g p p l 5 0 w a s i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h a n t i - P - T y r a n da n a l y z e d b y 2D-NEPHGE/SDS-PAGE. B ) G e l p i e c e s c o n t a i n i n g 3 2 P -l a b e l e d gppl5O i n ( A ) were c u t o u t a n d r a d i o a c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d b y al i q u i d s c i n t i l l a t o r .

F i g . 7 . I L 3 - c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o no f g p p l 5 0 . I C 2 c e l l s l a b e l e d w i t h [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e w e r e s t i m u l a t e d w i t ht h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n o f I L 3 f o r 3 m i n . g p p l 5 O i m m u n o p r e c i p i t a e dw i t h a n t i - P - T y r w as a n a l y z e d b y 2D-NEPHGE/SDS-PAGE ( i n s e t ) a n d t h er a d i o a c t i v i t y i n c o r p o r a t e d i n t o g p p l 5 O was d e t e r m i n e d .A B

N E P H G EF b m a b ab3 0 0 ) K -

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d i t i o n o f 1 nM I L 3 t o DA-lTr c e l l s d i d n o t e n h a n c e t h e p h o s -p h o r y l a t i o n o f gppl5O F i g u r e 8 A , p a n e l s c a n d d ) , w h i l e a d d i t i o nt o I C 2 T r c e l l s e n h a n c e d t h e p h o s p h o r y l a t i o n 2 - f o l d d a t a n o ts h o w n ) . B o t h I C 2 T r a n d DA-lTr w e r e f o u n d t o b e a r I L 3 r e c e p -t o r s u n p u b l i s h e d d a t a ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e r e s u l t s s u g g e s t t h a tg p p l 5 O i s m a x i m a l l y t y r o s i n e - p h o s p h o r y l a t e d i n s o m e I L 3 - i n -d e p e n d e n t v a r i a n t s .D i s c u s s i o nWe r e p o r t h e r e t h a t I L 3 s p e c i f i c a l l y i n d u c e s r a p i d t y r o s i n e p h o s -p h o r y l a t i o n o f a m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n , g p p l S O , i n I L 3 - d e p e n -d e n t c e l l l i n e s . I n a d d i t i o n t o I C 2 a n d D A - 1 , we h a v e d e t e c t e dg p p l S 0 i n o t h e r I L 3 - d e p e n d e n t c e l l l i n e s s u c h as N S F - 6 0 ( W e i n -s t e i n e t a l . , 1 9 8 6 ) , P B - 3 C B a l l e t a l . , 1 9 8 3 ) a n d 3 2 D c l . 3 G r e e n b e r g e r e t a l . , 1 9 8 3 ) w h e n s t i m u l a t e d w i t h I L 3 u n p u b l i s h e dd a t a ) . Among t h e r e a g e n t s t e s t e d i n c l u d i n g I L 3 , GM-CSF, I L 4 ,I L 2 a n d T P A , o n l y I L 3 i n d u c e d t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o fg p p l 5 O . T y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f gpplSO o c c u r r e d i n r e -sponse t o a l o w c o n c e n t r a t i o n o f I L 3 . T h e E C 5 0 , t h e concen-t r a t i o n o f I L 3 r e q u i r e d f o r t h e h a l f - m a x i m u m s t i m u l a t i o n o f

6 7K

F i g . 8 . g p p l 5 0 i s c o n s t i t u t i v e l y p h o s p h o r y l a t e d i n g r o w t h - f a c t o r - i n d e p e n d e n tv a r i a n t s . A ) I C 2 a ) , I C 2 T r b ) o r D A - l T r c , d ) l a b e l e d w i t h[ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e were i n c u b a t e d w i t h nM I L 3 a , d ) or s a l i n e b , c ) f o r3 m i n , a f t e r w h i c h g p p l 5 0 w as i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h a n t i - P - T y r a n da n a l y z e d b y 2D-NEPHGE/SDS-PAGE. B ) S p o t s o f 3 2 P - l a b e l e d g p p l 5 0w e r e c ut o u t f r o m I L 3 - s t i m u l a t e d I C 2 c e l l s a ) o r u n s t i m u l a t e d I C 2 T r c e l l s b ) a n d a n a l y z e d f o r t h e i r p e p t i d e maps u s i n g s t a p h y l o c o c c a l V8 p r o t e a s e C l e v e l a n d et a l . , 1 9 7 7 ) .t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f g p p l 5 0 , w a s 2 0 0 - 3 0 0 pM w i t h2 . 5 x 1 0 6 / m l I C 2 c e l l s F i g u r e 7 ) , w h i c h i s t h e same as t h ed i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r ' 2 I - l a b e l e d I L 3 b i n d i n g t o t h e h i g h -a f f i n i t y r e c e p t o r s P a l a s z y n s k i a n d I h l e , 1 9 8 4 ; P a r k e t a l . , 1 9 8 6 ;o u r u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h i s s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t y r o s i n e p h o s -p h o r y l a t i o n o f gppl5O i s i n d u c e d u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s .O u r p r e v i o u s r e s u l t s o b t a i n e d w i t h a h u m a n e p i d e r m o i d c a r c i -noma KB h a v e s h o w n t h a t t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f c e l l u l a rp r o t e i n s i n d u c e d b y g r o w t h f a c t o r s i n c l u d i n g i n s u l i n , I G F - I a n d

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S . K o y a s u e t a l .

