genetica dna e sintese proteica
TRANSCRIPT
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8/7/2019 genetica DNA e sintese proteica
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GENGENTICATICA MOLECULARMOLECULAR
Daniel Macedo de Melo [email protected]
SUMSUMRIORIO
Histria da Gentica Molecular;
Organizao e estrutura dos genomas;
DNA e RNA
Dogma Central
Genes e genomas;
Tcnicas Gentica Molecular
ReplicaoTranscrioTraduo
PCRSequenciamentoEST
O QUEO QUE GENGENTICA?TICA?
o estudo dos genes e de sua transmisso para asgeraes futuras.
dividida em:- Gentica Clssica Mendel (1856 1865)
unidade fundamental da hereditariedade
- Gentica ModernaWatson e Crick (1953)pedao de DNA que codifica uma protena
O QUEO QUE GENGENTICA?TICA?
Terra
Pas
Estado
Municpio
Pessoas
Clula
Cromossomo
Fragmento
cromossmico
Bases de
pares
Gene
Escala ComparativaEscala Comparativa
Acontecimentos na genAcontecimentos na genticaticae genmicae genmica
Acontecimentos na genAcontecimentos na genticaticae genmicae genmica
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Acontecimentos na genAcontecimentos na genticaticaee genmicagenmica
cido desoxirribonuclcido desoxirribonuclicoico -- DNADNA
A estrutura do DNAA estrutura do DNA
DNA o material gentico
Estrutura regular (difrao de Raio-X)
Fitas complementares de nucleotdeos
Dupla hlice
DNA associado a protenas
A dupla hA dupla hlice de DNAlice de DNA
A estrutura do DNAA estrutura do DNA
Nucleotdeo:- Acar: pentose, desoxirribose- Fosfato- Bases nitrogenadas:
- Purina: Adenina guanina- Pirimidina: citosina timina- Pareamento- Ligadas por pontes de hidrognio
Ligaes fosfodiester
Quantidade de A = quantidade de T
Quantidade de G = quantidade de C
NucleotNucleotdeodeo A unidade deA unidade deconstruconstruo do DNAo do DNA
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Desoxirribose:Desoxirribose:o ao acar do DNAcar do DNA
PirimidinasPirimidinasPurinasPurinas
Bases nitrogenadasBases nitrogenadas
cido ribonuclcido ribonuclicoico -- RNARNA
Principais Tipos de RNAPrincipais Tipos de RNA
RNA mensageiro (mRNA): contm a informao genticapara a seqncia de aminocidos das protenas
RNA transportador (tRNA): identifica e transporta osaminocidos at o ribossomo
RNA ribossmico (rRNA): constituinte dos ribossomos
RibonucleotRibonucleotdeodeo O blocoO blocode construde construo do RNAo do RNA
RNA: umRNA: um cido nuclcido nuclico comico comestrutura questrutura qumica diferente do DNAmica diferente do DNA
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DNADNA RNARNADesoxirribose Ribose
A; G; C; T A; G; C; U
Dupla fita Fita simples; dobrada
Armazena informaes Transportainformaes; funesestrutural e cataltica
Molcula grande Molcula pequena
DNA x RNADNA x RNA
Replicao
Transcrio
Traduo
Protena
TranscrioReversa
Replicao deRNA
Dogma Central da BiologiaDogma Central da BiologiaMolecularMolecular
ReplicaReplicaoo
o processo na qual oDNA duplicado, a partirda fita molde.
