МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет

имени В. И. Вернадского»

Таврическая академия

Факультет биологии и химии

Кафедра ботаники и физиологии растений и биотехнологий

Чмелёва С. И., Решетник Г. В., Кучер Е. Н.

МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ И ЗАДАНИЯ

ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ

ЗАНЯТИЙ

по дисциплине «Физиология растений»

для обучающихся 3 курса

направления подготовки 35.03.10 Ландшафтная архитектура

квалификация выпускника «бакалавр»

Симферополь

2017

2

ЧМЕЛЁВА С. И. Методические материалы и задания для

проведения лабораторных занятий по дисциплине «Физиология

растений»: для обучающихся 3 курса, направления подготовки 35.03.10

Ландшафтная архитектура квалификация выпускника «бакалавр» /

С. И. Чмелёва, Г. В. Решетник, Е. Н. Кучер / ФГАОУ ВО «Крымский

федеральный университет имени В. И. Вернадского». – Симферополь,

2017. – 56 с.

В методических материалах представлены лабораторные работы

по основным разделам физиологии растений. Рассмотрены

особенности физиологии растительной клетки, фотосинтеза, дыхания,

минерального питания, водного режима растений, превращения

запасных питательных веществ, роста и развития растений,

устойчивости растений к неблагоприятным внешним факторам. Для

лучшего усвоения лекционного и практического материала по

изучаемому курсу в конце каждой работы приведены контрольные

вопросы.

Выполнение представленных в методических материалах

лабораторных работ поможет обучающимся углубить и расширить

знания по теоретическому курсу, а также будет способствовать

формированию у обучающихся представлений о закономерностях

жизнедеятельности растений, биохимических и молекулярных основах

взаимозависимости сложных функций и механизмов их регуляции в

системе целого организма, приобретению навыков экспериментальной

работы в области ландшафтной архитектуры в аспектах

профессиональной деятельности.

© Чмелева С. И., Решетник Г. В.

Кучер Е. Н.

КФУ, 2017

3

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................. 5 ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ «ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ» . 6

Структура учебного плана ....................................................................... 6 Контрольные вопросы к экзамену .......................................................... 9

ЛАБОРАТОРНЫЕ ЗАНЯТИЯ ПО ДИСЦИПЛИНЕ

«ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ» ........................................................... 14 Правила техники безопасности при работе в учебной лаборатории 15 Неотложная медицинская помощь в учебной лаборатории .............. 16

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ .................................. 17 Работа 1. Явление плазмолиза и деплазмолиза .................................. 17 Работа 2. Определение осмотического давления клеточного сока

плазмолитическим методом по де Фризу ............................................ 19 ВОДНЫЙ ОБМЕН РАСТЕНИЙ .......................................................... 22

Работа 3. Определение транспирации листьев растений .................. 22 Работа 4. Наблюдение за устьичными движениями под

микроскопом ........................................................................................... 24 ФОТОСИНТЕЗ ........................................................................................ 26

Работа 5. Пигментный состав зеленого листа. Физические и

химические свойства пигментов ........................................................... 26 Работа 6. Обнаружение фотосинтеза методом крахмальной пробы

(проба Сакса)........................................................................................... 32 ФИЗИОЛОГИЯ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ ..... 35

Работа 7. Микрохимический анализ золы. Обнаружение нитратов в

растениях ................................................................................................. 35 Работа 8. Обнаружение запасных сахаров в растительном

материале ................................................................................................. 39 ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ ........................................................................ 41

Работа 9. Обнаружение ферментов оксидоредуктаз в дрожжевых и

растительных клетках ............................................................................ 41 ФИЗИОЛОГИЯ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ ..................... 48

Работа 10. Закладка опыта по определению влияния различных

регуляторов роста растений на прорастание семян ............................ 48 Работа 11. Определение влияние различных концентраций

гибберелловой кислоты на прорастание семян салата и

гетероауксина на рост корней у различных растений ........................ 51 ФИЗИОЛОГИЯ СТРЕССА ................................................................... 52

4

Работа 12. Определение водоудерживающей способности тканей

изолированных листьев растений методом прямого завядания по

Арланду ................................................................................................... 52 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........... Ошибка! Закладка не определена.

5

ВВЕДЕНИЕ

Программа изучения нормативной учебной дисциплины

"Физиология растений" составлена в соответствии с образовательно –

профессиональной программой направления подготовки 35.03.10

Ландшафтная архитектура квалификация выпускника «бакалавр»

Предметом изучения учебной дисциплины "Физиология

растений" являются функции растительных организмов на разных

уровнях организации и пути управления ими.

Междисциплинарные связи: "Физиология растений" изучается

после таких курсов, как ботаника, экология растений, лесоведение с

основами фитоценологии и логически связана с этими дисциплинами.

Физиология растений является теоретической базой для преподавания

таких курсов, как защита растений, лесопарковое хозяйство,

декоративное растениеводство, отдельных специальных дисциплин в

соответствии с ООП магистратуры по направлению «Ландшафтная

архитектура» для изучения элективных дисциплин.

Цель и задачи учебной дисциплины.

Целью преподавания учебной дисциплины "Физиология

растений" является формирование у обучающихся представлений о

закономерностях жизнедеятельности растений, биохимических,

молекулярных и генетических основах взаимозависимости сложных

функций и механизмов их регуляции в системе целого организма,

профессиональных первичных навыков лабораторного анализа и

постановки эксперимента в ходе изучения растительных организмов,

приобретение навыков экспериментальной работы в области

ландшафтной архитектуры в аспектах профессиональной

деятельности.

Особенностью дисциплины является то, что физиология

растений служит теоретической основой рационального подхода в

области ландшафтной архитектуры. Современный уровень знаний

позволяет характеризовать агроценоз как сложную систему, все

элементы которой взаимосвязаны. Только изучив закономерности

функционирования ценозов, в том числе основных продуцентов,

можно управлять процессом формирования искусственных

биологических систем.

6

ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ «ФИЗИОЛОГИЯ

РАСТЕНИЙ»

Структура учебного плана

Структура учебного плана по дисциплине "Физиология

растений" для обучающихся очной формы обучения в соответствии с

направлением подготовки 35.03.10 Ландшафтная архитектура

квалификация выпускника «бакалавр»

Таблица 1

Объем дисциплины и распределение часов по видам учебной работы

Виды контактной и внеаудиторной

работы

Всего часов очная форма обучения

Общий объем дисциплины 108

Аудиторная работа 68

в том числе:

Лекции 28

Лабораторные 40

Самостоятельная работа обучающихся 40

Виды промежуточной аттестации:

Экзамен 5 семестр

РАЗДЕЛ 1. Физиология растений как наука.

Тема 1. Физиология растений как наука. Определение науки,

цели, задачи, связь с другими науками. История возникновения науки.

Методы науки, методологические подходы в изучении растений.

Задачи физиологии и биохимии растений на современном этапе

развития общества.

РАЗДЕЛ 2. Физиология растительной клетки.

Тема 1. Мембранный принцип организации растительной клетки.

Клетки прокариотические и эукариотические. Структура и функции

клеточных мембран. Основные механизмы транспорта питательных

веществ в растительную клетку.

Тема 2. Осмотические, транспортные и электрофизиологические

функции растительной клетки. Растительная клетка как осмотическая

система. Осмотические явления в растительной клетке. Водный

потенциал в растительной клетке.

7

РАЗДЕЛ 3. Водный обмен растений.

Тема 1. Структура и физико– химические свойства воды. Роль

воды в биологических системах. Молекулярная структура воды.

Физические свойства воды. Роль воды в биологических системах.

Тема 2. Динамика воды в системе: почва – растение – атмосфера.

Транспорт воды в растение. Корень – основной водопоглощающий

орган растения. Радиальное перемещение воды в тканях корня.

Транспирация. Водный дефицит, его виды и причины возникновения в

растении.

Тема 3. Влияние водного дефицита на растение. Орошаемое

земледелие. Особенности водообмена у растений разных

экологических групп. Влияние внешних условий на степень

открытости устьиц. Суточный ход транспирации и транспирационные

величины. Водный дефицит, его виды и причины возникновения в

растении. Влияние водного дефицита на физиолого– биохимические

функции растений. Морфолого-анатомические и физиологические

особенности засухоустойчивых растений.

РАЗДЕЛ 4. Фотосинтез.

Тема 1. Фотосинтез. Общая характеристика процесса,

космическая роль. Определение фотосинтеза. Уравнение фотосинтеза

и его анализ. Эволюция ассимиляционного процесса на Земле.

Фототрофия. Отличительные особенности фотосинтеза высших

растений.

Тема 2. Надмолекулярные структуры фотосинтеза в зеленом

растении. Лист как орган фотосинтеза. Хлоренхима. Структурно-

функциональные особенности. Пластидный аппарат зеленого растения.

Тема 3. Фотосинтез. Световые реакции. Возбуждение светом

молекулы хлорофилла и пути его дезактивации. Эффект Эмерсона и

понятие о фотосистемах. Состав и функции фотосистем I и II в зеленом

растении. Взаимодействие фотосистем I и II в световой фазе

фотосинтеза. Перенос электронов и протонов. Фотосинтетическое

фосфорилирование. Основные продукты световой фазы.

Тема 4. Темновая фаза фотосинтеза. Цикл Кальвина. Цикл Хетча-

Слэка. САМ-путь фотосинтеза. Фотодыхание.

Тема 5. Экологические факторы фотосинтеза. Фотосинтез и

продукционный процесс в растении. Дневной ход фотосинтеза и

влияние на него внешних условий. Фотосинтез и урожай, их параметры

и связь. Способы повышения продуктивности фотосинтеза.

Светокультуры растений.

8

РАЗДЕЛ 5. Физиология минерального питания растений. Тема 1. Минеральные элементы в растительном организме и

окружающей среде. История развития учения о минеральном питании

растений. Микро – и макроэлементы, содержание в растении.

Органогены. Азот. Содержание в среде, усвоение растениями. Реакции

аминирования и переаминирования, их связь с дыханием растений.

Тема 2. Физиологическая роль макроэлементов в растении.

Тема 3. Физиологическая роль микроэлементов в растении.

РАЗДЕЛ 6. Транспорт веществ в растении.

Тема 1. Система восходящего и нисходящего транспорта веществ

в растении. Понятие о ближнем и дальнем транспорте веществ в

растении. Апопластный и симпластный транспорт. Ксилемний

транспорт. Флоемний транспорт.

РАЗДЕЛ 7. Дыхание растений.

Тема 1. Дыхание растений. Общая характеристика процесса

дыхания. Дыхание – основной окислительно-восстановительный

процесс в растении. Основные уравнения дыхания и его анализ.

Краткая история развития теории биологического окисления.

Дыхательные ферменты.

Тема 2. Гликолиз, основные реакции и роль в растении. Цикл

трикарбоновых кислот, реакции, роль в растении, связь с другими

процессами. Пентозофосфатный цикл дыхания. Глиоксилатный цикл

дыхания.

Тема 3. Дыхательная цепь митохондрий, ее состав и функции.

Дыхательное (окислительное) фосфорилирование. Теория Митчелла.

Механизм работы АТФ-СИНТАЗНОГО комплекса митохондрий.

РАЗДЕЛ 8. Гормональная система растений.

Тема 1. Общие принципы регуляции у растений.

Внутриклеточная регуляция: генетическая, мембранная и регуляция

активности ферментов (метаболическая). Межклеточная регуляция:

трофическая, гормональная и электрофизиологическая.

Организменный уровень регуляции.

Тема 2. Фитогормоны. Механизм действия фитогормонов на

клеточном и организменном уровнях. Определение понятия

"фитогормоны". Классификация фитогормонов, их молекулярная

структура. Механизм действия фитогормонов на клеточном и

организменном уровнях. Употребление фитогормонов и регуляторов

роста в практике сельского хозяйства.

