Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

Bandung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN

IMOBILISASI ANTIBODI T4 PADA PARfIKEL MAGNET

Ratnawati Kukuh, Daniel SantosoPusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional

AHSTRAKIMOBILISASI ANTIBODI T4 PADAPARTlKEL MAGNET. Metode pemisahan antigen

terikat dari antigen bebas merupakan komponen esensial dari sistem RIA. Dalam penelitianini dikembangkan metode pemisahan fase padat dengan tujuan menghindarkan penggunaanalat sentrifugasi, sehingga diharapkan Kit RIAfase padat dapat digunakan secara lebih luas.Untuk maksud ini antibodi diimobilisasikan pada partikel magnet sebagai penunjang padatdengan pengikatan secara kimiawi menggunakan l,l-karbonil-diimidazol (CD!). Antibodiyang digunakan perlu dalam bentuk IgG -T4 murni. Pemurnian dilakukan denganmenggunakan protein-A-sepharosa dan diperoleh fraksi IgG-T4sebesar 610 l1g/ml.Antibodiyang telah diimobilisasikan ini ditentukan titernya. Untuk memperoleh daerah kerja yangdiinginkan, ditentukan volume pereaksi dan waktu inkubasi optimal. Data percobaanmenunjukkan bahwa disain penentuan dengan 50111larutan baku T4/cuplikan, 50 111T4bertanda 1251,dan 50 111suspensi IgG-T4-partikel magnet serta waktu inkubasi 2 jammemberikan hasil yang cukup peka pada daerah keIja yang diperlukan, yaitu antara 25 ­>1500 nmol/l. Evaluasi lebih lanjut dari hasil kinerja penentuan menunjukkan bahwa kityang telah dibuat sebanding dengan kit buatan DPC dan Amersham. Untuk mengujikestabilan suspensi IgG- T4 partikel magnet dilakukan penentuan waktu kadaluwarsa (shelflife). Hasil pengamatan menunjukkan bahwa untukjangka waktu lebih kurang 5bulan masihcukup stabil. Dari data yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa pemisahan fasa padatmenggunakan partikel magnet memberikan hasil yang cukup memuaskan.

ABSTRACTIMMOBILIZATION OF T4 ANTIBODIES ON MAGNETIC PARTICLES An efficient

method to separate bound from free antigen is an essential component ofa radioimmunoassaysystem. In the present study a solid phase separation method has been developed with theaim to avoid centrifugation and thus enabling more extensive use of radioimmunoassay kitsin hospitals where centrifuges are not available. Antibodies were immobilised onto magnetisedparticles as solid support by means of chemical binding using 1,1-carbonil-diimidazole (CDI).The antibodies to be immobilized should be in the form of purified T4-lgG. Purification wasperformed using Protein-A-Sepharose and a fraction containing 0.610 I1g/mlof T4 wasobtained. The titre of the immobilized antibodies was then determined. Assay design wasoptimised by determining the reagent volumes and length of incubation time suitable for thedesired working range. An assay design using 50111ofT4 standard solution or sample, 50 111of 1251_labeledT4and 50 111of magnetised T4- IgG suspension was found to yield reasonablysensitive results in the working range of interest, i.e. between 25 -> 1500 nmol/l. Furtherevaluation showed that the in-house kit performs comparably with those produced by DPCand Amersham. Stability testing was carried out to determine shelflife. Experimental resultsshowed that up to about 5 months the kits are fairly stable. In general it can be concludedfrom the data obtained, that satisfactory results are obtained using a solid phase separationmethod employing magnetic particles.

PENDAHULUAN

Metode RIA untuk penentuan T4 sudahmerupakan cara pengujian yang rutin diguna­kan, termasuk di antaranya Kit RIA-T4PPTNyang menggunakan cara pemisahan antibodikedua (second antibody) dan larutan polietilen­glikol dalam fase cairoUntuk keperluan rumahsakit metode pemisahan yang menggunakanfase pad at dinilai lebih ekonomis.

