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Genômica: Aplicações Clínicas
Prof. Dra. Neuza Lopes - 2013P&D Grupo Fleury/InCor- HCFMUSP
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Projeto Gemona Humano
Objetivos• Determinar a sequência
de todos os nucleotídeos do DNA humano, identificar e localizar os genes.
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Genoma é constanteFenótipo é dinâmico, muda constantemente
registra a história da vida – papel do RNA
O fenótipo depende do meio ambiente e de suas interações com o genótipo.
Mudança de Paradigma
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Genoma
mRNA ncRNA
Proteínas
Variação Normal ou PatológicaAmbiente
Variação em seqüência Variação estrutural Variação química na cromatina
Epigenômica
Genômica
Transcriptômica
Proteômica
Dogma Central
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DOENÇAS COM COMPONENTE GENÉTICO
Identificação do defeito genético
Diagnóstico
Medicina preventiva
Farmacogenética
Terapêutica
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Análise do fluxo da informação celular pela pesquisa genômica
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Sequenciamento de DNA: princípios
• Sequenciamento de DNA: metodologia que revolucionou a medicina diagnóstica
• Sequencia de bases permite prever manifestações do indivíduo
• Diagnósticos precoces permitem melhor tratamento e qualidade de vida
• Diagnósticos moleculares são mais precisos
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Gerações de Seqüenciadores
3ª Geração (single molecule)
Single Molecule Real Time –SMRT
(Pacific Bioscience)
HeliScope (Helicos Bioscience)
454 (Roche)
2ª Geração(amplificação clonal)
SOLiD (Life Technologies)
HiSeq2000, HiSeq2500, MiSeqIllumina
Ion Torrent- PGM, Proton(Life Technologies)
GridION-Oxford Nanopore
4ª Geração (Post-Light)
1ª Geração(clonagem) Sanger
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•Informação em grande escala
•Custo baixo
•Grande Processamento
Sequenciamento de Próxima Geração (Next Generation Sequencing - NGS)
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Venter, 2010 - Nature
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2001: Human Genome Project2.7G$, 11 years
2001: Celera100M$, 3 years
2007: 4541M$, 3 months
2008: ABI SOLiD60K$, 2 weeks
2009: Illumina, Helicos40-50K$ 2010: 5K$,
a few days?2012: 1000 <24 hrs?
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Captura de Exons
Captura de 180.000 exons codificantesCaptura de 541 exons de micro RNAs
- Estima-se o exoma humano em 35 a 40 Mb (aproximadamente 1 % do genoma total)
- Estima-se que 90% das doenças mendelianas tem como causa variações em exons
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Exoma
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Objetivos para sequenciamento genômicoExemplo
Sequenciamento de novo
Sequenciamento genômico Sequenciamento de >1000 genomas deinfluenza
DNA de org. extinto NeanderthalMetagenomica Intestino humano
Resequencia-mento
Genomas completos Indivíduos humanosRegiões genômicas Detecção de rearranjos ou regiões
associados à doenças
Mutações somáticas Em câncerTranscriptoma mRNA Definir regulação da transcrição
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)RNAs não codificadores Identificar e quantificar microRNAs
Epigenética Padrão de Methilação Avaliar padrão de metilação em câncer
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Personal Genome Machine – Ion Torrent (life technologies)
Three types of semiconductor chips:314 – 20Mb316 - 200Mb318 – 1Gb
Read length depends on base composition 200-250bp (200cycles)System is enabled for Paired End 2x100cyclesThe fastest sequencing system on the market.Recommendation:Resequencing applications which require fast turnaround of samples
- Amplicons (PCR products)- Small and medium size genomes- Custom DNA capture applications
How it works:
H+ ion is released during base incorporation. Individual polymerases attached to beads are positioned in tiny wells that rest on a tiny pH meter.