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5/6

L 3 - s p e c i f i c t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o nE GF w a s r a p i d a n d t r a n s i e n t ( K a d o w a k i e t a l . , 1 9 8 7 ) . A s s h o w ni n F i g u r e 6 , t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f g p p l S O w a s a l s o r a p i d l ya n d t r a n s i e n t l y i n d u c e d i n I C 2 c e l l s i n a n I L 3 - d e p e n d e n t m a n n e r .When I C 2 c e l l s w e r e c o n t i n u o u s l y e x p o s e d t o I L 3 , g p p l S O w a sc o n t i n u o u s l y p h o s p h o r y l a t e d b u t a t a r e l a t i v e l y l o w l e v e l u n -p u b l i s h e d d a t a ) .I t w a s r e c e n t l y r e p o r t e d t h a t I L 3 i n d u c e d t h e p h o s p h o r y l a t i o no f t w o p r o t e i n s o f m o l . w t 6 7 k d p p 6 7 ) a n d 2 0 k d p p 2 O ) . T h e s ep h o s p h o r y l a t i o n s o c c u r r e d o n t h r e o n i n e r e s i d u e s p r o b a b l y t h r o u g ha c t i v a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C ( E v a n s e t a l . , 1 9 8 6 ) . U s i n g I C 2c e l l s , we h a v e o b s e r v e d t h a t I L 3 a n d GM-CSF i n d u c e d t h e p h o s -p h o r y l a t i o n o f p p 6 7 a n d p p 2 O o n s e r i n e a n d / o r t h r e o n i n e r e s i d u e s u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t p h o s p h o r y l a t i o no f p p 6 7 a n d p p 2 O i s n o t r e s t r i c t e d t o s t i m u l a t i o n b y I L 3 . F u r t h e r -m o r e , p h o s p h o r y l a t i o n o f p p 6 7 w a s r e p o r t e d i n T c e l l s s t i m u l a t e dw i t h I L 2 I s h i i e t a l . , 1 9 8 6 ) . A s d e s c r i b e d a b o v e , t y r o s i n e p h o s -p h o r y l a t i o n o f g p p l 5 O w a s n o t d e t e c t e d b y i n c u b a t i o n o f I C 2 c e l l sw i t h GM-CSF, I L 4 , I L 2 o r I G F - I . T h e k i n e t i c s o f p h o s p h o r y l -a t i o n a r e a l s o d i f f e r e n t . T h e p h o s p h o r y l a t i o n o f p p 6 7 a n d p p 2 Oi n I L 3 - s t i m u l a t e d c e l l s w a s o n l y d e t e c t a b l e 5 m i n a f t e r s t i m u l a t i o n( E v a n s e t a l . , 1 9 8 6 ) . I n c o n t r a s t , t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o fg p p l 5 O r e a c h e d i t s m a x i m u m 3 m i n a f t e r s t i m u l a t i o n F i g u r e 6 ) .T h u s , we c o n c l u d e t h a t t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f g p p l S O i so n e o f t h e e a r l i e s t e v e n t s s p e c i f i c a l l y a s s o c i a t e d w i t h I L 3 - s t i m u -l a t i o n .C h e m i c a l c r o s s - l i n k i n g s t u d i e s h a v e r e c e n t l y r e v e a l e d t h a t t h eI L 3 r e c e p t o r i s , a t m i n i m u m , a p r o t e i n s ) o f 60-75 k d N i c o l aa n d P e t e r s o n , 1 9 8 6 ; May a n d I h l e , 1 9 8 6 ; P a r k e t a l . , 1 9 8 6 ;S o r e n s e n e t a l . , 1 9 8 6 ) , s u g g e s t i n g t h a t g p p l 5 0 i s n o t t h e r e c e p t o r .N e v e r t h e l e s s , i n a d d i t i o n t o t h e 6 0 - 7 5 k d m o l e c u l e , a h i g h -m o l e c u l a r - w e i g h t s p e c i e s o f 1 5 0 - 1 8 0 k d h a s a l s o b e e n d e t e c t e di n c h e m i c a l c r o s s - l i n k i n g e x p e r i m e n t s u s i n g i n