expression antimikrobieller peptide in der synovialis der ... · aqua dest. lat. aqua destillata,...
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AusderKlinikfürDermatologie,VenerologieundAllergologie
(Direktor:Prof.Dr.ThomasSchwarz)
imUniversitätsklinikumSchleswig‐Holstein,CampusKiel
anderChristian‐Albrechts‐UniversitätzuKiel
ExpressionantimikrobiellerPeptideinder
SynovialisderPsoriasis‐Arthritis,bei
rheumatoiderArthritisundOsteoarthrose
sowieinderHautderPsoriasis
Inauguraldissertation
zur
ErlangungderDoktorwürde
der
MedizinischenFakultätderChristian‐Albrechts‐UniversitätzuKiel
Vorgelegtvon
HenrikeEdithTessieBierkarre,geb.Kosfeld
ausWesterland/Sylt
Kiel2015
2
Referent: Prof.Dr.med.RegineGläser,KlinikfürDermatologie,
VenerologieundAllergologie
Koreferent: Prof.Dr.med.DeikeVaroga,MVZOrthopädieundChirurgie
TagdermündlichenPrüfung:24.November2016
ZumDruckgenehmigtKiel,den23.Juli2016
Gez.Prof.Dr.med.JohannRoider
4
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................................................................7
1.Einleitung..........................................................................................................................................................................9
2.MaterialundMethoden...........................................................................................................................................11
2.1.Material.......................................................................................................................................................................11
VerwendeteChemikalien........................................................................................................................................11
PufferfürdieImmunhistochemie.......................................................................................................................11
Tris‐Base‐Saline(TBS)‐Puffer(Waschpuffer)............................................................................................11
Citratpuffer..............................................................................................................................................................12
VerwendeteAntikörperundKits........................................................................................................................12
VerwendeteAntikörper......................................................................................................................................13
VerwendeteKits.....................................................................................................................................................15
VerwendeteIsotypkontrollen..........................................................................................................................15
2.2.Methoden...................................................................................................................................................................16
Immunhistochemie....................................................................................................................................................16
HerkunftdesUntersuchungsgutes.................................................................................................................16
HerstellungderSchnittpräparate...................................................................................................................16
GrundlagenderImmunhistochemie.............................................................................................................16
Avidin‐Biotin‐Komplex(ABC)‐Methode.......................................................................................................17
AblaufderImmunhistochemie‐Färbung.....................................................................................................18
Kontrollen.................................................................................................................................................................20
BeurteilungderHautpräparate.......................................................................................................................21
BeurteilungderSynovialispräparate............................................................................................................23
Gesichtsfeldauszählung......................................................................................................................................23
Synovitis‐Score.......................................................................................................................................................24
Statistik...........................................................................................................................................................................26
DerexakteFishertest...........................................................................................................................................26
3.Ergebnisse.....................................................................................................................................................................27
3.1.ImmunhistochemieGelenke..............................................................................................................................27
Psoriasis‐Arthritis(PsA).........................................................................................................................................27
S100A8,S100A9,HNP1‐3undLL‐37..........................................................................................................27
Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3..........................................................................................................28
RheumatoideArthritis(RA)..................................................................................................................................31
5
S100A8,S100A9undHNP1‐3........................................................................................................................31
Psoriasin,RNase7,hBD‐2,hBD‐3undLL‐37............................................................................................31
Osteoarthrose(OA)...................................................................................................................................................34
S100A9,HNP1‐3...................................................................................................................................................34
S100A8,LL‐37,Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3.........................................................................34
GesundeSynovialis....................................................................................................................................................35
S100A8,S100A9,HNP1‐3undhBD‐3.........................................................................................................35
Psoriasin,RNase7,hBD‐2,LL‐37...................................................................................................................36
3.2.ErgebnisseHaut......................................................................................................................................................38
ImmunhistochemiePsoriasisvulgaris..............................................................................................................38
S100A8,S100A9..................................................................................................................................................38
HNP1‐3undLL‐37................................................................................................................................................40
Psoriasin(S100A7)undRNase7...................................................................................................................42
hBD‐2undhBD‐3..................................................................................................................................................44
3.3.VergleichderImmunreaktivitätvonAMPinGelenk‐probenmittelsFishertest.........................46
3.4.ZusammenfassungderErgebnisse..................................................................................................................47
4.Diskussion.....................................................................................................................................................................49
4.1.Methoden...................................................................................................................................................................49
Untersuchungsmethoden........................................................................................................................................49
BeurteilungderHautproben.................................................................................................................................50
BeurteilungderGelenkproben.............................................................................................................................51
4.2.ErgebnisseGelenke................................................................................................................................................51
