Βασιλική ΧατζήΥπ. Διδάκτορας, Υπότροφος ΙΠΤΑ

Τίτλος Διδακτορικής Διατριβής:

Έκθεση σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες καιχημικούς γενοτοξικούς παράγοντες στοεργασιακό περιβάλλον: Επιπτώσεις σε κυτταρογενετικό επίπεδο καιμηχανισμοί δράσης

ΗΜΕΡΙΔΑ ΥΠΟΨΗΦΙΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΩΝ ΙΠΤΑ, ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ»

ΕΚΕΦΕΕΚΕΦΕ ««ΔημόκριτοςΔημόκριτος»»

ΙνστιτούτοΙνστιτούτο ΠυρηνικήςΠυρηνικής ΤεχνολογίαςΤεχνολογίας & & ΑκτινοπροστασίαςΑκτινοπροστασίας

ΕργαστήριοΕργαστήριο ΥγειοφυσικήςΥγειοφυσικής & & ΠεριβαλλοντικήςΠεριβαλλοντικής ΥγείαςΥγείας

ΕπίβλεψηΕπίβλεψη

ΔρΔρ. . ΓεωργίαΓεωργία ΤερζούδηΤερζούδη

ΔρΔρ. . ΓαβριήλΓαβριήλ ΠαντελιάςΠαντελιάςΧαράΧαρά ΣπηλιοπούλουΣπηλιοπούλου, , ΑνΑν. . ΚαθηγήτριαΚαθηγήτριαΙατρικήΙατρική ΣχολήΣχολή, , ΠανεπιστημίουΠανεπιστημίου ΑθηνώνΑθηνών

ΚωσταντίνοςΚωσταντίνος ΜαραβέλιαςΜαραβέλιας, , ΑνΑν. . ΚαθηγητήςΚαθηγητήςΙατρικήΙατρική ΣχολήΣχολή, , ΠανεπιστημίουΠανεπιστημίου ΑθηνώνΑθηνών

ΔημήτριοςΔημήτριος ΜατθόπουλοςΜατθόπουλος, , ΑνΑν. . ΚαθηγητήςΚαθηγητήςΠανεπιστημιακήςΠανεπιστημιακής ΣχολήςΣχολής ΑγρινίουΑγρινίου, , ΠανεπιστήμιοΠανεπιστήμιο ΙωαννίνωνΙωαννίνων

ΥπΥπ. . ΔιδάκτοραςΔιδάκτορας απόαπό τοντον ΑπρίλιοΑπρίλιο τουτου 20042004ΙατρικήΙατρική ΣχολήΣχολή

ΕθνικόΕθνικό & & ΚαποδιστριακόΚαποδιστριακό ΠανεπιστήμιοΠανεπιστήμιο ΑθηνώνΑθηνών

ΕργαστήριοΕργαστήριο ΤοξικολογίαςΤοξικολογίας & & ΙατροδικαστικήςΙατροδικαστικής

ΤριμελήςΤριμελής ΣυμβουλευτικήΣυμβουλευτική ΕπιτροπήΕπιτροπή

Διαρκώς αυξανόμενη ανησυχία για τημεταλλαξιγόνο και καρκινογόνο δράσηγενοτοξικών παραγόντων στους οποίους οάνθρωπος εκτίθεται καθημερινά κυρίως στοεπαγγελματικό περιβάλλον.

Τέτοιοι επιβλαβείς παράγοντες, είναι οιιοντίζουσες ακτινοβολίες (IR) και οι χημικοίγενοτοξικοί παράγοντες, των οποίων ηεπικινδυνότητα δεν είναι πάντα πλήρωςδιευκρινισμένη.

Απαιτείται εμπεριστατωμένη έρευνα για τηδιευκρίνιση των μηχανισμών δράσης τωνγενοτοξικών παραγόντων.

Για την εκτίμηση επικινδυνότητας γενοτοξικώνπαραγόντων είναι αναγκαία η ανάπτυξη νέωνευαίσθητων μεθόδων ανίχνευσης καιδοσιμέτρησης των παραγόντων αυτών.

Προβληματισμός :

ΣτόχοιΣτόχοι ΔιατριβήςΔιατριβής

Μελέτη των επιπτώσεων IR και χημικών γενοτοξικών παραγόντωντου επαγγελματικού περιβάλλοντος σε κυτταρογενετικό επίπεδο.

