Infección por Helicobacter pylori en pacientes

sintomáticos con patología gastroduodenal benigna.

Análisis de 5.664 pacientes

Helicobacter pylori infection in symptomatic patients with benign gastroduodenal diseases. Analysis of 5.664 cases

JUAN PABLO ORTEGA1, ALBERTO ESPINO2, ALFONSO CALVO B.3, PATRICIA

VERDUGO3, MARTHA PRUYAS4, EVA NILSEN4, LUIS VILLARROEL5, OSLANDO PADILLA5, ARNOLDO RIQUELME2, ANTONIO ROLLÁN6

1Servicio de Medicina, Hospital Dr. Sótero del Río. 2Departamento de

Gastroenterología, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile. 3

Unidad de Endoscopia, Centro de Referencia de Salud San Rafael, La Florida,

Servicio de Salud Metropolitano Sur Oriente. 4Departamento de Anatomía

Patológica, Hospital Dr. Sótero del Río. 5Departamento de Salud Pública y Centro de

Investigaciones Médicas. Pontificia Universidad Católica de Chile. 6Departamento de

Enfermedades Digestivas y Latin American Endoscopic Training Center. Universidad del Desarrollo. Clinica Alemana de Santiago, Chile.

Dirección para correspondencia

Infection with Helicobacter pylori (H. pylori) is highly prevalent in Chile, but there

are no systematic studies in patients with upper gastrointestinal symptoms. Aim:

To determine the prevalence of H. pylori infection, according to age, gender and

endoscopic pathology in a large sample of patients. Methods: We studied 7,893

symptomatic patients submitted to upper gastrointestinal endoscopy between July

1996 and December 2003 in the context of a screening program of gastric cancer in

a high risk population. H. pylori infection was determined by rapid urease test

(RUT) in antral mucosa. We excluded 158 patients with gastric cancer (2%) and

2,071 patients without RUT. Results: We included 5,664 patients, mean age 50.7

± 13.9 years, women 72.1%. Endoscopic diagnoses were normal in 59.3%, erosive

esophagitis in 20%, gastric ulcer (GU) in 8.1%, duodenal ulcer (DU) in 6.4%, and

erosive gastropathy in 6.2%. RUT was positive in 78% of patients. After adjusting

for age and sex and with respect to patients with normal endoscopy, frequency of

H. pylori infection was 86.6% in DU (OR 2.1, 95% CI 1.5-2.8, p < 0.001); 81.4% in

GU (OR 1.8, 95% CI 1.4-2.4; p < 0.001 ); 79.9% in erosive gastropathy (OR 1.4,

95% CI 1.03-1.8; p = 0.03) and 77.4% in erosive esophagitis (OR 1.1, 95% CI:

0.9-1.3; p = NS). The probability of H. pylori infection decreased significantly with

age, more markedly in men with normal endoscopy. Conclusions: Prevalence of H.

pylori infection is very high in symptomatic Chilean patients and even higher in

those with gastroduodenal ulcer or erosions, while in patients with erosive

esophagitis is similar to those with normal endoscopy. The frequency of infection

decreases with age, probably as a consequence of rising frequency of gastric mucosal atrophy.

(Key words: Helicobacter pylori, Epidemiology, Peptic ulcer, Gastroscopy.)

Hace más de 20 años que Marshall y Warren cultivaron en mucosa gástrica humana

una bacteria Gram negativa, conocida actualmente como Helicobacter pylori (H.

pylori) y demostraron su rol etiopatogénico en la úlcera péptica gastroduodenal1,2.

Su trabajo generó una revolución en la comprensión y tratamiento de patologías

digestivas tan importantes como úlcera péptica y cáncer gástrico (CG), por lo que fueron premiados con el Premio Nobel de Fisiología y Medicina 2005.

La infección por H. Pylori afecta aproximadamente a 50% de la población mundial3.

Se adquiere mayoritariamente en la infancia y presenta una baja frecuencia relativa

(20-40%) en países desarrollados y una alta frecuencia (hasta 90%) en países en

desarrollo. En Chile, en población adulta asintomática alcanza 73% (IC 95% 70-

76%)4. Se asocia a una gastritis de intensidad variable, generalmente asintomática.

Casi toda la información publicada sobre esta infección proviene de países

desarrollados y es posible que muchos de los conceptos y conductas derivados de

este conocimiento, no puedan simplemente extrapolarse a los países en vías de desarrollo.

Hasta 15% de los sujetos infectados desarrollarán una úlcera péptica en el curso de

su vida, encontrándose la bacteria en más de 90% de las úlceras duodenales y en

70% de las úlceras gástricas5-7. La erradicación de la infección se asocia a la

curación de la úlcera en la mayoría de los casos y disminuye su recurrencia8. Por

otro lado, una pequeña proporción de los infectados desarrollará un CG, generalmente precedido por una gastritis crónica atrófica.

La infección por H. pylori se ha relacionado con otras patologías digestivas de alta

frecuencia, como el reflujo gastroesofágico (RGE) y la dispepsia funcional (DF). La

información disponible es contradictoria, pero sugiere que existe una correlación

inversa entre la frecuencia de RGE y la de H. pylori, más evidente en países con

alta prevalencia de infección9-11. Respecto a la DF, una de las causas más

frecuentes de consulta ambulatoria por síntomas digestivos, el rol etiológico del H.

pylori es incierto. La mayoría de los estudios publicados provienen de países con

baja frecuencia de infección y no muestran diferencias significativas entre

dispépticos y controles11-13, aunque la última revisión sistemática de la Cochrane

sugiere que la erradicación de H. pylori se asocia a una pequeña, pero significativa

mejor respuesta sintomática respecto a placebo14. Una vez más, existe escasa información de áreas geográficas con alta frecuencia de infección15.

