génomique microsporidienne - gplfgplf.assoc.univ-bpclermont.fr/gplf23-02-05/pdf dourdan/gplf...

Génomique Microsporidienne

E. CORNILLOT

Laboratoire de Biologie des Protistes - UMR CNRS 6023Université Blaise Pascal - Clermont-Ferrand

[email protected]

Génomique des Microsporidies:Pourquoi?

Une biodiversité importante

Polar cap

Lammellar polaroplastVacuolar polaroplastExopsoreEndospore

Plasma membranePolar tubeNucleus

Deux grands types d’organisationdu génome

217 kpb

315 kpb

11

Encephal.cuniculi

15

18

16

2.8 Mpb

6.2 Mpb

15 Mpb

19 Mpb

Kpb

1900

1000

800

650

400

Spraguealophii

Nosemabombycis

Glugeaatherinae

Le génome d’E. cuniculinous a fourni :

Une carte physique et un outil, le KARD pour l’exploiter

11 consensus correspondant aux 11 chromosomessans les télomères et certaines séquences d’extrémité

Un protéome déduit à partir d’environ 2000 CDS

Un facteur de virulence : les ATP/ADP translocases

Une hypothèse sur le mitosome

But how to mesure genome evolution

Phylogeny : a fungi relationship=> a systematic approach=> a rapid evolution of the primary sequences

Chromosome backbone => a eukaryotic chromosome=> a parasite paradigm

Genome size reduction ongoing process=> the proteome evolution=> the minimal proteome

Reconstruction du métabolisme

HMGCoA PI PIP

Dolichyl-PP Isopentenyl-PP PIP2

Farnesyl-PP

GPI

Signal transduction(kinase C)

Glycerol-3PFatty acids

Acetate AcetylCoA

L-serine PalmitoylCoA

SphingosinePhospholipid

Anabolism

IP3 , DAG ?

The E. cuniculi metabolism

Parasites de poissons

Poissons hôtes

E. cuniculi

Mammifères

The E. cuniculi metabolism

Examples of potential Examples of potential EcEc proteins specific of mitochondrial proteins specific of mitochondrial oxidoreductionsoxidoreductions (1)(1)

Chromosome Mitochondrial-type Homologue with the YeastNo protein highest BLAST score homologue

1 ? thioredoxin-like (H-type) YPD3 Caenorhabditis el. 179 (39%) YD83 167 (40%)4 pyruvate pyruvate DHaseDHase E1 beta subE1 beta sub. PDHB Rickettsia pr. 752 (43%) PDB1 750 (51%) 6 14-kDa protein (ALR/ERV1 fam.) ALR Rattus no. 262 (46%) ERV1 257 (45%)9 pyruvate pyruvate DHaseDHase E1 alpha sub.E1 alpha sub. Schizosacch. po. 680 (46%) PDB2 653 (44%)

10 mitoch. glycerol-3P DHase GPDM Caenorhabditis el. 1117 (40%) GPDM 901 (36%)11 Mn superoxide dismutase SODM Bacillus c. 471 (48%) SODM

No evidence for hydogenosomal-type oxidoreductases and aldehyde dehydrogenase

- E1 binds TPP and catalyses pyruvate decarboxylation- Pea E1 has been assembled as a functional tetramer α2β2 in Pichia pastoris (Moreno et al., 2000)

E1

α2β2Pyruvate

CO2

S-acetyldihydro-

lipoamide?

Ferredoxin ?NAD+ ?

Acetyl-CoAsynthetase ?...

Genes encoding subunits of the E1 component of mitochondrial pyruvate E1 component of mitochondrial pyruvate dehydrogenasedehydrogenase complexcomplex

lipoamide(no E2, no E3)

The mitosome hypothesis

Examples of potential Examples of potential EcEc proteins specific of mitochondrial proteins specific of mitochondrial oxidoreductionsoxidoreductions (2)(2)

Homologues of mitochondrial- and cytosolic-type glycerolglycerol--33--P P dehydrogenasesdehydrogenases

GlycerolGlycerol-- 33--phosphate shuttlephosphate shuttle (mitochondrial re-oxidation of cytosolic NADH)

2H+ + ½ O2 H2O

NADH NAD+

GPDGPD--CC

DHAP Glycerol-3-P

GPDGPD--MM

b c1 Co xQNd ext

Nd inte -

NADH NAD+Cytosol

Mitochondrialmatrix

NADH NAD+

?

no evidence for NADH dehydrogenases, cyt. bc1 complex, cyt. c and cyt. oxidase complex

C

The mitosome hypothesis

Pyruvate Acetyl-CoA NADH NAD+

e- electron transport ? e-

Glycolysis

CYTOSOL GPDH-cytoAcetate? Glycerol-3-P

shuttle DHAP Glycerol-3-P

ferredoxin NAD(P)H Fdx ORPDH -E1

décarboxylation of pyruvate Fe2S2 SOD-Mn

Fe-S cluster biosynthesis

HSP70TIM 22

translocation andprotein folding

NifU / IscU, Nfs, frataxin

mito ABC transp.

