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Doctoral Thesis

Peptides as carrier for tumor diagnosis and treatment

Author(s): Langer, Michael

Publication Date: 2001

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-004120534

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ETH Library

Dissertation ETH No. 13986

tides as arrier for iagnosis and Treatment

A dissertation submitted to the Swiss Federal Institute of Technology

for the degree of Doctor of Natural Sciences

presented by

Michael Larger

Eidg. Dipl. Apotheker ETH Ztirich

Born January 24th, 1972 Citizen of Zijrich, Ziirich

Accepted on the recommendation of

Prof. Dr. A. G. Beck-Sickinger, examiner Prof. Dr. G. Folkers, co-examiner

Prof. Dr. A. Schubiger, co-examiner

2000

Summary

SUMMARY

Nature has designed peptides for a large variety of specific functions. They

regulate many functions by acting as chemical messengers, neurotransmitters and

highly active stimulators or inhibitors. They bind to their specific receptors, which

mostly belong to the superfamily of G-protein coupled receptors. Peptides can be

considered as ideal agents as carrier for diagnostic and therapeutic applications,

adopting Paul Ehrlichs concept of the “magic bullet”. Tumor tissues expressing

receptors for a peptide can be addressed by the peptide or differently labelled

analogues. Depending on the label, the tumor can be visualized or therapeutically

treated. The specific binding to receptors can be used to meet the key requirement

in tumor targeting: selective addressing of neoplasm. Peptides are readily

synthesized and can withstand harsh conditions for modification and labelling.

Because of their small size, peptides exhibit fast blood clearance and high target-

to-background ratios compared to macromulecular carriers such as antibodies.

Peptides are less likely to induce immunogenic response, and tissue penetration

and tumor uptake are faster.

In radiopharmacy, these advantages have been attended, and radiolabelled

receptor-binding peptides have emerged as a new class of radiopharmaceuticals.

Over the last years, nuclear medicine has evaluated various peptides for tumor

scintigraphy, e.g. somatostatin, vasoactive intestinal peptide, bombesin,

neurotensin, substance P, cholecystokinin and many more. In chapter I, the latest

achievements in peptide-guided tumor diagnosis and treatment are summarized in

a review, and the prerequisites, advantages and specific pharmacokinetic

properties of peptides as carriers are discussed critically.

Chemotherapy has been the main therapy for treatment of cancer. One of the

major problems in classic chemotherapy is the non-specific toxicity of most

anticancer agents against normal cells. Efficient drug targeting could be of great

benefit for patients, reducing the severe, dose-related side effects. In order to

increase their therapeutic index, drug delivery systems are needed, which

selectively transport the antineoplastic agents to the tumor. In chapter 2 it is shown

that coupling of cytotoxic drugs to peptides is a promising approach to obtain

2 Summary

selectivity. The application of neuropeptide Y (NPY) as a carrier peptide has been

tested for the first time. NPY is a 36-amino acid peptide of the pancreatic

polypeptide family. It is expressed in the peripheral and central nervous system,

and is one of the most abundant neuropeptides in the brain. Five distinct NPY

receptors have been cloned, which have been named Y,, Yz, Y,I., Yg and y6

receptor subtype. These receptors are produced in a number of neuroblastoma

and the thereof derived cell lines, making them feasible targets for tumor targeting.

Daunorubicin and doxorubicin, two widely used antineoplastic agents in tumor

therapy, were covalently linked to NPY via two spacers that differ in stability. The

different conjugates were able to bind to the Y, receptor with high affinities, but

only the compound containing an acid-sensitive linker showed cytotoxic activity. As

the cytotoxicity was confined to cells expressing the Y1 receptor subtype,

selectivity was achieved by this peptide carrier approach.

For therapeutic applications, internalization of the peptide conjugate is an

absolute precondition, as the cytotoxic moiety has to reach its target within the

cell. Therefore, internalization studies on SK-N-MC cells were performed using

fluorescent and tritium labelled NPY (chapter 3). It was shown that approximately

20”30% of NPY is taken up by the cells by receptor-mediated endocytosis,

rendering NPY a suitable carrier for specific tumor targeting.

