instituto politecnico nacional secretarÍa...
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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
CLONACIÓN, EXPRESIÓN, PURIFICACIÓN E INMUNOLOCALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA PBP3 DE
Pseudomonas aeruginosa PAO1
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS EN BIOLOGÍA CLÍNICA PRESENTA
M. en C. SANDRA LUZ RUILOBA DE LEÓN FRESCAS
DIRECTORES DE TESIS DR. JORGE ALBERTO GONZÁLEZ Y MERCHAND
DRA. ETHEL AWILDA GARCÍA LATORRE
México, D. F., 2010
El presente trabajo se realizó en el Departamento de Microbiología
de la Universidad de Guelph, Provincia de Ontario, Canadá, bajo la
asesoría del Dr. Anthony J. Clarke, la dirección del Dr. Jorge Alberto
González y Merchand y la Dra. Ethel Awilda García Latorre de los
Departamentos de Microbiología y de Inmunología respectivamente
de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto
Politécnico Nacional.
Agradezco con profunda alegría a:
Mi siempre amada familia, mis queridos, entrañables y
solidarios amigos, respetados profesores y apreciados
alumnos que de una u otra forma contribuyeron a la conclusión
del presente trabajo.
Eduardo, por tu amor e impulso constante para alcanzar las
metas deseadas.
Jorge, por tu apoyo siempre cálido, tu paciencia, tu invaluable
amistad y por no dejar que perdiera la esperanza, muchas
gracias.
Thelma y Lulú, por ayudarme a confiar que todo puede tener un
muy buen final.
Mis sinodales por sus consejos y su extraordinaria paciencia
Dr. Anthony J. Clarke and Dr. Kathy Daniels, thank you for
your kindness, support and friendship.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
i
ÍNDICE
ÍNDICE
i
ÍNDICE DE TABLAS
ii
ÍNDICE DE FIGURAS
iii
RESUMEN
iv
ABSTRACT
v
I.- INTRODUCCIÓN 1
1.- Estructura y composición de la peptidoglicana. 2
2.- Biosíntesis de la peptidoglicana 5
3.-Enzimas participantes en las últimas etapas de la biosíntesis de la peptidoglicana
10
4.- Localización de las PBPs en Escherichia coli 19
5.- Proteínas involucradas en la formación del septo y selección del sitio de división celular
20
6.- Pseudomonas aeruginosa y sus PBPs
31
7.- Justificación
35
8.- Hipótesis 36
9.- Objetivos
37
Objetivo General 37 Objetivos Específicos
37
II.- MATERIAL Y MÉTODOS 38
1.- Cepas y Plásmidos 38
2.- Medios de cultivo, antibióticos y conservación de los cultivos bacterianos 40
3.- Obtención del DNA genómico 41
4.- Amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genes pbp3, pbp3 sin cola de histidinas terminales, Δpbp3 y prc de P. aeruginosa PAO1
44
5.- Purificación y secuenciación de los productos de la PCR 45
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
i
6.- Clonación de los productos de la PCR 45
7.- Obtención de células competentes 47
8.-Transformación de células competentes y búsqueda de transformantes 48
9.- Purificación del DNA plasmídico 50
10.-Electroforesis de los productos de la PCR, los plásmidos y las construcciones
52
11.- Secuenciación del DNA 52
12.-Inducción de la expresión de las proteínas PBP3, PBP3 sin histidinas terminales (PBP3s) y ΔPBP3
53
13.- Localización y purificación de las proteínas PBP3 y ΔPBP3
54
14.- Análisis de las proteínas PBP3, PBP3 sin histidinas, ΔPBP3 y Prc por electroforesis en geles de poliacrilamida
57
15.- Obtención de anticuerpos contra la proteína PBP3 62
16.- Determinación de la actividad de la PBP3 y ΔPBP3 64
17.- Efecto de tres antibióticos β-lactámicos sobre el crecimiento de células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con los plásmidos pET30a(+), pbp3- pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+)
64
18.- Inmunolocalización por microscopía electrónica de transmisión de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 utilizando células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con los plásmidos pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+)
65
19.- Microscopía electrónica de barrido de células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con los plásmidos pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+)
67
20.- Co-expresión de los genes pbp3 y prc de P. aeruginosa en células de E. coli transformadas e inducidas con los plásmidos pbp3- pET30a(+) y prc-pFLAG-CTC.
68
III.- RESULTADOS
70
1.- Obtención del DNA genómico 70
2.- Amplificación del gen pbp3 70
3.- Amplificación del gen pbp3 sin cola de histidinas (pbp3s) 71
4.- Amplificación del gen Δpbp3 72
5.- Amplificación del gen prc 73
6.- Clonación de los genes pbp3, pbp3s (sin cola de histidinas) y Δpbp3 en los vectores intermedios pGEM®T ó pGEM®TEasy
74
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
i
8.- Clonación de los genes pbp3, pbp3s (sin cola de histidinas) y Δpbp3 en el vector pET30a(+)
76
9.- Clonación del gen pbp3 en el vector pET30a(+) 77
10.- Clonación del gen pbp3s (sin cola de histidinas) en el vector pET30a(+) 78
11.- Clonación del gen Δpbp3 en el vector pET30a(+) 79
12.- Clonación del gen prc en el vector pFLAG-CTC 80
13.- Inducción de las proteínas PBP3, PBP3s (sin histidinas terminales) y ΔPBP3
81
14.- Purificación y localización de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS
84
15.- Obtención de anticuerpos contra la proteína PBP3
91
16.- Concentración y cuantificación de la proteína PBP3 92
17.- Determinación de la actividad de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 93
18.- Efecto de tres antibióticos β-lactámicos sobre el crecimiento de células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con los plásmidos pET30a(+) y las construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+)
94
19.- Inmunolocalización por microscopía electrónica de transmisión de la proteína PBP3 de P. aeruginosa en células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con el plásmido pET30a(+) y las construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+)
100
20.- Microscopía electrónica de barrido de células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con el plásmido pET30a(+) y las construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+)
102
21.- Expresión del gen prc 104
21.- Co-expresión de los genes prc y pbp3 de P. aeruginosa en E. coli
105
IV.- DISCUSIÓN
107
V.- CONCLUSIONES
127
VI.- PERSPECTIVAS
128
VII.- BIBLIOGRAFÍA VIII.- ANEXO 1.- Artículo Publicado
129
145
145
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
ii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla página Tabla 1 PBPs de E. coli, B. subtilis, S. aureus y S.
pneumoniae.
12
Tabla 2 Particularidades de las sintetasas de la peptidoglicana de E. coli.
14
Tabla 3 Enzimas degradadoras de la peptidoglicana de E. coli.
15
Tabla 4 Cepas microbianas y plásmidos utilizados en este trabajo.
38
Tabla 5 Condiciones de amplificación de los genes utilizados en este trabajo.
44
Tabla 6 Iniciadores empleados para la secuenciación de las construcciones y plásmidos utilizados en este trabajo.
53
Tabla 7 Preparación de los geles de acrilamida-bisacrilamida.
58
Tabla 8 Esquema de inmunización para la obtención de anticuerpos anti PBP3.
63
Tabla 9 Concentración y pureza del DNA genómico de P. aeruginosa obtenido por tres métodos distintos.
70
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
Figura 1 Unidad básica de la peptidoglicana.
2
Figura 2 Principales componentes de la peptidoglicana.
3
Figura 3 Biosíntesis de la peptidoglicana.
6
Figura 4 Reacciones de Transpeptidación y Transglicosilación en la mureína de E. coli.
9
Figura 5 Modelo propuesto del complejo multienzimático para la síntesis de peptidoglicana.
10
Figura 6 Organización Molecular de las peniciloil-serín transferasas.
16
Figura 7 Reclutamiento de las proteínas al anillo septal de E. coli.
22
Figura 8 Red de interacciones entre las mureín sintetasas, mureín hidrolasas y las proteínas de la división celular.
30
Figura 9 Esquema General de Trabajo
39
Figura 10 Electroferograma de la amplificación del gen pbp3 de P. aeruginosa.
71
Figura 11 Electroferograma de la amplificación del gen pbp3 sin cola de histidinas (pbp3s) de P. aeruginosa.
71
Figura 12 Electroferograma de la amplificación del gen Δpbp3 de P. aeruginosa.
72
Figura 13 Electroferograma de la amplificación gen Δpbp3 de P. aeruginosa con DNA obtenido por 3 métodos.
72
Figura 14 Electroferograma de la amplificación del gen prc de P. aeruginosa.
73
Figura 15 Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de la construcción pbp3-pGEM®-T de 3 clonas recombinantes.
75
Figura 16 Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de una clona recombinante con pbp3s-pGEM®T.
75
Figura 17 Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de los plásmidos recombinantes Δpbp3-pGEM®T.
76
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
iii
Figura 18 Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de los plásmidos recombinantes Δpbp3-pGEM®T.
78
Figura 19 Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de las construcciones pbp3s-pET30a(+).
79
Figura 20 Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de las construcciones Δpbp3-pET30a(+).
79
Figura 21 Electroferograma de la digestión con HindIII y KpnI de las construcciones prc-pFLAG-CTC.
80
Figura 22 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la inducción de la PBP3 en células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL incubadas a temperatura ambiente.
82
Figura 23 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la inducción de la PBP3 en células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL, incubadas a 37oC.
82
Figura 24 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la inducción de la proteína PBP3 en células transformadas de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL, cultivadas a 37oC (0-180 min).
83
Figura 25 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la proteína PBP3 purificada por cromatografía de afinidad (IMAC).
84
Figura 26 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la proteína ΔPBP3 purificada por cromatografía de afinidad (IMAC).
85
Figura 27 Análisis por Western blot de la PBP3 purificada por IMAC de células de E. coli BL21 Codon Plus(DE3)-RIL transformadas con pbp3-pET30a(+), incubadas a 37oC.
85
Figura 28 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la purificación de la PBP3 de células de E. coli transformadas con pbp3-pET30a(+).
87
Figura 29 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la purificación de la ΔPBP3 de células de E. coli transformadas con Δpbp3-pET30a(+).
87
Figura 30 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la purificación de la PBP3s (sin cola de histidinas) de células de E. coli transformadas con pbp3s-pET30a(+).
88
Figura 31 Tinción con plata de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la PBP3 de células de E. coli transformadas con pbp3-pET30a(+).
89
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
iii
Figura 32 Western blot de la PBP3 purificada a partir de células de E. coli con pbp3-pET30a(+).
90
Figura 33 Tinción de Pierce de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la PBP3 de células de E. coli con pbp3-pET30a(+).
90
Figura 34 Western blot de la proteína PBP3 y los anticuerpos obtenidos en conejo contra la PBP3 purificada.
91
Figura 35 Concentración y purificación de la proteína PBP3 de P. aeruginosa PAO1.
92
Figura 36 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la PBP3 y ΔPBP3 purificadas.
93
Figura 37 Fluorografía de la PBP3 y ΔPBP3 purificadas.
94
Figura 38 Efecto de diferentes concentraciones de penicilina G sobre el crecimiento de E. coli con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
97
Figura 39 Efecto de diferentes concentraciones de aztreonam sobre el crecimiento de E. coli con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
98
Figura 40 Efecto de diferentes concentraciones de cefotaxima sobre el crecimiento de E. coli con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
99
Figura 41 Micrografías (TEM) de E. coli con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
101
Figura 42 Micrografías (SEM) de E. coli con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
103
Figura 43 Sobre-expresión del gen prc de P. aeruginosa en E. coli.
104
Figura 44 Micrografías de la co-expresión de E. coli transformada con pbp3-pET30a(+) y prc-pFLAG-CTC.
106
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
RESUMEN
La forma característica de la mayoría de las bacterias se atribuye a la peptidoglicana. Este importante constituyente de la pared celular es el responsable de mantener la integridad estructural de la célula soportando la presión interna de turgencia. La biosíntesis de la peptidoglicana es por lo tanto esencial y su papel es único en las bacterias. Como consecuencia, las enzimas involucradas en este proceso complejo constituyen blancos importantes de los antibióticos.
Las proteínas que unen penicilina conocidas como PBPs, son esenciales para el crecimiento y la división celular bacteriana, porque catalizan los pasos finales de la síntesis de la peptidoglicana, que se lleva a cabo en el periplasma. Estas PBPs pertenecen a la familia de las acil-serin transfererasas y se han clasificado de acuerdo a su peso molecular en: PBPs de alto peso molecular y PBPs de bajo peso molecular. Todas se encuentran asociadas a la región externa de la membrana citoplásmica y todas poseen un dominio que une a la penicilina.
En E. coli se han aislado 13 PBPs, 5 de ellas son de alto peso molecular (1a, 1b, 1c, 2 y 3) y ocho de bajo peso molecular (4, 5, 6, 7, 8, DacD, AmpC y AmpH). Poco se sabe acerca de las PBPs de P. aeruginosa, un patógeno oportunista, que es intrínsecamente resistente a una amplia gama de antibióticos. Las infecciones provocadas por esta bacteria, se tratan a menudo con antibióticos β-lactámicos y estos antibióticos ejercen sus efectos actuando como sustratos análogos de las PBPs. Se han aislado 8 PBPs de P. aeruginosa, y se ha propuesto que son homólogas a las PBPs de E. coli 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 basándose en el alineamiento de las secuencias aminoacídicas. Las PBPs de P. aeruginosa 1a y 1b participan en la síntesis general de la PG, la PBP2 en el alargamiento y la conservación de la forma bacilar de la célula y la PBP3, está involucrada aparentemente en la formación del septo de división; las PBPs 4,5 y 7 contribuyen al mantenimiento de la forma; sin embargo, no han sido tan estudiadas como las de E. coli. Para contribuir al entendimiento de la organización, actividad y posible función de una de las PBPs de P.aeruginosa, se realizaron estudios con la PBP3 de este microorganismo. En este trabajo se clonó y se expresó el gen pbp3 y se inmunolocalizó la proteína PBP3 de P. aeruginosa PAO1.
Para llevar a cabo lo anterior, se clonó el gen pbp3 de P. aeruginosa en el vector pET30a(+) y se expresó en E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL; la proteína PBP3 expresada se purificó por cromatografía de afinidad con un metal inmovilizado y se determinó por medio de un fraccionamiento celular que esta proteína está asociada a la membrana citoplásmica. Con la PBP3 purificada se obtuvieron anticuerpos específicos que se utilizaron para definir su ubicación que se localizó principalmente en el septo de división celular. Se obtuvo además, una versión truncada de la PBP3, denominada ΔPBP3, a la cual se le eliminó su sitio de anclaje en la membrana citoplásmica. En el fraccionamiento celular, esta proteína se localizó preferentemente en el citoplasma, lo que disminuyó notablemente su reclutamiento en el septo de división con la consecuente formación de filamentos largos de células incapaces de dividirse.
Con el propósito de determinar la actividad in vivo de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 se hicieron ensayos turbidimétricos con E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformada con las construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+) crecidas en presencia de tres antibióticos β-lactámicos y se observó que la sobre-expresión de estas proteínas aumentó la resistencia de este microorganismo a Penicilina G, Aztreonam y Cefotaxima.
El presente trabajo se realizó con la finalidad de obtener más información sobre la función de la PBP3 en la división celular. La PBP3 es un componente esencial de una red de proteínas cuidadosamente reguladas que participan en la división celular. El estudio de esta importante enzima podría proporcionar datos que ayuden a comprender el grave problema de la resistencia a los antibióticos.
Finalmente, los sistemas experimentales usados en este trabajo pueden ayudar a comprender algunas de las características relevantes de la actividad de la PBP3, incluyendo su participación en la formación del septo de división celular.
iv
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
ABSTRACT
The characteristic shape of most bacteria is attributed to the peptidoglycan layer. This mayor constituent of the bacterial cell wall is responsible for the maintenance of the structural integrity of the cell by withstanding its internal turgor pressure. The biosynthesis of peptidoglycan is therefore essential and its role is unique to bacteria. As a consequence, enzymes involved in this complex process are used as targets for antibiotics.
Penicillin-binding proteins (PBPs) are essential for the growth and division of bacterial cells because they catalise the final steps of peptidoglycan synthesis within the periplasm. They belong to the family of acyl serine transferases and they are broadly classified according to their molecular size as either high-molecular-weigh (HMW) or low-molecular-weigh (LMW) PBPs. All are associated with the outer leaflet of the cytoplasmic membrane, and all posses a penicillin-binding (PB) domain.
In Escherichia coli , there are 13 known PBPs, five HMW (PBPs 1a, 1b, 1c, 2 and 3) and eight LMW PBPs (4,5,6,7,8, DacD, AmpC, and AmpH). Less is known about Pseudomonas aeruginosa PBPs, an opportunistic pathogen that is intrinsically resistant to a wide range of antibiotics. Infections by this bacterium are often treated with β-lactam antibiotics. β-lactams exert their effects by acting as the substrate analogs of the peptidoglycan biosynthetic enzymes commonly named penicillin-binding proteins because of their abilities to covalently bind radiolabelled penicillin. It has been found that there are eight PBPs in P. aeruginosa. Based on sequence alignment similarities, these are proposed to be homologs of E. coli PBPs 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 and 7. However, PBPs of P. aeruginosa are not as well studied as those in E. coli. To further understand the organization, activity and function of one of the P. aeruginosa PBPs, we characterize the PBP3 of this microorganism. In this study we have cloned, expressed and immunolocalized the PBP3 of P. aeruginosa PAO1.
To accomplish this, the pbp3 gene of P. aeruginosa was cloned in vector pET30a(+), and was expressed in E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL; the expressed PBP3 protein was purified through immovilized metal affinity chromatography and its location was determined by cell fractionation, since this protein is supposed to be associated to the cytoplasmic membrane. With the purified PBP3, specific antibodies were obtained, which were utilized to define its location by transmission electron microscopy (TEM), which was placed primarily in the cell division septum. A truncated version of PBP3 was also obtained, named ΔPBP3, whose cytoplasmic membrane anchor was eliminated. In the cell fractionation, this protein was located primarily in the cytoplasm, which notably decreased its recruitment in the division septum and the following formation of long filaments of cells that are incapable of dividing themselves.
With the purpose to determine in vitro activity of PBP3 and ΔPBP3 proteins, turbidimetric trials were made with E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformed with pbp3-pET30a(+) and Δpbp3-pET30a(+) constructions, growing in the presence of three β-lactamic antibiotics, and it was observed that the over-expression of these proteins increased the resistance of this microorganism to penicilin G, aztreonam and cefotaxime.
The results of this study may help to understand some of the relevant characteristics of PBP3 activity, including its participation in the formation of the cellular division septum. This way, the results of this study may help to comprehend the serious problem of antibiotic resistance that is extending every time more around the world.
v
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
1
INTRODUCCIÓN
El mundo bacteriano está lleno de formas diversas y tamaños variados, y
los microorganismos perpetúan una morfología definida generación tras
generación (Justice y col. 2008; Young, 2007).
Las mayoría de las bacterias son extremadamente pequeñas si se
comparan con la mayoría de los organismos eucarióticos, y muy lejos de ser
bolsas amorfas de biomoléculas, exhiben sorprendentes arreglos morfológicos que
van desde sencillas esferas, bacilos y estructuras helicoidales hasta células planas
y filamentos hermosamente ramificados. Tanto la forma como el tamaño son
importantes para el funcionamiento de la célula, particularmente en lo que se
refiere a la difusión de nutrimentos (Cabeen y Warner, 2005; Nanninga, 2001).
Generalmente, la mayoría de las bacterias están protegidas, envueltas, por
una estructura que mantiene la rigidez y da forma a la célula; además, esta
estructura conocida como pared celular funciona también como un tamiz molecular
que evita la ruptura celular cuando se presentan cambios osmóticos intensos. Se
ha estimado que las bacterias Gram negativas pueden soportar hasta 5
atmósferas de presión (van Heijenoort, 1994; Nanninga, 1998).
La pared es entonces una espectacular estructura tridimensional que rodea
completamente a la célula bacteriana. Tiene la forma y el tamaño de la bacteria y
se le considera una molécula gigantesca del orden de 3 a 6 x 109 Da por célula
que se denomina sáculo de peptidoglicana, mureína o mucopéptido. Se ha logrado
aislar la estructura intacta pero no en su forma nativa tridimensional debido a que
ésta se pierde inevitablemente cuando se libera la presión celular (Vollmer y
Höltje, 2004; Weidel y Pelzer, 1964).
Tanto en las bacterias Gram positivas como en las Gram negativas, el
andamiaje de la pared celular consiste de un polímero entrecruzado de
peptidoglicana que está formado por una larga cadena de glicanas que se
entrecruza por medio de péptidos flexibles que constituyen puentes, que forman
una estructura fuerte pero elástica, que protege al protoplasto de la lisis debido a
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
2
la alta presión osmótica interna (van Heijenoort, 1991, 2000; Höltje, 1998; Losick y
Shapiro, 1999; Nanninga, 1998; Pink y col., 2000; Shockman y Barret,1983).
Estructura y composición de la peptidoglicana
La arquitectura básica de la peptidoglicana es compartida por todas las
bacterias excepto por los Mycoplasmas y por algunas otras especies que no
poseen pared celular. Las cadenas de glicanas están formadas por unidades
alternadas de N-acetil murámico (NAM) y N-acetil glucosamina (NAG) unidas por
enlaces β-1-4 (Figura 1).
Figura 1. Unidad básica de la peptidoglicana. La unidad básica de la peptidoglicana es un disacárido compuesto por los aminoazúcares N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina, que se unen a través de un enlace glicosídico β1-4. Tomado de van Heijenoort, 1994.
La peptidoglicana es un glicoheteropolímero único que no es lineal ni
ramificado como el almidón o el glucógeno pero forma una red bidimensional o
tridimensional de dos materiales químicamente distintos: cadenas de glicanas y
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
3
de péptidos unidos por enlaces glicosídicos y peptídicos. La estructura del
tetrapéptido que entrelaza las cadenas de glicana está formada por isómeros D y
L de algunos aminoácidos y se une al grupo lactilo del residuo de NAM (Figura 2).
Se ha propuesto que las unidades de disacárido en las cadenas de glicanas
forman una estructura helicoidal con los péptidos proyectándose en todas
direcciones y formando ángulos entre ellos de aproximadamente 90º, de tal forma
que el entrecruzamiento y la formación de puentes se da en todas direcciones
(Koch, 2000; Labischinsky y col., 1991).
Figura 2. Principales componentes de la peptidoglicana. La peptidoglicana está formada por el disacárido compuesto por los aminoazúcares N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina unidos por un enlace β1-4 y un tetrapéptido unido covalentemente al grupo lactilo del N-acetilmurámico. Tomado de van Heijenoort, 1994.
En una peptidoglicana bidimensional, cada segundo péptido se encuentra
en el mismo plano y por lo tanto lo suficientemente cerca para entrecruzarse.
D-Glutámico
L-Alanina
N-Acetilmurámico N-Acetilglucosamina
D-Alanina
m-Diaminopimélico
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
4
Dependiendo de la cepa y de las condiciones de cultivo, del 44% al 60% de
los péptidos de la peptidoglicana de E. coli y de B. subtilis, respectivamente, se
encuentran entrecruzados. Cuando un péptido no se entrecruza, las dos alaninas
terminales son generalmente eliminadas por carboxipeptidasas (Koch, 2000;
Labischinski y col., 1991; Vollmer y Höltje, 2004).
La pared resiste una elevada tensión como resultado de la turgencia de la
célula y mucho se ha especulado sobre la forma que adopta la malla de mureína,
se cree que debido a las diferentes elasticidades tanto de las cadenas rígidas de
glicanas como de los muy flexibles péptidos, la red forma estructuras
rectangulares, aunque no se conoce con certeza su forma verdadera (Koch, 2000;
Vollmer y Höltje, 2004).
La composición química de la peptidoglicana puede variar dependiendo del
microorganismo, el ambiente y de la fase de crecimiento, pero en cada situación
mantiene sus propiedades protectoras, sin que la célula pierda su forma y continúe
con su crecimiento (de Jonge y col.,1989; Joseleau-Petit y col., 1999; Mengin-
Lecreulx y van Heijenoort, 1985; Pisabarro y col., 1985; Tuomanen y Cozens,
1987).
La estructura de la peptidoglicana es muy similar en las bacterias Gram
positivas y Gram negativas; sin embargo, el grosor de esta estructura es muy
diferente. Mientras que en los microorganismos Gram positivos es una estructura
multicapa (10-20 capas) ubicada en la superficie exterior de la membrana
citoplásmica, en el caso de las bacterias Gram negativas, la pared celular está
formada de una a tres capas que se localizan entre la membrana citoplásmica y la
membrana externa. Esto significa que en las bacterias Gram negativas una muy
delgada capa de peptidoglicana es suficiente para mantener la estabilidad
mecánica de la célula. Como consecuencia, la inserción y remoción de los
componentes que constituyen la pared celular debe ser cuidadosa y estrictamente
controlada por las enzimas que participan tanto en su biosíntesis como en su
recambio, puesto que de otra manera la estabilidad de esta vital estructura celular
se vería seriamente comprometida (Labischinski y Maidhof, 1994).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
5
Biosíntesis de la peptidoglicana
La biosíntesis de la peptidoglicana se describió inicialmente en E. coli y se
cree que se presenta un patrón semejante en las demás especies de bacterias
Gram negativas (Ghuysen, 1997; Glauner y col.,1988; Höltje, 1998; van
Heijenoort, 1994; Matsuhashi, 1994; Mengin-Lecreulx y col., 1982 y 1985). Esta
biosíntesis se lleva a cabo en tres sitios de la célula: el citoplasma, la membrana
citoplásmica y el periplasma (Figura 3).
Las subunidades de peptidoglicana se sintetizan en el citoplasma utilizando
como precursores el UDP del N-acetil murámico y de la N-acetil glucosamina.
Posteriormente se forma el UDP-N-acetilmuramoil-pentapéptido (UDP-NAM-
pentapéptido) a través de la adición secuencial de los aminoácidos D y L y el
UDP-N-acetil-glucosamina (UDP-NAG). El siguiente paso, que se lleva a cabo en
la membrana citoplásmica, involucra la transferencia del P-N-acetilmuramoil-
pentapéptido al acarreador lipídico transmembranal conocido como bactoprenol,
que es un alcohol isoprenoide-P de 55 átomos de carbono, dando lugar al NAM-
(pentapéptido)-pirofosforil-undecaprenol. Este compuesto se denomina lípido
intermediario I. Entonces, el UDP-N-acetil glucosamina se transfiere de su
acarreador al N-acetil murámico unido al lípido intermediario I en la cara interna de
la membrana citoplásmica, formando el lípido intermediario II [pirofosforil-NAG-β(1-
4)-NAM (pentapéptido)-undecaprenol]. Por un mecanismo desconocido, el lípido
intermediario II transloca la unidad de disacárido-pentapéptido a través de la
membrana citoplásmica y la deposita en el periplasma en donde se encuentra la
maquinaria ensambladora de la peptidoglicana. Las etapas finales de la
biosíntesis de la peptidoglicana involucran la formación de nuevos enlaces
glicosídicos y peptídicos para construir finalmente la compleja estructura que
constituye la pared celular bacteriana (Ghuysen, 1994; Glauner y col., 1988;
Matsuhashi, 1994).
El uso de una molécula lipofílica como el bactoprenol permite a la célula
transportar precursores hidrofílicos de un ambiente acuoso como el citoplasma, a
través de la membrana hidrofóbica, a los sitios en el exterior en donde se lleva a
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
6
Figura 3. Biosíntesis de la peptidoglicana. (1) MraY cataliza la transferencia de fosfo-N-acetilmuramil-pentapéptido (P-NAM-pentapéptido) (o L-Ala-D-Glu-L-Xaa tripéptido) del UDP al acarreador lipídico (bactoprenol) que está en la figura representado por una línea vertical gruesa situada en la membrana. (2) MurG cataliza la transferencia de N-acetilglucosamina (NAG) del UDP al NAM-pentapéptido (o tripéptido) unido al bactoprenol. (3) Ensamble de la pared celular de peptidoglicana. El sitio preciso en donde los componentes cruzan la membrana plasmática no se conoce. El ensamble es catalizado por las PBPs (“Penicillin Binding Proteins”) y está temporal y topológicamente controlado por las proteínas que participan en la regulación del ciclo celular. Se muestra además en la figura el tamaño y la localización de las proteínas FtsW-RodA, FtsQ, FtsA y FtsZ de E. coli así como la estructura de la penicilina, inhibidor de las PBPs.
Tomado de Ghuysen, 1994.
cabo su incorporación a la peptidoglicana creciente. Se ha sugerido que la
translocación del precursor, unido al lípido del citoplasma, a la región externa de
la membrana se realiza a una gran velocidad que coincide con la velocidad de
síntesis de la peptidoglicana y debe ser catalizada por una translocasa específica.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
7
Se ha propuesto que homólogos de FtsW y RodA probablemente participen en
esta actividad aunque hasta el momento no se ha obtenido una evidencia
bioquímica que apoye esta propuesta; sin embargo, se sabe que estas proteínas
están incluidas en la familia SEDS (“Shape, Elongation, Division and Sporulation”)
que se involucran en actividades celulares como la forma, el alargamiento la
división y la esporulación y se han encontrado homólogos en muchas bacterias
que poseen pared celular pero no en microorganismos sin pared (Henriques y col.,
1998, Real y col., 2008).
La tercera y última etapa de la biosíntesis de la peptidoglicana se lleva a
cabo en el lado externo de la membrana citoplásmica e involucra la polimerización
de las unidades de disacárido-péptido y su incorporación a la creciente
peptidoglicana. Esta acción es realizada principalmente por las PBPs que
catalizan las reacciones de transglicosilación y transpeptidación, responsables de
la formación de los enlaces glicosídicos y peptídicos, respectivamente, de la
peptidoglicana. Las reacciones de transglicosilación catalizan la formación de la
cadena de glicana, en donde el extremo reductor del NAM de la cadena naciente
de peptidoglicana unida al lípido, se transfiere al carbón C4 del residuo de la
glucosamina, con la concomitante liberación del undecaprenil-pirofosfato; este
compuesto es entonces desfosforilado para tener de nuevo al bactoprenol
disponible para una nueva ronda de síntesis. No está aún claro como es que la
cadena en crecimiento de peptidoglicana se libera de la enzima y tampoco se
sabe que es lo que determina la longitud de la cadena (Ghuysen, 1994, 1997;
Höltje, 1998; Matsuhashi, 1994).
En la reacción de transpeptidación, el enlace D-Ala-D-Ala del péptido
constituye el primer sitio blanco donde se forma un intermediario enzima-sustrato,
con la liberación de la D-Ala terminal. El rompimiento de este enlace proporciona
la energía necesaria para la reacción de transpeptidación que ocurre fuera de
la membrana citoplásmica en ausencia de donadores de energía como ATP
(van Heijenoort y Gutmann, 2000).
Un segundo paso involucra la transferencia del fragmento peptidil a un
aceptor que es el amino no α del aminoácido dibásico en el segundo péptido
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
8
(en bacterias con entrecruzamiento directo) o con el último aminoácido del puente
de entrecruzamiento cuando éste existe. La reacción da como resultado un
nuevo enlace peptídico entre la penúltima D-alanina de un péptido donador y un
grupo amino en el péptido aceptor ( Figura 4).
Para crecer y dividirse, las bacterias no sólo necesitan sintetizar nueva
peptidoglicana sino que también requieren del rompimiento de los enlaces que
existen en el sáculo de peptidoglicana que envuelve a la célula con el propósito de
permitir la inserción de material nuevo. La síntesis de la pared celular ha sido muy
estudiada y de manera general se conocen con mucha certeza las enzimas
involucradas. Se ha aceptado que las hidrolasas de la peptidoglicana son
elementos esenciales, junto con las PBPs, para el crecimiento de la pared celular
(Koch, 1990a,2001 ).
Existen hidrolasas específicas casi para cada unión covalente de la
peptidoglicana y estas enzimas se clasifican como muramidasas,
glucosaminidasas, amidasas, endopeptidasas y carboxipeptidasas dependiendo
del enlace específico que rompen en la peptidoglicana. Además del importante
papel que juegan las hidrolasas en el crecimiento de la pared celular, estas
enzimas están involucradas en la separación de las células después de la división,
en el reciclamiento de los componentes de la pared celular y en el complejo
proceso de la esporulación (Goodell, 1985; Heidrich y col., 2001 y 2002; Höltje y
Heidrich, 2001). Pero, ¿como es que la célula controla la actividad de las
hidrolasas durante la síntesis de peptidoglicana evitando la autolisis? Es una
pregunta que aún no se ha respondido adecuadamente. Se han propuesto
diferentes modelos tanto para las bacterias Gram positivas como para las
bacterias Gram negativas para intentar explicar este complejo proceso.
Una observación interesante es que de generación en generación, el saco
de peptidoglicana se duplica de manera exacta, es decir, se mantiene el diámetro
de la célula, la longitud se duplica en una generación y la división se realiza
exactamente a la mitad de la célula (de Pedro y col., 2004, Raychaudri y col.,
2001; Rothfield, 2003; Vicente y Errington, 1996; Young, 2003). Una de las
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
9
Figura 4. Reacciones de Transpeptidación y Transglicosilación en la mureína de E. coli. Las cadenas de peptidoglicana se sintetizan por medio de reacciones de transglicosilación y transpeptidación que conducen a la formación de largas cadenas de glicanas entrecruzadas por puentes formados por péptidos. En la reacción de transglicosilación, el extremo reductor del ácido N-acetilmurámico (NAM) de la cadena naciente de PG unida al lípido se transfiere al carbón C-4 del residuo de la N-acetilglucosamina (NAG) unida al precursor de PG unido al lípido, con la liberación concomitante del undecaprenil-pirofosfato (representado por el círculo pequeño). En la reacción de transpeptidación, el enlace D-Ala-D-Ala del brazo peptídico donador es primero roto por una enzima PBP, formándose un intermediario enzima-sustrato, con la liberación de una D-Ala terminal y formándose un enlace entre el grupo carboxilo de la penúltima D-Ala del precursor y el grupo amino ε del ácido m-Diaminopimélico (m-A2pm) presente en el componente peptídico del creciente sáculo de mureína. Los números especifican los enlaces rotos por las mureín-hidrolasas específicas presentes en E. coli. 1, N-acetilglucosaminidasa; 2, Transglicosilasa lítica; 3, N-acetilmuramil-L-Alanina amidasa; 4, D,D-endopeptidasa, 5, D-glutamil-L-ácido diaminopimélico-endopeptidasa; 6, L,D-carboxipeptidasa; 7, D,D-carboxipeptidasa.
Tomado de J.V. Höltje, 1998.
propuestas es que existe probablemente una delicada y precisa inserción
restringida de nuevo material en la pared celular que se acopla con los procesos
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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de hidrólisis; ambas actividades están armoniosamente organizadas en un
extraordinario complejo holoenzimático (Höltje, 1998, Figura 5).
Figura 5. Modelo propuesto del complejo multienzimático para la síntesis de PG. El complejo holoenzimático sintetiza las nuevas cadenas de la peptidoglicana (mostradas en color gris) y las une a los puentes en ambos lados de la cadena base (cadena única gris) y al mismo tiempo se degrada esta cadena por la acción concertada de una transglicosilasa lítica y de un dímero de endopeptidasa. La holoenzima se desliza a lo largo de la cadena base con las mureín sintetasas al frente de las hidrolasas, actuando de acuerdo a la estrategia de “hacer antes de romper”. TL, transglicosilasa lítica; EP, endopeptidasa; TP, transpeptidasa; TP/TG transpeptidasa-transglicosilasa (enzima bifuncional); TG, transglicosilasa. Tomado de Höltje, 1998.
