Interaction between the Signaling Molecules WNT7aand SHH during Vertebrate Limb Development:

Dorsal Signals Regulate Anteroposterior Patterning

Yingzi Yang and Lee Niswander. Cell, Vol 80, Issue 6, 24 March 1995, Pages 939-947.

M1 DI 2008/2009

TD Biologie du développement

FRIEDEL Perrine

ROMIER Maïté

Introduction

1. Le développement du bourgeon de membre de l’embryon de poulet

Développement des membres des vertébrés : étude approfondie chez le poulet.

Système simple à manipuler.

Gastrulation, rappel sur les feuillets germinatifs:

-Ectoderme (couche externe) : épiderme, système nerveux, etc.

-Mésoderme (couche intermédiaire) : cellules du sang, cœur, reins, tissus conjonctifs, etc.

-Endoderme (couche interne) : paroi du tube digestif, organes annexes.

Le bourgeon de membre apparaît comme un renflement du mésoderme latéral.

Antérieur

Postérieur

FGF family

AER : Apical Ectodermal Ridge (Crête apicale ectodermique)

ZPA : Zone of Polarising Activity (Zone d’activité polarisante)

Ectoderme de surface

PZ: Zone de progression

FGF family

AER : contrôle la croissance proximo-distale (épaule → doigts) en stimulant la prolifération des cellules du mésenchyme.

ZPA : induit la polarité antéro-postérieure (chez l’homme : pouce → auriculaire).

Ectoderme de surface : signaux contrôlant l’axe dorso-ventral (dos de la main → paume).

A

PoDo

V

DiPr

Études moléculaires:

- Fibroblaste growth factor family (FGF)

Expression à l’AER, induction des signaux pour le développement du membre (études expérimentales).

FGF4: expériences in vivo.

- Sonic Hedgehog (Shh)

Expression Shh ARN dans ZPA.

Expression ectopique (partie antérieure) → Respécification des cellules

SHH est un composant de la voie de signalisation de ZPA.

- Gènes Wnt : impliqués dans beaucoup de processus de développement. (Drosophile homologue wingless requit pour l’expression de hh)

Wnt7a : exprimé dans l’ectoderme dorsal.

FGF family

A

PoDo

V

DiPr

Wnt7a ?3

1. Est-ce que les interactions entre FGF4 et SHH peuvent contrôler la localisation de la ZPA?

2. Les signaux de l’ectoderme dorsale sont-ils nécessaires pour l’expression de Shh (et donc pour la formation du squelette postérieure)?

3. WNT7a est-il le signal de l’ectoderme dorsale requis pour l’expression de Shh?

Axe proximo-distal Axe antéro-postérieure

FgF4 Shh

Mutuellement dépendant

Expression régulée

Contrôlent la localisation de ZPA

?1

(AER) (ZPA)

Signaux de l’ectoderme

dorsalNécessaires pour

l’expression

?2

Axe dorso-ventral(Ectoderme)

1ère partie

Les interactions entre FGF4 et SHH contrôlent-elles la localisation de la ZPA?

1. Régulation de l’expression de l’ARN Shh in vivo.

• Hybridation in situ de la quantité totale d’ARN avec une sonde Shh marquée à la digoxygenine.

20 24 26

Proximal Distal

Antérieur

Postérieur

• Bourgeon de l’aile de poulet.

Stade 20 : expression de l’ARN Shh dans le mésenchyme postérieur selon l’axe proximal-distal.

Stades 24 à 26 : expression de l’ARN Shh restreinte dans la partie distal postérieur du bourgeon de membre près de la crête apicale.

• Restriction domaine Shh

• FGF4/crête apicale requis pour maintenir l’expression de Shh

Shh non régulé dans cellules qui ont perdu l’influence de la crête apicale/FGF4.

?

Tester cette hypothèse: → expression ectopique de FGF4.

- Petite entaille → paroi de l’organisme (postérieur/proximal).

- Insertion de billes (acrylique et héparine) imprégnées de FGF4 (stades précoces et avancés).

- Après 24h → Analyse de l’expression Shh.

Proximal Distal

A

P

Contrôle (bille de PBS)

Contrôle (sans bille)

Stade 20 : expression Shh autour de la bille dans mésenchyme proximal.

Stade 24-26 : activation de l’expression Shh près des billes.(Différents niveaux d’expression → stades différents, 26 : début formation du cartilage)

Contrôles : pas d’expression ectopique de Shh.

FGF4 induit l’expression de Shh

2. Induction d’une ZPA ectopique dans le mésenchyme proximal postérieur.

• Expression normale de gènes potentiellement cibles de la ZPA (Bmp2, Bmp4 et Hoxd13) près du domaine endogène Shh.

