g.w. brady, d.b. fein, h. lambertson, v. grassian, d. foos and c.j. benham- x-ray scattering from...

8/3/2019 G.W. Brady, D.B. Fein, H. Lambertson, V. Grassian, D. Foos and C.J. Benham- X-ray scattering from the superhelix in circular DNA

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P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S AV o l . 8 0 , p p . 7 4 1 - 7 4 4 , F e b r u a r y 1 9 8 3B i o p h y s i c s

X - r a y s c a t t e r i n g f r o m t h e s u p e r h e l i x i n c i r c u l a r DNA( s u p e r c o i l i n g / d i f f r a c t i o n f r o m s o l u t i o n s / s p e c i f i c l i n k i n g d i f f e r e n c e / w r i t h e v s . t w i s t )

G . W . B R A D Y * , D . B . F E I N * , H . L A M B E R T S O N t , V . G R A S S I A N t , D . F o o s t , AND C . J . BENHAMt* C e n t e r f o r L a b o r a t o r i e s a n d R e s e a r c h , Ne w Y o r k S t a t e D e p a r t m e n t o f H e a l t h , A l b a n y , Ne w Y o r k 1 2 2 2 2 ; t R e n s s e l a e r P o l y t e c h n i c I n s t i t u t e , T r o y , Ne w Y o r k 1 2 1 8 1 ;a n d t D e p a r t m e n t o f M a t h e m a t i c s , U n i v e r s i t y o f K e n t u c k y , L e x i n g t o n , K e n t u c k y 4 0 5 0 6C o m m u n i c a t e d b y B r u n o H . Z i m m , O c t o b e r 2 5 , 1 9 8 2A B S T R A C T T h i s c o m m u n i c a t i o n p r e s e n t s m e a s u r e m e n t s ,m a d e w i t h a n e w l y c o n s t r u c t e d p o s i t i o n - s e n s i t i v e d e t e c t o r , o f t h es m a l l - a n g l e x - r a y s c a t t e r i n g f r o m t h e f i r s t - o r d e r s u p e r h e l i x o f n a -t i v e C O P 6 0 8 p l a s m i d D N A . T h i s i n s t r u m e n t m e a s u r e s i n t e n s i t i e sf r e e o f s l i t e f f e c t s a n d p r o v i d e s g o o d r e s o l u t i o n i n t h e r e g i o n o fi n t e r e s t . T h e r e p o r t e d o b s e r v a t i o n s , m a d e b o t h i n t h e p r e s e n c ea n d i n t h e a b s e n c e o f i n t e r c a l a t o r , c l o s e l y f i t t h e s c a t t e r i n g p a t -t e r n s c a l c u l a t e d f o r n o n i n t e r w o u n d h e l i c a l f i r s t - o r d e r s u p e r h e l -i c e s . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h a t o r o i d a l h e l i c a l s t r u c t u r eb u t n o t w i t h i n t e r w o u n d c o n f o r m a t i o n s . T h e p i t c h a n g l e a a n dc o n t o u r l e n g t h p e r t u r n c a r e r e p o r t e d f o r t h e n a t i v e m o l e c u l e a ts e v e r a l c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p l a t i n u m i n t e r c a l a t i n g c o m p o u n d .F r o m t h e s e p a r a m e t e r s , t h e b e s t - f i t t i n g t o r o i d a l h e l i x i s c o n -s t r u c t e d a n d i t s g e o m e t r y i s i n v e s t i g a t e d . T h e s p e c i f i c l i n k i n g d i f -f e r e n c e o f t h e n a t i v e m o l e c u l e i s e s t i m a t e d t o b e A L k / L k 0 -- 0 . 