9

Тема 3. Фитогормоны как эндогенные регуляторы

морфогенетических и физиологических процессов в растительном

организме.

РАЗДЕЛ 9. Физиология роста и развития растений.

Тема 1. Рост растений. Определение понятия "рост". Клеточный

рост, его фазы. Меристема и камбий. Периодичность роста у растений.

Спокойствие и способы его регуляции.

Тема 2. Развитие растений. Определение понятия "развитие".

Основные этапы онтогенеза растений. Периодические явления в жизни

растений.

РАЗДЕЛ 10. Физиология стресса.

Тема 3. Теория стрессов и неспецифическая устойчивость

растений к неблагоприятным факторам. Механизмы стресса и

адаптации на клеточном, организменном и популяционном уровнях.

Тема 4. Устойчивость растений к действию неблагоприятных

факторов среды. Устойчивость к низким положительным

температурам. Морозостойкость и зимостойкость. Устойчивость к

высоким температурам (жаростойкость). Устойчивость к засолению.

Адаптация к недостатку кислорода. Газоустойчивость растений.

Тема 5. Защита растений от патогенов и фитофагов.

Контрольные вопросы к экзамену

1. Физиология и биохимия растений: предмет, цели и методы.

Методические подходы в изучении функций растительного организма.

2. Регуляция процессов в растительной клетке. Организм как

целостная система. Регуляция функций растений на организменном

уровне.

3. Мембранный принцип организации растительной клетки.

Структура и свойства биологических мембран.

4. Основные структурные элементы субклеточной

организации эукариотической растительной клетки, их функции.

5. Растительная клетка как осмотическая система. Понятие о

свойстве полупроницаемости клеточных мембран.

6. Основные механизмы поступления питательных веществ в

растительной клетке.

7. Обмен энергии в клетке растений. Фосфорилирование: его

разновидности в растительной клетке. Понятие о микро – и

макроэргических соединениях.

10

8. Сопрягающая мембрана как структурная основа

биоэнергетических процессов. Трансформация энергии на мембранах

тилакоидов и митохондрий. Понятие о редокс – потенциале.

9. Состояние воды в растении в связи с особенностями ее

молекулярной структуры. Роль воды в структуре и функциях

растительного организма.

10. Грунтовая вода, степень ее подвижности и доступности для

растений.

11. Передвижение воды в системе почва – растение –

атмосфера. Понятие о водном потенциале. Гуттация и плач у растений.

12. Поступление воды в растение. Корень как основной

водопоглощающий орган. Радиальное передвижение воды в тканях

корня.

13. Транспортировка воды с участием аквапоринов. Эндо – и

экзоцитоз.

14. Транспирация, ее регуляция в растении. Суточный ход

транспирации и транспирационные величины.

15. Водный дефицит у растений. Завядание. Влияние

завядания на функции растительного организма.

16. Морфолого - анатомические и физиологические признаки

засухоустойчивых растений. Растения – ксерофиты на примере

крымской флоры.

17. Краткая история развития учения о фотосинтезе. Работы

К.А. Тимирязева.

18. Классификация организмов по способу питания и

использования энергии (эволюция автотрофности на Земле).

19. Общее понятие о фотосинтезе. Уравнение фотосинтеза, его

анализ. Лист как орган фотосинтеза.

20. Ультраструктура хлоропластов. Онтогенез пластидного

аппарата у растений.

21. Хлорофиллы. Строение молекул, химические и физические

свойства хлорофиллов.

22. Каротиноиды, структура молекул и функции.

23. Космическая роль фотосинтеза.

24. С-3 путь темновой фазы фотосинтеза, его этапы. Фаза

карбоксилирования и восстановительная.

25. Фаза регенерации акцептора углерода в С-3 темновых

реакциях фотосинтеза.

26. С-4 путь темновой фазы фотосинтеза. Особенности

красуляции как приспособление к экстремальным условиям обитания.

11

27. Фотодыхание: биохимические реакции, их локализация.

Физиологическая роль фотодыхания.

28. Основные этапы биосинтеза хлорофилла в растении.

29. Електронвозбужденное состояние хлорофилла и пути его

дезактивации.

30. Циклический и нециклический перенос электронов в ходе

световой фазы фотосинтеза.

31. Понятие фотосинтетического фосфорилирования. Теория

П. Митчелла.

32. Структура и свойства фикобилинов. Явление

хроматической адаптации.

33. "Эффект усиления" Эмерсона. Понятие фотосистем и их

роль в процессе фотосинтеза.

34. Дневной ход фотосинтеза и влияние на него внешних

условий.

35. Светокультуры растений. Выращивание растений при

искусственном освещении.

36. Фотосинтез и урожай. КПД фотосинтеза. Способы

увеличения выхода биомассы урожая в агрофитоценозах.

37. Пути окисления дыхательного субстрата в растительном

организме. Теория биологического окисления А.М. Баха и В.И.

Паладина.

38. Ферментные системы дыхания. Оксидоредуктазы и

оксигеназы. Участие в реакциях окисления – восстановления.

39. Окисление дыхательного субстрата в анаэробной фазе

дыхания (гликолиз).

40. Пути окисления продуктов дыхания в аэробной фазе

дыхания (цикл Кребса).

41. Электронтранспортная цепь митохондрий и дыхательное

(окислительное) фосфорилирование.

42. Понятие фосфорилирования на уровне субстрата и

фосфорилирования в дыхательной цепи. Энергетический выход

анаэробной и аэробной фаз дыхания.

43. Дыхание – центральное звено обмена в растении. Значение

процесса дыхания в физиологии растительного организма.

44. Влияние внешних и внутренних условий на процессы

дыхания.

45. Количественные показатели дыхания. Дыхательный

коэффициент, его физиологическое значение.

12

46. Пентозофосфатный путь окисления дыхательного

субстрата в растениях, его отличительные черты от дихотомического

пути.

47. Глиоксилатний цикл дыхания.

48. Генетическая связь дыхания и брожения. Работы С.П.

Костычева.

49. Гетеротрофный способ питания у растений. Сапрофиты.

Паразиты и полупаразиты. Насекомоядные растения. Гетеротрофное

питание за счет собственных запасных веществ. Микотрофный тип

питания.

50. Динамика минеральных элементов в системе: литосфера –

растение. Понятие о макро – и микроэлементах, их содержание в

растениях. Органогены.

51. Поступление минеральных ионов в растительную клетку.

Роль Н-АТФ-азы в транспортных процессах. Понятие о свободном

пространстве ткани.

52. Источники азотного питания растений. Восстановление

нитратов в растении и пути ассимиляции аммиака.

53. Физиолого-биохимическая роль азота в растениях.

Биосинтез аминокислот и амидов. Работы Д.М. Прянишникова.

54. Физиологическая роль фосфора в растениях.

55. Физиологическая роль калия, кальция и магния в

растениях.

56. Физиологическая роль серы и железа.

57. Физиологическая роль бора и марганца.

58. Физиологическая роль меди и цинка.

59. Виды химических удобрений, физиологические основы и

способы их применения.

60. Представление о функциях ионных каналов и ионных

насосов в плазмалемме и тонопласте растительной клетки.

61. Корень как орган поглощения элементов минерального

питания и синтеза органических соединений в растении.

62. Понятие о восходящем и нисходящем транспорте веществ

у растений. Основные механизмы ксилемного и флоемного транспорта.

63. Акцепторные и донорно-акцепторные отношения в

растении. Транспорт веществ как интегрирующий процесс.

64. Транспортные формы веществ в растении.

65. Отложение в запас органических соединений в растении.

66. Превращения веществ в семенах при прорастании.

67. Рост растений. Фазы клеточного роста.

13

68. Ритмы роста растений и большая кривая роста. Типы роста.

Состояние покоя, его адаптивная функция.

69. Синтетические регуляторы роста: стимуляторы и

ретарданты, гербициды, дефолианты, десиканты, их практическое

применение.

70. Фитогормоны, общая характеристика. Роль фитогормонов

в регуляции метаболизма и ростовых процессов. Механизмы действия.

71. Индолилуксусная кислота и явление апикального

доминирования. Применение в растениеводстве.

72. Гиббереллины и кинетин, функциональная роль и

применение в растениеводстве.

73. Ростовые и тургорные движения растений.

74. Развитие растений. Понятие вегетативного и генеративного

развития. Основные этапы онтогенеза растений.

75. Понятие фотопериодизма и термопериодизма растений.

76. Фитохромная система растений и ее участие в регуляции

онтогенеза.

77. Ответная реакция растения на стресс. Общая стратегия

адаптации растений на действие неблагоприятных факторов.

78. Устойчивость растений к высоким температурам.

79. Устойчивость растений к положительным и

отрицательным низким температурам.

80. Влияние на растение избытка влаги.

81. Виды токсичных веществ в атмосфере и газоустойчивость

растений.

82. Физиологические основы засухоустойчивости растений.

83. Солеустойчивость растений.

84. Физиология орошаемого растения. Критические периоды в

водоснабжении растений.

85. Биохимические и физиолого-биохимические основы

устойчивости высших растений к патогенным микроорганизмам.

86. Приемы и методы повышения устойчивости растений к

действию неблагоприятных факторов среды. Комплексная и

специфическая устойчивость.

14

ЛАБОРАТОРНЫЕ ЗАНЯТИЯ ПО ДИСЦИПЛИНЕ

«ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ – наука экспериментальная,

поэтому в учебном плане подготовки биологов отводится время на

лабораторные занятия.

В задачи данных методических материалов входят: проверка и

закрепление теоретических положений, излагаемых в курсе лекций;

ознакомление с методами определения различных физиолого –

биохимических процессов у растений; привитие навыков научно–

исследовательской работы (постановка цели опыта, проведение

эксперимента, оформление первичной научной документации,

обсуждение результатов опытов, оформление выводов).

Лабораторные работы выполняются согласно графика учебного

процесса и самостоятельной работы обучающихся по данной

дисциплине. На выполнение лабораторной работы отводится 4

академических часа. При этом соблюдается принцип индивидуального

выполнения работ.

Каждый студент ведет рабочую тетрадь, оформление которой

должно отвечать требованиям, основные из которых следующие:

– каждую работу нумеруют в соответствии с методическими

указаниями,

указывают дату выполнения работы;

– полностью записывают название работы, цель и принцип

метода, кратко характеризуют ход эксперимента и объект

исследования; при необходимости приводят рисунок установки;

– результаты опытов фиксируют в виде рисунков с

обязательными подписями к ним, а также таблиц или описывают

словесно;

– в конце каждой работы делают вывод или заключение, которые

обсуждаются при подведении итогов занятия.

Все первичные записи необходимо делать в тетради по ходу

эксперимента. Для оценки академической активности и качества

работы студена рабочую тетрадь проверяет преподаватель.

15

К лабораторным работам студент допускается только после

инструктажа по технике безопасности.

Основная цель малого практикума по физиологии растений –

углубить и расширить знания, обучающихся по теоретическому курсу,

познакомить их с методами исследования в этой отрасли биологии. В

методических материалах приведены теоретические основы и

практические задачи по основным разделам физиологии растений:

физиологии растительной клетки, фотосинтезу, дыханию,

минеральному питанию, водному режиму растений, превращению

запасных питательных веществ, росту и развитию.

Правила техники безопасности при работе в учебной лаборатории

Работа в лабораториях проводится с кислотами, щелочами и

другими опасными веществами. Чтобы избежать случайных ожогов и

загрязнений одежды и тела, обучающихся следует к работе допускать

только в лабораторных халатах.

1. К работе с приборами обучающихся следует допускать

только после тщательного изучения инструкции к нему. Перед

включением электроприборов, нагревательных устройств необходимо

проверить исправность розеток, вилок, включателей, системы

заземления. Включать приборы можно только после установки их в

рабочее состояние по инструкции. После окончания работы

электроприбор следует выключить сначала из рабочего состояния,

затем из сети, и, если необходимо из водопроводной сети.