El objetivo principal del presente estudio fue determinar la prevalencia de infección

por H. pylori en pacientes con síntomas digestivos con indicación clínica de

endoscopia digestiva alta y correlacionar la frecuencia de la infección con las patologías más frecuentemente diagnosticadas.

Pacientes y Método

Se realizó un estudio prospectivo de pacientes que consultaron por dolor o molestia

abdominal alta mayor a dos semanas de evolución, que fueron derivados al Centro

de Referencia de Salud de La Florida, comuna urbana de Santiago de Chile con una

alta mortalidad por cáncer gástrico4 y que fueron sometidos a endoscopia digestiva

alta y búsqueda de H. pylori, en el contexto de un programa de pesquisa precoz de cáncer gástrico16.

Se emplearon endoscopios de fibra óptica Olympus, modelos GIF E y P3, con

técnica estándar, luego de consentimiento informado. Todos los procedimientos

fueron realizados por el mismo endoscopista (AC), bajo sedación moderada con

midazolam i.v. La determinación de H. pylori se realizó mediante test de ureasa rápido (CLOtest®, Kimberly-Clark)17 en una biopsia obtenida del antro proximal.

Se incluyeron pacientes estudiados entre julio de 1996 y noviembre de 2003. Se

excluyeron los que habían usado recientemente antibióticos (< 1 mes),

antagonistas de receptores H2 o inhibidores de la bomba de protones (< 2

semanas) y aquellos en los que no se realizó test de ureasa, por falta de

disponibilidad del test al momento de la endoscopia. También se excluyeron los

pacientes con CG, objeto de un reporte previo16. Sólo se consideró la endoscopia

inicial de cada paciente.

De acuerdo a los hallazgos endoscópicos los pacientes fueron clasificados en las

siguientes categorías: 1) Normal; 2) Esofagitis erosiva; 3) Gastropatía erosiva; 4)

Úlcera gástrica; 5) Úlcera duodenal. Los pacientes con más de una lesión fueron

categorizados de acuerdo a la de mayor gravedad (U. gástrica > U. duodenal >

Esofagitis erosiva > Gastropatía erosiva). Alteraciones inespecíficas de la mucosa

gástrica como congestión, eritema, o disminución aparente de los pliegues,

generalmente diagnosticados como "gastritis", o aquellos con alteraciones

inespecíficas de la mucosa esofágica, diagnosticada a menudo como "esofagitis no erosiva", fueron consideradas normales.

Análisis estadístico: Se utilizó test chi-cuadrado para comparar la presencia de H.

pylori entre distintos grupos. Para cuantificar el riesgo de H. pylori en las distintas

patologías se calcularon Odds Ratio (OR) crudos con intervalo de confanza de 95%.

Para determinar variables asociadas en forma conjunta con el resultado del test de

ureasa se ajustaron modelos de regresión logística binaria. Estos modelos

permitieron obtener OR del riesgo de infección por H. pylori para las distintas

patologías ajustados por edad y sexo. Para mostrar la relación entre la edad y la

prevalencia de H. pylori se representó el logit de la probabilidad [logit (p) = ln

(p/(1-p))] según diagnóstico y sexo, que tiene la ventaja de ser monótona

creciente en p y lineal en los regresores. Se utilizó el programa SPSS 15.0 para Windows, considerándose significativo valor p < 0,05.

Resultados

Durante el período de estudio, se realizaron 9.616 endoscopias en 7.893 pacientes.

Se excluyeron 2.229 por los criterios previamente descritos, de los cuales 158 (2%)

correspondieron a pacientes con CG. Un total de 5.664 pacientes fueron finalmente incluidos.

La Tabla 1 muestra las características demográficas de la muestra. La edad

promedio fiue de 50,7 años, con rango entre 14 y 90 años. El 72,1% fiueron

mujeres. El test de ureasa fiue positivo en 78% de los casos, sin difierencias

significativa por sexo (78,5% y 77,8% en hombres y mujeres, respetivamente; p = NS).

La Tabla 2 muestra la frecuencia de los diagnósticos endoscópicos. La endoscopia

fue normal en 59,3% de los pacientes. La esofagitis erosiva estuvo presente en

20%, constituyéndose en la patología más frecuente de la muestra. La úlcera

gástrica fue más frecuente en pacientes de mayor edad (74,4% de los casos en

mayores de 50 años), mientras la úlcera duodenal se distribuyó a lo largo de todo el espectro etario (25,5% en menores de 40 años y 34,3% en mayores de 60).

La Tabla 3 muestra que la distribución de los hallazgos endoscópicos fue

significativamente distinta al comparar ambos sexos (p < 0,0001). Una endoscopia

normal fue más frecuente en mujeres, mientras todos los hallazgos patológicos, excepto la gastropatía erosiva, fueron más frecuente en hombres.

La Tabla 4 muestra la asociación entre infección por H. pylori y patología

endoscópica, en comparación con la población con endoscopia normal. Se observa

una asociación significativa entre infección por H. pylori y gastropatía erosiva,

úlcera gástrica y úlcera duodenal, que es más marcada en relación con esta últ ima.