Subsequently, the use of NPY as a radiopeptide for scintigraphy was

investigated (chapter 4). A novel ggmTc(l) aqua complex and 2-picolyamine-/V,/V-

diacetic acid (PADA) as bifunctional chelating agent (BFCA) were tested.

[K4(PADA),A26]-NPY was specifically postlabelled, while maintaining high binding

affinity. Furthermore, the prelabelling approach has been applied for the shortened

analog [Ahx5*24]-NPY. The resulting Ac-[Ahx5~24,K4(ggmTc(C0)3-PADA)]-NPY was

produced with a yield of about 16%. Therefore, postlabelling was applied for the

short analog as well. Competitive binding assays using ‘85Re as a surrogate for

ggmTc showed high binding affinity of Ac-[Ahx5~24,K4(‘8”Re(C0)3-PADA,A26)]-NPY.

Internalization studies with the corresponding ggmTc labelled analog revealed

receptor-mediated internalization. gg”Tc-labelled NPY derivatives seem to have

promising characteristics for future applications in nuclear medicine.

Summary 3

The same radionuclide and BFCA have been exploited for the labelling of a

bombesin analog (chapter 5). The use of this peptide as radiopharmaceutical has

been suggested, as a variety of tumor tissues have been found to express

bombesin receptors, for instance lung, prostate, breast, pancreas and colon. The

spacer Ava (5”aminovalerianic acid) was introduced between the BFCA and the

peptide in order to avoid interference of the chelator moiety with the receptor-

binding C-terminus of the peptide. [ggmTc(l)-PADA-Ava]-bombesin(7-l 4) was

characterized extensively and revealed good properties for a scintigraphic

radiopeptide (chapter 6).

Most peptides and hormonal messengers are recognized on the cell surface by

their G-protein coupled receptors. Subsequent signal transduction via different

cascades triggers for instance cell growth and differentiation. Exact coordination

between the components of the signalling pathways is crucial for normal cell

growth. Any disturbance may cause uncontrolled proliferation resulting in the

establishment of cancer. Thus, the MAP-Kinase cascade and the inhibition of

forskolin-stimulated adenylate cyclase were investigated by using lipopeptides

derived from Ras and the C-terminal sequence of the Y1 receptor (chapter 7). Both

signal transduction pathways were affected by the synthetic short lipopeptides. As

structural requirements for the peptides sequence specificity for the investigated

receptor and lipidation were identified.

In conclusion, this work provides new insights and developments in the field of

specific tumor targeting. New “g’nTc-labelled peptides in nuclear medicine and

novel peptide conjugates for selective chemotherapy may augment the

armentarium in the dreadful fight against cancer.

Zusammenfassung 5

Die Natur konzipierte Peptide fur eine Vielzahl spezifischer Funktionen. Sie

regulieren zahlreiche Funktionen, indem sie als chemische Botenstoffe,

Neurotransmitter und hochaktive Stimulatoren oder Inhibitoren agieren. Sie binden

an ihre spezifischen Rezeptoren, welche meistens zur Superfamilie der G-Protein

gekoppelten Rezeptoren gehbren. In Anlehnung an Paul Ehrlichs Konzept der

Wunderwaffe (magic bullet) konnen Peptide als ideale Trtiger fur diagnostische

und therapeutische Anwendungen angesehen werden. Tumorgewebe, welches

die entsprechenden Rezeptoren fur das Peptid exprimiert, kann durch das Peptid

oder seine verschieden markierten Analoga adressiert werden. Je nach

Markierung kann anschliessend der Tumor sichtbar gemacht oder behandelt

werden. Das spezifische Binden an die Rezeptoren kann angewendet werden, urn

die Hauptanforderung des Tumor Targetings zu erfullen: das selektive Ansteuern

der Krebszellen. Peptide sind einfach zu synthetisieren und halten harte

Modifikationsprozeduren aus. Da sie so klein sind, zeigen sie im Vergleich zu

makromolekularen Tragern wie Antikorper ein schnelleres Verschwinden aus der

Blutbahn und ein hoheres Ziel-Hintergrund-Verhaltnis. Zudem induzieren Peptide

weniger Immmunantworten, und sie dringen schneller in Gewebe ein, weshalb

eine hohere Tumoraufnahme gewahrleistet werden kann.