Sistem pemisahan fase padat mulai dikem­bangkan dengan tujuan menghindarkan peng-

gunaan alat sentrifugasi yang diperlukan padapemisahan dalam fase cair, sehingga diharap­kan bahwa Kit RIA fase padat dapat digunakansecara lebih luas, terutama pada rumah- rumahsakit yang belum atau tidak mempunyai alatsentrifugasi.

Salah satu bagian terpenting dalam sistempenentuan imunoradio adalah suatu prosedurefisien untuk memisahkan antigen yang terikatpada antibodi terhadap antigen bebas. Pada pe-

312

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Teknologi Menuju Era Tinggal Landas

misahan dengan cara fase padat antibodi diimo­bilisasikan pada suatu penunjang padat (3,5).

Pada penelitian ini sebagai penunjang fasepadat dipakai partikel magnet (magnetic solidphase microbead) yang pengikatannya dilaku­kan secara kimiawi menggunakan 1,1- karbo­nil-diimidazol (CD!). Dengan digunakannyapartikel magnet sebagai cara pemisah fasepadat, maka tidak diperlukan penggunaan alatsentrifugasi. Antigen yang terikat dapat mudahdipisahkan dengan menggunakan pelat magne­tik. Pemisahan cara ini sangat sederhana, mu­dah, efisien, spesifik, memberikan nilai ikatantak spesifik (NSB) rendah, dan dapat dikerja­kan dalam waktu yang relatif singkat (4).

Antibodi yang akan diimobilisasikan padapartikel magnet haruslah IgG-T4 yang murni.Pada penelitian ini pemurnian dilakukan de­ngan menggunakan kolomprotein-A- sepharosa(1,2). IgG-T4yang telah dimurnikan kemudiandiimobilisasikan pada partikel magnet dengancara kimiawi menggunakan 1,1-karbonil- diimi­dazol (CDI)(4).

Hasil imobilisasi antibodi diuji dengan me­lakukan penentuan titer. Titer ditentukan de­ngan cara menginkubasi berbagai variasi volu­me suspensi IgG-T4partikel magnet dengan se­jumlah tertentu antigen radioaktif. Pada akhirinkubasi fraksi terikat dipisahkan mengguna­kan pelat magnetik, dan persen ikatan BIT(fraksi terikatl keaktifan total) dapat ditentu­kan.

Disain dan optimasi penentuan dilakukandengan menentukan volume pereaksi dan wak­tu inkubasi optimal untuk memperoleh daerahkeIja yang diinginkan.

Pengujian kinerja penentuan (assayperformance) dilakukan dengan mengevaluasinilai besaran karakteristik yang diperlukan un­tuk penentuan imunoradio, misalnya besaranikatan tak spesifik (NSB), ikatan maksimum(Borr), konsentrasi pada 50% BlBo (Ed 50), koe­fisien variasi antar penentuan cuplikan kontroldan penentuan profil presisi. Sebagai pemban­ding digunakan kit RIA-l'4tabung bersalut pro­duksi DPC dan kit RIA-T4cara magnetik pro­duksi Amersham.

Untuk menguji kestabilan suspensi IgG-T4partikel magnet, dilakukan penentuan waktukadaluwarsa (shelf life).

Tujuan penelitian ini adalah untuk menja­jaki pembuatan kit RIAfase padat dengan mem­pelajari imobilisasi antibodi 1'4 pada partikelmagnet.