Κατανόηση των μηχανισμών συνδυασμένης δράσης IRκαι χημικών γενοτοξικών παραγόντων.

Ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών δοσιμέτρησης καιβιοπαρακολούθησης εργαζομένων με IR και γενοτοξικούςπαράγοντες.

Ο στόχος των γενοτοξικώνπαραγόντων είναι το DNA τοοποίο οργανώνεται σεχρωμοσώματαστον πυρήνα του κυττάρου

ΣχηματικήΣχηματική αναπαράστασηαναπαράστασητουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου

Για την προστασία του κυττάρου καιτην επιδιόρθωση των βλαβών στογενετικό υλικό, υπάρχουν μεταξύ τωνφάσεων του κυτταρικού κύκλου«σημεία ελέγχου» (checkpoints).

Ένα τέτοιο σημείο ελέγχου υπάρχειμεταξύ της φάσης της προετοιμασίαςτου κυττάρου για τη Mίτωση (G2) καιτης φάσης της Μίτωσης (G2/M checkpoint)

Ανεπαρκής λειτουργία του σημείουελέγχου έχει συσχετιστεί με γενετικέςασθένειες όπως και με διάφορεςμορφές καρκίνου.

G2/M

Βιβλιογραφία: Terzoudi GI, Manola KN, Pantelias GE and Iliakis G: Checkpoint abrogation in G2 compromises repair of chromosomal breaks in ataxia telangiectasia cells. Cancer Res 65: 11292-11296, 2005.

ΑποτελέσματαΑποτελέσματα ΕπίδρασηςΕπίδρασης ΑκτινοβολιώνΑκτινοβολιών καικαι ΧημικώνΧημικώνΓενοτοξικώνΓενοτοξικών ΠαραγόντωνΠαραγόντων στοστο ΓενετικόΓενετικό ΥλικόΥλικό

Βλάβηστο DNA

Επιβίωση κυττάρου

Επιδιόρθωσηβλάβης χωρίς λάθη

Λανθασμένηεπιδιόρθωσηβλάβης

Κυτταρικός θάνατος

Μεταλλαγμένο κύτταρο

Σταμάτηματου

κυτταρικούκύκλουγια

επιδιόρθωσητης βλάβης

ΣυνδυασμένηΣυνδυασμένη δράσηδράσηιοντιζουσώνιοντιζουσών ακτινοβολιώνακτινοβολιών καικαι χημικώνχημικών ουσιώνουσιών

στοστο εργασιακόεργασιακό περιβάλλονπεριβάλλον

ΥδροκινόνηΥδροκινόνη ((HQ)HQ)ΓλουταραλδεϋδηΓλουταραλδεϋδη ((Glut)Glut)

ΧρήσειςΧρήσεις ΥδροκινόνηςΥδροκινόνης

Εμπεριέχεται στη σύστασηυγρών εμφάνισης film

Ακτινολογικά εργαστήρια

Βιομηχανία πλαστικών, πολυμερών

Βιομηχανία παρασκευήςφυτοφαρμάκων

Ιατρική (θεραπεία μελάσματος)

Αισθητική (λευκαντικέςκρέμες προσώπου γιαφακίδες και δυσχρωμίες)

Κομμωτική (βαφές μαλλιών)

ΚαπνόςΚαπνός τσιγάρουτσιγάρου (110(110--300 300 mgr/mgr/τσιγάροτσιγάρο))

ΧρήσειςΧρήσεις ΓλουταραλδεΓλουταραλδεΰΰδηςδης

Αποστείρωση Ιατρικού και Οδοντιατρικούεξοπλισμού σε νοσοκομεία και ιατρεία((βακτηριοκτόνοβακτηριοκτόνο, , μυκητοκτόνομυκητοκτόνο))

Βιομηχανία χαρτιού (Αντιβακτηριδιακόςπαράγοντας στην επεξεργασίαχαρτοπολτού)

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία(Μονιμοποιητικό διάλυμα ιστών)

Βυρσοδεψία

Ακτινολογικά εργαστήρια (υγράεμφάνισης film)

ΑναγκαιότηταΑναγκαιότητα διερεύνησηςδιερεύνησης δράσηςδράσηςγενοτοξικώνγενοτοξικών παραγόντωνπαραγόντων