All diese Vorteile wurden in der Radiopharmazie aufgegriffen, und

radiomarkierte, rezeptorbindende Peptide haben sich zu einer neuen und

eigenstsndigen Klasse der Radiopharmazeutika entwickelt. Die Nuklearmedizin

hat in den letzten Jahren zahlreiche Peptide zur Anwendung in der

Tumorszintigraphie getested, bespielsweise Somatostatin, Vasoaktives

lntestinales Peptid (VIP), Bombesin, Neurotensin, Substanz P, Cholezystokinin

und viele mehr. Im ersten Kapitel dieser Arbeit sind die neusten Erkenntnisse auf

dem Gebiet der peptidvermittelten Tumordiagnose und -therapie in einer

ubersicht zusammengefasst, und die Voraussetzungen, Vorteile und spezifischen

pharmakokinetischen Eigenheiten von Peptiden als Tragersubstanzen werden

erortert.

6 Zusammenfassung

Chemotherapie ist die meistverwendete Therapieform bei Krebs. Eines der

grdssten Probleme in der klasischen Chemotherapie ist die unspezifische Toxizitat

der meisten Zytostatika gegentiber normalen Zellen. Effizientes Tumor Targeting

konnte fur die Patienten sehr hilfreich sein, da die schweren, dosisabhgngigen

Nebenwirkungen vermindert wtirden. Urn den therapeutischen Index der

Medikamente zu erhohen, sind passende Arzneistoff-Transportsysteme

notwendig, welche das Zytostatikum selektiv zum Tumor bringen. Im zweiten

Kapitel wird gezeigt, dass das Koppeln von Zytostatika an Tragerpeptide ein

vielversprechender Ansatz in dieser Richtung ist. Die Anwendung von Neuropeptid

Y (NPY) als Carrier wird erstmalig vorgestellt. NPY ist ein 36 Aminosauren langes

Peptid, welches zur Familie der pankreatischen Polypeptide gehiirt. Es wird im

zentralen und peripheren Nervensystem exprimiert, und ist eines der haufigst

vokommenden Neuropeptide im Gehirn. Ftinf unterschiedliche Rezeptoren wurden

kloniert und Subtypen YI, Yp, Y4, Y5 und y6 genannt. lnteressanterweise werden

diese Rezeptoren such in verschiedenen Neuroblastoma und den davon

abgeleiteten Zellinien gefunden, weshalb sie mogliche Zielstrukturen fur Tumor

Targeting darstellen. Daunorubicin und Doxorubicin, zwei weitverbreitete

Zytostatika in der Chemotherapie, wurden kovalent an NPY gebunden, wobei man

zwei unterschiedlich stabile Spacer verwendete. Die verschiedenen Konjugate

konnten mit hoher Affinitat an den Y1 Rezeptor binden, jedoch nur die Verbindung

mit einer s&relabilen Spacergruppe zeigte zytotoxische AktivitX Da sich diese

Zytotoxizitat auf Zellen beschrankte, welche den Y1 Rezeptor exprimieren, wurde

Selektivitat durch diesen peptidvermittelten Ansatz erzielt.

lnternalisierung des Konjugates ist unbedingt notwendig fur therapeutische

Applikationen, denn der Arzneistoff muss sein Ziel innerhalb der Zelle erreichen.