0 5 5 . I f t h e b e s t - f i t t i n g t o r o i d a l h e l i x i s t a k e n t o b e t h e a c t u a ls t r u c t u r e , t h e p a r t i t i o n i n g o f s u p e r h e l i c i t y b e t w e e n t w i s t a n dw r i t h e o c c u r s i n t h e a p p r o x i m a t e r a t i o o f 2 : 1 .T h e l a r g e - s c a l e t e r t i a r y s t r u c t u r e o f a c o v a l e n t l y c l o s e d , c i r c u l a rD N A - m o l e c u l e ( c c c D N A ) i n s o l u t i o n i s k n o w n t o b e d r a s t i c a l l ya f f e c t e d b y t h e i n t e r n a l s t r e s s e s i m p o s e d b y s u p e r h e l i c i t y . T h ev a r i a t i o n s o f s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y w i t h i n c r e a s e d s u p e r c o i l i n gs u g g e s t a d e c r e a s i n g ( a v e r a g e ) r a d i u s o f g y r a t i o n a s t h e m o l e c u l ea s s u m e s m o r e c o m p a c t c o n f o r m a t i o n s ( 1 ) . I n a d d i t i o n t o h y d r o -d y n a m i c m e t h o d s , s m a l l - a n g l e x - r a y s c a t t e r i n g ( S A S ) m a y b eu s e d t o i n v e s t i g a t e l a r g e - s c a l e p r o p e r t i e s o f s t r e s s e d DNA s t r u c -t u r e i n s o l u t i o n . T h e o b s e r v e d s c a t t e r i n g i n t e n s i t y i s r e l a t e d t ot h e d i s t r i b u t i o n o f e l e c t r o n p a i r s w i t h i n t h e m o l e c u l e a n d h e n c ep r o v i d e s s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n .H y d r o d y n a m i c e v i d e n c e ( 2 ) i n d i c a t e s t h a t d i s s o l v e d s u p e r -h e l i c a l p o l y o m a c c c DNA m a y u n d e r g o a n i o n i c s t r e n g t h - d e -p e n d e n t t r a n s i t i o n b e t w e e n a n i n t e r w o u n d c o n f o r m a t i o n ( h i g hs a l t ) a n d a t o r o i d a l ( s u p e r ) h e l i x ( N a ' 0 . 0 1 M ) . T h e i n t e r w o u n ds u p e r h e l i c a l s t r u c t u r e o b s e r v e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y m a y n o tb e r e p r e s e n t a t i v e o f s o l u t i o n c o n f o r m a t i o n s b e c a u s e t h e s a m -p l e s a r e s p r e a d f l a t a n d d r i e d i n p r e p a r a t i o n f o r p h o t o g r a p h y .P r e v i o u s c o m m u n i c a t i o n s ( 3 , 4 ) r e p o r t e d t h e x - r a y s c a t t e r i n gf r o m t w o n a t i v e l y s u p e r h e l i c a l c c c D N A s i n f l s o l u t i o n , PM2[ = 1 0 , 6 0 0 b a s e p a i r s ( b p ) ] a n d P B R 3 1 3 ( - 4 , 4 0 0 b p ) . T h e o b -s e r v e d s u p e r h e l i x d i f f r a c t i o n p a t t e r n s w e r e c o n s i s t e n t w i t h an o n i n t e r w o u n d c o i l e d c o i l g e o m e t r y , t h e f i r s t ( i . e . , s m a l l e s t )o r d e r o f w h i c h h a d a c o n t o u r l e n g t h o f c = 9 2 0 A p e r t u r n a ta p i t c h a n g l e 4 5 0 < a < 5 5 . H o w e v e r , t h o s e r e s u l t s w e r e p r e -s e n t e d a s b e i n g p r e l i m i n a r y i n n a t u r e b e c a u s e p r a c t i c a l l i m i -t a t i o n s o f t h e e x p e r i m e n t p r e c l u d e d c o r r e c t i n g t h e d a t a f o r s l i te f f e c t s . T h e i n t e n s i t i e s i n t h e r e g i o n w h e r e t h e f i r s t - o r d e r s c a t -t e r s w e r e m e a s u r e d w i t h a K r a t k y c a m e r a h a v i n g i n f i n i t e s l i tg e o m e t r y . B e c a u s e o f t h e l o w i n t e n s i t i e s i n v o l v e d , s l i t w i d t h sc o n s i d e r a b l y g r e a t e r t h a n o p t i m a l h a d t o b e u s e d . T h i s d e -T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e -m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

