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UNIVERSIDAD DE JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
Bioquímica del olivo: triterpenos pentacíclicos
Alumno: Isabel María Fernández León
Julio, 2014
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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Bioquímica del olivo: triterpenos pentacíclicos
Alumno: Isabel María Fernández León
Julio, 2014
Índice:
1. Resumen ........................................................................................................... 1 2. “Abstract” .......................................................................................................... 3 3. Introducción ...................................................................................................... 5 4. Objetivos ......................................................................................................... 12 5. Material y métodos .......................................................................................... 13
5.1. Recogida de muestras .......................................................................... 13 5.2. Extracción y análisis de los triterpenos pentacíclicos ........................... 13 5.3. Métodos para determinar la actividad biológica de los triterpenos ....... 15
5.3.1. Cultivos celulares ..................................................................... 15 5.3.2. Ensayo de proliferación celular ................................................ 15 5.3.3. Estudios morfológicos .............................................................. 16 5.3.4. Detección de apoptosis ............................................................ 16 5.3.5. Análisis de citometría de flujo .................................................. 17 5.3.6. Pruebas de invasividad y viabilidad celular .............................. 17 5.3.7. Modelos experimentales .......................................................... 18
6. Resultados y discusión ................................................................................... 19 6.1. Localización y concentración de los triterpenos pentacíclicos en Olea
europaea……………………………………………………………………. 19 6.2. Actividad biológica………………………………………………………… 27 6.2.1. Efectos anti-cancerígenos…………..…………………………….. 27 6.2.2. Efectos sobre la diabetes…………...………………………….…. 34 6.2.3. Efectos sobre enfermedades cardiovasculares…………………. 37 6.2.4. Efectos en el tratamiento del dolor e inflamación……………… 39 6.2.5. Efectos sobre la infección por VIH y parásitos………………….. 42
7. Conclusiones ................................................................................................. 45 8. Bibliografía ................................................................................................. 46
ABREVIATURAS:
AM: ácido maslínico
AO: ácido oleanólico
AU: ácido ursólico
EO: eritrodiol
UO: uvaol
OS: (3S)-2,3-oxidoescualeno
LDL: lipoproteínas de baja densidad
HDL: lipoproteínas de alta densidad
HPLC-MS: cromatografía líquida de alta resolución- espectrometría de masas
HPLC-UV/vis: cromatografía líquida de alta resolución-ultravioleta-/visible
GP: glucógeno fosforilasa
PI: ioduro de propidio
MM: metil maslinato
IC50: concentración inhibitoria máxima media
ID50: concentración infecciosa máxima media
EC50: concentración efectiva máxima media
TNF-α: Factor de necrosis tumoral α
IL-1β: interleucina-1β
IL-6: interleucina-6
I-309: citoquina I-309
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1. RESUMEN.
Los triterpenos pentacíclicos son metabolitos secundarios localizados
ampliamente en numerosas especies del Reino Vegetal. Se trata de compuestos
presentes en altas concentraciones en órganos y productos derivados del olivo, por
tanto, muy abundantes en la dieta mediterránea. Nuestro estudio se basará
fundamentalmente en los triterpenos encontrados en hojas, aceitunas y aceite de
Olea europaea. Los triterpenos pentacíclicos presentan propiedades anti-tumorales,
modulan el metabolismo glucídico y lipídico, propiedades cardiovasculares, anti-
inflamatorias, anti-parasitarias, etc. Actualmente se encuentran en el punto de mira
de múltiples estudios ya que, debido a su gran actividad biológica en diversos
campos, están siendo considerados como productos naturales que pueden sustituir
o complementar la acción de fármacos convencionales en el tratamiento de diversas
patologías.
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2. ABSTRACT.
Pentacyclic triterpenes are secondary metabolites widely localized in many
species of the plant kingdom. These compounds are found in high concentration in
organs and olive products, therefore, they are very abundant in the Mediterranean
diet. Our study will be based on triterpenes found in leaves, olives and oil from Olea
europaea. Pentacyclic triterpenes have anti-tumor properties, modulate lipid and
glucose metabolism, cardiovascular properties, anti-parasitic, anti-inflammatory, etc.
They are currently in the focus of many studies since, due to its high biological
activity in various fields, are being considered as natural products that can replace or
supplement the action of conventional drugs in the treatment of various diseases.
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3. INTRODUCCIÓN.
Las plantas medicinales han sido usadas desde hace cientos de años en
muchas culturas como la China, Mexicana, Coreana o India. Todas estas culturas
tenían en común el uso de partes o extractos de estas plantas medicinales con el fin
de utilizarlos como fármacos en el tratamiento de personas o animales enfermos. En
las últimas décadas se han realizado miles de estudios con el fin de encontrar
nuevos beneficios a aquellas hierbas medicinales. De esta forma han surgido
nuevos compuestos naturales con características muy preciadas farmacéuticamente
para combatir enfermedades como la diabetes, el cáncer, así como procesos
inflamatorios.
Los triterpenos pentacíclicos han sido identificados como uno de los
principales componentes de las plantas medicinales utilizadas de forma tradicional y
han mostrado, entre otros, efectos analgésicos, hepatoprotectores, antitumorales,
anti-inflamatorios, antioxidantes y efectores del sistema inmune, tanto en su forma
libre como formando conjugados denominados aglicanos.
Estos compuestos representan un amplio grupo de metabolitos secundarios
en numerosas especies distribuidas ampliamente en el Reino Vegetal. Se trata de
moléculas constituidas por 30 carbonos agrupados en ciclos de cinco o seis
carbonos con diferentes sustituyentes.
Figura 1. Estructura de los compuestos triterpénicos más importantes: ácido oleanólico, ácido maslínico, ácido ursólico, eritrodiol y uvaol (Peragón et al. 2013; Wen et al. 2005).
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Los triterpenos se sintetizan a través de la vía citoplasmática de
acetato/mevalonato a partir del acetil-CoA, el cual se transforma en unidades de
isopreno activo (Figura 2). La condensación de seis moléculas de isopreno activo y
un precursor común, (3S)-2,3-oxidoescualeno (OS), da lugar a los triterpenos
(Peragón et al. 2013). OS sirve como substrato de numerosas ciclasas OS como la
β-amirina sintasa. Esta enzima cataliza la conversión de OS en β-amirina (12-
oleanan-3b-ol), uno de los precursores más comunes de los triterpenoides. Esta β-
amirina será el precursor del eritrodiol, ácido oleanólico y ácido maslínico. De igual
forma, la α- amirina será el precursor del uvaol y el ácido ursólico (Stiti et al. 2007).
Figura 2. Ruta de biosíntesis de los principales Triterpenos pentacíclicos (Stiti et al. 2007).
De estos compuestos, los más estudiados, por encontrarse a una mayor
concentración den los productos del olivo, son los ácidos oleanólico (AO), maslínico
(AM) y ursólico (AU); y los alcoholes eritrodiol (EO) y uvaol (UO) (Figura 1).
El primer compuesto que se forma a partir de la β-amirina es el eritrodiol (12–
oleanano-3b,28–diol, C30H50O2). Este compuesto, cuya masa molecular es 442,7 es
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el precursor de los triterpenos pentacíclicos más importantes: ácido maslínico y
ácido oleanólico.
El ácido oleanólico, (ácido 3β-hidroxi-olea-12-en-28-oico C30H48O3,). Un
compuesto de 5 anillos de seis carbonos cuyo peso molecular es 456,7 Da que se
caracteriza por presentar un grupo carboxilo en el carbono 28 y un grupo hidroxilo en
el carbono 3.
El ácido maslínico (ácido (2α,3β)-2,3-dihidroxiolean-12-en28-oico, C30H48O4)
es un compuesto de 5 anillos de seis carbonos que posee dos sustituyentes hidroxilo
en los carbonos 2 y 3, así como un grupo carboxilo en el carbono 28 y un doble
enlace sobre los carbonos 12-13. Se trata de un ácido con nueve centros
asimétricos, una masa molecular de 472,67 Da y un punto de fusión de 269-271ºC
(Wen X et al. 2005).