Enzimas participantes en las últimas etapas de la biosíntesis de la
peptidoglicana.
Las enzimas encargadas de la síntesis forman los enlaces adecuados para
unir las nuevas cadenas de peptidoglicana a la pared ya existente mientras que
las degradadoras rompen los enlaces peptídicos para liberar a la cadena que será
reemplazada (Ghuysen, 1997; Höltje, 1993, 1994ª, 1994b; Koch, 2000).
Las responsables del ensamble, mantenimiento y regulación de la
peptidoglicana (Denome y col., 1999) son una familia de enzimas conocidas
colectivamente como proteínas que unen penicilina o PBPs (“Penicillin Binding
Proteins”). Estas PBPs están presentes en casi todas las bacterias, pero varían de
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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especie a especie en número, tamaño, y afinidad a los antibióticos β lactámicos.
La mayoría de estas proteínas están ancladas a la membrana interna de la
membrana bacteriana (Amaral y col., 1986; Georgopapadakou y Liu, 1980;
Sauvage y col., 2008) con sus sitios activos disponibles en el espacio
periplásmico.
El por qué estas enzimas se denominan PBPs es histórica, y se debe a que
todas ellas sufren modificaciones cuando se ponen en contacto con la penicilina,
la cual se une covalentemente e irreversiblemente a sus sitios activos (Blumberg y
Strominger, 1974; Dougherty y col., 1996; Spratt, 1975; Tipper y Strominger, 1965;
Wientjes y col., 1983) dando como resultado enzimas inactivas y estables, de tal
manera que la bacteria se ve privada de las funciones esenciales de la biosíntesis
de su pared celular, dando como resultado la pérdida de la viabilidad. (Bayless,
2000; Macheboeuf y col., 2006; Ramachandran y col., 2006; Rogers y Forsberg,
1971).
Algunas bacterias han desarrollado alteraciones de sus PBPs
(Georgopapadakou, 1993, Godfrey y col.,1981) de forma tal que son menos
susceptibles a la acción deletérea de los antibióticos β-lactámicos; se tienen
importantes ejemplos con S. aureus, S. pneumoniae, Enterococcus hirae y
Enterococcus faecium que son bien conocidos y que además representan a
algunos de los patógenos clínicamente mas resistentes al tratamiento con
antibióticos.
Las funciones de las PBPs son muy diversas e incluyen actividades de
hidrólisis, transpeptidación, transglicosilación y carboxipeptidación (Ghuysen,
1991, 1994; Georgopapadakou, 1993; Höltje y col., 1975; Höltje, 2001; Sauvage y
col., 2008; Spratt, 1975; Young, 2001).
Las PBPs pueden dividirse básicamente en tres grupos, las PBPs
monofuncionales o de bajo peso molecular, las PBPs multimodulares o de alto
peso molecular y las β lactamasas (Ghuysen, 1991); En las Tablas 1, 2 , 3 y en
la Figura 6 se muestran las características de estas proteínas que se describen
más ampliamente en los párrafos siguientes.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Tabla 1. PBPs de E.coli, B. subtilis, S. aureus y S. pneumoniae.
Organismo
Clase Gene Proteína Función, expresión
Localización (métodos).
E. coli
A
ponA, mrcA
PBP1a
Síntesis general de
PG
ponB mrcB
PBP1b(α,β y γ)
Síntesis general de PG
pbpC PBP1c Funciona sólo como TG. Se une a
PBPs1B, 2, 3 y MltA
B pbpA PBP2 TP específica de alargamiento
Patrón de distribución a lo largo de la membrana lateral y en el sitio de división celular (GFP)
pbpB o
ftsI PBP3 FtsI
TP específica de división celular
Septo de división celular (IF,GFP)
Carboxipeptidasas
de bajo peso molecular
dacA PBP5 Control de la forma celular
dacC PBP6 dacD PBP6b
Endopeptidasas de bajo peso molecular
dacB PBP4 Control de la forma de la célula en
concierto con PBP5
pbpG PBP7 Control de la forma de la célula en
concierto con PBP5
mepA MepA Endopeptidasa insensible a la
penicilina
β-Lactamasas ampC AmpC Afecta la forma de la célula
ampH AmpH Afecta la forma de la célula
PG, peptidoglicana; TG, transglicosilasa; TP, transpeptidasa; IF, inmunofluorescencia; GFP, proteína de fusión fluorescente; esp, esporulación; veg, crecimiento vegetativo.
Cont…
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Organismo Clase Gene Proteína Función,
expresión Localización (métodos).
B. subtilis
A
ponA
PBP1a/b
TG/TP específica de
la división celular, veg
Septal (IF, GFP)
pbpD PBP4 Desconocida, veg Distribuida a lo largo de la membrana con sitios
específicos en la periferia (GFP)
pbpF PBP2c Síntesis de la PG de
la espora, veg, etapas tardías de la
esporulación
Distribuida a lo largo de la membrana,
redistribuida en la pre-espora durante la
esporulación (GFP) pbpG PBP2d Síntesis de la PG de
la espora,esp Distribuida a lo largo de
la membrana (GFP), redistribuida en la pre-
espora durante la esporulación
B pbpA PBP2a Síntesis de la pared lateral, veg.
Uniformemente distribuida a lo largo de
la membrana (GFP) pbpH PBPH Síntesis de la pared
lateral, veg. Uniformemente
distribuida a lo largo de la membrana (GFP)
pbpB PBP2b TP específica de la división celular.
Septal (IF, GFP)
pbpC PBP3 Desconocida, veg., baja expresión
durante la esporulación.
En focos definidos y en bandas en la periferia
de la célula (GFP)
spoVD SpoVD Síntesis de la PG de la espora, esp.
Desconocida
pbpI PBP4b Desconocida, esp. Uniformemente distribuida a lo largo de
la membrana (GFP)
Organismo
Clase Gene Proteína Función,
expresióna Localización (métodos).
S. aureus
A
pbp2 o pbpB
PBP2
División celular
Septo de división
(IF,GFP).
B pbpA PBP1 Desconocida No se conoce pbpC PBP3 Desconocida No se conoce mecA PBP2A o
PBP2´ Proteína que confiere resistencia a β-lactámicos
No se conoce
Transpeptidasa de bajo peso
molecular
pbpD o pbp4
PBP4 Entrecruzamiento secundario de la PG
No se conoce
Cont…
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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Organismo Clase Gene Proteína Función, expresión
Localización
S. pneumoniae
A
pbp1a
PBP1a PBP1b
División celular Desconocida
Septal
Septal o ecuatorial
pbp2a PBP2a Síntesis de la pared celular periférica
Ecuatorial
B pbp2x o pbpX
PBP2x División celular Septal
pbp2b PBP2b Síntesis de la pared celular periférica
Ecuatorial
D,D-carboxipeptidasa
de bajo peso molecular
dacA PBP3 Regula el grado de entrecruzamiento; coordinación del
proceso de división celular
Uniformemente distribuida en ambos hemisferios y ausente del sito de la futura división celular
Adaptado de Höltje, 1998 y de Scheffers y Pinho, 2005.
Tabla 2. Particularidades de las sintetasas de la peptidoglicana de Escherichia coli.
Gene Actividad Peso
Molecular (kDa)
Localización Referencia
ponA (mrcA)
Transpeptidasa/transglicosilasa
(PBP1A)
94.5
Membrana interna
Broome-Smith y col., 1985
ponB (mrcB)
Transpeptidasa/transglicosilasa
(PBP1B)
94.3
Membrana interna
Broome-Smith y col., 1985
pbpC
Transpeptidasa/transglicosilasa
(PBP1C)
85.1
Membrana interna
Schiffer & Höltje, 1999
pbpA (mrdA)
Transpeptidasa/(¿transglicosilasa?)
(PBP2)
70.8
Membrana interna
Asoh y col., 1986
ftsI (pbpB)
Transpeptidasa/(¿transglicosilasa?)
(PBP3)
63.9
Membrana interna
Nakamura y col., 1983
mgt
Glicosiltransferasa
(MGT)
27.3
Membrana interna
Di Bernardino y col., 1996
Adaptado de Höltje 1998.
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aeruginosa PAO1
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Tabla 3. Enzimas degradadoras de la peptidoglicana de Escherichia coli.
Clase Enzima Peso
Molecular (kDa)
Localización Referencia
Transglicosilasas líticas
Slt
70
Periplasma
Engel y col., 1991.
MltA 38 Membrana externa
Lommatzsch y col, 1997.
MltB 39 Membrana externa
Ehlert y col, 1995.
Slt35 (producto proteolítico de MltB)
35 Periplasma Dijkstra y col., 1995.
MltC 40 Membrana externa
Dijkstra & Keck, 1996
a, 1996
b
MltD 54 Membrana externa
Bateman & Bycroft, 2000.
Endo-Mlt (EmtA) 37 Citoplasma Kraft y col., 1998.
Β-Acetilglucosaminidasa
β-N
Acetilglucosaminidasa
37
Citoplasma
Votsch & Templin, 2000.
N-Acetilmuramil-L-alanin amidasas
Muramil-L-alanin
amidasa A
28
Periplasma
Tomioka y col., 1983.
Muramil-L-alanin amidasa B
48 Periplasma Tsui y col., 1994.
Muramil-L-alanin amidasa C
43 Periplasma Templin y col., 1999
N-Acetil-anhidromuramil-L-alanin
amidasa
20.5 Citoplasma Jacobs y col., 1995.
D,D-Endopeptidasas
PBP4 (también con actividad de D,D-Carboxipeptidasa)
48
Asociada a la
membrana
Korat y col., 1991.
PBP7/8 31 Asociada a la membrana
Romeis & Höltje, 1994.
MepA 28 Periplasma Keck y col., 1990.
D,D-Carboxipeptidasas
PBP5
40
Membrana
interna
Broome-Smith y col., 1988.
PBP6 40 Membrana interna
Broome-Smith y col., 1988.
PBP6B 43.5 Membrana interna
Baquero y col., 1996.
Adaptado de Höltje, 1998.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Figura 6. Organización Molecular de las peniciloil-serín transferasas. Esta figura muestra el diseño modular de las proteínas que unen penicilina (PBPs) de alto peso molecular (PB, Módulo que une penicilina; n-PB, Módulo que no une penicilina). Se observan también los motivos conservados. S* constituye el sitio activo con serina. La numeración de los aminoácidos en las PBPs de alto peso molecular es la de miembros prototipo, la PBP1a de S. pneumoniae (Clase A) y la PBP3 de E. coli (Clase B). Las PBPs de alto peso molecular de clase A son la PBP1a de S. pneumoniae, E. coli, B. subtilis y H. influenzae, y la PBP1b de E. coli. Las PBPs de alto peso molecular clase B son la PBP2 y PBP3 de E. coli, PBP2 de N. meningitidis y N. gonorrhoeae, PBP2x de S. pneumoniae, PBP2b y SpoVD de B. subtilis, la PBP2’ de baja afinidad de S. aureus, PBP3´ y PBP5 de E. hirae, PBP2b de S. penumoniae. También se muestran en la figura la organización molecular de las PBPs de bajo peso molecular y de las β-lactamasas.
Tomado de J.M. Ghuysen, 1994.
Las PBPs de alto peso molecular (HMPBPs) tienen una estructura
multidominio y exhiben en un sitio la actividad de transpeptidación que cataliza el
entrecruzamiento de la peptidoglicana (PB ó módulo C-terminal que se une a la
penicilina) otro de transglicosilación que participa en el alargamiento de las
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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cadenas de glicana conocido como el módulo que no une penicilina (n-PB) y un
tercer dominio transmembranal que participa como ancla (módulo N-terminal); sin
embargo, las funciones de los otros dominios se desconocen casi totalmente
(Goffin y Ghuysen, 1998).
Dependiendo de la estructura primaria y de la actividad del dominio
N-terminal, las PBPs multidominio se dividen en clases A y B (Ghuysen, 1991;
Goffin y Ghuysen, 1998). Los módulos PB o que unen a la penicilina de todas las
PBPs, pertenecen a la superfamilia de las peniciloil-serín transferasas, pero tienen
poca identidad en sus secuencias, excepto en los sitios activos conservados que
corresponden al motivo característico de estas enzimas (Ghuysen, 1997). Los
módulos n-PB de las clases A y B de las PBPs tienen plegamientos similares, pero
secuencias de aminoácidos diferentes, lo que sugiere funciones o sustratos únicos
(Ghuysen, 1994, 1997; Figura 6).
En las bacterias Gram negativas, la clase A de PBPs incluye a las PBPs 1a,
1b y 1c. Se ha demostrado in vitro que las PBPs clase A catalizan el alargamiento
de las cadenas de glicanas (transglicosilación) y el entrecruzamiento de los
péptidos a partir del intermediario lípido II (transpeptidación) (Ghuysen, 1991); se
cree que estas mismas funciones se realizan in vivo (Ghuysen y col., 1996). Es
necesario que al menos una de las PBPs 1a ó 1b estén activas puesto que una
deleción en los genes que codifican para estas proteínas es letal (Denome y col.,
1999). El “knockout” de uno de los dos genes puede tolerarse, sugiriendo que una
de las PBPs compensa a la otra (Denome y col., 1999 y Ghuysen, 1997). Una
sobre-expresión de la PBP1c es incapaz de complementar la pérdida de las PBPs
1a y 1b (Schiffer y Höltje, 1999) lo que sugiere que la PBP1c tiene una función
única y diferente a la de las PBPs 1a y 1b. La inactivación específica in vivo de los
módulos PB de las PBPs 1a y 1b por los antibióticos ß-lactámicos provoca la lisis
celular debido a las actividades de las enzimas líticas de la peptidoglicana (Chalut
y col., 2001; Meisel y col., 2003).
La clase B de las PBPs incluye a las PBPs 2 y 3. La PBP2 participa en el
crecimiento de la pared que controla la forma bacilar de la bacteria ya que su
ausencia provoca que las células crezcan como esferas (Denome y col., 1999;
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
18
Den Blaauwen y col., 2003; Höltje y col., 1975; Legaree y col., 2007a, 2007b, 2008;
Navarro y col., 1998). Se ha demostrado también que la PBP2 interactúa con una
proteína integral de la membrana citoplásmica llamada RodA que es también
esencial para la determinación de la forma celular (Navarro y col., 1998).
La PBP3 conocida también como FtsI participa activamente en la
biosíntesis de la peptidoglicana durante la formación del septo previo a la división
celular (van Heijenoort, 1994; Ghuysen, 1997). Estas proteínas muestran
actividades de transpeptidación pero a pesar de que sus dominios están muy
conservados entre las bacterias caracterizadas, no se ha podido asignar una
función catalítica al módulo n-PB, lo que implica que estas PBPs no participan en
los procesos de transglicosilación. La inactivación in vivo de los módulos PB de las
PBPs 2 y 3 por antibióticos β-lactámicos provocan anormalidades morfológicas,
que son seguidas a menudo de lisis celular. La inactivación del dominio PB de la
PBP2 resulta en la pérdida de la forma bacilar (Legaree y col., 2007b).
Una manera diferente de identificar los sitios en donde se sintetiza la
peptidoglicana es observando la localización de las principales enzimas
sintetizadoras (PBPs). Hasta el momento, se tiene información limitada sobre la
localización de las proteínas específicas responsables de la división celular en E.
coli y B. subtilis. El uso de proteínas de fusión fluorescentes (“GFP-Green Fusion
Protein”) para determinar la localización de ciertas proteínas dentro de la célula
bacteriana (Lewis, 2004; Wang y col., 1998; Weiss y col., 1997) ha conducido
durante los últimos años a un enorme caudal de datos sobre la localización de las
PBPs. Hasta el momento no se ha estudiado a profundidad la posible localización
de las transglicosilasas monofuncionales.
Por otro lado, la producción de β-lactamasas de las clases A, C y D es un
notable mecanismo de defensa que las bacterias han desarrollado para proteger a
su maquinaria biosintética del efecto tóxico de la penicilina (Bradford, 2001;
Ghuysen, 1991, 1994; Massova, 1998; Philippon, 1989; Votsch y Templin, 2000).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
19
Localización de las PBPs en Escherichia coli
En E. coli se han involucrado dos diferentes transpeptidasas en la síntesis
del material de la pared celular, durante el alargamiento a la PBP2 (Legaree y
col., 2007a, 2007b) y en el proceso de la división celular a la PBP3, llamada
también FtsI (Spratt, 1975). La diferencia entre las actividades de estas proteínas
se establece por la especificidad del sustrato, la PBP3 exhibe una preferencia por
cadenas laterales con tripéptidos y la PBP2 por cadenas laterales con
pentapéptidos (Begg, 1990; Botta y Park, 1981; Pisabarro y col., 1986). La
localización subcelular de ambas proteínas se ha determinado utilizando
inmunofluorescencia (IF) y fusiones GFP. La transpeptidasa PBP2 se localiza
tanto en un patrón de puntos en la pared lateral así como en el sitio de división
celular, de manera similar a la PBP4 y PBP5 de B. subtilis. Es interesante
observar que la presencia de la PBP2 en el sitio de división celular incita a la
pregunta si esta proteína forma parte de la maquinaria de la división celular; se ha
mostrado que este no es el caso. Se ha propuesto que el papel de la PBP2 es el
mantenimiento del diámetro correcto de la célula ya que células crecidas en
presencia de amdinocilina conocido también como mecilinam, que es un inhibidor
específico de la PBP2, muestran un incremento en el diámetro de los polos
formados de novo (Den Blaauwen y col., 2003; Young, 2008).
La transpeptidasa PBP3 división-específica se localiza en el septo de
división celular (Wang y col, 1998; Weiss y col., 1997, 1999) y esta localización
depende del dominio transmembranal de la PBP3 y de las proteínas de división
celular FtsZ, FtsA, FtsQ, FtsL y FtsW (Mercer y Weiss, 2002). Recientemente,
Piette y colaboradores (2004) así como Wissel y colaboradores (2005)
demostraron que el dominio transmembranal de la PBP3 sólo se localiza en el
septo de división con residuos en un lado de la hélice que son esenciales para la
localización, formación y para la posible interacción hélice-hélice con otras
proteínas de la división celular.
En el caso de las PBPs de bajo peso molecular (LMPBPs), la actividad
enzimática que se ha reconocido con certeza es la de carboxipeptidación. Son
proteínas que probablemente tienen un solo dominio. Es interesante también
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
20
observar que algunas de estas PBPs muestran actividades de endopeptidasas y
carboxipeptidasas (Ghuysen, 1991 y 1997). En este grupo se incluyen a las PBPs
4, 5, 6 y 7.
Existen además las β-lactamasas, que son enzimas de defensa sintetizadas
por la bacteria para proteger a sus PBPs del efecto dañino de la penicilina. La
única actividad conocida de estas enzimas es la hidrólisis de los antibióticos
β-lactámicos (Bradford, 2001; Ghuysen, 1991, 1994; Massova, 1998; Philippon,
1989; Votsch y Templin, 2000).
Con la excepción de una sola proteína que parece ser dependiente de zinc,
el resto de todos los miembros ya conocidos de esta gran familia de enzimas
pertenece al grupo de proteínas que poseen un sitio activo con serina y se les
denomina acil serin-transferasas (Joris y col., 1988; Figura 6).
Proteínas involucradas en la formación del septo y selección del sitio
de división celular
Las bacterias existen en una amplia variedad de formas e históricamente, la
morfología celular ha sido un importante criterio taxonómico. En el dominio
Bacteria, la peptidoglicana es el principal determinante de la forma celular. Como
ya se ha mencionado, la peptidoglicana está constituida por largas cadenas de
glicanas entrecruzadas por péptidos cortos. La estructura reticular resultante
comprende una molécula gigantesca que cubre la superficie completa de la célula.
Cuando la célula es despojada de esta estructura, el sáculo de PG conserva la
forma de la célula. Sin embargo, aún no se sabe como es que se determina la
forma tridimensional de la célula. Recientemente han habido avances al conocer
que un morfogene mreB codifica para un homólogo de actina que se ensambla en
cables helicoidales que podrían constituir elementos citoesqueléticos con un papel
directo en la determinación de la forma celular. Una pregunta crucial que ha
surgido después del descubrimiento del citoesqueleto de MreB es ¿cómo es que
estos cables citoesqueléticos controlan la topología de la biosíntesis de PG? En
principio, estos componentes actúan probablemente localizando una o más de las
enzimas involucradas en la síntesis de los precursores de la pared celular
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
21
(Ausmees y col., 2003; Cabeen y Warner, 2007; Carballido-López y Errington,
2003; Maddock y col., 1993).
Como resultado de varias décadas de trabajo, es posible ahora reconocer
un esquema general en la división celular bacteriana que ha sido descrito por
Errington y colaboradores (2003), de la siguiente manera:
1) Selección del sitio de división celular, que se ubica generalmente en la
mitad de la célula y entre los nucleoides recientemente replicados y
segregados.
2) Ensamble del aparato citoplásmico que involucra invariablemente a FtsZ
y en la mayoría de los organismos a FtsA; estas proteínas pueden unir e
hidrolizar moléculas de nucleósido-trifosfato, que proporcionan la
energía para remodelar la forma celular, posiblemente contrarrestando
fuerzas provocadas por la turgencia y/o la arquitectura de la pared
celular.
3) Interacciones con una o más proteínas que proporcionan una unión
entre la membrana citoplásmica y otras cubiertas celulares y por último
4) El ensamble de ciertas proteínas con importantes dominios
extracelulares, particularmente las muy especializadas PBPs, que
dirigen la síntesis de la pared celular que constituye los nuevos polos
celulares, la constricción de la célula y el cierre final del septo.
Durante la década pasada, se ha estudiado intensamente la diferenciación
del sitio de división celular en las bacterias revisando el ensamble de todas las
proteínas que están comprometidas en la maquinaria de división (Arends y Weiss,
2004; Gueiros-Filho y Losick, 2002; Mercer y Weiss, 2002). Estos estudios han
mostrado que las proteínas se ensamblan en un angosto anillo citocinético
denominado FtsZ en una etapa temprana de diferenciación en el sitio futuro de
división celular. En E. coli, se requieren de al menos 12 proteínas que se localizan
precisamente en esta estructura anular y que incluyen a FtsA, ZipA, FtsK, FtsQ,
FtsL, YgbQ, FtsW, FtsI (PBP3) y FtsN, que se reclutan en prácticamente un
orden lineal de dependencia (Figura 7). El complejo proteico resultante o
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
22
divisoma se requiere para la síntesis del septo de división celular y la subsecuente
formación de nuevos polos celulares.
Estas proteínas se han denominado Fts (“filamentation temperature
sensitive”) debido a que se obtuvieron mutantes capaces de forman largos
filamentos aseptados en condiciones de temperatura no permisivas (Spratt, 1977).
Figura 7. Reclutamiento de las proteínas al anillo septal de E. coli. En esta figura se muestra que el primer evento es la polimerización de FtsZ en el anillo Z. Posteriormente se unen FtsA y ZipA, que se unen directamente al anillo FtsZ. Las demás proteínas se reclutan en un orden establecido: FtsK, FtsQ, FtsL y YgbQ (codependientes), FtsW, FtsI (PBP3) y finalmente FtsN. Tomado de Mercer y Weiss (2002).
Un suceso vital en el estudio de la citología bacteriana ha sido la
demostración en 1991 (Bi y Lutkenhaus, 1991) de que la proteína involucrada en
la división celular FtsZ se ensambla en una estructura anular conocida como el
anillo Z en el sitio de división celular. Este hallazgo fue sumamente importante
porque demostró que una proteína citoplásmica puede localizarse en un sitio
particular de la célula y que su posicionamiento es pertinente con el papel que
juega en la citocinesis. El ensamble del anillo Z es responsable del reclutamiento
de otras proteínas que culmina finalmente con el establecimiento del septo de
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
23
división (Addinall y col., 1997a; Hale y Boer, 1997; Ma y col., 1996; Varma y
Young, 2004; Wang y col., 1998; Weiss y col., 1997, 1999).
En las células en crecimiento, la formación del anillo Z en la posición central
de la célula es responsable de la fisión binaria dando como resultado dos células
hijas idénticas. El movimiento de estas proteínas puede ser bastante rápido. En
las etapas tardías del ciclo celular de E. coli puede observarse que FtsZ se
despliega en menos de un minuto, del sitio de división celular a enclaves futuros
de citocinesis (Addinall y col., 1997b; Sun y Margolin, 1998). De todas las
proteínas de división identificadas hasta el momento, la más conocida
incuestionablemente es FtsZ, que es una proteína que se autoensambla en
presencia de GTP o de GDP en polímeros altamente ordenados que exhiben un
comportamiento intensamente dinámico y que forman una estructura anular en
asociación con la membrana citoplásmica (Lutkenhaus y Addinall, 1997;
Mukherjee y col., 1994, 1998). Este anillo Z constituye el andamio para el
posterior reclutamiento de muchas otras proteínas en un complejo que constituye
la maquinaria citocinética. Este anillo se mantiene mientras se sintetiza el septo y
después de su formación, se despolimeriza. Los anillos Z se forman in vivo en un
tiempo de 1-3 minutos y se desensamblan en prácticamente un minuto (Anderson
y col., 2004; Den Blaauwen y col., 1999). Se ha demostrado que cerca del 30% de
FtsZ celular está presente en el anillo Z y que existe un intercambio dinámico con
el FtsZ del citosol, el modelo considerado para este fenómeno es que el anillo Z
está hecho de una malla de filamentos que establece intercambios rápidos de
polímeros cortos de FtsZ que se forman en el citosol (Stricker y col., 2002).
Existen varios sistemas para controlar el ensamble de FtsZ y la formación
del anillo, los cuales difieren dependiendo de la especie. Está emergiendo un
consenso interesante que involucra a dos factores que serían clave para la
selección del sitio adecuado en la mitad de la célula para el inicio de la división
celular, uno de ellos incluye al propio cromosoma bacteriano, a través de un
efecto que se ha denominado oclusión por el nucleoide y en el segundo se ha
nombrado al sistema Min, al que se le atribuye la responsabilidad de bloquear los
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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sitios indeseables de división en los polos de la célula (Errington y col., 2003;
Margolin, 2001; Neuman y Crooke, 2000; Sun y Margolin, 1998).
El sistema de oclusión por el nucleoide es un mecanismo pobremente
conocido. En principio, el sitio de división en medio de la célula aparece y
desaparece cíclicamente, en paralelo con las rondas de replicación del
cromosoma. Si el modelo es el correcto, las bacterias han desarrollado un
mecanismo que “siente” la presencia de una zona libre de DNA en esta región de
la célula que se genera al final del ciclo de replicación celular, y que proporciona
no solamente una señal espacial pero también temporal para la división. En su
forma original este modelo se basó en el conocimiento de que la presencia de un
nucleoide replicándose activamente inhibe la biosíntesis de la pared celular en su
vecindad más próxima; esto, se ha reinterpretado como un mecanismo que evita
el ensamble del anillo Z en la cercanía del nucleoide. La base molecular de esta
inhibición se desconoce, pero se acepta que este fenómeno juega un papel
importante en la ubicación del septo en la región media de la célula en un
cuidadoso y coordinado proceso de citocinesis, que permite la replicación del
cromosoma bacteriano y su segregación (Errington y col., 2003; Margolin, 2001;
Neuman y Crooke, 2000; Sun y Margolin, 1998).
Una segunda forma de regulación de la posición del anillo Z es ejercida
por el sistema o complejo Min que consiste de tres proteínas, MinC, MinD y MinE
que evitan la división celular en los polos. MinC y MinD actúan juntas como un
regulador negativo del ensamble del anillo FtsZ. MinC es un dímero que consiste
de dos dominios distintos conectados por un eslabón flexible. El dominio
N-terminal, que interactúa con FtsZ, muestra cierta homología con FtsA (Hu y col.,
1999). El dominio C-terminal de MinC media la dimerización así como la
interacción con MinD que es una ATPasa asociada a la membrana que secuestra
a MinC a la membrana. Es probable que el complejo MinCD posea una afinidad
adicional para el ensamble de estructuras septales. MinE imparte la especificidad
topológica al complejo inhibidor MinCD evitando su ubicación en medio de la
célula. El complejo Min es un inhibidor sitio-específico de la formación del anillo Z,
cuya ausencia conduce a la formación de septos cercanos a los polos. La
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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especificidad topológica de las proteínas Min en E. coli en los extremos de la
célula impiden la formación de septos en estas regiones, pero no en el centro de la
célula. Se conoce un tercer factor capaz de inhibir la formación del anillo Z en B.
subtilis, la proteína membranal EzrA. La ausencia de esta proteína conduce a la
formación de anillos Z adicionales y facilita además la formación de estos anillos
cuando la concentración de FtsZ es baja; EzrA está homogéneamente distribuida
en la membrana celular y se localiza en el sitio de división celular una vez que el
anillo citocinético se ha ensamblado, presumiblemente vía interacción con el
polímero de FtsZ; entonces, en contraste con el sistema Min, EzrA actúa
desestabilizando los polímeros de FtsZ en toda la célula (Margolin, 2001; Shih y
col., 2003).
FtsA es la segunda proteína convocada al anillo Z, es una proteína
citosólica asociada a la membrana que se localiza en la parte central de la célula y
depende del ensamble previo de FtsZ en el anillo Z. El papel específico que se le
ha asignado a esta segunda proteína es el reclutamiento de las demás proteínas
involucradas en la división celular. En principio y dadas sus características es
posible que FtsA use la energía proveniente de la hidrólisis del ATP para estimular
el ensamble (Begg y col., 1998; Corbin y col., 2004; Ma y col., 1996; Tormo y col.,
1986).
El anillo Z debe estar firmemente unido a la membrana y esta asociación es
necesaria para coordinar su posterior invaginación acoplada a la síntesis de la
peptidoglicana en el septo. Se han propuesto muchos candidatos, entre ellos las
PBPs, para actuar como anclas de la membrana al anillo Z, pero también se ha
argumentado que las PBPs se reclutan en las etapas tardías al complejo de
división celular. Por lo tanto, la proteína ZipA se constituye como el candidato más
viable para esta tarea (Geissler y col., 2003; Hale y de Boer, 2002).
ZipA es una proteína de membrana con una topología inusual en donde la
región N-terminal está anclada a la membrana y unida a una larga porción
citoplásmica que consiste de dos claros dominios conectados por una región
flexible rica en Pro-Gln. Varias evidencias han mostrado que el dominio
C-terminal de ZipA interactúa con FtsZ. La naturaleza de esta interacción se ha
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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demostrado in vitro, en donde ZipA es de 10 a 100 veces menos abundante que
FtsZ. Tanto FtsA como ZipA interactúan con la región C-terminal de FtsZ pero es
muy probable que no compitan por los mismos sitios de unión en las mismas
moléculas de FtsZ (Geissler y col., 2003; Hale y de Boer, 2002).
FtsK es una proteína de gran tamaño con actividades diversas en las
etapas tardías de la división celular. Tiene un gran dominio citoplásmico que es
necesario para la segregación del cromosoma y está altamente conservada entre
las Eubacteria. El dominio N-terminal se encuentra incluido en la membrana
celular y es esencial para la división; el dominio C-terminal participa en el
“bombeo” de DNA a través del septo que está en proceso de cierre lo que ayuda a
asegurar que la división ocurra sólo en la región entre los cromosomas
recientemente replicados (Grenga y col., 2008; Müller y col., 2007).
FtsQ en E. coli es una proteína de 276 aa de poca abundancia
(aproximadamente 22 copias por célula) con una topología transmembranal similar
a FtsL, FtsN y FtsI. Aparentemente esta proteína es esencial para la división pero
su función no ha podido determinarse claramente (Guzman y col., 1997).
La proteína FtsL de E. coli es pequeña, (121 aa) y de ubicación
transmembranal (Ghigo y Beckwith, 2000). Se sabe poco sobre su función en la
división y se tiene cierta información sobre las características de su secuencia
aminoacídica con un motivo en su dominio C-terminal extracelular que podría estar
involucrado en interacciones proteína-proteína (Guzman y col., 1997).
Recientemente se identificó un nuevo gen esencial para la división, ygbQ, tanto en
Vibrio cholerae como en E. coli. La proteína YgbQ producto de este gen es una
proteína pequeña transmembranal (llamada también FtsB) con una estructura
similar a FtsL. Esta proteína también se localiza en el sitio de división celular y su
localización es codependiente de FtsL. La disminución de esta proteína induce un
fenotipo filamentoso típico de otras mutantes de la división celular.
FtsW, que es casi de las últimas proteínas en integrarse al sitio de división
celular, es un miembro de la familia SEDS (Henriques y col., 1998) con
aparentemente 10 regiones transmembranales, codificada por un gen que está
frecuentemente cercano al gen para las PBPs clase B, luego entonces ftsW está
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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en el mismo operón que ftsI lo que ha propuesto que sus actividades están
íntimamente conectadas (Boyle y col., 1997). Por lo tanto, se ha sugerido que
FtsW participa probablemente en la estabilización de FtsZ en E. coli.
Las funciones que se les han adjudicado a las proteínas SEDS, además de
reclutar a las PBPs, parecen ser la translocación del precursor unido al
bactoprenol, para la síntesis de peptidoglicana, del interior al exterior de la
membrana y su entrega al complejo sintetizador de PG (Höltje, 1998). Este
importante papel es consistente con la estructura transmembranal múltiple de
estas proteínas. Sin embargo, las PBPs clase B no tienen actividad de
transglicosilación y por lo tanto no podrían ser las receptoras inmediatas del
precursor. Presumiblemente, al menos, debe estar involucrada una PBP clase A.
Surge entonces la pregunta ¿por que se requiere de distintas proteínas para la
translocación? Existe cierta evidencia de que las actividades de la PBP2 y de FtsI
(PBP3), tienen preferencias distintas, la primera se activa con cadenas laterales
de pentapéptidos y la segunda con cadenas laterales con tripéptidos (Begg y col.,
1990). Es posible que RodA y FtsW tengan diferentes afinidades por ciertos
precursores y los canalizan a una maquinaria sintetizadora diferenciada de
peptidoglicana (Höltje, 1998).
La formación del septo requiere de una PBP exclusiva para la síntesis de
peptidoglicana que constituirá los nuevos polos de las células hijas. Se conoce
hasta el momento una familia extensa y diversa de proteínas involucradas en los
pasos finales de la biosíntesis de esta estructura tomando como base su
capacidad de unirse a la penicilina. Muchas bacterias tienen diversas PBPs y
parece ser que existe una considerable redundancia en la manera de actuar de
estas proteínas (Goffin y Ghuysen, 1998).
La división bacteriana se inicia en la parte central de la célula con la
formación del anillo FtsZ hacia el que se dirigen una cascada de proteínas que se
ensamblan para dirigir la formación del septo y la consecuente invaginación de las
envolturas. Como parte de este proceso la PBP3 ó FtsI redirige la síntesis de
peptidoglicana de una incorporación difusa en la región cilíndrica de la pared
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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condicionada por la PBP2, a un sitio específico en el septo de división celular
naciente (Botta y Park, 1981; Pogliano y col., 1997; Spratt y Pardee, 1975).
La PBP3 ó FtsI es una transpeptidasa que realiza el entrecruzamiento en la
pared celular durante la formación del septo de división celular. Es una proteína
membranal bitópica que se localiza tardíamente en el sitio de división celular y que
por lo tanto interacciona con varias proteínas involucradas en la división celular
(FtsA, FtsL, FtsN, FtsQ y FtsW) (Karimova y col., 2005; Wang y col., 1998; Weiss
y col., 1997, 1999; Wissel y col., 2005).