Regras bRegras bsicas do processo desicas do processo dereplicareplicao do DNAo do DNA
Processo semiconservativo
Incio da replicao
- Origem
Movimento da forquilha de replicao
- Unidirecional ou bidirecional
Direo da replicao
- 5 3Semidescontinuidade da replicao
Enzimas que participam daEnzimas que participam dareplicareplicaoo
DNA Polimerase
SSB (Single Strand Binding Protein)
Primase
Helicases (DnaB)
Topoisomerases
DNA ligase
ReplicaReplicaoo
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TranscriTranscrioo
o processo pelo qual uma molcula de RNA sintetizada a partir da informao contida nasequncia de nucleotdeos de uma molcula deDNA de fita dupla
CaracterCaractersticas da transcristicas da transcrioo
RNA imediatamente liberado do DNA
Produo simultnea de muitas cpias a partirdo mesmo gene
- Gene com 1.500pbTranscrio = 50 segundos
15 RNA-polimerase/gene
1 hora = milhares de transcritos
TranscriTranscrioo TranscriTranscrioo
DNA fita codificadora
DNA fita molde
RNA transcrito
intronsexons
Processamento do transcrito primrio
Exciso dos exons
Unio dos exons
Processamento doProcessamento do mRNAmRNA ntronsntrons ee xonsxons
ntron regio no-codificante de umgene, transcrita na mlecula de RNA, masremovida pelo processamento do RNA
- 80 a 10.000 nucleotdeos
xon Seguimento de um gene formadopor uma seqncia de nucleotdeos quesero representados no RNA
Processamento: processo de remoo dentrons e juno de xons no RNAmensageiro de eucariotos
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TraduTraduoo
Processo na qual uma seqncia demRNA convertido em uma protena.
TraduTraduoo
CCdigo Gendigo Genticotico
Conceito:
So as instrues para sintetizarmolculas proticas e esto inscritas emcdigo nas molculas de DNA dosorganismos vivos.
CCdigo Gendigo Genticotico
Caractersticas do cdigo gentico
Trplice: 3 bases = cdon codificam um aa
Degenerado ou redundante: um mesmo aminocido pode sercodificado por vrios cdons diferentes
No ambguo: cada cdon corresponde a somente umaminocido
Com sentido: Startcdon a um stopcdon;
Universal: o mesmo para todos seres vivos
Utilizao preferencial de codons: codon usage
CCdigo Gendigo Genticotico
Trincas do Cdigo Gentico
Cada trinca de nucleotdeo do DNA corresponde a um aa naprotena.
A combinao das 4 letras genticas TACG, 3 a 3, permiteobter 64 trincas diferentes.
61 correspondem a aminocidos e 3 correspondem a cdonsde terminao; UAA, UAG e UGA.
CCdigo Gendigo Genticotico
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Arg-Tyr-Ser-Val
TraduTraduoo
DNA fita codificadora
DNA fita molde
RNA transcrito
Protena traduzida
Resumo da traduResumo da traduoo
DNA ou RNADNA ou RNA
DNA e RNADNA e RNA
Cromossomo
Plasmdios
CromossomoPlasmdios
ProcariticasProcariticas EucariticasEucariticas
Cromossomo
Mitocndrias
Cloroplastos
Cromossomo
Mitocndrias
Cloroplastos
Os GenomasOs Genomas
Vrus
Clulas
Fita simplesFita simples
Fita DuplaFita Dupla
Os GenomasOs Genomas
Organismos Procariticos: Bactrias
CromossomoPlasmdeo
Os GenomasOs Genomas
Cromossomo + Plasmdeos
O genoma da E. coli
- 4.639 kb
- 2.400 genes
- 80% da molcula de DNA
- 1.897 genes codificantes de protenas
OsOs PlasmPlasmdiosdios
Elemento gentico, extra-cromossmico, capazde replicar independente do cromossomo
- Dupla fita de DNA; Circular
- 1 100(+) Kb; < 1/20 do cromossomo
Diferentes dos vrus- No causam danos s clulas
- No so formas extracelulares
Diferentes do cromossomo
- No contm genes essenciais
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O Genoma dos OrganismosO Genoma dos Organismos
EucariEucariticosticos
O Genoma HumanoO Genoma Humano
23 cromossomos
31.000 genes
3.000 milhes de bases
O Genoma HumanoO Genoma Humano
Clula
Genoma
nuclear
Genoma mitocondrial
Famlia
O Genoma dos EucariO Genoma dos Eucariticosticos
O genoma nuclear:
- E. coli: 2.400 genes; 1.897 codificam protenas
- Saccharomyces cerevisiae: 6.600 genes; 5.800codificam protenas Exemplos utilizao
- Humanos: 100.000 genes, codificam protenas;genes > (+ ntrons)
O Genoma dos EucariO Genoma dos Eucariticosticos
Genoma humano:
- xons
-ntrons
- DNA repetitivo (no essencial ?)