Bandung, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BAT/1N

BAHAN DAN TATI\. KERJA

BAHAN DAN PERA U TAN

Bahan yang digunakan

Antibodi yang digunakan adalah antibodihasil penelitian yang terdahulu (6), protein A­sepharosa produksi Pharmacia. Larutan daparfosfat O,lM pH 7,4, larutan dapar borat 0,05 MpH 9,6, larutan dapar glisin-HCI pH 2,8, larutandapar Tris, larutan dapar bikarbonat pH 8, danlarutan dapar asetat pH 4. Partikel magnetyang telah ditempeli cm diperoleh dari IAEA.Ase- ton, etanolamin dari E. Merck. Kit RIA'r 4cara magnetik produksi Amersham dan kitRIA-T4 tabung bersalut (coated tube- 1'4)produksi DPC.Peralatan

Peralatan yang digunakan adalah alat pe11.­

cacah sinar y (Miniassay type 6-20), pH metBr(Metrohm Herisau E 520),pelat magnetik, korn­puter IBMIPC, program disket dari IAEA, pipetependorf dengan ukuran 51l1,10III,50 Ill, 100~Ll,tabung reaksi, dan alat suntikan.TATA KERJA

Pemurnian Antibodi

Pemurnian antibodi 1'4 dilakukan denganmenggunakan kolom protein- A-sepharosa (~~).Ke dalam suntikan plastik berukuran 2,5 rnldimasukkan 0,3 g protein A-sepharosa dan 2 rnldapar fosfat 0,1 M pH 7,4. Campuran dikocokdan dibiarkan mengembang selama 15 menit.Setelah mengembang ke dalam kolom kemu­dian dimasukkan 500 IIIantibodi 1'4yang telahdilarutkan dalam 1ml dapar fosfat 0,1 M pH 7,4.Agar seluruh y-globulin teradsorpsi ke dalamkolom protein-A-sepharosa, maka larutan anti­bodi dikocok bersama dengan seluruh isi kolomdan dibiarkan selama 30 menit. Kolom kemu­dian dielusi dengan dapar fosfat 0,1 M pH 7,4.Penampungan dilakukan sebanyak 9 fraksi dantiap fraksi berisi 2 ml. Hasil setiap fraksi diten­tukan resapannya dengan spektroskopi UV pa­da panjang gelombang 280 nm. Setelah resapanmenurun, kolom dicuci dengan 3 ml NaCI 0,9%.Untuk mendesorpsi IgG-T4dari isi kolom, maImkolom dielusi kembali dengan dapar glisin-HCIpH 2,8.Eluat ditampung sebanyak 6 fraksi ma­sing-masing 2 ml dalam vial berisi 1 ml daparTris. Fraksi yang mengandung IgG dapat diten­tukan resapannya dengan spektroskopi UV pa­da panjang gelombang 280 nm. Fraksi IgGdikumpulkan dan didialisis dalam dapar boratpH 9,6 selama 24 jam pada suhu 4°C. Untukmenghitung kadar IgG yang diperoleh,

313

Proreemngs Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

ditentukan sekali lagi resapannya dandibandingkan dengan baku IgG.

lmobilisasi hasil pemurnian antibodi T4 padapartikel magnet

Mula-mula botol yang berisi partikel mag­net yang telah ditempeli CDI dalam aseton diko­cok perlahan-Iahan hingga diperoleh campuranpartikel magnet yang homogen. Ke dalam vialberukuran 50 ml dimasukkan 10 ml campuranpartikel magnet-CDI-aseton. Partikel diendap­kan dengan menggunakan pelat magnetik dan,kemudian dicuci berturut-turut 4 kali dengan 20ml akuades dan 4 kali dengan 20 ml daparbikarbonat pH 8. Setelah dilakukan pencucian,ke dalam partikel magnet tersebut ditambah­kan 0,5 ml IgG anti T4 hasil pemisahan dandapar bikarbonat pH 8 hingga volume keselu­ruhannya menjadi 10 m!. Campuran kemudiandiputar (rotate» selama 24 jam pada suhu y"a­

mar. Partikel magnet yang telah diimobilisasidengan IgG anti T4 ini kemudian diendapkandicuci berturut-turut 2 kali dengan 20 ml daparbikarbonat pH 8, dan terakhir dengan 20 mldapar bikarbonat yang mengandung etanola­min (3mlfl). Partikel diendapkan, disuspensi­knn dalam 20 ml dapar bikarbonat yang me­ngandung etanolamin (3 mlfl), kemudian dalam20 ml dapar asetat pH 4. Suspensi dilakukan 30menit pada suhu kamar sambil diputar. Selan­jutnya, partikel diendapkan kembali dan dicuci2 kali dengan 20 ml dapar fosfat.