Por otro lado, a partir de la α-amirina, se obtiene otra serie de compuestos de
gran interés. El primero de ellos es el uvaol (2-Ursan-3-beta,28-diol, C30H50O2), con
una masa molecular de 442,7. El uvaol es el precursor del ácido ursólico (ácido 3-
beta-3-hidroxi-ursan-12-en-28-oico, C30H48O3 ) con una masa molecular de 456,70.
Este estudio se ha centrado principalmente en Olea europea ya que
representa un papel importante en la dieta Mediterránea característica de países
como España, Francia, Italia, Grecia, Marruecos, etc. Olea europea es una especie
mediterránea adaptada al clima de la zona que ha sido cultivada desde hace
décadas y utilizada como planta medicinal gracias a sus propiedades.
Figura 3. Aceite, aceitunas y hojas de Olea europaea (http://mejorconsalud.com/aceite-de-oliva-lo-mejor-de-la-dieta-mediterranea/).
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Tanto en las hojas como en las aceitunas y el aceite de oliva se pueden
encontrar una gran variedad de compuestos triterpénicos. En las aceitunas y las
hojas podemos encontrarlos en forma libre o esterificados con ácidos grasos.
Mientras que en el aceite de oliva virgen y en el orujo se encuentran estos
compuestos en la fracción insaponificable (Rodriguez-Rodriguez et al. 2006).
Los triterpenos son compuestos que se encuentran en gran abundancia en la
piel del fruto de Olea europaea, protegiendo su integridad frente a insectos y
agentes antimicrobiológicos. EL compuesto que aparece a mayor concentración en
las aceitunas es el ácido maslínico seguido del ácido oleanólico (Guinda et al. 2010;
Peragón et al. 2013) Ambos componentes se localizan únicamente en el epicarpo
del fruto en una concentración significativamente menor que en las hojas.
El consumo de aceitunas de mesa y de aceite de oliva está generalizado en la
región mediterránea, siendo una importante fuente de compuestos con muchas
propiedades biológicas. Sin embargo, tras el procesado de las aceitunas, los niveles
de ácido maslínico y ácido oleanólico descienden considerablemente (Romero et al.
2010; Peragón et al. 2013).
A diferencia de lo que ocurre en el fruto, en la hoja de olivo, el ácido
triterpénico más abundante es el ácido oleanólico seguido de ácido maslínico y unos
niveles menores de eritrodiol, ácido ursólico y uvaol (Guinda et al. 2010; Peragón et
al. 2013). La abundancia de estos compuestos así como sus perfiles varía con la
ontogenia de la hoja.
El aceite de oliva virgen es un producto típico de las zonas mediterráneas
siendo ampliamente utilizado en la dieta típica mediterránea. Según estudios
(Allouche et al. 2009), los triterpenos más abundantes del aceite de oliva virgen son
el ácido maslínico y el oleanólico, aunque también se encuentra eritrodiol en
cantidades traza en algunas variedades de olivar. Según este estudio, la proporción
de estos compuestos está determinada genéticamente según cada especie. De esta
forma mediante un análisis químico se puede caracterizar el aceite de oliva virgen
monovarietal.
El orujo es un subproducto obtenido tras la maceración de las aceitunas
durante su procesado hasta aceite. Contiene fundamentalmente la pulpa de las
aceitunas y el hueso. Este subproducto contiene mayor concentración de ácidos
triterpénicos y alcoholes que el aceite de oliva virgen. De hecho las concentraciones
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de estos compuestos son un indicativo de la pureza del orujo (Rodriguez-Rodriguez
et al. 2006).
Los triterpenos se han convertido en el punto de mira de numerosas
investigaciones ya que son unos compuestos con un gran potencial farmacéutico
gracias a sus propiedades biológicas y terapéuticas. Años atrás se han utilizado
como remedios caseros frente a diversas enfermedades pero estudios recientes
corroboran estos efectos sobre la salud. En la Figura 4 se muestran los principales
efectos sobre la salud que presentan los triterpenos:
Figura 4. Principales propiedades funcionales de los triterpenoides del olivo y mecanismos fundamentales sobre los que actúan. Esta figura resume todos los mecanismos en los que están implicados los triterpenos (Rodriguez-Rodriguez et al. 2006).
Los triterpenos tienen propiedades beneficiosas para la salud y la prevención
de enfermedades, entre ellas destacan sus efectos antioxidantes (Montilla et al.
2003; Perona et al. 2005) suprimiendo la generación de aniones superóxidos (Leu et
al. 2004), la capacidad de protección frente a enfermedades hepáticas, ulceras, VIH,
obesidad, diabetes, hiperlipidemia, aterosclerosis, etc. Estudios realizados sobre el
metabolismo de la glucosa y lípidos muestran que los triterpenos pentacíclicos
tienen un efecto modulador en estos procesos. En estudios realizados por Wen et al.
2005, se demostró que los triterpenos producen una disminución de la concentración
de glucosa en sangre de ratones inducidos a hiperglucemia. Otros artículos
mostraron que el ácido maslínico poseía propiedades hipoglucemiantes (Jalil et al.
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1986) e hipoinsulínicas (Liu et al. 2007. a, b) en modelos experimentales en ratones.
También Teodoro el at. 2008 publicó que el ácido oleanólico induce la secreción de
insulina desde el páncreas. Por otro lado el ácido oleanólico y maslínico, pueden
controlar los niveles de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y aumentar el nivel
de lipoproteínas de alta densidad (HDL) en el metabolismo lipídico (Keys et al. 1986;
Willett, 1990). De esta forma se puede prevenir la hipertensión y la aterosclerosis.
Además, el ácido oleanólico y el ursólico producen una disminución de la resistencia
a la insulina en modelos experimentales de rata (Somova et al. 2003).
Los triterpenos pentacíclicos también juegan un papel importante en el
combate frente al cáncer. En los últimos años se han realizado numerosos estudios
in vivo e in vitro sobre su acción anticancerígena frente a diversas células tumorales
humanas. Diversos estudios muestran que tanto el eritrodiol como el ácido maslínico
tienen una actividad anti-proliferativa, inducen a la apoptosis celular y además de
una baja toxicidad frente a células de carcinoma colorrectal HT-29 (Reyes-Zurita et
al. 2011; Juan et al. 2008). Por otro lado, ensayos con ácido oleanólico en células
epiteliales tumorales HaCaT, (George et al. 2012), obtuvieron los mismos resultados
que los obtenidos en los trabajos anteriormente citados.
A pesar de la amplia distribución de los triterpenos en el mundo vegetal, se
encuentran pocos estudios sobre sus propiedades cardiovasculares (Rodriguez-
Rodriguez et al. 2006). Sin embargo, el estudio de estas propiedades está en
progreso. Los triterpenos poseen una actividad biológica en enfermedades
cardiovasculares y son agentes químicos con un gran futuro en la prevención de
dicha enfermedad. Estos compuestos tienen actividad vasodilatadora y anti-arrítmica
así como efectos cardiotónicos. Estudios in vitro realizados en aorta de rata
demuestran que estos compuestos presentan vasodilatación arterial en ratas
hipertensas (Rodriguez-Rodriguez et al. 2008). Por otro lado, estudios in vivo
realizados por Somova et al. en 2003 y 2004 demuestran que la administración
intraperitoneal de ácido oleanólico en ratas previene el desarrollo de hipertensión en
ratas. Este efecto puede ser atribuido a sus propiedades reguladoras en el
metabolismo de lípidos y glucosa así como a su propiedad antioxidante.
Estos compuestos también tienen efectos beneficiosos frente a diversos
síntomas generalizados en diversas enfermedades, por ejemplo el dolor y la
inflamación. Numerosos estudios proponen diversos mecanismos de acción de los
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triterpenos en la mediación de la inflamación. Safayhi y Sailer (1997); propusieron al
ácido oleanólico como principal atenuador de la histamina liberada por los
mastocitos en procesos inflamatorios. Lee et al (2004); han publicado un artículo
sobre el efecto inhibidor del ácido oleanólico en el complejo del complemento en las
respuestas inflamatorias. También Marquez-Martin et al. (2006), determinaron que el
ácido oleanólico es un agente modulador de las citoquinas liberadas en procesos
inflamatorios por los macrófagos. Todos estos efectos inhibidores de los triterpenos
han sido también estudiados en diferentes modelos de inflamación en ratón
obteniendo unos resultados positivos. Por otro lado, en relación a la respuesta al
dolor de los compuestos triterpenoides, un estudio realizado por Nieto et al. en 2013,
obtuvo unos resultados esperanzadores en modelos de ratón. Utilizó ácido maslínico
para aliviar el dolor inducido con distintos químicos y obtuvo una respuesta
satisfactoria.