Psoriasis‐Arthritis(PsA).........................................................................................................................................51
RheumatoideArthritis(RA)..................................................................................................................................53
Osteoarthrose(OA)...................................................................................................................................................55
GesundeSynovialis....................................................................................................................................................57
4.3.TherapienderPatienten......................................................................................................................................58
4.4.VergleichderGelenkerkrankungen................................................................................................................59
AMP‐ExpressioninderMembranasynovialis..........................................................................................60
S100A8undA9......................................................................................................................................................60
HNP1‐3......................................................................................................................................................................61
LL‐37...........................................................................................................................................................................63
4.5.ErgebnisseHaut......................................................................................................................................................64
S100A8undS100A9..........................................................................................................................................64
HNP1‐3undLL‐37................................................................................................................................................66
6
PsoriasinundRNase7.........................................................................................................................................67
hBD‐2undhBD‐3..................................................................................................................................................68
4.6.VergleichHaut–Gelenk.......................................................................................................................................69
4.7.ZusammenfassungundAusblick......................................................................................................................71
Literaturverzeichnis......................................................................................................................................................76
Danksagung.......................................................................................................................................................................82
Lebenslauf..........................................................................................................................................................................83
Veröffentlichungen.........................................................................................................................................................84
7
Abkurzungsverzeichnis
ABC engl.avidin‐biotin‐complex,Avidin‐Biotin‐Komplex
AK Antikörper
AMP Antimikrobielle(s)Peptid(e)
Aquadest. lat.aquadestillata,destilliertesWasser
AZ Aktenzeichen
biot. biotinyliert
BSA BovinesSerumalbumin
C6H5Na3O7.2H2O NatriumcitrattribasischDihydrat
C6H8O7.H2O CitronensäureMonohydrat
CRP C‐reaktivesProtein
DMARD engl.diseasemodifyinganti‐rheumaticdrug,eineGruppe
antirheumatischerMedikamente
E.coli Escherichiacoli,Gram‐negativesBakterium
ERK extrazelluläreSignal‐regulierteKinase
etal. lat.etalii,undandere
Ges. Gesamt
H2O2 Wasserstoffperoxid
hBD humanesβ‐Defensin
HCl Salzsäure
HNP humane(s)neutrophile(s)Peptid(e)/Defensin(e)
IFN Interferon
IHC Immunhistochemie
IL Interleukin
JNK C‐junN‐terminaleKinase
l Liter
LL‐37 humanesCathelicidin(37Aminosäurenlang,beginnend
mitLeucin‐Leucin)
M molar
MAPK mitogen‐aktivierteProteinkinase
8
mg Milligramm
µg Mikrogramm
min lat.minutum,Minute(n)
µl Mikroliter
ml Milliliter
µm Mikrometer
MMP Matrix‐Metalloproteinase
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natronlauge
NSAID engl.non‐steroidalanti‐inflammatorydrug,nicht‐
steroidaleantiinflammatorischeMedikamente
OA Osteoarthrose
PASI engl.psoriasisareaandseverityindex,einScorezur
BewertungderKrankheitsaktivitätderPsoriasis
PsA Psoriasis‐Arthritis
PsV Psoriasisvulgaris
RA rheumatoideArthritis,syn.chronischePolyarthritis
RNase Ribonuklease
sec lat.secundo,Sekunde(n)
SELDI‐TOF‐MS engl.Surface‐EnhancedLaserDesorption/Ionization
Time‐Of‐FlightMassSpectrometry,eineMethodeder
Massen‐Spektrometrie
TBS engl.tris‐bufferedsaline,Tris‐gepufferteKochsalzlösung
TH‐Zelle T‐Helfer‐Zelle
TLR engl.toll‐likereceptor,Toll‐ähnlicherRezeptor
TNF Tumor‐Nekrose‐Faktor
Tris Tris(hydroxymethyl)‐aminomethan
v/v engl.volumepervolume,VolumenproVolumen
w/v engl.weightpervolume,MasseproVolumen
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1.Einleitung
PsoriasiswirdnachdemheutigenKenntnisstandnichtmehrnuralseineErkrankung
der Haut, sondern als chronisch inflammatorische Systemerkrankung angesehen. Die
KomorbiditätderPsoriasisumfasstdabeimehrereErkrankungen,u.a.Krankheitendes
metabolischen Syndroms, Herz‐Kreislauferkrankungen, chronisch‐entzündliche Darm‐
erkrankungen, psychische Erkrankungen und die Psoriasis‐Arthritis (PsA). Von den
PatientenmitPsoriasisanderHautentwickelninDeutschlandungefähr30%einePsA
(Henes et al. 2014). Die PsA entwickelt sich dabei in der Regel erst nach den Haut‐
veränderungen,weshalbvielePatientenbereits jahrelang indermatologischerBetreu‐
ung sind,wenn sie arthritische Beschwerden entwickeln (Mease et al. 2014). Da eine
zusätzlichePsAdie Patientendeutlich stärker einschränkt als ein alleinigerBefall der
Haut(Reichetal.2009),istesvonhöchsterWichtigkeit,diePsAmöglichstfrühzeitigzu
diagnostizieren,umdieBehandlunganschließendraschbeginnenzukönnen.Umdieszu
ermöglichen, istdieErforschungderPathogenesebeiderEntitätenessenziell–welche
UnterschiedegibteszwischenderPsoriasisanderHautundderPsoriasisamGelenk?
WelcheFaktorenführennebenderDermatosezurArthritis?ZieldieserArbeitwares,
UnterschiedesowieGemeinsamkeitenzwischenderPsoriasisanderHautundderPso‐
riasisamGelenkinderExpressionantimikrobiellerPeptide(AMP)herauszufinden.
AlsAMPbezeichnetmaneine großeGruppevon endogenenProteinen, die vonvielen
Epithelzellen und spezialisierten Zellen des angeborenen Immunsystems gebildet
werdenkönnen.EvolutionsbiologischbetrachtetsindAMPsehralteMoleküle,diesich
sowohl bei Tieren als auch bei Pflanzen finden. Je nach Wirkspektrum können sie
bakterizid, viruzid oder fungizid wirken und ermöglichen Epithelien so einen wirk‐
samenSchutzvorderenUmwelt (Harderetal.2007).Sie sindhochaktivundkönnen
bereits in Konzentrationen im nano‐ oder mikromolaren Bereich wirksam werden
(Zasloff2002).
Diemenschliche Haut produziert konstitutiv AMP, um sich vor invadierendenMikro‐
organismenzuschützenundumihrebakterielleNormalflorazuregulieren(Braffetal.
2005).Dabei sindAMPnicht nur in gesunderHaut detektierbar, sondern auch in der
10
Haut verschiedener Erkrankungen wie der Psoriasis (Harder et al. 2005). In der
barrieregestörtenHautderPsoriasisläsionensindAMPstarkinduziertundschützendie
Haut äußerst wirksam vor Bakterien – so wirksam, dass Psoriasisläsionen seltener
infiziertwerdenalsgesundeHaut (Henseleret al. 1995).DieseklinischeBeobachtung
führte1997schließlichzurIsolationdeserstenantimikrobiellenPeptidesausmensch‐
licher Haut: dem humanen β‐Defensin hBD‐2 (Harder et al. 1997). Seitdem wurden
weitereAMPauspsoriatischerHautisoliert(HarderundSchröder2005).
Doch AMP wirken nicht nur antimikrobiell, sondern haben weitere Funktionen: Sie
können chemotaktisch auf Zellen des erworbenen Immunsystems wirken und ver‐
stärkensomitdieImmunantwort(Yangetal.2004).GegenstandaktuellerForschungist
dieRolle derAMP inderPathogenese verschiedensterKrankheitenwie derPsoriasis.
Beispielsweisewird hier demCathelicidinLL‐37unddemβ‐DefensinhBD‐2mit ihrer
Aktivierung plasmazytoider dendritischer Zellen ein wichtiger Beitrag zum Fort‐
schreiten der Pathogenese der Psoriasis zugeschrieben (Vergleich 4.5. HNP1‐3 und
LL‐37,S.66,und4.5.hBD‐2undhBD‐3,S.68).
Sostelltesich fürdievorliegendeArbeitdieFrage, inwieferndieAMP,die inderHaut
vonPsoriasisläsionenstarkinduziertsind,auchinderSynovialisderPsoriasis‐Arthritis
exprimiert werden – wie unterscheidet sich die AMP‐Expression psoriatischer Syno‐
vialisvonderpsoriatischerHaut,wogibtesGemeinsamkeiten?Insgesamt8AMP–Pso‐
riasin(S100A7),Ribonuklease7(RNase7),diehumanenβ‐DefensinehBD‐2undhBD‐3,
dasCathelicidinLL‐37,S100A8(CalgranulinA),S100A9(CalgranulinB)unddiehuma‐
nen α‐Defensine HNP1‐3 (humane neutrophile Peptide 1‐3)–wurden ausgewählt und
immunhistochemisch in Proben von Psoriasis vulgaris (läsionale und nicht‐läsionale
Haut von Psoriasispatienten sowie gesunde Kontrollen), Psoriasis‐Arthritis (PsA),
rheumatoider Arthritis (RA), Osteoarthrose (OA) und gesunder Synovialis untersucht.