Δεν είναι πλήρως διευκρινισμένη η γενοτοξικήτους δράση

Κατατάσσονται ως πιθανά καρκινογόνα για τονάνθρωπο και ως καρκινογόνα σε πειραματόζωα

Δεν υπάρχουν μελέτες σχετικά με τησυνεπίδρασή τους με ΙR

ΠειραματικόςΠειραματικός ΣχεδιασμόςΣχεδιασμόςΕπικεντρώνεταιΕπικεντρώνεται στηνστην::

ΑνάπτυξηΑνάπτυξη νέωννέων ευαίσθητωνευαίσθητων κυτταρογενετικώνκυτταρογενετικών μεθοδολογιώνμεθοδολογιώνγιαγια τοτο χαρακτηρισμόχαρακτηρισμό τηςτης γενοτοξικήςγενοτοξικής δράσηςδράσης χημικώνχημικώνπαραγόντωνπαραγόντων σεσε επίπεδοεπίπεδο χρωμοσωμάτωνχρωμοσωμάτων..

ΜελέτηΜελέτη τηςτης συνδυασμένηςσυνδυασμένης δράσηςδράσης ΙΙRR μεμε ΗΗQQ, , λαμβάνονταςλαμβάνονταςυπόψηυπόψη καικαι τιςτις διαφορέςδιαφορές στηνστην ενδογενήενδογενή ακτινοευαισθησίαακτινοευαισθησίαμεταξύμεταξύ τωντων ατόμωνατόμων..

ΚατανόησηΚατανόηση τωντων μηχανισμώνμηχανισμών τηςτης γενοτοξικήςγενοτοξικής τουςτους δράσηςδράσης..

ΜέθοδοιΜέθοδοι

ΓιαΓια τητη διερεύνησηδιερεύνηση χρωμοσωματικώνχρωμοσωματικών βλαβώνβλαβών μετάμετά απόαπό έκθεσηέκθεση σεσεγενοτοξικούςγενοτοξικούς παράγοντεςπαράγοντες εφαρμόστηκανεφαρμόστηκαν μέθοδοιμέθοδοι κλασικήςκλασικής

κυτταρογενετικήςκυτταρογενετικής πουπου περιλαμβάνουνπεριλαμβάνουν::

ΗΗ ανάλυσηανάλυση πραγματοποιήθηκεπραγματοποιήθηκε σεσε επίπεδοεπίπεδο: :

(1) (1) ΧρωμοσωματικώνΧρωμοσωματικών αλλοιώσεωναλλοιώσεων ((CAs)CAs)

CAs σε Μετάφαση PBL μετά από έκθεσησε ΙR (6Gy)

CAs:Χρησιμοποιούνταιευρέως ως δείκτηςγονοτοξικότητας, καρκινογένεσης καιως δείκτης έκθεσηςσε ιοντίζουσεςακτινοβολίες.

SCEs σε Μετάφαση PBL μετά από επίδρασηγενοτοξικού παράγοντα (18-20 SCEs)

SCEs:SCEs:ΧρησιμοποιούνταιΧρησιμοποιούνταιευρέωςευρέως ωςως δείκτηςδείκτηςέκθεσηςέκθεσης σεσεγενοτοξικούςγενοτοξικούςπαράγοντεςπαράγοντες

((22) ) ΑνταλλαγώνΑνταλλαγών αδελφώναδελφών χρωματίδωνχρωματίδων ((SCEs)SCEs)

Βιβλιογραφία: Terzoudi GI, Malik SI, Pantelias GE, Margaritis K, Manola K and Makropoulos W: A new cytogenetic approach for the evaluation of mutagenic potential of chemicals that induce cell cycle arrest in the G2 phase. Mutagenesis 18: 539-543, 2003.

ΓιαΓια τητη διερεύνησηδιερεύνηση τηςτης ακτινοευαισθησίαςακτινοευαισθησίαςεφαρμόστηκεεφαρμόστηκε ηη μέθοδοςμέθοδος τηςτης

G2G2--ακτινοευαισθησίαςακτινοευαισθησίας ((G2G2--assay)assay)

G2-assay:H Mέθοδος, βασίζεταιστην επίδραση IR στηG2-φάση τουκυτταρικού κύκλου καιστην καταμέτρηση τωνχρωμοσωματικώνβλαβών στη Mετάφαση

Χρωματιδικές αλλοιώσεις μετά απόακτινοβόληση στη G2-φάση

Βιβλιογραφία: Terzoudi GI, Jung T, Hain J, et al: Increased G2 chromosomal radiosensitivity in cancer patients: the role of cdk1/cyclin-B activity level in the mechanisms involved. Int J Radiat Biol 76: 607-615, 2000.