Los triterpenos pentacíclicos tienen también propiedades antivirales y
antiparasitarias. Estudios realizados por Herrera et al (2006) muestran la actividad
inhibitoria del ácido oleanólico y el maslínico contra la replicación del virus de la
inmunodeficiencia humana. El equipo de Huang (2013) descubrió 5 nuevos
triterpenos extraídos de Excoecaria acerifolia, todos ellos fueron analizados
mediante espectrofotometría y mostraron una moderada actividad anti-VIH. De
Pablos et al (2010), pusieron de manifiesto la actividad antiparasitaria del ácido
maslínico frente a taquizoitos de Toxoplasma gondii. Los parásitos tratados con el
ácido maslínico mostraron una mayor mortalidad y una alteración de su estructura
debido a este compuesto. La inhibición de las proteasas por parte del ácido
maslínico produjo una reducción de la infectividad de Toxoplasma.
Hipótesis y justificación del trabajo.
De todo lo expuesto se infiere que los compuestos triterpénicos presentes en
órganos y productos del olivo tienen una importancia elevada en la fisiología de la
planta y presentan importantes propiedades beneficiosas para la salud que deben
ser conocidas y estudiadas para conseguir un mejor aprovechamiento y
revalorización de productos como la aceituna de mesa o el aceite de oliva. Con este
trabajo se pretende realizar una revisión e investigación bibliográfica para conocer el
conjunto de nuevos experimentos, métodos y resultados relativos a: 1) la extracción,
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análisis y presencia de los compuestos triterpénicos presentes en el olivo, así como
2) los conocimientos existentes sobre las nuevas propiedades biológicas de estos
compuestos que los hacen beneficiosos para la salud y prevención de
enfermedades. Se trata de compuestos naturales presentes en productos
alimenticios básicos en nuestra alimentación, con un extraordinario potencial
farmacéutico o terapéutico que se están utilizando como base para poder actuar
sobre determinadas patologías. En los últimos años, es mucho el interés que están
despertando y mucha la experimentación que se está realizando centrada en estos
compuestos, se considera de mucho interés hacer un resumen de los principales
descubrimientos obtenidos sobre ellos. El conocimiento de todo ello puede servir
para conocer mejor y poner en valor productos como la aceituna de mesa o el aceite
de oliva.
4. OBJETIVOS:
El objetivo del presente trabajo fin de grado es realizar un trabajo de revisión
e investigación bibliográfica, a partir de artículos originales, para conocer de primera
mano los compuestos triterpénicos pentacíclicos que se encuentran en los órganos
y productos del olivo (ácimo maslínico -AM-, ácido oleanólico -AO-, ácido ursólico -
AU-, eritrodiol -EO- y uvaol -UO-) así como las características de sus propiedades
biológicas relacionadas con la salud y la prevención de enfermedades. Este objetivo
general se puede concretar en los siguientes objetivos particulares:
1. Resumir el conocimiento actual sobre qué compuestos triterpénicos se
encuentra presentes en los principales órganos del olivo y cómo cambia su
concentración a lo largo del desarrollo, maduración o en respuesta a
determinadas condiciones culturales o ambientales.
2. Resumir el conocimiento actual sobre las propiedades anti-cancerígenas del
AM, AO, AU, EO y UO.
3. Resumir el conocimiento actual sobre los efectos cardio-circulatorios del AM,
AO, AU, EO y UO.
4. Resumir el conocimiento actual sobre los efectos anti-diabéticos del AM, AO,
AU, EO y UO.
5. Resumir el conocimiento actual sobre los efectos anti-parasitarios del AM,
AO, AU, EO y UO
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5. MATERIAL Y MÉTODOS.
5.1 Recogida de muestras.
Para realizar la extracción y la determinación de los triterpenos pentacíclicos
el primer paso es diseñar un método experimental para recoger las muestras
necesarias para nuestro ensayo. Los triterpenos se encuentran fundamentalmente
en las hojas y en el epicarpo de las aceitunas, por tanto se deberán recoger estos
dos componentes de Olea europaea.
Para determinar la variación del perfil de los distintos triterpenos durante la
ontogenia de hojas y frutos, se realizarán tomas de muestras durante el periodo de
maduración de las aceitunas. Para ver la ontogenia de las hojas bastará con realizar
tomas de muestras de las hojas en diversas partes de las ramas: hojas pequeñas de
la yema apical, hojas cercanas a la yema apical, hojas verde oscuro un poco más
lejanas de la yema, hojas verdes oscura de las ramas y hojas adultas
presenescentes (Guinda et al. 2010). De esta forma obtendremos muestras
representativas de cada estadio ontogénico de ambas partes.
Para valorar la cantidad de compuestos triterpenoides en las aceitunas de
mesa, es decir, después del procesado que sufren desde su recogida hasta su
comercialización; se recogerán y se analizarán muestras de los distintos tipos de
aceitunas que queremos medir directamente del olivo. Tras el procesamiento de las
aceitunas de mesa, volvemos a medir los mismos valores para determinar su
variación y su contenido. Obtenemos así la cantidad de triterpenos pentacíclicos que
realmente ingerimos con nuestra dieta al consumir aceitunas de mesa.
Los triterpenos pentacíclicos también se encuentran en el aceite de oliva
virgen refinado así como en el orujo. La determinación de estos compuestos también
se puede llevar a cabo utilizando muestras de aceite de los distintos olivares.
5.2 Extracción y determinación de los triterpenos pentacíclicos.
Las hojas se lavan con agua destilada a temperatura ambiente y se secan en
una estufa de vacío a 35ºC y una presión de 10 mm de Hg durante 24 horas.
Posteriormente se trituran y se extraen con hexano o etanol mediante dos
procedimientos: en Soxhlet durante 6 horas o bien mediante maceración en 100 mL
durante 48 horas (Guinda et al. 2002). El extracto de los triterpenos pentacíclicos se
obtiene mediante la filtración de la disolución anterior.
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Para la extracción de estos compuestos en las aceitunas se emplea una
técnica similar a la descrita anteriormente. En este caso, las aceitunas se cortan y se
deshuesan para proceder a su maceración completa. Se centrifugan con etanol o
metanol y se separa la fase líquida de la sólida (Peragón et al. 2013).
Para obtener el extracto del aceite de oliva se realiza un procedimiento
similar: la pasta de aceitunas se amasa durante 30 min a 28ºC y a continuación se
centrifugan. Finalmente se deja decantar y se filtra (Allouche et al. 2009).
Figura 5. Esquema del procedimiento te extracción de los triterpenos
Una vez obtenidos los extractos necesarios se procede a la determinación de
los triterpenos presentes en la muestra así como su cuantificación. Para ello se
suelen utilizar dos técnicas similares: cromatografía líquida de alta resolución-
ultravioleta-/visible (HPLC-UV/vis) o bien cromatografía líquida de alta resolución-
espectrometría de masas (HPLC-MS). La cromatografía líquida es una técnica
utilizada para separar componentes basándose en los diferentes tipos de
interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna. La columna
actúa como una fase estacionaria a través de la cual pasa una fase móvil mezclada
con pequeñas cantidades inyectadas de la muestra a analizar. Los componentes de
la muestra se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones físico-
químicas que se produzcan con la fase estacionaria y la fase móvil.
Los resultados se pueden obtener de distintas formas acoplando un detector
determinado a esta cromatografía. En el caso de la HLPC-UV/vis se utilizan
detectores UV para medir la capacidad de absorción lumínica de cada sustancia.
Esta absorción es característica de cada compuesto y podemos diferenciarlos por
los valores obtenidos. La HLPC-MS tiene acoplado un detector que nos informa de
LAVAR CON
AGUA
DESTILADA
SECAR AL VACÍO Y TRITURACIÓN
HPLC-UV/vis
HPLC-MS
EXTRACCIÓN CON
ETANOL O HEXANO
Y FILTRACIÓN
15
la masa molecular de cada compuesto que atraviesa la columna. Esta técnica
confiere una gran fiabilidad ya que tiene una exactitud menor a 1 ppm, evitando de
esta manera falsos positivos.