c r e a s e d t h e l o w e r a n g l e l i m i t o f r e s o l u t i o n o f t h e i n s t r u m e n tb e c a u s e t h e i n n e r p o r t i o n o f t h e s c a t t e r i n g c u r v e w a s s u p e r -i m p o s e d o n a r i s i n g b a c k g r o u n d r e s u l t i n g f r o m p a r a s i t i c s l i t s c a t -t e r i n g . I n c o n s e q u e n c e , t h e r e s u l t i n g d a t a c o u l d n o t b e d e -s m e a r e d , s o a d i r e c t c o m p a r i s o n w i t h t h e o r y w a s p r e c l u d e d .T h i s p a p e r p r e s e n t s m e a s u r e m e n t s o f S A S f r o m t h e f i r s t - o r -d e r c c c DNA s u p e r h e l i x m a d e w i t h a n e w p o s i t i o n - s e n s i t i v ed e t e c t o r ( P S D ) . T h e r e s u l t i n g p r o f i l e s a r e f r e e o f s l i t e f f e c t s ,p e r m i t t i n g d i r e c t a n d u n a m b i g u o u s c o m p a r i s o n s w i t h t h e o r y .M A T E R I A L S AND METHODST h e a p p a r a t u s u s e d w i l l b e d e s c r i b e d i n d e t a i l e l s e w h e r e .B r i e f l y , i t c o n s i s t s o f a b e a m p o w e r e d b y a R i g a k u 1 2 - k W r o -t a t i n g a n o d e s o u r c e o p e r a t e d a t 5 0 k V a n d 1 9 0 mA c o l l i m a t e db y t w o p i n h o l e s 0 . 7 5 mm i n d i a m e t e r s e t 1 0 0 c m a p a r t i n a ne v a c u a t e d c o l l i m a t i o n c h a m b e r . T h e b e a m i r r a d i a t e s t h e s a m p l ec o n t a i n e d i n a f l a t s a m p l e h o l d e r w i t h m i c a w i n d o w s s e p a r a t e db y a p a t h l e n g t h o f 1 m m . I t s d i f f r a c t i o n p a t t e r n i s r e c o r d e d o na P S D p l a c e d a t t h e e n d o f a n e v a c u a t e d p a t h 1 5 0 c m f r o m t h es a m p l e . A n e x t r a g u a r d p i n h o l e , d i a m e t e r 0 . 8 m m , i s p l a c e d j u s tb e f o r e t h e s a m p l e . W i t h t h i s a r r a n g e m e n t , t h e s l i t s c a t t e r i n gi s e f f e c t i v e l y r e d u c e d t o a n i n s i g n i f i c a n t v a l u e e v e r y w h e r e b u ta t t h e i n n e r m o s t r e g i o n o f t h e p a t t e r n . B e c a u s e o f t h e s m a l l s i z eo f t h e b e a m a n d t h e l a r g e s a m p l e - t o - d e t e c t o r d i s t a n c e , s l i t c o r -r e c t i o n s a r e n o t n e c e s s a r y . T h e i n t e n s i t y l o s s a s s o c i a t e d w i t h t h eg r e a t l y i n c r e a s e d c o l l i m a t i o n o f t h e p i n h o l e s a n d t h e l a r g e s c a t -t e r i n g r a d i u s a r e a d e q u a t e l y c o m p e n s a t e d f o r b y t h e m u c hg r e a t e r p o w e r o u t p u t o f t h e 1 2 - k W g e n e r a t o r . T h u s , w e a r e n o wa b l e t o o b t a i n d i r e c t t r a c e s o f t h e d i f f r a c t i o n p a t t e r n s f r e e o f a l lc o r r e c t i o n s w i t h t h e e x c e p t i o n o f a f a i r l y m i n o r o n e d u e t o t h ef i n i t e w i d t h o f t h e m a i n b e a m . T h i s c a u s e s a n o v e r l a p o f t w o o rt h r e e c h a n n e l s o f t h e P S D a n d i s n o t s i g n i f i c a n t .I n t h e s e e x p e r i m e n t s t h e DNA u s e d w a s t h e n a t i v e l y s u p e r -c o i l e d C O P 6 0 8 p l a s m i d ( 4 , 2 5 8 b p ) , a 1 7 9 - b p d e l e t i o n o f t h e P T1 8 1 p l a s m i d o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . T h e c e l l s w e r e g r o w no v e r n i g h t i n C y b r o t h , h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , a n d l y s e db y t h e c l e a r l y s a t e m e t h o d ( 5 ) . P u r i f i c a t i o n o f t h e s u p e r h e l i c a lDNA w a s d o n e a c c o r d i n g t o - t h e a c i d / p h e n o l e x t r a c t i o n p r o -c e d u r e o f Z a s l o f f e t a L ( 6 ) . T h e DNA s o l u t i o n w a s f r e e d o f RNAa n d p r o t e i n i m p u r i t i e s . T h e DNA w a s p r e c i p i t a t e d , r e s u s -p e n d e d i n l o w i o n i c s t r e n g t h b u f f e r , a n d t h e n t w i c e e x t r a c t e dw i t h 1 v o l o f r e d i s t i l l e d p h e n o l e q u i l i b r a t e d w i t h 5 0 mM N a O A ct o a pH o f 4 . 0 . A s s h o w n b y Z a s l o f f e t a L ( 6 ) , n i c k e d a n d c h r o -m o s o m a l DNA w i l l b e s e l e c t i v e l y r e m o v e d f r o m t h e a q u e o u sp h a s e b y t h i s p r o c e s s , l e a v i n g a 9 5 % p u r e s o l u t i o n o f s u p e r -h e l i c a l D N A . T h e p h e n o l w a s r e m o v e d b y e t h e r e x t r a c t i o n . T h es o l u t i o n w a s e t h a n o l p r e c i p i t a t e d a n d t h e DNA w a s r e s u s -p e n d e d i n t h e b u f f e r u s e d f o r t h e x - r a y e x p e r i m e n t s ( 0 . 2 MT r i s H C l , pH 7 . 5 / 0 . 0 5 M N a C l / 1 . 0 mM N a 2 E D T A ) . I n c e r t a i n