Neben demVergleich der Psoriasis an der Hautmit der Psoriasis am Gelenkwurden
durchdieAuswahlvonProbenandererGelenkentitätenweitereVergleichemöglich:Der
derPsAmitderRA–zweierhochgradigerSynovialitiden,derderPsAmitderOA(einer
niedriggradigenSynovialitis)undderVergleichmitgesundenKontrollen.
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2.MaterialundMethoden
2.1.Material
VerwendeteChemikalien
Aquadest. DeltaSelectGmbH,München;institutseigenerAutoklav
BovinesSerumalbumin(BSA) Sigma,Steinheim
C6H5Na3O7.2.H2O Merck,Darmstadt
C6H8O7.H2O Merck,Darmstadt
H2O2 Merck,Darmstadt
Ethanol BÜFA,Hude‐Altmoorhausen
Eukitt Kindler,Freiburg
Hämalaun Merck,Darmstadt
HCl Sigma,Steinheim
NaCl Merck,Darmstadt
NaOH Merck,Darmstadt
Tris/HCl Sigma,Steinheim
Tween®20 Sigma,Steinheim
Xylolersatz Vogler,Giessen
PufferfürdieImmunhistochemie
Tris‐Base‐Saline(TBS)‐Puffer(Waschpuffer)
DerTBS‐Pufferwurdezunächstals10‐fach‐Konzentrathergestellt,autoklaviertundan‐
schließend bei 4 °C aufbewahrt. Hierauswurde zur Verwendung die einfache Lösung
hergestellt,derpH‐Wertauf7,4–7,6mitHCloderNaOHeingestelltundanschließend
0,05%(v/v)Tween®20zugesetzt.
12
TBS‐Puffer(einfacheLösung):
8,763gNaCl
7,88gTris/HCl
6,5mlNaOH
ad1.000mlAquadest.
Citratpuffer
FürdenCitratpufferwurdenzunächstdieStammlösungenAundBgetrennthergestellt,
autoklaviertundanschließendbei4°Caufbewahrt.
Citrat‐Puffer0,01M:
‐StammlösungA:
21,01g0,1MC6H8O7.H2O
ad1.000mlAquadest.
‐ StammlösungB:
29,4g0,1MC6H5Na3O7.2H2O
ad1.000mlAquadest.
ZurVerwendungwurdendiebeidenLösungendanninfolgendemVerhältnisgemischt:
‐ 27mlStammlösungA+123mlStammlösungB
ad1.500mlAquadest.
‐ pH6,0mitHCloderNaOHeingestellt
VerwendeteAntikörperundKits
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Antikörper gegenPsoriasin undRNase 7
warenamInstitut fürDermatologiederUniversitätsklinikKielhergestelltwordenund
lagenzuBeginnderArbeitbereitsvor.DieAntikörpergegendieanderenAMPwurden
vonuntengenanntenHerstellernbezogen.
ZurHerstellungwurdenzunächstVersuchstieremitdemgewünschtenAntigenimmuni‐
siert. Anschließendwurde für dieHerstellung polyklonaler Antikörper Serum gewon‐
nen, das die gesuchten Antikörper enthielt. Für die Herstellung monoklonaler Anti‐
körper wurde den Tieren die Milz entnommen, um die antikörperproduzierenden
Plasmazellen zu gewinnen.Diese produzierten anschließend inKultur dieAntikörper,
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dieausdenZellüberständenisoliertwurden.EineausführlicheBeschreibungfindetsich
beiGläser,Harderetal.2005.
VerwendeteAntikörper
Primärantikörper Sekundärantikörper
Antikörper PsoriasinAB2 Anti‐Mausbiot.
Art Monoklonal Polyklonal
Spezies Maus Kaninchen
Verdünnung 1:8000 1:200
Arbeitskonzentration 1,25µg/ml 6µg/ml
Katalognummer ‐ E0354
Hersteller DermatologieKiel DakoCytomation
Glostrup,Dänemark
Primärantikörper Sekundärantikörper
Antikörper RNase7 Anti‐Ziegebiot.
Klonalität Polyklonal Polyklonal
Spezies Ziege Kaninchen
Verdünnung 1:400 1:500
Arbeitskonzentration 26µg/ml 2,8µg/ml
Katalognummer ‐ 305‐066‐045
Hersteller DermatologieKiel JacksonImmunoResearch
WestGrove,U.S.A.
Primärantikörper Sekundärantikörper
Antikörper hBD‐2 Anti‐Ziegebiot.
Klonalität Polyklonal Polyklonal
Spezies Ziege Kaninchen
Verdünnung 1:500 1:500
Arbeitskonzentration 1µg/ml 2,8µg/ml
Katalognummer C‐500P1‐61 305‐066‐045
Hersteller PeproTechCell JacksonImmunoResearch
Concepts,D‐Umkirch WestGrove,U.S.A.
14
Primärantikörper Sekundärantikörper
Antikörper hBD‐3 Anti‐Kaninchenbiot.
Klonalität Polyklonal Polyklonal
Spezies Kaninchen Schwein
Verdünnung 1:500 1:300
Arbeitskonzentration 0,001µg/µl 2,93µg/ml
Katalognummer C‐500P2‐41L E0431
Hersteller PeproTechCell DakoCytomation
Concepts,D‐Umkirch Glostrup,Dänemark
Primärantikörper Sekundärantikörper
Antikörper LL‐37 Anti‐Kaninchenbiot.
Klonalität Polyklonal Polyklonal
Spezies Kaninchen Schwein
Verdünnung 1:150 1:300
Arbeitskonzentration 0,006µg/µl 2,93µg/ml
Katalognummer PA‐LL37100 E0431
Hersteller Innovagen DakoCytomation
Lund,Schweden Glostrup,Dänemark
Primärantikörper Sekundärantikörper
Antikörper S100A8 Anti‐Mausbiot.
Klonalität Monoklonal Polyklonal
Spezies Maus Kaninchen
Verdünnung 1:100 1:200
Arbeitskonzentration 2µg/ml 6µg/ml
Katalognummer BM4029 E0354
Hersteller AcrisAntibodies DakoCytomation
SanDiego,U.S.A. Glostrup,Dänemark
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Primärantikörper Sekundärantikörper
Antikörper S100A9 Anti‐Mausbiot.