5.3 Métodos para determinar la actividad biológica de los triterpenos.
5.3.1 Cultivo celular.
Para realizar estudios de actividad biológica sobre células cancerígenas se
utilizan cultivos celulares de líneas tumorales para estudiar su respuesta frente a un
compuesto. Estudios de Reyes-Zurita et al. (2008) y Juan et al. (2008) utilizan
células de carcinoma colorrectal HT-29. Estas células se obtienen de “American
Type Culture Collections”. Se utiliza un medio de cultivo suplementado con un 10%
de suero fetal de ternera y 2nM de glutamina. Además se añadieron los antibióticos
necesarios: 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Los cultivos se
mantuvieron en una atmósfera humidificada con un 95% de aire y un 5% de CO2 a
37ºC. El medio de cultivo se retiraba cada dos días y se sustituía por medio de
cultivo nuevo.
5.3.2 Ensayo de proliferación celular.
Para evaluar el efecto de los compuestos triterpénicos en la proliferación
celular se utilizan cultivos celulares con una densidad celular de 5x103 células/pocillo
en placas de 24 pocillos. Estos cultivos se incuban a 37 ºC hasta su completa
adhesión durante 24 horas. El medio de cultivo es sustituido por medio fresco con
concentraciones crecientes del extracto de triterpenos pentacíclicos. Se dejan
incubar las placas durante 24, 48 y 72 horas para ver la variación de la proliferación
celular con respecto al tiempo y la concentración de triterpenos.
El análisis se realiza con un lector multiplaca, para ello las células son lisadas
con Triton X-100 al 1% en un medio isotónico de NaCl. Posteriormente el ADN se
tiñe con SYTOX-Green. Este compuesto fluorescente tiene gran afinidad por las
cadenas de ADN, al lisar las células el SYTOX-Green penetra hasta el núcleo y se
obtiene una medida del ADN total. La fluorescescencia es medida con un lector
multiplaca el cual muestra un valor total de células (Juan et al. 2008; George et al.
2012).
16
5.3.3 Estudios morfológicos.
El análisis morfológico se realiza con un procedimiento similar al
anteriormente descrito. Se cultivan las células con una densidad similar a ensayo
anterior y se introduce en el medio una concentración determinada de triterpenos. El
cultivo se deja incubar durante 24, 48 y 72 horas a 37ºC. Posteriormente se pueden
observar los cambios morfológicos que experimentan con respecto al control, para
ello se utiliza un microscopio de contraste de fases a 20x aumentos (George et al.
2012).
5.3.4 Detección de apoptosis.
La detección de la apoptosis celular inducida por un compuesto se lleva
acabo utilizando dos técnicas diferentes. Por una parte la apoptosis puede ser
medida utilizando la actividad de la Caspasa-3. Se trata de una proteína que actúa
como mediador esencial de la apoptosis celular o muerte programada. Para realizar
un análisis utilizando esta técnica es fundamental obtener los extractos citosólicos
de las células utilizadas ensayo. Anteriormente se expusieron las células a
diferentes concentraciones de del extracto de triterpenos pentacíclicos a evaluar y se
realizó una lisis celular con Triton. Las células lisadas se centrifugan a 2500xg
durante 10 minutos obteniendo de esta manera los extractos citosólicos.
Posteriormente se añaden otros compuestos a la mezcla y substrato fluorescente de
Caspasa-3. Mediante lector multiplaca se puede valorar la actividad de la proteína
(Juan et al. 2008).
Por otro lado, el análisis de la apoptosis celular también se puede realizar
mediante un análisis de ELISA (George et al. 2012). En este caso se utiliza un kit de
ELISA para la fragmentación celular. Las células HaCaT, en densidad 1x105
células/ml, fueron marcadas con 10 µM de BrdU. 100 µL del cultivo celular marcado
con BrdU fue tratado con distintas concentraciones de OA durante un periodo de 4
horas. Posteriormente las células se lisaron y se obtuvieron los fragmentos
apoptóticos mediante centrifugación a 1500 rpm. El extracto anterior fue transferido
a una microplaca con anti-DNA e incubado durante 90 min a 15-25 ºC.
Posteriormente el AND se desnaturalizó mediante la utilización de microondas y se
añadió 100 µl de solución anti-BrdU-POD. Por último se añadió un sustrato
coloreado, TMB. Los resultados se obtuvieron por espectrofotometría a 450 nm tras
añadir la solución de parada de la reacción.
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5.3.5 Análisis de citometría de flujo.
La citometría de flujo se utiliza como una herramienta para medir la ploidia del
ADN asís como para medir las alteraciones del ADN en cada fase del ciclo celular, o
el número de células que se encuentra en cada fase del ciclo. Para realizar esta
técnica se cultivan las células en una densidad de 175 x 103 células/pocillo en un
medio de cultivo adecuado y se incuban durante 24 horas a 37ºC. Posteriormente se
tratan con distintas concentraciones crecientes del compuesto a analizar durante 72
o 96 horas. Tras una tripsinización celular y posterior tinción del ADN con ioduro de
propidio (PI), se realiza una estimación mediante fluorescencia del número de
células en cada fase del ciclo celular midiendo en un citómetro de flujo (Reyes-Zurita
et al. 2011).
Figura 6. Equipo de citometría de flujo
(http://www.uam.es/cs/ContentServer/es/1242663063124/1242666607631/UAM_Laboratorio_FA/laboratorio/Laboratorio_de_Citometria_de_Flujo.htm)
5.3.6 Pruebas de invasividad y viabilidad celular.
Las pruebas de invasividad se utilizan fundamentalmente en ensayos con
parásitos. De Pablos et al. (2010) estudió el efecto del ácido maslínico en la
capacidad infectiva de Toxoplasma gondii. En este ensayo los taquizoitos de
Toxoplasma fueron cultivados a diferentes concentraciones de ácido maslínico y
posteriormente se pusieron en contacto con células Vero para ver su capacidad
infectiva. Tras una incubación durante 24 y 48 horas a 37ºC se realizó una
microscopía de luz para determinar el porcentaje de parasitismo por célula.
En este mismo trabajo se realizaron ensayos de motilidad del parásito tras
aplicar el tratamiento con ácido maslínico. Se realizó un procedimiento similar al
18
anterior y se midieron y registraron las longitudes recorridas por los taquizoitos
mediante microscopía confocal.
5.3.6 Modelos experimentales.
Los ensayos de la actividad biológica de diferentes compuestos también
pueden ser evaluados mediante la utilización de modelos experimentales in vitro. En
este caso se utilizan ratones a los cuales se inducen los factores que queremos
evaluar mediante compuestos químicos o variaciones en su alimentación. Se trata
de obtener una representación fiel de las enfermedades o características que
presentaría un humano con el fin de testar nuevos fármacos o productos. En el
campo de los ensayos de las características biológicas de los triterpenos
pentacíclicos se han utilizado ratones en muchos trabajos para demostrar su
eficiencia frente a diabetes, procesos inflamatorios, efectos cardiovasculares. En
todos estos casos los ratones son inducidos químicamente a las distintas
enfermedades y se analiza su progresión tras el uso de un determinado tratamiento.
De esta forma se puede ver de forma general en todo el organismo el mecanismo de
acción de un producto determinado.
Para diabetes Mellitus tipo 2, se usaron ratones diabéticos inducidos
siguiendo el protocolo publicado por Jalil et al. 1986, el cual se basa en la utilización
de streptozotocina. También se utilizan ratones hipoglucémicos inducidos por
adrenalina (Wen et al. 2005). Así mismo se utilizan modelos experimentales con
dietas basadas en un alto contenido de colesterol para valorar la acción de los
triterpenos pentacíclicos en el metabolismo lipídico y glucídico (Liu et al. 2007a,b).
Para testar la acción de compuestos como el ácido maslínico en estudios de
nocicepción en ratones se utilizan modelos experimentales a los cuales se les
induce mediante ácido acético, formalina o capsicina distintas fases de dolor (Nieto
et al. 2013).
En diferentes estudios sobre los efectos cardiovasculares de los compuestos
triterpénicos se utilizan ratones genéticamente hipertensos (Somova et al. 2003).
19
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
6.1 Localización y concentración de los triterpenos pentacíclicos en
Olea europaea.