A b b r e v i a t i o n s : c c c D N A , c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r D N A ; S A S , s m a l l -a n g l e x - r a y s c a t t e r i n g ; P S D , p o s i t i o n - s e n s i t i v e d e t e c t o r ; b p , b a s e p a i r s( b p ) ; P t T S , 2 - h y d r o x y e t h a n e t h i o l a t o ( 2 , 2 ' , 2 " , - t e r p y r i d i n e ) p l a t i n u m ( I I ) .7 4 1


2/4

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 0 ( 1 9 8 3 )c a s e s t h e a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n o f t h e i n t e r c a l a t i n g a g e n t2 - h y d r o x y e t h a n e t h i o l a t o ( 2 , 2 ' , 2 " - t e r p y r i d i n e ) p l a t i n u m ( I I ) ( P t T S )w a s a d d e d . F o r c o m p a r i s o n , c a l f t h y m u s DNA ( t y p e I , S i g m a )w a s d i s s o l v e d i n b u f f e r ( 0 . 2 M T r i s H C l , p H 7 . 5 / 0 . 0 5 M N a C l /1 mM N a E D T A ) , e t h a n o l p r e c i p i t a t e d , a n d d i a l y z e d a g a i n s tt h e s a m e b u f f e r .

RESULTS AND A N A L Y S I SF i g . 1 s h o w s a p l o t o f t h e s u p e r h e l i c a l s c a t t e r i n g f r o m a s o l u -t i o n o f p l a s m i d C O P 6 0 8 DNA ( 1 1 . 6 m g / m l ) , M r 2 . 8 X 1 0 6 ,a l o n g w i t h t h e b a c k g r o u n d s c a t t e r i n g ( l o w e r c u r v e ) f r o m t h eb u f f e r s o l u t i o n ( 0 . 2 M T r i s - H C I , pH 7 . 5 / 0 . 0 5 M N a C l / 1 mMN a 2 E D T A ) . B o t h c u r v e s a r e t h e a c t u a l o u t p u t f r o m t h e d e t e c t o rw i t h o u t s m o o t h i n g . T h e c o u n t i n g t i m e w a s 4 h r . C o m p a r i s o no f t h e t w o s h o w s t h a t - t h e r a p i d l y r i s i n g p o r t i o n o f t h e b a c k -g r o u n d i s c o n f i n e d t o c h a n n e l n u m b e r s l e s s t h a n 5 2 . B e y o n dt h i s i t l e v e l s o f f t o a s m o o t h l y d e c r e a s i n g c u r v e o f v e r y f a v o r a b l es i g n a l - t o - b a c k g r o u n d r a t i o w h i c h c a n b e a v e r a g e d o v e r a 5 - c h a n -n e l i n t e r v a l b y a l e a s t s q u a r e s p r o g r a m a n d t h e n d i r e c t l y s u b -t r a c t e d f r o m t h e DNA c u r v e s .F i g . 2 s h o w s t h e s c a t t e r i n g c u r v e s , c o r r e c t e d f o r b a c k g r o u n d ,o f c a l f t h y m u s DNA ( c u r v e 1 ) , o f s u p e r h e l i c a l DNA ( c u r v e 2 ) ,a n d o f s u p e r h e l i c a l DNA ( c u r v e s 3 , 4 , a n d 5 ) i n w h i c h P t T S h a db e e n i n t e r c a l a t e d i n t h e m o l r a t i o s o f 0 , 1 : 3 0 , 1 : 2 5 a n d 1 : 2 0( m o l P t T S i n t e r c a l a t e d / m o l b p ) . T h e c a l f t h y m u s c u r v e i s c o m -p l e t e l y f e a t u r e l e s s . I n c o n t r a s t , t h e s u p e r h e l i c a l c u r v e s s h o wp r o n o u n c e d m a x i m a w h i c h d e c r e a s e i n m a g n i t u d e w i t h i n c r e a s -i n g P t T S / D N A r a t i o s . T h i s s h o w s t h a t t h e d i f f r a c t i o n m a x i m aa r e a t t r i b u t a b l e t o t h e s u p e r h e l i c a l c o n f o r m a t i o n o f t h e c i r c u l a rp l a s m i d D N A . C u r v e s t a k e n a t l o w e r c o n c e n t r a t i o n s r e p r o d u c et h i s b e h a v i o r , s o i n t e r m o l e c u l a r s c a t t e r i n g p l a y s n o p a r t . T h em a x i m u m f o r t h e n o n i n t e r c a l a t e d DNA i s p a r t i c u l a r l y p r o -n o u n c e d . I n t e r c a l a t i o n r e s u l t s i n d i s p l a c e m e n t o f t h e c u r v e s o u tt o l a r g e r s v a l u e s , c o n s i s t e n t w i t h a d e c r e a s e i n c o n t o u r l e n g t hp e r t u r n , c , o f t h e u n w i n d i n g s u p e r h e l i x . ( T h i s l a t t e r e f f e c t w i l lb e d e m o n s t r a t e d b e l o w , w h e r e t h e m e a s u r e d c u r v e s a r e c o m -p a r e d w i t h t h o s e c a l c u l a t e d f o r b o t h i n t e r w o u n d a n d n o n i n t e r -w o u n d h e l i c a l s u p e r c o i l s . ) T h e s c a t t e r i n t h e d a t a p o i n t s c o u l db e s m o o t h e d o u t b y u s i n g l o n g e r c o u n t i n g t i m e s . H o w e v e r , t h i sr i s k s n i c k i n g t h e D N A , w i t h c o n s e q u e n t r e l a x a t i o n o f t h e s u -p e r h e l i x . F o r t h e i r r a d i a t i o n t i m e s u s e d i n t h e e x p e r i m e n t s o fF i g . 2 , n o s i g n i f i c a n t c h a n g e w a s o b s e r v e d b e t w e e n t h e m i c r o -d e n s i t o m e t e r t r a c e s o f t h e g e l e l e c t r o p h o r e s i s p a t t e r n s a f t e r a n db e f o r e t h e i n t e n s i t i e s w e r e m e a s u r e d , s o n i c k i n g e f f e c t s w e r em i n i m a l .T h e s c a t t e r i n g i n t e n s i t y f r o m a p o p u l a t i o n o f i d e n t i c a l , r a n -d o m l y o r i e n t e d f i l a m e n t s m a y b e c a l c u l a t e d b y u s i n g D e b y e ' s

87

U f );zLUI z 4

3

2_ * /.; .-% - s e - * %

6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0C H A N N E L NUMBER

F I G . 1 . S c a t t e r i n g ( u p p e r curve) a n d b a c k g r o u n d ( l o w e r c u r v e )curves o f t h e DNA s u p e r h e l i x . T h e p o i n t s ar e t h e o u t p u t f r o m t h e P S D .C o u n t i n g t i m e , 4 h r ; DNA c o n c e n t r a t i o n , 1 1 . 6 m g / m l .