2. Приготовление растворов кислот, щелочей и других

вредных веществ необходимо проводить в вытяжном шкафу; исходный

продукт отбирать только пипеткой с резиновой грушей или мерным

цилиндром. Все растворы и химикаты должны иметь надписи

(карандашом по стеклу) с указанием вещества и его концентрации,

должны быть закрыты и, во избежание повреждения, стоять только на

полках лабораторных столов.

3. Поврежденной посудой обучающимся пользоваться

запрещается. Поэтому перед пользованием следует проверить, нет ли

трещин, заостренных краев и других повреждений.

16

4. После окончания занятий, дежурный и руководитель

проверяют отключение всех приборов, состояние водопроводных

кранов, порядок в лаборатории.

5. При несчастных случаях, связанных со здоровьем,

необходимо оказать первую помощь и вызвать скорую помощь по

телефону “103”, при пожаре “101” нужно вызвать пожарную команду,

известить дежурного швейцара, привести в действие противопожарные

средства.

Неотложная медицинская помощь в учебной лаборатории

При ранении стеклом нужно удалить его осколки из раны,

смазать ее йодом и перевязать.

При термических ожогах обожжённое место необходимо

поместить под струю холодной воды, а затем присыпать

гидрокарбонатом натрия или обработать примочками из

свежеприготовленных растворов питьевой соды (2 %) или

перманганата калия (5 %), или 100 – 96 0-ым этиловым спиртом,

оказывающим обеззараживающее и обезболивающее действие.

При ожогах кислотами или щелочами пораженный участок

быстро промывают большим количеством воды, затем на обожжённое

место накладывают примочку: при ожогах кислотой – из 2 %-го

содового раствора, при ожогах щелочь – из слабого раствора уксусной

кислоты.

17

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Работа 1. Явление плазмолиза и деплазмолиза

Цель занятия: ознакомиться с осмотическими явлениями в

растительной клетке. Сформулировать понятие: полупроницаемость

нативной растительной клетки.

Растительную клетку можно рассматривать как осмотическую

систему, в которой роль раствора осмотически действующих веществ

играет клеточный сок, а роль полупроницаемой перепонки –

цитоплазматические мембраны. Клеточный сок, как и любой раствор,

обладает потенциальным осмотическим давлением, которое прямо

пропорционально числу частиц в единице объема независимо от

размеров и характера этих частиц (молекулы, ионы). Раствор,

отделенный от чистой воды полупроницаемой перепонкой

(пропускающей воду и непроницаемой для растворенных веществ),

сосет воду с силой, численно равной его осмотическому давлению, т. е.

давлению, которое нужно приложить, чтобы воспрепятствовать

передвижению воды в сторону раствора.

Для каждой клетки можно подобрать следующие растворы: 1)

гипотонический, осмотическое давление, которого меньше

осмотического давления клеточного сока, 2) изотонический, имеющий

осмотическое давление, равное осмотическому давлению клеточного

сока, 3) гипертонический, осмотическое давление которого больше,

чем давление клеточного сока.

При погружении клетки в гипертонический раствор вода из нее

выходит наружу до выравнивания осмотических давлений клеточного

сока и внешнего раствора. При этом клетка претерпевает следующие

изменения (рис. 1): сначала она сокращается, а после полной потери

тургора цитоплазма отстает от клеточной стенки по углам (уголковый

плазмолиз), затем во многих местах (вогнутый плазмолиз) и, наконец,

протопласт округляется (выпуклый плазмолиз). Образующееся

пространство между цитоплазмой и клеточной стенкой (хорошо

проницаемой как для воды, так и для растворенных веществ)

заполняется внешним раствором. В качестве плазмолитиков (веществ,

растворы которых вызывают плазмолиз) используют неядовитые

вещества, плохо проникающие или совсем не проникающие через

цитоплазму в вакуоль.

18

Рис. 1. Последовательные стадии плазмолиза: 1 – тургесцентная клетка,

2– общее сокращение объема клетки, 3 – уголковый плазмолиз, 4 – вогнутый

плазмолиз, 5 – выпуклый плазмолиз.

Плазмолиз – обратимый процесс. Возвращение

плазмолизированной клетки в исходное состояние называется

деплазмолизом.

Материалы и оборудование: 1) луковица синего лука или листья

традесканции; 2) 1 М раствор сахарозы в капельнице; 3) лезвие бритвы; 4)

скальпель; 5) пинцет; 6) препаровальная игла; 7) микроскоп; 8) предметные и

покровные стекла; 9) стакан с кипяченой водопроводной водой; 10) стеклянная

палочка; 11) кусочки фильтровальной бумаги; 12) спиртовка; 13) спички.

Практические задания: 1. Приготовить препарат эпидермиса чешуи репчатого лука.

2. Поместить в гипертонический раствор,

3. Наблюдать последовательные стадии плазмолиза.

4. Зарисовать состояние клеток в каждой стадии.

5. Поместить препарат в каплю воды.

6. Наблюдать деплазмолиз.

7. Сделать заключение и выводы.

Ход работы. Срезать бритвой кусочек эпидермиса, клетки

которого содержат антоциан. Во избежание повреждения клеток

эпидермиса желательно, чтобы срез состоял из двух слоев клеток.

Поместить срез в каплю воды на предметное стекло, накрыть

покровным стеклом и рассмотреть в микроскоп клетки с окрашенным

клеточным соком. Заменить воду 1 М раствором сахарозы, для чего

отсосать воду кусочком фильтровальной бумаги, и нанести на препарат

каплю раствора. Следить в микроскоп за тем, что происходит в клетках.

Сделать схематические рисунки клеток в состоянии тургора,

уголкового, вогнутого и выпуклого плазмолиза, обозначив клеточную

стенку плазмалемму и цитоплазму.

Ввести под покровное стекло 2–3 капли воды, отсасывая раствор

фильтровальной бумагой, и немедленно приступить к наблюдению

19

деплазмолиза клеток (обратите внимание на скорость этого процесса

по сравнению с плазмолизом).

После окончания деплазмолиза убить клетки, держа край

предметного стекла пинцетом и осторожно нагревая препарат на

пламени спиртовки, не допуская полного испарения воды. Заменить

воду на 1 М раствор сахарозы и, рассматривая препарат в микроскоп,

установить, происходит ли плазмолиз.

Записать результаты наблюдений и ответить на следующие

вопросы:

Вопросы:

1) Что такое плазмолиз и каковы его причины? 2) Как происходит

деплазмолиз? 3) Способны ли плазмолизироваться мертвые клетки? 4) В чем

состоит свойство полупроницаемости клеточных мембран?

Работа 2. Определение осмотического давления клеточного

сока плазмолитическим методом по де Фризу

Цель занятия: 1. Ознакомиться с одними из методов

определения осмотического давления клеточного сока растительной

клетки; 2. Определить осмотическое давление клеточного сока клеток

эпидермиса репчатого лука.

Концентрацию клеточного сока, представляющего собой раствор

большого количества разнообразных органических и минеральных

веществ, чаще всего определяют по его осмотическому давлению.

Плазмолитический метод определения осмотического давления

клеточного сока заключается в том, что срезы исследуемой ткани

погружают в ряд растворов известной концентрации, а затем

рассматривают в микроскоп. Исходя из того, что плазмолиз способны

вызывать только гипертонические растворы, находят такой, в котором

в отдельных клетках наблюдается начальный (уголковый) плазмолиз.

Этот раствор имеет концентрацию несколько выше, чем концентрация

клеточного сока. Изотонический раствор будет находиться между этим

раствором и следующим (более слабым), который не вызывает плаз-

молиза. Отсюда следует, что концентрация изотонического раствора

равна (с известной долей погрешности) среднему арифметическому

между концентрациями указанных соседних растворов.

Установив концентрацию изотонического раствора, вычисляют

осмотическое давление по уравнению Вант – Гоффа Р = RTCi, где Р–

осмотическое давление, Мпа*; R – универсальная газовая постоянная (R

= 0,00831 кДж/град•моль)**; С – концентрация раствора, моль/л; i –

20

изотонический коэффициент, показывающий отношение числа частиц

(молекул и ионов) в растворе к исходному количеству молекул

растворенного вещества. Для неэлектролитов, например, для сахарозы,

i = 1. Для растворов электролитов i зависит от числа ионов, на которые

диссоциирует молекула, и от степени диссоциации. Значения i для

растворов NaCl даны ниже.

Таблица 2

Значение изотонического коэффициента (i) для растворов NаCl

Материалы и оборудование: 1) луковица синего лука или листья

традесканции; 2) 1 М раствор NaCl; 3) дистиллированная вода; 4) бюретки с

воронками (2 шт.); 5) часовое стекло; 6) баночки или тигельки для растворов (7

шт.); 7) крышки или кусочки стекла для закрывания баночек (7 шт.); 8) микроскоп;

9) предметные и покровные стекла; 10) скальпель; 11) лезвие бритвы; 12)

препаровальные иглы; 13) кисточка; 14) стеклянная палочка; 15) стакан с

кипяченой водой; 16) кусочки фильтровальной бумаги; 17) карандаш по стеклу; 18)

термометр комнатный. *МП (мегапаскаль)=106Па=9,87 атм.

**(R=0,08205 латм/градмоль.

Практические задания:

1. Поместить срезы растений в растворы возрастающей

концентрации.

2. По начальной стадии плазмолиза установить изоосмотическую

концентрацию и осмотическое давление клеточного сока по уравнению

Вант Гоффа в кДж и атм.

3. Делают вывод о зависимости степени плазмолиза от

концентрации наружного раствора с соответствующим объяснением.

Ход работы. Приготовить по 5 мл растворов NaCl или сахарозы

концентрацией от 0,1 до 0,7 моль/л, наливая из бюреток в баночки,

снабженные соответствующими надписями, 1 М раствор и

дистиллированную воду. Предварительно целесообразно составить

таблицу разведения:

Концентрация

NaCl, моль/л

1,0

0,8

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,01

Изотонический

коэффициент

1,62

1,64

1,66 1,68 1,70

1,73

1,75 1,78

1,83

1,93

21

Таблица 3

Таблица разведения NaCl (или сахарозы)

Концентрация опытного

раствора, моль/л

На 5 мл раствора

1 М раствора, мл воды, мл

0,1 0,5 4,5

0,2 1,0 4,0

0,3 1,5 3,5

0,4 2,0 3,0

0,5 2,5 2,5

0,6 3,0 2,0

0,7 3,5 1,5

Тщательно перемешав растворы, закрыть баночки крышками или

кусочками стекла для защиты от испарения.

Приготовить при помощи бритвы 14 срезов исследуемой ткани,

например, кожицы синего лука, и поместить их в воду на часовое

стекло (вода должна быть кипяченой, чтобы не было пузырьков

воздуха). При погружении в воду удаляется сок, вытекающий из

поврежденных клеток, и достигается одинаковое состояние всех

срезов. Через несколько минут извлечь срезы кисточкой из воды,

обсушить фильтровальной бумагой и погрузить по 2 среза в каждый

раствор, начиная с самого концентрированного. При этом необходимо

следить за тем, чтобы срезы не плавали на поверхности, а были

погружены в растворы (если срез всплывает, его следует “утопить” при

помощи препаровальной иглы).

Через 20–30 мин рассмотреть срезы в микроскоп в капле

соответствующего раствора в той же последовательности. Стеклянную

палочку, которой наносилась капля раствора, кисточку, стекла после

каждого раствора необходимо ополаскивать водой и вытирать

салфеткой или фильтровальной бумагой.