En la muestra estudiada, casi 90% de los pacientes con úlcera duodenal y más de

80% de los ulcerosos gástricos portaban la bacteria. No hubo asociación, en cambio, entre infección por H. pylori y esofagitis erosiva.

En la Figura 1 se muestra la frecuencia de H. pylori por grupo etario, para el grupo

con endoscopia normal y para aquellos con úlcera gástrica o duodenal. A partir de

la cuarta década se aprecia una tendencia a la disminución, que parece más

evidente en los pacientes con endoscopia normal y más tardía en los pacientes con

úlcera duodenal. La Figura 2 muestra un análisis multivariado (logit de

probabilidades) del riesgo de infección por H. pylori en función de la edad, sexo y

diagnóstico endoscópico. En esta muestra la probabilidad de infección disminuye

signifcativamente con la edad y esta disminución es significativamente mayor en

hombres, especialmente en aquellos con endoscopia normal.

Figura 1. infección por H. pylori en función de la edad y grupo

diagnóstico.

Figura 2. infección por H. pylori en función de la edad, sexo y

grupo diagnóstico. Análisis multivariado (logit de Probabilidad).

Discusión

Este estudio comprende una gran serie de casos de pacientes sintomáticos

provenientes de un área geográfica caracterizada por una alta frecuencia de

infección por H. pylori y alta mortalidad por CG, condiciones que lo distinguen de la

mayor parte de las publicaciones relacionadas con el tema. Las conclusiones son

probablemente aplicables a poblaciones que compartan estas características, hasta

ahora subrepresentadas en la literatura disponible. Es importante destacar que en

Chile existe una evidente heterogeneidad respecto al riesgo de CG, siendo más

frecuente en comunas y población de menor nivel socioeconómico, hacia las cuales deben enfocarse predominantemente las conclusiones de este estudio.

El tamaño muestral nos permitió demostrar correlaciones y diferencias imposibles

de analizar en muestras de menor tamaño. La categorización de los hallazgos

endoscópicos fue exigente, sin considerar como patológicos hallazgos con alto

componente subjetivo ("gastritis") y dudosa representación sintomática. Desde esta

perspectiva, la demostración de patología en 40% de los pacientes sugiere que la

endoscopia estuvo en general bien indicada, especialmente en el caso de los

hombres. La evidente sobrerepresentación de las mujeres (70% de la muestra) y la

significativa menor frecuencia de hallazgos patológicos en ellas (37,1% vs 50,7%

en los hombres; p < 0,001), sugieren que, en esta población, probablemente el

sexo determina diferencias en los patrones de consulta médica, aunque el estudio

no fue diseñado para entregar información causal al respecto, de modo que no

contamos con un registro detallado de la sintomatología que motivó la indicación de endoscopia.

La esofagitis erosiva constituyó la principal patología detectada, afectando a 20%

de los pacientes. Si consideramos que la mayoría de los pacientes con RGE no tiene

esofagitis endoscópica18, la proporción de pacientes con RGE debe ser aún mayor.

La coexistencia de una alta frecuencia de RGE con una alta frecuencia de H. pylori y

el que la prevalencia de esta última haya sido similar en los pacientes con y sin

esofagitis sugieren que, al menos en esta población, la infección por HP no parece tener un efecto protector relevante respecto al RGE.

La úlcera gastroduodenal estuvo presente en 15% de los pacientes y se asoció

significativamente a la presencia de H. pylori. El que esta asociación sea

significativa aun en una población con tan alta frecuencia basal de infección, apoya

el rol etiológico de H. pylori en la úlcera péptica. A diferencia de la tendencia que se

observa en países desarrollados, en los que la proporción de úlceras no asociadas a

H. pylori va en aumento19, la infección fue casi universal en los pacientes ulcerosos

y sugiere que la erradicación empírica de H. pylori en pacientes con úlcera gastroduodenal es probablemente costo-efectiva en esta población.

La significativa asociación entre infección por H. pylori y gastropatía erosiva es

esperable dado que, junto con los antiinflamatorios no esteroidales, es considerada

el principal factor etiológico para esta patología. A diferencia de la esofagitis y la

úlcera, no existe un correlato claro entre la alteración anatómica y las

manifestaciones clínicas. Es imposible saber en cuantos de estos pacientes (la

mayor parte probablemente con síntomas inespecíficos y por lo tanto calificables de

"dispépticos") los síntomas estaban relacionados con las erosiones gástricas. Sólo la

erradicación de la infección y un posterior seguimiento clínico y endoscópico

pudiera contestar esta pregunta. La erradicación de H. pylori ha sido sugerida como

la terapia de elección para los pacientes dispépticos en la mayor parte de las guías

clínicas de países desarrollados20, aun cuando la mayor parte de los pacientes

persistirá sintomático luego del tratamiento14. En nuestro entorno de infección casi

universal la indicación de erradicación de H. pylori a todos los pacientes dispépticos

tiene múltiples implicancias potenciales, que demandan estudios de costo-

efectividad aún no disponibles. En el intertanto, erradicar al menos a aquellos con

gastropatía erosiva parece una conducta razonable, sobre todo considerando la

reconocida asociación entre erosiones antrales y úlcera péptica21 y el hecho de que

hasta 8% de los pacientes dispépticos con endoscopia normal desarrollan una

úlcera durante el seguimiento22. Es plausible suponer que el grupo con erosiones

antrales concentre especialmente a los ulcerosos no reconocidos, que son

precisamente los que más se benefician de la erradicación de H. pylori. Esta conducta requiere ser validada con estudios específicamente diseñados.