U , 30 - 4_ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0 - 3

I } ' ' I0 0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5 0 . 3 0S - = 4 1 S I N O x 1 0

F I G . 2 . S c a t t e r i n g c u r v e s ( c o r r e c t e d f o r b a c k g r o u n d ) o f c a l f t h y -m u s DNA a n d s u p e r h e l i c a l DNA a t v a r i o u s i n t e r c a l a t o r r a t i o s . T h ea b s c i s s a o r i g i n s f o r c u r v e s 3 a n d 4 h a v e b e e n d i s p l a c e d u p w a r d . - C o n -c e n t r a t i o n s a n d c o u n t i n g t i m e s w e r e a s i n F i g . 1 . T h e h e a v y c o n t i n u o u sl i n e s a r e c a l c u l a t e d c u r v e s f o r n o n i n t e r w o u n d m o l e c u l e s .e q u a t i o n ( 4 , 7 , 8 )

I ( s ) = 2 L L s i n s r ( , 2 .2 J o '0 s r ( l j j 1 2 [ 1 ]H e r e , 1 1 a n d 1 2 a r e t w o c o p i e s o f t h e l e n g t h p a r a m e t e r , p i s t h ee f f e c t i v e e l e c t r o n d e n s i t y o f t h e f i l a m e n t , a n d s = 4 1 T / A s i n 6 ;A i s t h e w a v e l e n g t h ( C u K a , A = 1 . 5 4 A ) a n d 0 i s o n e - h a l f t h es c a t t e r i n g a n g l e . T h e v a r i a b l e r ( l 1 , 1 2 ) i s t h e d i s t a n c e i n s p a c eb e t w e e n t w o p o i n t s o n t h e s c a t t e r i n g f i l a m e n t a n d L i s t h e f i l -a m e n t l e n g t h . I f t h e s u p e r c o i l s a r e h e l i c a l , t h e i r s c a t t e r i n g m a yb e c o m p u t e d b y r e d u c i n g D e b y e ' s e q u a t i o n t o a o n e - v a r i a b l ee x p r e s s i o n w h i c h i s i n t e g r a t e d n u m e r i c a l l y ( 4 ) . T h e s c a t t e r i n gp r o f i l e s o f h e l i c a l l y i n t e r w o u n d ( s u p e r c o i l e d ) s t r u c t u r e s m a y b ef o u n d i n a s i m i l a r m a n n e r . T h e d o m i n a n t c o n t r i b u t i o n t o t h es c a t t e r i n g f r o m i n t e r w o u n d c o n f o r m a t i o n s c o m e s f r o m t h e r e l -a t i v e l y h i g h d e n s i t y o f e l e c t r o n p a i r s s e p a r a t e d b y d i s t a n c e s n e a rt h e i n t e r s t r a n d s e p a r a t i o n . T h i s r e m a i n s t r u e r e g a r d l e s s o f t h ep i t c h a n g l e a o f t h e i n t e r w o u n d h e l i x . I n c o n t r a s t , a n o n i n t e r -w o u n d h e l i c a l s t r u c t u r e s c a t t e r s i n a m a n n e r s t r o n g l y d e p e n -d e n t o n p i t c h a n g l e ( 4 ) .C a l c u l a t e d c u r v e s m a y b e f i t t e d d i r e c t l y t o t h e e x p e r i m e n -t a l l y m e a s u r e d p r o f i l e s ( 4 ) . F o r n o n i n t e r w o u n d h e l i c a l s t r u c -t u r e s t h e s h a p e o f t h e c a l c u l a t e d c u r v e w h i c h b e s t f i t s t h e e x -p e r i m e n t a l c u r v e d e t e r m i n e s t h e p i t c h a n g l e a t o n t h ec o r r e s p o n d i n g h e l i x ; t h e a n g u l a r s c a l e a t w h i c h s c a t t e r i n g o c c u r si s i n v e r s e l y r e l a t e d t o t h e s c a l e o f t h e h e l i x . I t f o l l o w s t h a t t h ep i t c h a n g l e a a n d c o n t o u r l e n g t h p e r t u r n , c , o f t h e b e s t - f i t t i n gh e l i x m a y b e f o u n d f r o m t h e e x p e r i m e n t a l l y m e a s u r e d p r o f i l e s ,a s h a s b e e n s h o w n ( 4 ) . T h e c a l c u l a t e d ( n o n i n t e r w o u n d ) s c a t t e r -i n g c u r v e s w h i c h b e s t f i t t h e p r e s e n t o b s e r v a t i o n s a r e s h o w na s t h e s o l i d l i n e s i n F i g . 2 . T h e a g r e e m e n t b e t w e e n e x p e r i m e n ta n d c a l c u l a t i o n i s c l o s e i n a l l c a s e s . T h e r e s u l t i n g v a l u e s o f a a n dc a r e g i v e n i n T a b l e 1 . F r o m t h e s e q u a n t i t i e s t h e r a d i u s r a n dp i t c h p o f t h e h e l i x m a y b e f o u n d . T h e n u m b e r N o f t h e h e l i c a lt u r n s o f t h e g i v e n s c a l e w h i c h t h e C O P 6 0 8 p l a s m i d c o u l d c o n -t a i n i s g i v e n b y L / c .T h e m e a n ( S D ) c o n t o u r l e n g t h p e r t u r n f o r t h e n a t i v e l ys u p e r c o i l e d C O P 6 0 8 p l a s m i d i s f o u n d t o b e 1 , 0 2 0 2 0 A w i t ha p i t c h a n g l e o f a = 6 0 0 2 0 . T h e s e r e s u l t s r e f i n e t h e p r e v i -

6 k5 K :

7 4 - 2 B i o p h y s i c s : B r a d y e t a L


3/4

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 0 ( 1 9 8 3 ) 7 4 3T a b l e 1 . M e a s u r e d s u p e r h e l i x p a r a m e t e r s