t a c t c e l l s N i c o l aa n d P e t e r s o n , 1 9 8 6 ; P a r k e t a l . , 1 9 8 6 ; o u r u n p u b l i s h e d d a t a ) .B y c o n t r a s t , o n l y t h e 6 0 - 7 5 k d m o l e c u l e w a s d e t e c t e d w h e nc r o s s - l i n k i n g w a s p e r f o r m e d u s i n g m e m b r a n e f r a c t i o n s P a r k e ta l . , 1 9 8 6 ; o u r u n p u b l i s h e d d a t a ) . We p r o p o s e s e v e r a l p o s s i b i l i t i e sw h i c h d e s c r i b e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o no f g p p l S O a n d t h e I L 3 b i n d i n g m o l e c u l e s ) : ( i ) t h e I L 3 b i n d i n gm o l e c u l e i s a p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e w h i c h p h o s p h o r y l a t e sg p p l 5 O u p o n I L 3 b i n d i n g ; ( i i ) g p p l 5 O i s a p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s es t r u c t u r a l l y a s s o c i a t e d w i t h t h e I L 3 b i n d i n g m o l e c u l e , a n d i s a u t o -p h o s p h o r y l a t e d u p o n b i n d i n g o f I L 3 t o t h e r e c e p t o r ; ( i i i ) I L 3s t i m u l a t e s a s p e c i f i c , b u t r e c e p t o r - u n r e l a t e d p r o t e i n t y r o s i n ek i n a s e t o p h o s p h o r y l a t e g p p l 5 O . T h e s e c o n d c a s e i s a n a l o g o u st o t h e i n s u l i n r e c e p t o r s y s t e m , w h i c h i s c o m p o s e d o f t w o f u n c -t i n a l p o l y p e p t i d e s b o u n d t o g e t h e r b y a d i s u l f i d e b o n d K a s u g ae t a l . , 1 9 8 2 ) . R e c e n t l y , we h a v e f o u n d t h a t g p p l S O w a s r a d i o -i o d i n a t e d u p o n s u r f a c e l a b e l i n g o f i n t a c t I C 2 c e l l s w i t h 1 2 5 I u n -p u b l i s h e d d a t a ) . A p p r o p r i a t e c h e m i c a l c r o s s - l i n k i n g e x p e r i m e n t sa r e n e e d e d t o c l a r i f y t h e f u n c t i o n a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e I L 3r e c e p t o r a n d g p p 1 5 0 . F u r t h e r m o r e , i n v i t r o e x p e r i m e n t s o n t h ep r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e a c t i v i t y w i l l b e o f i n t e r e s t i n f u t u r e s t u d i e s .g p p l 5 0 w a s c o n s t i t u t i v e l y p h o s p h o r y l a t e d i n I C 2 T r a n dD A - l T r c e l l s w h i c h c a n g r o w i n a n I L 3 - i n d e p e n d e n t m a n n e r .T h e s e v a r i a n t s d i d n o t s y n t h e s i z e I L 3 , s u g g e s t i n g t h a t t h e s ev a r i a n t s d i d n o t g r o w i n a n a u t o c r i n e m a n n e r a n d t h a t t y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o n o f g p p l 5 0 i n I C 2 T r a n d D A - l T r was n o t c a u s -e d b y t h e b i n d i n g o f I L 3 t o i t s r e c e p t o r . S i n c e t h e a c t i v a t i o n o fp r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e s i s i n v o l v e d i n some c e l l u l a r t r a n s f o r m a -t i o n e v e n t s H u n t e r a n d C o o p e r , 1 9 8 5 ) , i t m a y b e t h a t c o n s t i t u t i v et y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f g p p l 5 O i s c a u s a l l y r e l a t e d t o a c q u i s i -t i o n o f t h e a b i l i t y o f I C 2 a n d D A - 1 c e l l s t o g r o w i n a g r o w t h -f a c t o r - i n d e p e n d e n t m a n n e r .