ΟιΟι συμβατικέςσυμβατικές μέθοδοιμέθοδοι ανάλυσηςανάλυσης τωντων χρωμοσωμάτωνχρωμοσωμάτωνστηστη ΜετάφασηΜετάφαση, , εφαρμόστηκανεφαρμόστηκαν σεσε συνδυασμόσυνδυασμό μεμε άλλεςάλλεςκυτταρογενετικέςκυτταρογενετικές μεθόδουςμεθόδους τελευταίαςτελευταίας τεχνολογίαςτεχνολογίας::

ΜεθοδολογίαΜεθοδολογίαΠρόωρηςΠρόωρης ΧρωμοσωματικήςΧρωμοσωματικής ΣυμπύκνωσηςΣυμπύκνωσης

((PCC, Premature Chromosome Condensation)PCC, Premature Chromosome Condensation)

ΜεθοδολογίαΜεθοδολογία PCC PCC μεμε τητη χρήσηχρήση καλυκουλίνηςκαλυκουλίνης--ΑΑ

Επιτρέπει τημικροσκοπικήανάλυση καιταξινόμηση τωνκυττάρων στιςδιάφορες φάσεις τουκυτταρικού κύκλουκαι όχι μόνο στηΜετάφαση πουεπιτρέπει ησυμβατική μέθοδος

Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος σε διάφορες φάσεις τουκυτταρικού κύκλου με τη χρήση καλυκουλίνης-Α.

Βιβλιογραφία: Terzoudi GI, Malik SI, Pantelias GE, Margaritis K, Manola K and Makropoulos W: A new cytogenetic approach for the evaluation of mutagenic potential of chemicals that induce cell cycle arrest in the G2 phase. Mutagenesis 18: 539-543, 2003.

ΜεθοδολογίαΜεθοδολογία PCC PCC μέσωμέσωκυτταρικήςκυτταρικής σύντηξηςσύντηξης

Η Μέθοδος βασίζεται στην σύντηξημιτωτικών κυττάρων χάμστερ (CHO)με λεμφοκύτταρα (Ly) που έχουνεκτεθεί σε χημικούς γενοτοξικούςπαράγοντες και ΙR.

Με τον τρόπο αυτό, μετά την κυτταρικήσύντηξη, παράγοντες που προωθούν τηΜίτωση (MPF) από τα CHO κύτταραεπιδρούν στα λεμφοκύτταρα,συμπυκνώνοντας πρόωρα ταχρωμοσώματα τους και επιτρέποντας τηνάμεση ανάλυση της βλάβης.

Βιβλιογραφία: Pantelias GE and Maillie HD: A simple method for premature chromosome condensation induction in primary human and rodent cells using polyethylene glycol. Somatic Cell Genet 9: 533-547, 1983.

ΑποτελέσματαΑποτελέσματα

(1) (1) ΜελέτηΜελέτη επαγωγήςεπαγωγής CAsCAs

Έκθεση σε [ΗQ] >30μΜ →στατιστικώς σημαντικήδιαφορά στις CAs ως προς τοControl

Στα 200μΜ δεν ήταν δυνατήη ανάλυση μεταφάσεων

(2) (2) ΜελέτηΜελέτη επαγωγήςεπαγωγής SCEsSCEs

Η ΗQ προκαλείδοσοεξαρτώμενη αύξησητων SCEs

Με τη μέθοδο PCC, μελετήθηκαν SCEs στη G2-φάση (παρατηρήθηκε ↑ ↑SCEs)

Επιπλέον:Κατέστη δυνατή η ανάλυσηSCEs στη G2-φάση σε [ΗQ]που η ανάλυση στηMετάφαση δεν είναι εφικτή(200μΜ)

Λεμφοκύτταρα περιφερικούαίματος εκτέθηκαν σεμη-γενοτοξική δόση HQ καισε ΙR.

Η HQ αυξάνει τηG2-ακτινοευαισθησία.