Klonalität Monoklonal Polyklonal
Spezies Maus Kaninchen
Verdünnung 1:100 1:200
Arbeitskonzentration 1µg/ml 6µg/ml
Katalognummer ab24111 E0354
Hersteller Abcam DakoCytomation
Cambridge,U.K. Glostrup,Dänemark
Primärantikörper Sekundärantikörper
Antikörper HNP1‐3 Anti‐Mausbiot.
Klonalität Monoklonal Polyklonal
Spezies Maus Kaninchen
Verdünnung 1:200 1:200
Arbeitskonzentration 1µg/ml 6µg/ml
Katalognummer HNP103 E0354
Hersteller BioLogo DakoCytomation
D‐Kronshagen Glostrup,Dänemark
VerwendeteKits
‐Vectastain®ABCPeroxidaseKitElitePK‐6100Standard Vector,Burlingame,U.S.A.
‐Vector®NovaREDTMPeroxidaseSubstrateKitSK‐4800 Vector,Burlingame,U.S.A.
VerwendeteIsotypkontrollen
Isotypkontrolle
Maus
Isotypkontrolle
Kaninchen
Isotypkontrolle
Ziege
Verdünnung wiePrimärantikörper wiePrimärantikörper wiePrimärantikörper
Herstellerkonzentration 0,1mg/ml 15mg/ml 15mg/ml
Katalognummer X0943 X0936 26‐787‐278030
Hersteller DakoCytomation DakoCytomation GenWayBiotech
Glostrup,Dänemark Glostrup,Dänemark SanDiego,U.S.A.
16
2.2.Methoden
Immunhistochemie
HerkunftdesUntersuchungsgutes
Insgesamtwurden 27 Synovialis‐ und 12Hautpräparate untersucht. EswurdenHaut‐
biopsien von 4 unbehandelten Patientenmit Psoriasis vulgaris gewonnen: Von jedem
PatientenjeweilseineProbeauseinerPsoriasisläsionundeineProbeauseinermakro‐
skopischgesundenHautpartiegleicherLokalisation.Zusätzlichwurdenausdemhisto‐
logischen Archiv der Dermatologie Kiel 4 Präparate von hautgesunden Patienten
herausgesucht, die den Psoriasispatienten in Alter, Geschlecht und Körperlokalisation
derBiopsieentsprachen.DieKontrollprobenstammtenausnichtbetroffenenRändern
vonNävuszellnävus‐Exzisionen.FüralleBiopsienlageinpositivesEthikvotumvor(Kiel
AZA104/06).
DieSynovialispräparateerhieltenwirzumeinenvonProf.DennisMcGonagleausLeeds,
U.K. Diese Proben wurden arthroskopisch gewonnen. Zehn Präparate stammten von
Patienten mit Psoriasis‐Arthritis, vier von Patienten mit Osteoarthrose und acht von
PatientenmitrheumatoiderArthritis.
VonProf.Dr.rer.nat.ThomasPufeausAachenwurdenfünfweitereSynovialispräparate
gelenkgesunderKontrollenzurVerfügunggestellt.
SämtlicheGewebeprobenwurdeninFormalinfixiertundinParaffineingebettet.
HerstellungderSchnittpräparate
Vonden in4%‐igemFormalin fixiertenund inParaffineingebettetenPräparatenwur‐
denmithilfeeinesRotationsmikrotoms5‐7µmdickeSchnitteangefertigt.Diesewurden
zurEntfaltungaufein45°CwarmesWasserbadgelegtunddannaufsilanisierteObjekt‐
trägeraufgezogen.DanachwurdendiePräparateanderLuftgetrocknetund inPräpa‐
ratekästenaufbewahrt.
GrundlagenderImmunhistochemie
DieImmunhistochemiestellteineMethodedar,mitderüberspezifischeAntikörperge‐
suchte Antigene innerhalb eines histologischen Präparates detektiert werden können
17
(Coons 1941). Es kann zwischen direkter und indirekter immunhistochemischer Fär‐
bung gewähltwerden. Bei der direktenMethode bindet an das Antigen nur ein Anti‐
körper, der selbst mit einem Farbstoff markiert ist. Bei der indirekten Immunhisto‐
chemie führenmehrereAntikörper zur Färbung: ein primärer, der gegen dasAntigen
gerichtet ist,undeinsekundärer,dergegendenprimärengerichtet ist.Andensekun‐
därenAntikörperisteinFarbstoffodereinEnzym,daseinSubstratzueinemFarbstoff
umsetzt,gekoppelt.DiesistbeispielsweisederFallbeideruntenbeschriebenenAvidin‐
Biotin‐Komplex‐Methode(Hsuetal.1981).
EinewichtigeVoraussetzungfürdieimmunhistochemischeDetektionvonAntigenenist,
dassdiese fürdie spezifischenAntikörperzugänglichsind.DieFixierungdesGewebes
mit Formalin kann zur Maskierung der Antigene führen: Durch Quervernetzungen in
FormvonAldehydverbindungenzwischenProteinenkönnenAntikörpergegebenenfalls
nichtmehrbinden(Werneretal.2000).DieseQuervernetzungensindjedochteilweise
reversibel und mithilfe verschiedener Demaskierungsmethoden können die Antigene
wiederfreigelegtwerden(Shietal.2001).IndervorliegendenArbeitwurdedieHitze‐
demaskierung inCitratpuffermiteinemDampfgarergewählt (Namimatsuetal.2005).
Um ein Abschwimmen der Präparate von den Objektträgern während der Hitzede‐
maskierungzuverhindern,wurdensilanisierteObjektträgerverwendet,diedurchposi‐
tive Ladungen auf ihrer Oberfläche kovalente Bindungenmit den Geweben eingingen
undsoeinAbschwimmenverhinderten.
Avidin‐Biotin‐Komplex(ABC)‐Methode
Die ABC‐Methode ist eine besondere Form der indirekten Immunhistochemie (Hsu,
Raine et al. 1981). Hier bindet ein biotinylierter Sekundärantikörper an den Primär‐
antikörper.AndasVitaminBiotinbindetdasGlykoproteinAvidin,daseinebesondere
Affinität zum Biotin hat und insgesamt 4 Bindungsstellen für dieses besitzt. An die
anderen Bindungsstellen kann das biotinylierte Enzym binden, das letztendlich sein
Substrat in einen Farbstoff umwandelt. Durch die vielen Bindungsstellen können sich
großeKomplexebilden,wodurchdasSignalverstärktwird. IndieserArbeitwurdeals
EnzymPeroxidasegewählt.