El tamaño de la muestra permitió realizar análisis de subgrupos. La frecuencia de

infección por H. pylori muestra una tendencia descendente con la edad, que es

mayor en hombres y en aquellos con endoscopia normal. Este hallazgo reproduce lo

observado previamente en un estudio serológico de población asintomática4. Es

probable que la progresiva instalación de atrofia gástrica (AG) determine un

ambiente hostil para la sobrevivencia de H. pylori y probablemente sea una

característica común en países con alta prevalencia de H. pylori y CG, aunque no

tenemos conocimiento de que haya sido descrita previamente. Esto contrasta con lo

observado en países con baja prevalencia de H. pylori, donde la frecuencia de la

infección aumenta en la población de mayor edad23, lo que se ha atribuido a un

efecto de cohorte determinado por la disminución progresiva en el riesgo de

infección en la infancia. La Figura 1 muestra que la caída en la frecuencia de H.

pylori es menor y más tardía en los pacientes con úlcera duodenal, que tienen

menor riesgo de AG y CG24, lo que parece apoyar esta interpretación, aunque la

ausencia de histología impide confirmar esta hipótesis. En estudio epidemiológico

previo comprobamos un significativo ascenso en la frecuencia de AG (determinada

por serología) a contar de los 60 años, que coincidió inversamente con la caída en

la frecuencia de infección por HP25. Esta observación tiene implicancias prác ticas:

para identificar la población con riesgo de CG en nuestro medio es necesario

detectar especialmente el grupo con AG y H. pylori (-), ya que concentra el mayor

riesgo de CG. El diagnóstico simultáneo de ambas condiciones puede realizarse en

forma no invasiva mediante la determinación serológica de pepsinógeno y

anticuerpos contra H. pylori en población asintomática, y mediante histología en

pacientes sintomáticos con indicación de endoscopia. Probablemente en todo

paciente sometido a una endoscopia alta debiera realizarse un test de ureasa para

detectar y eventualmente tratar la infección por H. pylori, pero estos datos

permiten sugerir que en hombres y mujeres mayores de 40 y 50 años,

respectivamente (10 años antes del quiebre respectivo en la frecuencia de CG en

población Chilena) debiera realizarse además biopsias gástricas para detectar AG.

Nuevamente, determinar el protocolo de biopsias más costo efectivo requiere estudios específicos.

En resumen, comprobamos una alta frecuencia de infección por H. pylori en

pacientes sintomáticos digestivos con endoscopia normal, que es aun mayor en

pacientes con úlcera gastroduodenal o gastropatía erosiva, pero no en aquellos con

esofagitis por RGE, la patología benigna del tubo digestivo alto más frecuente. La

infección casi universal permite sugerir la erradicación empírica (aun sin infección

demostrada) como una estrategia razonable en pacientes ulcerosos en nuestra

población. La disminución en la frecuencia de H. pylori demostrada en los pacientes

de mayor edad confirma lo observado previamente en población asintomática4,25,

sugiere que pudiera tratarse de una característica particular de poblaciones con alta

frecuencia de H. pylori y CG y plantea la conveniencia de agregar la histología al estudio endoscópico en los pacientes dispépticos que concentran el riesgo de CG.

Agradecimientos: Queremos agradecer la revisión del manuscrito y consejos de

nuestro querido Profesor Dr. Vicente Valdivieso Dávila. Departamento Gastroenterología, Facultad de Medicina, Pontific ia Universidad Católica de Chile.

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Recibido el 6 de noviembre de 2009, acepato el 27 de abril de 2010.

Correspondencia a: Dr. Antonio Rollán R. Av Vitacura 5951, Vitacura, Santiago

RM. Fono: 562-5866032 e-mail: arollan@alemana.cl

© 2013 Sociedad Médica de Santiago Bernarda Morín 488, Providencia,

Casilla 168, Correo 55 Santiago - Chile

Teléfono: 56-2-7535520

Fono/Fax:56-2-7535524

omparación de Helicobacter pylori en cavidad oral y

mucosa gástrica de acuerdo a genotipo de virulencia

(cagA y vacAm 1)

Comparison of Helicobacter pylori in oral cavity and gastric

mucosa according to virulence genotype (cagA and vacA m1)

Ester Sepúlveda, Jessica Moreno, María L. Spencer, Sandra Quilodrán, Ursula Brethauer, Carlos Briceño y Apolinaria García

Universidad de Concepción, Concepción, Chile.

Facultad de Odontología Departamento de Patología y Diagnóstico (ES, MLS, UB).

Facultad de Ciencias Biol ógicas Departamento de Microbiología (SQ, AG).

Facultad de Medicina Departamento de Medicina Interna (CB). Facultad de Ciencias Biol ógicas Departamento de Ciencias Biológicas (JM).

Dirección para correspondencia

Objective: To compare the virulence genotype (cagA and vacA ml genes) of

Helicobacter pylori obtained simultaneously from gastric mucosa and oral cavity.

Material and Methods: Gastric samples of 18 patients were obtained by endoscopic

biopsies. Oral samples of these patients were obtained from dental plaque and

saliva swabs from the floor of the mouth and the base of the tongue. All samples

were studied by conventional PCR and real-time PCR (RT-PCR). Virulence genes

cagA and vacA ml were studied by RT- PCR. Results: According to presence and/or

absence of cagA and vacAm1 genes, seven different combinations were observed.