Los triterpenos pentacíclicos son compuestos que se pueden encontrar en
gran cantidad en hojas y aceitunas de Olea europaea. Se trata de metabolitos
secundarios sintetizados a partir de escualeno. A estos compuestos se les atribuyen
propiedades defensivas y antibacterianas frente al ataque externo de las hojas y las
aceitunas. Además tienen características beneficiosas para la salud como por
ejemplo: anti-inflamatorias, anti-oxidantes, cardiovasculares, reguladores del
metabolismo de la glucosa y los lípidos, anti-cancerígenas, etc.
Diferentes autores han estudiado y caracterizado la presencia de estos
compuestos en diferentes muestras de olivo y en diferentes situaciones. En primer
lugar, las hojas de Olea europaea contienen grandes cantidades de ácido oleanólico,
seguido de una cantidad significativa de ácido maslínico y unos niveles menores de
eritrodiol, ácido ursólico y uvaol (Guinda et al. 2010). En la Figura 7 se muestra un
cromatograma típico de muestras de hoja.
Figura 7. Imagen del análisis cromatográfico de los triterpenos pentacíclicos en una hoja adulta: eritrodiol (1), uvaol (2), ácido oleanólico (3), ácido ursólico (4), ácido maslínico (5), y 18β-glycirrhetinic acid (IS) (Guinda et al. 2010).
En la Tabla 1 se muestra la proporción de cada uno de los compuestos
encontrados en hojas adultas de tres olivares distintos. El AO representa un 3,00-
3,50% del peso seco de la hoja, el AM constituye el 0,5-0,75%, y el AU
aproximadamente el 0,20-0,25% del peso seco. Además la tabla revela que el
20
contenido de estos componentes depende de la variedad de olivo que se analice. En
este estudio la variedad Picual está caracterizada por presentar unos niveles de AM,
AO y AU más elevados que el resto de variedades, sin embargo, la variedad
Arbequina muestra concentraciones más altas de triterpenos dialcohólicos.
Tabla 1. Triterpenos pentacíclicos analizados en hojas adultas de olivares Picual, Hojiblanca y Arbequina (Guinda et al. 2010).
Los estudios realizados por Guinda et al. (2010) concluyen que en el proceso
de ontogenia de las hojas, estudiada en la variedad Arbequina; las concentraciones
de triterpenos varían durante su transcurso. En primer lugar el eritrodiol y el uvaol
están ausentes en las primeras fases del desarrollo de la hoja (estadios 1 y 2), pero
se detectan claramente en los estadios más tardíos a niveles de 1,5-2,0 mg/g. El
ácido oleanólico, por otra parte, es el principal triterpeno presente en todos los
estadios de la hoja y su concentración aumenta con la ontogenia. Las hojas más
jóvenes presentan un contenido de 13,1±1,9 mg/g mientras que las hojas adultas
muestran niveles 2,5 veces mayores. El ácido ursólico se puede medir en todos los
estadíos, sin embargo no muestra modificaciones durante la ontogenia. Finalmente
el ácido maslínico muestra una gráfica en forma de U con niveles de concentración
altos durante las etapas jóvenes y las más adultas, 5,0 mg/g, Figura 8.
Estudios similares realizados por Peragón et al. (2013) muestran resultados
similares obtenidos mediante el análisis de otras variedades de olivares.
21
Figura 8. Evolución de triterpenos pentacíclicos en las hojas de la variedad Arbequia durante su ontogenia. Representa los 5 estadios de maduración estudiados (Guinda et al. 2010).
Por otra parte, en las aceitunas, los triterpenos están exclusivamente
localizados en el epicarpo en concentraciones 30 veces menores que en las hojas.
En este caso, el principal compuesto es el ácido maslínico y sólo está acompañado
por el ácido oleanólico (Guinda et al. 2010). En la Figura 9 se muestra el análisis
realizado por Guinda et al. (2010) en las diferentes partes de la aceituna,
exactamente en la variedad Arbequina. Los triterpenos únicamente se detectaron en
el análisis del fruto entero y en el análisis del epicarpo, siendo las únicas medidas
obtenidas las del ácido maslínico y el ácido oleanólico. En los análisis de del
mesocarpo y de la semilla no se detectó ningún triterpeno.
Durante la maduración de las aceitunas se produce una disminución del
contenido de triterpenos presentes en el fruto. En la Tabla 2 se observa el cambio
producido en la concentración de triterpenos durante la maduración de la aceituna
en tres olivares distintos: Picual, Hojiblanca y Arbequina. El contenido de triterpenos
en las aceitunas depende del estado de desarrollo en que se encuentre el fruto. En
el trascurso entre la aceituna verde y la negra, los triterpenos disminuyen en un
20%, tanto el ácido maslínico como el oleanólico. También, el balance entre AM y
AO depende del olivar analizado. En las variedades Picual y Hojiblanca, los niveles
de maslínico fueron 2,5 veces mayores que los de ácido oleanólico. Sin embargo, en
el caso de Arbequina, el balance AM/AO fue a razón de 4,0 (Guinda et al. 2010).
22
Figura 9. Cromatografía en columna de gas de los triterpenos pentacíclicos analizados en las distintas partes de aceitunas Arbequina: (A) aceituna entera, (B) epicarpo, (C) mesocarpo y (D) semilla. (3) Ácido oleanólico y (5) ácido maslínico (Guinda et al. 2010).
Tabla 2. Triterpenos pentacíclicos detectados en aceitunas Picual, Hojiblanca y Arbequina (Guinda et al. 2010).
23
La concentración de triterpenos disminuye también durante el procesado de
las aceitunas de mesa. Estudios de Romero et al. (2010) mostraron que los niveles
de triterpenos en aceitunas de mesa comerciales oscilaban entre 460 hasta 1470
mg/kg. Esto se debe a que la solución de NaOH utilizada durante el procesado de
las aceitunas de mesa reducía la concentración de estos compuestos. Aceitunas
negras de mesa, no tratadas con NaOH, muestran valores más elevados de 2000
mg/kg. En la Figura 10 se muestra la concentración de OA y AM de distintas
variedades de aceitunas destinadas a ser procesadas para el consumo. La
concentración de maslínico y oleanólico varía entre 1500 hasta 3000 mg/kg, siendo
el oleanólico el componente en mayor concentración.
Figura 10. Concentración de ácidos triterpénicos de varias variedades de aceituna cruda destinada a aceitunas de mesa. Las barras indican la desviación estándar (Romero et al. 2010).
En las Figuras 11 y 12 se puede apreciar cómo disminuye la concentración de
triterpenos según los dos estilos de procesado español: aceitunas verdes y
aceitunas negras respectivamente.
24
Figura 11. Concentración de triterpenos ácidos en las diferentes soluciones generadas durante el procesado español realizado a aceitunas verdes de las variedades Manzanilla, Hojiblanca y Gordal (Romero et al. 2010).
Por otra parte, Allouche et al. (2009) realizaron un estudio sobre 40 olivares
para determinar la composición de triterpenos pentacíclicos (Uvaol, Eritrodiol,
Oleanólico, Maslínico y Ursólico) en el aceite de oliva virgen. El análisis de los
dialcoholes triterpénicos mostró que los cultivos presentaban una concentración de
eritrodiol y uvaol en un rango de 8,15 hasta 85,05 mg/kg, siendo el primero el más
abundante con una representación del 78% del total. Su concentración está
determinada dentro de un rango de 5,89 hasta 73,78 mg/kg, mientras que la
concentración de uvaol oscila entre 1,50 hasta 19,35 mg/kg. Los diferentes cultivos
fueron establecidos en 5 grupos según su concentración de eritrodiol, Tabla 4.
Figura 12. Concentración de triterpe-nos ácidos en las diferentes soluciones generadas durante el procesado español de aceitunas blancas de las variedades Manzanilla y Hojiblanca (Romero et al. 2010).
25
Tabla 4. Composición de dialcoholes triterpénicos en aceite virgen de oliva de 40 cultivos diferentes
(Allouche et al. 2009)
El análisis del contenido en ácidos triterpénicos estableció al ácido ursólico
como el componente presente en la mayoría de los aceites como elemento traza,
llegando incluso a no encontrarse en algunas variedades. El ácido oleanólico y el
26
maslínico se encuentran en grandes cantidades en el aceite virgen siendo el
oleanólico el más abundante en la mayoría de los casos, Tabla 5 (Allouche et al.