18
Abbildung1:SchematischeDarstellungAvidin‐Biotin‐Komplex‐Methode
AblaufderImmunhistochemie‐Färbung
ZunächstwurdendieSchnitte imTrockenschrankbei63°CfüreineStundegetrocknet,
umunterdemSchnittverbliebenesWasserabzutrocknen,welcheszurZerstörungdes
Präparates während der Hitzedemaskierung führen könnte. Anschließend wurde in
XylolersatzdasParaffinentfernt,zweimalje10min.DannwurdendieSchnitteineiner
absteigendenAlkoholreiherehydriert:
100%Ethanol 2x2min
96%Ethanol 2x2min
80%Ethanol 1x2min
70%Ethanol 1x2min
Aquadest. 1x10min
Tabelle1:absteigendeAlkoholreihe
ImAnschlusswurdendieProbenimDampfgarerdemaskiert.DabeiwurdendieSchnitte
20 min lang in Citratpuffer gekocht und kühlten danach 45 min im Citratpuffer ab.
DarauffolgtedieBlockierungderendogenenPeroxidasemithilfevon3%‐igemWasser‐
stoffperoxid in Aqua dest. für 10 min. Um diese Blockierungslösung zu entfernen,
wurden die Schnitte anschließend kurz inAqua dest. und dann für 5min in TBS und
Tween (im Folgenden als „Waschpuffer“ bezeichnet) gewaschen. Der Waschpuffer
wurdemit Labortüchern vorsichtig von den Rändern abgesaugt. Die Schnittewurden
19
miteinemFettstifteingekreist,umbeidennachfolgendenSchrittendieentsprechenden
LösungenwährendderInkubationaufdenPräparatenzuhalten.
Anschließendwurden die Präparate blockiert, um elektrostatische Ladungen der Pro‐
teine im Untersuchungsgut abzusättigen, die später zu unspezifischen Antikörper‐
bindungenführenkönnten.HierzuwurdeTBSmit12%BSAoderNormalserumausdem
Kaninchen,fallsder1.AntikörpernichtvomKaninchenstammte,verwendetund20min
bei Raumtemperatur inkubiert. Falls Kaninchen‐Normalserum verwendetwurde, ging
mandavonaus, dassdasnicht‐immunisierteKaninchenkeine spezifischenAntikörper
gegendasgesuchtehumaneAntigengebildethatte.
FolgendwurdedieBlockierungslösungabgeschütteltundder1.Antikörperaufgetragen,
derfür1StundebeiRaumtemperaturoderbei4°CüberNachtinkubiertwurde.
Danachwurden die Präparate zweimal für je 3minmitWaschpuffer gewaschen, um
nicht gebundene Antikörper vom Präparat zu entfernen, wobei die Negativkontrollen
getrenntgewaschenwurden.Anschließendwurdeder2.Antikörperaufgebracht,derfür
30minbeiRaumtemperaturinkubierte.
Erneut wurde mitWaschpuffer zweimal je 3 min gewaschen, bevor der AB‐Komplex
aufgetragenwurde.Hierfürwurdenzuvor10µlderAvidinlösungmit10µlderBiotin‐
Peroxidase‐Lösung (Vectastain® ABC Peroxidase Kit Elite PK‐6100 Standard, Vector,
Burlingame,U.S.A.)in1000µlTBS‐Pufferzusammengebracht,uminnerhalbvon30min
beiRaumtemperaturaneinanderzubindenunddenAB‐Komplexzubilden.
Anschließendwurdedreimal je3minmitWaschpuffergewaschen.Danachwurdedas
Peroxidase‐Substrat aufgetragen und 4min in dunkler Kammer bei Raumtemperatur
inkubiert.EswurdedasVector®NovaREDTMPeroxidaseSubstrateKitSK‐4800(Vector,
Burlingame,U.S.A.) verwendetunddieLösungunmittelbarvorher inAquadest. ange‐
setzt(37,5µlLösungA+25µlLösungB+25µlLösungC+25µlLösungD+2,5mlAqua
dest.).
Die Präparatewurden anschließend 10min inWaschpuffer gewaschen, kurz in Aqua
dest. getaucht und mit Hämalaun gegengefärbt. Hierzu wurde 30%iges Hämalaun in
Aquadest.hergestellt, indasdieSchnitte30secgetauchtwurden.Danachwurdendie
PräparateunterfließendemLeitungswasser7minlanggebläut.
FolgendwurdendieSchnitteinaufsteigenderAlkoholreihedehydriertundzweimalje2
mininXylolersatzgetaucht.AbschließendwurdensiemitEukitt®eingedeckt.
20
Kontrollen
Um die Spezifität der Antikörper gegenüber dem gesuchten Antigen sicherzustellen,
wurdenbeidenFärbungenjeweils3Kontrollenmitgefärbt.HierfürwurdenProbenver‐
wendet, von denen zuvor sichergestellt worden war, dass sie das gesuchte Antigen
enthalten:
Psoriasin(S100A7),RNase7 GesundeHaut
hBD‐2,hBD‐3,S100A8,S100A9 Psoriasisvulgaris
LL‐37 Wundrand
HNP1‐3 Verrucavulgaris
Tabelle2:KontrollenzumNachweisdereinzelnenAMP
Es wurde in jeder Serie eine Positivkontrolle gefärbt, die alle Schritte des Protokolls
durchliefundamEndeandenspezifischenLokalisationeneindeutigeImmunreaktivität
zeigensollte.
DieNegativkontrollewurdebisaufden1.Antikörpergenaubehandeltwiealleanderen
Präparate.WährenddiePräparatemitdem1.Antikörperinkubierten,wurdedieNega‐
tivkontrolleinderBlockierungslösungbelassenundanschließendgetrenntmitWasch‐
puffergewaschen.ImAnschlusswurdesiewiedermitdenanderenPräparatenzusam‐
menbehandelt.AmEndesolltedieNegativkontrollekeinerlei Immunreaktivitätzeigen
undsobeweisen,dassdieFärbungalleinaufdem1.Antikörperberuhteundkeineun‐
spezifischenReaktionenstattfanden.
UmdieSpezifitätdesPrimärantikörperszudokumentieren,wurdezusätzlicheineIso‐
typkontrolleverwendet.WährendderInkubationszeitdes1.Antikörperswurdeaufdie
IsotypkontrolleeinunspezifischerKontrollantikörperaufgebracht,derausdemgleichen
Tier stammte wie der spezifische Primärantikörper. Da der Antikörper der Isotyp‐
kontrolle jedoch nicht an spezifische Antigene binden konnte,wurde er im folgenden
SchrittmitdemWaschpufferabgewaschen.SokonnteauchderSekundärantikörperim
nächstenSchrittnichtbindenunddiePräparatebliebenletztendlichnegativ.Aufdiese
Weisekonntesichergestelltwerden,dassdieFärbungaufderspezifischenAffinitätdes
PrimärantikörperszumAntigenberuhte.