M a t e r i a l s a n d m e t h o d sM a t e r i a l sF e m a l e D B A / 2 m i c e w e r e p u r c h a s e d f r o m C h a r l e s R i v e r J a p a n , T o k y o . RPMI1 6 4 0 m e d i u m a n d f e t a l c a l f s e r u m ( F C S ) w e r e o b t a i n e d f r o m G i b c o ; p e n i c i l l i nG a n d k a n a m y c i n w e r e f r o m M e i j i S e i k a C o . , T o k y o ; p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e( P M S F ) , 4 - 2 - h y d r o x y e t h y l ) - 1 - p i p e r a z i n e e t h a n e s u l f o n i c a c i d H e p e s ) a n d a p r o -t i n i n f r o m S i g m a ; p a n s o r b i n S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s C o w a n I c e l l s ) w a s f r o mB e h r i n g D i a g n o s t i c s ; TPA w a s f r o m CM C h e m i c a l s , K a t o n a h , N Y , U S A ; WGA-S e p h a r o s e w a s f r o m P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s A B , U p p s a l a , S w e d e n ; [ m e t h y l -3 H ] t h y m i d i n e , L - [ 3 5 5 ] m e t h i o n i n e a n d [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e w e r e f r o m A m e r s h a mI n t e r n a t i o n a l , B u c k s , U K . RPMI 1 6 4 0 w a s g e n e r a l l y s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 mMH e p e s , 0 . 2 s o d i u m b i c a r b o n a t e , 5 x 1 0 - M j B - m e r c a p t o e t h a n o l , 1 0 0 u n i t s / m lp e n i c i l l i n G a n d 0 . 2 m g / m l k a n a m y c i n .M o u s e r e c o m b i n a n t I L 3 ( Y o k o t a e t a l . , 1 9 8 4 ) a n d I L 4 ( L e e e t a l . , 1 9 8 6 ) w e r ep u r i f i e d f r o m s e r u m - f r e e c u l t u r e s u p e r n a t a n t f l u i d s o f C O S - 7 c e l l s t r a n s f e c t e dw i t h e x p r e s s i o n v e c t o r s c a r r y i n g cDNAs f o r m o u s e I L 3 a n d m o u s e I L 4 r e s p e c t -i v e l y . M o u s e r e c o m b i n a n t GM-CSF M i y a t a k e e t a l . , 1 9 8 5 ) w a s p u r i f i e d f r o mc u l t u r e s u p e r n a t a n t o f y e a s t c e l l s a s r e p o r t e d p r e v i o u s l y M i y a j i m a e t a l . , 1 9 8 6 ) .T h e p u r i t y o f I L 3 a n d GM-CSF was>95 a n d t h a t o f I L 4 w a s - 5 0 . P u r eh u m a n r e c o m b i n a n t I L 2 w a s a g i f t o f D r Y . S u g i n o , C e n t r a l R e s e a r c h D i v i s i o n ,T a k e d a C h e m i c a l I n d u s t r i e s , O s a k a , J a p a n .C e l l s a n d g r o w t h c o n d i t i o n sC o n d i t i o n e d m e d i a f r o m C o n A - s t i m u l a t e d s p l e n o c y t e s a n d c u l t u r e s u p e m a t a n tf l u i d s o f W E H I - 3 c e l l s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d ( K o y a s u e t a l . , 1 9 8 5 , 1 9 8 6 ) .An I L 3 - d e p e n d e n t o r m u l t i - f a c t o r - d e p e n d e n t P c e l l c l o n e , I C 2 K o y a s u e t a l . ,1 9 8 5 ) , w a s c u l t u r e d i n RPMI 1 6 4 0 c o n t a i n i n g 5 FCS a n d 5 0 s p l e n o c y t e sc o n d i t i o n e d m e d i u m . A n o t h e r I L 3 - d e p e n d e n t c e l l l i n e , D A - 1 W e i n s t e i n e t a l . ,1 9 8 6 ) , h a s b e e n c u l t u r e d i n RPMI 1 6 4 0 c o n t a i n i n g 1 0 FCS a n d 1 0 W E H I - 3c o n d i t i o n e d m e d i u m . S t i m u l a t i o n o f D N A s y n t h e s i s i n d u c e d b y I L 3 o r o t h e r g r o w t hf a c t o r s w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y K o y a s u e t a l . , 1 9 8 5 ) . I C 2 T r a n dD A - l T r , g r o w t h - f a c t o r - i n d e p e n d e n t v a r i a n t s d e r i v e d f r o m I C 2 a n d D A - 1 r e s p e c t -i v e l y , w e r e e s t a b l i s h e d w i t h o u t m u t a g e n e s i s a s f o l l o w s . T h e c o n c e n t r a t i o n o f c o n -d i t i o n e d m e d i u m w a s g r a d u a l l y d e c r e a s e d a n d s u r v i v i n g c e l l s w e r e f u r t h e r c u l t u r e d .A f t e r a f e w m o n t h s , g r o w t h - f a c t o r - i n d e p e n d e n t v a r i a n t s w e r e i s o l a t e d b y l i m i t i n gd i l u t i o n .A n a l y s i s o f t y r o s i n e - p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n sP r e p a r a t i o n o f t h e a f f i n i t y - p u r i f i e d a n t i - P - T y r was d e s c r i b e d p r e v i o u s l y K a d o w a k ie t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f t h e a n t i b o d y was 2 5 0 u g / m l . I C 2 c e l l sw e r e u s e d 3 d a y s a f t e r c h a n g i n g t h e c o n d i t i o n e d m e d i u m . D A - 1 c e l l s w e r e c u l t u r e df o r 1 2 h b e f o r e l a b e l i n g i n RPMI 1 6 4 0 c o n t a i n i n g 1 0 FCS a n d 1 W E H I - 3 - c o n -d i t i o n e d m e d i u m . C e l l s 2 . 