Penentuan titer antibodi yang telah diimobi­lisasi pada partikel magnet

Titer antibodi ditentukan dengan mela­kukan suatu seri percobaan menggunakanjum­Ish suspensi partikel magnet yang berbeda. Kedalam suatu seri tabung reaksi dimasukkan 5,10, 20, 50, 100, 200 J.lIsuspensi partikel magnetyang telah diimobilisasi dengan antibodi T4 .Untuk memperoleh jumlah volume yang sarnaditambahkan dapar fosfat 0,05 M pH 7,5.Selan­jutnya ke dalam setia p tabung ditambahkan 100J.llT4bertanda 1251. Campuran diinkubasi sam­bil diputar selama 2 jam pada suhu kamar.Setelah inkubasi ke dalam campuran tersebutditambahkan 1 mllarutan dapar pencuci (daparfosfat 0,05 M pH 7,5, 0.5% tween 20). Partikelmagnet yang mengandung fraksi terikat dien­dapkan menggunakan pelat magnetik. Endap­an dicuci dengan 1mllarutan dapar pencuci dankeaktifannya dicacah dengan menggunakanpencacah sinar y.

Ban-dung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN

Penentuan daerah herja dengan kepekaan yangdiinginkana). Pembuatau kurva baku dan kurva profil

presisi dengan jumlah suspensi antibodi T4magnetik yang memberikan 50% peru nutterikat.

Untuk pembuatan kurva baku digunakan25 J.lliarutan baku T4dengan konsentrasi 0,10,50, 100, 150, dan 250 nmol/l. Kemudian ditam­bahkan 100 J.lIT4 bertanda 1251 dan 100 J.lIsuspensi antibodi T4-magnetik. Campuran dia­duk dengan pengaduk vortex, diinkubasi sambildiputar selama 2 jam pada suhu kamar. Selan­jutnya ke dalam campuran ditambahkan 1 mllarutan dapar pencuci. Partikel magnet yangmengandung fraksi terikat dipisahkan denganpelat magnetik. Endapan kemudian dicuci de­ngan 1 ml larutan dapar pencuci dan keaktif­annya ditentukan dengan pencacah sinary. Pro­tokol RIA untuk percobaan ini dapat dilihatpada Tabel1 ( lihat halaman berikut).

Dari hasil percobaan kemudian dibuatgrafik antara fraksi terikat dan konsentrasi T4serta grafik profil presisi yang menggambarkanhubungan antara % koefisien variasi (% CV)dengan konsentrasi.b). Penentuan volume pereaksi optimal untuk

mendapatkan daerah kerja dengan kepeka­an yang diinginkan.

Untuk maksud ini dilakukan berbagaikombinasi dengan disain percobaan sebagaiberikut:1. 25 J.lIlarutan baku T4, 100 J.lIT4 bertanda

1251,100 J.lIsuspensi T4 magnetik.2.50 J.lI larutan baku T4, 100 J.lIT4 bertanda

1251, 100 J.lIsuspensi T4 magnetik.3.25 J.lI larutan baku T4, 50 J.lIT4 bertanda

1251,50 J.lIsuspensi T4 magnetik.4. 100 J.lIlarutan baku T4, 100 J.lIT4bertanda

1251, 100 J.lIsuspensi T4 magnetik.5. 50 J.lI larutan baku T4, 50 J.lIT4 bertanda

1251,50 J.lIsuspensi T4 magnetik.Percobaan dilakukan sesuai dengan pro­

tokol RIA yang tertera pada Tabel1. Dari selu­ruh percobaan kemudian dibuat grafik antarafraksi terikat dan konsentrasi T4 serta grafikprofil presisi.

