fish
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TECNICA MOLECULARTRANSCRIPT
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FISH HIBRIDACIÓN IN SITU
FLUORESCENTE
BLGA. ROCÍO M. GONZÁLEZ MORENO
SONDAS para FISH
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TECNOLOGÍA DE MARCADO DIRECTO
COLOCAR LA MUESTRA
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HIBRIDACIÓN
La muestra es hibridizada con
sondas fluorescentes.
Sondas de diferente color
pueden ser usadas sobre
diferentes cromosomas o
genes.
TIPOS DE SONDAS TINCIÓN COMPLETA---
SECUENCIAS
REPETITIVAS---------
SECUENCIA
ÚNICA---------------
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Nombre: Vysis LSI 13 Ubicación de la sonda: 13q14 Fluoróforo: SpectrumGreen
SONDA COPIA ÚNICA
Nombre: Vysis LSI 21 Ubicación de la sonda: 21q22.13-q22.2 Fluoróforo: SpectrumOrange
SONDA COPIA
ÚNICA
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SONDA DE COPIA ÚNICA
TRISOMÍA 21: Patrón 2V3N (dos señales verdes y tres señales de color naranja).
SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS
Chromosome enumeration probes (CEP) Nombre: CEP X Ubicación de la Sonda: Xp11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA Fluoróforo: SpectrumOrange
Nombre:CEP Y Ubicación de la Sonda: Yq12 Satellite III Fluoróforo: SpectrumGreen
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DNA satélite
SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS
SEXO FEMENINO: Patrón 2O (dos señales anaranjadas)
SEXO MASCULINO: 1G1O (Una señal verde, una señal anaranjada)
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SONDA CENTROMÉRICA
Nombre: Vysis CEP 18
Ubicación de la Sonda:18p11.1-q11.1 Alpha Satellite DNA
Fluoróforo: SpectrumAqua
SET de SONDAS 18/X/Y
Tres señales aqua indican tres copias del cromosoma 18, una señal verde indica una copia del cromosoma X y una señal naranja indica una copia del cromosoma Y
SONDAS DE SECUENCIAS REPETITIVAS
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SONDA DE PINTADO PARA EL CROMOSOMA
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Multi-FISH o SKY
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FUNDAMENTO DEL FISH
FISH SE REALIZA EN VARIEDAD DE MUESTRAS
El botón de la muestra puede tener variada procedencia:
Un cultivo de sangre periférica o de médula ósea
Eyaculado de esperma,
Cultivo o células directas de Liquido amniótico
Cortes de muestras de tejido de archivo de patología: ovario, mama
Cualquier tejido ó célula única para realizar diagnóstico genético de preimplantación (DGP).
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PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
PREPARACIÓN DE LA SONDA
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CODESNATURALIZACIÓN E HIBRIDACIÓN
•Colocar las láminas a 73-75 grados centígrados
dejar por 5 minutos.
•Colocar las láminas en cámara de hibridación húmeda
previamente mantenida a 37 grados durante 18-48
horas
LAVADOS
SOLUCIONES Solución A 2xSSC pH 7.0 a
temperatura ambiente.
Solución B, 0.4SSC-0.3% NP40 o
tween 80 o tween 20, pH 7.0
mantenida en baño María a 72-75 °C.
Solución C, 2xSSC 0.1%, NP40 o
tween 80 o tween 20, pH 7.0
Temperatura ambiente.
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LAVADOS
Contratinción
•Hacer una mezcla 1:1 de colorante
de DAPI II y Antidesvanecente.
•Dejar reposar en obscuridad y en
refrigeración (2-8 °C), durante 10-15
minutos
•Observar bajo microscopio de
fluorescencia.
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ANÁLISIS
ANÁLISIS
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FISH EN NUCLEOS INTERFÁSICOS
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LSI D7S486/CEP 7 Dual Color Probe Patrón: 202G SONDAS DE FUSION
LSI MLL Dual Color, Break Apart Patrón: 1O1G1F
SONDAS DE ESCISIÓN
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LSI BCR/ABL Dual Color, Dual FusionTranslocation Probe Patrón: 1O1G2F
SONDAS DE FUSION
NOMENCLATURA DE FISH SEGÚN
EL MANUAL DEL SISTEMA
INTERNACIONAL DE
NOMENCLATURA CROMOSÓMICA
ISCN 2013
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- Ausencia de un cromosoma específico, o secuencia
genómica.
+ Presente en un cromosoma específico o secuencia
genómica.
++ Dos señales de hibridación ó regiones sobre un
cromosoma específico.
X Signo de multiplicación precede el número de señales
vistas.
. Punto, separa observaciones de resultados de
hibridación in situ
SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
; Punto y coma, separa las sondas en diferentes cromosomas
derivativos
Amp Señal amplificada
Dim Señal disminuida
Enh Intensidad de señal realzada
Fib ish Hibridización in situ en una fibra de cromatina
extendida.
ish Hibridización in situ , cuando se realiza sobre cromosomas
(metafases)
nuc ish Hibridación in situ en núcleos ó en interfase
SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
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pcp Pintado parcial de cromosomas (hibridación con
mezclas de sondas )
rev ish Hibridación in situ reversa incluyendo CGH con
FISH
sep Señales separadas
subtel Subteloméricas
Wcp Pintado completo del cromosoma
SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
CUANDO SE REALIZA EL ANÁLISIS
EN NÚCLEOS INTERFÁSICOS
nuc ish 15q11.2(D15S10X1)[300]
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EJEMPLOS EN METAFASE del 22q11
46,XY,ish 22q11.2(TUPLE 1X2)
Cuando se le realiza cariotipo
EJEMPLO EN METAFASE EN EL SÍNDROME DE
PRADER WILLI/ANGELMAN
46,XX, ish del(15)(q11.2q11.2)(D15S10-)
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Ej. CON PINTADO COMPLETO DEL CROMOSOMA
47,XX,+mar[20]. ish (wcp 12+)
-Identifica desórdenes genómicos mediante la detección directa
de los genes involucrados, utilizando sondas de ADN marcadas
con fluorocromos.
- Núcleos interfásicos: permite determinar el número de copias de uno o varios
cromosomas, así como para detectar algunas reorganizaciones específicas que son
características de ciertos tipos de cáncer
- Se pueden estudiar hasta 1000 células.
- No es necesario cultivar
- Células en metafase: para detectar microdeleciones específicas, o para
identificar material extra de origen desconocido.
Para determinar si un cromosoma tiene una deleción simple o si está implicado en
una reorganización sutil o compleja.
VENTAJAS DE FISH
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VENTAJAS DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR
- Alta sensibilidad
- Alta especificidad
- Permite diagnóstico, pronóstico y seguimiento rápido.
- Permite el diagnóstico en casos con cariotipo normal.
- Permite caracterizar los diferentes puntos de ruptura,
asociados a distintos tipos de patologías .