Во второй строке указать, в каком состоянии находится

большинство клеток среза (сильный плазмолиз, когда протопласт

сокращается более чем на 1/3, слабый плазмолиз – цитоплазма немного

отстает от клеточной стенки, уголковый плазмолиз или плазмолиза

нет). В третьей строке схематически зарисовать одну клетку,

характерную для данного среза.

Найти изотоническую концентрацию и вычислить осмотическое

давление клеточного сока по уравнению Вант– Гоффа.

Сделать вывод о зависимости степени плазмолиза клеток от

концентрации наружного раствора (с соответствующим объяснением).

22

Результаты опыта записать по форме:

Таблица 4

Определение изотонической концентрации раствора

плазмолитическим методом

Концентрация раствора,

моль/л

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

Степень плазмолиза

Рисунок клетки

Вопросы:

1) В чем заключается явление осмоса? 2) Что такое осмотическое давление

клеточного сока и каких единицах оно измеряется? 3) С какими физиологическими

процессами в растительной клетке связаны её осмотические свойства?

ВОДНЫЙ ОБМЕН РАСТЕНИЙ

Тема: Определение транспирации листьев растений,

наблюдение за состоянием и движением устьиц под микроскопом

Цель занятия: 1. Ознакомиться с весовым методом определения

интенсивности транспирации; 2. Изучить влияние осмотически

активных веществ на степень открытости устьиц.

Работа 3. Определение транспирации листьев растений

Транспирация – процесс испарения воды надземными частями

растений. Интенсивность транспирации – это количество воды,

испаренной в единицу времени единицей листовой поверхности.

Отношение интенсивности транспирации к интенсивности эвапорации

(испарения со свободной водной поверхности) при тех же условиях

называется относительной транспирацией; этот показатель характе-

ризует способность растений регулировать транспирацию и

выражается в виде десятичной дроби.

Наиболее простой и достаточно точный метод учета

транспирации – метод быстрого взвешивания, предложенный Л. А.

Ивановым: побег или отдельный лист срезают и дважды взвешивают с

интервалом не более 5 мин, так как при более длительной экспозиции

может начаться завядания листьев, снижающее транспирацию.

23

Установленное этим методом уменьшение массы листьев

соответствует количеству испаренной воды (увеличением массы в

процессе фотосинтеза можно пренебречь, поскольку интенсивность

фотосинтеза во много раз меньше интенсивности транспирации).

Материалы и оборудование: 1) комнатные растения (пеларгония, примула

и др.); 2) торсионные весы; 3) технические весы с разновесом; 4) ножницы; 5)

скальпель; 6) крышка чашки Петри; 7) нитки; 8) миллиметровая бумага; 9)

фильтровальная бумага.

Практические задания:

1. Определить интенсивность транспирации по уменьшению

массы срезанных листьев с помощью торсионных весов;

2. Сделать выводы.

Ход работы. Установить торсионные весы в вертикальное

положение (по уровню) и проверить их нулевую точку, после чего

закрыть арретир и снять с крючка корзиночку. Срезать лист с

небольшим отрезком черешка, немедленно подвесить его к крючку

весов при помощи нитки с петлей на конце (привязав другой конец за

черешок), быстро взвесить и записать время уравновешивания весов.

Через 3 мин сделать второе взвешивание, также отметив время. Если

испарение идет слабо, можно увеличить экспозицию до 5 мин. Закрыть

арретир и снять лист с крючка.

Для определения поверхности листа взвесить на торсионных

весах квадрат миллиметровой бумаги площади (1 см2), и бумажный

шаблон, точно соответствующий площади листа. Площадь листа

вычислить по пропорции a/b = с/s, где а – масса квадрата, b – масса

бумажной фигуры, с – площадь квадрата, s – площадь листа.

Одновременно определить при тех же условиях интенсивность

эвапорации (свободного испарения). Для этого взвесить чашку,

наполненную почти до краев водой комнатной температуры (наружная

поверхность чашки должна быть совершенно сухой), и через любое

время, например, через 30 мин, сделать второе взвешивание.

Определить испаряющую поверхность, измерив внутренний диаметр

чашки. Результаты записать в таблицу, указав вид исследованного

растения.

Интенсивность транспирации IТ (г/м2 • ч) вычислить по формуле

IT = п•10 000• 60/ (S•t),

где n – количество испарившейся воды, г; S – площадь, см2; t –

экспозиция, мин; 10000 – коэффициент перевода см2 в м2; 60 –

коэффициент перевода минут в часы.

24

Вычислить интенсивность эвапорации (IE) по той же формуле.

Найти относительную транспирацию IT/IE.

На основании величины относительной транспирации (IT/IE

меньше 0,5 считается низкой) сделать вывод о регуляции листом

процесса транспирации.

Таблица 5

Определение интенсивности транспирации весовым методом

Объект Время

взвешивания

Экспозиция,

мин

Масса, г Испарено

воды, г

Площадь,

см2

1– го 2– го 1– я 2– я

Лист

Сосуд с водой

Вопросы:

1) Что такое транспирация? 2) Какие факторы среды влияют на

интенсивность транспирации? 3) В каких единицах измеряется интенсивность

транспирации? 4) Как соотносятся испарение с определенной поверхности листа и

открытой водной поверхности такой же площади? 5) Каким образом процесс

транспирации связан с водным потенциалом растения?

Работа 4. Наблюдение за устьичными движениями под

микроскопом

Газообмен между межклетниками листа и наружной атмосферой

регулируется устьицами. Каждое устьице состоит из двух замыкающих

клеток, у которых стенки, примыкающие к устьичной щели, сильно

утолщены, тогда как наружные части оболочки остаются тонкими.

Неодинаковая толщина наружных и внутренних стенок замыкающих

клеток приводит к тому, что при изменении тургора замыкающие

клетки способны искривляться или распрямляться, открывая или

закрывая при этом устьичную щель.

Материалы и оборудование: 1) свежие листья пеларгонии, амариллиса,

бегонии или традесканции; 2) 1 М раствор сахарозы в капельнице; 3) 5 %– ный

раствор глицерина в капельнице; 4) лезвие бритвы; 5) препаровальная игла; 6)

микроскоп; 7) предметные и покровные стекла; 8) стакан с водой; 9) стеклянная

палочка; 10) кусочки фильтровальной бумаги.

25

Практические задания:

1. Наблюдать за степенью открытости устьиц при помещении

препаратов нижнего эпидермиса листа в раствор глицерина и сахарозы.

2. Сделать выводы о механизме регуляции степени открытости

устьиц путем изменении осмотической концентрации клеточного сока

замыкающих клеток.

Ход работы.

О п ы т 1. Срез нижнего эпидермиса листа какого-либо растения

рассмотреть в капле воды при большом увеличении микроскопа.

Зарисовать одно устьице, отметив утолщения клеточных стенок

замыкающих клеток. Нанести рядом с покровным стеклом 2–3 капли 1

М раствора сахарозы, приложив с другой стороны кусочек

фильтровальной бумаги, и сразу приступить к наблюдению за

изменением ширины устьичных щелей. Зарисовать устьице в закрытом

состоянии. Снова заменить раствор водой и наблюдать постепенное

открывание устьиц.

О п ы т 2. Приготовить срез эпидермиса листа какого– либо

растения, поместить в каплю 5 %-ного раствора глицерина на

предметное стекло, накрыть покровным стеклом и сразу начать

наблюдения плазмолиза под микроскопом как в замыкающих клетках,

так и в остальных клетках эпидермиса. Устьичные щели при этом

закрываются.

Через некоторое время, вследствие того, что глицерин начинает

проникать через цитоплазму в клеточный сок, наступает деплазмолиз и

устьица открываются.

Заменить глицерин водой, для чего нанести рядом с покровным

стеклом каплю воды, а с другой стороны оттянуть глицерин

фильтровальной бумагой. При этом устьица откроются еще шире, чем

это было в начале опыта, так как вследствие проникновения глицерина

в клеточный сок осмотическое давление в замыкающих клетках

повысилось.

Записать результаты наблюдений и объяснить причины

устьичных движений. Вопросы:

1) Каков механизм регуляции степени открытости устьиц листьев растений?

2) Как изменяется степень открытости устьиц в течение суток? Какие факторы

оказывают влияние на степень открытости устьиц?

26

ФОТОСИНТЕЗ

Работа 5. Пигментный состав зеленого листа. Физические и

химические свойства пигментов

Цель занятия: Овладеть методиками извлечения пигментной

вытяжки и хроматографического разделения растительных пигментов.

Тема 1. Физические и химические свойства пигментов

Фотосинтез – процесс образования органических веществ из

диоксида углерода и воды с использованием световой энергии:

6СО2 + 6Н2О + световая энергия → C6H12O6 + 6O2

Фотосинтез происходит в хлоропластах, которые окружены

двумя белково-липоидными мембранами. Хлоропласт включает

систему ламеллярных двойных мембран – тилакоидов, образованных

внутренней мембраной. В тилакоидах осуществляется световая фаза

фотосинтеза, т. е. преобразование энергии световых лучей в

химическую энергию молекул АТФ и НАДФ•Н2, а биохимические

реакции восстановления СО2 и синтеза углеводов происходят в

межтилакоидном пространстве.

В мембранах тилакоидов содержатся следующие пигменты:

хлорофилл a C55H72O5N4Mg – зеленый с синеватым оттенком;

хлорофилл b C55H70O6 N4Mg – зеленый с желтоватым оттенком;

каротин С40Н56 – желто– оранжевый; лютеин С40Н56О2 и виолаксантин

С40Н56О4 – золотисто– желтые. Все эти пигменты нерастворимы в воде,

но растворяются в органических растворителях (спирте, ацетоне и др.).

По химической природе хлорофилл a (рис. 2) представляет собой

сложный эфир дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов –

метанола СН3ОН и фитола С20Н39ОН. Хлорофиллин содержит

порфириновое ядро, состоящее из четырех пиррольных колец,

соединенных друг с другом метиновыми мостиками = СН -. В центре

порфиринового ядра расположен атом магния, соединенный с атомами

азота пиррольных колец. Кроме того, в ядре молекулы хлорофилла

имеется пятое кольцо – циклопентановое, содержащее карбонильную

группу. Хлорофилл b отличается от хлорофилла а лишь тем, что у

второго пиррольного кольца вместо метальной группы имеется

альдегидная.

27

Рис. 2. Структура хлорофилла а.

Благодаря атому азота порфириновое ядро имеет гидрофильный

характер и связано с белковыми молекулами мембран. В то же время

длинный гидрофобный углеводородный “хвост”, образованный

остатком фитола, обращен в сторону липидных слоев тилакоидов и

обусловливает хорошую растворимость хлорофилла в неполярных

растворителях (бензин, петролейный эфир). Однако для полного

извлечения хлорофилла из листьев используют не эти безводные

растворители, а спирт или ацетон, содержащие небольшое количество

воды, необходимой для гидролиза хлорофилл–белкового комплекса.

Наряду с хлорофиллами а и b в хлоропластах содержатся

каротиноиды – группа желтых пигментов, являющихся по химической

природе тетратерпеноидами (8 остатков изопрена С5Н8). Каротины (в

основном – каротин) – непредельные углеводороды, содержащие два

симметрично расположенных иононовых кольца, соединенных

длинной углеродной цепью (рис. 3). Среди ксантофиллов, являющихся

кислородсодержащими производными каротина, преобладает лютеин,

имеющий в каждом иононовом кольце спиртовую группу.

Задача данной работы – получение спиртовой вытяжки из

зеленых листьев и ознакомление с некоторыми свойствами пигментов.

Рис. 3. Структура – каротина.