Matrix pre-proteins fer cytosolic Fe-S proteins

ferritin

ERV1

GPDH- mito

CO2

ACS

MITOSOME

Katinka et al., Nature, 2001

The ATP/ADP translocasesparalogues

L’omique

Gradient de pH linéaire5 8MM (kDa)

200

11696

66

45

31

21

parasites récoltés dans le milieu de culture

élimination des débris cellulaires

1010 parasites purifiés

extraction en urée, thiourée, DTT, CHAPS, SDS

Soluble 1 (1,56 mg)

électrophorèse 2D

MALDI-TOF(acquisition, annotation,

identification automatisées)

+ LC-MS/MS

préparation robotiséedes échantillons

insoluble

extraction par NaOH

insoluble

extraction en

LaemmliSoluble 3(0,18 mg)

Soluble 2(0,72 mg)

LC-MS/MS

digestion trypsique

complète de l’échantillon

Stratégie d’extractions protéiques et d’identification par spectrométrie de masse

Approches haut débit: le protéome

Métabolisme(4.5 %)

Energie (4.0 %)

Croissance, division,

synthèse ADN (4.0 %)

Transcription (3.4 %)

Synthèse protéique (19.9 %)

Modification et devenir

des protéines (21.0 %)

Transport facilité (0.6 %)Transport

intracellulaire (6.3 %)

Organisation cellulaire et biogenèse

(6.3 %)

Communication cellulaire et

transduction du signal (1.1 %)

Survie, défense, mort et

vieillissement cellulaire (3.4 %)

Fonction inconnue (25.6 %)

177 protéines différentes identifiées réparties en 12 classes fonctionnelles :Approches haut débit: le protéome

Génomique comparée: étude l’appareil invasif

Encephalitozoon cuniculi

(chromosome VI)

Antonosporalocustae

(contig 605)

ptp1

06_0250

ptp2

06_0240 06_0230i06_026006_028006_1320

860 bp

1117 bpORF-A ORF-B

Encephalitozoon cuniculiLe génome minimum

KARDKARD--PFGE PFGE KKaryotype aryotype AAnd nd RRestriction estriction DDisplayisplay 2D2D--PFGEPFGE

1st dimension PFGE= molécular karyotype

In gel digestionand radioactive

labelling

2nd dimensionelectrophoresis

Autoradiography

Brugère et al.,Nucleic Acids Res., 2000

Régions chromosomiques sub-terminales chez E. cuniculi

karyotype C variant

Sub-terminal probes

Hybridizationreference MluI KARD

I XI

kpb

10

48.5

97

146


II-

III -AD

-VD & F

VII

+IV

F

VIIIF

XID & F

X -- +

D & FC +IX

F C

I --C

VIFD CD


Chromosome 6Chromosome 9Chromosome 3Chromosome 11Chromosome 2Chromosome 7Chromosome 10Chromosome 8Chromosome 4Chromosome 5Chromosome 1

0 50 100 150 200 250 kpb


Chr. 1 1>1> rDNArDNA>>

<2<2 1>1><3<3

<1<1 2>2><3<3 4>4>

<4<4 4>4>

<5<5 4>4>

1<1< 1>1>

5>5><4<4 3>3>

<4<4 6>6>

<1<1

2>2>

22 6>6>

<6<6 7>7>

<<rDNArDNA

<6<6

<<rDNArDNA

Chr. 11Chr. 10Chr. 9

Chr. 8Chr. 7Chr. 6Chr. 5Chr. 4Chr. 3Chr. 2

5 kpb


Ancrage des consensusaux unités ADNr

Régions sub-terminales:- organisation- relation avec le cœur codant

Sub-télomère Région sub-terminale

‘Cœur’ riche enséquences codantes


Chr. 1 1>1> rDNArDNA>>

<2<2 1>1><3<3

<1<1 2>2><3<3 4>4>

<4<4 4>4>

<5<5 4>4>

<1<1 1>1>

5>5><4<4 3>3>

<4<4 6>6>

<1<1

2>2>

22 6>6>

<6<6 7>7>

<<rDNArDNA

<6<6

<<rDNArDNA

Chr. 11Chr. 10Chr. 9

Chr. 8Chr. 7Chr. 6Chr. 5Chr. 4Chr. 3Chr. 2

5 kpb


Chromosome 1

Chromosome 4

Chromosome 8

1111

11

1166 77

22

11

REGIONALISATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DES EXTREMITES

CHROMOSOMIQUES

Sub telomeric region of 15 kbp encompassing one rDNA unit.Sub terminal region with a size varying between 10 and 23 kbp.