(3) (3) ΜελετήθηκεΜελετήθηκε ηη τροποποίησητροποποίηση τωντων βιολογικώνβιολογικώνεπιδράσεωνεπιδράσεων IRIR μετάμετά απόαπό επίδρασηεπίδραση χημικώνχημικώνγενοτοξικώνγενοτοξικών παραγόντωνπαραγόντων

(4) (4) ΔιερευνήθηκανΔιερευνήθηκαν μεμε PCC PCC οιοι μηχανισμοίμηχανισμοίδράσηςδράσης τηςτης HQ HQ στηνστην αύξησηαύξηση τηςτης

ακτινοευαισθησίαςακτινοευαισθησίας

Πιο συγκεκριμένα, αν η HQ επιδρά:

A) Αρχική βλάβη που προκαλείται από την ακτινοβολία

B) Μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA

Γ) Κυτταρικό κύκλο

(4(4ΑΑ) ) ΕπίδρασηΕπίδραση HQ + IRHQ + IR στηνστην επαγωγήεπαγωγήχρωμοσωματικώνχρωμοσωματικών βλαβώνβλαβών

Ο αριθμός των CAs μετά από έκθεση σε2, 4 και 6 Gy παραμένει ίδιοςπαρουσία καιαπουσία ΗQ.

Συμπέρασμα:η HQ δεν επιδρά στηναρχική βλάβη πουπροκαλείται από τηνακτινοβολία

(4(4ΒΒ) ) ΕπίδρασηΕπίδραση HQ + IRHQ + IR στοστο μηχανισμόμηχανισμόεπιδιόρθωσηςεπιδιόρθωσης τουτου DNADNA

Ο αριθμός των CAs 2 και 4 ώρες μετά τηνέκθεση σε IR παραμένειίδιος παρουσία καιαπουσία ΗQ.

Συμπέρασμα:η HQ δεν επιδρά στομηχανισμό επιδιόρθωσηςτου DNA

(4(4ΓΓ) ) ΕπίδρασηΕπίδραση ΗΗQ+IR Q+IR στονστονκυτταρικόκυτταρικό κύκλοκύκλο

Μετά από ταξινόμησηκυττάρων στις G1, S, G2, M φάσεις του κύκλου

Συμπέρασμα: H HQ αυξάνει την επαγωγήCAs μετά από έκθεση σε IRεπιδρώντας στο “G2/M checkpoint” επιτρέπονταςπερισσότερα αλλοιωμένακύτταρα να περνούν στηΜετάφαση.

G2/M

checkpoint

ΠαρουσιάσειςΠαρουσιάσεις -- ΣυνέδριαΣυνέδρια

Hatzi V.I., G.I.Terzoudi, S.I. Malik, G.E. Pantelias & V. Makropoulos “Combined cytogenetic action of hydroquinone and ionising radiation as analyzed in metaphase and G2-phase of peripheral blood lymphocytes”. 35th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society – Environment and Human Genetic Disease-Causes, mechanisms and effects, Kos, July, 2005.

Hatzi V.I., G.I.Terzoudi, S.I. Malik, C. Stavropoulou, G.E. Pantelias, and V. Makropoulos. “Individual sensitivity to the genotoxic agents by the analysis of SCEs in G2-phase arrested cells and the potential role of endogenous mutagenesis” 35th Annual Meeting of the European Environmental Mutagen Society – Environment and Human Genetic Disease-Causes, mechanisms and effects, Kos, July, 2005.

Χατζή Β.Ι., Γ.Ι. Τερζούδη, Γ.Ε. Παντελιάς και Β. Μακρόπουλος. “Κυτταρογενετική μελέτη συνδυασμένης δράσης υδροκινόνηςκαι ιοντίζουσας ακτινοβολίας σε λεμφοκύτταρα περιφερικούαίματος” 4ο Πανελλήνιο Συνέδριο Προαγωγής και Αγωγής Υγείας,Αθήνα 8-10 Δεκεμβρίου 2005.

Hatzi V.I., G.I.Terzoudi, G.E. Pantelias and V. Makropoulos. “Simultaneous in vitro exposure to hydroquinone and ionising radiation: SCEs and chromosome aberration analysis in peripheral blood lymphocytes” 28th International Congress on Occupational Health, 11-16 June 2006, Milan, Italy.