Материалы и оборудование: 1) свежие или сушеные листья растений

(крапива, примула, аспидистра, плющ); 2) этиловый спирт; 3) бензин; 4) 20 %– ный

раствор КОН в капельнице; 5) 10 %– ная НС1 в капельнице; 6) СаСО3; 7)

уксуснокислый цинк; 8) кварцевый песок или толченое стекло; 9) ступка с

пестиком (сухие); 10) воронка; 11) стеклянная палочка; 12) штатив с пробирками

(5 шт.); 13) стакан с водой; 14) пипетка; 15) ножницы; 16) скальпель; 17) спиртовка;

28

18) держалка для пробирок; 19) вазелин; 20) бумажный фильтр; 21) спички; 22)

цветные карандаши.

Практические задания: 1. Получить спиртовую вытяжку из гомогената тканей зеленых

листьев.

2. С помощью спектроскопа определить спектральные участки, на

которые приходятся максимумы поглощения зеленых и желтых

пигментов.

3. Наблюдать явление флуоресценции концентрированной

вытяжки, дать его определение.

4. Изучить некоторые химические свойства пигментов и метод

разделения пигментной вытяжки по Краусу.

5. Методом бумажной хроматографии разделить пигментную

вытяжку на составляющие хлорофиллы и каротиноиды.

6. Сделать вывод о пигментном составе вытяжки.

Ход работы. Свежие или сушеные листья измельчить

ножницами, отбросив крупные жилки и черешки, поместить в ступку,

добавить на кончике ножа СаСО3 (для нейтрализации кислот

клеточного сока) и немного чистого кварцевого песка или толченого

стекла. Тщательно растереть, приливая понемногу этиловый спирт,

смазать носик ступки с наружной стороны вазелином и слить

полученный темно-зеленый раствор по палочке в воронку с фильтром.

Налить полученную вытяжку по 2–3 мл в четыре пробирки и

провести следующие опыты.

а) Разделение пигментов по Краусу. Добавить к спиртовой

вытяжке пигментов несколько больший объем бензина и 2–3 капли

воды (чтобы спирт не смешивался с бензином). Закрыть пробирку

большим пальцем, несколько раз сильно встряхнуть и дать отстояться.

Если разделение пигментов будет недостаточно четким (оба слоя

окрашены в зеленый цвет), то необходимо прилить еще бензина и

продолжать взбалтывание. Помутнение нижнего слоя (от избытка

воды) можно устранить, добавляя немного спирта. Отметить окраску

нижнего спиртового слоя и верхнего бензинового (сделать рисунок).

Сделать выводы о различной растворимости пигментов в спирте

и бензине. При этом нужно учесть, что ксантофилл, будучи

двухосновным спиртом, почти нерастворим в бензине. В отношении

каротина правильный вывод можно будет сделать, сопоставив

результаты данного опыта и следующего.

б) Омыление хлорофилла щелочью . К 2–3 мл спиртовой

вытяжки пигментов добавить 4—5 капель 20 %–ного раствора щелочи

и взболтать. Прилить в пробирку равный объем бензина, сильно

29

встряхнуть и дать отстояться. Отметить окраску спиртового и

бензинового слоев (зарисовать).

В выводах записать реакцию омыления хлорофилла, в результате

которой происходит отщепление спиртов – метилового и фитола, а

двухосновная кислота хлорофиллин дает соль:

Соли хлорофиллинов имеют зеленую окраску, но отличаются от

хлорофилла нерастворимостью в бензине.

Указать, какие вещества растворены в спирте и какие в бензине,

имея в виду, что желтые пигменты со щелочью не реагируют.

в) Получение феофитина и восстановление

металлорганической связи . Взять две пробирки со спиртовой

вытяжкой пигментов и добавить в них по 2–3 капли 10 ной соляной

кислоты. Получается буровато-оливковое вещество – феофитин –

продукт замещения магния в молекуле хлорофилла двумя атомами

водорода:

В одну из пробирок с феофитином внести на кончике ножа

немного уксуснокислого цинка и довести раствор до кипения. Если

окраска не изменится, добавить еще уксуснокислого цинка и

продолжать нагревание. Отметить изменение окраски благодаря

восстановлению металлорганической связи (атом цинка становится на

то место, где раньше был магний). Написать уравнение реакции.

Тема 2. Разделение пигментов методом бумажной

хроматографии по Закржевскому Целью настоящей работы является освоение метода разделения

смеси пигментов зеленого листа с помощью восходящей бумажной

хроматографии.

Хроматографический метод разделения пигментов, впервые

предложенный русским ученым М.С. Цветом, заключается в том, что

раствор, содержащий смесь пигментов, пропускается через слой

адсорбента. Различные пигменты, обладая неодинаковой

30

растворимостью в данном растворителе и разной адсорбируемостью,

передвигается по мере движения растворителя с различной скоростью

и располагается на адсорбенте в разных местах. Чем больше

растворимость пигмента в растворителе и чем хуже он адсорбируется

данным адсорбентом, тем быстрее он будет передвигаться и тем

дальше будет располагаться зона этого пигмента.

Материалы и оборудование: ступки, мел, хроматографическая бумага

13х18, микропипетки на 100 – 200 мкл, листья растений, хроматографическая

камера, разгоночная смесь (бензол, петролейный эфир 2:1), скрепки, бумажные

фильтры, воронки, пробирки, штативы, стекла для камер, линейка.

Ход работы: нарезать 1 – 2 г листьев ножницами в ступку без

средней жилки, добавить на кончике ножа мел (СаСО3) и песок.

Растереть до гомогенной массы с добавлением небольшого количества

спирта или ацетона, гомогенат залить 10 – 15 мл спирта или ацетона,

пестиком размешать и отфильтровать через бумажный фильтр. На

хроматографической бумаге очертить карандашом стартовую линию

на расстоянии 4 см от нижнего края листа с полями по 1 см с обеих

сторон. Нанести с помощью микропипетки 0,5 – 1 мл экстракта

пигментов на стартовую линию путем многократного повторения.

Ширина полоски нанесенного экстракта не должна превышать 0,7 см.

Бумагу свернуть трубочкой и закрепить скрепками и поставить

хроматографическую камеру на дне которой налита разгоночная смесь,

состоящая из толуола (можно бензол) петролейного эфира 2:1. Закрыть

хроматографическую камеру стеклом и обвернуть черной тканью.

Время разгонки 40 – 60 мин. Фронт растворителя не должен доходить

до верхнего края листа на 1 см. Пигменты распределяются следующим

образом сверху вниз: каротин, лютеин, виолоксантин, хлорофилл “а”,

хлорофилл “б” (рис. 4).

Хроматограмму вынуть немедленно отметить линию фронта

растворителя, высушить, полосы обвести простым карандашом,

измерить расстояние от стартовой линии до фронта растворителя, а

также расстояние, пройденное каждым пигментом от стартовой линии

до середины полосы. Вычислить Rf для каждого пигмента, зная, что Rf

это отношение расстояния, пройденного данным веществом к фронту

растворителя в см. Занести полученные результаты в таблицу 6 и

сделать выводы.

31

Рис. 4. Вид хроматограммы с разделенными пигментами.

Таблица 6

Электрофоретическая подвижность пигментов листьев высших

растений

Расположение полос

пигментов на

хроматограмме сверху

вниз

Расстояние, пройденное в см

L R f

l

в относительных

единицах

фронтом

растворителя (L)

пигментом

(l)

Каротин

Лютеин

Виолаксантин

Хлорофилл а

Хлорофилл б

Вопросы:

1) Какие пигменты входят в состав пигментной вытяжки из листьев высших

растений? 2) К какой группе химических соединений относятся хлорофиллы и

какие реакции это доказывают? 3) Какова функция хлорофиллов в световой фазе

фотосинтеза? 4) Какой участок молекулы хлорофилла обеспечивает “запуск”

световых реакций? 5) Какова роль “фитольного хвоста”? 6) Какими физическими

свойствами обладает спиртовая вытяжка хлорофилла? 7) Какова химическая

природа и физиологическая роль каротиноидов?

32

Работа 6. Обнаружение фотосинтеза методом крахмальной

пробы (проба Сакса)

Цель занятия: Заложить опыт для проведения пробы Сакса.

Наиболее простой метод обнаружения фотосинтеза –

крахмальная проба. Она состоит в том, что лист, выдержанный на

свету, обесцвечивают спиртом, а затем обрабатывают раствором йода,

окрашивающего образовавшийся в хлоропластах крахмал в темно–

синий цвет. Опыт рекомендуется проводить со срезанными и

поставленными в воду листьями, у которых крахмал накапливается

быстрее, так как отток отсутствует.

Для наблюдения за процессом образования первичного крахмала

необходимо, чтобы в начале опыта листья не содержали этого

вещества. Обескрахмаливания листьев можно достичь, выдерживая их

в течение нескольких дней в темноте; за это время весь имевшийся в

листьях крахмал превратится в сахара, которые будут частично

отведены в стебель, а частично израсходованы на дыхание клеток

листа.

Материалы и оборудование: 1) пеларгония (желательно пестролистная),

выдержанная в течение 2–3 суток в темноте; 2) спирт; 3) раствор I в KI

(концентрированный раствор, разбавленный в 3 раза водой); 4) 30 %– ный раствор

щелочи; 5) лампа электрическая на 200 – 300 Вт; 6) ножницы; 7) пинцет; 8) штатив

с 2 пробирками; 9) спиртовка; 10) коническая колбочка; 11) фарфоровая чашка; 12)

водяная баня; 13) 2 пробковых кружка диаметром 1,0 – 1,5 см с булавкой; 14)

электроплитка; 15) колпак стеклянный, установленный на куске стекла; 16)

ланолин или вазелин; 17) маленькие стаканчики (2 шт.); 18) воронка; 19) держалка

для пробирок; 20) бритва; 21) спички; 22) цветные карандаши; 23) картон; 24)

канцелярские скрепки.

Ход работы. Обильно полить растение и выдержать его в течение

2–3 дней в темноте (или закрыть отдельные листья

светонепроницаемыми чехлами).

Проверить полноту обескрахмаливания листа, для чего отрезать

кусочек листа, поместить в пробирку и кипятить его с водой, чтобы

33

убить клетки. Воду слить, прилить спирт и кипятить на водяной бане

до полного извлечения пигментов. Нагревать следует осторожно, так

как при бурном кипении может произойти выплескивание спирта из

пробирки. Слить спирт, размягчить кусочек листа, наливая на него

небольшое количество воды (после действия спирта ткани становятся

хрупкими), поместить его в фарфоровую чашку и облить раствором

йода. Отсутствие синего окрашивания покажет, что крахмала в листе

нет, если же проба с йодом окажется положительной, то с данным

листом ставить опыта не следует, так как в этом случае будет трудно

наблюдать за образованием нового крахмала.

Срезать лист, обновить бритвой срез под водой и опустить

черешок в пробирку с водой. Затемнить часть листовой пластинки, для

чего наложить на верхнюю и нижнюю поверхности листа пробковые

кружки точно один против другого и закрепить их на листе булавкой.

Можно поставить опыт иначе: покрыть лист с обеих сторон

кусками картона с вырезанной в них фигурой или приложить к листу

контрастный, не очень темный фотонегатив, прикрепив к листу

канцелярскими скрепками.

Другой лист (также проверенный на отсутствие крахмала)

поставить черешком в стаканчик с водой и поместить в атмосферу,

лишенную диоксида углерода, для чего рядом с листом поставить сосуд

с крепким раствором щелочи и закрыть стеклянным колпаком. Для

полной герметичности следует поставить стакан с листом и сосуд со

щелочью на кусок стекла, а края колпака смазать ланолином или

вазелином. Выставить оба листа на яркий солнечный или

электрический свет (при использовании лампы накаливания 200–300

Вт во избежание перегрева лист должен находиться на расстоянии не

менее 30 см от лампы).