5. Optimasi waktu inkubasi

Optimasi inkubasi diperoleh dari variasiwaktu.Pembuatan kurva baku dan kurva profilpresisi dikerjakan sesuai percobaan di atasdengan lama inkubasi 1, 2, 4, dan 24 jam padasuhu kamar.

314

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdun Teknologi Menuju Era Tinggal Landas

Bandung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN

Tabell. Protokol RIA-T4 menggunakan pemisah paartikel magnet-

Volume BlangkoKonsentrasi baku T (nmol/l)pembanding

Uti )01050100150250cuplika.n( I!l)

T15free serum

-25------ -

1 1-T4100100100100100100100100100

Larutan baku--252525252525 -

Suspensi antibodiT 4-100"100100100100100100100

partikel magnet Cuplikan

-------- 25

1nkubasi selama 2 iam pada suhu kamar sambil diputar

- Tambahkan 1 mllarutan dapar pencuci- Pisahkan partikel magnet dengan menggunakan pelat magnetik- Pisahkan supernatan dan tentukan keradioaktifan dari endapan..- Suspensi partikel; magnet-CD1 tanpa antibodi

6. Pengujian karakteristik RIA T4 caramagnetik

Setelah diperoleh disain penentuan secaraoptimal maka langkah selanjutnya dilakukanpengujian beberapa parameter pengendalianmutu internal (internal quality control) yangmenggambarkan karakteristik suatu kit RIA.Hal ini dilaksanakan dengan mengevaluasi ni­lai besaran: ikatan tak spesifik (NSB), ikatanmaksimum (Botr), konsentrasi yang membe­rikan 50% BlBo (Ed 50) dan koefisien variasiantar penentuan (interassay) cuplikan kontrolserta profil presisi. Sebagai pembanding digu­nakan kit RIA-T4 tabung bersalut produksiDPC, dan kit RIA-T4 cara magnetik produksiAmersham.

HASILDAN DISKUSI

Dalam penggunaan RIAdengan sistem pe­misahan fase padat, antibodi spesifik diimobi­lisasikan pada suatu penunjang fase padat sebe­lum assay dilakukan. Untuk maksud ini dibu­tuhkan antibodi dengan kemurnian, titer,spesifisitas dan aviditas yang tinggi, sebabhanya antibodi dengan sifat tersebut di atasyang memungkinkan terjadinya ikatan antaraantigen dengan antibodi fase padat dan diper­olehnya hasil penentuan dengan kepekaantinggi (3).Antibodi dengan titer rendah kurangbaik untuk penentuan RIA fase padat, sebabantigen yang terikat (%Bo/T) sangat rendah.Hal ini akan memberikan bentuk kurva bakulandai yang akan mengurangi kepekaan danpresisi percobaan.

Untuk memperoleh antibodi yang meme­nuhi persyaratan agar dapat diimobilisasikan

pad a penunjang padat, maka dilakukanpemurnian antibodi T4' Dari berbagai cara, ter­bukti bahwa pemurnian menggunakan proteinA- sepharosa adalah yang terbaik (2). Dengancara ini diperoleh fraksi 19G-T4 sebesar H10I!g/ml.