21
BeurteilungderHautpräparate
DiePräparatewurdennachderFärbungimLichtmikroskopaufImmunreaktivitätunter‐
sucht.ZurBeurteilungwurdedazueinScorebenutzt,derdieExpressionderantimikro‐
biellenPeptide inden jeweiligenEpidermisschichtenbeschreibt.Hier ist anzumerken,
dassbeiPsoriasisaufgrundderParakeratoseperdefinitionemkeinStratumgranulosum
existiert.ZurVergleichbarkeitmitdenKontrollprobenwurdendiesubcornealenSchich‐
tenderPsoriasispräparatebeiderBeurteilungalsStratumgranulosumklassifiziert.Es
wurden0‐4PunktenachfolgendenKriterienvergeben:
0 KeinerleiImmunreaktivität
1 ImmunreaktivitätimStratumcorneum
2 ImmunreaktivitätinStratumcorneumundgranulosum
3 ImmunreaktivitätinStratumcorneum,granulosumundspinosum
4 ImmunreaktivitätingesamterEpidermis
Tabelle3:ScorezurBeurteilungderEpidermis
Abbildung2:BeispielefürEpidermisscore,10xvergrößerteläsionalePsoriasis(0–keineImmun‐
reaktivität;1–ImmunreaktivitätnurStratumcorneum;2–ImmunreaktivitätStratumcorneum
und subcorneal (entsprechend Stratum granulosum); 3 – Immunreaktivität Stratum corneum,
subcorneal(entsprechendStratumgranulosum)undStratumspinosum;4–Immunreaktivitätin
gesamterEpidermis)
22
DesWeiterenwurde das dermale Stroma hinsichtlich der Immunreaktivität bewertet.
Hierwurdebeurteilt,inwiefernz.B.eingewanderteLeukozytenpositivgefärbtwaren:Es
wurdezwischenleichter,mittlererundstarkerImmunreaktivitätunterschieden.
LeichteImmunreaktivitätbedeutete,dassnureinzelneZellengefärbtwarenunddieFär‐
bungeherschwachwar.Einestarke Immunreaktivitäthingegenbedeuteteeinestarke
FärbungvielerZellen.WarenmäßigvieleZellenmittelgradigkräftiggefärbt,wurdedies
alsmittlereImmunreaktivitäteingestuft.
+ LeichteImmunreaktivität
++ MittlereImmunreaktivität
+++ StarkeImmunreaktivität
Tabelle4:ScorefürLeukozyteninderDermis
Abbildung3:ImmunreaktivitätamBeispielläsionalerPsoriasis,rotePfeilemarkierendermale
Infiltrate(a:negativeDermis,b:positiveDermis+,c:positiveDermis+++)
23
BeurteilungderSynovialispräparate
DiePräparatewurdennachderFärbungimLichtmikroskopaufImmunreaktivitätunter‐
sucht. Die Untersucher waren dabei verblindet, d.h. sie kannten die Diagnosen der
Patienten,vondenendieProbenstammten,nicht.3verschiedeneMusterderFärbung
wurdenbeurteilt:
1. ImmunreaktivitätinSynoviozytenderMembranasynovialis
2. ImmunreaktivitätineingewandertenLeukozytenimSynovialstroma
3. ImmunreaktivitätinLeukozyten,dieinBlutgefäßenzuerkennenwaren
Abbildung4:Beurteilungder ImmunreaktivitätderSynovialispräparate (1.: Immunreaktivität
inSynoviozyten,2.: Immunreaktivität ineingewandertenLeukozyten imSynovialstroma,3.: Im‐
munreaktivitätinLeukozyteninBlutgefäßen)
Die Immunreaktivität in Synoviozyten wurde mithilfe einer Gesichtsfeldauszählung
weiterquantifiziert,dieimFolgendenbeschriebenist.
Gesichtsfeldauszählung
UmquantitativeAussagenüberdieImmunreaktivitätderMembranasynovialismachen
zukönnen,wurdenSynoviozytennachpositivundnegativunterschiedenundbei100‐
facher Vergrößerung 10 Gesichtsfelder pro Präparat ausgezählt. Eine Zelle wurde als
positiv gewertet,wenn ihr Zytoplasmapositiv gefärbtwar. Gezähltwurdendie Zellen
oberhalbderBasalmembran.FallsdieMembranasynovialisentzündungsbedingtbreiter
alseinGesichtsfeldwar,wurdedasgesamteGesichtsfeldausgezählt.
JederUntersucherwählte10repräsentativeGesichtsfelderproPräparatzurBeurteilung
aus.ÜberdieZahlenderpositivenSynoviozytenunddieGesamtzahlenkonntensodie
prozentualenAnteilederpositivenZelleninderMembranasynovialisermitteltwerden.
DieMethodewurdevonzweiunabhängigenUntersucherndurchgeführt.
24
Im folgenden Bild ist exemplarisch ein Gesichtsfeld bei 100facher Vergrößerung zu
sehen mit den Markierungen für P=positiv und N=negativ. Die Basalmembran ist als
schwarzeLiniegekennzeichnet.Esbefindensich34positiveund10negativeSynovio‐
zytenindiesemGesichtsfeld,woraussicheineGesamtzahlvon44ergibtunddamitein
prozentualerAnteilderpositivenSynoviozytenvon34/44=77,3%.
Abbildung5:GesichtsfeldauszählungamBeispielrheumatoiderArthritis
Synovitis‐Score
Um die Entzündung in der Synovialis in jedem Präparat zu quantifizieren und damit
vergleichbarmachenzukönnen,wurdendiePräparatemithilfeeinenSynovitis‐Scores
(Krennetal.2006)beurteilt.Eswurde jedesPräparatmitHämalaungefärbtundmit‐
hilfe eines Lichtmikroskopes von einem unabhängigen Untersucher verblindet unter‐
sucht.Folgende3Kategorienwurdendabeibeurteilt:
1. AnzahlderSynoviozytenschichteninderMembranasynovialis
2. DichteresidenterZellen(Fibroblasten,Fibrozyten,Endothelzellen,
Makrophagen)imSynovialstroma
3. VorhandenseineingewanderterLeukozyten(Lymphozyten,Plasmazellen)
JedeKategoriewurdemit 0‐3Punktenbewertet (sieheTabelle 5) unddiePunkte ad‐
diert.DiePunktesummenwurdenwiefolgteingeteilt:0‐1–keineSynovitis,2‐4–leicht‐
gradigeSynovitis,5‐9–hochgradigeSynovitis.