- 30%
- No codifica
- No transcreve
- Repetidas muitas vezes
70%70%
CompactaCompactao do DNA emo do DNA emCromossomosCromossomos
Genoma humano
- 23 cromossomos - 1 metro
- DNA + Protenas
Protenas
- RNA polimerase, DNA polimerase, reguladoras, Histonas
Cromatina
- DNA-Protena Compactao do DNA
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TTcnicas de Gencnicas de GenticaticaMolecularMolecular
PCR
SequenciamentoEST
ReaReao em Cadeia dao em Cadeia daPolimerasePolimerase -- PCRPCR
1983: Kary Mullis
1985: 1 artigo
Processo patenteado em1989 por Cetus Corporation& Hoffman-LaRoche
1993: Nobel da Qumica
PCRPCR
Grande quantidade de DNA em pouco tempo.
Baixo custo
A amostra de DNA no necessita de estar altamentepurificada
PCR pode amplificar uma nica molcula de DNA / RNA
O produto do PCR pode ser digerido com enzimas derestrio, sequenciado ou clonado.
difcil exagerar o impacto da PCR na Biologia Molecular
Simplificou e democratizou as tcnicas de BiologiaMolecular
Possibilitou extender a Biologia Molecular para disciplinasnunca pensadas como Ecologia, Direito, Arqueologia,Economia, etc.
PCRPCR
dCTP
dGTP
dTTP
Mg2+
dATP
DNApolimerase
IniciadoresdNTPs
O queO que necessnecessrio?rio?
Em soluo tampo de PCR, H2O ultra-filtrada (pH 7,0)e leo mineral.
TermocicladoresTermocicladores
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www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf
MecanismoMecanismo
Divide-se em 3 passos principais, que se repetem por25 a 35 ciclos:
- Desnaturao
- Hibridao
- Extenso
A quantidade de DNA final segueuma funo exponencial, onde:
N=N0.2nN: nmero final de cadeias de DNA
N0: nmero inicial de DNA molde (template)
n: nmero de repeties do ciclo
DesnaturaDesnaturaoo
Processo no qual ocorre a separao dafita dupla de DNA por meio da elevao datemperatura.
As amostras so aquecidas a 94-96 Cdurante um a vrios minutos.
HibridaHibridaoo
A temperatura reduzida a 55-65 C durantealguns minutos.
Os iniciadores hibridam com as seqnciascomplementares do Molde.
ExtensoExtenso
Eleva-se a temperatura a 72C durante 2 minutos.
O DNA polimerase atua junto dos iniciadores
que hibridaram, comeando a duplicao dacadeia e recrutando no meio os nucletidoscomplementares disponveis.