Conclusion: These results suggest that there is a variety of genetic profiles of

Helicobacter pylori in the stomach and oral cavity, with a predominance of less virulent genotypes in the patients included in this study (cagA-, vacA m1-).

Key words: Helicobacter pylori, virulence genes, real-time PCR.

Resumen

Objetivo: Comparar el genotipo de virulencia (genes cagA y vacA m1) de

Helicobacter pylori, obtenido simultáneamente de mucosa gástrica y cavidad oral.

Material y Métodos: Para esto se incluyeron muestras de biopsias gástricas de 18

pacientes. Las muestras orales de estos pacientes fueron obtenidas de placa

bacteriana y saliva del piso de boca y base de la lengua. Las muestras fueron

estudiadas con RPC convencional y RPC en tiempo real (RPC-TR). Los genes de

virulencia cagA y vacA m1 fueron estudiados con RPC-TR. Resultados: De acuerdo a

la presencia o ausencia de los genes de virulencia cagA y vacA m1 detectados en

las muestras gástricas y orales, se pudieron diferenciar siete combinaciones

diferentes. Conclusión: Estos resultados sugieren que existe una variedad de

genotipos de virulencia en Helicobacter pylori en el estómago y la cavidad oral,

predominando en los pacientes incluidos en este estudio las cepas con genotipos asociados a menor virulencia (cagA-, vacA m1-).

Palabras clave: Helicobacter pylori, genes de virulencia, RPC en tiempo real.

INTRODUCCIÓN

Helicobacter pylori ha sido asociado a una variedad de patologías gastro-

duodenales, especialmente carcinoma gástricol. En Chile, el carcinoma gástrico es

la principal causa de muerte en hombres y la tercera en mujeres2. La prevalencia

de H. pylori en Chile varía de 73 a 83%, dependiendo del área geográfica3,4. Un

estudio reciente5 realizado en niños entre 3 y 14 años de Santiago de Chile, demostró una prevalencia de 26%, con mayor proporción en los varones.

Helicobacter pylori posee una variedad de factores de virulencia como flagelo,

morfología espiralada, ad-hesinas, enzimas y lipopolisacáridos6,7. Destacan entre

sus factores de virulencia las proteínas CagA y VacA, las cuales pueden ser

investigadas más fácilmente a través de los genes que las codifican, que se

denominan genes asociados a virulencia, específicamente en este caso, cagA y

vacA8-11. Cabe destacar que los genes cagA y vacA son actualmente importantes

marcadores genéticos asociados a virulencia en H. pylori12.

El gen cagA codifica la síntesis de la proteína CagA. La producción de esta proteína

se potencia por la presencia de pH ácido y es mediada por un sistema de secreción

tipo IV La proteína CagA induce a nivel de las células epiteliales gástricas la

producción de citoquinas inflamatorias, como la IL-8, y el reclutamiento de

leucocitos. El efecto directo sobre las células gástricas es la reducción de la

secreción de ácido13. Por otra parte, el gen vacA codifica la producción de toxina

VacA, la que presenta un mosaico genético basado en variaciones de alelos en las

regiones medias (alelos m1 o m2 y subtipos) y variaciones de señalización (alelos

s1 o s2 y subtipos)14,15. Se ha observado que los tipos s1/m1 son más agresivos y

son llamados Tox+16. La toxina VacA es secretada por aproximadamente 50% de

los tipos de H. pylori, causando degeneración vacuolar de las células epiteliales

gástricas y ulceración de la mucosa17. Se ha demostrado que los tipos vacA s1/m1

tienen una actividad citotóxica aumentada en comparación con los tipos s1/m2 y que los tipos s2/m2 no poseen ninguna actividad citotóxica14.

Estudios realizados por nuestro grupo18,19, incluyendo muestras de biopsias

gástricas de pacientes de diversas regiones de Chile, señalan la importancia de los

genes cagA y vacA m1 en la patogenicidad de H. pylori, razón por la cual fueron

considerados en esta investigación. Cabe destacar que los resultados de dichas

investigaciones generaron el consecuente desarrollo de un kit molecular en proceso

de patentamiento ("Un kit molecular de diagnóstico de cepas virulentas de Helicobacter pylori", patente en trámite, número de solicitud: 1520-08).

Diferentes investigaciones demuestran la presencia de H. pylori en la cavidad oral

(placa bacteriana y saliva), actuando como un reservorio para la bacteria20-25.

Algunos autores han encontrado una asociación entre la presencia de H. pylori en

mucosa gástrica y oral26-33. En una investigación previa realizada por nuestro

grupo, se observó la co-existencia de la bacteria en ambas localizaciones mediante

RPC en tiempo real (RPC-TR)34. En este estudio se observó que de 54 pacientes,

39% (n = 21) presentó muestras gástricas positivas para H. pylori. Todas las

muestras orales de estos 21 pacientes resultaron negativas para H. pylori mediante

cultivo. Sólo una muestra de placa bacteriana fue positiva mediante RPC

convencional y todas las muestras de saliva resultaron negativas. Sin embargo, las

muestras orales de todos los pacientes resultaron positivas mediante RPC-TR

(20/21 placa bacteriana, 21/21 saliva del piso de la boca y 20/21 saliva de la base de la lengua).