P t T S / D N A , a ,m o l / m o l c d e g r e e s r , A p , A0 1 , 0 2 0 2 0 6 0 2 1 4 1 5 1 11 : 3 0 8 1 6 1 0 5 0 2 1 0 0 5 2 41 : 2 5 7 6 4 1 0 4 5 3 8 7 5 3 11 : 2 0 7 2 8 1 0 3 9 3 7 3 5 6 3

c a n d a a r e g i v e n a s m e a n S D .o u s l y p u b l i s h e d e s t i m a t e s m a d e f r o m s m e a r e d d a t a o n n a t i v eP M 2 a n d P B R 3 1 3 D N A s ( 4 ) . A l t h o u g h t h e m o l e c u l a r l e n g t h s( a n d p r o b a b l y t h e s u p e r h e l i x d e n s i t i e s ) d i f f e r , t h e c o r r e c t i o n si n t r o d u c e d i n v o l v e i n c r e a s e s o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 - 1 5 % i n b o t ha a n d c .T h e s c a t t e r i n g f r o m i n t e r w o u n d s t r u c t u r e s i s d o m i n a t e d b yi n t e r s t r a n d e l e c t r o n p a i r c o r r e l a t i o n s , a s m a n i f e s t e d b y s t r o n gm a x i m a a t p o s i t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e s t r a n d s e p a r a t i o n .T h i s i s s h o w n i n F i g . 3 w h e r e t h e t h e o r e t i c a l s c a t t e r i n g c u r v e sa r e p l o t t e d f o r t w o f o r m s o f i n t e r w o u n d s t r u c t u r e s ( c u r v e s 2 a n d3 ) a s w e l l a s t h e e x p e r i m e n t a l d a t a o n t h e n o n i n t e r c a l a t e dC O P 6 0 8 m o l e c u l e ( c u r v e 1 ) . T h e s t r o n g i n t e r s t r a n d s c a t t e r i n g ,a f e a t u r e c o m m o n t o i n t e r w o u n d s t r u c t u r e s o f a l l p i t c h a n g l e s ,i s n o t p r e s e n t i n t h e e x p e r i m e n t a l c u r v e . T h i s s t r o n g l y s u g g e s t st h a t t h e n a t i v e C O P 6 0 8 DNA i s n o t i n t e r w o u n d w h e n i n s o -l u t i o n u n d e r t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s u s e d .T h e s e r e s u l t s s u p p o r t t h e t o r o i d a l h e l i c a l m o d e l o f s u p e r -c o i l e d s t r u c t u r e , a c o n f o r m a t i o n t h a t i s p r e d i c t e d t o o c c u r a ts t r e s s e d e l a s t i c e q u i l i b r i u m ( 9 , 1 0 ) . O n e m a y c o n s t r u c t f o r e a c hs u p e r h e l i c a l c a s e t h e b e s t - f i t t i n g t o r o i d a l h e l i x h a v i n g t h e g i v e nv a l u e s o f p i t c h a n g l e a , c o n t o u r l e n g t h p e r t u r n c , a n d n u m b e ro f t u r n s p e r m o l e c u l e N . T h e l e n g t h o f t h e c e n t r a l a x i s o f t h i ss t r u c t u r e i s t h e n N p , w h e r e p i s t h e p i t c h . I n a t o r o i d a l h e l i x ,t h i s c e n t r a l a x i s f o r m s a c i r c l e w h o s e r a d i u s R i s N p / 2 1 r . V a l u e sd e d u c e d f r o m t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s f o r t h e h e l i c a l r a d i u s r ,t h e a x i a l r a d i u s R , a n d t h e i r r a t i o T = r / R a r e g i v e n i n T a b l e2 . T h e w r i t h i n g n u m b e r ( W r ) o f a t o r o i d a l h e l i x o f N t u r n s a n dX = r I R , a l s o g i v e n , i s c a l c u l a t e d b y t h e f o l l o w i n g e x p r e s s i o n ,w h i c h i s d e r i v e d b y a p p l i c a t i o n o f F u l l e r ' s i n t e g r a l ( 1 1 ) :

W-NY T C NO { [ ( 1 + r c os N O ) 2 + r 2 N 2 ] 1 " 2 + ( 1 += 2 10 ( 1 + Tcos N O { [ ( 1 + cos N O ) 2 + r 2 N 2 ] 2 + ( 1H e r e t h e v a r i a b l e o f i n t e g r a t i o n i s 0 , t h e a n g l e s u b t e n d e d b yan a r c o f t h e c i r c u l a r c e n t r a l a x i s . T h e v a l u e s f o r Wr i n T a b l e2 a r e f o r t h e b e s t - f i t t i n g t o r o i d a l h e l i c e s c o r r e s p o n d i n g t o t h ef o u r s u p e r h e l i c a l curves o f F i g . 2 . F i n a l l y , e a c h i n t e r c a l a t i o ne v e n t u n w i n d s t h e d u p l e x b y a p p r o x i m a t e l y 2 6 0 ( 1 2 ) . T a b l e 2g i v e s t h e average n u m b e r o f i n t e r c a l a t e d P t T S m o l e c u l e s i ne a c h DNA a n d t h e n u m b e r o f t u r n s o f u n d e r t w i s t , A T w 1 , w h i c har e s t a b i l i z e d t h e r e b y .T h e d a t a g i v e n i n t h e t a b l e s y i e l d s e v e r a l i m p o r t a n t c o n c l u -s i o n s r e g a r d i n g s u p e r h e l i c a l s t r u c t u r e a n d i n t e r c a l a t i v e r e l a x -a t i o n . F i r s t , b o t h t h e p i t c h a n g l e a a n d t h e c o n t o u r l e n g t h pert u r n c d e c r e a s e a s t h e m o l e c u l e i s r e l a x e d . I t f o l l o w s t h a t t h en u m b e r o f t u r n s N p er m o l e c u l e a c t u a l l y i n c r e a s e s w i t h i n t e r -c a l a t i o n , p o s s i b l y d u e t o t h e i n t r o d u c t i o n o f s l i g h t k i n k s . T h es i m u l t a n e o u s d e c r e a s e o f a a n d i n c r e a s e o f N e x e r t o p p o s i t e i n -f l u e n c e s on W r . H ow e v e r , t h e d a t a s h o w t h a t t h e m a g n i t u d eo f Wr f o r t h e b e s t - f i t t i n g t o r o i d a l h e l i x d e c r e a s e s w i t h r e l a x a -t i o n , i n a c c o r d w i t h t h e a c c e p t e d m e c h a n i s m o f i n t e r c a l a t i o n .H o w e v e r , t h e v a r i a t i o n s o f Wr ar e n o t l i n e a r w i t h i n t e r c a l a t i o n