El gen ftsI de E. coli codifica para una proteína de 588 aminoácidos, que
sufre un procesamiento que remueve 11 residuos de la región C-terminal (Hara y
col., 1991). El estudio de la topología de esta proteína ha revelado que posee tres
regiones: un dominio citoplásmico amino-terminal constituido por 23 aminoácidos,
una sola hélice transmembranal de 17 residuos y un dominio periplásmico largo de
537 residuos. Este dominio periplásmico comprende dos regiones, un dominio no
catalítico de función desconocida y un dominio catalítico que es el directamente
responsable de realizar el entrecruzamiento de la peptidoglicana del septo de
división. Muchos estudios han implicado tanto al dominio citoplásmico como a la
hélice transmembranal en la ubicación de FtsI en el anillo septal (Goffin y col.,
1996; Guzman y col., 1997; Weiss y col., 1999). El dominio catalítico se extiende
del residuo 237 al 577 y es el sitio de la actividad de transpeptidación responsable
del entrecruzamiento. Este dominio catalítico muestra homología a otras
transpeptidasas involucradas en el metabolismo de la peptidoglicana (Goffin y
Ghuysen, 1998). De manera particular, el sitio activo contiene un residuo de serina
universalmente conservado (S307) que forma un enlace covalente con el péptido
del sustrato durante la transpeptidación, reacción que procede vía un intermediario
acil-enzima. El dominio catalítico, conocido también como dominio PB, se une a
los antibióticos β-lactámicos que imitan al sustrato de la transpeptidasa y
funcionan como inhibidores suicidas formando un complejo covalente con el
residuo de serina (Nicholas y col., 1985). Este dominio PB muestra el pliegue
esperado para la región catalítica de una transpeptidasa .
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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El dominio no catalítico (nPB) se extiende del residuo 41 al 236. Este
dominio fue primero reconocido como un elemento estructural distinto cuando se
reveló que las secuencias se conservaban entre un subgrupo de transpeptidasas
de alto peso molecular de la clase B (Ghuysen, 1991). Se ha propuesto que el
dominio no catalítico interactúe con otras proteínas del anillo septal y que estas
interacciones son importantes para la localización de FtsI y para el reclutamiento
de las últimas proteínas como FtsN, así como en la regulación de la actividad de
transpeptidación. Se ha sugerido también que la región n-PB puede comportarse
como una chaperona intramolecular, que se requiere para el adecuado
plegamiento del dominio PB. Sin embargo, se han propuesto otras tareas para
esta región incluyendo que funcione como un posible sitio para la interacción con
otras proteínas de la división celular o proteínas generales de la maquinaria
biosintética de la peptidoglicana (Goffin y col., 1996).
Se ha estimado que FtsI está presente en aproximadamente 100 moléculas
por célula, lo que confirma una baja cantidad de esta proteína (Weiss y col., 1997).
En un modelo atractivo y actual de síntesis de peptidoglicana propuesto
para bacterias Gram negativas, FtsI (PBP3), actúa en un complejo multiproteico
que introduce tres nuevas cadenas de glicana en paralelo con la hidrólisis de una
cadena que participa como molde (Höltje, 1998; Höltje y Heidrich, 2001).
La última proteína que se integra al septo es FtsN. Esta proteína tiene un
segmento N-terminal que está incluido en la membrana citoplásmica y un dominio
C-terminal en la región periplásmica. FtsN se localiza en la región central de la
célula y es dependiente de la actividad de FtsI, además, es necesaria para el
reclutamiento de otros dos componentes, el primero de ellos es la mureín
hidrolasa (AmiC), que contribuye para la separación de las células hijas y el
segundo es el complejo Tol-Pal que es requerido para la invaginación adecuada
durante el proceso de constricción. Se han propuesto varias funciones para esta
proteína incluyendo la estabilización del anillo septal (Ursinus y col., 2004; Wissel
y Weiss, 2004).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Mϋller y colaboradores (2007) han propuesto una red de interacciones entre
las mureín sintetasas, la mureín hidrolasas y las proteínas involucradas en la
división celular (Figura 8).
Figura 8. Red de interacciones entre las mureín sintetasas, mureín hidrolasas y las proteínas de la división celular. En esta figura se muestran las interacciones entre las mureín sintetasas (PBP1B, PBP3), mureín hidrolasas (MltA, Slt70, PBP7) y las proteínas de la división celular (FtsN, FtsW, FtsA, FtsQ y FtsB). Las flechas sólidas muestran interacciones directas detectadas utilizando proteínas purificadas. Las flechas discontinuas muestran interacciones observadas por cromatografía de afinidad y por último las flechas punteadas muestran las interacciones manifestadas por métodos genéticos. Tomado de Mϋller y col., 2007
P. aeruginosa y sus PBPs
Un patógeno oportunista es un organismo que es incapaz de causar
enfermedad en individuos sanos pero que puede infectar personas cuyas
defensas específicas o inespecíficas se han deteriorado. P. aeruginosa es un
microorganismo Gram negativo, ubicuo y patógeno oportunista. Se encuentra
normalmente en el suelo y en el agua y es capaz de colonizar transitoriamente la
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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piel y el tracto digestivo del hombre y de los animales (Kiska y Gilligan, 2003;
Salyers, y Whitt, 1994, 2001).
P. aeruginosa ha sido particularmente exitosa en la adaptación a nuevos
ambientes creados por las actividades humanas. Tiene pocos requerimientos
nutricionales y posee una extraordinaria versatilidad para utilizar un enorme caudal
de compuestos naturales y artificiales como fuentes de carbono y energía. Las
defensas normales inespecíficas del sistema inmune son suficientes para prevenir
una infección por P. aeruginosa, pero cualquier perturbación de estas defensas
puede favorecer la invasión por este microorganismo y causar una enfermedad
sistémica fatal (Kiska y Gilligan, 2003; Palleroni, 1991; Salyers y Whitt, 1994,
2001).
P. aeruginosa es capaz de provocar enfermedad en pacientes
inmunocomprometidos (enfermos de SIDA, pacientes con cáncer, quemados) y en
individuos que padecen la enfermedad genética conocida como fibrosis quística en
donde provoca infecciones crónicas que conducen al deterioro pulmonar y
finalmente a la muerte. Esta bacteria muestra además una resistencia intrínseca a
una amplia variedad de antibióticos lo que hace difícil su erradicación. Pocos
antibióticos son efectivos, y entre estos se incluyen a las fluoroquinonas,
amikacina, gentamicina y algunos de los más recientes β-lactámicos como el
imipenem; aun estos antibióticos pueden resultar sin actividad sobre algunas
cepas. El problema constante de los tratamientos de infecciones por P.
aeruginosa resulta de enorme importancia en pacientes hospitalizados, pero se
ilustra de manera más dramática en los pacientes con fibrosis quística, quienes
eventualmente se infectarán con una cepa resistente que no podrá ser eliminada
(Godfrey y col., 1981; Okamoto y col., 2001).
La notable resistencia de P. aeruginosa a los antibióticos ha provocado
importantes y vastas investigaciones para saber de que manera interactúa esta
bacteria con los antimicrobianos y como es que resiste el efecto de antibióticos de
primera línea. El primer paso de la interacción entre los antibióticos y las bacterias
Gram negativas ocurre en la membrana externa. Algunos antibióticos utilizan
aparentemente porinas específicas para ingresar al espacio periplásmico, como
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
32
sucede con los β-lactámicos y es común intentar tratamientos con estos
antibióticos que ejercen su efecto inhibiendo la síntesis de la peptidoglicana y que
han demostrado su efectividad ya que este componente es esencial para la
conformación de una pared celular estable. La alteración en los mecanismos de
biosíntesis de la peptidoglicana, provocan una gran sensibilidad osmótica que
resulta finalmente en la lisis celular (Bayless, 2000; Georgopapadakou, 1993;
Nikaido y Normak, 1987).
P. aeruginosa tiene ocho PBPs que se han clasificado también de acuerdo
a su peso molecular (Noguchi y col., 1979). En el grupo de alto peso molecular se
incluyen a las PBP1a, PBP1b, PBP2 y PBP3 y entre las de bajo peso molecular
están las PBP4 PBP5, PBP6 y PBP7. Todas estas proteínas participan
activamente en la síntesis de la pared celular, la PBP1a y PBP1b en el
alargamiento de la célula, la PBP2 es esencial para mantener la forma y la PBP3
está involucrada en la formación del septo durante la división celular. Además
todas estas enzimas son necesarias para el crecimiento celular y blancos letales
de los antibióticos β-lactámicos. En el caso de las PBPs pequeñas o de bajo peso
molecular se ha sugerido que no son esenciales para la sobrevivencia de la célula
(Denome y col., 1999; Spratt y Pardee, 1975).
La PBP3, motivo de nuestro estudio, es una proteína esencial que participa
en la formación del septo durante la división celular y su inactivación selectiva
hace que la célula crezca formando filamentos largos (Ghuysen, 1991). Esta
proteína, junto con el resto de las PBPs, son las responsables del ensamble,
mantenimiento, regulación y remodelación de la pared celular (Georgopapadakou
y Liu, 1980).
El gen ftsI que codifica para la PBP3 se encuentra muy cercano al grupo de
genes requeridos para la síntesis de precursores de la peptidoglicana (murE,
murF, murG y murC) y de los genes que participan en la formación del septo y la
división celular (ftsW, ftsQ, ftsA y ftsZ) lo que sugiere que la PBP3 es esencial
para la división celular (Höltje, 1996).
La PBP3 se encuentra ampliamente distribuida en un gran número de
bacterias y está sumamente conservada, por lo que puede convertirse en un
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
33
importante blanco para la creación de nuevos antibióticos de amplio espectro
(Fraipont y col., 1994; Goffin y col., 1996, 1998; Massova y Mobashery, 1998;
Piette y col., 2004).
Se ha reportado que la PBP3 de P. aeruginosa es el blanco principal de las
cefalosporinas de cuarta generación (Maejima y col., 1991) y otro hallazgo
interesante fue la existencia de cepas de origen clínico de P. aeruginosa aisladas
de pacientes con fibrosis quística resistentes a este tipo de antibióticos debido a la
pérdida de las PBP3 y/o PBP6 (Godfrey y col., 1981).
Los antibióticos β-lactámicos son potentes agentes bactericidas, de amplio
espectro y baja toxicidad para los organismos eucariotes y su uso clínico está
ampliamente distribuido a nivel mundial. En los últimos 50 años, se ha avanzado
enormemente en el estudio y la biología de estos antibióticos, que son sin duda
alguna los agentes quimioterapéuticos más exitosos. La serendipia ha guiado el
poco conocimiento de su actividad antibacteriana. A nivel molecular, existe cierta
comprensión de la estructura blanco de los β-lactámicos, las PBPs, así como su
íntima relación con las β-lactamasas. Tanto las PBPs como las β-lactamasas son
enzimas que interactúan con los antibióticos β-lactámicos y ambas se relacionan
desde el punto de vista estructural y evolutivo (Ghuysen, 1991; Massova y
Mobashery, 1998)
Los antibióticos β-lactámicos se han utilizado intensamente para inhibir a
las PBPs de un gran número de bacterias debido a que éstos actúan como
sustratos análogos para el dominio de la transpeptidasa de las PBPs (Liao y
Hancock, 1995, 1997ª y 1997b) se unen covalentemente e irreversiblemente a los
β-lactámicos y como resultado la actividad de las PBPs se inhibe y la bacteria
muere. La reacción de transpeptidación se ha analizado con gran detalle debido a
que es el blanco de estos antibióticos que son los agentes antibacterianos más
familiares (Tipper y Strominger, 1965; van Heijenoort y Gutmann, 2000).
La PBP3 de P. aeruginosa, es una proteína cuya mayor parte se proyecta
al espacio periplásmico en donde actúa en la biosíntesis de la peptidoglicana, la
región N-terminal es la que ancla la proteína a la membrana y el resto de la
proteína se proyecta al espacio periplásmico en donde su dominio C-terminal
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
34
posee la actividad de transpeptidación así como la capacidad de unirse
covalentemente a la penicilina (Liao y Hancock, 1995). En E. coli el producto
primario del gen ftsI tiene un peso molecular de 63.85 kDa mientras que la forma
procesada muestra una mayor movilidad electroforética que corresponde a un
peso aproximado de 60 kDa. Inicialmente se pensó que la maduración de la PBP3
incluía un procesamiento del péptido señal N-terminal, pero se demostró que esto
no sucedía así, ya que al eliminar 40 residuos de esta región, la proteína se
acumulaba en el citoplasma pues había perdido su sitio de anclaje (Nakamura y
col., 1983).
En 1989 Hara y colaboradores, clonaron y caracterizaron al gen prc de E.
coli cuyo producto (Tsp ó Prc) es el responsable del procesamiento C-terminal de
la PBP3. En el caso de P. aeruginosa no se ha reportado la clonación ni la
caracterización de dicho gen.
El gen ftsI de P. aeruginosa ya había sido clonado pero no se logró el
aislamiento ni la purificación de la proteína PBP3 (Liao y Hancock, 1995, 1997).
Con el propósito de entender la actividad y función de una de las PBPs de
la clase B, se realizó el estudio de la PBP3 de P. aeruginosa, tanto en su forma
nativa como en su forma soluble.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas aeruginosa PAO1
35
JUSTIFICACIÓN
Las proteínas que unen penicilina (PBPs) son enzimas que catalizan las
etapas finales de la biosíntesis de la peptidoglicana. Se ubican en el periplasma
y son esenciales para el crecimiento y la división de las células bacterianas.
Todas las bacterias caracterizadas hasta el momento, producen un
determinado número de PBPs que participan en el metabolismo de la
peptidoglicana, tanto en su síntesis como en el reciclamiento de sus
componentes. Gracias a la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida-
SDS, estas PBPs se han clasificado por su peso molecular en PBPs de alto
peso molecular (HMW) y PBPs de bajo peso molecular (LMW). E. coli produce
13 diferentes PBPs, 5 de alto peso molecular y el resto de bajo peso molecular.
Se ha demostrado que las PBPs se asocian a la membrana citoplásmica ya
sea como proteínas integrales o periféricas y como implica su nombre todas
poseen la capacidad de unirse a la penicilina.
Las PBPs de alto peso molecular 1a, 1b y 1c catalizan la
transglicosilación y la transpeptidación de los precursores de la peptidoglicana
unidos al bactoprenol al sáculo creciente de la peptidoglicana y se ha
establecido que las PBP2 y PBP3 participan activamente en las reacciones de
transpeptidación que se involucran en la forma y en la formación del septo de
división celular respectivamente. Las proteínas pequeñas 4, 5, 6, 7, 8 , DacD,
AmpC y AmpH tienen actividades de endopeptidasas y carboxipeptidasas.
Poco se sabe acerca de las PBPs de P. aeruginosa, pero diversos
estudios han manifestado que este patógeno oportunista, que es
intrínsecamente resistente a una amplia gama de antibióticos produce 8 PBPs.
Basándose en similitudes por alineamiento de secuencias de aminoácidos, se
ha propuesto que estas PBPs son homólogas a la PBPs 1a, 1b, 2, 3, 4, 5, 6 y 7
de E. coli. Sin embargo, las PBPs de P. aeruginosa no han sido
completamente caracterizadas por lo que se consideró importante abordar el
estudio de la proteína PBP3 implicada en la formación del septo de la división
celular, para de esta forma ayudar a entender las interacciones entre la pared
celular de P. aeruginosa y los antibióticos que más se emplean para combatirla.
36
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
HIPÓTESIS
Si la PBP3 de Escherichia coli es una proteína que participa en la formación
del septo de división celular y se localiza preferentemente en este sitio,
entonces es posible que la PBP3 de Pseudomonas aeruginosa muestre
actividades semejantes y se ubique de manera similar, así mismo es probable
que la sobre-expresión de esta proteína provoque la formación de filamentos
largos aseptados debido a la incapacidad de las células para formar el septo de
división celular y dividirse normalmente. También existe la probabilidad de que
la sobre producción de la proteína PBP3 incremente la resistencia celular hacia
los antibióticos β-lactámicos.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
37
OBJETIVO GENERAL
Estudiar y caracterizar a la proteína PBP3 de P. aeruginosa PAO1
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Clonar y expresar el gen de la proteína PBP3 de P. aeruginosa PAO1
Purificar a la proteína PBP3 de P. aeruginosa PAO1 en su forma nativa y en
su forma citoplásmica (ΔPBP3).
Determinar la ubicación celular de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 utilizando
anticuerpos específicos.
Evaluar el efecto de la sobre-expresión de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 de P.
aeruginosa expresadas en E. coli, en presencia de tres antibióticos β-
lactámicos.
Co-expresar los genes prc y pbp3 de P. aeruginosa en E. coli y valorar sus
efectos sobre la morfología microscópica.
.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
38
Material y Métodos
El esquema general de trabajo se muestra en la Figura 9
1.- Cepas y Plásmidos
Las características de las cepas microbianas y de los plásmidos que se
utilizaron en este trabajo se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Cepas microbianas y plásmidos utilizados en este trabajo
Cepa o plásmido Genotipo o gen de
resistencia Característica
principal Uso en este trabajo
Pseudomonas aeruginosa
PAO1
protótrofa
Productora de PBP3
Para la amplificación,expresión y coexpresión de los genes
pbp3 y prc.
Escherichia coli DH5 (Grant y col., 1990)
F-(λ
-) Φ80dlac ZΔM15
Δ(lacZYA-_argF)U169 endA1
recA1 hsdR17 deoR thi-1
supE44 gyrA96 relA1
lac Z
- pero puede ser
complementada por lac Zα
Para los experimentos de
transformación
E. coli BL 21 (DE3).
E. coli B F-dcm ompT
hsdS(rB-mB
-) gal (DE3)
Codifica para la T7 RNA polimerasa bajo el control
del promotor lacUV5.
Para los experimentos de expresión de proteínas no
tóxicas
E.coli BL 21 (DE3) pLysS
E. coli B F
- dcm ompT
hsdS(rB-mB-) gal (DE3) [pLysS Cam
r]a
El plásmido pLysS codifica para la lisozima T7 que es un inhibidor de la T7 RNA
polimerasa.
Se utilizó para la expresión tanto de proteínas tóxicas como
no tóxicas.
Escherichia coli BL21 Codon
Plus (DE3)- RIL.
E. coli B F- ompT hsdS(rB
-
mB-) dcm+ Tet
r gal (DE3)
endA Hte [argU ileY leuW Cam
r]
Codifica para la T7 RNA polimerasa bajo el control
del promotor lacUV5
Para la expresión de proteínas.
pGEM T Vector Systems de Promega (3003 pb)
amp
r
Vector intermedio
Para la clonación de los genes
pbp3, pbp3 y pbp3 sin histidinas
pGEM® T Easy Vector Systems de Promega
(3015 pb)
amp
r
Vector intermedio
Para la clonación de pb, pbp3 y pbp3 sin histidinas
pET30a(+) de Novagen (5422 pb)
kan
r
Vector de expresión
Para la clonación de los genes
pbp3, pbp3 y pbp3 sin histidinas terminales
pFLAG-CTC de Sigma (5336pb)
amp
r
Vector de expresión
Clonación y expresión del gene prc
Para obtener un abasto suficiente, todos los plásmidos se propagaron en
Escherichia coli DH5α y se purificaron con el “kit” QIAprep Miniprep System de
QIAGEN que consiste brevemente, en unir-lavar y eluir el plásmido de una
membrana de sílica-gel que es capaz de incorporar hasta 20 g de DNA en
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
39
Cultivo de Pseudomonas aeruginosa
Amplificación
pbp3
Clonación
pbp3
Clonación
Δpbp3
Expresión de la proteína PBP de P.
aeruginosa en E. coli en
diferentes condiciones de cultivo
Purificación de la
PBP3
Obtención de
anticuerpos
Expresión de la proteína
ΔPBP3 de P. aeruginosa
en E. coli en diferentes
condiciones de cultivo
Purificación de la
ΔPBP3
Microscopía
Electrónica
de
Transmisión
Microscopía
Electrónica de
Barrido
Microscopía
Electrónica
de
Transmisión
Microscopía
Electrónica de
Barrido
Amplificación del
gen prc
Clonación del
gen prc
Expresión de la
proteína Prc de P.
aeruginosa en E. coli
Coexpresión
de los genes
prc y pbp3 de
P. aeruginosa
en E. coli
Amplificación
Δpbp3
Efecto de
antibióticos β-
lactámicos sobre
el crecimiento y
la morfología
Obtención de
DNA genómico
Figura 9. ESQUEMA GENERAL DE TRABAJO
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
40
presencia de una concentración elevada de sales caotrópicas y permite la
posterior elución de este DNA en un volumen pequeño de regulador con baja
concentración de sales.
Posteriormente la identidad de cada uno de los plásmidos se confirmó
mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% utilizando TAE como regulador
de corrimiento.
2.-Medios de cultivo, antibióticos y conservación de los cultivos bacterianos.
A).- Medio de Luria Bertani
El medio de Luria Bertani (Bertani, 1952) líquido o adicionado de agar se
utilizó para el crecimiento de todos los cultivos bacterianos y para los ensayos de
expresión, su composición química es la siguiente: 5 g/L de extracto de levadura
(Difco), 10 g/L de NaCl (Fisher) y 10 g/L de triptona peptona (Difco). A los medios
sólidos se les adicionó agar (Difco) a una concentración final de 1.5%. Cuando
fue requerido se adicionaron los antibióticos adecuados como agentes de
selección.
Todos los cultivos se incubaron a 37oC y en el caso de los cultivos líquidos
se crecieron en agitación a 200 rpm. Cuando así fue requerido, los cultivos se
ajustaron a una absorbancia (A600) de 0.6 a 0.7 a 600 nm en un espectrofotómetro
Beckman DU-70.
B).-“Super Broth”
Este medio se utilizó para la expresión de las proteínas y contiene 32 g/L de
triptona peptona (Difco), 20g/L de extracto de levadura (Difco) y 5 g/L de NaCl
(Fisher)
C.-“Terrific Broth”
Este medio también se utilizó para la expresión de proteínas y contiene 24
g/L de extracto de levadura (Difco), 12 g/L de triptona peptona (Difco) y 4 mL/L de
glicerol (Fisher). Estos ingredientes se incorporaron a 900 mL de agua destilada y
se esterilizaron a 121oC por 15 min. A este medio se le adicionaron momentos
antes de ser inoculado, 100 mL de un regulador de fosfato de potasio pH 7.4 que
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
41
contenía KH2PO4 0.17 M (Fisher) y K2HPO4 0.72 M (CCI) el cual se esterilizó por
separado en autoclave también a 121oC por 15 min.
Antibióticos
Los antibióticos se adicionaron a los medios de cultivo sólidos o líquidos.
Ampicilina de Roche Diagnostics a una concentración de 100µg/mL, Aztreonam
de ICN Biomedicals a concentraciones de 1,3,5,10 y 15 µg/mL, Cefotaxima de
Sigma a concentraciones de 1,3,5,10 y 15 µg/mL, Cloranfenicol de Sigma a una
concentración de 34 µg/mL, Kanamicina de Sigma a una concentración de 30
µg/mL, Penicilina G de Sigma a concentraciones de 5,10,100,150 y 300 µg/mL.
Conservación de los cultivos bacterianos.
Para un mantenimiento a corto plazo (no más de una semana) todos los
cultivos de células se conservaron en refrigeración a 4oC y para una conservación
a mediano y largo plazo se adicionó glicerol a los cultivos a una concentración final
de 25% y se mantuvieron a -70oC.
3.-Obtención del DNA genómico
Se utilizaron tres métodos para la obtención del DNA cromosómico de P.
aeruginosa.
A).-Método de CTAB (Bromuro de hexadecil-trimetil amonio) de Sigma. (Ausubel y
col., 1995).
La cepa se creció en medio LB a 37º C durante 12-16 h en agitación. Se
tomaron 25 mL del cultivo y se centrifugaron a 4080 x g durante 5 min, el paquete
de células se resuspendió en 14 mL de regulador TE (1X), se adicionaron 0.75 mL
de SDS al 10%, se mezcló vigorosamente en un vortex y se adicionaron 75 L de
proteinasa K (20 mg/mL); la mezcla se volvió a agitar y se incubó a 37º C durante
1 h. Se agregaron 2.5 mL de NaCl 5 M y 2.0 mL de la mezcla CTAB/NaCl a una
concentración final de CTAB 10% en NaCl 0.7M a la mezcla de células y se incubó
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
42
a 65º C por 10 min. Posteriormente se adicionó cloroformo-alcohol isoamílico en
una proporción de 24:1 y se mezcló suavemente. Se centrifugó a 14400 x g
durante 30 min y se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio, se repitió la adición
de cloroformo-alcohol isoamílico y la centrifugación hasta que ya no se observó
interfase. El sobrenadante se colocó en un tubo limpio y se le adicionó un volumen
igual de una mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico en proporción 50:24:1. Se
centrifugó a 14,400 x g por 20 min y se repitió la adición de la mezcla
fenol:cloroformo:isoamílico hasta obtener una solución clara. Dicho sobrenadante
se transfirió a un tubo Corex al cual se le adicionaron 0.6 mL de isopropanol por
volumen de muestra y se mezclaron hasta que el DNA precipitó. Para obtener un
mayor rendimiento, se conservó la mezcla a 4º C durante toda la noche. Al día
siguiente, las hebras de DNA se transfirieron a un tubo limpio con la ayuda de una
pipeta Pasteur doblada en su extremo y se conservaron a –20º C hasta su uso.
Nota: Para preparar la solución de CTAB en NaCl, se procedió de la siguiente
manera. Se disolvieron 4.1 gramos de NaCl en 80 mL de agua destilada, se
adicionaron lentamente 10 mL de la solución de CTAB en un baño a 65º C
mezclando suavemente. Se mantuvo a esta temperatura hasta la total disolución
del CTAB. Se ajustó el volumen final a 100 mL. Se obtiene una concentración final
de CTAB al 10% en NaCl al 0.7 M.
B).- Método de DNAzol Reagent de Gibco BRL
Se cultivó P. aeruginosa PAO1 en 3 mL de LB a 37oC por 12-14 h. El cultivo
se centrifugó a 14400 x g durante 2 min. Se adicionó 1 mL de DNAzol y se mezcló
suavemente. La suspensión se conservó a temperatura ambiente durante 1 h para
favorecer la lisis celular; posteriormente se centrifugó a 8520 x g por 10 min y se
adicionaron 0.5 mL de etanol absoluto frío para inducir la precipitación del DNA, se
mantuvo a temperatura ambiente por 30 min. Se centrifugó de nuevo a 14400 x g
por 30 min y el precipitado se lavó dos veces con etanol al 95% seguido de otra
centrifugación a 14400 x g por 2 min. El sobrenadante se eliminó y el precipitado
se secó a temperatura ambiente. Posteriormente el DNA se resuspendió en 20 L
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
43
de Tris-EDTA adicionado de 1 L de RNasa (Roche Diagnostics) a una
concentración de 2U/mL.
C).- Método de Daniels, 1999.
Este método consistió en crecer a la bacteria (10 mL) en medio LB a 37o C
por 18 h en agitación constante a 200 rpm. Se procedió a centrifugar el cultivo a
3640 x g por 10 min para obtener el paquete celular el cual se resuspendió en 3
mL de solución salina estéril. Se transfirió este volumen a un tubo de centrífuga y
se adicionaron cuidadosamente 3 mL de Tris-Fenol saturado (Gibco). Se mezcló
utilizando un vortex a velocidad máxima durante 45 seg. Se centrifugó a 1700 x g
a 10oC por 10 min, se separó cuidadosamente la fase acuosa (superior) utilizando
una pipeta Pasteur estéril y se transfirió a un tubo limpio y estéril.
Al remanente de células se le adicionaron 3 mL más de Tris-Fenol saturado,
se mezcló por inversión durante 2 min, se centrifugó a 1700 x g a una temperatura
de 10o C durante 10 min. Se tomó de nuevo con una pipeta Pasteur la fase
acuosa y se incorporó al tubo que previamente ya contenía el sobrenadante de la
primera extracción. Se le adicionaron a este tubo 3 mL de isopropanol absoluto,
se mezcló girando suavemente el tubo entre las manos. Se introdujo al tubo una
pipeta Pasteur estéril doblada en el extremo y se enrollaron cuidadosamente las
hebras de DNA que se transfirieron a un tubo limpio y estéril que contenía 10 mL
de etanol al 70%. Posteriormente el DNA se transfirió a un microtubo estéril que
contenía 750 L de agua bidestilada estéril y se conservó a 4oC.
Cabe señalar que el DNA obtenido por los tres métodos mencionados se
cuantificó en un espectrofotómetro Beckman DU-70. Las muestras se leyeron a
una A260 y la concentración de DNA se calculó utilizando la relación de 1 unidad de
Absorbancia a 260 nm es igual a 50 g /mL de DNA de doble cadena (Miller,
1972).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
44
4.- Amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de
los genes pbp3, pbp3 sin cola de histidinas terminales, pbp3 y prc de P.
aeruginosa PAO1.
La amplificación de estos genes se realizó en un termociclador Perkin
Elmer Gene Amp PCR System 2400. Las condiciones de amplificación se
encuentran señaladas en la Tabla 5
Para las amplificaciones se ensayó en primera instancia la enzima Pwo y
posteriormente el sistema Expand Long Template PCR que tiene una
combinación de las polimerasas Taq y Pwo.
Tabla 5. Condiciones de amplificación de los genes utilizados en este trabajo
Gen
amplificado Proteína Iniciadores utilizados* Condiciones de
amplificación Tamaño del
amplicón
pbp3
PBP3 con una secuencia terminal de histidinas
5´>GGTGGCCATATGAAACTGAATTATTTCCAGGGC<3´ (NdeI) 5´>GGCTCATAGCTCGAGGCCACGCCCTCCTTTTGC<3´ (XhoI)
1 x 94º C 4 min 10 x 94º C 10 seg 10 x 55º C 30 seg 10 x 68º C 1 min 15 x 94º C 10 seg 15 x 57º C 30 seg 1 x 68º C 7 min
4º C
1764 pb
pbp3s sin histidinas terminales
PBP3s
5´>GGTGGCCATATGAAACTGAATTATTTCCAGGGC<3’ (NdeI) 5´>TCAGGCCTCGAGGCATCAGCCACG<3’ (XhoI)
1 x 94º C 4 min 30 x 94º C 45 seg 30 x 55º C 45 seg 30 x 68º C 4 min 30 seg 1 x 68º C 7 min 1 x 4º C ∞
1740 pb
pbp3
PBP3 truncada sin los
primeros 28 aa
5´>ATGGTCCATATGATCGTCTGGCGAATC <3’ (NdeI) 5´>GGCTCATAGCTCGAGGCCACGCCCTCCTTTTGC <3´ (XhoI)
1 x 96º C 25 x 96º C 30 seg 25 x 53º C 45 seg 25 x 68º C 2 min 30 seg 1 x 68º C 10 min 1 x 4º C ∞
1680 pb
Prc
PRC
5´>CATTACTCCGGTACCAGGAGAATCAGCATGAAGC<3´ (HindIII) 5´>ATGACGCTCTAGATGAACTCAGTG <3’ (KpnI)
1 x 94º C 4 min 30 x 94º C 45 seg 30 x 50º C 45 seg 30 x 68º C 4 min 30 seg 1 x 68º C 7 min 1 x 4º C ∞
2055 pb
* Los sitios de reconocimiento para las enzimas NdeI, XhoI, HindIII y KpnI se encuentran subrayados.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
45
5.- Purificación y secuenciación de los productos de la PCR.
Para confirmar la identidad de todos los fragmentos obtenidos en el
punto 4, se secuenciaron en forma automática en el Guelph Molecular
Supercentre Service and Research utilizando un secuenciador ABI PRISM
Modelo 377, versión 3.3.
Así mismo, todos los fragmentos se purificaron utilizando el “kit” QIAquick
PCR Purification de QIAGEN que combina la tecnología involucrada en una
columna de sílica gel que es capaz de unir selectivamente hasta 10 g de DNA
con reguladores especiales para optimizar una recuperación eficiente de DNA
eliminando contaminantes. El DNA se adsorbe a la membrana de sílica-gel en
presencia de un regulador de alto contenido salino mientras los contaminantes
pasan a través de la columna, el DNA es entonces recuperado eluyendo con un
regulador de bajo contenido salino que puede ser Tris o agua.
6.- Clonación de los productos de la PCR
Para la ligación de los productos de la PCR obtenidos en el punto 5 se
utilizaron los siguientes plásmidos:
A).- pGEM®T ó pGEM®T Easy
Estos plásmidos se utilizaron en todos los casos como vectores intermedios
y para su uso se siguieron las instrucciones del fabricante. Las ventajas que
brinda este sistema son que los plásmidos tienen en ambos extremos timidinas 3´
terminales que impiden que estos vectores se religuen por lo que no es necesario
el uso de fosfatasa alcalina. En nuestro caso, esto fue importante porque el
sistema Expand Long Template que utilizamos para la amplificación del gen pbp3
tiene a la enzima Taq polimerasa que adiciona adenosinas en los extremos 5´ lo
que favorece la ligación con estos plásmidos. Ambos plásmidos se propagaron
inicialmente en células de E. coli DH5 competentes utilizando ampicilina como
antibiótico de selección. Las clonas positivas se sub-cultivaron en medio LB
adicionado del mismo antibiótico, se incubaron a 37oC por 12 h en agitación a
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200 rpm. Se procedió a la cosecha de las células por centrifugación a 16700 x g
durante 10 min y los plásmidos se purificaron mediante el “kit” QIAprep miniprep
System de QIAGEN.
B).- pET30a(+)
A este vector se ligaron los genes pbp3, pbp3 y pbp3 sin histidinas. Antes
de proceder a la ligación, tanto el vector como los fragmentos se sometieron a la
actividad de las enzimas de restricción. Se utilizó NdeI de New England Biolabs
Ltd que requirió del regulador NEBuffer 4 que tiene acetato de potasio 50 mM,
Tris acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, ditiotreitol 1 mM a un pH de 7.9.
La reacción se incubó a 37º C durante 2 h. La segunda enzima que se usó fue
XhoI, también de New England Biolabs LTd, que requirió del regulador NEBuffer
que contiene NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM y ditiotreitol a un pH de 7.9 además de
la incorporación de seroalbúmina bovina a una concentración de 100 g/mL. La
mezcla se incubó a 37º C por 2 h. Las digestiones se hicieron por separado
utilizando 2 L del DNA a digerir, 1 L de la enzima (2U/L), 2 L del regulador
adecuado y el resto de ddH2O para hacer un total de 20 L de mezcla. Cuando se
usó XhoI se adicionaron 0.2 L de seroalbúmina bovina que se incorporaron a la
mezcla. Al término de cada digestión las enzimas se inactivaron calentando a 65o
C por 20 min.
La ligación se llevó a cabo, dejando la mezcla de reacción durante toda la
noche a 4oC y utilizando la DNA ligasa de T4 a una concentración final de 2U/L.
Se probaron diversas concentraciones de vector y de inserto hasta lograr
aquella con la que se obtuvieron un mayor número de transformantes. El producto
de la ligación se utilizó para la transformación de E. coli DH5.