5 x 1 0 6 ) w e r e s u s p e n d e d i n 1 m l o f p h o s p h a t e - f r e eRPMI 1 6 4 0 c o n t a i n i n g c a r r i e r - f r e e [ 3 2 P ] o r t h o p h o s p h a t e ( 1 m C i / m l ) . F o r l a b e l i n gc e l l s w i t h L - [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e , t h e c e l l s w e r e s u s p e n d e d a t 2 x 1 0 5 / m l i n RPMI1 6 4 0 c o n t a i n i n g 1 0 F C S , 2 W E H I - 3 - c o n d i t i o n e d m e d i u m , 1 0 o f t h e n o r m a lc o n c e n t r a t i o n o f L - m e t h i o n i n e a n d L - [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e ( 0 . 1 m C i / m o l ) a n d c u l t u r e df o r 1 6 h . T h e c e l l s w e r e f u r t h e r i n c u b a t e d i n s e r u m - f r e e m e d i u m f o r 2 h b e f o r es t i m u l a t i o n . L a b e l e d c e l l s w e r e s t i m u l a t e d w i t h o r w i t h o u t g r o w t h f a c t o r s a t 3 7 Ca s i n d i c a t e d , c e n t r i f u g e d a t 1 2 0 0 0 g f o r 1 m i n , a n d f r o z e n w i t h l i q u i d n i t r o g e na f t e r a s p i r a t i o n o f t h e m e d i u m . T h e c e l l s w e r e t h e n t h a w e d a n d s o l u b i l i z e d i m -m e d i a t e l y a t 4 0 C i n 0 . 4 m l o f a s o l u b i l i z i n g s o l u t i o n c o n s i s t i n g o f 1 T r i t o nX - 1 0 0 , 1 0 mM s o d i u m p y r o p h o s p h a t e , 1 0 0 mM s o d i u m f l u o r i d e , 4 mM E D T A ,2 mM s o d i u m o r t h o v a n a d a t e , 1 mM P M S F , 1 0 0 U / m i a p r o t i n i n a n d 5 0 mMH e p e s , p H 7 . 4 . S u p e r n a t a n t s o f t h e w h o l e - c e l l e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d b y h o m o g e n -i z i n g t h e r a d i o l a b e l e d c e l l s a n d s e d i m e n t i n g t h e i n s o l u b l e m a t e r i a l s b y c e n t r i f u g a t i o na t 1 5 0 0 0 g f o r 1 5 m i n . A f t e r i n c u b a t i o n o f t h e e x t r a c t s w i t h a n t i - P - T y r ( 1 : 1 0 0 )a t 4 C f o r 1 . 5 h , t h e a n t i b o d i e s w e r e i m m o b i l i z e d o n p a n s o r b i n a n d t h e p r e c i p i t a t e sw e r e w a s h e d f o u r t i m e s w i t h a w a s h i n g s o l u t i o n c o n s i s t i n g o f 1 T r i t o n X - 1 0 0 ,0 . 1 S D S , 1 5 0 mM s o d i u m c h l o r i d e , 1 0 0 mM s o d i u m f l u o r i d e , 2 mM s o d i u mo r t h o v a n a d a t e a n d 5 0 mM H e p e s , p H 7 . 4 . P h o s p h o t y r o s i n e - c o n t a i n i n g p r o t e i n sw e r e e l u t e d f r o m p a n s o r b i n w i t h a s o l u t i o n c o n s i s t i n g o f 1 0 mM p - n i t r o p h e n y l -p h o s p h a t e , 0 . 1 T r i t o n X - 1 0 0 a n d 2 5 mM H e p e s , p H 7 . 4 , a t 4 0 C f o r 1 h .C y t o s o l a n d m e m b r a n e f r a c t i o n s were p r e p a r e d a s f o l l o w s . A f t e r s t i m u l a t i o nw i t h g r o w t h f a c t o r s , t h e c e l l s w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , a n d f r o z e n b y l i q u i dn i t r o g e n a s d e s c r i b e d a b o v e a n d s u s p e n d e d i n t h e s o l u b i l i z i n g s o l u t i o n w i t h o u tT r i t o n X - 1 0 0 . T h e c e l l s were h o m o g e n i z e d , s u b j e c t e d t o t h r e e c y c l e s o f f r e e z i n ga n d t h a w i n g a n d c e n t r i f u g e d a t 1 5 0 0 0 g f o r 1 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t c y t o s o lf r a c t i o n was m i x e d w i t h 1 / 1 0 v o l o f 1 0 T r i t o n X - 1 0 0 . T h e p e l l e t s were s u s -p e n d e d i n t h e s o l u b i ] i z i n g s o l u t i o n c o n t a i n i n g 1 T r i t o n X - 1 0 0 . C l e a r s u p e r -n a t a n t s c o n t a i n i n g m e m b r a n e p r o t e i n s were o b t a i n e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 5 0 0 0 gf o r 1 5 m i n .P h o s p h o a m i n o a c i d a n a l y s i sT h e p h o s p h o a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n was d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y H a r i n g e t a l . , 1 9 8 4 ; A k i y a m a et a l . , 1 9 8 6 ; K a d o w a k i e t a l . , 1 9 8 7 ) . D r i e d p o l y -a c r y l a m i d e g e l p i e c e s c o n t a i n i n g p h o s p h o p r o t e i n as i d e n t i f i e d b y a u t o r a d i o g r a p h y

