Functional characterization of the common c.-32-13T>G mutation of

GAA gene: identification of potential therapeutic agents.

Dardis et al., Nucleic Acid Research; 2013

�La maggior parte dei pazienti LO presenta la mutazione di splicing c.-

32-13T>G. (circa il 90 % dei pazienti presentano la mutazione in un

allele).

�Recentemente, sono state utilizzate numerose strategie per valutare

approcci terapeutici in grado di correggere/aumentare lo splicing

normale di trascritti che presentano mutazioni che colpiscono lo

splicing dell’mRNA.

�Esempi: AONs (clinical trials).

Piccole molecole che aumentano l’espressione o l’attività

dei fattori di splicing

�Questi approcci sono mutazione specifici e dipendono del

meccanismo mediante il quale la mutazione altera lo splicing normale.

�Caratterizzazione funzionale della mutazione c.-32-

13T>G del gene GAA

�Valutare in vitro strategie mirate a correggere/aumentare

lo splicing normale dei trascritti mutati.

Obbiettivi

exon 1

exon 2 (578 bp)

exon 3

cgggtgaga

35 bp

gcg/gtaaca

tcttctcccgcaggc….

60 bp

….acggtgggc catctcttctagat

g-13T>G Tcttccccaag/ga

Rela

tive n

orr

mal sp

liced

m

RN

A e

xp

ressio

n(%

of

C)

1 2 3

RT-qPCR

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Control P1 P2

5’ss(c1) 3’ss(c2)GAA

SV2

SV3c2

SV1

SV3’c2

mRNA splicing

YURAY (Y)n NCAGGAGGURAGU

U6U4

U2

U1U2AF

65BBP

U1 U2

U5

U2A

F35

U2AF

65

U2A

F35

SPLICEOSOME

mRNA

Exon 1 Exon 2

Exon 1

Exon 2

Exon 2Exon 1

ISE/ESE

ESS/ISS

A

-13u gccucccugcugagcccgcuuucuucucccgcagGCCUGUAugugugug

-13g gccucccugcugagcccgcuugcuucucccgcagGCCUGUAugugugug

-13u-13g Beads

U2AF65

TDP-43

-13 3‘ssug-tailBP

(yncuray)

CB -13u-13g BeadsMW

83

58

47.5

32.5

kDa

P. red Western

WT Mut

N

SV3SV2

0

20

40

60

80

100

120

WT MutR

ela

tive n

orr

mal sp

liced

m

RN

A e

xp

ressio

n(%

of

WT

)

Nde1�

50nt 50nt

GAAExon 2SV40

Nde1�

pA

Nde1�

50nt 50nt

GAAExon 2SV40

Nde1�

pAa2-3 Bra2

Minigene

WT

Mut

N

SV3SV2

N

SV3SV2

-

Effetto della sovraespressione di proteine SR e hnRNP sullo

splicing del esone 2 della GAA

SV3SV2

-

N

N

SV3

SV2

SRSF4

Tubulin

B CR

ela

tive n

orr

mal sp

liced

mR

NA

exp

ressio

n(%

of

scra

mb

le)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

P1 P1+2ug SRSF4 P1+4ug SRSF4

A

Rela

tive n

orr

mal sp

liced

mR

NA

exp

ressio

n(%

of

mo

ck t

ran

sfe

cetd

cells)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

scramble siRNA

*

*

*

Fibroblasti c.-32-13T>G

Fibroblasti Normali

Resv

- +

Resv.

SRSF4

SRSF6

SRSF1

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

Control P1 P1+Resv P2 P2+Resv

*

*

Rela

tive n

orr

mal sp

liced

m

RN

A e

xp

ressio

n(%

of

C)

*

**

Rela

tive n

orr

mal sp

liced

m

RN

A e

xp

ressio

n(%

of

Mu

t)

Rela

tive G

AA

acti

vit

y (

% o

f C

)

*

*

0

20

40

60

80

100

120

Control P1 P1+Resv P2 P2+Resv

0

1

2

3

4

5

6

**

70kDa

Actin

GAA

C P1 P2

- - + - +

Screening

Rela

tive n

orr

mal sp

liced

m

RN

A e

xp

ressio

n(%

of

Mu

t)*

**

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

Screening

exon 1

exon 2 (578 bp)

exon 3

cgggtgaga

35 bp

gcg/gtaaca

tcttctcccgcaggc….

60 bp

….acggtgggc catctcttctagat

-13T>G

Tcttccccaag/ga5’ss(c1) 3’ss(c2)

U2AF

65

SRSF4 Isoforma normale di splicing

Resv. SAHA Isoforma normale di splicing

Espressione della proteina GAA

Attività enzimatica GAA

“in vitro proof of principle” per l’utilizzo di piccole molecole al fine di

correggere lo splicing degli alleli che presentano la mutazione c.-32-

13T>G

In sintesi

Ringraziamenti

ICGEB

Emanuele Buratti

Cristiana Stuani

Francisco Baralle

Regional Coordinator Centre

for Rare Diseases

Stefania Zampieri

Irene Zanin

Annalisa Pianta

Milena Romanello

Bruno Bembi