Через 2 ч (или более) обработать листья так же, как и кусочки, в

которых проверяли полноту обескрахмаливания: облить кипящей

водой, обесцветить спиртом, размягчить погружением в воду и облить

раствором йода (лист обесцвечивают в колбе, закрытой для

уменьшения испарения спирта воронкой). Для получения более

34

наглядных результатов листья с экранами можно оставить до

следующего занятия (рис. 5).

Записать результаты, отмечая, в каких частях листа образовался

крахмал (для пестрого листа обратить внимание на белые участки) и

сделать соответствующие рисунки. Обработанный раствором йода

лист можно сохранить, засушив его между кусками бумаги под

прессом.

Рис. 5. Обнаружение фотосинтеза методом крахмальной пробы (проба

Сакса).

В выводах указать, какие условия необходимы для процесса

фотосинтеза.

Вопросы:

1) В чем заключается фотосенсибилизирующие свойства хлорофилла? 2)

Как реагирует молекула хлорофилла на действие кванта света? 3) Что такое

фотовозбужденное состояние хлорофилла? 4) Какой простой опыт доказывает, что

для образования ассимилятов в процессе фотосинтеза необходим диоксид

углерода?

35

ФИЗИОЛОГИЯ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ РАСТЕНИЙ

Работа 7. Микрохимический анализ золы. Обнаружение

нитратов в растениях

Цель занятия: Открыть в золе растений некоторые

макроэлементы.

Зола, получаемая при сжигании растений, содержит большое

количество элементов, среди которых различают макроэлементы

(фосфор, сера, калий, кальций, магний) и микроэлементы (железо,

медь, цинк, марганец, молибден, бор и ряд других).

Для изучения химического состава золы можно использовать

микрохимический метод, для которого требуется небольшое

количество золы.

Материалы и оборудование: 1) зола, полученная при сжигании листьев,

или табачный пепел; 2) 10 %– ный раствор соляной кислоты; 3) 1 %– ная H2SO4; 4)

10 %– ный раствор NH3; 5) 1 %– ный раствор Na2HPO4; 6) 1 %– ный раствор

молибдата аммония в 1 %– ной HNO3; 7) 1 %– ный раствор желтой кровяной соли

в капельнице; 8) дистиллированная вода в стакане; 9) пробирки (2 шт.); 10) воронка

маленькая; 11) бумажный фильтр; 12) стеклянные палочки с заостренным концом

(2 шт.); 13) предметные стекла (3 шт.); 14) микроскоп; 15) кусочки фильтровальной

бумаги.

Практические задания:

1. Микрохимическим методом с помощью качественных реакций

обнаружить в золе растений Ca, Mg, P, Fe;

2. Используя 1 % раствор дифениламина обнаружить наличие

(или отсутствие) нитратной формы азота в вегетативных и запасающих

органах растений.

3. Сделать выводы.

Тема 1. Микрохимический анализ золы. Насыпать в пробирку

небольшое количество золы и залить ее примерно четырехкратным

объемом 10 %– ной НС1. Отфильтровать полученный раствор в чистую

пробирку через маленький фильтр. Провести на предметных стеклах

реакции на Са, Mg и Р. Для этого тупым концом стеклянной палочки

36

нанести на предметное стекло маленькую каплю вытяжки и на

расстоянии 4–5 мм от нее – каплю соответствующего реактива. Затем

заостренным концом стеклянной палочки соединить капли

дугообразным каналом. В месте соединения произойдет реакция,

причем по краям канала будет наблюдаться быстрая кристаллизация

продуктов реакции. Рассмотреть образующиеся кристаллы в

микроскоп. Стеклянные палочки после нанесения каждого реактива

необходимо вымыть и вытереть фильтровальной бумагой.

Рис. 6. Кристаллы сульфата кальция.

Рис. 7. Кристаллы фосфорноаммиачномагнезиальной соли.

Реактивом на ион кальция служит 1%– ная H2SO4. При этом

хлорид кальция, содержащийся в вытяжке, реагирует с кислотой по

уравнению:

СаС12 + H2SO4 → CaSO4 + 2HC1

Образующийся гипс осаждается в виде игольчатых кристаллов

(рис. 6).

Для обнаружения магния к капле испытуемого раствора следует

сначала добавить каплю раствора аммиака, а затем соединить

канальцем с реактивом, которым служит 1 %– ный раствор

фосфорнокислого натрия.

Образуется фосфорноаммиачномагнезиальная соль (рис. 7),

кристаллизующаяся в виде прямоугольников, крышечек, звезд или

крыльев, в результате следующей реакции:

MgCl2 + Na2HPO4 + NH3 → NH4MgPO4 + 2NaCl

37

Для обнаружения фосфора соединить каплю вытяжки с 1 %– ным

раствором молибдата аммония в азотной кислоте. Получается

зеленовато – желтый осадок фосфорномолибденовокислого аммония

(рис. 8):

H3PO4+ 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 → (NH4)3PO4•12MoO3 +

21NH4NO3+12H2O

Рис. 8. Кристаллы фосфорномолибденовокислого аммония.

Железо можно обнаружить с помощью раствора желтой

кровяной соли. В результате реакции образуется берлинская лазурь:

4FeCl3 + 3K4[Fe(CN)6] → Fe4[Fe(CN)6]3+12KCl

Реакцию на железо рекомендуется проводить в пробирке: к

остатку зольной вытяжки добавлять по каплям раствор желтой

кровяной соли до появления синей окраски. Результаты работы

оформить в виде рисунков кристаллов гипса,

фосфорноаммиачномагнезиальной соли и

фосфорномолибденовокислого аммония.

Записать уравнения реакций.

Тема 2. Обнаружение нитратов в растениях

Материалы и оборудование: 1) растения, выращенные на питательном

растворе или в почве; 2) 1 %– ный раствор дифениламина в концентрированной

серной кислоте в капельнице (хранить в темноте; капельницу поставить на крышку

чашки Петри, чтобы предотвратить попадание на стол капель этой едкой

жидкости); 3) ножницы; 4) белая фарфоровая тарелка; 5) стеклянная палочка; 6)

стакан с водой; 7) фильтровальная бумага.

38

Соли азотной кислоты (нитраты), поглощаемые корнями из

почвы, восстанавливаются в растении до аммиака через ряд этапов,

каждый из которых катализирует особый фермент (нитратредуктаза,

нитритредуктаза, гипонитритредуктаза и гидроксиламинредуктаза).

Аммиак связывается кетокислотами (– кетоглутаровой,

щавелевоуксусной и пировиноградной), образуя в процессе

восстановительного аминирования первичные аминокислоты –

глутаминовую, аспарагиновую и аланин. Другие аминокислоты

образуются путем трансаминирования или ферментативного

превращения одних аминокислот в другие. Сказанное можно

представить в виде схемы:

NO–3 → NO–

2 → NO– → NH2OH → аминокислоты→ нитрат →

→ нитрит → гипонит → гидроксиламин

При достаточном содержании растворимых углеводов и высокой

активности соответствующих ферментов перечисленные

биохимические процессы происходят в корнях. Однако часть нитратов

(нередко весьма значительная) может пройти через паренхиму корня в

неизменном виде. В этом случае нитраты попадают в сосуды ксилемы

и поднимаются с восходящим током к листьям, где и происходит их

восстановление. Для восстановления нитратов требуется АТФ,

образующаяся в процессе окислительного или фотофосфорилирования.

Определение содержания нитратов в соке, отжатом из стеблей

или черешков, позволяет судить о восстановлении нитратов в корнях:

чем меньше обнаруживается ионов NO3– в соке, тем полнее проходит

этот процесс в клетках корня. Сопоставление содержания нитратов в

черешках и листовых пластинках дает представление о

нитратредуктазной активности клеток мезофилла.

Для обнаружения нитратов можно использовать реакцию с

дифениламином, который в присутствии иона NO3– образует синюю

анилиновую краску. По интенсивности посинения можно

приблизительно судить о количестве нитратов в исследуемом объекте.

Ход работы. Поместить на белую тарелку кусочки черешка и

листовой пластинки какого - либо растения. Размять эти кусочки

стеклянной палочкой (палочку каждый раз споласкивать чистой водой

и вытирать) и облить раствором дифениламина в крепкой серной

кислоте. Исследовать 2–3 растения разных видов. Желательно также

проанализировать растения одного вида, произраставшие в разных

условиях (на солнце и в тени, до и после подкормки минеральными

удобрениями и т. п.).

Результаты записать в таблицу 7, оценивая интенсивность

окраски по пятибалльной шкале.

39

Таблица 7

Обнаружение нитратов в растениях

Растение Условия Количество нитратов

в черешке В листовой пластинке

Ответить на вопросы:

1) В каких органах исследованных растений восстанавливались нитраты? 2)

Как влияют внешние условия на содержание нитратов в листьях? 3) Какие

макроэлементы содержатся в растительной золе и какое это может иметь

практическое применение?

ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ В РАСТЕНИИ

Работа 8. Обнаружение запасных сахаров в растительном

материале

Цель занятия: Убедиться в наличие различных форм сахаров в

запасающих органах растений.

Все моносахара, а также дисахариды типа мальтозы благодаря

присутствию альдегидной или кетонной группы являются

редуцирующими, т. е. обладают восстанавливающими свойствами.

Распространенная в растениях сахароза – нередуцирующее вещество,

так как ее молекула состоит из остатков глюкозы и фруктозы,

соединенных за счет альдегидной группы глюкозы и кетонной группы

фруктозы.

Характерная реакция на редуцирующие сахара – реакция

восстановления фелинговой жидкости. Эту жидкость готовят

непосредственно перед употреблением путем смешивания равных

объемов раствора медного купороса и раствора щелочи с сегнетовой

солью. Последнюю прибавляют для того, чтобы не дать

образовавшемуся гидрату оксида меди (II) выпасть в осадок:

40

Для обнаружения редуцирующих сахаров, т. е. сахаров с

альдегидной, к исследуемому раствору приливают фелингову

жидкость в равном объеме и доводят до кипения. При этом СuО

восстанавливается с образованием кирпично– красного осадка Сu2О:

Для обнаружения сахарозы сначала необходимо подвергнуть ее

гидролизу на глюкозу и фруктозу и лишь затем провести реакцию с

жидкостью Фелинга. По количеству осадка Сu2О можно судить о

количестве редуцирующих веществ как содержавшихся в исходном

материале, так и образовавшихся в результате гидролиза сахарозы.

Материалы и оборудование: 1) свежий или высушенный растительный

материал (лук, морковь, сахарная свекла); 2) глюкоза; 3) сахароза; 4) 4 %– ный

раствор CuSO4; 5) щелочной раствор сегнетовой соли (200 г сегнетовой соли и 150

г КОН или NaOH в 1 л воды); 6) 20 %– ная НО в капельнице; 7) Nа2СО3

порошкообразный; 8) тарелки (3 шт.); 9) скальпели (3 шт.); 10) штатив с

пробирками с резиновыми колечками (15 шт.); 11) водяная баня; 12) спиртовка; 13)

мерный цилиндр на 100 – 200 мл; 14) колба для фелинговой жидкости; 15) пипетки

на 2 – 3 мл (3 шт.); 16) держалка для пробирок; 17) воронки (3 шт.); 18) бумажные

фильтры; 19) стакан химический; 20) спички.

Практические задания: 1. С помощью реакции Фелинга обнаруживают в запасающих

органах растений (корнеплодах, луковицах) моно– и дисахара.

2. Делают вывод о наличии различных форм сахаров.

Ход работы. Перед тем как приступить к анализу растительного

материала, следует приготовить фелингову жидкость и проделать

следующие качественные реакции:

3) поместить в пробирку щепотку глюкозы, растворить в

небольшом количестве воды, прилить равный объем фелинговой

жидкости и нагреть до кипения;

2) растворить в воде щепотку сахарозы, добавить равный объем

фелинговой жидкости и довести до кипения;

41

3) приготовить в пробирке раствор сахарозы, добавить 2–3 капли

20 %– ной НСl и кипятить в течение 1 мин; нейтрализовать кислоту

содой (сыпать до прекращения выделения СО2), прилить равный объем

фелинговой жидкости и вновь довести до кипения.