C).-pFLAG-CTC
El gen prc obtenido por la PCR se ligó a este plásmido previa digestión del
vector y del inserto con HindIII, de New England Biolabs Ltd, que requiere del
NEBuffer 2 que contiene NaCl a una concentración de 50 nM, Tris-HCl 10 mM y
ditiotreitol a una concentración de 1 mM; la reacción se incubó a 37º C durante
2 h. También se utilizó la enzima KpnI (New England Biolabs Ltd) que necesita
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del regulador NEBuffer 1 que contiene Tris HCl-propano 10 mM; MgCl2, 10 mM
y ditiotreitol 1 mM a un pH de 7. La reacción de digestión con esta enzima
requiere de la incorporación de seroalbúmina bovina a una concentración de 100
g/mL. La mezcla se incubó a 37º C por 2 h. Las digestiones se hicieron por
separado utilizando 2 L del DNA a digerir, 1 L de la enzima (2U/L), 2 L del
regulador adecuado y el resto de ddH2O para hacer un total de 20 L de mezcla.
Al término de la digestión con HindIII se detuvo su actividad calentando a 65o C
por 20 min. En el caso de KpnI no se inactiva por calor. La ligación se llevó a
cabo, dejando la mezcla de reacción durante toda la noche a 4oC y utilizando la
DNA ligasa de T4 a una concentración final de 2U/L.
El producto de la ligación se utilizó para la transformación de células de E.
coli DH5. Al igual que en los casos anteriores se probaron varias
concentraciones de inserto y vector hasta obtener un adecuado número de
transformantes.
7.- Obtención de células competentes.
Para la obtención de células competentes de E. coli DH5α se siguieron dos
procedimientos:
1.-El método tradicional que utiliza CaCl2 (Hanahan, 1983).
2.- El segundo método que se llevó a cabo fue el propuesto por Daniels, (1999).
Este método consistió en cultivar células de E.coli DH5 durante 12-14 h en 10 mL
de medio LB, se tomó una alícuota de este cultivo y se inocularon 25 mL del
mismo medio. Se incubó a 37oC por 1.5-2 h hasta alcanzar una A600 entre 0.6-0.7.
El cultivo se enfrió en hielo, se centrifugó a 3020 x g y se resuspendió en 10 mL
de la solución “” que contenía acetato de potasio 30 mM, cloruro de potasio 100
mM, cloruro de calcio 10 mM, cloruro de magnesio 50 mM y glicerol al 15%; ya
que el pH de la solución debe ser de 5.8, se ajustó con ácido acético 0.2 M. Se
centrifugó de nuevo a 3020 x g por 20 min a 4oC y las células se resuspendieron
suavemente en 1 mL de la solución “” que tenía MOPS (ácido 3-
Morfolinpropansulfónico) de Sigma 10 mM, cloruro de calcio 75 mM, cloruro de
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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potasio 10 mM y glicerol al 15%. El pH de esta solución se ajustó a 6.5 con KOH 1
M. Las células se mantuvieron en hielo durante 2 h y se depositaron alícuotas de
150-200 L en microtubos previamente esterilizados y se congelaron en una
mezcla de hielo seco etanol procediendo a almacenarlas a –70oC.
8.-Transformación de células competentes y búsqueda de transformantes.
Para la transformación utilizando choque térmico, se probaron dos
procedimientos, el primero de ellos consistió en descongelar aproximadamente
200 L de células competentes en hielo por 15 min. Se les adicionaron de 5-15 L
del producto de la ligación y se mantuvo la mezcla en hielo por 10 min. Se dio un
choque térmico a 42º C por 60-90 seg y se dejaron a temperatura ambiente por 10
min. Posteriormente se les adicionaron 600 L de caldo Luria Bertani tibio sin
antibióticos y la mezcla se incubó a 37oC durante 1 h.
En el segundo método, las células se descongelaron en hielo, se adicionó el
producto de la ligación (5-15 L) y se mantuvieron en hielo por 30 min más.
Posteriormente se incubaron a 37º C por 3 min y se colocaron de nuevo en hielo
por 5 min más. Se adicionaron 500 L de caldo LB y se incubaron en agitación a
37º C por 45 min.
Para cualquiera de los dos métodos anteriores se tomaron alícuotas de 50,
100 y 250 L de las células transformadas y se depositaron en cajas de Petri
conteniendo LB adicionado del antibiótico adecuado dependiendo del tipo de
plásmido y se dispersaron en la superficie del medio de cultivo utilizando una
varilla de metal acodada.
Cuando se utilizaron los vectores pGEMT y pGEM®T Easy la
transformación se hizo siguiendo las instrucciones del manual de Promega. La
mezcla de ligación se incorporó a las células E. coli DH5 competentes y se
sembraron en agar LB adicionado de IPTG a una concentración de 0.05 mM, y
X-Gal a una concentración final de 80 g/mL y ampicilina a una concentración de
100 g/mL. Las cajas de Petri se incubaron a 37oC por 18-24 h. La presencia de
X-Gal en el medio de cultivo hizo posible la fácil selección de las clonas
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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transformantes. Cuando el producto de PCR se inserta correctamente, se
interrumpe el gen lacZ que codifica para la -galactosidasa, de tal manera que se
obtienen colonias blancas. En el caso contrario, es decir cuando no hay inserto en
el plásmido o esta incorporación se lleva a cabo en otro sitio del vector, la
-galactosidasa se sintetiza normalmente e hidroliza a la X-Gal generándose una
colonia de color azul debido a la subunidad cromógena de la molécula.
La búsqueda de recombinantes utilizando pGEMT y pGEM®T Easy fue
sencilla debido a que las colonias son de color blanco. Estas se cultivaron en
caldo LB más ampicilina y se realizó la extracción de los plásmidos por alguno de
los métodos ya descritos.
En el caso de las células transformadas con pET30a(+), se sembraron en
agar LB adicionado de kanamicina a una concentración de 30 g/mL y se
incubaron a 37oC por 18-24 h. Las colonias que se desarrollaron, se transfirieron a
medios nuevos adicionados del mismo antibiótico utilizando palillos de madera
estériles.
Para la búsqueda rápida de transformantes con pbp3-pET30a(+) y prc-
pFLAG-CTC se realizó la técnica de E-Lyse (Daniels, 1999) que consistió en lo
siguiente: Las colonias se transfirieron utilizando palillos de madera estériles a
placas de microtitulación estériles en las que previamente se habían depositado
10 L de TE en cada pozo. Se mezclaron suavemente hasta obtener una
suspensión ligeramente turbia. Se agregaron a cada pozo 10 L de la solución de
lisis que tiene sacarosa (de Sigma) al 25% en TBE (Tris 89 mM, Ácido Bórico 2
mM, EDTA 1 mM) adicionada de 2µL de RNasa a una concentración de 10
mg/mL. Esta solución se calentó a 90oC por 10 min antes de adicionarle lisozima
(Sigma) a una concentración de 1 mg/mL.
De cada suspensión de células lisadas se transfirieron 10 L a pozos en un
gel de agarosa 1% en TBE adicionado por cada 100 mL de agarosa de 1 mL de
SDS (ICN) al 20%. Las suspensiones se mantuvieron en los pozos por 30 min a
temperatura ambiente y se sometieron a electroforesis a 20 volts por 20-30 min.
Posteriormente se aumentó a 80 volts por 20 min más. El gel se tiñó con bromuro
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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de etidio y se confirmó la presencia de células transformantes comparando sus
plásmidos (plásmido mas inserto) con los de las colonias testigo de E.coli DH5
que solo tenían el plásmido pET30a(+) ó pFLAG-CTC.
Las colonias que fueron positivas, es decir que mostraron la presencia de
un plásmido con el peso esperado de aproximadamente 7 Kb [(inserto-plásmido
pET30a(+)], se cultivaron en caldo LB adicionado de kanamicina a 37oC por 12-14
h en agitación a 200 rpm.
Para la obtención de células transformadas con el plásmido prc-pFLAG se
utilizaron células competentes de E. coli DH5α. La búsqueda de transformantes
se realizó sembrando alícuotas en agar LB adicionado de ampicilina (100 µg/mL).
Se incubaron a 37oC por 18-24 h. Las colonias que se desarrollaron, se
transfirieron a medios LB nuevos (5 mL) adicionados del mismo antibiótico
utilizando palillos de madera estériles y se incubaron a 37oC por 18-24 h en
agitación moderada (200 rpm).
Como ya se mencionó, se utilizó la técnica se E-Lyse para la búsqueda
rápida de posibles transformantes. Se utilizaron células de E. coli DH5α con el
plásmido pFLAG-CTC (5336 pb) como testigo. Aquellas clonas que mostraron
plásmidos con un peso mayor que el plásmido testigo se sub-cultivaron de nuevo
en caldo LB adicionado de ampicilina (100 µg/mL) a 37oC por 18-24 h en agitación
constante (200 rpm).
9.-Purificación del DNA plasmídico.
Se utilizaron tres métodos.
A).- Método de Garger y col., 1983. El DNA plasmídico se aisló de esta
forma: Se tomaron 1.5 mL del cultivo crecido durante toda la noche en medio LB y
se transfirieron a un microtubo, se centrifugaron a 19200 x g durante 1 min, se
resuspendieron en 100 µL de la solución I que contenía glucosa 50 mM, Tris-HCl
25 mM, pH 8.0 y EDTA 10 mM. Se adicionaron 200 µL de la solución II que tenía
NaOH 0.2 M y SDS al 1% (peso/vol). Se incubó en hielo por 5 min. Se adicionaron
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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150 µL de la solución III que se preparó con 60 mL de acetato de potasio 5M,
pH 4.8, 11.5 mL de ácido acético glacial y 28.5 mL de agua destilada. Se incubó
de nuevo durante 5 min en hielo y se centrifugó a 19200 x g, durante 8 min.
El sobrenadante se transfirió a un microtubo limpio y se adicionaron 250 µl
de la solución IV que contenía acetato de amonio 7.5 M pH 7.8. Se mantuvo en
hielo durante 15 min más. Se centrifugó a 19200 x g, por 15 min. Se transfirió el
sobrenadante a otro microtubo limpio y el DNA plasmídico se precipitó
adicionando 0.8 mL de propanol y se incubó en hielo por 15 min. El DNA se
obtuvo por centrifugación a 19200 x g, durante 15 min, se lavó con etanol al 70%,
se centrifugó durante 3 min a 19200 x g, y el DNA se resuspendió en 50 µL de
agua Milli Q.
B).- Método de lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979), que consistió en lo
siguiente: Se centrifugaron 1.5 mL de un cultivo (con el plásmido) de 18-24 h en
un tubo de microcentrífuga a 85 x g. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió
el botón de células en 200 L de regulador GET que contiene glucosa 50 mM,
EDTA 10 mM pH 8.0 y Tris 25 mM pH 8.0 (se utilizaron 200 µL/tubo). Se
adicionaron 300 L de una solución recientemente preparada de NaOH 0.2N/SDS
1% y se mezcló invirtiendo el tubo varias veces. La solución se neutralizó
agregando 300 L de acetato de potasio 3.0 M pH 4.8, se mezcló invirtiendo el
tubo suavemente, se incubó en hielo por 5 min. Se eliminaron los restos celulares
centrifugando a 85 x g/10 min a temperatura ambiente y se transfirió el
sobrenadante a un tubo limpio. Se hizo una extracción del sobrenadante con 400
L de una mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) agitando en un
vortex. Se centrifugó de nuevo a 85 x g/ 1-2 min para separar las fases, se
transfirió la fase acuosa a un tubo limpio y estéril. Se precipitó el DNA adicionando
un volumen igual de isopropanol absoluto y se centrifugó de nuevo la mezcla a
85 x g/ 1-2 min a temperatura ambiente. Se lavó el botón con 500 L de etanol al
70% y se dejó secar al aire. El botón se disolvió en 20 L de agua destilada estéril
con RNasa (20 g/mL) y se incubó a 37oC por 20 min.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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C).- Utilización de los “kits” comerciales Concert Nucleic Acid Purification
System, de Gibco y QIA Prep Spin Miniprep, de QIAGEN.
Estos métodos se basan en la utilización de una columna de sílica gel que
es capaz de unir selectivamente al DNA con reguladores especiales con el fin de
obtener una recuperación óptima de DNA eliminando contaminantes. El DNA se
adsorbe a la membrana de sílica-gel en presencia de un regulador de alto
contenido salino mientras los contaminantes pasan a través de la columna, el DNA
es entonces recuperado eluyendo con un regulador de bajo contenido salino que
puede ser Tris o agua.
10.- Electroforesis de los productos de la PCR, los plásmidos y las
construcciones.
Los productos de la PCR, los plásmidos y las construcciones se sometieron
a electroforesis en un aparato diseñado específicamente para volúmenes
pequeños (22.5 mL) de agarosa (Omnipur) la cual se utilizó a una concentración
de 1% (peso/volumen) en regulador TAE (Tris Acetato EDTA).
Las muestras, de generalmente 3-5 µL se mezclaron con 3 µL del colorante
constituido por azul de bromofenol de Sigma al 0.25%, xilen-cianol FF de BDH al
0.25% y glicerol de Sigma al 30% o sacarosa al 40% en agua destilada y 2 µL de
TAE. La electroforesis se realizó a temperatura ambiente por 25-30 min a 100
volts. El gel se colocó posteriormente en una solución de bromuro de etidio (0.4-
1.0 µg/mL) y se dejó teñir por no mas de 3-5 min. Las bandas de DNA se
visualizaron en un transiluminador de luz UV Gel Doc System 1000 de BioRad.
Como marcadores de peso molecular se utilizaron Kilobase™ de Pharmacia ó
1 kb DNA Ladder de New England BioLabs.
11.-Secuenciación del DNA
Todas las construcciones se secuenciaron en el Guelph Molecular
Supercentre Service and Research. El objetivo fue confirmar que todos los
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
53
insertos habían sido clonados apropiadamente. Las secuencias de los iniciadores
empleados se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Iniciadores empleados para la secuenciación de las construcciones
y plásmidos utilizados en este trabajo.
Construcciones ó plásmidos Iniciadores
pbp3, pbp3 sin histidinas y pbp3 con pGEM®T o pGEM®T Easy
pUC/M13 forward 5´>GTTTTCCCAGTCACGAC<3´
pUC/M13 reverse 5´>CAGGAAACAGCTATGAC<3´
pbp3, pbp3 sin histidinas y pbp3 con pET30 a(+)
T7 promoter 5´>TAATACGACTCACTATAGGG<3´
T7 terminator 5´>TATGCTAGTTATTGCTCAG<3´
prc con pFLAG-CTC
N-26 5’>CATCATAACGGTTCTGGCAAATATTC<3’
C-24 5’>CTGTATCAGGCTGAAAATCTTCTC<3’
12.- Inducción de la expresión de las proteínas PBP3, PBP3 sin histidinas
terminales (PBP3s) y PBP3.
Las células de E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) pLysS y E coli BL21
Codon Plus (DE3)-RIL, las cuales se transformaron con las construcciones pbp3-
pET30a(+), pbp3-pET30a(+) sin histidinas C terminales y pbp3-pET30a(+), se
sembraron en 50 mL de medio LB, SB o TB adicionados de kanamicina (30
µg/mL) y cloranfenicol (34 µg/mL) y se incubaron a 37oC por 16 h en agitación
constante a 200 rpm. Estos cultivos se utilizaron para inocular 1 L de los mismos
medios con los antibióticos mencionados y se incubaron a 37oC siempre con
agitación constante de 200 rpm, hasta alcanzar una A entre 0.6-0.7 a 600 nm. De
estos cultivos se tomaron alícuotas de células denominadas “no inducidas”. Se
procedió entonces a la inducción de la expresión de la proteína adicionando IPTG
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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a concentraciones de 0.1, 0.5 y 1.0 mM. Los cultivos continuaron su incubación a
temperatura ambiente ó a 37oC durante 3 h. Las células se cosecharon por
centrifugación a 8000 x g durante 10 min. Para dar seguimiento al proceso de
inducción, se tomaron alícuotas de 1 mL cada 30 ó 60 min.
Las muestras de células completas no inducidas e inducidas se
centrifugaron a 14400 x g durante 5 min se eliminó el sobrenadante, se
adicionaron 120 L de agua bidestilada estéril y 40 L de regulador de corrimiento
(5X SDS-PAGE “Sample Buffer” que contiene Tris-HCL 0.5 M pH 6.8, glicerol al
50%, SDS al 10%, azul de bromofenol al 1%, 0.5 mL de 2-mercaptoetanol y
cuanto baste de agua destilada para 10 mL) se desnaturalizaron por calentamiento
a ebullición por 5-10 min y posteriormente se sometieron a análisis en un gel de
poliacrilamida-SDS al 12%. El volumen de la muestra varió dependiendo del
tiempo de inducción, generalmente se utilizaron 15 L de células no inducidas, 10
l de las células con 1 h de inducción, 7.5 L para las de 2 h, y 5 L para aquellas
que tuvieron 3 h de inducción.
13.- Localización y purificación de las proteínas PBP3 y PBP3.
Para lograr la adecuada purificación de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 y para
conservar su actividad enzimática se utilizó cromatografía de afinidad con un metal
inmovilizado (IMAC) que tiene una columna de agarosa-Ni-Ácido Nitrilotriacético
(Ni-NTA) de QIAGEN; para determinar la localización de las proteínas se hizo un
fraccionamiento celular modificado del inicialmente propuesto por Osborn y
colaboradores (1972), que consistió en obtener diversos componentes celulares
mediante el uso de detergentes, reguladores y sonicación. Se probaron Tritón X-
100 (Sigma), N-Lauroylsarcosine (Sigma) y CHAPS (Unison Bio Tek) al 1%.
Método IMAC de QIAGEN.
Las células transformadas e inducidas con las construcciones adecuadas
se cultivaron en los medios LB, SB y TB adicionados de kanamicina (30 µg/mL) y
cloranfenicol (34 µg/mL) a 37o C durante 16 h con agitación a 200 rpm. Las
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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bacterias, se sub-cultivaron (1:25) en matraces de 250 mL con el mismo medio
adicionado de los antibióticos ya mencionados y se incubaron a 37oC en agitación
permanente a 200 rpm hasta alcanzar una DO600 entre 0.6-0.7. Se adicionó IPTG
a las concentraciones ya descritas y se ajustaron las condiciones ambientales
dependiendo del experimento. Se dejaron crecer por exactamente 3 h (después de
haber adicionado el inductor), se centrifugaron a 10400 x g durante 10 min a 4oC.
Las células se lavaron con Tris 20 mM, pH 7.5 frío, se lisaron por sonicación
y se separaron por ultracentrifugación (35000 x g /90 min/4oC). Las fracciones se
conservaron en refrigeración a 4oC ó en congelación a –20oC
La resina Ni-NTA requiere de una preparación previa antes de ser utilizada,
por lo que se tomó 1mL de la resina Ni-NTA, que es una resina pre-cargada con
Níquel, y se lavó por tres ocasiones con el regulador de equilibrio (N-
Lauroylsarcosine al 1% Tris-HCl 20 mM, Glicerol 10% (v/v) NaCl 0.5 M y NaH2PO4
100mM pH 8.0), se depositó suavemente en una columna y se equilibró de nuevo
adicionando 15 mL de regulador de equilibrio. Se dejó salir el regulador de
equilibrio evitando que la resina se secara y se mezcló con la fracción problema
por 90 min a 4oC con agitación suave y constante para favorecer la unión de la
proteína a la resina. Se dejó salir esta fracción, se recolectó y se adicionó el
regulador de lavado A (2 x 15 mL) que tiene N-Lauroylsarcosine 1% (v/v), Tris-HCl
20 mM, glicerol al 10% (v/v), NaCl 0.5 M, NaH2PO4 200mM pH 8.0 e imidazol a
una concentración de 20 mM; también una vez eluída esta fracción se colectó. Se
agregó ahora el regulador de lavado B que tiene los mismos ingredientes que el
regulador A pero el imidazol en este caso se encontraba a una concentración de
30 mM. Esta fracción también se conservó hasta su uso. Se hicieron 3 eluciones
para remover la proteína con su marca de poli-histidinas de la resina Ni-NTA
utilizando 12 mL del regulador de elución que tenía los mismos ingredientes que
los reguladores ya mencionados, pero el imidazol se encontraba a una
concentración de 400 mM. Se tomaron fracciones de aproximadamente 3 mL cada
una.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Las muestras se colocaron en una membrana “Spectra/Por Membrane
MWCO 3500” de Spectrum Medical Industries Inc y se dializaron durante toda la
noche en 4 litros de regulador de diálisis que contenía Tris-HCl 20 mM, glicerol al
10% (v/v) y NaCl 100 mM pH 8.0; posteriormente fueron concentradas en
Carbowax PEG 8000 (Fisher) y conservadas a 4oC hasta su uso.
Para la obtención de la proteína ΔPBP3 se siguió un protocolo ligeramente
distinto, los reguladores que se utilizaron fueron los siguientes. El regulador A ó de
lisis contenía NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 10 mM con un pH
ajustado a 8.0 con NaOH. El regulador de lavado que utilizamos tenía NaH2PO4,
NaCl 300 mM e imidazol 20 mM también con un pH ajustado a 8. El regulador de
elución empleado contenía NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol a una
concentración de 250 mM con un pH final de 8.0
Método de Osborn y col., (1972).
Este método es una modificación del originalmente descrito. Las células se
crecieron con agitación a 200 rpm en “Terrific Broth” a 37oC hasta alcanzar una
A600 entre 0.6-0.7, se indujeron con IPTG (0.1, 0.5 y 1.0 mM) y se incubaron a
temperatura ambiente ó a 37o C. Se cosechó el paquete celular por centrifugación
a 10400 x g/10min/4oC y se resuspendió en Tris 20 mM frío. La mezcla se
mantuvo en hielo, se adicionó una tableta de inhibidores de proteasas llamado
“Complete Mini EDTA-free” de Boehringer Mannheim y 600 µL de lisozima una
concentración de 1 mg/mL en agua bidestilada estéril y se incubó la mezcla en
hielo por 20 min más. Se procedió a la sonicación de las células a una potencia de
4.5 volts por 2 min totales con 5 seg de pulso y 10 de descanso utilizando la
macro punta en un Ultrasonic Liquid Processor Modelo HS-XL2020.
Las células se centrifugaron de nuevo a 10400 x g /10 min/4º C y se
obtuvieron dos fracciones, el sobrenadante y el precipitado de células completas
que contenía cuerpos de inclusión. Se tomó el sobrenadante y se ultracentrifugó a
35000 x g /90 min/4º C utilizando una ultracentrífuga Beckman L-8M. Se
obtuvieron dos fracciones; el sobrenadante, que corresponde al
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
57
citoplasma/periplasma, y el precipitado que corresponde a las envolturas
completas.
Estas membranas se resuspendieron en agua bidestilada estéril fría. Se
tomó una alícuota y se le adicionó un volumen igual de detergente, se probaron
Tritón X-100, N-Lauroylsarcosine y CHAPS al 1% y al 2%. Las membranas se
mezclaron con el detergente durante 6 h con agitación intermitente en un vortex a
temperatura ambiente y se ultracentrifugaron de nuevo a 35000 x g /90 min/10º C
En el sobrenadante se aisló la membrana citoplásmica y en el precipitado
se ubicó la membrana externa, la cual se resuspendió en agua bidestilada estéril y
fría. Todas las fracciones se conservaron en congelación a –20º C hasta su uso.
Con esta metodología se obtuvieron las siguientes fracciones: citoplasma/
periplasma, membrana citoplásmica, membrana externa y cuerpos de inclusión.
La concentración de proteínas se determinó utilizando el ensayo comercial
del ácido bicinconínico de Pierce®, con seroalbúmina bovina como estándar.
14.- Análisis de las proteínas PBP3·, PBP3 sin histidinas , ΔPBP3 y Prc por
electroforesis en geles de poliacrilamida.
El análisis de las proteínas se realizó por electroforesis de acuerdo al
método descrito por Laemmli, (1970).
Todas las muestras fueron desnaturalizadas por calor durante 5-10 min
antes de ser depositadas en geles de acrilamida-bisacrilamida-SDS al 12%. El
regulador en donde se colocaron las muestras contenía azul de bromofenol al
0.25%, SDS al 2% (p/v), glicerol al 10% (v/v), mercaptoetanol al 5% (v/v) y Tris-
HCl 0.06 M pH 6.8 (Garfin, 1990). El volumen máximo que se colocó por carril fue
de 30 µL y se utilizaron estándares de bajo peso molecular (14.4-108 Kd) y de
amplio peso molecular (6.9 – 205 Kd) de BioRad que siempre se incluyeron en la
electroforesis. El regulador utilizado para la cámara de electroforesis consistió en
glicina 192 mM (Fisher), Tris 25 mM (Boehringer Mannheim) y SDS al 1%
(Boheringer-Mannheim) en un volumen final de un litro. Los geles se sometieron a
un voltaje entre 100-120 volts por aproximadamente 45-60 min hasta que el frente
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
58
del colorante migró cerca del extremo inferior del aparato de electroforesis Mini-
Protein II de Bio Rad.
Para la preparación de estos geles se utilizaron los reactivos en las
cantidades señaladas en la Tabla 7.
Tabla 7. Preparación de los geles de acrilamida-bisacrilamida
Reactivo Gel separador 12%
Gel espaciador
Acrilamida-Bisacrilamida 4.0 mL 1.3 mL
Agua destilada 3.35 mL 6.1 mL
Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 2.5 mL -
Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 - 2.5 mL
SDS 10% (peso/volumen) 100 L 100 L
APS 10% (peso/volumen 50 L 50 L
TEMED 5 L 10 L
SDS, dodecil sulfato de sodio, de Boehringer Mannheim
APS, persulfato de amonio, de Sigma.
TEMED, N´N´N´N´-tetrametilendiamina, de Sigma.
Para la observación de las proteínas PBP3·, PBP3· sin histidinas y PBP3·
separadas por electroforesis se utilizaron alguno de los 4 métodos siguientes:
A.-Tinción con azul brillante de Coomassie
Se procedió a la tinción de los minigeles que fueron transferidos a una
solución de azul brillante de Coomassie R-250 (BioRad) 0.1% (p/v), metanol
(Baker) al 40% (v/v) y ácido acético glacial (Fisher) al 10% (v/v). Se agitaron
suavemente a temperatura ambiente por aproximadamente 1 h y luego se
transfirieron a 100 mL de una solución de metanol 10% (v/v) y ácido acético glacial
al 10% (v/v) para eliminar el exceso de colorante. Se hicieron cambios sucesivos
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
59
en esta solución hasta que el fondo del gel ya no tenía color y las bandas de
proteína se observaron claramente.
B.-Utilización del “Gel Code® 6xHis Protein Tag Staining Kit” de PIERCE™
Este es un sistema que consta de dos reactivos diseñados para teñir
específicamente proteínas con una cola de histidinas después de haber sido
separadas por electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS. Las bandas se
detectan exponiendo el gel a luz UV. Las proteínas fluorescerán como bandas de
color amarillo. Este es el caso de la proteína PBP3 que tiene una cola de 6
histidinas con el fin de facilitar su aislamiento, identificación y purificación.
Estos reactivos se utilizaron de la siguiente manera.
1.- Después de la electroforesis de la proteína en un gel de poliacrilamida-
SDS, se procedió a lavar el gel agitándolo suavemente en 100 mL de agua
desionizada por 20 min. Se repitió de nuevo este paso y se eliminó el agua de
lavado.
2.-Se agregaron al gel 50 mL de “6xHis Protein Tag STAIN” y se agitó
suavemente durante 5 min.
3.-Se lavó el gel en agua destilada durante 15 min, agitándolo suavemente.
Se repitió este paso. Se eliminó el agua de lavado.
4.- Se adicionaron 50 mL de “6xHis Protein Tag DEVELOPER” y se agitó
suavemente por 15 min.
5.-Se lavó gel con 100 mL de agua destilada estéril y se agitó suavemente
por 15 min. Se repitió este paso.
6.- Se irradió el gel con luz ultravioleta (λ 300 nm) en un transiluminador
(Gel-Doc System de BioRad); la proteína marcada con la cola de histidinas se
observó como una banda fluorescente de color amarillo. Estos geles pueden
posteriormente teñirse en la forma tradicional utilizando el colorante azul de
Coomassie.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
60
C.-Detección de la proteína marcada con una cola de histidinas utilizando
“Western blot”.
Esta es una detección colorimétrica que utiliza anticuerpos de ratón anti-
histidina. Las muestras fueron primero sometidas a una electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS y luego transferidas a nitrocelulosa utilizando una corriente de
transferencia de 40-50 volts por 1 h en un Trans-Blot Cell de BioRad. El regulador
de transferencia consistió de Tris-HCl 25 mM pH 8.3, Glicina 192 mM y etanol al
5% (v/v). Después de la transferencia, la hoja de nitrocelulosa se lavó con TBS
(Tris–HCl 10 mM pH 7.5, NaCl 10 mM) por dos ocasiones durante 10 min.
Posteriormente se sumergió en colorante Rojo de Ponceau (0.2% en ácido
acético 5% v/v). Se incubó de nuevo durante 1 h en regulador de bloqueo
(seroalbúmina bovina de Sigma al 3% en PBS) para evitar las uniones no
específicas y se consideró conveniente dejar la hoja de nitrocelulosa en esta
solución durante toda la noche a temperatura ambiente con agitación suave.
Posteriormente se lavó 2 x 10 min en regulador de TBS/Tween/Tritón (Tris-HCl 20
mM pH 7.5, Tween 20 al 0.05% v/v y Tritón X-100 al 0.2%) a temperatura
ambiente. Se lavó en TBS a temperatura ambiente durante 10 min y se incubó con
el anticuerpo de ratón anti-His de QIAGEN diluido 1:1000 en regulador de bloqueo
a temperatura ambiente por 1 h con agitación suave. Se lavó con regulador
TBS/Tween/Tritón a temperatura ambiente por dos ocasiones durante 10 min. Se
lavó una vez más con TBS a temperatura ambiente durante 10 min.
El anticuerpo de ratón anti-His se detectó al adicionar anticuerpo de cabra
anti-ratón acoplado a la fosfatasa alcalina de QIAGEN diluido 1:2000 en leche
descremada al 8% en TBS y se incubó por 90 min a temperatura ambiente. La
membrana de nitrocelulosa se lavó 4 veces por 10 min en regulador
TBS/Tween/Tritón a temperatura ambiente. Se incubó por 2 min en 10 mL de
regulador de detección que contiene Tris-HCl 100 mM pH 9.5, NaCl 100 mM y
MgCl2 5mM y para visualizar los complejos antígeno-anticuerpo se utilizó el
regulador de revelado que consiste en 10 mL de regulador de detección
conteniendo 45 µL de NTB (Nitro-azul de tetrazolium de Sigma en 100% de
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
61
dimetilformamida) y 35 µL de BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) también de
Sigma y disuelto en formamida al 100%.
La membrana se dejó revelar en la oscuridad y se detuvo la reacción
lavando con agua destilada estéril. Para su secado se dejó durante toda la noche
entre dos hojas de papel Whatman y se conservó en papel aluminio para evitar su
decoloración.
D.-Tinción de Plata, protocolo modificado del propuesto por Morrissey, 1981.
Este método de tinción se basa en la unión de los iones de plata a los
grupos carboxilo y sulfhidrilo de las proteínas previamente separadas. Después
de la electroforesis, las proteínas se fijan y se exponen al nitrato de plata. La
intensidad en el grado de desarrollo de las bandas de proteína se controlan en
función del tiempo que permanece el gel en el reactivo que funciona como
revelador.
La tinción se hizo de la siguiente manera: Se colocó el gel en 100 mL de la
solución fijadora que contiene glutaraldehído al 10% (Sigma) y se dejó actuar
durante 30 min, se eliminó esta solución y se lavó el gel con agua destilada
haciendo varios cambios durante 2 h. También es posible depositar el gel en 2
litros de agua durante toda la noche y el día siguiente lavarlo nuevamente con
agua destilada. Es importante notar que si el glutaraldehído no se elimina
completamente el resultado será una intensa tinción del fondo del gel, lo que
impedirá observar claramente las bandas de proteína. El gel se colocó en la
solución de DTT (ditiotreitol a una concentración de 5 µg/mL) y se incubó durante
30 min agitando suavemente en una plataforma móvil. Se eliminó esta solución del
gel (pero no se enjuagó) y se le adicionaron 100 mL de la solución de nitrato de
plata al 0.1% p/v (Sigma) en donde se mantuvo por 30 min en agitación suave en
una plataforma móvil. Se lavó con agua desionizada y se eliminó esta agua de
enjuague. Se adicionaron 50 mL de la solución reveladora que se preparó
momentos antes de utilizarse y consistió de carbonato de sodio al 3% y
formaldehído al 0.019%, se agitó brevemente y se eliminó la solución reveladora.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
62
Se repitió dos veces más. Se agregaron 100 mL de solución reveladora y se
movió lentamente. La tinción se da lentamente al principio y posteriormente
progresa muy rápidamente (el proceso de revelado total toma aproximadamente
de 5 a 10 min). Si la banda deseada se observa muy clara, se remueve la
solución reveladora, se enjuaga rápidamente con agua y se adiciona solución
decolorante II (ácido acético al 7% y metanol al 5%) que funciona en este caso
como solución que detiene el proceso. De manera alternativa, se pueden
incorporar 5 mL de ácido cítrico a la solución reveladora para detener el revelado.
De todas maneras el revelado no se detiene inmediatamente sino que continúa
por aproximadamente durante 5 min después de adicionar la última solución que
detiene el proceso y que consiste de citrato de sodio 2.3 M. El gel se enjuaga
varias veces en solución decolorante II y finalmente en agua en donde se puede
conservar. Para preservar el gel a mediano plazo, se puede adicionar glicerol al
1.5% al agua de conservación.
Para la observación de la proteína Prc, producto del gen prc, que se ligó al
vector pFLAG-CTC, se utilizó la tinción con azul brillante de Coomassie y la
técnica de Western Blot utilizando el anticuerpo monoclonal “Anti-Flag® M2” de
Sigma.
15.-Obtención de anticuerpos contra la proteína PBP3
Para la obtención de anticuerpos contra la proteína PBP3 se solicitó al
Centro de Servicio de Cuidado de Animales de la Universidad de Guelph un
conejo Nueva Zelanda, blanco, hembra de 3.0 a 3.5 Kg de peso. Una vez que el
protocolo de inmunización fue aprobado por el comité de ética se inició el proceso
aplicando 150 g de proteína PBP3 purificada en 500 L mas 500 L de
adyuvante incompleto de Freund para dar un total de 1 mL. El esquema de
inmunización se muestra en la Tabla 8.
Al terminar el esquema de inmunización se inició la purificación de los
anticuerpos anti PBP3 utilizando el método de Salamitou y colaboradores (1994),
que consiste en la purificación de los anticuerpos por inmunoafinidad.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
63
Aproximadamente 300 g de la proteína PBP3 se sometieron a electroforesis en
un gel de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa. La banda de proteína se puso de manifiesto utilizando Rojo de
Ponceau.