25
Kategorie Punkte Bewertung
Synoviozyten‐
schichten
0 SynoviozytenbildeneineZellschicht
1 Synoviozytenbilden2‐3Zellschichten
2 4‐5Zellschichten,darunternebendenSynoviozyteneinige
multinukleäreZellen
3 >5Zellschichten,ggf.ulzeriert,infiltriertmitmulti‐
nukleärenZellen
Dichteresidenter
Synovialstroma‐
zellen
0 normaleDichteresidenterZellen
1 leichterhöhteDichteresidenterZellen
2 moderaterhöhteDichteresidenterZellen,ggf.multi‐
nukleäreZellen
3 starkerhöhteDichteresidenterZellen,ggf.multinukleäre
Riesenzellen,Pannusund/oderrheumatoideGranulome
Vorhandensein
eingewanderter
Leukozyten
0 keineLymphozytenoderPlasmazellen
1 wenigeLymphozytenoderPlasmazellen,v.a.perivaskulär
lokalisiert
2 mehrereLymphozytenundPlasmazellen,teilweise
Follikelbildung
3 starkeinflammatorischeInfiltrierung,mehreregroße
Follikel
Tabelle5:BeurteilungvonSynovialispräparatenmittelsSynovitisscore(3Kategorien,diemit je‐
weils 0‐3 Punkten bewertet werden, die Summe der Punkte wird folgendermaßen eingeteilt:
0‐1 Punkt – keine Synovitis, 2‐4 Punkte – leichtgradige Synovitis, 5‐9 Punkte – hochgradige
Synovitis)
26
Statistik
DerexakteFishertest
Der Test nach Fisher eignet sich zur Untersuchung auf statistische Signifikanz bei bi‐
närenDaten invoneinanderunahängigenStichproben.ErwurdevonRonaldA.Fisher
und Frank Yates für die Vierfeldertafel entwickelt, d.h. für zwei voneinander unab‐
hängigeVariablen,diebeidenur2möglicheMerkmalsausprägungenannehmenkönnen
(Fisher et al. 1948). In der vorliegenden Arbeit wurde der Fishertest für die Unter‐
suchungderGelenkprobenverwendet.Dainsgesamt4voneinanderunabhängigeStich‐
proben existierten (Psoriasis‐Arthritis, Rheumatoide Arthritis, Osteoarthrose und ge‐
sunde Synovialis), wurde ein modifizierter exakter Fishertest angewendet (Clarkson
1993). Ziel der Untersuchungwar es, einemögliche statistische Signifikanz zwischen
den4Diagnosenzuuntersuchen.DazuwurdendieimmunreaktivenAMPhBD‐3,LL‐37,
S100A8,S100A9undHNP1‐3injeweils3GruppeneingeteiltanalogzurBeurteilungder
Synovialisproben:
1.Membranasynovialis
2.EingewanderteLeukozytenimSynovialisstroma
3.LeukozyteninBlutgefäßenderSynovialis
Soergabensichaus5antimikrobiellenPeptidenà3Gruppeninsgesamt15Gruppenmit
je27Synovialispräparatender4verschiedenenDiagnosen.Füralle15Gruppenwurde
mittels desmodifizierten exakten Fishertests der p‐Wert für die jeweilige Gruppe er‐
mittelt. Dazu wurden die Präparate tabellarisch aufgelistet und bei jedem Präparat
zwischenpositiv(1)undnegativ(0)unterschieden(eineBerücksichtigungderprozen‐
tualenGesichtsfeldauszählungderMembranasynovialiswarsomitnichtmöglich).Mit‐
hilfedesProgramms„R“konntedannüberdieTabellenfürjededer15Gruppenderje‐
weiligep‐Werterrechnetwerden(R‐Core‐Team2013).
27
3.Ergebnisse
3.1.ImmunhistochemieGelenke
Insgesamt wurden 27 arthroskopisch gewonnene Synovialisbiopsien immunhisto‐
chemisch aufgearbeitet: 10 Proben von Patienten mit Psoriasis‐Arthritis, 8 von
Patienten mit rheumatoider Arthritis, 4 von Patienten mit Osteoarthrose und 5 von
gelenkgesundenPatientenausRoutinearthroskopien.
Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung wurden 3 Aspekte beurteilt: 1. Immun‐
reaktivitätinSynoviozytenderMembranasynovialis,2.ImmunreaktivitätinLeukozyten
imSynovialstroma,3. Immunreaktivität inLeukozyten inBlutgefäßen.UmdieImmun‐
reaktivität der Synoviozyten zu quantifizieren, wurden die positiven und negativen
SynoviozytenausgezähltundderAnteilderpositivenSynoviozytenanderGesamtzahl
ausgerechnet.BeiderImmunreaktivitätderLeukozytenimSynovialstromaundinBlut‐
gefäßenwurdezwischenpositiv(indenTabellen„+“)undnegativ(indenTabellen„–“)
unterschieden.
Psoriasis‐Arthritis(PsA)
S100A8,S100A9,HNP1‐3undLL‐37
EineExpressionvonS100A8undS100A9wurdein7von10PsA‐Probenidentifiziert.
DieImmunreaktivitätwarvoralleminLeukozytenimSynovialstromazufinden,die,der
MorphologieundderZelldichteindiesenArealennachzuurteilen,imRahmenderEnt‐
zündungeingewandertwaren.EinigepositiveLeukozytenfandensichauchinGefäßen
und zeigten eine positive Färbung ihres Zytosols und des sie umgebenden Serums. In
einem Präparat zeigte sich außerdem eine Induktion von sowohl S100 A8 als auch
S100A9inderMembranasynovialis.Hierproduziertendurchschnittlich31%derZellen
S100A8und14%S100A9.NachVerteilungundMorphologiehandeltees sichhierbei
umSynoviozyten.
28
HNP1‐3wurden in8von10Präparatennachgewiesen.DiepositivenZellenwarenvor
allemLeukozytenimSynovialstromaundinBlutgefäßen.VieledieserLeukozytenwaren
Granulozyten (durch die Morphologie mit dem typischen septierten Zellkern identi‐
fiziert),dieeinebesondershoheImmunreaktivitätinihremZytosolundauchindemsie
umgebenden Extrazellularraum zeigten. In einem Präparat konnte außerdem eine
HNP1‐3‐ExpressioninSynoviozytengezeigtwerdenmitdurchschnittlich25%positiven
Zellen.
LL‐37war,imVergleichzudenbishergenanntenAMP,eherschwachnachweisbarund
konnte invereinzeltenLeukozyten in2von10Präparaten identifiziertwerden. Inder
MembranasynovialiszeigtesichkeineLL‐37‐Expression.
Die Gesamtpunktezahlen der Synovitisscores, die für jede Biopsie beurteilt wurden,
reichtenvon0(keineSynovitis)bis6(hochgradigeSynovitis).