Sebelum dilakukan imobilisasi pada parti­kel magnet, ditentukan terlebih dahulujumlahantibodi maksimum, dan dari hasil percobaanternyata penambahan 0,5 ml 19Ganti T4 mem­berikan hasil yang optimum. Hasil imobilisasiantibodi pada permukaan partikel magnet diujidengan melakukan penentuan titer. Dari kuX"Vatitrasi 19G-T4fase padat pada Gambar 1 dapatdisimpulkan, bahwa dengan volume suspensi19G-T4-partikel magnet sebesar 50- 100I!lmem­berikan hasil yang cukup baik untuk penen­tuan RIA,yaitu yang memberikan 50%perunutterikat. Dengan kondisi tersebut selanjutnyadilakukan disain dan optimasi assay. Untukmaksud tersebut dilakukan penentuan volumepereaksi dan waktu inkubasi optimal. Data pe­nentuan hasil optimasi dari berbagai kombinasivolume pereaksi dapat dilihat pada Gambar 2dan Tabel 2, dan data hasil optimasi variasiinkubasi dapat dilihat pada Tabel 3. Terbuktibahwa disain penentuan dengan 50 I!l larutanbaku T4 (cuplikan), 50 I!l T4-bertanda 1251Clan50 I!l suspensi 19G-partikel magnet serta wak­tu inkubasi 2 jam memberikan percobaan yangcukup peka pada daerah kerja yang diinginkan,yaitu antara 25 - >1500 nmol/l. Nilai normal T4berkisar antara 60 - 150 nmol/l. Data menun­jukkan bahwa volume pereaksi mempengaruhibatas deteksi. Bila diinginkan penentuan pnda

315

Pror:eedings Seminar Reakror Nuklir dalam Penelitian Sainsclan Teknologi MenuJu Era Tinggal Landas

•".

"

30

'.,i

,0L . 12'5 10 "'50 25 'Ii kel magnet200 '~ Volume par

Gambar 1. Kurva hasil penentuan titer IgG-T4pa rtikel magnet.

Bandung, 8 -10 Okrober 1991PPTN - BATAN

Tabel 2..-

KombinaslBarrEd 50Batas profil

pereaksi

(%)(nmoI/l)presisi(nmoI/l)1.25 !AIbaku

50,993,744 - >1323

50 !AI1251T- 4

50 !Alanti-T4 magnetik2.50 !AIbaku

53,4114,753,4 - 900

100 !AI1251-T4 100 !AIanti-T4magnetik3.100 !AIbaku

47,057,428,0->2000

100 !AI1251_T4 100 !Alanti-T4magnetik4.50 !AIbaku

51,649,525,0 - 650

50 !AI1251-T4 50 !AIanti-T4magnetik5.25 !AIbaku

56,5237,3180 -)1800100 !AI1251-T4 100 !AIanti-T4magnetik

100 !AIX, 100 !AIY, 100 !AIZ;

Gambar 2. Kurva baku dan profil presisi padaberbagai kombinasi pereaksi.

B = fraksi terikat; Bo = fraksi pada konsentrasiO·,X = Iarutan baku; Y = 1251-T4 ; Z = IgG-T4partikel magnet.

50

"CV

a

•. . \... '. ..••....

\<':,:~;;~~;~.;:~-.~,<'_i\.~~,~,. _..• '"

~ SO 100 500 1000 nmolll 5000Konsentrasi

Tabel 3. Hasil variasi waktu inkubasi

Waktu BolTEd 50Batas profilinkubasi

(%)(nmoI/l)presisi(nmoI/l)1jam

75,946,121 - 700

2 jam76,255,825 - > 1500

4jam72,055,625 - 650

24jam62,359,929 - 600

daerah konsentrasi rendah, maka dibutuhkanvolume cuplikanyang Iebih besar. Faktor utamayang mempengaruhi waktu inkubasi ialah avi­ditas antibodi yang digunakan. Makin tinggiaviditas suatu antibodi, maka waktu yang dibu­tuhkan untuk mencapai keseimbangan makinpendek. Hal lain yang berpengaruh adalah bo­bot molekul antigen yang akan ditentukan.Mengingat bahwa T4mempunyai bobot molekul777, maka untuk mencapai keseimbangan tidakdibutuhkan waktu inkubasi yang terlalu lama.Untuk memperoleh kepekaan analisis dan pre-

316

Proceedings Seminar ReMwr Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas

Bandung, 8- 10 Okwber lS91PPTN - BATiW

.untuk kadar rendah, menengah dan tinggi. Darihasil pengujian kinerja penentuan dapat disim­pulkan bahwa ketiga kit tersebut mempunyaipersamaan karena tidak menunjukkan perbe­daan yang nyata .