Tabla 8. Esquema de inmunización para la obtención de anticuerpos anti PBP3
Día Dosis y vía Actividad
1 1 mL/ subcutánea Pre sangrado de prueba
4 1 mL/ subcutánea
7 1 mL/ subcutánea
17 1 mL/ intramuscular
22 Sangrado de prueba No. 1
24 1 mL/ intramuscular
29 Sangrado de prueba No. 2
38 1 mL/ intramuscular
42 Sangrado de prueba No. 3
52 1 mL/ intramuscular
56 Sangrado de prueba No. 4
74 1 mL/ intramuscular
78 1 mL/ intramuscular
81 Sangrado final (en blanco)
Posteriormente se cortó el fragmento con la banda de proteína PBP3 de la
membrana de nitrocelulosa y se incubó durante una 1 h a temperatura ambiente
en PBS adicionado de 5% de leche descremada y de Tween 20 a una
concentración final de 0.1%. Posteriormente la membrana se incubó con 4 mL del
antisuero (anti PBP3 obtenido en conejo), a temperatura ambiente durante 4 h, en
una plataforma móvil. La membrana se lavó por tres ocasiones durante 15 min
con PBS conteniendo 0.1% de Tween 20 y un último lavado con PBS. El
fragmento de membrana de nitrocelulosa se cortó en trozos pequeños y los
anticuerpos se eluyeron utilizando 0.7 mL de un regulador de glicina-HCl 0.2M pH
2.2 a temperatura ambiente durante 15 min. El pH se ajustó a 7 con 0.3 mL de
K2HPO4 1M y la preparación se dializó durante toda la noche a 4oC en PBS.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
64
16.- Determinación de la actividad de la PBP3 y PBP3
La actividad de las proteínas PBP3 y PBP3 se determinó mediante alguno
de los siguientes métodos.
A).- Método de “Bocillin FL”. Se utilizó un producto comercial llamado “Bocillin FL”
de Molecular Probes Inc. que consiste en un derivado de la penicilina que
fluoresce a 290 nm y puede ser fácilmente visualizado con luz ultravioleta. Para el
uso de este reactivo seguimos las indicaciones del proveedor.
B).- Método por Fluorografía. Es el método convencional, que consiste en el uso
de fenil 4 (n) 3H Bencilpenicilina de Amersham Life Science. Se utilizaron
generalmente de 2-20 µL de la proteína y se mezclaron con 5 µL de la
bencilpenicilina radioactiva (1µCi/µL). La reacción se incubó a 30º C por 30 min y
se agregaron 5 µL de regulador de corrimiento (5X Sample Buffer) para detener la
reacción. Se procedió a hacer la electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al
12 %, se tiñó con azul de Coomassie para visualizar las proteínas. Se eliminó el
exceso de colorante, y para ponerlo en contacto con la película fotográfica se secó
colocándolo entre una hoja de papel Whatman y una película plástica. Se utilizó
un secador de geles a 80º durante 2 h. Sobre el gel completamente seco y
adherido al papel Whatman se colocó una película fotográfica “HyperFilm M.P.” de
Amersham Life Science que se depositó dentro de un casete y se conservó a
–70º C en un Revco durante 4-5 semanas. Al término de este tiempo se llevó a
cabo el revelado de la placa fotográfica.
17.- Efecto de tres antibióticos β-lactámicos sobre el crecimiento de células
de E.coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con los
plásmidos pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y pbp3-pET30a(+).
Los antibióticos probados fueron:
a) Penicilina G de Sigma a concentraciones de 5,10,100,150 y 300 g/mL
b) Aztreonam de ICN Biomedicals a 1,3,5,10 y 15 g/mL
c) Cefotaxima de Sigma a concentraciones de 1,3,5,10 y 15 g/mL.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
65
Se transformaron las células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con los
plásmidos mencionados, las clonas positivas se cultivaron en medio LB con
kanamicina y cloranfenicol a 37º C durante 14-16 h en agitación constante. Se
hizo un subcultivo en medio TB adicionado de los antibióticos mencionados y se
continuó con las mismas condiciones de incubación. Se hicieron lecturas cada 15
minutos en un espectrofotómetro Beckman DU-70 hasta alcanzar una A600 de 0.6,
aproximadamente a los 180 min de incubación. Se adicionó IPTG a una
concentración de 1 mM y se continuó con la incubación, tomando lecturas cada 15
minutos. Después de 30 min de la inducción (210 minutos totales de incubación)
se adicionó el antibiótico -lactámico y se continuó con las lecturas durante 6
horas. Se mantuvieron en incubación por 6 horas más y se realizó una última
lectura.
18.- Inmunolocalización por Microscopía Electrónica de Transmisión de las
proteínas PBP3 y PBP3 utilizando células de E. coli BL21 Codon Plus
(DE3)-RIL transformadas e inducidas con el plásmido pET30a(+) y las
construcciones pbp3-pET30a(+) y pbp3-pET30a(+).
Las células de E.coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL competentes (200 L) se
transformaron con 5 l del plásmido pET30a(+) y de las construcciones pbp3-
pET30a(+)y pbp3-pET30a(+); se crecieron en medio TB adicionado de
kanamicina (30 g/mL) y cloranfenicol (34 g/mL) a 37º C en agitación hasta
alcanzar una A600 de 0.6-07. Se tomaron muestras al tiempo cero y se adicionó
IPTG a una concentración de 1 mM. Se dejaron crecer las células por 1 h y se
tomaron de nuevo muestras. Las células se lavaron cuidadosamente utilizando
PBS y se mezclaron suavemente en agar “noble” al 2% tratando de mantener la
muestra muy concentrada. Se cortaron cubos pequeños y se procedieron a
realizar los pasos A, B y C en frío.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
66
A.- Se utilizaron glutaraldehído al 0.1% (v/v) y formaldehído al 2.0% (p/v) por 45
min. HEPES 50 mM pH 6.8-7.2 conteniendo CaCl2 1 mM y MgSO4 1 mM a 4º C
por 60 min.
B.- Las células se lavaron con HEPES a 4º C por 3 veces durante 2 min y se
procedió a la siguiente etapa.
C.- Deshidratación. Se llevó a cabo utilizando los siguientes reactivos y tiempos de
exposición:
Etanol 25% 10 min
Etanol 50% 10 min
Etanol 75 % 10 min
Etanol 95% 10 min
Etanol 100% 3 cambios durante 45-60 min
D.-Infiltración en la resina. Se utilizó etanol/resina “LR White 50/50”. Los cubitos
de agar se incorporaron a esta mezcla y se centrifugaron por 10 min, se eliminó el
sobrenadante y se incorporó la resina “LR White” al 100%. Los cubitos de agar
tienden a flotar y se centrifugaron de nuevo por 10 min. Se hicieron cuando menos
dos cambios de resina al 100% centrifugando por 10-15 min.
E.- Se etiquetaron cápsulas pequeñas de gelatina y se colocó una gota de la
resina en la cápsula, se adicionaron uno o dos cubos de agar con la muestra y se
llenó con más resina, se cerró la cápsula y se colocó en un horno a 60º C durante
1 h hasta que la resina se polimerizó.
F.- Utilización de anticuerpos. Una vez obtenidas las secciones se colocaron sobre
rejillas de níquel las que posteriormente se ubicaron sobre gotas de PBS/leche
descremada al 3%, que actúa como agente bloqueador, durante 20 min. Se secó y
se adicionó el anticuerpo primario purificado (obtenido en conejo), por 30-60 min,
se secó y se lavó cuidadosamente con el agente bloqueador por tres ocasiones
durante 2 min cada uno. Se secó de nuevo y se colocó una gota del anticuerpo
secundario IgG anti-conejo marcado con oro diluido 1:50 en agente bloqueador y
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
67
se dejó actuar durante 1 h. Se lavó con el agente bloqueador por 3 ocasiones
durante 2 min y finalmente con agua bidestilada 4 veces por 2 min.
Se procedió a teñir utilizando acetato de uranilo al 2% por 5-10 min, y se
adicionó citrato de plomo por 1-2 min y se lavó de nuevo.
Las observaciones se realizaron con un Microscopio Philips EM 300 a 52,720X y
69,120X.
19.- Microscopía Electrónica de Barrido de células de E. coli BL21 Codon
Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con los plásmidos pET30a(+),
pbp3-pET30a(+) y pbp3-pET30a(+).
Las células competentes de E.coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL (200 µL) se
transformaron con 5 µl de cada uno de los plásmidos pET30a(+), pbp3-pET30a(+)
y pbp3-pET30a(+). Se crecieron en medio SB adicionado de kanamicina (30
g/mL) y cloranfenicol (34 g/mL) a 37º C en agitación hasta alcanzar una A600 de
0.6-07. Se tomaron muestras al tiempo cero y se adicionó IPTG a una
concentración de 1 mM. Se dejaron crecer las células por 1 y 2 h tomando
muestras de 1 mL en cada ocasión. Se centrifugaron por 2 min a 20,200 x g, se
eliminó el medio y se lavaron con un poco de regulador AB (regulador de
Sorensen) (solución A: Na2HPO4 0.07 M; solución B: KH2PO4 0.07 M pH de 6.8 en
ambas soluciones). Se tomaron 100 mL de A y 100 mL de B para tener un total de
200 mL de solución AB. Las células se lavaron y centrifugaron por cuatro
ocasiones más con el fin de eliminar los restos de medio.
Las muestras se colocaron en filtros de membrana de policarbonato de
0.2 M (Poretics Corp. Livermore, CA) y se eliminó el exceso de regulador
colocando los filtros en una jeringa acoplada a un equipo Buchner permitiendo que
el vacío removiera los restos de la solución reguladora.
Estos filtros se transfirieron cuidadosamente a recipientes que contenían
1 mL de glutaraldehído al 2%, haciendo una mezcla del regulador AB con el
glutaraldehído al 4% por lo que se utilizaron 20 mL de regulador AB y 10 mL de
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
68
glutaraldehído al 4%. Se dejó en la oscuridad a temperatura ambiente durante
toda la noche.
Los filtros se lavaron con el regulador AB por tres ocasiones más; se
adicionó al regulador AB, tetróxido de osmio al 2% para obtener una concentración
final de tetróxido de osmio al 1%. Se dejó actuar a temperatura ambiente durante
1 h y se eliminó el exceso con el regulador AB. Posteriormente se realizó la
deshidratación utilizando los siguientes reactivos y tiempos de exposición.
Etanol 50% 10 min
Etanol 70% 10 min
Etanol 80% 10 min
Etanol 90% 10 min
Etanol 95% 10 min
Etanol 100% 10 min (por 3 veces)
Finalmente se hizo una deshidratación al vacío con presión y temperatura
controlada hasta alcanzar el punto crítico de secado utilizando CO2.
Las muestras se recubrieron con 20 nm de una mezcla oro-paladio en un
“Hummer VII Sputter Coater” de Anatech Corp. Alexandria, VA. para obtener la
imagen final. Las observaciones se realizaron en un microscopio electrónico de
barrido Hitachi S-570, Tokio, Japón.
Las imágenes se capturaron por digitalización directa utilizando el “SEM
Quartz PCI Software” de Quartz Imaging Corp. Vancouver, BC.
20.- Co-expresión de los genes pbp3 y prc de P. aeruginosa en células de E.
coli transformadas e inducidas con los plásmidos
pbp3-pET30a(+) y prc-pFLAG-CTC.
El gen prc está involucrado en el procesamiento C-terminal del precursor de
la PBP3 en E. coli (Hara y col, 1991), por lo que en el caso de P. aeruginosa se
realizó la búsqueda en la base de datos de Gene Bank y se encontró un homólogo
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
69
de la proteína PRC definida también como una proteasa periplásmica específica
de 698 aa cuya función es aparentemente el procesamiento de la PBP3. Este gen
de P. aeruginosa se clonó y expresó utilizando como vector pFLAG .
La co-expresión se realizó transformando inicialmente células competentes
de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con el plásmido pbp3-pET30a(+).
Posteriormente estas mismas células se hicieron competentes para recibir
nuevamente por transformación el plásmido prc-pFLAG-CTC. Se conservaron
a -70oC hasta su uso.
Para el experimento de co-expresión se sembraron 500µL de células
transformadas en un matraz conteniendo 25 mL de caldo LB adicionado de
kanamicina (50 µg/mL) y ampicilina (100 µg/mL). Se incubaron a 37oC por 18-24 h
en agitación constante a 200 rpm, se tomó un mL de este matraz y se inoculó un
nuevo matraz con caldo LB adicionado de los mismos antibióticos, se incubó por
aproximadamente 2 h a 37oC en agitación. Se tomó una muestra de 1mL que
corresponde a Tiempo 0. A los 60 min de incubación, se adicionó IPTG a una
concentración de 1 mM. Se tomaron alícuotas de 1 mL y de 20 µL cada 30 min
hasta los 240 min que duró el experimento. Las alícuotas de 1 mL, se
centrifugaron a 14400 x g durante 4 min, se eliminó el sobrenadante y el paquete
celular se resuspendió con 120 mL de agua bidestilada estéril, se incorporaron 40
µL de 4XSB y se colocaron en un gel de poliacrilamida al 12% para determinar por
electroforesis la presencia de las proteínas PBP3 y PRC, también se realizó un
WB, utilizando para verificar la presencia de PBP3, los anticuerpos obtenidos
durante este trabajo y para la proteína PRC se utilizó el anticuerpo monoclonal
“Anti -FLAG M2” de Sigma.
Las alícuotas pequeñas (20 µL) se utilizaron para hacer frotis que se tiñeron
por la técnica de Gram para dar seguimiento a la morfología microscópica de E.
coli transformada con los plásmidos mencionados.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
70
Resultados
Obtención del DNA genómico
El aislamiento del DNA genómico utilizando el bromuro de hexadecil trimetil
amonio (CTAB) mostró buenos resultados ya que se obtuvo un rendimiento alto de
DNA y con una mayor pureza que con el DNAzol Reagent (Tabla 9).
El uso del DNAzol Reagent así como el método de Daniels resultaron
muy convenientes cuando se requirió obtener DNA genómico en poco tiempo ya
que las técnicas son mucho mas sencillas, la preparación de reactivos es mínima
y menos laboriosa que la extracción con CTAB. Los inconvenientes son que el
rendimiento es un poco menor y las manipulaciones deben llevarse a cabo en una
campana de extracción debido a la toxicidad tanto del DNAzol como del Tris-
Fenol.
Tabla 9. Concentración y pureza del DNA genómico de P. aeruginosa
obtenido por tres métodos distintos
Método Concentración de DNA (A260/A280)
CTAB 41 g/mL 1.86
DNAzol Reagent 35 g/mL 1.5
Daniels 38 g/mL 1.7
Amplificación del gen pbp3 de P. aeruginosa
En la Figura 10 se muestra el producto obtenido por la PCR del DNA genómico de
P. aeruginosa en donde se observa una banda que corresponde al gen pbp3 del
tamaño esperado (1764 pb).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
71
Figura 10. Electroferograma de la amplificación del gen pbp3 de P. aeruginosa. Carril 1, marcador de tamaño molecular Kilobase™ de Pharmacia; carril 2, DNA de P. aeruginosa.
Amplificación del gene pbp3 sin cola de histidinas (pbp3s)
Durante el curso del proyecto de investigación se consideró la obtención de
un producto del gen pbp3 pero sin la cola de 6 histidinas en la región C terminal
porque existía la posibilidad de interferencia al hacer los ensayos de
reconocimiento con la penicilina; por lo tanto, se diseñaron los iniciadores
adecuados para obtener este producto (ver material y métodos). El producto se
muestra en la Figura 11.
1 2 3 4
1 2
pbp3 (1764 pb)
10 Kb
2 Kb
1 Kb
0.5 Kb
pbp3s 1740 pb
10 Kb
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Figura 11. Electroferograma de la amplificación del gen pbp3 sin cola de histidinas (pbp3s) de P. aeruginosa. Carril 1, marcador de tamaño molecular “1 Kb DNA Ladder de New England BioLabs”; carriles 3 y 4, DNA de P. aeruginosa.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
72
Amplificación del gen pbp3
Para obtener la versión truncada de la proteína PBP3 que corresponde a la
región transmembranal, se diseñaron los iniciadores adecuados para amplificar el
gen que corresponde al pbp3 eliminando los primeros 27 tripletes. En la Figura
12, se muestran los resultados obtenidos, en donde se observa en el carril 2 una
banda del tamaño esperado (1680 pb) que corresponde al gen pbp3.
Para la amplificación de este gen se ensayó el DNA molde de P.
aeruginosa obtenido por los 3 métodos anteriormente mencionados y se
obtuvieron los resultados que se observan en la Figura 13. En esta figura se
muestran las bandas que corresponden al gen pbp3 de P. aeruginosa del
tamaño esperado (1680 pb)
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Figura 13. Electroferograma de la amplificación del gen Δpbp3 de P. aeruginosa con DNA obtenido por 3 métodos. Carril 1, marcador de tamaño molecular Kilobase™ de Pharmacia; carriles 2-7, DNA de P. aeruginosa obtenido por:
a) CTAB (carriles 2 y 3) b) DNA®zol Reagent
(carriles 4 y 5) c) Daniels (carriles 6 y 7).
Δpbp3 (1680 pb)
Figura 12. Electroferograma de la amplificación del gen Δpbp3 de P. aeruginosa. Carril 1, marcador de tamaño molecular Kilobase™ de
Pharmacia; carril 2, pbp3; carril
3, plásmido pET30a(+) digerido con NdeI y XhoI, y en el último carril pET30a(+) intacto.
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pET30a(+) (5422 pb) Δpbp3 (1680 pb)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
73
Amplificación del gen prc
Se obtuvo la secuencia del gen prc de Escherichia coli de la base de datos
del Banco de Genes http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/ con el número de acceso
D00674, con esta información se compararon las secuencias conocidas de
nuecleótidos de Pseudomonas aeruginosa utilizando el sitio de Pseudomonas
Genome Project http://www.pseudomonas.com y se encontraron dos genes homólogos .
La secuencia completa de estos dos genes homólogos se tradujo utilizando el
programa de computación Clone Manager 5. Este mismo programa permitió
también obtener todos los sitios de restricción de los fragmentos analizados.
Utilizando esta información, se seleccionó la secuencia que mostró un 58% de
homología con el gen prc de E. coli , se diseñaron los iniciadores y se utilizó el
programa en el termociclador mas adecuado (ver Material y Métodos) para la
amplificación de este gen.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 14 en donde se observa
en los carriles 2 y 3 una banda del tamaño esperado( 2055 pb), que corresponde
al gen prc de P. aeruginosa. Posteriormente, este producto se purificó utilizando
el QIAquick PCR Purificaction Kit de QIAGEN y su identidad se verificó en el
Guelph Molecular Supercentre.
Figura 14. Electroferograma de la amplificación del gen prc de P. aeruginosa. Carril 1, marcador de tamaño molecular “1 Kb DNA Ladder de New England BioLabs”; carril 2, DNA de P. aeruginosa utilizando 3 µL de cada iniciador; carril 3, DNA de P. aeruginosa utilizando 1 µL de cada iniciador. El DNA molde se obtuvo por el método de Daniels.
1 2 3
prc (2055 pb)
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Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Clonación de los genes pbp3, pbp3s (sin cola de histidinas) y Δpbp3 en los
vectores intermedios pGEMT ó pGEMTEasy
Para la clonación de estos genes previamente amplificados se ensayaron
los vectores intermedios pGEMT ó pGEMTEasy .
Se siguieron las instrucciones del proveedor en el uso de estos vectores y
el producto de la ligación se utilizó para transformar células de E. coli DH5
competentes. Para la selección de las transformantes, las células se sembraron en
medio Agar Luria Bertani (ALB) adicionado de isopropil--D-tiogalactopiranósido
(IPTG) y 5-bromo-4-cloro-3-indoil D galactopiranósido y el antibiótico selector fue
la ampicilina.
La búsqueda de recombinantes se facilitó enormemente ya que es fácil
distinguir a las bacterias recombinantes que producen colonias blancas de las de
color azul que no tienen el inserto en la región esperada. Se obtuvieron varias
decenas de colonias transformadas con los genes pbp3, pbp3s y Δpbp3; cada una
de estas colonias, se cultivó en medio LB y se realizó la extracción de los
plásmidos utilizando el juego de reactivos “Concert Rapid Plasmid Miniprep
System”. Se tomaron al azar muestras de 5 plásmidos y se enviaron a secuenciar
al Guelph Molecular Supercentre.
Se analizaron las secuencias obtenidas con el programa de computación
Clone Manager y se seleccionaron las clonas con las secuencias correctas. Con
estos resultados, se realizó la digestión de estos plásmidos con las enzimas de
restricción NdeI y XhoI para separar los insertos (genes pbp3, pbp3s ó Δpbp3) del
vector correspondiente. Las digestiones se hicieron por separado y los mejores
resultados se obtuvieron cuando se incubaron a 37º C, durante 2 h, utilizando 2 L
de DNA , 1 L de enzima (2 U/L), 2 L del regulador adecuado y el resto de dH20
estéril para tener un total en la mezcla de reacción de 20 L. En el caso de la
enzima XhoI se requirió de la adición de 0.2 L de seroalbúmina bovina que se
incorporó a la mezcla (Figura 15).
Estos dos vectores se utilizaron como un recurso para favorecer la
clonación de estos genes que manifestaron ser de difícil incorporación; una vez
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
75
obtenido el producto deseado fue fácilmente transferido al vector pET30a(+). Es
de nuestro interés clonar al gen pbp3, en pET30a(+) porque una vez transferido al
huésped de expresión adecuado, la obtención y purificación de la proteína
esperada es mucho mas sencilla por la presencia de la cola de poli-histidinas
presentes en este vector.
En la Figura 16 se muestra el resultado obtenido de la clonación de pbp3s en
estos vectores intermedios, en donde se observan en el carril 2, los dos
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PGEM®T (3003 pb) pbp3 (1764 pb)
pGEM®T (3003 pb) pbp3s ( 1740 pb)
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Figura 15. Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de la construcción pbp3-pGEM®-T de 3 clonas recombinantes. Carril 1, marcador de tamaño molecular “1 Kb DNA Ladder de New England BioLabs”; carriles 2-4, construcciones pbp3-pGEM®-T de las clonas recombinantes 2, 5 y 15 respectivamente.
Figura 16. Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de una clona recombinante con pbp3s-pGEM®T. Carril 1, marcador de tamaño molecular Kilobase™ de Pharmacia; carril 2, clona 7 con la construcción pbp3s-pGEM®T, digerida.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
76
fragmentos obtenidos de la digestión con NdeI y XhoI de la construcción pbp3s-
pGEM®T. El fragmento pequeño corresponde al gen pbp3s (1740 pb) y el mayor
al vector pGEM®T (3003 pb).
Se continuó con la misma estrategia de clonación utilizando vectores
intermedios en donde se incorporó el gen Δpbp3 a pGEM®T; el resultado se
observa en la Figura 17, en donde se muestra la digestión de varios plásmidos
recombinantes Δpbp3-pGEM®T con NdeI y XhoI; en esta digestión se obtuvieron
dos fragmentos de distinto tamaño; el pequeño corresponde al gen Δpbp3 (1680
pb) y el de mayor tamaño al vector pGEM®T (3003 pb). En los carriles 2 y 8 se
incluyó al vector pGEM®T sin digerir como testigo.
Figura 17. Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de los plásmidos recombinantes Δpbp3-pGEM®T. Carril 1, marcador de tamaño molecular “1 Kb DNA Ladder de New England BioLabs”; carriles 2 y 8, vector pGEM®T; carriles 3-7 y 9-11, construcciones de Δpbp3-pGEM®T de clonas recombinantes digeridas con NdeI y XhoI.
Clonación de los genes pbp3, pbp3 sin cola de histidinas y Δpbp3 en el
vector pET30a(+)
Estos amplicones se ligaron al plásmido pET30a(+) previamente digerido
con NdeI y XhoI. Los ensayos con diversas concentraciones nos revelaron que
los mejores resultados se obtuvieron cuando la relación vector-inserto fue de 1:3
ó 1:4 y obtuvimos más células transformadas cuando la ligación se dejó a 4º C
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pGEM®T (3003 pb) Δpbp3 (1680 pb)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
77
durante toda la noche. La ligasa se utilizó a una concentración de 1L por reacción
(2 U/L) en una mezcla total de 20 L.
Se realizaron varios ensayos de ligación rápida utilizando el “Rapid DNA
Ligation Kit”, cuya propaganda menciona que en 5 min a temperatura ambiente se
forman productos ligados, pero en nuestro caso los resultados no fueron buenos
pues la pobreza de células transformadas fue evidente por lo que se decidió seguir
utilizando el protocolo previamente descrito en material y métodos.
Las mezclas de ligación se pusieron en contacto para la transformación de
células competentes de E.coli DH5, posteriormente se sembraron en medio ALB
adicionado de kanamicina que es el antibiótico selector. Se escogieron las
transformantes después del período de incubación a 37º C de 18-24 h.
Clonación del gen pbp3 en el vector pET30a(+)
Se obtuvieron mas de 400 colonias de posibles recombinantes que se
transfirieron a medios de cultivo nuevos para continuar con su estudio, como el
número de recombinantes fue relativamente alto se realizó la técnica de E-Lyse
que permite hacer una búsqueda rápida de probables recombinantes. Se utilizó
como testigo E. coli DH5+pET30a(+). Es importante hacer notar que la técnica
de E-Lyse no es una técnica fina sino que nos permite visualizar a grosso modo y
de manera relativamente rápida aquellas colonias que probablemente tengan la
construcción con el tamaño esperado, el cual se compara visualmente con el
tamaño del plásmido testigo sin inserto.
Se hizo E-Lyse a 100 clonas de las clonas obtenidas; las que mostraron
una construcción de mayor tamaño que el vector pET30a(+), se cultivaron en
medio LB+kanamicina, se crecieron a 37º C en agitación constante, se extrajeron
sus plásmidos por la técnica de Daniels que es más económica que utilizar el
“QIAprep Spin Miniprep Kit”, con un resultado similar en cuanto a la pureza de las
preparaciones. Las clonas con plásmidos de aproximadamente 7 Kb son las que
tienen probablemente el inserto esperado por lo que los plásmidos así aislados se
sometieron a la acción de las enzimas de restricción NdeI y XhoI para obtener dos
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
78
fragmentos, uno que corresponde al plásmido y el otro al inserto. Para pbp3-
pET30a(+) sabemos que el plásmido tiene 5422 pb menos 188 que se eliminan al
cortar con NdeI y XhoI y el gen pbp3 tiene 1840 pb menos las que se eliminan por
el mismo motivo lo que nos da un producto de aproximadamente 6975 pb. En la
Figura 18 se observan algunas de las construcciones digeridas con NdeI y XhoI y
se comparan con el vector pET30a(+) intacto y digerido con las mismas enzimas.
Figura 18. Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de los plásmidos recombinantes Δpbp3-pGEM®T. Carril 1, marcador de tamaño molecular Kilobase™ de Pharmacia; carril 2, pET30a(+) intacto; carriles 3, 4 y 5, construcciones pbp3-pET30a(+) digeridas y carril 6, vector pET30a(+), digerido con las mismas enzimas.
Clonación del gen pbp3s (sin cola de histidinas) en el vector pET30a(+)
Para la clonación de este gen se realizó el mismo procedimiento y se obtuvieron
86 clonas. Los resultados que demuestran la clonación del gen pbp3s se
observan en la Figura 19 en donde se muestra la digestión con NdeI y XhoI de
varias construcciones con pbp3s-pET30a(+) que presentan dos fragmentos, el
pequeño, corresponde al gen pbp3s (1740 pb) y el mayor al vector pET30a(+).
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pET30a(+) (5234 pb) pbp3 (1764 pb)
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Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Figura 19. Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de las construcciones pbp3s-pET30a(+). Carril 1 y 16, marcador de tamaño molecular Kilobase™ de Pharmacia; carriles 2, 4, 6, 8 y 10, construcciones intactas; carriles 3, 5, 7, 9, 11 y 13 construcciones digeridas; carriles 14 y 15, plásmido pET30a(+) intacto y digerido respectivamente.
Clonación del gen Δpbp3s en el vector pET30a(+)
La clonación del gen Δpbp3 en el vector pET30a(+) resultó un
procedimiento muy sencillo con la experiencia adquirida en las clonaciones
previas. Se siguió el procedimiento ya descrito y se obtuvieron más de 500
transformantes. Con este número tan elevado se aplicó nuevamente la prueba
tamiz conocida como E-Lyse para descartar aquellas clonas que no tuvieran la
construcción Δpbp3-pET30a(+). En la Figura 20, se observa el resultado de la
Figura 20. Electroferograma de la digestión con NdeI y XhoI de las construcciones Δpbp3-pET30a(+). Carriles 1 y 12, marcador de tamaño molecular “1 Kb Ladder DNA de New England BioLabs”; carriles 2 y 8 pET30a(+) digerido con las mismas enzimas; carriles 3,4,5,6,7,9,10 y 11, construcciones Δpbp3-pET30a(+) digeridas; carril 13, pET30a(+) intacto; carriles 14 y 15, pET30a(+) digerido con las mismas enzimas.
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pET30 a(+) intacto y digerido (5234 pb) Δpbp3 (1680 pb)
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Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
80
digestión con NdeI y XhoI de 8 clonas que muestran la presencia de dos
fragmentos que corresponden al gen Δpbp3 (1680 pb) y el fragmento mayor al
pET30a(+), con aproximadamente 5422 pb.
Clonación del gen prc en el vector pFLAG-CTC
Con el producto del gen prc de P. aeruginosa , amplificado, purificado y
digerido con las enzimas HindIII y KpnI se hizo la ligación correspondiente al
plásmido pFLAG-CTC. Las construcciones de las clonas recombinantes se
digirieron con las mismas enzimas y los resultados obtenidos, se muestran en la
Figura 21, en donde se observan 2 bandas, la de tamaño molecular menor
corresponde al gen prc (2055 pb) y la de mayor tamaño molecular corresponde al
vector pFLAG-CTC (5336 pb).
Figura 21. Electroferograma de la digestión con HindIII y KpnI de las construcciones prc-pFLAG-CTC. Carril 1, Tamaño molecular “1 Kb DNA Ladder de New England BioLabs”; carril 2, pFLAG-CTC intacto; carril 3, 4 y 6 construcciones prc-pFLAG-CTC digeridas; carril 5, construcción con un fragmento mas pequeño que el esperado para el gen prc.
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pFLAG-CTC (5336 pb) prc (2055 pb)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
81
Inducción de la expresión de las proteínas PBP3, PBP3s (sin histidinas
terminales) y ΔPBP3.
Con la identidad de todas las construcciones comprobadas por el análisis
de la secuencias correspondientes de pbp3-pET30a+, pbp3s-pET30a(+) y Δpbp3-
pET30a(+), se transformaron células de E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3)
pLysS y E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL, que fueron crecidas inicialmente en
agar LB adicionado de kanamicina y cloranfenicol, que son los antibióticos que
ejercen el efecto selectivo. Con estas células se iniciaron los experimentos de
inducción en los medios LB, SB y TB.
Los mejores resultados se obtuvieron con las células E. coli BL21 Codon
Plus (DE3)-RIL, por lo que fueron las elegidas para la producción de las proteínas.
Con estas células transformadas con los genes pbp3, pbp3s (sin cola de
histidinas) y Δpbp3, se sembraron los medios LB, SB y TB. Los mejores
rendimientos se obtuvieron con el medio TB, que contiene entre sus ingredientes
una alta concentración de extracto de levadura que aporta importantes
aminoácidos para la síntesis de proteínas. En las Figuras 22 y 23, se muestran,
los resultados obtenidos de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la
inducción de la proteína PBP3, en células de E. coli BL-21 Codon Plus (DE3)-RIL,
utilizando IPTG como inductor, a dos concentraciones distintas: 0.5 mM y 1 mM, e
incubadas a temperatura ambiente y a 37oC respectivamente. En los dos
experimentos se tomaron muestras con intervalos de 30 min hasta completar 90
min.
Se puede observar en los dos experimentos, que la banda de proteína que
corresponde a la PBP3, se incrementa con respecto al tiempo a las dos
concentraciones de IPTG ensayadas con las células incubadas a temperatura
ambiente, pero esta situación muestra un cambio al variar la temperatura de
incubación a 37oC, en donde la banda de proteína que corresponde a la PBP3 se
incrementa notablemente con respecto al tiempo cuando la concentración de
IPTG es de 1 mM.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
82
Figura 22. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la inducción de la PBP3 en células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL incubadas a temperatura ambiente. Se utilizó IPTG como inductor a concentraciones de 0.5 mM y 1 mM. Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carriles 2, 3, 4 y 5 IPTG 0.5 mM; carriles 6,7,8 y 9, IPTG 1 mM.
Figura 23. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la inducción de la PBP3 en células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL, incubadas a 37oC. Se utilizó IPTG como inductor a concentraciones de 0.5 mM y 1 mM. Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carriles 2,3,4 y 5, IPTG 0.5 mM, carriles 6,7,8 y 9, IPTG 1 mM.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
83
Con los resultados preliminares obtenidos, para los experimentos
posteriores, se utilizó una concentración de IPTG de 1 mM y una temperatura de
incubación de 37ºC. En la Figura 24 se observan los resultados obtenidos en un
gel de poliacrilamida-SDS con células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL
transformadas con pbp3-pET30a(+) e inducidas. En el carril 2 se incluyó una
alícuota de células no inducidas; en los siguientes carriles se observa el mismo
cultivo después de la inducción con IPTG 1 mM y mantenidas a 37°C por 3 h. En
los carriles del 3 al 8 se colocaron las muestras con intervalos de 30 min de
incubación y se observa claramente la presencia de una banda de proteína, que
se incrementa con respecto al tiempo, con un peso molecular de
aproximadamente 62.8 kDa, que es el peso esperado para la proteína PBP3.
Figura 24. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la inducción de la proteína PBP3 en células transformadas de E.coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL, cultivadas a 37oC (0-180 min). Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carril 2 células no inducidas (NI) y carriles 3 a 8 muestras con intervalos de 30 min de células inducidas con IPTG a una concentración de 1 mM.
PBP3 (62.8 kDa)
97.4 kDa
66.2 kDa
45 kDa
31 kDa
21.5 kDa
14.4 kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 NI 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min 180 min
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
84
Purificación y localización de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 por electroforesis
en geles de poliacrilamida-SDS
A).-Método IMAC de QIAGEN
El primer método consistió en la utilización de cromatografía de afinidad con
un metal inmovilizado (IMAC) que tiene una columna de agarosa-Ni-Acido
Nitrilotriacético (Ni-NTA) de QIAGEN. La presencia de la proteína se observó
utilizando dos técnicas:
a) Tinción con Azul brillante de Coomassie
b) Western blot
En la Figura 25, se muestran los resultados obtenidos en un gel de
poliacrilamida-SDS de la purificación de la PBP3 utilizando cromatografía de
afinidad con un metal inmovilizado y teñida con azul brillante de Coomassie. Se
observa que la proteína es prácticamente eluida en su totalidad en la primera
fracción. Esta banda de proteína corresponde al peso molecular esperado para la
PBP3 (62.8 kDa).
Figura 25. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la proteína PBP3 purificada por cromatografía de afinidad (IMAC). Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carriles 2,3, 4 y 5, regulador de elución, fracciones 1, 2, 3 y 4 respectivamente; carril 6, regulador de lavado.
En la Figura 26, se muestra el resultado obtenido de la purificación de la proteína
ΔPBP3, utilizando también cromatografía de afinidad con un metal inmovilizado.
La banda de proteína se observa principalmente en las fracciones 1 y 2 (carriles 5
y 6) su peso molecular corresponde al esperado para la versión truncada de
la PBP3 (58.72 kDa).
97.4 Kd
66.2 Kd
45 Kd
31 Kd
21.5 Kd 14.4 Kd
1 2 3 4 5 6
PBP3 (62.8 kDa)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Figura 26. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la proteína ΔPBP3 purificada por cromatografía de afinidad (IMAC). Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carril 2 y 3, sonicado de células; carril 4, regulador de lavado; carril 5, regulador de elución, fracción 1; carril 6, regulador de elución, fracción 2; carril 7, regulador de elución, fracción 3; carril 8, regulador de elución, fracción 4.