3 9 8 3


6/6

S . K o y a s u e t a l .w e r e w a s h e d f o r 1 2 h a t 3 7 C w i t h 2 0 m l o f 1 0 m e t h a n o l . T h e g e l p i e c e s w e r et h e n d r i e d a t 7 0 C f o r 6 0 m i n a n d e x t r a c t e d w i t h 2 m l o f 5 0 mM NH4HCO3c o n t a i n i n g 1 0 0, u g o f T P C K - t r y p s i n f o r 2 4 h a t 3 7 C . T h e e x t r a c t s w e r e l y o p h i l -i z e d a f t e r c e n t r i f u g a t i o n a n d h y d ro l y z ed i n 0 . 3 m l o f 6 N H C I f o r 2 h a t 1 1 0 0 C .T h e s a m p l e w a s d i l u t e d w i t h 2 ml o f w a t e r , l y o p h i l i z e d , d i s s o l v e d i n 0 . 5 m l o fw a t e r a n d l y o p h i l i z e d a g a i n . T h e l y o p h i l i z e d m a t e r i a l s w e r e f i n a l l y d i s s o l v e d i nw a t e r c o n t a i n i n g 1 m g / m l e a c h o f p h o s p h o t y r o s i n e , p h o s p h o s e r i n e a n d p h o s p h o -t h r e o n i n e , a n d a p p l i e d o n t o c e l l u l o s e t h i n - l a y e r p l a t e s . E l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r -f o r m e d a t p H 1 . 9 f o r m i c a c i d / a c e t i c a c i d / w a t e r , 2 5 : 7 8 : 8 9 7 b y v o l . ) a t 1 0 0 0 Vf o r 1 1 0 m i n i n t h e f i r s t d i m e n s i o n a n d a t pH 3 . 5 p y r i d i n e / a c e t i c a c i d / w a t e r ,1 : 1 0 : 8 9 b y v o l . ) a t 1 0 0 0 V f o r 7 0 m i n i n t h e s e c o n d d i m e n s i o n . T h e s t a n d a r dp h o s p h o a m i n o a c i d s w e r e d e t e c t e d b y r e a c t i o n w i t h n i n h y d r i n , a n d t h e r a d i o -a c t i v e a m i n o a c i d s w e r e d e t e c t e d b y a u t o r a d i o g r a p h y .M i s c e l l a n e o u sS D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s (SDS-PAGE) a n d t w o - d i m e n s i o n a l 2 D ) - n o n e q u i l i b r i u m pH g r a d i e n t (NEPHGE)/SDS-PAGE w e r e p er f o rm e d a sd e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( L a e m m l i , 1 9 7 0 ; O F a r r e l l e t a l . , 1 9 7 7 ) . P e p t i d e m a p p i n ga n a l y s i s w i t h S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s V8 p r o t e a s e w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t ot h e m e t h o d d e s c r i b e d p r e v i o u s l y C l e v e l a n d e t a l . , 1 9 7 7 ) . W G A - S e p h a r o s e a f -f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d s d e s c r i b e d p r e v i o u s -l y ( E k a n d H e l d i n , 1 9 8 4 ; K a d o w a k i e t a l . , 1 9 8 7 ) .A c k n o w l e d g e m e n t sWe t h a n k D r T . S u d a i n t h e J i c h i M e d i c a l S c h o o l f o r p r o v i d i n g D A - 1 c e l l s , D rM . M o r i o k a a n d h i s a s s o c i a t e s i n t h e R a d i o i s o t o p e C e n t e r o f t h e U n i v e r s i t y o fT o k y o f o r e x p e r i m e n t a l s u p p o r t , a n d D r s T . K a d o w a k i a n d K . T o b e i n t h e T h i r dD e p a r t m e n t o f I n t e r n a l M e d i c i n e , F a c u l t y o f M e d i c i n e , t h e U n i v e r s i t y o f T o k y o ,f o r u s e f u l c o m m e n t s . We a l s o t h a n k Ms F . S a m e s h i m a , E . A b e a n d H . I z u m i i nt h e D e p a r t m e n t o f C e l l B i o l o g y , T h e T o k y o M e t r o p o l i t a n I n s t i t u t e o f M e d i c a lS c i e n c e f o r t h e i r e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y S p e c i a lC o o r d i n a t i o n F u n d s f o r P r o m o t i n g S c i e n c e a n d T ec h n ol o g y f r o m t h e S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y A g e n c y o f J a p a n , a n d b y G r a n t s - i n - A i d f r o m t h e M i n i s t r y o f E d u -c a t i o n , S c i e n c e a n d C u l t u r e o f J a p a n .R e f e r e n c e sA k i y a m a , T . , S u d o , C . , O g a w a r a , H . , T o y o s h i m a , K . a n d Y a m a m o t o , T . 