2009).
Tabla 5. Composición de ácidos triterpénicos en aceite virgen de oliva de 40 cultivos diferentes (Allouche et al. 2009)
Los datos obtenidos muestran la composición de dialcoholes triterpénicos y
ácidos en los aceites de oliva virgen de diferentes variedades de olivo, así como las
diferencias entre las muestras de aceite de los distintos olivares, todos ellos crecidos
bajo las mismas condiciones climáticas y las mismas prácticas agrícolas, así como el
27
mismo protocolo de extracción. Se concluye que la variabilidad observada en el
aceite de oliva en cuanto a la composición de los triterpenos es debida a factores
genéticos. Además la aplicación de métodos quimiométricos muestra que los
componentes triterpénicos son capaces de discriminar entre el aceite de los distintos
olivares y pueden ser considerados como una herramienta para evaluar el aceite de
oliva virgen (Allouche et al. 2009).
6.2 Actividad biológica.
6.2.1 Efectos anti-cancerígenos.
Como ya se ha comentado anteriormente, los triterpenos pentacíclicos tienen
propiedades biológicas relacionadas con la salud. Es el caso de numerosos estudios
realizados para comprobar y validar la capacidad antitumoral de estos compuestos
Juan et al. (2008) y Reyes-Zurita et al. (2011) realizaron estudios similares
sobre la actividad del eritrodiol y el ácido maslínico como agentes antitumorales en
células humanas de carcinoma colorrectal HT-29.
Los estudios realizados por Juan et al (2008) determinaron en primer lugar
que el eritrodiol no tenía un efecto citotóxico para las células. A concentraciones de
100µM un 94,5 ± 3.0% de las células eran viables. Sin embargo, a concentraciones
superiores, a 150 µM, el número de células descendía a 86,3 ± 0,6% y a
concentraciones de 300 µM descendía hasta 75,6 ± 1,4%, Figura 13.
Figura 13. Efectos del eritrodiol en la necrosis celular en HT-29 (Juan et al. 2008).
La actividad inhibitoria del crecimiento celular producida por el eritrodiol fue
determinada exponiendo las células HT-29 a diferentes concentraciones durante 72
horas. El crecimiento celular fue completamente inhibido a concentraciones
28
superiores a 100 µM. Como se pude observar en la Figura 14, la concentración de
eritrodiol que causa el 50% de la inhibicion del crecimiento celular (IC50) fue
determinada a una concentración de 48,8 ±3,7 µM.
Figura 14. Efecto del eritrodiol en la proliferación de células HT-29 (Juan et al. 2008)
Por último se realizó un ensayo fluorogénico para determinar si la disminucion
en el crecimiento celular observada en el tratamiento celular con eritrodiol era
resultado del aumento de la apoptosis en células HT-29. Se utilizó la actividad
Caspasa-3 como enzima diana para la vía apoptótica ya que se trata de un
marcador de meurte celular programada. El eritrodiol ejerció una actividad pro-
apoptótica dependiente de la dosis en células HT-29 con incrementos de 3,2-, 4,8- y
5,2- en las células control a concentraciones de 50, 100 y 150µM respectivamente,
Figura 15.
Figura 15. Actividad caspasa-3 dosis-dependiente en células HT-29 (Juan et al. 2008).
29
Los estudios realizados por Reyes-Zurita et al. (2011) muestran resultados
similares. En este caso el compuesto utilizado para analizar su actividad anti-tumoral
fue el ácido maslínico. En primer lugar se determinó la integridad del ADN a distintas
concentraciones de AM en células HT-29. Se realizaron 2 ensayos con
concentraciones IC50 e IC80 y se midio los resultados a 24, 48 y 72 horas (Figura 16).
Tras 48h a concentración IC50, la mortalidad celular se incrementó al menos 6 veces.
Figura 16. Resultados observados tras el tratamiento con ácido maslínico en células HT-29 (Reyes-Zurita et al. 2011).
A la luz de la inhibición en la proliferación celular causada por el AM en
trabajos anteriores, (Reyes et al. 2006); se investigó su efecto en el ciclo celular
viendo la proliferación y la proporción de células en las diferentes fases del ciclo
celular en 72 y 96 horas. Los resultados mostrados por los histogramas de ADN
realizados revelaron que el AM induce un incremento dosis-dependiente del número
de células en la fase G0/G1 con un máximo en IC80 (21,4±6,0%). Este incremento
está acompañado de un descenso del porcentaje de proliferación celular de
17,7±5,4% en la fase S y de 3,3±1,4% en la fase G2/M. A concentración IC50 el
incremento en la fase G0/G1 fue de 12,5±5,1% y el descenso en fase S fue de
9,4±4,4% y 3,7±1,1% en la fase G2/M, Figura 17.
30
Figura 17. Resultados observados tras el tratamiento con ácido maslínico en células HT-29 en las distintas fases del ciclo celular (Reyes-Zurita et al. 2011).
La actividad anti - tumoral de ácido maslínico podría ser producida a través de la
apoptosis mediada por p53 actuando sobre los principales componentes de
señalización que conducen al aumento de la actividad de p53 y la inducción del resto
de los factor que participan en la vía apoptótica. Se encontró que, en las células
HT29, el ácido maslínico activa la expresión de c –Jun Quinasa NH2 -terminal (JNK),
induciendo así a p53 . El tratamiento de células tumorales con ácido maslínico
también da lugar al incremento en la expresión de Bax y Bid , represión de Bcl - 2 ,
la liberación de citocromo C y el aumento de la expresión de caspasas -3 , -9 , y -7 .
Además, el ácido maslínico produjo una actividad tardía de la caspasa -8,
amplificando así la señalización apoptótica mitocondrial inicial. Para analizar la
actividad de todos estos compuestos se realizó un Western blot para cada enzima a
distintas concentraciones de AM (IC50, IC80) trascurridas 72 horas, Figuras 18 y 19.
31
Figura 18. Resultados obtenidos tras realizar un western blot a JNK (A), P53 (B) y Bid (C),, (Reyes-Zurita et al. 2011).
32
Figura 19. Resultados observados tras realizar un western blot a Bax (A), Bcl-2 (B) y citocromo-c (C (Reyes-Zurita et al. 2011).
Por otra parte, George et al. (2012) realizó un ensayo con ácido oleanólico
sobre queratinocitos inmortalizados, HaCaT. En este caso se realizaron estudios
para ver la actividad antioxidante del AO. Los estudios se realizaron con DPPH, un
tipo de radical libre que cuando acepta un electrón o un hidrogenión se transforma
en una molécula magnéticamente estable. Los datos mostraron que el AO tiene un
moderado potencial de captación de radicales, a concentración de 200 µM se obtuvo
un 28,82% de captación, Figura 20.
33
Figura 20. El AO muestra un moderado potencial de captación de radicales libres dosis-dependiente.
Se midió la viabilidad celular a 450 nm a diferentes concentraciones de AO
tras 24, 48 y 72 horas. Como muestra la Figura 21, el AO muestra una moderada
toxicidad en las células HaCaT. A la mayor concentración de AO, 200 µM, se obtuvo
una toxicidad del 26.2% a las 72 horas de incubación.
Figura 21. Citotoxicidad del ácido oleanólico en células HaCaT estimada mediante ensayos XTT tras 24, 48 y 72 horas de incubación (George et al. 2012)
Por último, la muerte celular se caracteriza por cambios en la morfología así
como la destrucción de la membrana, la condensación de los cromosomas,
formación de cuerpos apoptóticos, etc. La exposición de las células HaCaT a la
mayor concentración de AO mostró cambios en la morfología de la membrana
celular así como un descenso del número de células. La apoptosis se midió
mediante un análisis de fragmentación de ADN con ELISA a 450 nm. Como se
puede observar en la Figura 22, el ácido oleanólico muestra una inducción a la
apoptosis celular dosis-dependiente.
34
Figura 22. Inducción a la apoptosis en células HaCaT mediante la exposición a ácido oleanólico. En ensayo fue realizado mediante análisis de fragmentación de ADN usando el método ELISA (George et al. 2012).