Se ha estudiado la presencia de genes de virulencia de H. pylori proveniente de

estómago y cavidad oral del mismo paciente35,36, pero de acuerdo a nuestro

conocimiento, no existen investigaciones en la población chilena. Por lo anterior, el

objetivo del presente estudio fue comparar los genotipos asociados a virulencia

(cagA y vacA m1) de H. pylori obtenido simultáneamente de mucosa gástrica y cavidad oral a partir del mismo paciente.

MATERIAL Y MÉTODOS

Pacientes. Se estudiaron muestras gástricas y orales de 21 pacientes con indicación

médica de endoscopia digestiva alta, de la Unidad de Gastroenterología del Hospital

Regional de Concepción. Se excluyeron pacientes con tratamiento antimicrobiano

para H. pylori y se obtuvo un consentimiento informado de cada paciente. Esta

investigación fue aprobada por la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción.

Obtención de muestras. Las muestras gástricas y orales fueron obtenidas de cada

paciente al momento de realizar la endoscopia digestiva. Las muestras orales se

obtuvieron de placa bacteriana sub-gingival, con una sonda dental, y las muestras

de saliva fueron obtenidas del piso de boca y base de lengua con tórulas de algodón

estériles. Las biopsias gástricas se tomaron del antro y cuerpo durante la inspección

endoscópica del estómago.

Aislamiento de ADN. El ADN del control positivo de H. pylori ATCC se obtuvo con el

kit E.Z.N.A.® para ADN bacteriano, siguiendo las instrucciones del fabricante

(OMEGA bio-tek, Norcross, GA, USA). Para las muestras orales se utilizó el kit BIO

101 Protocol Fast DNA E.Z.N.A.® (OMEGA bio-tek, Norcross, GA, USA) y para las

muestras gástricas se utilizó el kit E.Z.N.A.® para ADN tisular (OMEGA bio-tek,

Norcross, GA, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Diseño y elección de Oligos. Se obtuvo por lo menos 15 pares de partidores y

sondas mediante el sotfware Oligo 6.2, para la detección de β-actina (específica

para ADN humano), para la región 16S ARNr de H. pylori y para los genes de

virulencia cagA y vacA m1, eligiendo finalmente sólo un par de ellos, usando los

códigos de acceso de sus secuencias mostrados en la Tabla 1. La herramienta

BLASTn (Basic Local nucleotid Alignment Search Tool), disponible en NCBI (National

Center Biotechnology), permitió encontrar regiones con similitud de secuencias

nucleótido por nucleótido. Los criterios de la selección de los partidores fueron los

que tenían las mejores condiciones termodinámicas arrojadas por el programa Oligo

6.2 para el de β-actina y que además coincidieran con alguno ya probado por otros

autores, tanto para el gen 16S ARNr37, cagA38 y vacA m139. Los porcentajes de

identidad fueron de 100% para los oligos elegidos, dando un mayor puntaje de

probabilidad de unión. En la Tabla 1 se detallan los partidores elegidos, los productos esperados y su código NCBI.

RPC. Las muestras gástricas y orales fueron ratificadas con RPC convencional y

RPC-TR mediante la amplificación de una región del gen 16S ADNr. Los genes de

virulencia cagA y vacA m1 fueron estudiados con RPC-TR. Las muestras de 3

pacientes fueron descartadas, ya que no existía suficiente muestra gástrica,

dejando un total de 18 pacientes. Para confirmar la amplificación del ADN, como

control interno, se investigó la presencia del gen de la β-actina mediante RPC-TR.

Como control negativo se utilizó AlDN de Lactobacillus spp., agua grado RPC como blanco y el control positivo AlDN de H. pylori ATCC 43504.

Mezcla para RPC convencional. El preparado para RPC consistió en 10 ml de ADN,

2,5 ml de solución tampón (10X), 0,5 ml de dNTPs (10 mM), 1,25 ml de MgCl2 (50

mM), 0,125 ml de ADN Taq polimerasa, H2O grado RPC para un volumen total de

25 ml, y 1,25 ml de partidores sentido y antisentido, que se muestran en la Tabla

1. Los parámetros para RPC convencional consistieron en un período de pre-

incubación inicial de 15 min a 95°C, un período de denaturación de 30s a 95°C,

seguido de 45 ciclos de alineamiento a 55°C por 30s, un período de extensión a

72°C por 2 min y luego por 5 min, y finalmente enfriamiento a 4°C. Los productos RPC se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% bajo luz UV.

Mezcla para RPC-TR. Detección de H. pylori 16S ARNr mediante RPC-TR con sonda

de hidrólisis TaqMan. Se siguieron las instrucciones del fabricante para la mezcla de

amplificación lista para usar LightCycler® TaqMan® Master, para el equipo de

LightCycler 2.0 de Roche (catálogo 04735536001), que consiste en 9,1 μ! de H2O

grado RPC, 0,5 μL de 10 μM de sonda TaqMan, de mezcla de partidores 16S ARNr

de concentración 10 μM y 5 μl de templado de AlDN para un volumen final de 20

μL. Los parámetros de las reacciones para el equipo de RPC LightCycler 2.0 de

Roche consistieron en un período inicial de activación de la enzima a 95°C por 10

min, denaturación a 95°C por 10s, seguido de 50 ciclos de amplificación y

alineamiento a 55°C por 10s y elongación a 72°C por 8s. La presencia de productos

de amplificación específicos para H. pylori y controles positivos de H. pylori ATCC

43504 fueron monitoreados por la detección fluorescente positiva a 530 nm de la

sonda de hidrólisis FAM-TAMRA en el software del equipo y confirmado por los

tamaños de producto esperado de 119 bp en gel de agarosa al 2%, 80 v por 60 min

en luz UV. Los controles positivos asociados al valor de Tm y amplicón, fueron

previamente secuenciados en Macrogen Inc. Seoul, Korea.