1 9 8 6 )S c i e n c e , 2 3 2 , 1 6 4 4 - 1 6 4 6 .B a l l , P . E . , C o n r o y , M . C . , H e u s s e r , C . H . , D a v i s , J . M . a n d C o n s c i e n c e , J . - F . 1 9 8 3 )D i f f e r e n t i a t i o n , 2 4 , 7 4 - 7 8 .C l e v e l a n d , D . W . , F i s c h e r , S . G . , K i r s c h n e r , M . W . a n d L a e m m l i , U . K . 1 9 7 7 ) J .B i o l . C h e m . , 2 5 2 , 1 1 0 2 - 1 1 0 6 .C o o k , W . D . , M e t c a l f , D . , N i c o l a , N . A . , B u r g e s s , A . W . a n d W a l k e r , F . 1 9 8 5 ) C e l l ,4 1 , 6 7 7 - 6 8 3 .D e x t e r , T . M . , G a r l a n d , J . , S c o t t , D . , S c o l n i c k , E . a n d M e t c a l f , D . 1 9 8 0 ) J . E x p .M e d . , 1 5 2 , 1 0 3 6 - 1 0 4 7 .E k , B . a n d H e l d i n , C . - H . 1 9 8 4 ) J . B i o l . C h e m . , 2 5 9 , 1 1 1 4 5 - 1 1 1 5 2 .E k , B . , W e s t e r m a r k , B . , W a s t e s o n , A . a n d H e l d i n , C . - H . 1 9 8 2 ) N a t u r e , 2 9 5 , 4 1 9 -4 2 0 .E v a n s S W R e n n i c k , D . a n d F a r r a r , W . L . 1 9 8 6 ) B l o o d , 6 8 , 9 0 6 - 9 1 3 .G r e e n b e r g e r , J . S . , E c k n e r , R . J . , S a k a k e e n y , M . , M a r k s , P . , R e i d , D . , N a b e l , G . ,H a p e l , A . , I h l e , J . N . a n d H u m p h r i e s , K . C . 1 9 8 3 ) F e d . P r o c . , 4 2 , 2 7 6 2 - 2 7 7 1 .H a p e l , A . J . , W a r r e n , H . S . a n d H u m e , D . A . 1 9 8 4 ) B l o o d , 6 4 , 7 8 6 - 7 9 0 .H a r i n g , H . - U . , K a s u g a , M . , W h i t e , M . F . , C r e t t a z , M . a n d K a h n , C . R . 1 9 8 4 )B i o c h e m i s t r y , 2 3 , 3 2 9 8 - 3 3 0 6 .H u n t e r , T . a n d C o o p e r , J . A . 1 9 8 5 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . , 5 4 , 8 9 7 - 9 3 0 .I h l e , J . N . a n d W e i n s t e i n , Y . 1 9 8 6 ) A d v . I m m u n o l . , 3 9 , 1 - 5 0 .I s h i i , T . , S u g a m u r a , K . , N a k a m u r a , M . a n d H i n u m a , Y . 1 9 8 6 ) B i o c h e m . B i o p h y s .R e s . C o m m u n . , 1 3 5 , 4 8 7 - 4 9 4 .J a c o b s , S . , K u l l , F . C . , J r , E a r p , H . S . , S v o b o d a , M . E . , V a n W y k J J a n d C u a t r e -c a s a s , P . 1 9 8 3 ) J . B i o l . C h e m . , 2 5 8 , 9 5 8 1 - 9 5 8 4 .K a d o w a k i , T . , K o y a s u , S . , N i s h i d a , E . , T o b e , K . , I z u m i , T . , T a k a k u , F . , S a k a i , H . ,Y a h a r a , I . a n d K a s u g a , M . 1 9 8 7 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 2 , 7 3 4 2 - 7 3 5 0 .K a s u g a , M . , Z i c k , Y . , B l i t h e , D . L . , C r e t t a z , M . a n d K a h n , C . R . 1 9 8 2 ) N a t u r e ,2 9 8 , 6 6 7 - 6 6 9 .K o y a s u , S . , N a k a u c h i , H . , K i t a m u r a , K . , Y o n e h a r a , S . , O k u m u r a , K . , T a d a , T . a n dY a h a r a , I . 1 9 8 5 ) J . I m m u n o l . , 1 3 4 , 3 1 3 0 - 3 1 3 6 .K o y a s u , S . , Y o d o i , J . , N i k a i d o , T . , T a g a y a , Y . , T a n i g u c h i , Y . , H o n j o , T . a n dY a h a r a , I . 1 9 8 6 ) J . l I m m u n o l . , 1 3 6 , 9 8 4 - 9 8 7 .L a e m m l i , U . K . 1 9 7 0 ) N a t u r e , 2 2 7 , 6 8 0 - 6 8 5 .L e e , F . , Y o k o t a , T . , O t s u k a , T . , M e y e r s o n , P . , V i l l a r e t , D . , C o f f m a n , R . , M o s m a n n ,T . , R e n n i c k , D . , R o e h m , N . , S m i t h , C . , Z l o t n i k , A . a n d A r a i , K . - I . 1 9 8 6 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 3 , 2 0 6 1 - 2 0 6 5 .M a y , W . S . a n d I h l e , J . N . 1 9 8 6 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 1 3 5 , 8 7 0 - 8 7 9 .M i y a j i m a , A . , O t s u , K . , S c h r e u r s , J . , B o n d , M . W . , A b r a m s , J . S . a n d A r a i , K . - I .