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Ion Proton System
- Human genome in one day- Cost of reagents $1000 per run- Error rate around 1.2%- Human Genome, RNAseq, ChIPseq
Ion Proton Chip I – 10Gb(Whole Exome capture experiments)
Ion Proton Chip II – 100GbWhole human Genome resequencing
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Biotecnologia
Genômica, transcriptômica, proteômica, lipidômica, ômicas
- Bioinformática, quimioinformática, neuroinformática
- Biologia computacional- Algoritmos - Análise estatística de dados biológicos- Biologia digital- Biologia de sistemas- Data mining
Text mining
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GWAS Genome Wide Association Studies
• Genotipagem de milhares de SNPs utilizando microarranjos da Illumina
• Modelo de Arquitetura Alélica para doenças Complexas – CD/CV – Common Disease/Common Variability ?
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Indicação
• Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos
• Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais
• Sequenciamento do DNA e genotipagem
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Microarray Processing sequence
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Published Genome-Wide Associations through 06/2011,
1,449 published GWA at p≤5x10-8 for 237 traits
NHGRI GWA Catalogwww.genome.gov/GWAStudies
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Não está assim tão claro!
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Ambiente e epigenéticaVariação fenotípica
normal
Modificado de:
?
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Oncologia molecular
• Genes do câncer• Fatores genéticos no câncer• Terapia gênica• Aplicações no diagnóstico• Triagem genética• Prognóstico
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PCR em tempo real
• Auxilia a identificação de diferentes subtipos deleucemias – translocações cromossômicasenvolvendo pontos de quebra recorrentes eespecíficos no DNA genômico
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Farmacogenética
• Medicina Personalizada já é uma realidade
Herceptina - Só é efetiva num subgrupo de cancer de mama com amplificação do protooncogene neu/ herbB
primeira droga no mercado que necessita de um teste genético antes de ser usada!
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Farmacogenética - Varfarina
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Farmacogenética - Clopidogrel
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Farmacogenética - Estatinas
Functionalrs4149056
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Microbiologia molecular
• Detecção laboratorial de patógenos• Patogenia das doenças• Epidemiologia dos distúrbios infecciosos
– Identificação – Resistência a drogas– Evolução e taxonomia
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Diagnóstico molecular – meningite e penuemonia bacteriana
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Testes genéticos comerciaisMiocardiopatia Hipertrófica
Painel de genes testados varia conforme a empresa
Mais simples: 10 genes
Mais completos: 28 genes
Identificação da mutação em 30-62% dos casos
Resultado negativo ≠ ausência da doença
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PROJETO EPIGENOMA HUMANOInstituto Sanger (britânico) e empresa Epigenomics (alemã) -
2005
•Pretende esclarecer como fatores ambientais (dieta e estresse) podem interferir no funcionamento dos genes?
•Como o estilo de vida aciona ou silencia os genes?•Como gêmeos idênticos (mesmo genoma) manifestam doenças diversas, como esquizofrenia, diabetes ou câncer?
•A metilação do DNA é influenciada pela alimentação →suplementação de vit B12,
ácido fólico e betaína → ricos em grupo metil → desativação gênica
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DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS MÉTODOS DE RASTREAMENTO
• Ampla variação de técnicas • Vantagens e desvantagens dos métodos• Limitações e sensibilidade dos métodos
Avanços tecnológicos e redução de custos podem tornar novas técnicas de diagnóstico aliadas poderosas e acessíveis na prevenção e no
tratamento de doenças genéticas
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Futuro
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Avanços na Medicina
• Preventiva
• Diagnóstico (específico, sensível, efetivo e seguro)
• Tratamento (desenhos de fármacos específicos)
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- Identificação de vírus respiratórios por painel em array de baixa densidade – 18 agentes avaliados em conjunto
- Avaliação de mutações em tumores sólidos (pulmão) para resposta à quimioterapia (EGFR / KRAS / BRAF)
- Variantes HPV
- Painéis de Leucemia – qualitativos e quantitativos
- Genética Molecular
- Avaliação de cepas bacterianas
- Quantificação e Genotipagem HIV
Onde estamos na era pós-genômica no Grupo Fleury
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Perspectivas
• Analitos avaliados em conjunto• Volume crescente de informação • Interpretação conjunta com diversas áreas• Tecnologias robustas• Reavaliação da ponte desenvolvimento-
aplicação• Remodelagem mercado saúde
• aplicações rápidas• Novos clientes