En la Figura 27 se muestra el Western blot de la PBP3 purificada por IMAC
de células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL incubadas a 37oC e inducidas
con IPTG 1 mM. Se observa en las fracciones 1, 2 y 3, la presencia de una banda
de proteína del tamaño esperado que corresponde a la PBP3 (62.8 kDa). En el
último carril se colocó un sonicado de células y se manifiesta también la presencia
de la PBP3.
Figura 27. Análisis por Western blot de la PBP3 purificada por IMAC de células de E. coli BL21 Codon Plus(DE3)-RIL transformadas con pbp3-pET30a(+), incubadas a 37oC. Se utilizó IPTG 1 mM como inductor. Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carril 2, 3 regulador de lavado; carriles 4,5 y 6, regulador de elución; carril 7, sonicado de células. Se utilizó anticuerpo de ratón anti-histidina de QIAGEN.
1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7 8
205 kDa
120 kDa 84 kDa
52.4 kDa 36.3 kDa
30.2 kDa
PBP3 (62.8 kDa)
97.4 Kd 66.2 Kd
54 Kd
31 Kd
21.5 Kd
14.4 Kd
ΔPBP3 (58.7 kDa)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
86
B).-Método de Osborn y colaboradores (1972)
Este método proporcionó información con la que fue posible determinar la
ubicación de las proteínas PBP3, PBPs (sin poli-histidinas terminales) y ΔPBP3
en las distintas fracciones celulares: citoplasma/periplasma, membrana
citoplásmica, membrana externa, envolturas completas y cuerpos de inclusión.
Para la observación de estas proteínas en geles de poliacrilamida-SDS se
utilizó alguna de las siguientes técnicas:
a).-Tinción con azul brillante de Coomassie. (Figuras 28,29 y 30).
b).-Tinción de plata. (Figura 31).
c).-“Western blot” para las proteínas con cola de histidinas. (Figura 32).
d).-Utilización del “Gel Code 6xHis Protein Staining” de Pierce®. (Figura 33).
En la Figura 28 se muestra el resultado obtenido de la purificación de la
PBP3 mediante el método de Osborn y colaboradores, 1972. En los primeros
carriles (3, 4 y 5) se observa una banda de proteína que corresponde al peso
esperado para la PBP3 (62.8 kDa), en células inducidas (tiempo 1, 2 y 3 h
respectivamente). El fraccionamiento celular reveló la presencia de la PBP3 en
mayor cantidad en las fracciones que corresponden a citoplasma/periplasma
(carril 7) y membrana citoplásmica (carril 8). Esta banda de proteína también se
manifestó en una menor cantidad en la fracción de envolturas completas (carril 9)
y en los cuerpos de inclusión (carril 10).
La Figura 29 muestra los resultados obtenidos del fraccionamiento celular
de E. coli BL21Codon Plus(DE3)-RIL transformada con la construcción Δpbp3-
pET30a(+). Se observa que la banda de proteína que corresponde al peso
esperado para la ΔPBP3 (58.7 kDa) se encuentra principalmente en las fracciones
que corresponden a citoplasma/periplasma y membrana citoplásmica, así como en
menor cantidad en las fracciones de envolturas completas y membrana externa.
La localización de la PBP3s (sin histidinas terminales), se observa en la
Figura 30, en donde se muestra la presencia de la banda que corresponde al
tamaño esperado para esta proteína (61.8 kDa) en las fracciones que
corresponden a citoplasma/periplasma, membrana citoplásmica y envolturas
completas. Este patrón es análogo al mostrado por la PBP3.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
87
Figura 28. Electroforesis en gel de poliacrialmida-SDS de la purificación de la PBP3 de células de E. coli transformadas con pbp3-pET30a(+). Todas las células se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG a una concentración de 1mM. Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carril 2, células no inducidas; carril 3, células inducidas durante 60 min; carril 4, células inducidas durante 120 min; carril 5, células inducidas durante 180 min; carril 6, membrana externa; carril 7, citoplasma/periplasma; carril 8, membrana citoplásmica; carril 9, envolturas completas; carril 10, cuerpos de inclusión. Método de Osborn y colaboradores (1972).
Figura 29. Electroforesis en gel de poliacrialmida-SDS de la purificación de la ΔPBP3 de células de E. coli transformadas con Δpbp3-pET30a(+). Todas las células se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG a una concentración de 1mM. Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carril 2, células no inducidas; carril 3, células inducidas durante 30 min; carril 4, citoplasma/periplasma; carril 5, envolturas completas; carril 6, membrana citoplásmica; carril 7, membrana externa. Método de Osborn y colaboradores (1972).
1 2 3 4 5 6 7
97.4 kDa
66.2 kDa
45 kDa
31 kDa
21.5 kDa
14.4 kDa
ΔPBP3 (58.7 kDa)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
88
Figura 30. Electroforesis en gel de poliacrialmida-SDS de la purificación de la PBP3s (sin cola de histidinas) de células de E. coli transformadas con pbp3s-pET30a(+). Todas las células se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG a una concentración de 1mM. Carril 1, PM de BIORAD; carriles 2 y 5 citoplasma/periplasma (5 y 15 µL); carril 3 y 6, membrana citoplásmica (5 y 15 µL); carril 4, membrana externa; carril 7, envolturas completas. Método de Osborn y colaboradores (1972).
En la Figura 31, se muestran los resultados obtenidos del fraccionamiento
celular de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformada con pbp3-pET30a(+) e
inducida con IPTG 1 mM. El gel de poliacrilamida-SDS se tiñó con plata. Se
observa en los carriles 2, 3 y 4, en células inducidas (tiempo 1,2 y 3 h
respectivamente) una banda de proteína, que corresponde al tamaño esperado
para la PBP3 (62.8 kDa). Del carril 6 al 9 se observan los resultados obtenidos del
fraccionamiento celular (Osborn y col., 1972), en donde la PBP3 se localizó
principalmente en las fracciones que corresponden a membrana citoplásmica
(carril 7) y envolturas completas (carril 9) y en una proporción menor en las
fracciones del citoplasma/periplasma y de la membrana externa.
El Western blot fue otra técnica que permitió observar la presencia de la
PBP3, utilizando anticuerpos específicos contra la cola de histidinas. Los
resultados obtenidos se muestran en la Figura 32, en donde en los primeros
carriles (2-5) se analizaron las fracciones celulares obtenidas por el método de
Osborn y colaboradores (1972) y en los carriles del 6 al 8 se incorporaron las
PBP3s (61.8 kDa)
1 2 3 4 5 6 7
205 kDa 121 kDa 70 kDa
52.4 kDa
34.9 kDa
29.1 kDa
20.7 kDa
6.9 kDa
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
89
Figura 31. Tinción con plata de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la PBP3 de células de E. coli transformadas con pbp3-pET30a(+).Todas las células se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG a una concentración de 1mM. Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carril 2, células no inducidas; carriles 3, 4 y 5 , células inducidas 1, 2 y 3 h respectivamente; carril 6, citoplasma/periplasma; carril 7, membrana citoplásmica; carril 8, membrana externa y carril 9, envolturas completas. Método de Osborn y colaboradores (1972).
fracciones obtenidas de la purificación de la PBP3 por el método IMAC. Se
observa una banda que corresponde al peso esperado para la PBP3 de
aproximadamente 62.8 kDa; que se presenta en cantidades semejantes en las
fracciones que corresponden a citoplasma/periplasma (carril 2), membrana
citoplásmica (carril 3) y envolturas completas (carril 4). En las fracciones
obtenidas por IMAC se observa la presencia de la banda del tamaño esperado
para la PBP3 en las fracciones 1 y 2 (carriles 6 y 7). En el carril 8 se colocó una
alícuota (5 µL) de la PBP3 purificada.
La última técnica de tinción utilizada en este trabajo para observar la
presencia de la PBP3 fue el juego de reactivos de Pierce, que permite visualizar a
aquellas proteínas que portan una cola de histidinas, al irradiarlas con una de
300 nm. En la Figura 33, se observa el resultado obtenido con esta tinción, en
donde se muestra la presencia de una banda (fluorescente en el transiluminador)
que corresponde a la PBP3 en cantidad similar en las fracciones que
1 2 3 4 5 6 7 8 9
97.4 kDa 66.2 kDa 45 kDa 31 kDa 21.5 kDa
PBP3 (62.8 kDa)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
90
corresponden a envolturas completas (carril 1), citoplasma/periplasma (carril 2),
membrana citoplásmica (carril 3) y cuerpos de inclusión (carril 5). En el carril 4,
que corresponde a membrana externa no se observó ninguna banda. Las
fracciones se obtuvieron por el método de Osborn y colaboradores (1972) a partir
de de E. coli BL 21 Codon Plus (DE3)-RIL, transformada con la construcción
pbp3-pET30a(+) incubada a 37oC e inducida con IPTG 1 mM.
Figura 32. Western blot de la PBP3 purificada a partir de células de E. coli con pbp3-pET30a(+).Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carril 2, citoplasma/periplasma; carril 3, membrana citoplásmica; carril 4, envolturas completas; carril 5, regulador de lavado; carriles 6 y 7, regulador de elución fracciones 1 y 2 respectivamente; carril 8, PBP3 purificada. Método de Osborn y colaboradores (1972), carriles 2,3 y 4; Método IMAC, carriles 5,6 y 7.
1 2 3 4 5
Figura 33. Tinción de Pierce de la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la PBP3 de células de E. coli con pbp3-pET30a(+). Tinción con “Gel Code 6His Protein Staining” de Pierce. Carril 1, envolturas completas; carril 2, citoplasma/periplasma; carril 3, membrana citoplásmica; carril 4, membrana externa; carril 5, cuerpos de inclusión. Método de Osborn y colaboradores, 1972.
PBP3 62.8 kDa
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
91
Obtención de anticuerpos contra la proteína PBP3
Los anticuerpos contra la proteína PBP3 se obtuvieron en un conejo Nueva
Zelanda, blanco, hembra de 3.0 a 3.5 Kg de peso con un esquema de
inmunización que se llevó a cabo durante 81 días. En la Figura 34 se muestra el
resultado obtenido del Western blot de la PBP3 utilizando el suero obtenido en
este trabajo. En la Figura 34a, se observa el resultado del suero obtenido en la 2ª
sangría (dilución 1:750) y en la Figura 34b, se observa el resultado del suero
obtenido en la 3ª sangría (dilución 1: 1000).
Figura 34. Western blot de la proteína PBP3 y los anticuerpos obtenidos en conejo contra la PBP3 purificada. a) Suero obtenido en la 2ª sangría y b) Suero obtenido en la 3ª sangría.
a)
PBP3 62.8 kDa
b)
PBP3 62.8 kDa
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
92
Concentración y cuantificación de la proteína PBP3
Para concentrar la proteína PBP3 se utilizó Carbowax PEG 8000. La
purificación de la proteína PBP3 se comprobó realizando electroforesis en geles
de poliacrilamida-SDS y por Western blot. En la Figura 35a (Tinción con azul de
Coomassie) se muestra la banda que corresponde a la PBP3 con un peso
aproximado de 62.8 kDa. En la Figura 35b se muestra el Western blot de la PBP3
purificada. Se utilizaron los anticuerpos purificados obtenidos en este trabajo; se
observa una banda que corresponde al peso esperado para la PBP3, de
62.8 kDa.
La cuantificación de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 se realizó utilizando el
método del ácido bicinconínico. Se obtuvieron concentraciones de 0.01 mg/L y
1.13 mg/L respectivamente.
a)
Figura 35. Concentración y purificación de la proteína PBP3 de P. aeruginosa PAO1. a) Electroforesis en gel de poliacrilamida de la PBP3 purificada. b) Western blot de la PBP3 purificada con el anticuerpo purificado obtenido en este trabajo. Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carril 2, PBP3 purificada.
97.4 kDa 66.2 kDa 45 kDa 31 kDa 21.5 kDa 14.4 kDa
97.4 kDa 66.2 kDa 45 kDa 31 kDa 21.5 kDa 14.4 kDa
PBP3 62.8 kDa
PBP3 62.8 kDa
1 2
1 2
b)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
93
Determinación de la actividad de la PBP3 y ΔPBP3
La actividad de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 se determinó por alguno de los
siguientes métodos.
A.-Método de Bocillin FL (Figura 36).
B.-Fluorografía (Figura 37).
El producto comercial “Bocillin FL” es un derivado de la penicilina que
fluoresce a una de 290. El resultado obtenido se muestra en la Figura 36 en
donde se observa una banda que corresponde al PM esperado para la PBP3
(62.8 kDa) y para la ΔPBP3 (58.7 kDa). Se incluyeron en este gel las fracciones en
donde se ha demostrado la presencia de estas proteínas utilizando otras técnicas
de tinción, pero no se logró observar estas proteínas en dichas fracciones.
Figura 36. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de la PBP3 y ΔPBP3 purificadas. Carril 1, Marcadores de PM de BIORAD; carril 2, ΔPBP3/citoplasma; carril 3, ΔPBP3 purificada; carril 4, PBP3/membrana citoplásmica; carril 5, PBP3 purificada; carril 6, células completas de P. aeruginosa PAO1.
La fluorografía es el método tradicional utilizado para demostrar la actividad
de las PBPs. Se utilizó Bencilpenicilina radioactiva y los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 37, en donde se observa en los carriles 2 y 3 la presencia
de una banda con el tamaño esperado para la PBP3 (62.8 kDa), y en el carril 4,
la que corresponde a la ΔPBP3 con un PM de 58.7 kDa. Se observan otras
bandas que probablemente correspondan a otras PBPs.
1 2 3 4 5 6
97.4 kDa 66.2 kDa
54 kDa
31 kDa
21.5 kDa 14.4 kDa
PBP3 (62.8 kDa) ΔPBP3 (58.7 kDa)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
94
Figura 37. Fluorografía de la PBP3 y ΔPBP3 purificadas. Carril 1, Marcador de PM de BIORAD; carriles 2 y 3, PBP3 purificada; carril 4, ΔPBP3 purificada.
Efecto de tres antibióticos β-lactámicos sobre el crecimiento de células de
E.coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas e inducidas con los
plásmidos pET30a+ y las construcciones pbp3-pET30a(+) y pbp3-
pET30a(+).
Los antibióticos ensayados fueron:
a) Penicilina G, a concentraciones de 5,10,100,150 y 300 g/mL
b) Aztreonam, a 1,3,5,10 y 15 g/mL
c) Cefotaxima, a concentraciones de 1,3,5,10 y 15 g/mL.
En las siguientes figuras se muestran los resultados del efecto de estos
tres antibióticos sobre el crecimiento de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL
transformada e inducida (IPTG a una concentración de 1mM) con el plásmido
pET30a(+) y las construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30 a(+). Todos los
cultivos se incubaron a 37oC durante 12 horas. Las lecturas se hicieron a una A600.
En estas figuras se incluyeron los resultados tanto del plásmido
pET30a(+) sin inserto como de las construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-
pET30a(+) sin inducir e inducidas con IPTG 1 mM, sin antibiótico.
PBP3 (62.808 kDa) ΔPBP3 (58.72 kDa)
205 kDa
121 kDa
70 kDa
52.4 kDa 34.9 kDa
29.1 kDa
1 2 3 4
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
95
En la Figura 38 se observa el efecto de diferentes concentraciones de
penicilina G, en donde el crecimiento de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con la
construcción pbp3-pET30a(+) se incrementó ligeramente a concentraciones de 5 y
10 µg/mL. después del 240 min de incubación. A concentraciones mayores del
antibiótico (100, 150 y 300 µg/mL), el crecimiento se mantuvo en una fase
estacionaria relativamente estable durante aproximadamente 75 min mas; al
término del período total de incubación (720 min) se observó la declinación del
crecimiento y la muerte celular con las concentraciones de 100, 150 y 300 µg/mL;
con las concentraciones menores ( 5 y 10 µg/mL), se recuperaron células viables
al término del período de incubación. Un efecto relativamente similar pero mucho
mas notable, se observó durante los primeros 240 min de incubación de E. coli
BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con la construcción Δpbp3-pET30a(+), pero en este
caso, las células no solo incrementaron su crecimiento a concentraciones de 5 y
10 µg/mL, sino que al término de las 12 h de incubación también se recuperaron
células viables.
El efecto del aztreonam se muestra en la Figura 39, en donde se observó
que este antibiótico no tuvo efecto inhibitorio sobre el crecimiento de E. coli BL21
Codon Plus (DE3)-RIL transformada con las construcciones pbp3-pET30a(+) y
Δpbp3-pET30a(+). El crecimiento no solo se mantuvo estable sino que aumentó
en función del tiempo. Ninguna de las concentraciones utilizadas (1, 3, 5, 10 y 15
µg/mL) provocó la muerte celular. Los resultados obtenidos muestran en todos
los casos, resistencia a este antibiótico, incluso a la concentración más alta
utilizada (15 µg/mL). La cepa de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL utilizada como
testigo con el plásmido pET30a(+) presentó, a partir de los 210 min de
incubación, el inicio de la fase estacionaria, misma que se prolongó hasta los 300
min. Con las construcciones [pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+)], se observó un
incremento en el número de células (determinadas como A600), en comparación
con el grupo de células testigo [pET30a(+)];el inicio de la fase estacionaria no se
estableció claramente en ambos casos. Las células continuaron con su
crecimiento prácticamente logarítmico con todas las concentraciones ensayadas
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
96
(1, 2, 5, 10 y 15 µg/mL). Al término de las doce horas de incubación, en presencia
de este antimicrobiano, se recuperaron células viables.
Figura 38. Efecto de diferentes concentraciones de penicilina G sobre el crecimiento de E. coli con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+). a) pET30a(+); b) pbp3-pET30a(+); c) Δpbp3-pET30a(+). Todos los cultivos se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG 1mM.
a)
b)
c)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
97
Figura 39. Efecto de diferentes concentraciones de aztreonam sobre el crecimiento de E. coli con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+). a) pET30a(+); b) pbp3-pET30a(+); c) Δpbp3-pET30a(+). Todos los cultivos se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG 1mM.
b)
c)
a)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
98
Cuando E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con el plásmido pET30a(+) se
creció en presencia de cefotaxima (Figura 40), se observó un crecimiento
logarítmico hasta aproximadamente 195-225 min; a partir de este punto se inició
un descenso en el crecimiento que se hizo mas evidente con las concentraciones
mas altas que se utilizaron de este antibiótico (5, 10 y 15 µg/mL); con las
concentraciones menores (1 y 3 µg/mL) se presentó una pequeña fase
estacionaria de aproximadamente 45 min para posteriormente, mostrar una
disminución en el crecimiento. No se recuperaron células viables al término del
período de incubación.
Al utilizar E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con la construcción pbp3-
pET30a(+), se observó un crecimiento logarítmico hasta los 240 min en todas las
concentraciones empleadas, para entrar a una fase estacionaria relativamente
estable que se mantuvo por aproximadamente 60 min con todas las
concentraciones ensayadas; posteriormente, se observó una muerte
prácticamente logarítmica al final del período de incubación. No se recuperaron
células viables después de los 720 min de haber iniciado el experimento.
El efecto de la cefotaxima sobre E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con la
construcción Δpbp3-pET30a(+) fue inesperado ya que al inicio del experimento, el
comportamiento de las células fue similar al observado con la construcción pbp3-
pET30a(+), pero al final del período de incubación no solo se observó un
incremento en el crecimiento, sino que fue posible la recuperación de células
viables al final del experimento a partir de todas las concentraciones ensayadas.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
99
Figura 40. Efecto de diferentes concentraciones de cefotaxima sobre el crecimiento de E. coli con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+). a) pET30a(+); b) pbp3-pET30a(+); c) Δpbp3-pET30a(+). Todos los cultivos se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG 1mM.
a)
b)
c)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
100
Inmunolocalización por microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la
proteína PBP3 de P. aeruginosa en células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-
RIL transformadas con el plásmido pET30a(+), y las construcciones pbp3-
pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
En la Figura 41 se muestra la ubicación de la PBP3 en las células de E. coli BL21
Codon Plus (DE3)-RIL transformadas con el plásmido pET30a(+) y las
construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
En la Figura 41 a y b, se muestra el resultado de la inducción del plásmido
pET30a(+). No se observa la presencia de la proteína PBP3 en ninguno de los
dos tiempos ensayados (0 y 60 min). Las células conservan su tamaño y se
dividen aparentemente de manera normal.
Cuando las células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL se transformaron
con la construcción pbp3-pET30a(+), mantuvieron su tamaño y se dividieron
normalmente antes de ser inducidas (tiempo 0 min) Figura 41c. Una imagen
diferente se observa cuando estas mismas células se indujeron con IPTG 1 mM
(Figura 41d), en donde se visualizó claramente la presencia de la PBP3 en la
región del septo de división celular y en los extremos de la célula, es decir en sus
polos, después de 60 min de la inducción.
En el caso de las mismas células pero ahora transformadas con la
construcción pbp3-pET30a(+), sin inducir (tiempo 0 min), no se observó ningún
cambio en la morfología celular (Figura 41e), pero 60 min después de la inducción
con IPTG 1 mM, se observó la presencia notable de la ΔPBP3, pero con una
ubicación completamente diferente a la mostrada anteriormente con la
construcción pbp3-pET30a(+); la ΔPBP3 se inmunolocalizó preferentemente en
toda la periferia del soma bacteriano y en ningún caso se situó únicamente en la
región septal ó en los polos celulares (Figura 41f).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
101
Figura 41. Micrografías (TEM) de células de E. coli transformadas con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+). Todos los cultivos se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG 1 mM. a y b) pET30 a(+); c y d) pbp3-pET30a(+); e y f) Δpbp3-pET30a(+); a,c y e) tiempo 0 min, cultivos sin inducir; b,d y f) tiempo 60 min, cultivos inducidos. a y c) 52,720X; b, d, e y f) 63,264X. Las proteínas se marcaron con los anticuerpos obtenidos en este trabajo. Las flechas señalan a la PBP3 y a la ΔPBP3. Barra = 1 µm.
a) b) c)
d) e) f)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
102
Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de células de E. coli BL21 Codon Plus
(DE3)-RIL transformadas e inducidas con el plásmido pET30a(+), y las
construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
En la Figura 42 se muestran los resultados obtenidos que a continuación se
describen con mas detalle.
Las células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformadas con el plásmido
pET30a(+) y sin inducir (tiempo 0 min), exhibieron una morfología típica de E. coli, es
decir mostraron ser bacilos cortos, con la longitud esperada para este microorganismo,
de aproximadamente 1-1.5 µm (Figura 42a). Estas células constituyeron el testigo del
experimento.
En la Figura 42b, se muestra a las mismas células pero ahora transformadas con
la construcción pbp3-pET30a(+), tiempo 0 min y sin inducir; la morfología se mantuvo
sin cambio y se observó que algunas células se encuentraban en proceso de división
aparentemente de manera normal. La imagen mostrada en la Figura 42c presenta a
las células que se transformaron con pbp3-pET30a(+), pero a los 60 min posteriores a
la inducción con IPTG 1 mM. La mayoría de las células mostró una morfología celular
clásica de E. coli pero algunas células empezaron a exhibir una longitud ligeramente
mayor y se apreció además la presencia de algunas células que se alargaron de tal
manera que formaron filamentos cortos.
La Figura 42d muestra a las mismas células transformadas con la construcción
Δpbp3-pET30a(+), tiempo 0 min y sin inducir. No se manifestó ningún cambio, la
morfología se mantuvo inalterada y la longitud no mostró variación alguna.
En la Figura 42e, se muestra a las mismas células transformadas con la
construcción Δpbp3-pET30a(+), despues de 60 min posteriores a la inducción con IPTG
1 mM. Se observó en este caso la presencia de células individuales mostrando de
manera general una mayor longitud a la esperada para E. coli y, algunas de ellas
formando filamentos mucho mas largos que los observados con la construcción pbp3-
pET30a(+). Practicamente todas las células de E. coli transformadas con esta
construcción mostraron una longitud mayor que la esperada para este microorganismo,
solo unas cuantas conservaron la morfología típica de esta bacteria.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
103
Figura 42. Micrografías (SEM) de células de E. coli transformadas con pET30a(+), pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+). Todos los cultivos se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG 1 mM. a) pET30a(+), tiempo 0 min, sin inducir; b) pbp3-pET30a(+), tiempo 0 min sin inducir; c) pbp3-pET30a(+), tiempo 60 min, inducida; d) Δpbp3-pET30 a(+), tiempo 0 min, sin inducir y e) Δpbp3-pET30a(+), tiempo 60 min, inducida . Barra = 1 µm.
a)
b) c)
d) e)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
104
Expresión del gen prc
Para llevar a cabo la co-expresión se indujo la expresión de los genes pbp3-
pET30 a (+) y prc-pFLAG-CTC en células de E.coli BL21Codon Plus(DE3)-RIL y
se dio seguimiento a este evento por microscopía óptica (Figura 44). Los
resultados de la expresión del gen pbp3 ya han sido previamente mostrados
(Figura 23). Para la observación de la proteína Prc, producto del gen prc, que se
ligó al vector pFLAG-CTC, se utilizó la tinción de Azul Brillante de Coomassie
(Figura 43a) y la técnica de Western blot con el anticuerpo monoclonal anti-FLAG
M2 de Sigma (Figura 43b).
En la Figura 43a se muestra la presencia de una banda de proteína de
aproximadamente 78.1 kDa que corresponde al peso esperado para el producto
de la expresión del gen prc. Las células transformadas con la construcción prc-
pFLAG-CTC, se incubaron a 37oC se indujeron con IPTG 1 mM y se tomaron
alícuotas a los tiempos, 0 min (células no inducidas), 30, 60, 90, 120 y 150 min
(células inducidas). En la Figura 43b se muestra el resultado obtenido por la
técnica de Inmunoblot para la misma proteína y en donde se muestra que el
anticuerpo solo reconoce a una proteína del tamaño esperado para Prc.
Figura 43. Sobre expresión del gen prc de P. aeruginosa en E. coli. a) Electroforesis en gel de poliacrilamida de la proteína Prc y b) Western blot de la proteína Prc de células de E. coli transformadas con prc-pFLAG-CTC, incubadas a 37oC. Carril 1, PM de BIORAD ; carril 2, células no inducidas; carril 3, células inducidas durante 30 min; Carril 4, células inducidas durante 60 min; carril 5, células inducidas durante 90 min; carril 6, células inducidas durante 120 min; carril 7, células inducidas durante 150 min. La inducción se hizo con IPTG 1 mM.
1 2 3 4 5 6 7
205 kDa 121 kDa
70 kDa
52.4 kDa
34.9 kDa 29.1 kDa
20.7 kDa
205 kDa 121 kDa 70 kDa
52.4 kDa
34.9 kDa 29.1 kDa 20.7 kDa
1 2 3 4 5 6 7
Prc (78.1 kDa)
Prc 78.1 kDa
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
105
Co-expresión de los genes prc y pbp3 de P. aeruginosa en E. coli.
En la Figura 44 se muestran los resultados obtenidos de la co-expresión de
los genes pbp3 y prc en células de E. coli BL 21 Codon Plus (DE3)-RIL
transformadas con las construcciones correspondientes [pbp3-pET30a(+) y prc-
pFLAG-CTC] incubadas a 37oC e inducidas con IPTG 1 mM.
El resultado de la células no inducidas que corresponde al tiempo 0 min
se observa en la Figura 44a, en donde E. coli mostró su morfología microscópica
característica que corresponde a un bacilo corto, Gram negativo que no se
agrupa y se describe como aislado.
Una vez que las células fueron inducidas, se tomaron muestras cada 30 min
hasta completar un total de 240 min. Las imágenes que a continuación se
presentan son representativas de los tiempos 30,60, 120, 180 y 240 min de
incubación.
En la Figura 44b, transcurridos 30 min posteriores a la inducción, las
células de E. coli tuvieron una apariencia normal, es decir, la morfología
microscópica fue la esperada para esta bacteria, aunque se empiezan a observar
algunos filamentos.
Al aumentar el tiempo de incubación, algunas células manifestaron de
nuevo un ligero incremento en su longitud, efecto que se puede observar en la
Figura 44d que corresponde a 120 min posteriores a la inducción. Un efecto
similar se apreció en la preparación correspondiente a los 180 min de incubación
(Figura 44e) en donde se manifestó de nuevo la presencia de algunas células
cuya longitud fue mayor que la observada en las células testigo, efecto que se
mantuvo incluso hasta los 240 min de incubación (44f).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
106
Figura 44. Micrografías de la co-expresión de E. coli transformada con pbp3-pET30a(+) y prc-pFLAG-CTC. Todos los cultivos se incubaron a 37oC y se indujeron con IPTG 1 mM. a) 0 min; b) 30 min; c) 60 min; d) 120 min; e) 180 min; f) 240 min. Las flechas señalan células que forman filamentos cortos. Las fotografías se tomaron con un aumento de 1000X .
a) b)
c) d)
e) f)
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
107
DISCUSIÓN
La forma celular en la mayoría de las eubacterias es mantenida por una
fuerte estructura externa de diseño extraordinario que permite su crecimiento en
prácticamente cualquier ambiente. Esta envoltura llamada sáculo de mureína o de
peptidoglicana es un biopolímero único constituido por cadenas de glicanas
entrecruzadas por pequeños péptidos, y podría compararse a una especie de
exoesqueleto que dota a la célula de una extraordinaria resistencia que le permite
tolerar la presión intracelular de varias atmósferas y además, como ya ha sido
mencionado, contribuye a mantener una forma celular específica (van Heijenoort,
1991, 1994; Höltje, 1998; Losick y Shapiro 1999; Nanninga, 1998, Pink y col.,2000;
Shockman y Barret.,1983).
La mureína se mantiene unida por medio de enlaces covalentes en dos y en
tres dimensiones resultando una estructura con características reticulares que la
hacen ideal para proteger la delicada membrana citoplásmica contra la turgencia
celular (Weidel y Pelzer, 1964).
La peptidoglicana es un heteropolímero de estructura y composición
característica que se asocia de manera particular y única a las paredes
bacterianas (Labischinski y Maidhof, 1994; Seidl y Schleifer, 1986, Ward, 1973).
La ruta biosintética que conduce a la formación de la mureína involucra tres
compartimentos celulares: el citoplasma, la membrana citoplasmática y el
periplasma. Las subunidades del biopolímero se sintetizan en el citoplasma como
precursores UDP activados, que son posteriormente translocados unidos a un
lípido a través de la membrana y finalmente insertados en el saco pre-existente de
mureína por las mureín sintetasas (Glauner y col., 1988; Matsuhashi, 1994; van
Heijenoort, 1994; Ghuysen, 1997; Höltje, 1998; Mengin-Lecreulx y col., 1982 y
1985).
La síntesis de una mureína entrecruzada involucra la formación de dos
tipos de enlaces covalentes: glucosídico y peptídico. Las transpeptidasas deben
de cooperar con las mureín transglicosilasas que catalizan la polimerización de los
precursores de las cadenas de glicanas. Es interesante observar que además de
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
108
las mureín transglicosilasas monofuncionales también existen las enzimas
bifuncionales que muestran tanto actividades de transpeptidación como de
transglicosilación, catalizando entonces ambas reacciones (Ghuysen, 1991,1994;
Georgopapadakou, 1993; Höltje y col., 1975; Höltje y Heidrich, 2001; van
Heijenoort y col., 2000; Koch, 1990ª, 2001; Spratt, 1975; Young, 2001).
La reacción de transpeptidación se ha analizado con gran detalle debido a
que es el blanco de los antibióticos β-lactámicos que son los agentes
antibacterianos más familiares (Tipper y col, 1965). Las enzimas que interactúan
con estos antibióticos se incluyen en tres grupos: las β-lactamasas, las PBPs de
alto peso molecular y las PBPs de bajo peso molecular. Las β-lactamasas son
enzimas de defensa que la bacteria sintetiza para proteger a sus PBPs del efecto
delétereo de la penicilina. Las PBPs de bajo peso molecular actúan como DD-
carboxipeptidasas y las de alto peso molecular clase A y B tienen dos dominios
funcionales que están fusionados y que operan de manera concertada (Alaedini y
Day., 1999; Bradford, 2001; Denome y col., 1999; Goffin y Ghuysen, 1998;
Ghuysen, 1994, 1997; Jacoby y col., 1991; Philippon y col., 1989; Romeis y col.,
1994; Vollmer y col., 2004).
Para favorecer el crecimiento y la división celular existen complejas redes
morfogenéticas que conducen al ensamble de la peptidoglicana permitiendo la
expansión de la membrana y la formación del septo previo a la división celular
(Alaedini y col., 1999; Ghuysen, 1997; Höltje, 1993, 1996ª, 1996b y 1998; Koch,
1990b, 2000; Koch y Doyle, 1985; Spratt, 1975; Wei y col., 2003).
La PBP3 (FtsI), motivo de nuestro estudio, es una proteína esencial que
participa en la formación del septo durante la división celular y su inactivación
selectiva hace que la célula crezca formando largos filamentos (Ghuysen, 1991).
Esta proteína junto con el resto de las PBPs son las responsables del ensamble,
mantenimiento, regulación y remodelación de la pared celular. Por esta razón, se
sabe que la presencia de esta proteína se encuentra ampliamente extendida en
un gran número de bacterias y que además está sumamente conservada (Goffin y
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
109
Ghuysen 1998), lo que implica su importancia pudiendo convertirse en un
importante blanco para la creación de nuevos antibióticos de amplio espectro.
Las PBPs son enzimas que catalizan los últimos pasos de la síntesis de la
peptidoglicana y se encuentran ancladas en la membrana citoplásmica con sus
sitios activos en el espacio periplásmico (Amaral y col., 1986; Denome y col.,
1999; Georgopapadakou y col., 1980; Massova y Mobashery, 1998).
El gen pbp3 de P. aeruginosa ya ha sido clonado pero no se llegó al
aislamiento ni a la purificación de la proteína PBP3 (Liao y Hancock 1995).
En el presente trabajo se logró la amplificación y expresión del gene pbp3
de Pseudomonas aeruginosa. El diseño de los iniciadores apropiados se facilitó
utilizando la información disponible en el banco de genes y en el “Pseudomonas
Genome Project”. Fue posible además predecir su estabilidad y su capacidad de
alineación con el DNA molde así como su estructura. Se incluyeron en los
iniciadores dos sitios de restricción, uno de ellos para la enzima NdeI y el otro para
XhoI. Esto se hizo para facilitar su incorporación al plásmido pET30a(+), que
actuó como vehículo.
Un factor determinante en la obtención de los productos amplificados fue la
pureza del DNA que se utilizó como molde, el DNA obtenido durante este trabajo
mostró un buen rendimiento y una calidad adecuada.
El aislamiento del DNA genómico utilizando bromuro de hexadecil trimetil
amonio (CTAB) mostró buenos resultados ya que se obtuvo un rendimiento alto de
DNA y con una mayor pureza que cuando se utilizó el reactivo DNAzol Reagent.
La mayoría de las técnicas descritas para la obtención de DNA cromosómico
bacteriano consisten de una lisis enzimática con lisozima seguida de una
incubación con proteasas inespecíficas y una serie de extracciones utilizando
fenol, cloroformo y alcohol isoamílico antes de precipitar a los ácidos nucleicos con
alcohol. Estos procedimientos efectivamente eliminan a las proteínas
contaminantes pero no son capaces de remover las grandes cantidades de
polisacáridos que una variedad de géneros bacterianos y entre estos
Pseudomonas son capaces de producir, y que pueden interferir, de manera
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
110
importante con las posteriores manipulaciones que incluyen el uso de enzimas de
restricción y de ligasas. En este método, la incubación con la proteinasa K es
seguido por la extracción con el CTAB, en donde este compuesto forma complejos
con los polisacáridos y con las proteínas residuales. Todas estas moléculas
contaminantes son efectivamente eliminadas con las posteriores emulsificaciones
y extracciones con cloroformo y alcohol isoamílico obteniéndose entonces un DNA
bastante puro.