Detección por RPC-TR con SYBR Green de los genes de virulencia de H. pylori cagA

y vac m1 y de las células totales con el gen β-actina como control interno. Se

siguieron las instrucciones del fabricante de la mezc la lista para usar LightCycler®

FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (catálogo 03515885001), la cual consistió

en 10μL de H2O libre de nucleasas, de MgCl2 25mM, 1 de la mezcla de partidores

cagA, vacA m1 o β-actina respectivamente, de concentración stock 10 μM, 2μl de

mezcla de SYBR Green y 5 μl de templado de ADN para un volumen final de 20 μL.

Los parámetros para las reacciones de RPC LightCycler 2.0 sugeridos en el

protocolo del fabricante consistieron en un período de activación de la enzima por

10 min a 95°C, denaturación a 95°C por 10s, seguido por 50 ciclos de amplificación

con una temperatura de alineamiento de 55°C por 10s y elongación a 72°C por

14s, análisis de curva de melting 95°C, 69°C y 95°C. La presencia de productos de

amplificación específicos para H. pylori y controles positivos para H. pylori ATCC

43504 fueron monitoreados a 530 nm para el fluoróforo SYBR Green intercalado en

la elongación a 72°C mediante el software del equipo, con el respectivo análisis de

la curva de melting característica de producto único y luego confirmado por su

tamaño 298 bp para cagA y 290 bp para vacA m1 y 289 bp para β-actina y

asociación con la curva de melting en gel de agarosa al 2%, 80v por 60 min en

transiluminador UV. Los controles positivos asociados al valor de Tm y amplicón,

fueron previamente secuenciados en Macrogen Inc. Seoul, Korea .

RESULTADOS

Como se observa en la Tabla 2, se obtuvo 7 combinaciones diferentes de genes

cagA y vacA m1, las que denominamos grupos. Ocho pacientes, correspondientes a

los grupos 1 y 2, presentaban el mismo perfil de virulencia en estómago y boca, en

base a los dos genes en estudio. Los restantes 10 pacientes, correspondientes a los

grupos 3 al 7, presentaban cepas de H. pylori con perfiles genéticos asociados a virulencia diferentes en cavidad oral y mucosa gástrica.

También podemos observar en esta tabla que no se detectó en paciente alguno la

presencia simultánea de H. pylori con su genotipo más virulento (cagA+, vacA m1

+), ni en cavidad oral ni en mucosa gástrica. Sin embargo, al analizar por separado

ambos compartimentos, se observa que en las muestras gástricas, dos pacientes

(correspondientes a los grupos 4 y 5) poseían este genotipo. Dos pacientes

presentaban cepas de H. pylori con el perfil cagA+, vacA m1- y cinco el perfil cagA-

, vacA m1+. Por otra parte, en las muestras orales, tres pacientes presentaban el

genotipo asociado a virulencia cagA+, vacA m1- (correspondientes a los grupos 1 y

3), un paciente presentaba el genotipo de H. pylori cagA-, vacA m1+ y los

restantes pacientes (n = 14) presentaban cepas de H. pylori con el genotipo cagA-, vacA m1-.

DISCUSIÓN

Varios estudios han demostrado la presencia de H. pylori simultáneamente en

cavidad oral y mucosa gástrica, mostrando diferentes prevalencias, dependiendo de

la población estudiada, la selección de la muestra y técnicas de detección de la

bacteria26-33,40. Mapstone41, demostró que la presencia de H. pylori en la boca de

pacientes dispépticos es importante para su diseminación y considera la cavidad

oral una potencial fuente de reinfección luego de la erradicación del microorganismo

del estómago. Esto último, fue una de las motivaciones para realizar esta investigación.

Sin embargo, es sabido que la identificación de especies bacterianas de la cavidad

oral es particularmente difícil debido a que existen más de 500 especies en la placa

bacteriana oral42 y más de 700 especies en la cavidad oral en general43. Por ello, es

necesario contar con métodos lo más específicos y sensibles para la detección e

identificación de H. pylori. La especificidad en la identificación de este

microorganismo se evidencia en su cultivo bacteriológico, y se ha observado que

muestras con cultivos gástricos positivos para H. pylori también presentan

resultados positivos para muestras orales mediante RPC-TR34, avalando la

especificidad de este método molecular para esta bacteria. Sin embargo, en cuanto

a la sensibilidad, algunos autores han reportado esfuerzos insatisfactorios para

cultivar H. pylori de la cavidad oral44. Esto puede deberse a un bajo número de

bacteria en la boca debido a una inhibición producida por la compleja microbiota

oral o debido a la forma cocoide de la bacteria, que no es detectable mediante

técnicas de cultivo tradicionales45. La conversión de la forma bacilar a cocoide se

acompaña de una gran disminución de las unidades formadoras de colonias por

mililitro (ufc/ml)46. Se sabe que la forma cocoide es una forma viable pero no

cultivable en los métodos clásicos de cultivo de este microorganismo, como el agar

Columbia47,48. Recientemente el trabajo de Al-Sulami y cols.49, presenta la primera

evidencia de crecimiento de H. pylori en agua potable municipal, esto gracias al

desarrollo de un medio selectivo, llamado agar modificado urea Columbia (MCUA)50.