coding core of the chromosome

-

-

-+

D & F-

- +D & FC

+F C

--

D

bioinformatic analysis genetic analysis

chromosome structure

F

CFD

FD&F

C

D A


CHROMOSOMIQUES

Familles VIR

Plasmodium falciparum

Plasmodium vivax

Trypanosoma brucei

Pneumocystis carinii

Familles MSG

Familles RIF, STEVOR et VAR

Encephalitozoon cuniculi

Familles INTER

FACTEURS DE VIRULENCE : forte recombinaison homologue

Familles VSG

ADNr


CHROMOSOMIQUES

Région conservée

Région conservée

FORTE DYNAMIQUE

Région sub-télomèrique

Région sub-terminale

Cœur codant

T

FACTEURS DEVIRULENCE

FORT TAUX DE RECOMBINAISON HOMOLOGUE

EUCHROMATINE HETEROCHROMATINEjonction


CHROMOSOMIQUES

P2x5 P2X3 P1X2 P2X2 L Sc P2X1 P1X1 * Pop P2X4 P2X6**

Génome des microsporidies:Spraguea lophii

k1k1

i1i1

g1g1f1f1

e1e1

c1c1

b3b3

b1b1a1a1

a10

h1h1 o1

o3

n1

n3

n2

j1j1

j2j2

k3k3

i2i2

h3h3h4h4

i4i4

g2g2

g3g3

g4g4

g5g5g6g6

f2f2

f3f3

f4f4

f5f5

e2e2e3e3

e4e4

c2c2

b2b2

b4b4b5b5

b6b6b7b7

b8b8

b10b10b9b9

a5a5a6a6a7a7a8a8

a9a9

a2a2

l2

l1

d2d2

d3d3d4d4d5d5

d6d6

d7d7c4c4

o2k2k2

h2h2

i5i5

a11

k4k4

n4

m1

m2

Kbp

300

150

100

50

20

5

a3a3

a4a4

d1d1

c3c3 i3i3

i6i6

Génome des microsporidies:Spraguea lophii

Génome des microsporidies:Paranosema grylii

Génome des microsporidies:Paranosema

grylii

Origine du caryotype:

-Diplocayon-Noyaux haploïdes(4,5-4,7Mpb, 17 chromosomes)-Sous populations dans l’hôte

=> Recombinaisons ectopiques

• Glugea atherinae : une microsporidie parasite du poisson Atherinae boyeri

• séquençage d’environnementKpb

1900

1600

1000

800

650500

400

Zone 1

Zone 2

Zone 3

Zone 4

K1

K2

K14

K3K4

K5K6K7K8K9

K10

K16

K11K12K13

K15

K17K18

K19

A.

E.

D.

C.

B.

K3 K4 K3 K4

Génome des microsporidies:Glugea atherinae

Du génome minimum au protéome minimum

70

60

50

40

30

20

10

0-20 -10 0 10 20 30 40 50

Size comparaisons between E. cuniculi andS. cerevisiae orthologues (%) - n=350

Num

bero

f pro

tein

s

E. cuniculi:espèce type

pour le protéome minimum

Katinka et al., Nature, 2001

Multiple alignment treatment and protein description

Gap1 Gap2 Gap3 Gap4

E. cuniculi: espèce type pour le protéome minimum

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

axe 1 2.5216 ( 42.03 %)

axe

2 1

.469

9 ( 2

4.5

%)

type1

type2type3

type4

type5

gap

Cercle des corrélationsCLUSTER=5

FREQUENCY of organi sme

CAEEL29

ENCCU375

SCHPO19

OTHER41

E. cuniculi: espèce type pour le protéome minimum

ACP: cercle des corrélation

Association des variablesTypologie des individus

Classification Ascendante Hiérarchique

Equipe Parasitologie Moléculaire et CellulaireUMR 6023 CNRS – Université Blaise Pascal

C.P. Vivarès

Génomique Protéomique Tube Ultrastructure BiochimieComparée PolaireE. Cornillot C. Texier F. Delbac G. Prensier H. DeniseInterB Carte Structure Glycomique G. MéténierN. Dia D. Brosson V. Polonais V. Taupin Blastocystis

KARD N. bombycis Interactome H. El AlaouiL. Mansour J. Wang I. Warwziniak J. BataE. NasonovaSéquençageL. LavieL. Wang

BioinformatiqueG. Chakroun(Pôle Modélisation)

ACI CNRS ProtéomiqueAromagroup M. MazetPharmaplanta N. Carpentier

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