6.2.2 Efectos sobre la diabetes.
Diabetes Mellitus tipo 2 es una enfermedad crónica caracterizada por altos
niveles en sangre de glucosa que puede estar producida por que la producción de
insulina pancreática es insuficiente o por la existencia de una resistencia a la acción
de la insulina.. La hiperglucemia causa numerosas enfermedades mico y
macrovasculares a diferentes órganos, incluyendo ojos, riñones, corazón y cerebro.
Además, este tipo de diabetes está asociado con una significativa mortalidad y
morbilidad.
Según Wen et al. (2005), los triterpenos producen una disminución la
concentración de glucosa en sangre en ratones inducidos a hiperglucemia mediante
la utilización de adrenalina. En este estudio se utilizó dos compuestos distintos:
ácido maslínico y ácido corosólico. Éste último compuesto es un principio activo
localizado en el extracto de una planta denominado Glucosol, el cual se ha
comercializado en Japón y Estados Unidos ya que reduce los niveles de glucosa en
sangre y ayuda en la pérdida de peso. Tiene una estructura similar al ácido
maslínico, Figura 23.
Figura 23. El compuesto 1 corresponde a la representación del ácido
corosólico y el compuesto 2 al ácido maslínico (Wen et al. 2005).
35
La glucógeno fosforilasa (GP) es la primera enzima que cataliza la
degradación del glucógeno y juega un papel importante en el control del
metabolismo de la glucosa. La GP del hígado es la principal enzima que controla la
producción de glucosa hepática y su inhibición puede ser un enfoque terapéutico útil
para la diabetes tipo 1 y 2, así como para la prevención de enfermedades vasculares
y tumores (Wen et al. 2005). Este estudio midió la capacidad de inhibición de la GP
en el hígado de ratón y en el músculo esquelético en conejos ya que ambas enzimas
son bastante similares.
La actividad de la enzima se midió a través de la detección de la liberación de
fosfato a partir de glucosa-1-fosfato. El ácido corosólico (IC50=20µM) y el ácido
maslínico (IC50=28µM) mostraron una moderada actividad inhibitoria de la GP en el
músculo de conejo. Estos resultados fueron 4 veces mayores que los resultados
obtenidos mediante la utilización de cafeína (IC50=114µM), Figura 24. Así mismo, en
los ensayos realizados con la GP hepática fueron similares, el ácido corosólico y el
ácido maslínico obtuvieron un IC50 de 101µM y 99µM respectivamente. La cafeína
resultó ser un inhibidor 6 veces menos potente que los compuestos anteriores
(IC50=648µM), Figura 25. Otros estudios, como los realizados por Jalil et al. (1986),
ya habían expuesto anteriormente el efecto hipoglucemiante del ácido maslínico.
Figura 24. Inhibición de la GP en músculo en conejo producido por ácido corosólico (Cuadrado), ácido maslínico (rombo) y cafeína (triangulo), a distintas concentra-
ciones de cada compuesto (Wen et al. 2005).
Figura 25. Inhibición de la GP hepática en ratón producido por ácido corosólico (Cuadrado), ácido maslínico (rombo) y cafeína (triangulo), a distintas concentraciones de cada
compuesto (Wen et al. 2005).
36
Un estudio realizado por Liu et al. (2007) obtuvo resultados más concretos
sobre el efecto hipoglucemiante en ratones KK-Ay, un animal modelo genético de la
diabetes tipo 2. En este caso se realizaron dos estudios distintos. En primer lugar se
administró a los ratones oralmente distintas concentraciones de AM (3, 10 y 30
mg/kg) disueltas en disolución CMC-Na. Posteriormente se tomaban muestras de
sangre trascurridas 2, 4 y 7 horas para determinar la glucosa en sangre. En la Figura
26 se puede observar que, a concentraciones de 10 y 30 mg/kg, la glucosa en
sangre se reduce considerablemente tras la administración del tratamiento. Además
a concentración 30 mg/kg los niveles de glucosa a las 4 y 7 horas después del
tratamiento disminuyen considerablemente a comparación con los ratones control,
sin tratamiento.
Figura 26. Efectos del tratamiento con AM en las concentraciones de glucosa en sangre en ratones KK-Ay , una sola dosis (Liu et al. 2007).
Por otro lado los ratones fueron tratados con AM por vía oral (10, 30 mg/kg),
una dosis de la solución durante dos semanas. Al igual que en el caso anterior se
obtuvieron muestras de sangre para determinar la concentración de glucosa cada
semana. Como se muestra en la Figura 27, los ratones muestran una disminución
de la glucosa en sangre tras una o dos semanas de tratamiento.
37
Figura 27. Efectos del tratamiento con AM en las concentraciones de glucosa en sangre en ratones KK-Ay, una dosis al día durante dos semanas (Liu et al. 2007).
Tras analizar la respuesta a la administración del AM tras su administración y
durante el transcurso del tratamiento durante dos semanas, se comprobó su
capacidad hipoglucémica. El ácido maslínico puede ser una gran promesa para el
tratamiento de la diabetes tipo dos debido a que se trata de un agente natural.
6.2.3 Efectos sobre enfermedades cardiovasculares.
Liu et al. (2007) examinó los efectos terapéuticos de los triterpenos
pentacíclicos: ácido oleanólico y ácido maslínico, en la hiperlipidemia en modelos de
ratas con una diete rica en colesterol. Las ratas inducidas a hipercolesterolemia
presentaban un 92% de TG, 838% de TC, 265% de HDL y un 2594% de LDL a
comparación del grupo de ratas con dieta normal, control. Estos modelos fueron
suplementados por AM y AO (100 mg / kg peso corporal / día) durante 15 días y se
obtuvieron los resultados representados en la Tabla 6 Como se puede observar,
tras el tratamiento los niveles de todos los compuestos fueron reducidos en más del
50%.
Tabla 6. Efectos del tratamiento con AM y OA en ratas control e inducidas a hiperlipidemia durante 15 días (Liu et al. (2007).
38
La oxidación de ácidos grasos es una de las principales fuentes de energía
metabólica en los seres humanos, sin embargo, el excesivo consumo de estos
compuestos puede conducir hiperlipidemia resultando en las complicaciones de la
enfermedad vascular (Saleh et al. 1999). Los triterpenos pentacíclicos pueden ser
unos agentes prometedores en la regulación de la lipidemia evitando la
aterosclerosis y, por tanto, numerosas enfermedades cardiovasculares (Liu et al.
(2007).
Además, los triterpenos pentacíclicos poseen efectos cardiotónicos y anti-
arrítmicos. Somova et al. (2004) utilizaron ácido oleanólico, ácido ursólico, uvaol y
metil maslinato (MM). El experimento se llevó a cabo usando modelo de ratas para
valorar la actividad de estos compuestos. Estas ratas fueron anestesiadas usando
40 mg/kg de peso corporal de Tiopental de sodio. Se logró una respiración mecánica
de las ratas mediante la introducción de una cánula traqueal y un respirador para
rodeores. Se indujeron a cada rata 0,2 ml por 100g de peso de un fármaco
sintetizado a partir de los triterpenos y se realizó un electrocardiograma para ver su
efecto. Estos compuestos mostraron una baja toxicidad así como un efecto
vasodepresor dosis-dependiente que dura más de 60 min con un máximo a los 20
min de la aplicación (Tabla 7). La LC50 fue 0.50, 0.95 y 1.10 mg/ml respectivamente.
Tabla 7. Cambios en el ritmo cardiaco y presión arterial tras la aplicación intraperitoneal de diferentes dosis de ácido oleanólico, ursólico, metil maslinato y uvaol (Somova et al. 2004)
39
Se comprobó que el AO y el MM actuaban como antagonistas β-adrenérgicos
bloqueando el efecto de la adrenalina y la isoprenalina. Los efectos anti-arrítmicos
fueron evaluados en arritmias inducidas químicamente por adrenalina y CaCl2 así
como en arritmias por isquemia-reperfusión. El AO y el AU muestran efectos anti-
arrítmicos en ambos tipos de arritmia química y el AO y UV muestran los mismos
efectos en dosis de 40mg/kg en la arritmia por isquemia-reperfusión.