El uso del DNAzol Reagent así como el método de Daniels resultaron
muy convenientes cuando se requirió obtener DNA genómico en poco tiempo ya
que las técnicas son mucho mas sencillas, la preparación de reactivos es mínima
y menos laboriosa que la extracción con CTAB. Los inconvenientes son que el
rendimiento es un poco menor y las manipulaciones deben llevarse a cabo en una
campana de extracción debido a la toxicidad tanto del DNAzol como del Tris-
Fenol.
El proyecto inicial de este trabajo contemplaba sólo la clonación y expresión
del gen pbp3 (ftsI) , pero durante su desarrollo, surgieron dos nuevas propuestas,
una de ellas fue la obtención de una proteína que no tuviese la marca de
polihistidinas que se incorpora a la proteína al utilizar el vector pET30a(+), ya que
en trabajos paralelos que se realizaban en el equipo de trabajo se había
observado cierta interferencia durante la determinación de la actividad de otras
PBPs utilizando penicilina radioactiva; la segunda propuesta, consistió en la
obtención de una proteína que no estuviera anclada a la membrana celular. Se
sabe que la PBP3 está unida a la membrana en su región N-terminal por medio de
un segmento hidrofóbico que tiene las características de un péptido señal. Se
analizó la posible presencia de hélices transmembranales (TMH) en esta proteína
utilizando el sitio http://www.ch.embnet.org/cgi-bin/TMPRED y se encontró sólo
una región. Para complementar esta información, se hizo también una
comparación con la secuencia aminoacídica de la PBP3 de E. coli en donde se
conocen con precisión los tres dominios que la constituyen: el módulo que se
ancla a la cara externa de la membrana (M1-A36), el módulo nPB (F37-S259) y el
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
111
módulo C-terminal PB (G260-V577) que se proyecta hacia el periplasma
(Fraipont y col., 1994; Goffin y col., 1996, 1998; Piette y col., 2004). Es interesante
observar que la PBP3 de P. aeruginosa tiene una homología 45% idéntica y 62%
similar a la PBP3 de E. coli. Tomando como base estos análisis, se diseñaron los
iniciadores adecuados para obtener un gen sin los primeros 28 codones de tal
manera que este gen denominado Δ1-28pbp3 al ser traducido generó una proteína
sin sitio de anclaje en la membrana citoplásmica, es decir se eliminaron los
primeros 28 aminoácidos de la región N-terminal. Esta proteína se acumuló
principalmente en el citoplasma. Este gen modificado, así como su producto se
denominaron Δpbp3 y ΔPBP3 respectivamente.
Para la amplificación de los genes pbp3, pbp3 sin histidinas terminales y
pbp3 de P. aeruginosa PAO1 por medio de la PCR se ensayaron varios
programas en el termociclador y se obtuvieron buenos resultados con alto
rendimiento de producto y pocos iniciadores dimerizados cuando se utilizó una
temperatura elevada (94oC-96oC) para la desnaturalización del DNA molde, esto
se hizo porque P. aeruginosa posee en su genoma un alto contenido de GC, cerca
del 66 % (Stanier,1960 y Palleroni, 1972).
Existen dos factores importantes que afectan la eficiencia en la
transferencia de material genético exógeno, uno de ellos concierne a la entrada
propiamente del DNA a la célula receptora y el otro se refiere a su permanencia y
estabilidad. La transformación es un fenómeno que ocurre con frecuencia de
manera natural en una gran variedad de géneros bacterianos y el término
competencia se refiere a la capacidad que tiene una célula de transportar DNA del
medio de cultivo a su interior (Provence y Curtiss, 1994).
En 1970 se reportó que el tratamiento de células de E. coli con CaCl2
seguido de una incubación en frío y un choque térmico resultaba en la
incorporación de DNA. Este descubrimiento ha llevado a una serie de técnicas
refinadas para inducir competencia en varios géneros bacterianos y permitir su
transformación con DNA plasmídico o cromosomal (Hanahan, 1983). En el
presente trabajo la obtención de células competentes fue crucial y de los dos
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
112
métodos ensayados resultó mas efectivo el de Daniels, 1999; el número de
células competentes que fueron transformadas se duplicó en comparación con las
células competentes obtenidas por el método tradicional. Es importante hacer
notar que para obtener un buen número de células competentes se deben
cosechar cuando se encuentran en la fase logarítmica temprana, es decir cuando
la A600 del cultivo es de aproximadamente 0.6 a 0.7.
La purificación del DNA plásmídico se realizó mediante tres métodos, dos
de ellos utilizados tradicionalmente que consumen mucho tiempo y reactivos y el
tercero de ellos que involucró el uso de “kits” comerciales tanto de Gibco como de
QIAGEN. Los plásmidos obtenidos por los tres métodos tenían la pureza esperada
para su posterior utilización pero la argumentación a favor del uso de los “kits”
tiene que ver con el volumen de trabajo y el tiempo. Se realizaron cientos de
extracciones de plásmidos y el trabajo ciertamente se facilitó empleando estos
sistemas comerciales.
Una vez corroborada la identidad de las construcciones se realizó la
inducción de las proteínas PBP3 y ΔPBP3. Se ensayaron diversas células como
E. coli BL21 (DE3)pLysS, E. coli BL21 (DE3) y E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL
y se modificaron varias condiciones como los medios de cultivo, la temperatura y
la concentración del inductor (IPTG). La utilización de las células E. coli BL21
Codon Plus (DE3)-RIL como vehículo de expresión fue importante ya que esta
cepa es capaz de producir copias extra de especies escasas de tRNA. En muchas
ocasiones la producción de proteínas heterólogas en E. coli se ve limitada por la
escasez de tRNA los cuales son más abundantes en el organismo original de
donde se derivan estas proteínas. El forzar altos niveles de expresión acaba con la
poza de estos pocos tRNA y la traducción se detiene. Esta cepa de E. coli tiene
copias extra de los genes que codifican para las especies de tRNA que reconocen
los codones para la arginina AGA y AGG, el codón para la isoleucina AUA y el
CUA que corresponde a la leucina. La disponibilidad de estos tRNA permite un
alto nivel de expresión de los genes recombinantes que se expresarían
pobremente en una cepa de E. coli BL21 convencional. Otro factor importante fue
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
113
el uso del medio conocido como Terrific Broth (TB) ya que cuando se ensayó la
expresión en medio LB y SB los niveles de proteína fueron bajos. El medio TB
tiene entre sus ingredientes una muy alta cantidad de extracto de levadura y por lo
tanto una elevada concentración de aminoácidos disponibles que se incorporarán
durante el activo proceso de traducción de la proteína. Finalmente la mejor
expresión se obtuvo incubando las células a 37oC y utilizando una concentración
de IPTG de 1mM.
Se sabe que el proceso de purificación de una proteína es importante para
lograr la caracterización de su función, su estructura y probablemente las posibles
interacciones que esta proteína establezca con otros componentes celulares.
Para lograr la adecuada purificación de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 y
además conservar su actividad se utilizó cromatografía de afinidad con un metal
inmovilizado (IMAC de QIAGEN). Esta interesante metodología se basa en la
presencia de una marca de poli-histidinas unida a la región C-terminal de la
proteína, que muestra una marcada afinidad hacia iones divalentes como el
Níquel y el Cobalto. En este trabajo se utilizó una resina con iones Ni
inmovilizados en un soporte en el que por afinidad se unieron de manera
específica las proteínas PBP3 y ΔPBP3 marcadas con una cola de 6-histidinas.
Como estas proteínas son los únicos componentes con esta marca de poli-
histidinas quedaron unidas a la columna mientras que todas las otras proteínas
pasaron a través de la columna. Posteriormente las proteínas se liberaron de la
columna por elución, adicionando imidazol que compite con la proteína marcada
con la cola de histidinas en la unión al níquel debido a que tiene una estructura
similar a la histidina. La PBP3 fue removida de la columna prácticamente en su
totalidad en la primera fracción del regulador de elución utilizando una
concentración de 400 mM de imidazol.
Para la purificación de la ΔPBP3 se siguió un protocolo ligeramente distinto,
se utilizó un regulador de elución con una concentración de imidazol de 250 mM
ya que esta proteína se encuentra en forma soluble y los resultados obtenidos
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
114
muestran la presencia de la proteína en las fracciones 1 y 2 de este regulador de
elución.
Para determinar la ubicación de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 se realizó un
fraccionamiento celular modificado del inicialmente propuesto por Osborn y
colaboradores, 1972 y que consiste en obtener diversos componentes celulares
mediante el uso de detergentes, reguladores, sonicación y centrifugación. Para
optimizar la purificación de estas proteínas se probaron los detergentes Tritón
X-100, N-Lauroylsarcosine y CHAPS a diferentes concentraciones. Las fracciones
obtenidas fueron periplasma, citoplasma, membrana externa, membrana
citoplásmica y envolturas completas. Se obtuvieron mejores resultados utilizando
N-Lauroylsarcosine al 1% que con Tritón X-100, también al 1%. Es conveniente
comentar que la mayoría de los estudios publicados sobre la purificación de las
PBPs mencionan el uso de Tritón X-100 que es un detergente no iónico como el
más efectivo (Botta y Park, 1981; Georgopapadakou y Liu, 1980). Pero Spratt
(1977) utilizó N-Lauroylsarcosine en uno de los trabajos clásicos sobre las
propiedades de las PBPs y los resultados obtenidos en nuestro trabajo lo
corroboran. Se incluyó también el uso de CHAPS que es un detergente biológico
no desnaturalizante obtenido a partir del ácido cólico, pero no se logró una
adecuada solubilización de la PBP3.
La información importante que brinda la técnica de fraccionamiento celular
es que permite definir con bastante precisión la ubicación de la proteína en una
determinada región de la célula.
La proteína PBP3 se sitúa primordialmente en las fracciones que
corresponden al citoplasma/periplasma y a la membrana citoplásmica, que es un
resultado esperado, puesto que esta proteína se encuentra anclada a la
membrana citoplásmica y se proyecta hacia el espacio periplásmico. Se hizo otro
ensayo con el producto del gen pbp3s (sin la marca de histidinas) que se
denominó PBP3s y su ubicación fue idéntica a la de la proteína PBP3, lo que
muestra que la presencia de la cola de poli-histidinas no altera la localización de
esta proteína en la célula.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
115
La proteína ΔPBP3, se manifestó con una mayor presencia en la fracción
que correspondió a citoplasma/periplasma y en menor proporción en la
membrana citoplásmica, efecto esperado debido a la eliminación de los primeros
28 aminoácidos que constituyen el sitio de anclaje de esta proteína a la membrana
citoplásmica.
Para observar la presencia de las proteínas tanto en las fracciones
celulares como en las fracciones de elución se emplearon los métodos
tradicionales de tinción utilizando azul brillante de Coomassie y la tinción de plata
que en función de su sensibilidad permitieron detectar a las proteínas PBP3,
PBP3s y ΔPBP3. Estos resultados fueron reforzados por el análisis de estas
proteínas por Western blot.
El kit comercial “Gel Code &xHis Protein Staining” de Pierce®, diseñado
específicamente para la observación de proteínas con una marca de poli-histidinas
reveló la presencia de la PBP3 en las mismas fracciones celulares que ya han
sido comentadas.
Para la cuantificación de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 se utilizó el método
del ácido bicinconínico y las concentraciones obtenidas fueron de 0.01 mg y 1.13
mg respectivamente por cada litro de medio de cultivo. Consideramos que se
obtuvo un buen rendimiento ya que la cuantificación directa del número total de
PBPs por célula en E. coli es de aproximadamente entre 2500-2780 moléculas
(Dougherty y col., 1996; Legaree y col, 2007a y Spratt, 1977), y de manera
particular, el número de las PBPs 1b, 2,3 y 4 obtenidas en medio LB es
virtualmente equimolar con aproximadamente 50-130 moléculas por célula.
Para definir la localización de la proteína PBP3 en el soma bacteriano se
utilizaron anticuerpos. Para lograr este objetivo se empleó un conejo Nueva
Zelanda, blanco, hembra de 3.0 a 3.5 Kg de peso y se diseñó un esquema de
inmunización largo con varios descansos intermedios y un estímulo intenso al final
con el fin de obtener una respuesta máxima y específica.
La inmunolocalización por microscopía electrónica de transmisión de las
proteínas PBP3 y ΔPBP3 se realizó con los anticuerpos purificados obtenidos en
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
116
este trabajo, la propuesta inicial en el uso de anticuerpos para ubicar estas
proteínas se basó principalmente en la sensibilidad y especificidad que se puede
lograr con su uso y los resultados así lo demostraron . Se utilizaron células de
E.coli BL21 Codon Plus(DE3)-RIL transformadas con los plásmidos pET30a(+)
que constituye el testigo y las construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-
pET30a(+).
Los resultados muestran que la localización de la PBP3 en el anillo septal
requiere de su anclaje en la membrana. Se sabe que el ensamble del septo de
división en las bacterias está mediado por varias proteínas que se localizan en el
sitio de división celular. Una de estas es la PBP3 que en E. coli posee un pequeño
dominio citoplásmico, un solo segmento que atraviesa la membrana y un largo
dominio periplásmico que posee la actividad de transpeptidasa involucrada en la
síntesis de la peptidoglicana septal. La proteína PBP3 se localiza en el sitio de
división celular durante las etapas tardías del crecimiento celular y durante todo el
tiempo de la formación del septo. La PBP3 se encuentra en el sitio de división
celular en aproximadamente del 40 al 50% de las células. Es interesante observar
que cuando la PBP3 se sobre-expresa también se ubica en los polos de la célula.
Algunos estudios de localización de la proteína PBP3 de E. coli realizados
por Weiss y colaboradores en 1999, utilizando PBP3-GFP, observaron el mismo
fenómeno y esta localización no esperada se debe quizá al exceso de PBP3 que
fue sintetizada, otra posible propuesta que podría considerarse para tratar de
explicar la presencia de la PBP3 en los polos de la célula es que los polos en
esencia son septos recientemente terminados. Probablemente la PBP3 ubicada en
esta zona tiene una actividad severamente limitada pues no se ha detectado
actividad biosintética de peptidoglicana en estos sitios (de Pedro y col., 1997;
Wientjes y Nanninga ,1989).
Se puede concluir, que la PBP3 se presentó consistentemente en dos sitios
celulares, en la región septal (aproximadamente en el 50% de las células) y en los
polos, en un 10-20% de las células, lo que concuerda con un estudio hecho en E.
coli por Weiss y col., en 1997.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
117
Es difícil detectar a la proteína PBP3 por su baja cantidad dentro de la
célula, como ya se ha mencionado, por lo que la obtención de señales fuertes de
la proteína PBP3 requiere de concentraciones adecuadas de anticuerpos
primarios y las evidencias mostradas en este trabajo lo determinan claramente.
Las imágenes obtenidas de la localización de la ΔPBP3 que posee un sitio
de anclaje modificado muestran una distribución homogénea en la región
periférica de la célula. Esta proteína es una enzima soluble en el citoplasma y en
el periplasma que como se demuestra mas adelante retiene su actividad catalítica
pero, probablemente no puede apoyar o soportar el proceso de división celular
porque es incapaz de localizarse en el sitio de división adecuado.
Existen varios ejemplos, la mayoría relacionados a la división celular en
donde la localización de una proteína depende de la ubicación inicial de otras
proteínas (Addinall y col., 1997b, Wang y col., 1998). Al menos dos proteínas que
se establecen en el sitio de división celular FtsA y ZipA lo hacen probablemente
uniéndose directamente a otra proteína, FtsZ que ya se encuentra ubicada en
este sitio. Pero ¿cómo es que FtsZ encuentra su ubicación en este sitio? No se
tiene una respuesta a esta pregunta (Hale y Boer, 2002., Ma y col., 1996).
El sitio de anclaje de la proteína PBP3 es muy importante para su
localización en el septo. ¿Cómo es que las proteínas de membrana involucradas
en el ensamble del septo se reclutan en el sitio de división celular? En algún
momento se propuso la existencia de un motivo compartido por todas estas
proteínas que probablemente participara como blanco, pero haciendo
comparaciones de las secuencias de esta proteínas no se ha podido encontrar
este posible motivo (Piette y col., 2004; Weiss y col., 1999; Wissel y col., 2005).
La localización de la PBP3 depende de la presencia previa de las proteínas
FtsZ, FtsA, ZipA, FtsK, FtsQ, FtsB, FtsL y FtsW (Buddelmeijer y Beckwith, 2002).
La presencia de FtsW para el reclutamiento de la PBP3 está particularmente bien
documentada y la localización de la PBP3 parece depender de un asa
periplásmica localizada entre los segmentos transmembranales 9 y 10 de la
proteína FtsW (Mercer y Weiss, 2002).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
118
Poco se sabe sobre los mecanismos por medio de los cuales las proteínas
bacterianas se localizan en sitios subcelulares discretos, tales como el septo o los
polos. La localización de la PBP3 en el anillo septal requiere de su anclaje en la
membrana, la interpretación más sencilla en este trabajo es que se requiere
necesariamente del fragmento transmembranal para su adecuado posicionamiento
en el septo de división celular. El segmento de la PBP3 incluido en la membrana
parece ser pequeño pero se asemeja a los dominios transmembranales de otras
proteínas bitópicas de la división celular cuya longitud varía de 20 (FtsL) a 28
residuos (FtsN). La proteína PBP2 que parece ser la transpeptidasa primaria (Den
Blaauwen y col., 2003; Denome y col., 1999; Goffin y Ghuysen, 1998; Legaree y
col., 2007b) involucrada en el alargamiento, tiene aparentemente un dominio
transmembranal de 25 aminoácidos (Asoh y col., 1986), estas observaciones
parecen sugerir que la longitud del dominio transmembranal podría ser importante.
Pero, ¿Por cual mecanismo este pequeño fragmento direcciona a la proteína hacia
el septo de división?, una de las propuestas es que quizá la membrana
citoplásmica se adelgaza en el sitio de división celular, y en este caso, este
pequeño dominio transmembranal podría funcionar directamente como una señal
de localización; el reclutamiento de la proteína PBP3 a este sitio sería dependiente
de la alteración de la membrana inducida por otras proteínas que podrían
anteceder a la PBP3 en el sitio de la división celular. Otra posible explicación es
que el acomodo de este pequeño segmento en la bicapa de lípidos de la
membrana citoplásmica obligue al dominio periplásmico a ubicarse en una
orientación o posición precisa que sería necesaria para su adecuado ensamble en
un complejo multiproteico. Höltje, 1998, tiene evidencias que apoyan la existencia
de este complejo enzimático que involucra a la PBP3 y a muchas otras enzimas
implicadas en el metabolismo de la peptidoglicana.
Las proteínas de la división celular que residen primariamente en el
citoplasma (FtsZ, FtsA y ZipA) preceden en su ubicación final en el septo de
división celular a aquellas que residen primariamente en el periplasma (FtsQ, FtsL,
FtsI y FtsN). La proteína PBP3 tiene además un dominio de función desconocida
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
119
y se ha sugerido que este podría ser el sitio de interacción con otras proteínas de
la división celular.
¿En donde se generan las señales que determinan el proceso de división
celular? ¿En el citoplasma o en la envoltura celular? Todas estas preguntan
permanecen sin respuestas definitivas.
La división celular en E. coli requiere de aproximadamente una docena de
proteínas las que se localizan en la región media de la célula en donde dirigen el
ensamble del septo (Vicente y col., 2006). La mayoría de las proteínas que
intervienen en este proceso se denominan Fts por “filamentation temperature
sensitive”, ya que si cualquiera de estas proteínas se inactiva, las células crecen
formando largos filamentos que finalmente se lisan, por lo que el bloqueo de la
división celular, es letal. Sin embargo, después de la inhibición de la división
celular y durante varias generaciones, los únicos efectos obvios son morfológicos,
ya que la velocidad de crecimiento (determinada como incremento de masa), la
replicación de DNA y la segregación de los cromosomas aparentemente continúan
como si nada hubiese sucedido (Arends y Weiss, 2004).
Varios estudios realizados sobre la localización de las diversas proteínas en
los filamentos que se forman después de la inactivación de algunas de estas
proteínas de división nos muestran que estas proteínas se ubican en la zona
media de la célula en un orden definido a través de un reclutamiento secuencial;
en esta complicada jerarquía, la PBP3 es una de las últimas proteínas reclutadas.
Su localización depende de la presencia inicial de la proteína FtsZ, una abundante
GTPasa semejante a la tubulina que forma un anillo contráctil en la cara interna de
la membrana citoplásmica. Las proteínas FtsA, ZipA y ZapA (Errington y col.,
2003) se unen directamente al anillo Z y posteriormente se incorporan FtsEx,
FtsK, FtsQ, FtsL/YbgQ (probablemente un heterodímero), FtsW, FtsI, FtsN y AmiC
en este orden preciso. Este esquema sugiere que la PBP3 (FtsI) se une a todas
las proteínas anteriores en una serie de interacciones en cascada, involucradas
todas ellas en el ensamble de este complejo proteico multienzimático. La proteína
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
120
FtsW parece ser la directamente responsable de reclutar a la PBP3 al sitio de
división celular (Mercer y Weiss, 2002).
Una vez expuesta la ubicación de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 en el
soma bacteriano utilizando microscopía electrónica de transmisión, se realizó la
observación de las mismas células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL
inducidas con el plásmido pET30a(+) que constituyó el testigo y las construcciones
pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+) pero empleando ahora microscopía
electrónica de barrido. Los resultados mostraron que la sobre-expresión tanto de
la PBP3 como de la proteína ΔPBP3 inducen un aumento en la longitud de la
célula, observando que este incremento fue mayor con la proteína ΔPBP3; en
este caso es posible la observación de filamentos largos que están revelando la
incapacidad de la célula para dividirse.
La explicación en general para este fenómeno es que, debido a la
manipulación genética en estas células se está sobre-expresando solo una de las
muchas enzimas que participan en el hipotético complejo multienzimático
propuesto por Höltje, 1998 y al no existir en cantidades apropiadas las muchas
otras enzimas participantes, la célula es incapaz de formar el septo de división
celular. Un efecto similar se observa cuando se elimina a la PBP3, las células
tienden a crecer formando largos filamentos. Como puede observarse en la
Figura 42e, la longitud de los filamentos es mucho mayor en función del tiempo,
en las células transformadas con Δpbp3-pET30a(+), la posible explicación es que
además de la excesiva presencia de la proteína ΔPBP3, ésta no se ubica en una
posición definida, sino que se encuentra distribuida en toda la periferia de la
célula, lo que impide la formación del septo en una determinada región del soma
bacteriano, motivando entonces la interrupción del proceso normal de la división
celular, pero no el crecimiento.
La división celular incluye varias etapas secuenciales: identificación del sitio
correcto para la formación del septo, la diferenciación de este sitio en preparación
para el evento de la división, la elaboración del septo de división con la
coordinación de la invaginación de las cubiertas celulares. En la última década, se
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
121
ha estudiado profusamente la división celular bacteriana y se ha revelado que las
proteínas involucradas se ensamblan en el anillo citocinético FtsZ. Miguel de
Pedro y colaboradores (1997, 2003a, 2003b) determinaron en células de E. coli
los patrones localizados de síntesis de mureína en células normales y en células
bloqueadas en diferentes etapas de la diferenciación del sitio de división celular y
las evidencias mostraron con precisión la biosíntesis de mureína en los sitios de la
división celular. La mureína pre-septal persiste en estas zonas por muchas
generaciones, probablemente de manera permanente. Sorprendentemente, de
Pedro también observó que las zonas de síntesis de mureína perfectamente
delimitadas en los sitios de división celular se formaban aun en ausencia de las
proteínas requeridas para el crecimiento del septo de división. Esto se realizó
inactivando a la proteína PBP3, lo que condujo a la formación de largos filamentos
aseptados.
En general, las proteínas deben encontrarse y posicionarse en sitios
definidos en las bacterias, ya que esta delicada especificidad es determinante
para la regulación de la replicación del DNA, la segregación de los cromosomas, la
división celular, la diferenciación y la quimiotaxis.
Durante el desarrollo del proyecto un objetivo importante fue manifestar
que tanto la proteína PBP3 como la ΔPBP3 sobre-expresada conservaron su
actividad. Existen varios métodos in vitro que se utilizan para lograr este objetivo.
En este trabajo se utilizaron dos. El primero de ellos consistió en el empleo de un
producto comercial llamado Bocillin FL de Molecular Probes Inc que consiste en
un derivado de la penicilina que fluoresce a 290 nm y puede ser fácilmente
visualizado con luz ultravioleta, lo que brindó una ventaja muy importante con
respecto al método tradicional que se emplea para determinar la actividad de las
PBPs. Es un reactivo relativamente nuevo, sensible, rápido y no radioactivo capaz
de reaccionar con las PBPs. Los resultados obtenidos con Bocillin FL mostraron
que la PBP3 se encuentra principalmente en la fracción que corresponde a la
membrana citoplásmica y la ΔPBP3 se encuentra de manera importante en el
citoplasma. La ventaja que presenta la utilización de este producto con respecto
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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al método tradicional, que consiste en la utilización de [fenil-4(n)-3H]
Bencilpenicilina, es que los resultados con Bocillin FL, se pueden observar casi
de manera inmediata y no es necesario esperar de 4 a 6 semanas para revelar la
fluorografía, pero lo que parece quizá mas importante es el evitar trabajar con
materiales radioactivos que implican siempre un riesgo para el usuario.
El segundo método utilizado fue el tradicional que involucra el uso de [fenil-
4(n)-3H] bencilpenicilina que además es el método histórico que se utilizó para
demostrar por vez primera la existencia de las PBPs (Spratt, 1975, 1977). Las
PBPs funcionales y activas se unen covalentemente a la penicilina. El resultado de
la fluorografía así lo demuestra, se ensayó tanto la PBP3 como la ΔPBP3.
Un método in vivo que permite establecer el posible efecto en la eliminación
o el incremento de las PBPs consiste en evaluar el resultado de enfrentar a células
genéticamente modificadas con algún β-lactámico en particular dado que se
conoce la afinidad distinta que presentan algunas PBPs a estos antibióticos
(Haenni y col., 2010; Kosowska-Shick y col.,2010; Sarkar y col., 2010). La proteína
PBP3 es sensible a algunos antibióticos β-lactámicos como aztreonam,
ceftazidima, cefotaxima, cefsulodina y piperacilina (Godfrey col., 1981).
En el curso de este trabajo se determinó el efecto de tres antibióticos β-
lactámicos sobre el crecimiento de células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL
transformadas e inducidas con el plásmido pET30a(+) que actuó como testigo y
las construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+).
Los antibióticos β-lactámicos empleados en este ensayo fueron la penicilina
G, también conocida como bencilpenicilina que históricamente fue el primer
antibiótico utilizado ampliamente en medicina, aztreonam que es un
monobactámico y una cefalosporina de tercera generación llamada cefotaxima.
Los resultados obtenidos con la penicilina G nos muestran que las células
de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con el plásmido pET30a(+) y las
construcciones pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+) fueron sensibles a las
concentraciones de 100, 150 y 300 µg/mL del antibiótico y al término del período
de incubación (720 minutos) se observó la declinación del crecimiento y la muerte
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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celular, pero con las concentraciones menores ( 5 y 10 µg) se recuperaron células
viables al término de la incubación. Existen estudios sobre el efecto que tiene la
penicilina G sobre diversas cepas de E. coli y la concentración mínima inhibitoria
(CMI) con este antibiótico varía entre 25-64 µg/mL (Neu, 1983). Este resultado
coincide con el comportamiento observado en el presente estudio.
El aztreonam no tuvo prácticamente efecto inhibitorio sobre el crecimiento
de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL transformada con las construcciones pbp3-
pET30a(+) y Δpbp3-pET30a(+). El crecimiento no sólo se mantuvo estable sino
que aumentó en función del tiempo, ninguna de las concentraciones utilizadas
(1,3,5,10 y 15 µg/mL) provocó la muerte celular. Aztreonam al contrario de la
mayoría de los antibióticos β-lactámicos, no induce actividad de β-lactamasas y su
estructura molecular le confiere un alto grado de resistencia a la hidrólisis por
estas enzimas. La CMI para E. coli ATCC 25922 es de 0.06-0.25 µg/mL y para P.
aeruginosa ATCC 27853 es de 4-32 µg/mL (Giamarellou y col., 1984). Los
resultados obtenidos muestran en todos los casos resistencia al efecto de este
antibiótico incluso a la concentración más alta utilizada (15 µg/mL). Este
antibiótico es el único β-lactámico monocíclico sintético, aislado originalmente de
Chromobacterium violaceum. Es un bactericida resistente a las β-lactamasas
generadas por las bacterias Gram negativas y exhibe un amplio espectro de
acción. Se utiliza comúnmente en el área médica frente a las infecciones
causadas por P. aeruginosa pero su amplio espectro también abarca a las
enterobacterias de importancia clínica.
Cuando se ensayó la cefotaxima sobre las células de E. coli BL21 Codon
Plus (DE3)-RIL con el plásmido pET30a(+) y con la construcción pbp3- pET30a(+)
el efecto fue deletéreo, que se evidenció sobre todo con las concentraciones mas
altas utilizadas (5, 10 y 15 µg/mL.). Con las concentraciones menores (1 y 3
µg/mL) se presentó una pequeña fase estacionaria y posteriormente se observó
una disminución en el crecimiento. No se recuperaron células viables después de
los 720 min de haber iniciado el experimento.
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El efecto de este antibiótico sobre E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL con
la construcción Δpbp3-pET30a(+) fue muy interesante, pues al inicio el
comportamiento fue similar al observado con la construcción pbp3-pET30a(+),
pero al final del periodo de incubación no sólo se observó un incremento en el
crecimiento sino que se recuperaron células viables en todas las concentraciones
ensayadas.
La cefotaxima se encuentra incluida junto con la ceftazidima, cefperamida y
cefsulodina como uno de los anti-pseudomonadales más importantes de la tercera
generación de cefalosporinas. Tiene un amplio espectro de acción y es un potente
inhibidor de las β-lactamasas. Tiene afinidad por la PBP1b y la PBP3. Las CMI
para E. coli y para P. aeruginosa son de 0.06-0.25 µg/mL y 4-16 µg/mL
respectivamente (Matsuyoshi y col., 1980).
La propuesta general que surge de estos hallazgos es que tanto la PBP3
como de ΔPBP3 sobre-expresadas, participan activamente uniéndose al
antibiótico e inactivándolo, pero como existe un exceso de estas proteínas tanto
en el espacio periplásmico (PBP3) como en el citoplasma (ΔPBP3), es posible la
continuación del crecimiento bacteriano. Este efecto es más notable con la
ΔPBP3.
Se ha reportado en aislados clínicos de P. aeruginosa que la resistencia a
los antibióticos β-lactámicos (no mediada por las β-lactamasas) está asociada con
una reducción de la PBP3 (Godfrey y col., 1981)
Los experimentos realizados en el curso de esta investigación constituyen
una determinación indirecta del efecto que puede presentar la sobre-expresión de
una de las tantas PBPs que existen en las bacterias, pero las evidencias muestran
amplias posibilidades para continuar con este estudio.
Durante el curso del trabajo y al revisar la bibliografía concerniente a la
proteína PBP3 encontramos la posibilidad de que ésta fuera modificada por otra
proteína llamada Prc (Hara y col., 1991).
Se sabe que muchas proteínas cuyo destino es una región
extracitoplásmica se sintetizan como precursores que posteriormente son
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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procesados a formas maduras por proteólisis de sus péptidos señal durante su
paso a través de la membrana citoplásmica. La PBP3 de E. coli es una proteína
que se encuentra anclada a la membrana por su región N-terminal (Figura 10) y
el resto de la proteína se proyecta hacia el espacio periplásmico. Esta proteína
está codificada por el gen ftsI y su producto primario tiene un PM de 63.8 kDa y es
aparentemente procesada a su forma madura a una forma con mayor movilidad
electroforética que corresponde a aproximadamente 60 kDa. Hara y col., 1991,
revelaron que el evento responsable de la maduración era la eliminación de once
residuos en la región C-terminal de la proteína. La enzima responsable es una
proteasa periplásmica denominada Prc o también conocida como Tsp. En el
caso de P. aeruginosa se realizó la búsqueda en la base de datos de Gene Bank y
se encontró un homólogo de la proteína Prc definida también como una proteasa
periplásmica específica de 698 aa con un PM de 78.1 kDa cuya función es
aparentemente el procesamiento de la proteína PBP3.
Se decidió entonces explorar esta nueva posibilidad clonando y expresando
el gen prc de P. aeruginosa PAO1 utilizando como vector al plásmido pFLAG-
CTC. Posteriormente, células de E. coli BL21 Codon plus (DE3)-RIL con la
construcción pbp3-pET30a(+) se transformaron con la construcción prc-pFLAG-
CTC para inducir su co-expresión. Se dio seguimiento a este proceso por
microscopía óptica y la producción de las proteínas PBP3 y Prc se determinó por
análisis en geles de poliacrilamida y WB.
Las microfotografías muestran al inicio del experimento (tiempo cero),
células de E. coli BL21 Codon Plus (DE3)-RIL de longitud normal. Estas células
poseen los dos plásmidos pero no fueron inducidas.
Las imágenes posteriores que corresponden a las mismas células inducidas
con IPTG manifiestan en función del tiempo, (120, 150, 180, 210 y 240 min) la
presencia de células un poco mas alargadas y algunas de ellas formando
filamentos, pero es importante hacer notar que cuando las células solo tienen la
construcción pbp3-pET30, la cantidad de células en filamentos que se presenta es
mayor (imágenes no mostradas).
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
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Es posible con estos hallazgos sugerir que al co-expresar estos dos genes,
aumenta relativamente la eficiencia de una PBP3 madura que posiblemente
participe más activamente en la formación del septo de división celular. Hasta
donde sabemos, estos resultados constituyen estudios preliminares inéditos de la
proteína Prc de P. aeruginosa que no han sido aún abordados por otros equipos
de trabajo.
La variación en el grado de co-expresión depende de la cercanía entre los
genes de una red metabólica. La co-expresión es mas intensa entre genes
adyacentes y decrece en función de la distancia. Los genes que codifican para la
PBP3 y otras seis proteínas involucradas en el ciclo celular residen en el cluster de
división y pared celular (dcw) que se encuentra en la región 2-min del cromosoma
(Vicente y Errington 1996) y el gen prc se localiza en la región 40.4 min del
cromosoma (Hara y col., 1991). El gen prc de P. aeruginosa PAO1 tiene una
homología del 58% con el mismo gen de E. coli. Los productos de ambos genes
tienen actividad de proteasas carboxil terminales y se ha propuesto una activa
participación en la maduración de la proteína PBP3. Tanto la proteína PBP3 como
la proteína producto del gen prc se encuentran en el periplasma y es probable que
el procesamiento suceda en este sitio.
En conclusión, en este estudio se demostró que la PBP3 de P. aeruginosa
se ubica principalmente en el septo de división celular; cuando se estimuló la
sobre-expresión de la PBP3, ésta se ubicó en sitios extra-septales e indujo la
formación de filamentos y células de mayor longitud.
La eliminación del segmento transmembranal de la PBP3, alteró su sitio de
anclaje en la membrana citoplásmica, lo que evitó su posible reclutamiento en el
septo de la división celular.