32-

0 . 1 0 0 . 1 5 0 . 2 0 0 . 2 5 0 . 3 0 0 . 3 5 0 . 4 0S x 1 0

F I G . 3 . C o m p a r i s o n o f t h e e x p e r i m e n t a l c u r ve f o r t h e n o n i n t e r -c a l a t e d DNA w i t h c a l c u l a t e d c u r ves f o r t h e t w o i n t e r w o u n d c o n f i g u -r a t i o n s i n d i c a t e d i n t h e l e g e n d .d e n s i t y . I n c o n t r a s t , t h e r a t i o o f r a d i i T=r I R i s s een t o d e c r e a s el i n e a r l y w i t h t h e a b s o r b e d u n d e r t w i s t A T w j over t h e e x p e r i -m e n t a l r a n g e . T h e f i t o f t h e s e p a r a m e t e r s t o a r e g r e s s i o n l i n ei s e x t r e m e l y c l o s e ( r 2 = 0 . 9 9 6 ) .B e c a u s e t h e d i f f r a c t i o n m a x i m a b e c o m e f a i n t f o r a n g l e s o fs m a l l p i t c h , d e t e r m i n a t i o n o f s u p e r h e l i x p a r a m e t e r s i s pre-c l u d e d w h e n a < 3 0 0 ( 4 ) . U n f o r t u n a t e l y , t h i s m e a n s t h a t t h erange o f e x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n s c a n n o t b e e x t e n d e d c l o s e rt o t h e r e l a x e d s t a t e . H o w e v e r , e x t r a p o l a t i o n o f t h e p h e n o m e -n o l o g i c a l l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n A T w 1 a n d T =r / R per-m i t s e s t i m a t i o n o f t h e a m o u n t o f i n t e r c a l a t i v e l y a b s o r b e d t w i s tt h a t c o m p l e t e l y r e l a x e s t h e m o l e c u l e ( i . e . , T =0 ) . T h i s oc c u r sw h e n A T w 1 =2 2 . 4 , t h e x i n t e r c e p t o f t h e r e g r e s s i o n l i n e . B e -cause t h e u n s t r e s s e d l i n k i n g n u m b e r o f a m t o l e c u l e o f N =4 , 2 5 8bp is L k o 4,258/10.4, onemay estimate the s p e c i f i c linkingd i f f e r e n c e o f t h e n a t i v e m o l e c u l e u n d e r e x p e r i m e n t a l c o n d i -tions to be A L k / L k O - 2 2 . 4 / 4 0 9=0.055. This value liesw i t h i n t h e range o f s u p e r h e l i c i t i e s f o u n d f o r o t h e r p l a s m i d s ( 1 3 ) .

Trcos NO)}+ T2N2+'r cos NO)} +r 2 N d . O . [ 2 ]

F i n a l l y , i f t h e l i n k i n g d i f f e r e n c e A L k =L k - L k O =- 2 2 . 4 a n dWr i s - 7 . 0 , t h e n t h e t o t a l m o l e c u l a r t o r s i o n a l d e f o r m a t i o n i sATw =ALk-Wr =- 1 5 . 4 . T h a t i s , t h e n a t i v e m o l e c u l e u n d e re x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s i s e s t i m a t e d t o p a r t i t i o n i t s s u p e r h e l i c a ld e f o r m a t i o n b e t w e e n t w i s t a n d w r i t h e i n t h e a p p r o x i m a t e r a t i oo f 2 : 1 . T h i s r e s u l t i s c o n s i s t e n t w i t h a p r e v i o u s e s t i m a t e m a d eb y u s i n g a d i f f e r e n t m e t h o d ( 1 4 ) .

T a b l e 2 . C a l c u l a t e d p r o p e r t i e s *P t T S / D N A ,m o l / m o l N A T w 1 R , A r I R Wr0 1 4 0 1 , 1 3 9 0 . 1 2 4 7 . 0 11 : 3 0 1 8 1 0 . 2 5 1 , 4 8 0 0 . 0 6 7 6 6 . 5 71 : 2 5 1 9 1 2 . 3 1 , 6 3 3 0 . 0 5 7 2 5 . 5 71 : 2 0 2 0 1 5 . 4 1 , 7 9 2 0 . 0 4 0 7 4 . 4 9

* F o r t h e p a r a m e t e r s l i s t e d i n T a b l e 1 , b y u s i n g m e t h o d d e s c r i b e d i nt h e t e x t . A t o r o i d a l c o n f o r m a t i o n w a s a s s u m e d i n c o m p u t i n g t h e l a s tt h r e e n u m b e r s .