• Traitement FGF4, domaine ectopique Shh (mésenchyme proximal postérieur), expression de ces gènes (données non montrées).

• Domaine Shh exogène (mésenchyme proximal postérieur) sans FGF4, pas d’expression de ces gènes.

Un tissu proximal postérieur dans lequel Shh a été induit (FGF4) peut-il fonctionner comme une ZPA? ?

Test réalisé:

- Bille imprégnée de FGF4 insérée près de la paroi de l’organisme à différents stades.

- Un morceau de tissu adjacent à la bille FGF4 est greffé sur le côté antérieur d’un bourgeon hôte d’aile de poulet.

- Observation de la formation du squelette « doublé ».

• Activité de polarisation complète.

• Duplication complète des doigts.

Induction d’un taux élevé d’ARN Shh.

Induction d’un taux plus faible d’ARN Shh.

• Activité de polarisation plus faible.

• Production d’un doigt en plus (2-2) (4 cas sur 9)

(n=9)

(n=9)

Contrôle : bille de PBS → Aucune activité polarisante. (stade 24, n=4)

Un tissu proximal postérieur dans lequel Shh a été induit (FGF4) peut fonctionner comme une ZPA.

Insertion bille FGF4 sans greffe, observation du squelette 7 jours après :

Conséquence morphologique unique:

Ulna plus épais (cubitus).

- Insertion bille FGF4

- Greffe du mésenchyme de la ZP et de l’ectoderme d’un bourgeon de membre stade 20 près de la bille.

Expression ectopique (*): doigt 4 manque. (n=4)

Contrôle : bille de PBS → petite pièce de cartilage observée sans forme.

La ZPA induite doit agir conjointement avec une ZP indifférenciée pour produire un membre complet.

Conclusion 1ère partie

• FGF4 induit et régule l’expression de Shh.

• Les interactions entre FGF4 et SHH permettent la localisation de la ZPA.

• La ZPA doit agir conjointement avec une zone de progression indifférenciée pour l’obtention d’un membre complet et organisé.

2ème partie

Les signaux de l’ectoderme dorsal sont-ils nécessaires pour l’expression de Shh (et

donc pour la formation du squelette postérieure)?

1. L’expression ectopique de Shh et les signaux de l’ectoderme dorsal et ventral.

• ARN Shh : distribution non équitable autour de la bille FGF4.

• Expression de Shh restreinte (mésenchyme, surface de l’ectoderme).

A. Bille FGF4 insérée dans le mésenchyme proximal postérieur (stade 24).

Localisation dorsale de l’expression de Shh → réponse différentielle du mésenchyme dorsal et ventral?

B. Bille FGF4 : mésenchyme côté ventral. Bille PBS : mésenchyme côté dorsal.

• Expression Shh : mésenchyme dorsal.

Les signaux de l’ectoderme dorsal sont-ils requis pour induire l’expression de Shh?

?

C. Élimination de l’ectoderme dorsal + bille FGF4 dans le mésenchyme proximal postérieur.

• Faible expression ectopique de Shh. (Contrairement au fort taux d’expression induit en présence d’une bille FGF4 et de l’ectoderme intact)

D. Élimination de l’ectoderme ventral.

• Effet mineur sur l’expression de Shh.

E. Élimination de l’ectoderme dorsal et ventral

• Expression de Shh non détectée.

Des signaux de l’ectoderme dorsal sont requis conjointement avec FGF4 pour induire l’expression ectopique de Shh.

Les signaux de l’ectoderme dorsal sont-ils requis pour l’expression endogène de Shh ? ?

2. L’expression endogène de Shh et les signaux de l’ectoderme dorsal et ventral.

A. Élimination de l’ectoderme dorsal.

• Expression endogène de Shh réduite en absence de l’ectoderme dorsal.

B. Élimination de l’ectoderme ventral.

• Effet mineur de l’absence de l’ectoderme ventral sur l’expression endogène de Shh.

Autres tests réalisés:

- Élimination de l’ectoderme dorsal et ventral.

Perturbation de la crête.

- Effet de l’élimination de l’ectoderme dorsal sur l’activité polarisante.

Élimination de l’ectoderme dorsale ou non.

+ 24h : greffe de la partie postérieur distale (sans/avec l’ectoderme) sur le côté antérieur d’un bourgeon de membre hôte.

Observations : - avec ectoderme : forte polarité.

- sans ectoderme : faible/absente polarité.

Les signaux de l’ectoderme (principalement l’ectoderme dorsal) sont nécessaires pour maintenir l’expression endogène de Shh ainsi que l’activité polarisante.