6.2.4 Efectos en el tratamiento del dolor e inflamación.
Los síntomas de la inflamación (enrojecimiento, edema, calor, dolor, y la
función del tejido alterado) son el resultado de complejos procesos fisiopatológicos
que incluyen aumento del flujo sanguíneo y la permeabilidad vascular, la activación
de mecanismos de defensa humoral y celular, sensibilización y activación de los
nociceptores. Estos procesos están mediados por una variedad de señales
moleculares producidas por mastocitos, macrófagos, granulocitos, plaquetas,
linfocitos, terminaciones nerviosas, células endoteliales, etc,
Márquez-Martin et al (2006) determinó que el ácido oleanólico es un agente
modulador de las citoquinas liberadas en procesos inflamatorios por los macrófagos.
Para ello utilizó cultivos de células sanguíneas periféricas mononucleares
estimuladas para ensayar la actividad biológica de los triterpenos frente a la
inflamación. Se obtuvo sangre de voluntarios sanos y se trataron con diferentes
concentraciones (10-100µM) de eritrodiol, uvaol, ácido maslínico y ácido oleanólico.
Posteriormente los cultivos fueron analizados midiendo TNF-α, IL-1β, IL-6 y I-309
usando kits ELISA. Se observó que el ácido oleanólico producía una inhibición
dosis-dependiente de IL-1β. Por otro lado el ácido maslínico y el uvaol no afectaban
significativamente a la liberación de la citoquina. Sin embargo, el eritrodiol era el
compuesto que mostraba una mayor inhibición a la liberación de esta citoquina,
Figura 28.
Se obtuvieron efectos similares respecto a TNF-α, IL-6 y I-309 en los cuales el
efecto del ácido oleanólico siempre era bastante significativo. Los datos obtenidos
en el análisis de TNF-α mostraron una gran inhibición por parte del AO y el uvaol.
Por otra parte, los resultados obtenidos tras el análisis determinaron una fuerte
inhibición tras la aplicación de uvaol, eritrodiol y AO, Figura 29.
40
Figura 28. Inhibición de IL-1β producida en células sanguíneas periféricas mononucleares por uvaol (UV), eritrodiol (ER), ácido oleanólico (OA) y ácido maslínico (MA), (Márquez-Martin et al 2006)
Figura 29. Inhibición de IL-1β producida en células sanguíneas periféricas mononucleares por uvaol (UV), eritrodiol (ER), ácido oleanólico (OA) y ácido maslínico (MA), (Márquez-Martin et al 2006)
También se han realizado estudios sobre la nocicepción en ratones tras
realizar un tratamiento con ácido maslínico. La administración sistémica del ácido
maslínico reduce el dolor inducido por el ácido acético así como la fase inflamatoria
41
del dolor inducido por formalina en modelos experimentales de ratón (Nieto et al.
2013).
Los efectos de la administración sistémica AM fueron evaluados usando dos
test de inducción al dolor: contorsiones inducidas por el ac acético y la prueba de la
formalina. La administración intraperitoneal de ácido acético induce la inflamación
visceral y somática de los tejidos induciendo la respuesta al dolor en forma de
contorsiones. El tratamiento sistémico con AM inhibe un 60% de las contorsiones
ocasionadas por el compuesto. En la Figura 30 se muestra una gráfica donde se
puede observar el efecto del AM a distintas concentraciones. También se compara
con el experimento control realizado con Ibuprofeno.
Figura 30. Efectos de la administración sistémica de ácido maslínico en modelos experimentales de ratón químicamente inducidos al dolor mediante una inyección intraperitoneal de ácido acético (Nieto et al. 2013).
Con una inyección intraplantar de formalina se inducen repuestas bifásicas
nociceptivas (lamer la pata trasera). La primera fase es consecuencia de la
estimulación directa de los nociceptores y la segunda es más compleja e implica un
proceso inflamatorio agudo. El tratamiento no altero significativamente la primera
fase del dolor agudo, pero las respuestas nociceptivas fueron reducidas en la
segunda fase, Figura 31. Este ensayo también utilizó Ibuprofeno como experimento
control al tratamiento con el ácido maslínico.
42
Figura 31. Efectos del ácido maslínico a la respuesta del dolor inducido por una inyección intraplantar a modelos experimentales de ratón (Nieto et al. 2013).
6.2.5 VIH e infección parasitaria.
Huang et al (2013) halló 5 nuevos triterpenos los cuales aislados del extracto
de Excoecaria acerifolia. Sus estructuras fueron determinadas por análisis de datos
espectroscópicos y se realizaron estudios anti-VIH. Se evaluaron cuatro compuestos
(A, C, D y E) realizando ensayos in vitro para medir su actividad anti-VIH. Para ello
se midieron los efectos citopáticos causados por VIH-1 sobre la línea celular C8166.
El compuesto A exhibió una moderada actividad a una concentración EC50 de 5,58
µM, sin embargo los restantes compuestos mostraron una actividad mucho más
baja, Tabla 8.
Tabla 8. Actividad anti-VIH in vitro de Excocarinoles A, C, D y E (Huang et al. 2013).
Un estudio realizado por De Pablos et al. (2010) demostró que el ácido
maslínico inhibe el crecimiento y la replicación celular de Toxoplasma gondii. Se
trata de una inhibición dosis-dependiente. Tras un tratamiento con AM durante 24
horas, se observa que tras 24h de tratamiento con ácido maslínico se encuentra una
dosis infectiva media (ID50) de 46 µM, mientras que a las 48h fue de 8µM, Figura
32.
43
Figura 32. Inhibición de la penetración de T. gondii en células tras 24 (A) y 48 horas (B) de tratamiento con AM (Pablos et al. 2010).
La inhibición ejercida por el ac maslínico en las proteasas presentes en los
productos secretados también mostró una fracción dependiente de la dosis en su
inhibición. Esta inhibición fue similar a la conseguida por los inhibidores clásicos.
La inhibición de la actividad de la proteasa a través del AM conduce a la
obstrucción de los mecanismos implicados en la penetración de los taquizoitos en la
célula huésped o de mecanismos necesarios para esta penetración. La inhibición de
la capacidad de internalización podría considerarse un efecto indirecto, dada la
acción del ácido en la motilidad de deslizamiento del parásito. El efecto de
inhibidores de la proteasa que ejercen sobre la movilidad puede ser una
consecuencia de la interacción de estos inhibidores productos de secreción.
44
Como se refleja en los resultados, Tabla 9, el ácido maslínico a una
concentración de 50 µM inhibe la motilidad de deslizamiento hasta 100 %. Este
mecanismo es, posiblemente, uno de los responsables de impedir la penetración de
la célula huésped.
Tabla 9. Actividad in vitro del ácido maslínico en taquizoitos de Toxoplasma gondii (Pablos et al. 2010).
45
7. CONCLUSIONES:
1. Los triterpenos pentacíclicos tales como el ácido oleanólico, ácido maslínico,
ácido ursólico, eritrodiol y uvaol se encuentran presentes en altas concentraciones
en órganos y productos derivados del olivo. Su presencia y su concentración junto a
sus efectos beneficiosos para la salud, hacen que la aceituna de mesa y el aceite de
oliva sean alimentos saludables y recomendados a incluir en nuestra dieta.
2. Varios compuestos triterpénicos como el eritrodiol y el ácido maslínico provocan la
inhibición selectiva de la proliferación celular de diversas líneas celulares
procedentes de tumores humanos. Esta inhibición se ejerce por inducción de
apoptosis celular selectiva en este tipo de células.
3. En experimentos realizados con animales, se ha demostrado que el ácido
maslínico produce la disminución del dolor en una respuesta similar al tratamiento
con ibuprofeno.
4. El ácido maslínico se puede considerar como una molécula de potencial utilidad
para prevenir la parasitosis humana y animal en situaciones donde la infectividad
esta mediada por proteasas, por ejemplo Toxoplasma, así como otras enfermedades
causadas por protozoos Apicomplexa.
5. El ácido oleanólico y el uvaol presentan efectos beneficiosos para la función
cardiovascular que los hacen buenos candidatos a tener en cuenta en el tratamiento
convencional de la hipertensión, angina de pecho.
6. Debido a sus propiedades, los triterpenos pentacíclicos o/y algunos de sus
derivados, están siendo considerados como productos naturales que pueden
sustituir o complementar la acción de fármacos convencionales en el tratamiento de
diversas patologías.
46
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