Отметить, образуется ли в пробирках кирпично– красный осадок,

и сделать выводы о причинах наблюдаемых явлений.

Анализ растительного материала. Нарезать на мелкие кусочки

луковицу лука, корнеплоды моркови и сахарной свеклы. Поместить

материал в отдельные пробирки (примерно по ¼ пробирки), залить

небольшим количеством воды и нагревать не менее 5 мин в кипящей

водяной бане. Полученную вытяжку профильтровать и перенести при

помощи пипетки одинаковые порции фильтрата в две чистые

пробирки. С одной порцией проделать реакцию на редуцирующие

сахара, во второй пробирке провести гидролиз сахарозы соляной

кислотой; после нейтрализации кислоты прилить фелингову жидкость

в равном объеме и вновь нагреть до 100 °С.

Полученные результаты записать в таблицу, оценивая количество

Сu2О по пятибалльной шкале.

Таблица 8

Определение редуцирующих сахаров в растительном материале

Объект

Количество Cu2O

без гидролиза после гидролиза

Сделать выводы о присутствии в исследованном материале

редуцирующих сахаров и сахарозы.

ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ

Работа 9. Обнаружение ферментов оксидоредуктаз в

дрожжевых и растительных клетках

42

Цель занятия: Убедиться в наличие ферментов дегидраз и

оксидаз в клетках дрожжей и высших растений.

Оксидазами называют ферменты, активирующие молекулярный

кислород (переносящие на него электроны от окисляемого вещества).

Активированный таким образом кислород соединяется с отщепляемым

от субстрата водородом, образуя воду или пероксид водорода по схеме оксидаза

2АН2 + О2 → 2А + 2Н2О

К этой группе ферментов относится полифенолоксидаза,

окисляющая полифенолы кислородом воздуха с образованием

соответствующих хинонов:

Пероксидаза – фермент, окисляющий полифенолы и

ароматические амины кислородом пероксида водорода: пероксидаза

дифенол + НА → хинон + 2Н2О

Обнаружить полифенолоксидазу можно при помощи раствора

гваяковой смолы, который в присутствии этого фермента изменяет

окраску из желтой в синюю. Объясняется это тем, что содержащиеся в

гваяковой смоле полифенолы, не способные самопроизвольно

реагировать с молекулярным кислородом, окисляются

активированным кислородом.

Для обнаружения пероксидазы можно использовать ту же

реакцию окисления полифенолов гваяковой смолы. Но так как

пероксидаза с молекулярным кислородом не реагирует, к раствору

гваяковой смолы необходимо добавить пероксид водорода. Вместо

гваяковой смолы можно использовать раствор пирокатехина.

Работу удобно проводить на двух срезах исследуемой части

растения, нанося на первый срез раствор гваяковой смолы, на второй –

растворы гваяковой смолы и пероксида водорода: посинение первого

среза свидетельствует о присутствии в клетках полифенолоксидазы,

тогда как посинение второго среза есть результат совместного действия

двух ферментов – полифенолоксидазы и пероксидазы или – в случае

отсутствия в данном объекте первого фермента – одной пероксидазы

(показатель присутствия обоих ферментов – более быстрое посинение

второго среза).

43

Тема 1. Обнаружение полифенолоксидазы и пероксидазы

Материалы и оборудование: 1) клубни картофеля – свежий и вареный; 2)

побеги конского каштана, дуба и других древесных растений, корни хрена и

редьки; 3) 1 %– ный водный раствор пирокатехина в капельнице; 4) 3 %– ный

раствор Н2О2 в капельнице; 5) скальпель; 6) пинцет; 7) электроплитка; 8) тарелка;

9) стаканы с водой (2 шт.); 10) фильтровальная бумага.

Практические задания:

1. Готовиться вытяжка из дрожжей и срезы тканей растительных

органов (картофеля).

2. С помощью качественных реакций обнаруживается активность

ферментов дегидразы (НАД) в дрожжах, полифенолоксидазы и

пероксидазы – в клетках высших растений.

3. Делается вывод о наличие или отсутствии в исследуемых

объектах ферментов оксидоредуктаз.

Ход работы. Поместить на тарелку два кружка картофеля и

облить их одновременно раствором гваяковой смолы (или

пирокатехина), причем второй срез дополнительно обработать каплей

раствора пероксида водорода. Для контроля обработать таким же

образом материал, предварительно подвергнутый кипячению.

Исследовать несколько объектов, не допуская при этом

попадания сока из одного объекта на срез другого (скальпель,

используемый для разрезания исследуемых объектов, необходимо

каждый раз мыть и вытирать).

Результаты записать в таблицу 9, отмечая скорость появления

синей окраски (в баллах).

В выводах указать наличие или отсутствие в исследуемых

объектах полифенолоксидазы и пероксидазы и ориентировочно

оценить активность этих ферментов (полифенолоксидазы – по

изменению окраски 1– го среза, пероксидазы – по разности скоростей

изменение окраски 2– го и 1– го срезов).

Таблица 9

Обнаружение полифенолоксидазы и пероксидазы в растительных

объектах

Объект

Изменение окраски (потемнение среза) при действии

пирокатехина пирокатехина + H2O2

44

Тема 2. Обнаружение дегидраз и оксидаз в растении

Материалы и оборудование: 1) прессованные дрожжи, 2) клубни

картофеля, 3) 5 % раствор сахарозы, 4) пробирки, 5) фарфоровые ступки, 6)

спиртовка, 7) раствор метиленовой сини, 8) водяная баня.

Практические задания:

1. Обнаружение дегидраз в растении по восстановлению

метиленового синего.

2. Обнаружение оксидаз при окислении лейкосоединения

метиленового синего.

Ход работы: 1. 5г прессованных дрожжей растереть, прибавляя 30 мл 5 % р-ра

сахарозы.

Взвесь дрожжей, содержащую дегидразы разлить в две пробирки,

I пробирка – опытная

II пробирка – контрольная

Содержимое контрольной пробирки прокипятить в течении 5

минут.

В обе пробирки прибавить по 5 капель метиленовой сини и

поставить их в водяную баню при 450С на 10– 15 мин. Наблюдать.

N(CH3)

2S

N

(CH3)

2N

Cl

N(CH3)

2S

N

(CH3)

2N

Cl

H

H

+ HAD .H2

Мeтиленовая синь

(голубая)

Лeйкосоединениe мeтилeновой сини (бeсцвeтноe)

Происходит обесцвечивание метиленовой сини в результате

образования лейкосоединения. Донором водорода является

которая образуется при сбраживании

сахарозы клетками дрожжей.

2. Непосредственно перед опытом приготовить вытяжку из

клубня картофеля, в которой будут присутствовать оксидазы (натереть

картофель и процедить через марлю, добавить немного воды).

45

В первую (опытную) пробирку с лейкосоединением метиленовой

сини прибавить 2 мл картофельного сока.

Наблюдать.

Происходит восстановление голубой окраски метиленовой сини

– окисление её в результате отнятия водорода при активном участии

ферментов оксидазной группы, содержащихся в картофельном соке.

Тема 3. Газометрическое определение каталазы

Материалы и оборудование: 1) растительный материал; 2)

дистиллированная вода; 3) 5 %– я перекись водорода; 4) прибор для определения

активности каталазы (каталазиметр); 5) реакционный сосуд; 6) мерная колба на 100

мл; 7) мерный цилиндр на 10 мл; 8) пипетка на 5 мл; 9) песочные часы; 10) весы;

11) мел; 12) песок; 13) ступка с пестиком; 14) стеклянные палочки.

Каталаза так же, как и пероксидаза, относится к оксидазам,

окисляющим субстрат кислородом перекиси водорода. Но главная

функция каталазы – расщепление перекиси водорода на воду и

молекулярный кислород. Ядовитый для живых тканей продукт обмена

веществ Н2О2 обезвреживается при участии каталазы. По химической

природе каталаза – гемопротеид. Содержится она во всех тканях и

органах растений, но активность её различна и часто коррелирует с

активностью процессов жизнедеятельности организма.

Метод определения активности фермента основан на

способности каталазы разлагать перекись водорода с выделением

газообразного кислорода. Поскольку количество перекиси водорода,

подвергнувшейся разложению, зависит от активности фермента,

оказывается возможным по количеству кислорода и скорости его

выделения судить об активности каталазы.

Если непосредственно измеряется объем газа, то такой метод

называется газометрическим.

Практические задания:

1. Готовится вытяжка растительного материала для определения

активности фермента каталазы.

46

Обнаружение каталазы в растении по выделению газообразного

кислорода.

Ход работы:

1. Взять навеску листьев или частей растения массой 4 г, добавить

0,2 г мела (для придания щелочной реакции), щепотку песку и

тщательно растереть в ступке с небольшим количеством

дистиллированной воды. Растертую массу по воронке перенести в

мерную колбу на 100 мл и довести дистиллированной водой до метки.

2. Колбу с растительным экстрактом оставить стоять на 15 минут.

В это время приготовить все части прибора каталазиметра для

определения активности каталазы и проверить его герметичность.

3. По истечении 15 минут, из колбы с помощью мерной пипетки

взять 10 мл экстракта вместе со взвесью и перенести в одно отделение

реакционного сосуда (каталазника). В другое отделение сосуда

поместить 5 мл перекиси водорода. Реакционный сосуд подсоединить

к остальной части прибора каталазиметра (рис. 9).

Рис. 9. Прибор для определения активности каталазы: 1 – каталазник; 2 –

стеклянный тройник; 3 – винтовой зажим; 4 – стеклянная груша; 5 – бюретка на

50 мл.

4. Жидкость в измерительной бюретке установить на ноль.

Движением реакционного сосуда смешать находящиеся там жидкости.

47

5. Отметить количество вытесненной жидкости,

соответствующей объему выделившегося кислорода через следующие

интервалы времени: 1мин, 2 мин, 3 мин, 4 мин, 5 минут.

6. Опыт проводят в трехкратной повторности и по средним

значениям строят график активности фермента каталазы в зависимости

от времени. По оси ординат откладывают количество выделившегося

кислорода, а по оси абсцисс – время в минутах. Результаты опыта

занести в таблицу 10.

Таблица 10

Определение активности каталазы в различных растительных тканях

Объект Навеска, г

Время опыта,

мин

О2,

выделенный за

время опыта,

мл

Активность

каталазы, мл

О2, на г

сырого

вещества за

время опыта

В выводе указать активность каталазы исследуемого объекта и

сравнить с активностью других объектов.

Вопросы:

1) Какие группы ферментов – оксидоредуктаз участвуют в анаэробных

реакциях окисления? 2) В чем состоит особенность биохимического механизма

окислительного действия полифенолоксидазы и пероксидазы? 3) Какую реакцию

катализирует фермент каталаза и в каких физиолого - биохимических процессах

необходимо его действие?

48

ФИЗИОЛОГИЯ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ

Работа 10. Закладка опыта по определению влияния

различных регуляторов роста растений на прорастание семян

Цель занятия: 1. Заложить опыт по изучению влияния

различных концентраций гиббереллина на прорастание семян салата.

2. Определить задерживающее и стимулирующее действие

гетероауксина на рост корней.

Тема 1. Влияние гиббереллина на прорастание семян салата

Материалы и оборудование: 1) семена салата, 2) раствор ГК 1, 5, 25 мг/л, 3) химические

стаканы на 50– 150 мл, 4) пробирки, полоски фильтровальной бумаги, 5) резиновые колечки, 6)

нитки, 7) черная бумага, 8) ножницы, 9) полоски миллиметровой бумаги.