B i o p h y s i c s : B r a d y e t a L


4/4

7 4 4 B i o p h y s i c s : B r a d y e t a LDISCUSSION

T h e o b s e r v a t i o n s r e p o r t e d h e r e s h o w t h a t , u n d e r t h e e x p e r i -m e n t a l c o n d i t i o n s u s e d , t h e s u p e r h e l i x d o e s n o t o c c u r i n t h ei n t e r w o u n d c o n f o r m a t i o n . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h ec o n c l u s i o n s o f G r a y ( 2 ) w h o s e h y d r o d y n a m i c a n a l y s i s s u g g e s t st h a t s u p e r h e l i c a l p o l y o m a c c c DNA o c c u r s i n a t o r o i d a l h e l i c a lc o n f o r m a t i o n a t l o w i o n i c s t r e n g t h .I n a d d i t i o n t o c h a n g e s o f l a r g e - s c a l e t e r t i a r y s t r u c t u r e , s u -p e r h e l i c a l s t r e s s e s c o u l d i n d u c e l o c a l c o n f o r m a t i o n a l t r a n s i t i o n st o a l t e r n a t i v e s e c o n d a r y s t r u c t u r e s h a v i n g d i f f e r e n t u n s t r e s s e dt w i s t r a t e s ( 1 4 ) . I t f o l l o w s t h a t t h e s t r e s s e d b e h a v i o r o f a n y s p e -c i f i c DNA m o l e c u l e c a n b e q u i t e c o m p l e x i n p r a c t i c e . T h e p r e s -e n t e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e s w i l l d o m u c h t o i l l u m i n a t e t h e i n -t e r a c t i o n s b e t w e e n l a r g e - s c a l e t e r t i a r y s t r u c t u r e a n d l o c a ls e c o n d a r y s t r u c t u r e i n a s u p e r c o i l e d m o l e c u l e .We a c k n o w l e d g e t h e a s s i s t a n c e o f D r . S t e p h e n C a r l e t o n o f t h e P u b l i cH e a l t h I n s t i t u t e o f New Y o r k C i t y w h o k i n d l y p r o v i d e d s u f f i c i e n t q u a n -t i t i e s o f S . a u r e u s c e l l s f o r t h e e x t r a c t i o n o f t h e p l a s m i d D N A , a n d t h eN a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n f o r f i n a n c i a l s u p p o r t ( G r a n t s P C M -

P r o c . N a t L A c a d . S c i . USA 8 0 ( 1 9 8 3 )8 0 4 1 3 3 7 s u p p o r t i n g G . W . B . a n d P C M - 8 0 0 2 8 1 4 s u p p o r t i n g C . J . B . ) . I na d d i t i o n , C . J . B . w a s s u p p o r t e d i n p a r t b y a n A l f r e d P . S l o a n F e l l o w s h i p .

1 . U p h o l t , W . , G r a y , H . B . & V i n o g r a d , J . ( 1 9 7 1 ) J . M o l B i o l 6 1 ,2 1 - 3 8 .2 . G r a y , N . B . ( 1 9 6 7 ) B i o p o l y m e r s 5 , 1 0 0 9 - 1 0 1 9 .3 . B r a d y , G . W . , F e i n , D . B . & B r u m b e r g e r , H . ( 1 9 7 6 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 6 4 , 2 3 1 - 2 3 4 .4 . B e n h a m , C . J . , B r a d y , G . W . & F e i n , D . B . ( 1 9 8 0 ) B i o p h y s . J .2 9 , 3 5 1 - 3 6 6 .5 . N o v i c k , R . P . & B o u a n c h a u d , D . ( 1 9 7 1 ) A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 8 2 ,2 7 9 - 2 9 4 .6 . Z a s l o f f , M . , G i n d e r , G . D . & F e l s e n f e l d , G . ( 1 9 7 8 ) N u c l e i c A c i d sR e s . 5 , 1 1 3 9 - 1 1 5 2 .7 . D e b y e , P . ( 1 9 1 5 ) A n n . P h y s i k 4 6 , 8 0 9 - 8 2 4 .8 . S c h m i d t , P . W . ( 1 9 6 5 ) i n S m a l l A n g l e X - R a y S c a t t e r i n g , e d .B r u m b e r g e r , H . ( G o r d o n & B r e a c h , Ne w Y o r k ) , p p . 1 7 - 3 1 .9 . B e n h a m , C . J . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A 7 4 , 2 3 9 7 - 2 4 0 1 .1 0 . B e n h a m , C . J . ( 1 9 7 9 ) B i o p o l y m e r s 1 8 , 6 0 9 - 6 2 3 .1 1 . F u l l e r , F . B . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 8 , 3 5 5 7 - 3 5 6 1 .1 2 . W a n g , J . C . ( 1 9 7 4 ) J . M o l . B i o l 8 9 , 7 3 8 - 8 0 1 .1 3 . B a u e r , W . R . ( 1 9 7 8 ) A n n u . R e v . B i o p h y s . B i o e n g . 7 , 2 8 7 - 3 1 3 .1 4 . B e n h a m , C . J . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A 7 6 , 3 8 7 0 - 3 8 7 4 .

g.w. brady, d.b. fein, h. lambertson, v. grassian, d. foos and c.j. benham- x-ray scattering from...

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