Diversos autores51,52 discuten la importancia de desarrollar nuevas técnicas para la

detección, aislamiento y cultivo de bajos recuentos de H. pylori en placa bacteriana

oral. De acuerdo a nuestros resultados, creemos que este problema ha sido

parcialmente superado, pues es posible detectar el ADN de la bacteria, aunque no

se logre su aislamiento. Sugerimos, por tanto, que para las muestras orales con

bajos números de H. pylori, la técnica de elección para su detección sea la RPC-TR.

Si bien cabe destacar que en este trabajo se incluyeron sólo dos genes asociados a

virulencia, los genes seleccionados, cagA y vacA m1, partes del cromosoma

bacteriano, siguen siendo importantes marcadores genéticos asociados a virulencia

en H. pylori12. Específicamente cagA se encuentra formando parte de las islas de

patogenicidad cag (cagPAI)12. Las islas de patogenicidad en bacterias

gramnegativas, como lo es H. pylori, suelen poseer genes para movilizarse, por lo

tanto, es posible que provengan de un proceso de captación de información

genética tipo conjugación y tener capacidad de transferirse. No sucede lo mismo con el gen vacA, de localización cromosomal, pero no formando parte de una isla53.

Además, trabajos previos de nuestro grupo muestran la importancia de estos genes

de H. pylori en población chilena, pues se encuentran asociados a patologías

gastro-duodenales18,19. Con respecto al bajo al número de pacientes incluidos, cabe

señalar que no es fácil contar con muestras obtenidas simultáneamente de cavidad

oral y mucosa gástrica de un mismo paciente; no obstante se reconoce esta limitación.

Al analizar los resultados se observa que 14 de 18 pacientes presentaban en su

cavidad oral cepas de H. pylori con el genotipo cagA-, vacAm1-, lo que sugiere que

la mayoría de los pacientes son colonizados oralmente por los genotipos menos

virulentos de H. pylori. A su vez, en el estómago, la mitad de los pacientes estaban

colonizados por este genotipo de H. pylori. Por lo tanto, podemos pensar que

efectivamente los pacientes incluidos en este estudio, en su mayoría poseían cepas

con genotipos asociados a menor virulencia.

Por otra parte, los resultados sugieren que en los ocho pacientes, en los cuales se

detectaron los mismos genotipos de virulencia en las muestras orales y gástricas,

se trate de las mismas cepas de H. pylori. Sin embargo, para asegurar esto se

deberían secuenciar los genomas completos de las cepas detectadas, ya que esta es la única forma de demostrar identidad genética.

En otros ocho pacientes (grupos 4 al 7) se detectaron perfiles de cepas menos

virulentas en la cavidad oral respecto del estómago, en estos casos se puede

pensar que se trata de cepas diferentes. Sin embargo, también es probable que las

cepas de H. pylori detectadas en cavidad oral fuesen las mismas que detectamos en

las muestras gástricas para estos pacientes. Esto podría ser explicado por una

posible recombinación genética, ya fuese en la misma cavidad oral o en el

estómago, haciéndose más virulentas. Lo anterior, puede ser avalado por un

estudio reciente de Kennemann y cols.54, quienes señalan que el genoma de H.

pylori evoluciona durante la infección humana y que es estable en ausencia de una

infección mixta. En el presente trabajo no se investigó la existencia o no de

infección mixta; sin embargo, trabajos previos sí han señalado la existencia de

infección mixta en pacientes chilenos18,19. Sólo en dos pacientes (grupo 3) se

observó un perfil más virulento en la cavidad oral en relación al estómago. En estos

casos lo más probable es que se trate de cepas diferentes. Esto se basa en que se

sabe que estos genes están en el cromosoma y no en material de ADN extra-

cromosómico, como los plásmidos, donde sus genes son más fáciles de perder, por

ej emplo por curación o auto-curación plasmídica (pérdida natural del plásmido).

Sin embargo, dada la evolución del genoma bacteriano en el organismo humano,

no es posible descartar totalmente que puedan ser las mismas cepas que en el seno

del estómago perdieron su gen cagA54. Nuevamente, para dilucidar esto se deberían secuenciar los genomas completos de las cepas de H. pylori detectadas.

Los resultados de la presente investigación, en su conjunto, muestran que existe

una variedad de genotipos de virulencia en H. pylori, basados en los genes cagA y

vacA m1 en el estómago y la cavidad oral, predominando en los pacientes incluidos

en este estudio las cepas con genotipos asociados a menor virulencia (cagA-, vacA

m1-). Conociendo el potencial de virulencia de la bacteria podemos deducir algo

sobre el pronóstico, pues los individuos colonizados por cepas cagA, vacA m1

negativas podrían corresponder a la mayoría de la población que está colonizada

por la bacteria, pero son asintómaticos durante toda su vida. En cambio, los

individuos colonizados por cepas cagA, vacA m1 positivas, son los que en su mayoría llegan a ser sintomáticos12.

Se sugieren futuros estudios con mayor cantidad de pacientes e incluyendo otros

genes asociados a virulencia, como vacA s1 y dupA; estos últimos porque en

estudios previos de nuestro grupo (resultados proyecto Fondef D03i1109 aún no

publicados) también han demostrado ser importantes para la población chilena