• Signaux de l’ectoderme + FGF4 sont requis pour l’expression ectopique et endogène de Shh.

• Signaux provenant essentiellement de l’ectoderme dorsal.

• Maintient de l’activité du mésenchyme postérieur.

Conclusion 2ème partie

3ème partie

Rôle de SHH

Ablation de l'ectoderme dorsal

Absence de l'ulna et du doigt 4Membre plus petit

Diminution de SHH = > perte d'éléments squelettiques

Importance de SHH

Sauvetage d'un embryon avec l'ajout de SHH ?

Ablation de l'ectoderme dorsal+

Ajout de cellules exprimant SHH

présence de l'ulna et du doigt 4Membre plus petit

SHH est responsable de la présence et du développement d'éléments squelettiques postérieurs

Action dose dépendante spécifique de SHH pour spécifier le destin cellulaire le long de l'axe antéropostérieur

• Shh primordial pour le développement du squelette du membre antérieur comme postérieur.

• L'action de Shh est dose dépendante.

• Shh est à l'origine de la décision de spécialisation cellulaire.

Conclusion 3ème partie

4ème partie

Constats :

- Wnt7a n'est exprimé que dans l'ectoderme dorsal,

- Drosophile : wg requis pour l’expression de hh.

Wnt7a est-il le signal nécessaire à l'ectoderme dorsal pour que ce dernier exprime Shh dans le membre?

1ère étape : Vérification de la dépendance de Wnt7a pour l'expression de Shh endogène

Ablation de l'ectoderme dorsal et ajout ou non d'un groupe de cellules exprimant Wnt7a.

Expression de Shh maintenue à taux normal seulement en présence de Wnt7a.

2nde étape : Influence de Wnt7a et FGF4 sur l'expression de Shh

Ablation de l'ectoderme dorsal et de la crête apicale+

Ajout de groupe de cellules exprimant Wnt7a et une source de FGF4

Expression de Shh maintenue à taux normal en présence de Wnt7a et FGF4.

Wnt7a ou FGF4 n’ont aucune action séparément, c'est leur coopération qui permet l'expression de Shh.

Ablation de l’ectoderme dorsal et de la crête apicale

Contrôles

FgF4 FgF4 + îlot cellulaire non transfecté

3ème étape : Influence de Wnt7a sur l'expression ectopique de Shh

Ablation de l'ectoderme dorsal+

Ajout d'une source de Wnt7a (rétrovirus ou groupe de cellules) et une source de FGF4

Retrovirus Groupe de cellules

Expression de Shh dans une zone proche de la source de FGF4.

Vue postérieure

4ème étape : Rôle de Wnt7a sur le développement squelettique des membres postérieurs

Ablation de l'ectoderme dorsal +

Source de Wnt7a

• Présence de l'ulna et du doigt 4 = >Wnt7a peut reconstituer la formation des membres antéropostérieurs.

• Membre plus petit = > Wnt7a ne peut pas corriger la réduction de taille de ces membres.

• Wnt7a et FGF4 sont nécessaires pour maintenir le taux d'expression de Shh à des valeurs normales.

• Wnt7a est responsable du développement du squelette des membres antérieurs et postérieurs.

• Wnt7a permet la présence du squelette mais ne régit pas sa croissance en elle même.

Conclusion 4ème partie

Remarque : Shh dépend de la coopération entre Wnt7a et des signaux de la crête apicale (FGF4).

Discussion

Axes de développement d'un membre :- proximo-distal = > crête apicale- antéro-postérieur = > mésenchyme postérieur- dorso-ventral = > ectoderme dorsal

Il existe une coopération entre les trois unités responsables de cette croissance, et donc une interaction entre les signaux Wnt7a, FGF4 et SHH :

• Shh est contrôlé par la production de FGF4 par la crête.

• Les signaux de l'ectoderme dorsal coopèrent avec FGF4 dans la régulation de Shh.

• Wnt7a peut remplacer le signal de l'ectoderme dorsal nécessaire pour l'expression de Shh.

• La résultante des différents signaux constituent la ZPA : l'activité de cette zone exige des signaux des trois zones de synthèse : la crête, le mésenchyme postérieur et l'ectoderme dorsal. C'est dans l'interaction complexe de ces produits de gène que la ZPA trouve son identité.

Modèle d'interaction proposé

+ ++-

-

-

Les molécules de signalisation Wnt, FGF et Shh sont exprimées partout dans beaucoup de stade de développement embryonnaire.

La compréhension de leurs interactions et les gènes qu'ils contrôlent en aval devraient fournir une connaissance plus grande de leur action de coordination pour un certain nombre de processus liés au développement (structures neurales, organisation de la structure axial de l'embryon...).

Ouverture