Природный фитогормон гиббереллин прерывает покой семян,

стимулирует зацветание растений длинного дня и двулетних растений

в течении первого года жизни, стимулирует синтез фермента альфа –

амилазы в семенах, и рост партенокарпических плодов.

Ход работы: Взять полоску фильтровальной бумаги длиною 10–

15 см и шириною 6– 8 см. Сделать надрез на глубину 1– 1,5 см на

расстоянии 0,7 –1 см (рис.10) по длине полоски. Обернуть полоской

верхнюю часть пробирки закрепить резиновым кольцом или завязать

нитками. Отогнуть лепестки надрезов. Вырезать из фильтровальной

бумаги 2 кольца, которые можно надеть на пробирку на отогнутые

лепестки (рис.11) и по размеру круга стакана.

Разложить семена салата на бумажное кольцо. Надеть еще одно

бумажное кольцо, которое по размеру равно площади круга стакана для

устойчивости пробирки, вставить в пробирку полоску миллиметровой

бумаги для измерения роста проростков. Налить в стакан 50– 70 мл

раствора гиббереллина /не выше уровня семян/ по следующей схеме:

1. дистиллированная вода

2. раствор ГК 0,5 мг/л

3. раствор ГК 1,0 мг/л

4. раствор ГК 5,0 мг/л

Через несколько дней учесть прорастание семян салата, записать

в таблицу и сделать выводы.

49

Таблица 11

Влияние гиббереллина на прорастание семян салата

Вариант Число

проросших

семян, шт

Средняя

длина

стебля, см

Средняя

длина

корня, см

Количество

корней 1

проростка,

шт.

Цвет

листочков

в баллах

Контроль

ГК 1 мг/л

и т.д.

Рис. 10. Надрезы на полоске фильтровальной бумаги.

Тема 2. Задерживающее и стимулирующее действие

гетероауксина на рост корней

Материалы и оборудование: 1) семена кукурузы (Zea mays L.) или

пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.); 2) 0,01 %– й раствор гетероауксина; 3)

чашки Петри; 4) пипетки на 1 мл; 5) мерные цилиндры на 10 мл; 6) фильтровальная

бумага.

Гетероауксин, или ß– индолилуксусная кислота, служит

природным стимулятором роста, относящимся к группе ауксинов. Он

встречается в тканях всех высших растений, регулируя рост, движения

и корреляцию органов. Гетероауксин прост по химическому строению,

поэтому синтезируется промышленным способом. В продажу

поступает калиевая или натриевая соль гетероауксина. В практике

растениеводства гетероауксин чаще всего применяют для

стимулирования укоренения черенков и улучшения роста корневых

систем.

надрезы

50

Гетероауксин, как любой регулятор роста, в зависимости от

концентрации раствора может не только активировать рост, но и

задерживать или полностью приостанавливать его.

Рис. 11. Установка для определения влияния гиббереллина на прорастание

семян салата.

Таблица 12

Влияние гетероауксина на рост корней

Вариант опыта Длина корешков,

см

Средняя длина

корешков на одно

растение, см

Длина корешков,

% к контролю

Вода (контроль)

Раствор

гетероауксина

0,01 %

Раствор

гетероауксина

0,001 %

Раствор

гетероауксина

0,0001 %

Раствор

гетероауксина

0,00001 %

51

Ход работы:

1. 5 чашек Петри выстилают фильтровальной бумагой,

увлажненной 9 мл дистиллированной воды или раствора

гетероауксина: 0,01; 0,001; 0,0001; 0,00001 %– й концентрации.

2. Для получения указанных концентраций 1 мл исходного 0,01 %

- го раствора гетероауксина наливают в мерный цилиндр на 10 мл и

доливают водой до черты, тщательно перемешивают.

3. Затем 9 мл помещают в чашку Петри, а оставшийся 1 мл

разбавляют водой до 10 мл.

4. На увлажненную фильтровальную бумагу раскладывают по 10

зерен кукурузы или пшеницы, закрывают чашки Петри крышкой и

помещают их в темное место при температуре 20 – 25ºС.

5. Через неделю измеряют длину корешков и делают вывод о

задержке и стимулировании роста корней в зависимости от

концентрации гетероауксина.

Работа 11. Определение влияние различных концентраций

гибберелловой кислоты на прорастание семян салата и

гетероауксина на рост корней у различных растений

Цель занятия: 1. Изучить действие гиббереллина на ростовые

процессы двудольного растения – салата; 2. Выявить влияние

различных концентраций гетероауксина на рост корней растений (опыт

заложен на предыдущем занятии).

Практические задания: 1. Проводятся учеты по вариантам опыта: а) количество

проросших семян; б) морфометрические показатели проростков.

2. Делают выводы о влиянии гибберелловой кислоты на процесс

прорастания семян и гетероауксина на рост корней у различных

растений.

3. Провести статистическую обработку полученных результатов и

вычислить % ошибки опыта.

Вопросы:

1) К какой группе химических соединений относится гиббереллин? 2) Какие

физиологические процессы, кроме прорастания семян, может стимулировать

гиббереллин в растениях? 3) Что такое “концентрационная зависимость действия

фитогормонов”?

52

ФИЗИОЛОГИЯ СТРЕССА

Работа 12. Определение водоудерживающей способности

тканей изолированных листьев растений методом прямого

завядания по Арланду

Цель занятия: Сравнить водоудерживающую способность

листьев парковой растительности окрестностей г. Симферополя.

Метод, предложенный Арландом, заключается в учете скорости

потери воды при завядании проростков или срезанных побегов путем

многократного взвешивания. Интервал между первым и вторым

взвешиванием должен составлять 30 мин для травянистых растений и

1–2 ч для древесных пород.

Арланд считает, что факторы, повышающие “скорость

водоотдачи”, снижают продуктивность растений, и наоборот,

оптимальным условиям соответствует минимальная потеря воды

завядающими растениями. Исследование “водоудерживающей

способности” дает возможность быстро определить потребность

растений в удобрениях, проводить сравнительное изучение сортов и т.

д. Величины, полученные при измерении водоотдачи растений, взятых

непосредственно с поля и имеющих разную степень насыщения водой,

не всегда могут служить основой для заключений. Растения должны

быть подготовлены к исследованию так, чтобы их клетки были

приведены в сравнимое состояние. Для этого их выращивают в

одинаковых условиях и насыщают водой.

Материалы и оборудование: 1) побеги различных древесных и травянистых растений,

проростки злаков в фазе четырех листьев, насыщенные водой (вечером накануне определения

срезать острым скальпелем или бритвой, поставить в воду с температурой 25–28 0С и закрыть

колпаком или поставить в шкаф с плотно закрывающимися дверцами); 2) скальпель; 3) весы

технические с разновесом; 4) фильтровальная бумага.

Практические задания: 1. Изолированные листовые пробы подвергают завяданию.

2. В течение 2– х часов и через каждые 0,5 часа проводят

повторные взвешивания для определения потери воды.

3. Данные выражают в виде графика.

4. Делают вывод о скорости потери воды листьями и

засухоустойчивости изучаемых тканей.

Ход работы. Листовая проба из 10 листьев, взятая с учетом

ярусности и расположения листьев на побеге, доставляется в

53

лабораторию в целлофановом мешке. Листья, взвешивают и

раскладывают каждую пробу на отдельном листе бумаге для завядания

(нижней стороной листа к верху). Таблица 13

Определение водоудерживающей способности тканей изолированных

листьев растений

Объект Исходная

масса 10

листьев

Потеря воды при завядании за время (час)

0,5 1,0 1,5 2,0

г % г % г % г %

Исходный вес пробы записывают на том же листе. Через 0,5, 1,

1,5 2, 2,5, 3 часа завядания пробы взвешивают с целью определения

потери воды за данный промежуток времени. Определяем потерю воды

листьями за каждый срок в % к исходному весу. Результат выражается

графически. Метод является сравнительным. Результаты вносятся в

таблицу 11.

Сделать вывод, сопоставляя водоудерживающую способность

разных объектов.

54

Вопросы:

1) Какие древесные растения окрестности г. Симферополя обладают

наибольшей водоудерживающей способностью? 2) Можно ли по величине

водоудерживающей способности судить о засухоустойчивости растения в целом?

3) Совпадает ли способность удерживать воду и жаростойкость у отдельных

объектов?

55

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и

биотехнологии на их основе : учебное пособие / Р. Г. Бутенко. – М.:

ФБК– ПРЕСС, 1991. – 160 с.

2. Викторов, Д. П. Малый практикум по физиологии растений :

учебное пособие / Д. П. Викторов. – М. : Высш. школа, 1983. – 135

с.

3. Гродзинский, А. М. Краткий справочник по физиологии растений /

А. М. Гродзинский, Д. М. Гродзинский. – К. : Наук. думка, 1973. –

591 с.

4. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта / Б. А. Доспехов. – М. :

Колос, 1973. – 336 с.

5. Дымина, Е.В. Практические занятия по физиологии и биохимии

растений / Е.В. Дымина, И.И. Баяндина. – Новосибирск : НГАУ,

2010. — 136 с.

6. Кузнецов, Вл. В. Физиология растений / Вл. В. Кузнецов, Г. А.

Дмитриева. – М. : Высш. школа, 2006. – 504 с.

7. Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. – М. : Высш. школа. – 1980. –

352 с.

8. Медведев, С. С. Физиология растений. Учебник / С. С. Медведев. –

СПб. С.- Петерб. университет, 2004. – 336 с.

9. Методы биохимического исследования растений / А. И. Ермаков [и

др.]. – Л. : Колос, 1972. – 456 с.

10. Минеральное питание растений: Методические указания для

выполнения лабораторных работ по дисциплине «Физиология

растений» для обучающихся очной формы обучения по

направлению подготовки 35.03.10 «Ландшафтная архитектура» / –

Нижний Новгород: Нижегородский государственный архитектурно-

строительный университет, ЭБС АСВ, 2014.— 74 c.

11. Павленко, В. Б. Анализ экспериментальных данных на компьютере:

[учебное пособие для обучающихся биологического факультета] / В.

Б. Павленко. ― Симферополь, 2007. ― 43 с.

12. Патофизиология сельскохозяйственных культур: учебное

пособие / Кошкин Е.И. – М. : Проспект, 2016.

13. Паушева,З. П. Практикум по цитологии растений / З. П. Паушева. –

М. : Агропромиздат, 1988. – 271 с.

56

14. Плохинский, Н. А. Математические методы в биологии / Н. А.

Плохинский. – М. : Изд– во МГУ, 1978. – 264 с.

15. Полевой, В. В. Физиология растений : учебник для биол. спец. вузов

/ В. В. Полевой. – М. : Высшая школа, 1989. – 464 с.

16. Починок, Х. Н. Методы биохимического анализа растений / Х. Н.

Починок. – К. : Наукова думка, 1976. – 336 с.

17. Практикум по физиологии растений / под ред. Н. Н. Третьякова. –

М. : Агропромиздат, 1990. – 271 с.

18. Рогожин, В.В. Биохимия растений : учебник / В.В. Рогожин .— СПб.

: ГИОРД, 2012 .— 430 с.

19. Рогожин, В.В. Практикум по физиологии и биохимии растений:

Учебное пособие / В.В. Рогожин, Т.В. Рогожина. – СПб.: ГИОРД,

2013. – 352 c

20. Физиология растений / Н. Д. Алехина [и др.]. – М. : Академия, 2005.

– 640 с.

21. Физиология растений : учебник для студ. вузов / под ред. И. П.

Ермакова. – 2– е изд. – М. : Академия, 2007. – 640 с.

22. Якушкина Н. И. Физиология растений / Н. И. Якушкина – М. :

Просвещение, 1993. – 351 с.