Untuk menguji kestabilan suspensi IgG··T4partikel magnet dilakukan penentuan waktukadaluwarsa. Hasil pengamatan menunjukkanbahwa suspensi partikel magnet tersebut ma:sihcukup stabil untuk jangka waktu lebih kurang5 bulan. Hasil dapat dilihat pada Tabel 5.

sisi percobaan yang lebih baik biasanya dibu- berturut-turut untult kadar rendah, menengahtuhkan waktu inkubasi yang lebih lama. dan tinggi. Untuk h~ RIA-T4 tabung bersalut

Hasil pengujian kinerja penentuan (assay produksi DPC diperoleh nilai ikatan tak spe-performance) dapat dilihat pada Tabel 4. sifik (4,5 ± 0,5)%, ikatan maksimum (55,5 ±

Data percobaan menunjukkan bahwa 3,1)%, konsentrasi pada 50% B/Bo: (115,5 ±penggunaan IgG-T4 partikel magnet sebagai 13,3)nmol/l dan untuk cuplikan kontrol mem­pemisah rase padat pada kit PPTN memberikan berikan nilai (34,8 ± 6,1) nmol/l, (88,5 ± 6,5)nilai ikatan tak spesifik (NSB) berkisar antara nmol/l, dan (144,8 ± 6,9) nmol/l berturut-turut

Tabel 4. Hasil pengujian kinerja penentuan dari berbagai macam kit

PPTNAmershamDPC

(magnetik)(magnetik)(coated tube)

Borr (%)

54,2 ± 8,373,7 ± 3,255,5 ± 3,1Kemiringan

1,06 ± 0,091,06 ± 0,051,04 ± 0,04Ed 50 (nmol/l)

44,9 ± 5,055,5 ± 1,9115,5 ± 13,3NSB (%)

3,9 ± 0,63,8± 0,44,5 ± 0,5Cup. rendah (nmol/l)

37,7 ± 3,534,2 ± 0,734,8 ± 6,1Cup.menengah

96,2 ± 5,294,1 ± 1,588,5 ± 6,5(nmol/l) Cup. tinggi (nmol/l)

146,3 ± 6,7149,7 ± 7,9144,8 ± 6,9

(3,9 ± 0,6)%, ikatan maksimum (Bo/T)(54,2 ±8,3)%. Konsentrasi 50% B/Bo (Ed 50) diperolehnilai (44,9 ± 5,0) nmol/l dari 9 kali penentuan.Penentuan cuplikan kontrol antar assay mem­berikan hasil (37,7± 3,5) nmol/l untuk cuplikankadar rendah, (96,2± 5,2)nmol/l untuk cuplikankadar menengah, dan (146,3± 6,7) nmol/l untukcuplikan kontrol kadar tinggi. Untuk kit RIA-T4cara magnetik produksi Amersham diperolehnilai-nilai ikatan takspesifik (3,8± 0,4)%,ikatanmaksimum (73,7± 3,2)%,konsentrasi pada 50%B/Bo :(55,5 ± 1,9)nmol/l dan untuk cuplikankontrol memberikan nilai (34,2 ± 0,7) nmol/l,(94,1 ± 1,5) nmol/l, dan (149,7 ± 7,9)nmol/l

Tabel 5. Hasil penentuan kestabilan suspensi IgG-T4 partikel magnet

Waktu0141119

(minggu)Borr (%)

55,461,664,559,753,2Kemiringan

0,91,11,01,20,9Ed 50 (nmol/l)

45,943,846,037,433,9NSB (%)

3,14,44,44,810,1QC-A (nmol/l)

34,532,335,838,348,8QC-B (nmol/l)

101,288,8106,294,199,4QC-C(nmol/l)

159,8147,4142,6145,0162,5

Catatan : Batas nilai cuplikan kontrol

QC-A: 32,3 - 46,5 nmol/l; QC-B : 87,6 - 104,0 nmol/l; QC-C : 138,0 - 163,0 nmol/l.