Deshalb wurden lnternalisierungsstudien mit fluoreszenz- und tritiummarkiertem

NPY an SK-N-MC Zellen durchgefuhrt (Kapitel 3). Es konnte gezeigt werden, dass

ca. 20-30% des NPY durch rezeptorvermittelte Endozytose in die Zellen

aufgenommen wird, was NPY zu einem passenden Transportvehikel fur

tumorspezifisches Targeting macht.

Zusammenfassuna 7

Anschliessend wurde die Anwendung von NPY als Radiopeptid fur Szintigraphie

untersucht (Kapitel 4). Man testete einen neuen ggmTc(l)-Komplex und PADA (2-

picolyamine-N,N-diacetic acid) als bifunktionellen Chelator. [K4(PADA),A26]-NPY

wurde spezifisch postgelabelt, wahrend es hohe Bindungsaffinitat beibehielt.

Zudem wurde der Prelabeling Weg fur das vergurzte Analogon [Ahx5-24]-NPY

angewandt. Das resultierende Ac-[Ahx5-24 4 ggm ,K ( Tc(CO),-PADA)]-NPY erhielt man

mit einer Ausbeute von nur 16%, weshalb such hier ein Postlabeling versucht

wurde. Kompetitionsbindungsstudien, bei welchen 185Re als Erstaz fur das heisse

ggmT~ verwendet wurde, zeigten hohe Bindungsaffinitat van Ac-[Ahx5-24,

K4(‘85Re(C0)3-PADA,A26)]-NPY. lnternalisierungsstudien mit der entsprechenden

““Tc markierten Verbindung ergaben rezeptorvermittelte Internalisierung.

Deshalb konnten ggm Tc markierte NPY-Derivate vielverprechende Kandidaten fur

zukiinftige Anwendungen in der Nuklearmedizin darstellen.

Dasselbe Radionuklid und derselbe Chelator wurden fur die Markierung eines

Bombesinderivates benutzt (Kapitel 5). Die Verwendung dieses Peptides als

Radiopharmazeutikum war vorgeschlagen worden, da viele Tumorgewebe

Bombesinrezeptoren exprimieren, beispielsweise in der Lunge, Brust, Prostata,

Pankreas und Colon. Urn lnterferenzen zwischen dem Chelator und der

rezeptorbindenden, C-terminalen Sequenz des Peptides zu vermeiden, wurde der

Spacer Ava (5-aminovalerianic acid) eingeftihrt. [ggmTc(l)-PADA-Ava]-Bombesin(7-

14) wurde eingehend charakterisiert und zeigte gute Eigenschaften zur

Verwendung als Radiopeptid fur die Szintigraphie (Kapitel 6).

Die meisten Peptide und hormonalen Botenstoffe werden durch ihre G-Protein-

gekoppelten Rezeptoren an der Zelloberflache erkannt. Die anschliessende

Signaltransduktion via verschiedener Kaskaden lost zum Beispiel Zellwachstum

und -differenzierung aus. Exakte Koordination zwischen den einzelnen

Komponenten der Signaltransduktionswege ist essentiell fur eine normale

Zellentwicklung. Jedwelche Storung konnte eine unkontrollierte Proliferation

bewirken, was zu Krebs fijhren wit-de. Deshalb untersuchte man die MAP-Kinase

Kaskade und die Inhibition van Forskolin-stimulierter Adenylatzyklase mit

Lipopeptiden, welche von Ras respektive der C-terminalen Sequenz des Y,

Rezeptors abgeleitet waren (Kapitel 7). Beide Signaltransduktionswege wurden

8 Zusammenfassung

durch die synthetischen Lipopeptide beeinflusst. Als strukturelle Anforderungen an

solche Peptide wurden Sequenzspezifittit und ein Lipidrest identifiziert.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese Arbeit neue Einblicke und

Entwicklungen im Gebiet des spezifischen Tumor Targetings liefert. Neue 9g’nT~

markierte Peptide in der Nuklearmedizin und neue Peptidkonjugate zur selektiven

Chemotherapie konnten effektive Waffen im Kampf gegen Krebs darstellen.