1 9 8 6 ) EMBOJ . , 5 , 1 1 9 3 - 1 1 9 7 .

M i y a t a k e , S . , O t s u k a , T . , Y o k o t a , T . , L e e , F . a n d A r a i , K . - I . 1 9 8 5 ) EMBO J . ,4 , 2 5 6 1 - 2 5 6 8 .M o s m a n n , T . R . , B o n d , M . W . , C o f f m a n , R . L . , O h a r a , J . a n d P a u l , W . E . 1 9 8 6 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 3 , 5 6 5 4 - 5 6 5 8 .N i c o l a , N . A . a n d M e t c a l f , D . 1 9 8 6 ) J . C e l l . P h y s i o l . , 1 2 8 , 1 8 0 - 1 8 8 .N i c o l a , N . A . a n d P e t e r s o n , L . 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 1 , 1 2 3 8 4 - 1 2 3 8 9 .O F a r r e l l , P . Z . , G o o d m a n , H . M . a n d O F a r r e l l , P . H . 1 9 7 7 ) C e l l , 1 2 , 1 1 3 3 - 1 1 4 2 .O h a r a , J . a n d P a u l , W . E . 1 9 8 7 ) N a t u r e , 3 2 5 , 5 3 7 - 5 4 0 .P a l a s z y n s k i , E . W . a n d I h l e , J . N . 1 9 8 4 ) J . I m m u n o l . , 1 3 2 , 1 8 7 2 - 1 8 7 8 .P a r k , L . S . , F r i e n d , D . , G i l l i s , S . a n d U r d a l , D . L . 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 1 , 2 0 5 -2 1 0 .P a r k , L . S . , F r i e n d , D . , G r a b s t e i n , K . a n d U r d a l , D . L . 1 9 8 7 ) P r o c . N a t l . A c a d .S c i . U S A , 8 4 , 1 6 6 9 - 1 6 7 3 .P i e r c e , J . H . , D i F i o r e , P . P . , A a r o n s o n , S . A . , P o t t e r , M . , P u m p h r e y , J . , S c o t t , A .a n d I h l e , J . N . 1 9 8 5 ) C e l l , 4 1 , 6 8 5 - 6 9 3 .R u b i n , J . B . , S h i a , M . A . a n d P i l c h , P . F . 1 9 8 3 ) N a t u r e , 3 0 5 , 4 3 8 - 4 4 0 .S c h r a d e r , J . W . 1 9 8 6 ) A n n u . R e v . I m m u n o l . , 4 , 2 0 5 - 2 3 0 .S c h r a d e r , J . W . , L e w i s , S . J . , C l a r k - L e w i s , I . a n d C u l v e n o r , J . G . 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . U S A , 7 8 , 3 2 3 - 3 2 7 .S i d e r a s , P . a n d P a l a c i o s , R . 1 9 8 7 ) E u r . J . I m m u n o l . , 1 7 , 2 1 7 - 2 2 1 .S o r e n s o n , P . , F a r b er , N . M . a n d K r y s t a l , G . 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . , 2 6 1 , 9 0 9 4 -9 0 9 7S w a r u p , G . , C o h e n , S . a n d G a r b e r s , D . L . 1 9 8 2 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . ,1 0 7 , 1 1 0 4 - 1 1 0 9 .T e r t i a n , G . , Y u n g , Y . - P . , G u y - G r a n d , D . a n d M o o r e , M . A . S . 1 9 8 1 ) J . I m m n u n o l . ,1 2 7 , 7 8 8 - 7 9 4 .T o j o , A . , K a s u g a , M . , U r a b e , A . a n d T a k a k u , F . 1 9 8 7 ) E r p . C e l l R e s . , 1 7 1 , 1 6 -2 3 .U s h i r o , H . a n d C o h e n , S . 1 9 8 0 ) J . B i o l . C h e m . , 2 5 5 , 8 3 6 3 - 8 3 6 5 .W a lk er ,F . a nd B u r g e s s , A . W . 1 9 8 5 ) EMBO J . , 4 , 9 3 3 - 9 3 9 .W e i n s t e i n , Y . , I h l e , J . N . , L a v u , S . a n d R e d d y , E . P . 1 9 8 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U S A , 8 3 , 5 0 1 0 - 5 0 1 4 .Y o k o t a , T . , L e e , F . , R e n n i c k , D . , H a l l , C . , A r a i , N . , M o s m a n n , T . , N a b l e , G . ,C a n t o r , H . a n d A r a i , K . - I . 1 9 8 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 1 , 1 0 7 0 - 1 0 7 4 .R e c e i v e d o n A u g u s t 3 , 1 9 8 7 ; r e v i s e d o n O c t o b er 1 2 , 1 9 8 7

3 9 8 4

interleukin 3-specific tyrosine phosphorylation of a membrane.pdf

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