Y finalmente, en este trabajo se logró demostrar que la sobre-expresión de
una de las varias PBPs que participan en la síntesis de la pared celular es capaz
de modificar la resistencia a tres antibióticos β-lactámicos probados en este
estudio. Dicha resistencia se incrementó con la versión soluble de la PBP3.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de
Pseudomonas aeruginosa PAO1
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CONCLUSIONES
1.-Se clonaron y sobre-expresaron las proteínas PBP3 y ΔPBP3 de
Pseudomonas aeruginosa en forma activa y soluble, lo que facilitó su análisis
y caracterización.
2.-La presencia de una cola de histidinas terminales permitió la purificación de
las proteínas PBP3 y ΔPBP3 por cromatografía de afinidad; esta fusión no
alteró su capacidad de unirse a la penicilina conservando su actividad
enzimática. Además, se facilitó el uso de estas proteínas en técnicas
inmunológicas para su localización en el soma bacteriano.
3.- La proteína PBP3 de P. aeruginosa se localizó en el septo de división
celular durante la formación del septo. Este hallazgo sugiere que esta PBP,
puede estar asociada al divisoma de P. aeruginosa.
4.- La alteración del sitio de anclaje de la proteína ΔPBP3 evita su
reclutamiento en el septo de división celular.
5.-La sobre-expresión de la proteína PBP3 estimula su ubicación tanto en el
septo de división como en sitios extra-septales
6.-La sobre-expresión de las proteínas PBP3 y ΔPBP3 inhiben la división
celular e inducen la formación de células de mayor longitud y filamentos. La
ΔPBP3 promueve la formación de filamentos con mayor longitud y en mayor
número.
7.-La sobre-expresión de la proteína PBP3 aumenta la resistencia de
Escherichia coli transformada con la construcción pbp3-pET30a(+) y Δpbp3-
PET30a(+) a los antibióticos β-lactámicos penicilina G, Aztreonam y
Cefotaxima.
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Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
aeruginosa PAO1
PERSPECTIVAS
Poco se sabe a nivel molecular como es que se forman y organizan
los complejos proteicos que participan en el crecimiento y la división
celular. Se ha sugerido que las PBPs multimodulares clase B
interactúan vía sus módulos nPB con otros componentes en estos
complejos. Los resultados de estos estudios podrían proveer de
evidencia experimental para esta propuesta ya que las asociaciones
con el módulo nPB podrían influir en los cambios morfológicos que
se observan cuando se sobre produce la PBP3; por lo tanto, se
podría proponer:
1.- Diseñar y obtener mutantes sitio específicas del gen ftsI (pbp3)
de P. aeruginosa PAO1 en E. coli, utilizando un casete de
gentamicina.
1a.-Insertar el casete de gentamicina en la región PBS del gen
ftsI (pbp3) de P. aeruginosa.
1b.- Insertar el casete de gentamicina en la región NPBS del
gen ftsI (pbp3) de P. aeruginosa.
2.-Diseñar y obtener mutantes sitio específicas del gen prc de P.
aeruginosa PAO1 en E. coli, utilizando un casete de gentamicina.
3.-Obtener mutantes cromosomales del gen ftsI (pbp3) de P.
aeruginosa PAO1.
4.-Hacer ensayos de sensibilidad y/o resistencia a diversos
antibióticos β-lactámicos con las mutantes del gen ftsI (pbp3) de P.
aeruginosa PAO1.
Clonación, expresión, purificación e inmunolocalización de la proteína PBP3 de Pseudomonas
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ARTICLE IN PRESS
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Protein Expression and Purification
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Production and purification of the penicillin-binding protein 3 fromPseudomonas aeruginosa
Sandra Ruiloba de León 1, Kathy Daniels, Anthony J. Clarke *
Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada N1G 2W1
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history:Received 24 March 2010and in revised form 30 April 2010Available online xxxx
Keywords:Pseudomonas aeruginosaPenicillin-binding proteinPBP 3Protein productionLocalization
1046-5928/$ - see front matter � 2010 Elsevier Inc. Adoi:10.1016/j.pep.2010.05.005
* Corresponding author. Fax: +1 519 837 1802.E-mail address: [email protected] (A.J. Clarke).
1 Present address: Departamento de Microbiologia,Biologicas, Instituto Politecnico Nacional, ProlongacionColonia Santo Tomas, CP 11340, Mexico.
2 Abbreviations used: Amp, ampicillin; HMW, high mmycin; LMW, low molecular weight; n-PB, non-penibinding; PBP, penicillin-binding protein; TEM, transmi
Please cite this article in press as: S.R. de León eExpr. Purif. (2010), doi:10.1016/j.pep.2010.05.0
The penicillin-binding proteins (PBPs) are peripheral membrane enzymes that catalyze the final steps forthe biosynthesis of the essential bacterial cell wall heteropolymer peptidoglycan. Bacteria produce anumber and variety of PBPs which are classified as either high molecular weight or low molecular weightPBPs. The high molecular weight PBPs are multimodular being comprised of an N-terminal membraneanchor followed by a non-pencillin binding domain and a C-terminal penicillin-binding domain. The pen-icillin-binding domain functions as a serine-acyl transpeptidase to catalyze the crosslinking of neighbor-ing glycan strands within the peptidoglycan sacculus. PBP 3 from Escherichia coli has been studiedextensively and it has been shown to be responsible for the synthesis of peptidoglycan during the divisionand septation of the cells. The opportunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa produces a similarcompliment of PBPs to E. coli, but differences in their organization and function have been noted. Toinvestigate these differences further, appropriate quantities of each of the P. aeruginosa PBPs are requiredin forms amenable for study both in vivo and in vitro. Herein, we describe the cloning and expression ofthe ftsI gene encoding PBP 3from P. aeruginosa. The PBP was engineered in soluble form to facilitate itsstudy in vitro and with a hexa-His tag to permit its facile purification by affinity chromatography. Therecombinant proteins were demonstrated to bind penicillin and these forms of the PBPs were shownto be useful in studying their localization within their host cells by immunogold transmission electronmicroscopy.
� 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.
Introduction
Peptidoglycan (murein), the major constituent of the bacterialcell wall, is a heteropolymer of b-1,4-linked N-acetylglucosaminyland N-acetylmuramoyl residues with attached stem peptides. Thestem peptides associated with neighboring glycan strands cross-link together thus forming a covalently closed complex (sacculus)that surrounds the entire cell. This peptidoglycan sacculus isresponsible for the maintenance of the structural integrity of thecell by withstanding its internal turgor pressure. The biosynthesisof peptidoglycan is therefore essential to the cell. Given this, to-gether with the fact that peptidoglycan is unique to bacteria, theenzymes involved its biosynthesis are effective targets for antibiot-ics (recently reviewed in [1–4]). One such group of enzymes are thepenicillin-binding proteins (PBPs),2 peripheral membrane enzymes
ll rights reserved.
Escuela Nacional de Cienciasde Carpio y Plan de Ayala S/N,
olecular weight; Kan, kana-cillin-binding; PB, penicillin-ssion electron microscopy.
t al., Production and purificatio05
responsible for the final steps of peptidoglycan synthesis withinthe periplasm.
The PBPs belong to the acyl-serine transferase family of en-zymes because they function either as transpeptidases to catalyzethe crosslinking of neighboring stem peptides within the peptido-glycan sacculus, or as carboxypeptidases to remove the terminalD-Ala residue from the stem peptides. The latter activity controlsthe extent of crosslinking by precluding the use of the truncatedpeptide as a crosslink donor. The PBPs are broadly classifiedaccording to their molecular size as either high molecular weight(HMW) or low molecular weight (LMW) PBPs [5]. The proteins ofboth groups are localized to the outer leaflet of the cytoplasmicmembrane, and they all possess a penicillin-binding (PB) domainthat catalyzes the acyl-serine transferase activity. The HMW-PBPspossess an additional N-terminal, non-penicillin-binding (n-PB)domain which is anchored to the cytoplasmic membrane via anon-cleavable signal-sequence peptide. The n-PB domain of theclass A HMW-PBPs catalyzes the transglycosylation of bactopre-nol-linked peptidoglycan precursors into the growing sacculusthus making these proteins both multimodular and bi-functional.The class B HMW-PBPs also possess an N-terminal n-PB domain,but its function remains unknown. There is some evidence tosuggest that the n-PB domain of these proteins directs the proper
n of the penicillin-binding protein 3 from Pseudomonas aeruginosa, Protein
2 S.R. de León et al. / Protein Expression and Purification xxx (2010) xxx–xxx
ARTICLE IN PRESS
folding of the C-terminal PB domain [6] and it may also be involvedin protein–protein interactions [7–9].
Thirteen distinct PBPs have been identified in Escherichia coli;three class A (PBPs 1a, 1b, and 1c) and two class B (PBPs 2 and 3)HMW-PBPs, and eight LMW-PBPs (PBPs 4, 5, 6, 7, and 8, DacD,AmpC, and AmpH) [10,11]. Inhibition experiments with cepha-lexin, a b-lactam with specificity for PBP 3 (reviewed in [10]),and deletion studies targeting the gene encoding PBP 3, ftsI, haveshown that cells do not divide but instead grow as enlongated rodsin the absence of this protein’s activity. Hence, PBP 3 is thought tofunction specifically during cell division in this bacterium.
Based on apparent molecular masses, an early study suggestedthat Pseudomonas aeruginosa produces six PBPs, homologs of E. coliPBPs 1a, 1b, 2, 3, 4, and 5 [12]. In subsequent studies, the genesencoding each of these, except for PBP 4, have been cloned and ex-pressed in E. coli [9,13–16]. In addition, a second form of PBP 3,named 3� was discovered [17], and the product of pbpG wasshown to be a homolog of E. coli PBP 7, a DD-endopeptidase [18].Nothing else had been reported on these proteins until we initiatedour investigations on PBP 2 from this important opportunistic hu-man pathogen. Thus, we found that, like E. coli, PBP 2 in P. aerugin-osa is responsible for the rod-shape morphology of the cells [9].Unlike E. coli, however, cells lacking an active PBP 2 remain viablesuggesting that differences exist in the organization of the peptido-glycan biosynthetic machinery between these two bacteria. Toinvestigate these differences further, appropriate quantities of eachof the P. aeruginosa PBPs are required in forms amenable for studyboth in vivo and in vitro.
Herein, we describe the cloning and expression of the ftsI geneencoding PBP 3 from P. aeruginosa. The PBP was engineered insoluble form to facilitate its study in vitro and with a hexa-His tagto permit both its facile purification by affinity chromatographyand its detection by immunogold transmission electron microscopy(TEM).
Materials and methods
Chemicals and reagents
DNase I, RNase A, pronase, Expand Long polymerase, IPTG, andEDTA-free protease inhibitor tablets were purchased from RocheMolecular Biochemicals (Laval, PQ, Canada). Molecular biology kitsand Ni2+–NTA-agarose were obtained from Qiagen (Valencia, CA).T4 DNA ligase and restriction enzymes were from New EnglandBiolabs (Mississauga, ON). Fisher Scientific (Nepean, ON, Canada)provided acrylamide, glycerol, and Luria–Bertani (LB) growth med-ium and unless otherwise stated, all other growth media andchemicals were from Difco Laboratories (Detroit, MI) and SigmaChemical Co. (St. Louis, MO), respectively.
Table 1Bacterial strains and plasmids used in this study.
Strain or plasmid Genotype or relevant characteristic
StrainsE. coli BL21[kDE3]-RIL F� ompT hsdSB (rB
� mB�) dcm gal(kDE
E. coli DH5a K-12 /80d lacZDM15 endA1 hsdR17 (rD(lacZYA–argF) U169 F�
P. aeruginosa PAO1 Serotype 05; A+ B+
PlasmidspGEM-T PCR product cloning vector; AmpR
pET30a(+) IPTG inducible expression vector; KanpACSR-1 pET30a(+) derivative containing P. aer
fragment encoding full-length PBP 3;pACSR-13 pET30a(+) derivative containing trunc
NdeI/HinDIII fragment encoding PBP 3acid residue leader sequence and mem
Please cite this article in press as: S.R. de León et al., Production and purificatioExpr. Purif. (2010), doi:10.1016/j.pep.2010.05.005
Bacterial strains and growth
The sources of plasmids and bacterial strains used in this study,together with their genotypic description, are listed in Table 1. Cul-tures of E. coli were routinely grown in Luria–Bertani (LB) broth (1%tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) at 37 �C with agitation,supplemented with 50 lg/mL kanamycin sulfate (Kan) in the caseof strains harboring pET30a(+). For over-expression of clonedgenes, cultures were grown in rich media containing 3.2% tryptone,2% yeast extract and 1% NaCl.
Cloning and expression of P. aeruginosa ftsI encoding PBP 3 in E. coli
All PCR reactions used to amplify DNA were performed usingthe polymerase Expand Long (Roche) following the manufacturer’sinstructions. Chromosomal DNA from P. aeruginosa PAO1 was pre-pared as template from overnight cultures using DNAzol (Invitro-gen Canada Inc., Burlington, ON), according to the manufacturer’sprotocol and was used as template to PCR amplify ftsI encodingthe full-length PBP 3. The oligonucleotide primers used are pre-sented in Table 2. Amplified products were cleaned using HighPure PCR Product Purification kit (Roche), digested with NdeI/XhoIand ligated with appropriately digested pET30a(+) plasmid DNA.Recombinant plasmids were transformed into competent E. coliDH5a. Individual constructs were isolated from transformants,screened for the correct size of insert by agarose gel electrophore-sis, and they were sequenced to confirm nucleotide identity. Theresulting isolated construct was named pACSR-1 and was designedto generate PBP 3 with a C-terminal hexa-His tag (PBP 3-His6).
To facilitate its expression and purification, a truncated con-struct of PBP 3, named sPBP 3, was engineered by removing the50 sequence coding for the hydrophobic leader peptide (aminoacids 1–28) of PBP 3. The open reading frame encoding PBP 3 start-ing at amino acid 29 was PCR amplified as described above usingoligonuleotides PasPBP1 and PasPBP2 (Table 2). The truncated ftsIwas cloned into pET30a(+) yielding pACSR-13, thereby encodingthe truncated version of PBP 3 with a hexa-His tag (sPBP 3-His6).
Expression of engineered ftsI genes
Freshly transformed cells of E. coli BL21[kDE3]-RIL harboringeither pET30a(+), pACSR-1 or pACSR-13, were grown overnight in1 L of LB or enriched medium supplemented with 50 lg/mL Kanat 37 �C with aeration (200 rpm). To induce protein expression,freshly prepared IPTG was added to the culture to a final concen-tration of 0.1–1 mM when it reached mid-exponential phase(OD600 approximately 0.6), and growth was continued for a further6 h at either 15, 25, or 37 �C.
Reference or source
3)endA Hte[argU, ileY, leuW]TetR NovagenK� mK
�) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 Invitrogen
[31]
PromegaR Novagenuginosa ftsI on an NdeI/HinDIIIKanR
This study
ated P. aeruginosa ftsI on anlacking its N-terminal 28 aminobrane anchor; KanR
This study
n of the penicillin-binding protein 3 from Pseudomonas aeruginosa, Protein
Table 2Oligonucleotide primers used in this study.
Primer name 50 to 30 sequence (new restriction site) Description Construct
PaPBP3-1 GGTGGCCATATGAAACTGAATTATTTCCAGGGC (NdeI) Forward primer for ftsI pACSR-1PaPBP3-2 GGCCCTCGAGGCCACGCCCTCCTTTTGC (XhoI) Reverse primer for ftsI pACSR-1
PasPBP3-1 ATGGTCCATATGATCGTCTGGCGAATC (NdeI) Forward primer for 50 truncated ftsI pACSR-13
PasPBP3-2 GGCTCATAGCTCGAGGCCACGCCCTCCTTTTGC (XhoI) Reverse primer for 50 truncated ftsI pACSR-13
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Western immunoblotting
Detection of produced His-tagged proteins by Western immu-noblotting was performed as previously described [15] using a1:1000 dilution of mouse anti-His antibody (Santa Cruz Biotech-nology, Inc., Santa Cruz, CA) and a 1:2000 dilution of the secondaryantibody, goat anti-mouse IgG + IgM-alkaline phosphatase conju-gated antibody (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, ON).
PBP assays
PBPs were analyzed for penicillin-binding activity by the SDS–PAGE based assay [9] using [phenyl-4(n)-3H]benzylpenicillin(25 Ci/mmol; GE Healthcare) and BOCILLIN FL [19] as previouslydescribed [9]. For the fluorescent assay, 15 lL samples of the puri-fied protein (2–5 lg) were incubated with 5 lL of BOCILLIN (finalconcentration of 50 lM) for 2 h at 35 �C. SDS–PAGE sample bufferwas added to protein samples and boiled for 10 min prior to elec-trophoresis. Samples lacking either the proteins or labeled penicil-lins served as negative controls, while a sample of P. aeruginosa PBP2 [9] was used as a positive control for the assay. Detection of PBP–BOCILLIN complexes was achieved by exposing the gel to UV290 nm
light.
Cellular localization of PBP 3 and its soluble derivative
The localization of the recombinant PBPs within E. coli wasinvestigated by SDS–PAGE analysis of isolated fractions of cellsfrom 1 L of culture. Cell fractionation using the sucrose density gra-dient ultracentrifugation technique was conducted as describedpreviously [20].
Isolation and purification of PBPs
Cells were harvested by centrifugation (5000g, 12 min, 4 �C) andstored at �20 �C until required. Thawed cell pellets were washedand re-suspended in Lysis buffer (50 mM sodium phosphate buffer,pH 8.0, 300 mM NaCl) containing Complete Mini EDTA-free Prote-ase Inhibitor Cocktail Tablets and then subjected to sonicationusing an Ultrasonic Liquid Processor Sonicator (Heat SystemsInc., Toronto, ON). The cell lysate was clarified by centrifugation(10,400 g, 15 min, 4 �C) prior to its ultracentrifugation (35,000g,90 min, 4 �C).
The membrane-associated PBP 3 was isolated and purified byresuspending the membrane fraction in 20 mM Tris–HCl pH 8, con-taining 2% N-Lauroyl-sarcosine and stirred for 6 h at 4 �C. Insolubledebris were removed by ultracentrifugation (35,000 g, 90 min,4 �C). The membrane extract was diluted to 1% Sarkosyl in Mem-brane Buffer (20 mM Tris–HCl, 200 mM NaH2PO4, pH 8 containing0.5 M NaCl, 10% glycerol) and incubated with Ni2+–NTA agarose(1 mL resin/L original culture volume previously equilibrated inMembrane Buffer) with gentle agitation (on a Nutator) for 1 h at4 �C. The resin slurry was then packed into a disposable columnand the flow-through fractions were collected. The column waseluted with 10 column volumes of Membrane Buffer containing30 mM imidazole to remove contaminating proteins. His6-tagged
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PBP3 was then eluted with 3–5 mL of Membrane buffer containing400 mM imidazole.
For isolation and purification of the soluble sPBP3-His6, the celllysate in Lysis Buffer containing 10 mM imidazole was added to1 mL His-Select agarose. After gentle agitation for 90 min at 4 �C,the slurry was transferred to a 25 mL column and washed with Ly-sis Buffer containing, initially 20 mM imidazole, followed by30 mM imidazole. Finally, sPBP3-His6 was eluted from the columnwith 6 mL of Lysis Buffer containing 250 mM imidazole.
Immuno-gold labeling and transmission electron microscopy
Cell pellets were washed and resupended in PBS and mixedwith 2% noble agar. Small blocks were cut and fixed with 0.1% glu-taraldehyde and 2% formaldehyde for 1 h at 4 �C. The samples wererinsed thrice in HEPES buffer, dehydrated in a graded ethanol ser-ies, mixed with LR White resin (Electron Microscopy Sciences,Hatfield, PA), and then embedded in gelatin capsules filled withthe resin. Polymerization of the resin was achieved by incubatingin an oven at 60 �C for 1 h. Thin sections (50–100 nm) wereobtained and placed over nickel grids, rinsed with 3% skim milkin PBS for 20 min.
For immuno-gold labeling, purified primary antibody wasadded for 60 min, allowed to dry, and then rinsed four times for2 min with 3% skim milk in PBS. Once dried, anti-rabbit secondaryantibody was added and rinsed thrice for 2 min each with 3% skimmilk in PBS before four final rinses with deionized water. Labelingof antigen–antibody complexes with colloidal gold (10 nm parti-cles)-protein G was performed as previously described [21]. Thespecimens were stained with 2% uranyl acetate and lead citrateprior to their examination using a Philips EM 300 electron micro-scope operating at 60 kV.
Other analytical techniques
The ftsI gene (PA4418) was examined for signal peptide and sec-ondary structure predictions using the algorithms SignalP (v. 3.0)[22] and GOR4 [23], respectively.
Agarose gel electrophoresis was performed using 1% agarose(OmniPur, Darmstadt, Germany), while SDS–PAGE [24] was per-formed using 12.5% (w/v) acrylamide (Bio-Rad Laboratories(Canada) Ltd., Mississauga, ON). DNA sequencing was performedby the Guelph Molecular Supercentre, University of Guelph. Pro-tein concentrations were determined using a commercial BCA as-say (Pierce, Rockford, IL) with BSA (0.05–2 mg/mL) as thestandard. N-Terminal sequence analysis of purified PBP 3-His6 thatwas subjected to SDS–PAGE and subsequently transferred to a0.45 lm polyvinylidene difluoride membrane was performed byDavid Watson, National Research Council, Ottawa, Canada.
Results
Characterization of the P. aeruginosa ftsI gene and encoded PBP 3
The nucleotide sequence of PBP 3 (FtsI) was identified withinthe P. aeruginosa genome by a BLASTP search using E. coli ftsI (NCBI
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Accession No. P08150) as the query. P. aeruginosa PBP3 was identi-fied as ORF PA4418 (Genbank Accession No. X84053). Analysis ofthe P. aeruginosa PAO1 chromosome immediately upstream anddownstream of ftsI indicated that, as with E. coli, the PBP 3-encod-ing gene is found proximal to a cluster of genes required for thesynthesis of the peptidoglycan precursors (e.g. murE, murF, murD,mraW, and mraY), and for cell division and septum formation(e.g., ftsW, ftsL) (Fig. 1).
PA4418 codes for a hypothetical protein of 579 amino acid res-idues with 45% identity and 62% similarity to E. coli PBP 3. Its the-oretical Mr and pI values are 62,856.2 and 9.58, respectively.Analysis of its predicted secondary structure suggests that it pos-sesses a non-cleavable N-terminal signal peptide of 28 amino acidresidues and a transmembrane helix involving residues Tyr11through to Arg32 (Fig. 1). The three-dimensional structure of thehypothetical protein was predicted using the Phyre server(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/). The algorithm selected thestructure of PBP 2a from Staphylococcus aureus (1VQQ) as the bestfit (E-value of 9.952582e-41) for threading the P. aeruginosa PBP 3amino acid sequence (Fig. 1). Thus, the predicted structure con-sisted of a bi-lobal n-PB domain and a C-terminal transpeptidasedomain with an overall fold similar to other transpeptidases andthe serine b-lactamases. A secondary structure prediction usingGOR 4 supported the a/b structure for the PBP (36.1% a-helix,20.9% b-strand predicted). Classified as a class B PBP based on se-quence alignment, P. aeruginosa PBP 3 would be a mono-functionalenzyme involving a membrane-associated n-PB domain and anacyl-serine transferase PB domain, as known for its E. coli homolog[5]. Ser294 was identified as the catalytic Ser residue comprisingthe SxxK consensus motif at the active site of the PB domain.
Cloning of ftsI and engineering a truncated derivative
Based on the nucleotide sequence of ftsI, appropriate oligonu-cleotide primers were synthesized for PCR amplification of the en-
Fig. 1. Genetic organization and structure of P. aeruginosa PBP 3. (a) The ftsI gene encoproteins associated with peptidoglycan synthesis and cell division including, FtsL (downsa non-cleavable 28 amino acid leader peptide containing a membrane-spanning a-helixconsensus motif of the catalytic site. The plasmid pACSR-1 encodes the entire ftsI gene, wThe structure of PBP 3 as predicted by the Phyre Server. The arrow denotes the position
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tire gene encoding all 579 amino acids which would thus includeits signal peptide and transmembrane helix. The amplified productwas cloned into pET30a(+) in frame with coding for a C-terminalHis6 tag, and the construct, pACSR-1, was transformed into E. coliDH5a. The nucleotide sequence was confirmed by DNA sequencingprior to subsequent use.
To prepare a more soluble form of PBP 3 which would be moreamenable for in vitro studies, its gene was truncated by 84 nucleo-tides at its 50 end. The resulting construct, pACSR-13 thus encodedthe protein beginning at Ile29 and lacking both its N-terminal lea-der sequence and its membrane-spanning a-helix.
Expression and overproduction of PBP 3
Initially, the ftsI construct pACSR-1was transformed into E. coliBL21(kDE3) for induction-expression trials. Cells were grown tomid-exponential phase and then induced for ftsI expression withvarying concentrations of IPTG (0.1–1 mM) and incubation ateither 15, 25, or 37 �C. Continuing growth was monitored over a6 h period by both turbidity measurements while PBP 3 productionwas followed by SDS–PAGE and Western immunoblot analysis(Fig. 2). Optimum induction conditions were established to involvethe addition of 1.0 mM IPTG for 3 h at 37 �C. Incubation beyondthis point was followed by cell lysis as observed by light micros-copy (data not shown), implying that elevated concentrations ofPBP 3-His6 is lethal for the E. coli host. On the other hand, expres-sion of the truncated ftsI from pACSR-13 did not lead to cell lysisupon extended incubation.
Localization of recombinant PBP3 and its truncated derivative
Cell fractionation studies demonstrated that, as expected, thefull-length recombinant PBP 3 was localized to the cytoplamsicmembrane and periplasm (Fig. 3). However, a considerable fractionof the protein remained in the cytoplasm as insoluble aggregates, a
ding PBP 3 is flanked by other genes in the P. aeruginosa chromosome coding fortream) and MurE, MurF, MraY, MurD, and FtsH (upstream). (b) PBP 3 is composed of
(MH), followed by a n-PB domain and a PB catalytic domain containing the SxxKhereas pACSR-13 codes for the truncated soluble derivative beginning at Ile29. (c)of the catalytic Ser294 residue in the active site pocket of the PB domain.
n of the penicillin-binding protein 3 from Pseudomonas aeruginosa, Protein
Fig. 2. Overexpression of P. aeruginosa ftsI in E. coli BL21(DE3) transformed withpACSR-1. Cells were recovered from the culture at the times indicated afterinduction with 1 mM IPTG and total protein was analyzed by SDS–PAGE withCoommassie brilliant blue staining. The arrow denotes PBP 3, and MW markers arepresented on the left side of the panel.
Fig. 3. Localization of overproduced P. aeruginosa PBP 3by E. coli BL21(DE3). Cellswere fractionated as described in Materials and Methods and samples of equalprotein content of the cytoplasmic membrane (CM), periplasm (P) and outermem-brane (OM) were analyzed by SDS–PAGE with Coommassie brilliant blue staining.The arrow denotes the migration of PBP 3, and MW markers are indicated on theleft.
Fig. 4. Purification of recombinant P. aeruginosa PBP 3-His6 and its N-terminallytruncated soluble derivative. Cells of E. coli BL21(kDE3) harboring either a) pACSR-1(encoding PBP 3-His6) or b) pACSR-13 (encoding sPBP 3-His6) were induced with1.0 mM IPTG, harvested, and lysed. Fractions obtained during the purification of theHis-tagged PBPs by affinity chromatography on Ni–NTA agarose were analyzed bySDS–PAGE on 12.5% acrylamide. Lanes: 1, crude lysates; 2–4, elution with 400 mMimidazole in Membrane buffer. Lane 5, Western immunoblot analysis of purifiedproteins using an anti-His tag polyclonal antibody. Lane 6, autoradiographs ofpenicillin binding to purified PBPs using [phenyl-4(n)-3H]benzylpenicillin. Molec-ular weight markers (kDa) are indicated on the left.
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common problem encountered with membrane proteins, such asthe HMW-PBPs (e.g., [12]). Lacking both a signal-sequence andmembrane anchoring a-helix, high levels of truncated PBP 3 (sPBP3-His6) were recovered mainly in the cytoplasm. Nonetheless, asmall but significant fraction of the PBP was also detected in theperiplasm (data not shown).
Purification of PBP3
Immobilized metal affinity chromatography with Ni2+–NTAagarose was used to isolate and purify the full-length His6-taggedPBP 3. Crude protein samples were applied to the resin at pH 8and after initial washes incorporating 20 and 30 mM imidazole,increasing the imidazole concentration to 400 mM served to elutePBP 3 with minimal contamination as determined by SDS–PAGE(Fig. 4). The MW of purified PBP 3 was estimated by SDS–PAGEto be approximately 62.2 kDa which is 1.4 kDa less than that ex-pected for the hypothetical protein product of ftsI possessing ahexa-His tag (viz. 63,679 Da). However, this protocol providedthe full-length PBP 3 in the very low yield of approximately0.01 mg/L of cell culture. Attempts were made to increase therecovery of PBP 3-His6 using different detergents (e.g., CHAPS, Tri-ton X-100) but without success. Incubation of the E. coli transform-ant overproducing PBP 3 at the reduced temperatures of 15 or25 �C also did not result in increased recoveries of the enzyme.
The truncated, soluble sPBP 3-His6 was also purified by affinitychromatography but the protein could be recovered with the appli-cation of 250 mM imidazole to the elution buffer. More impor-tantly though, yields of approximately 1.1 mg of purified proteinper liter of cell culture were recovered. Its apparent MW was cal-culated to be 59.2 kDa (theoretical: 60,522 Da with hexa-His; D,1.3 kDa) (Fig. 4).
Characterization of recombinant PBP3s
To ensure that the truncated sPBP 3 had not been processed byits E. coli host during its over-expression, a sample of the purified
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protein was submitted to N-terminal sequencing. A sequence ofM-I-V-W-R-I-V-D-L-x-V-I was obtained for the first 12 cycles ofthe Edman degradation process which corresponds to the sequenceexpected for the recombinant protein (the unidentified residue atcycle 10 was presumably His). Both PBP 3-His6 and sPBP 3-His6
were assayed for penicillin-binding activity to ensure that they re-mained active following their isolation and purification. The puri-fied full-length PBP 3-His6 and truncated sPBP 3-His6 were ableto bind both radiolabeled penicillin G (Fig. 4) and BOCILLIN FL, afluorescent labeled penicillin. These observations indicated thatthe PBPs were functional and apparently not hindered in their pen-icillin-binding capacity by the presence of the C-terminal His-tags.
Immuno-gold labeling followed by TEM was used to locate re-combinant PBP 3-His6 in E. coli. As seen in Fig. 5, the PBP is local-ized to two distinct sites in the cell, at the septal region inapproximately 50% of the cells, and at the poles in 10–20% of thecells. The soluble sPBP-His6, on the other hand was observed tobe localized evenly in the peripheral region around the cell (Fig. 5).
Discussion
The ftsI gene encoding PBP 3 from P. aeruginosa had been clonedpreviously but not in way that provided the protein in a form ame-nable for either in vivo or in vitro investigation [14]. Indeed, the
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Fig. 5. Localization of recombinant PBP 3 in E. coli detected by TEM. Cells were prepared for TEM, thin sectioned, and treated with antibodies as described in Materials andMethods. The localization of PBP 3 was detected by treating the sections with colloidal gold (10 nm particles)-protein G which appear in the electron photomicrographs asblack dots. The representative micrographs are of E. coli BL21(kDE3) harboring, (a) empty pET30a(+) (negative control); (b) pACSR-1 (PBP 3-His6); and (c) pACSR-13 (sPBP 3-His6). The solid bars denoted 1 lm.
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overproduction of the full-length membrane-associated PBP 3leads to an accumulation of the majority of the protein in insolubleaggregates, a phenomenon we also encountered. Decreasing ratesof its overproduction by manipulating concentration of the IPTGinducer and/or incubation temperature did not serve to improveyields of the purified PBP. In the current study, however, we de-scribe the engineering and expression of ftsI in E. coli for the pro-duction of significant quantities of the encoded protein lackingits membrane-spanning a-helix and anchor. This PBP 3 derivativeis thus produced in both active and soluble form thereby facilitat-ing its detailed analysis and characterization. Moreover, the fusionof a C-terminal hexa-His tag was demonstrated to not impair itspenicillin-binding capacity indicating the protein retains its enzy-matic function. The presence of this hexa-His tag not only providesa facile means for the purification of the PBP by affinity chromatog-raphy, but in addition, the opportunity to conduct studies on, forexample, protein–protein interactions involving affinity chroma-tography and/or immunoprecipitation using the tagged PBP 3 asbait and its localization within whole cells using immunologicaltechniques. Indeed, with respect to the latter, we demonstratedthe potential of immuno-gold labeling to locate the presence ofthe full-length, membrane-associated PBP 3 predominantly at thesepta of cells (Fig. 5).
In E. coli, PBP 3 is the only peptidoglycan synthase that is knownto be essential for cell division [8]. This process requires a numberof proteins to form specific complexes that then associate into theseptal ring and divisome to direct the synthesis of new peptidogly-can at the mid-point of the cell during the septation of daughtercells (reviewed in [1]). The septal ring involves proteins on boththe cytoplasmic (FtsA, FtsZ, and ZipA) and periplasmic (FtsL, FtsN,FtsQ, and FtsW) sides of the membrane. PBP 3 is thought it interactwith each of these division proteins including MipA but, with theexception of FtsW, little direct evidence of the nature, mechanism,and function of the associations has been obtained. With FtsW, itspresence for the recruitment of PBP 3 has been well documented[1], and its localization appears to depend on a periplasmic loop lo-cated between transmembrane segments 9 and 10 of the FtsW pro-tein [25]. PBP 3 is also known to associate with specific lytictransglycosylases, enzymes responsible for creating sites for thesynthesis of new peptidoglycan [26].
The preliminary data presented in this study pertaining to thelocalization of PBP 3 to the septal region of the cell suggests thatthis PBP, as in E. coli, is also associated with the divisome in P. aeru-ginosa. However, it is becoming increasingly apparent that differ-ences exist in both the organization and association of theenzymes and proteins involved in the biosynthesis and mainte-nance of peptidoglycan between these two bacteria. For example,
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(i) the compliment of both the PBPs [5,9] and the lytic transglycos-ylases [27] present in these two bacteria are different; (ii) unlike E.coli, cells of P. aeruginosa lacking an active PBP 2 remain viable[16]; (iii) PBP 2 does not appear to complex with membrane-boundlytic transglycosylase B (MltB) in E. coli [28], whereas a close asso-ciation of the functional equivalents in P. aeruginosa exists at boththe protein and genetic levels; and (iv) a homolog of the scaffoldingprotein, MipA, that mediates the interaction between the PBPs andlytic transglycosylases in E. coli [29] does not appear to exist in P.aeruginosa [30]. These differences underscore the diversity thatwould appear to exist in the metabolism of peptidoglycan acrossthe bacteria and thus the need to exercise caution when attempt-ing to extend the observations and interpretations made with onespecific bacterium to others. This is especially relevant given thatthe majority of the investigations to date on multienzyme com-plexes involved in peptidoglycan metabolism have been focusedon a limited number of bacterial species. Our ability to generateappropriate forms of P. aeruginosa PBP 3 amenable for a varietyof different investigations would greatly facilitate our furtherunderstanding of the process of peptidoglycan synthesis and main-tenance in this bacterium. More significantly, it will help to furtherour investigations on the identification of potential new targets forthe development of effective antibiotics that target this importanthuman pathogen.
Acknowledgment
These studies were supported by operating Grant MOP49623 toA.J.C. from the Canadian Institutes for Health Research.
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