317

Prcx<eedingsSerrU/'UU"Reahtor Nuklir dalam Penelitian Sainsclan Tekrwlogi Menuju Era TInggal Landas

KESIMPUIAN:Pemisahan fase padat menggunakan par­

tikel magnet memberikan hasil yang cukup me­m\.:laskan.Hasil penelitian ini diharapkan akan

DAFfAR PUSTAKA

Bandung, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BATAN

sangat bergun..l untuk pembuatan Kit RIA-T4fase padat.

1. Gembicki, M., A. Polanska, J. Kosowicz, "T3dan T4 solid phase radioimmunoassay with theIspesificantibodies isolated by affinity chromatography", Radioimmunoassay and Related Pro­.:;edurein Medicine, 1982, IAEA,Vienna (1982) 95-105.

2. Nanny, K H. dan kawan-kawan, "Isolasi imunogamaglobulin anti-T4 dari antisera", SeminarPendayagunaan Reaktor Nuklir untuk Kesejahteraan Masyarakat, PPTN- BATAN, Ban­dung (1990).

3. Edward, R., "Solid-phase immunoassay", Regional Training Course on Production and Useof Bulk Reagents for RIA of Thyroid Related Hormones, Bangkok, Thailand (1986).

4. Sufi, S. and Micallef, J., "Immobilisation of antibodies", International Atomic Energy AgencyRegional Course on Optimisation of Production Techniques and Distribution Schemes forReagents for Radioimmunoassay, National Institute of Health Nonthabury, Thailand (1989).

5. Catt, KJ., Niall, H.D., Tregear,G.W., Solid-phase radioimmunoassay of .human growth hor­mone, Biochem.J. 100 (1966) 31c.

6. Ratnawati K., dan Pringgo Soedigdo, "Pembuatan antibodi T4 untuk bahan pereaksi RIA",Seminar Pendayagunaan Reaktor Nuklir untuk Kesejahteraan Masyarakat , PPTN-BATAN,Bandung (1990).

DISKUSI

Nanny Kartini:1. Bila dilihat dari hasil percobaan membandingkan RIA-magnetik yang dibuat dengan kit RIAkomersiallain, terlihat bahwa ED-50 dari partikel magnetik 49 nmol/l sedangkan DPC = 115nmol/l. Apakah yang menyebabkan perbedaan ini ?2. Berapakah kadar normal dari T4 ?Ratnawati K :1. Biasanya Ed-50 berada disekitar daerah normal T4 dan terlihat bahwa pada kit DPC, ED-50nya cenderung lebih tinggi, ini berarti bahwa kit DPC lebih peka di daerah tinggi. Ed50 daripartikel magnet PPTN = 49 nmol/l, walaupun ED-50 nya berbeda cukup besar, tetapi masihmencakup daerah kerja yang cukup lebar yaitu antara 25 - > 1500 nmol/l, sehingga perbedaanED-50 antara kit DPC dan kit PPTN partikel magnet tidak berpengaruh besar.2. Kadar normal dari T4 adalah 60 - 150 nmol/l.

n[)onSuparman :Mohon dijelaskan prinsip penempelan antibodi T4 pada partikel magnet!Ratnawati Kukuh:Prinsip penempelan antibodi T4 pada cellulosa-partikel magnet adalah sebagai berikut :Penempelan dilakukan secara kimia dengan terlebih dahulu mereaksikan cellulosa-partikel

magnet + CDI (carboni! di imidazol). Selanjutnya antibodi T4 (gugus amida pada antibodi T4 )bereaksi dengan gugus carbonil dari CD!.

318