SequenciamentoSequenciamento
Reao deSequenciamento
Molde
Taqpolimerase
Primer
Deoxinucleotdeos
Dideoxinucleotdeos
SequenciamentoSequenciamento
Mtodo didesoxiconhecido tambm como determinadores de cadeiaou de Sanger
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TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||
3
ATGCTTCATGCTTC5 3
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AA
TTTTTT TT
TT TT
TT
TT
TT
TT
TT
GG
GG
GGGG
GG
GG
GG
GG
GG
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CCCC
PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA
5
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||
3
ATGCTTCATGCTTC5 3
AA
AA
AA
AA
AAAA
AA
AA
AA
AA
TTTTTT TT
TT TT
TT
TT
TT
TT
TT
GG
GG
GGGG
GG
GG
GG
GG
GG
CC
CC
CC
CCCC
CC
CC
CC
CC
CCCC
PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA
5
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
||||||||||
3
ATGCTTCATGCTTCTGTG5 3
AA
AA
AA
AA
AA AA
AA
AA
AA
AA
TTTT
TT
TT
TT TT
TT
TT
TT
TT
TT
GG
GG
GGGG
GG
GG
GG
GG
GG
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA
5
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||||
3
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCT5 3
AA
AA
AA
AA
AAAA
AA
AA
AA AA
TT TTTT
TT
TTTT TT
TT
TT
TTTT GGGG
GGGG GG
GG
GG
GG GG
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA
5
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||||
3
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCT5 3
AA
AA
AA
AA
AAAA
AAAA
AA
AA
TT
TTTT
TT
TTTT
TT
TT
TT
TTTT
GG
GG
GGGG
GG GG
GG
GG
GG
CC
CC
CC
CCCC
CCCC
CC
CC
CC
CC
PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA
5
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||
3
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT5 3
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AAAA
AA
AA
TTTT
TT
TTTT
TT
TTTT
TTTT
TT
GG
GGGG
GG
GGGG
GG
GGGG
CCCCCC
CCCC
CC
CC
CCCC
CC
CC
PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA
-
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5
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||
3
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT5 3
AA
AA
AA AAAA
AA
AAAA
AA
AA
TTTT
TT
TT
TTTT
TTTT
TT TT
TT
GG
GGGG
GG
GGGG
GG
GGGG
CC
CC
CCCC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
CC
PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA
5
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAATACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
|||||||||||||||
3
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT5 3
AA
AA
AAAA
AA
AA
AAAA
AA
AATT
TTTT
TT
TTTT TT
TT
TTTT
TT
GG
GGGG
GG
GGGG
GG
GGGG
CC
CCCC
CCCC
CC
CC
CCCC
CC
CC
PolimerizaPolimerizao de DNAo de DNA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATGGCAGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT TT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC TT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGGCAGATCTGAACAGTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC TT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT TT
ATGCTTCATGCTTCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGGCAGATCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTGGCAGATCTGAACAGTGT TT
ATGCTTCATGCTTCTTGGATGCTTCATGCTTCTGTGGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCATGGCAGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTTGGCAGATCTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACATGGCAGATCTGAACAGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTTGGCAGATCTGAACAGTGG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT GG
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT GG
ATGCTTCATGCTTCTGGTGGCC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATTGGCAGATCC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAATGGCAGATCTGAACC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTATGGCAGATCTGAACAGTGTTACC
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG CC
ATGCTTCATGCTTCTGGCTGGCAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGTGGCAGAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGTGGCAGATCTGAAATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGATGGCAGATCTGAAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACTGGCAGATCTGAACAA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTTGGCAGATCTGAACAGTGTT AA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG AA
ATGCTTCATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT AA
G A T C
SeqSeqenciamento de DNAenciamento de DNA Gel de sequenciamento de DNAGel de sequenciamento de DNA
SequenciadoresSequenciadores
Seqenciamento parcial detranscritos
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intronsexons
Processamento do transcritoprimrio
Exciso dos exons
Unio dos exons
O que so ESTs?O que so ESTs?
EST= Expressed Sequence Tag
(Etiquetas de Seqncias Expressas)
cDNAREGIO CODIFICADORAREGIO CODIFICADORA
ATGATG STOPSTOP
AAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAATTTTTTTTTTTT
EST 5EST 5
EST 5EST 5
EST 3EST 3
EST 3EST 3
AAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTEST 5EST 5
EST 3EST 3
SeqSeqenciamento parcial deenciamento parcial detranscritostranscritos
AAAAAAAATTTTTTTTTT
EST 5EST 5 EST 3EST 3
AAAAAAAATTTTTTTTTT
EST 5EST 5
AAAAAAAATTTTTTTTTT
EST 5EST 5
AAAAAAAATTTTTTTTTT
EST 5EST 5
AAAAAAAATTTTTTTTTT
Clusterde ESTs oude reads
Seqnciaconsenso
SeqSeqenciamento parcial deenciamento parcial detranscritostranscritos Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Sergio Lifschitz. Ao comit organizador do BSB e ao
comit do IWGD. A todos os presentes.