Von7PsA‐PatientenlagenInformationenzumedikamentösenTherapienzumZeitpunkt
der Biopsie vor. Alle Patienten erhielten NSAID („non‐steroidal antiinflammatory
drugs“),3erhieltenDMARD(„disease‐modifyingantirheumaticdrugs“)undeinPatient
systemischKortikosteroide.
Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3
Die Präparate zeigten keinerlei Immunreaktivität für das S100‐Protein Psoriasin
(S100A7),dieRibonukleaseRNase7unddie humanenβ‐DefensinehBD‐2undhBD‐3.
WederinderMembranasynovialis,nochinStromaoderBlutgefäßenkonntenpositive
Zellenimmunhistochemischnachgewiesenwerden.
ZusammenfassendwurdeinderPsoriasis‐ArthritiseinehoheImmunreaktivitätgegen‐
überS100A8,S100A9undHNP1‐3nachgewiesen,diebei2PatientenaucheineProduk‐
tion dieser antimikrobiellen Peptide in der Membrana synovialis durch Synoviozyten
einschloss.DesWeiterenwurdeeineleichtePositivitätfürLL‐37imSynovialstromage‐
funden. Psoriasin, RNase 7, hBD‐2 und hBD‐3 konnten hingegen nicht nachgewiesen
werden.
29
#S100A8 S100A9 HNP1‐3 LL‐37 Synovitisscore
CRPTherapie
Sy St G Sy St G Sy St G Sy St G E R I Ges. S D N
1 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 1 1 0 2 x x x x
2 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0,25 + ‐ 0 ‐ ‐ 1 2 2 5 28 ‐ Su +
3 0 ‐ + 0 + + 0 + + 0 ‐ ‐ 1 3 0 4 x + x +
4 0 ‐ 0 ‐ + 0 + + 0 ‐ ‐ 1 0 0 1 7 ‐ Su +
5 0,31 + + 0,14 + + 0 + + 0 + + 2 3 1 6 29 ‐ ‐ +
6 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 + ‐ 0 ‐ ‐ 1 0 1 2 73 x x x
7 0 ‐ + 0 ‐ + 0 ‐ + 0 + ‐ 0 0 0 0 x x x +
8 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 1 2 1 4 x x x +
9 0 ‐ ‐ 0 ‐ + 0 + + 0 ‐ ‐ 1 1 1 3 x x x x
10 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 ‐ ‐ 0 0 0 0 <5 ‐ M,Su +
Tabelle6:ImmunreaktivitätgegenüberS100A8,S100A9,HNP1‐3undLL‐37inPsA:Sy–positive
Synoviozyten in Prozent derGesamtsynoviozytenzahl; St – Immunreaktivität in eingewanderten
Leukozyten im Synovialstroma: positive Zellen zu detektieren (+) oder nicht (‐); G – Immun‐
reaktivität in Leukozyten in Blutgefäßen: positive Zellen zu detektieren (+) oder nicht (‐);
Synovitisscore(E–AnzahlderZellschichten inMembranasynovialis,R–DichteresidenterZellen
imSynovialstroma,I–AnzahlinfiltrierterZellenimSynovialstroma,Ges.–Synovitisscoregesamt);
CRP (C‐reaktives Protein) im Blut inmg/l; Therapie der Patienten zum Zeitpunkt der Biopsie:
S–systemischeKortikosteroide,D–DMARD(disease‐modifyinganti‐rheumaticdrugs),N–NSAID
(non‐steroidalanti‐inflammatorydrugs),Su–Sulfasalazin,M–Methotrexat,x–keineInformation
inderPatientenaktevorhanden
30
Abbildung6: ImmunreaktivitätgegenüberS100A8undS100A9 inPsoriasis‐Arthritis (links:
S100A8inPräparat5‐SynovialisundStromapositiv;Mitte:S100A9inPräparat5‐Synovialis
und Stroma positiv; rechts: S100 A9 in Präparat 4 – Leukozyten in Blutgefäßen positiv),
Vergrößerungen jeweils 10x in oberer Reihe und 40x in unterer Reihe, die die jeweiligen
AusschnittederrotenBoxenzeigt
Abbildung 7: Immunreaktivität gegenüber HNP1‐3 und LL‐37 in Psoriasis‐Arthritis (links:
HNP1‐3inPräparat2‐Synovialispositiv;Mitte:HNP1‐3inPräparat3–StromaundBlutgefäße
positiv; rechts: LL‐37 in Präparat 5 ‐ Stroma positiv),Vergrößerungen jeweils 10x in oberer
Reiheund40xinuntererReihe,diediejeweiligenAusschnittederrotenBoxenzeigt
31
RheumatoideArthritis(RA)
S100A8,S100A9undHNP1‐3
S100 A8 konnte in 2 der 8 Präparate nachgewiesen werden. In einer Biopsie konnte
neben der Immunreaktivität eingewanderter Leukozyten im Synovialstroma eine
S100‐A8‐Expression in derMembrana synovialis detektiertwerdenmit 65%S100‐A8‐
positivenSynoviozyten.
Das gleiche Präparat zeigte Immunreaktivität gegenüber S100 A9 in der Membrana
synovialismitdurchschnittlich34%S100‐A9‐positivenZellen.S100A9wurdeebenfalls
in2von8RA‐Präparatennachgewiesen.
In insgesamt 5 von 8 Präparaten konnte Immunreaktivität gegenüber HNP1‐3 nach‐
gewiesen werden. Vor allem im Synovialstroma exprimierten eingewanderte Leuko‐
zytenHNP1‐3undineinemPräparatzeigtesichzusätzlicheineExpressioninSynovio‐
zytenmiteinemdurchschnittlichenAnteilderpositivenSynoviozytenvon55%.
Die Gesamtpunktezahlen der Synovitisscores, die für jede Biopsie beurteilt wurden,
reichtenvon0(keineSynovitis)bis5(hochgradigeSynovitis).Von6Patientenausder
Gruppe der RA lagen Daten zu ihren Therapien vor. 5 erhielten zum Zeitpunkt der
Biopsie DMARD („disease‐modifying antirheumatic drugs“), 4 NSAID („non‐steroidal
antiinflammatorydrugs“)und4systemischKortikosteroide.
Psoriasin,RNase7,hBD‐2,hBD‐3undLL‐37
IndenvorliegendenPräparatenderRAkonntekeineImmunreaktivitätgegenüberPso‐
riasin,RNase7,hBD‐2,hBD‐3undLL‐37nachgewiesenwerden.
Zusammenfassendwurde indenPräparatenderrheumatoidenArthritis Immunreak‐
tivitätgegenüberS100A8,S100A9undHNP1‐3identifiziert,diebeieinemPatientauch
eine Expression der drei AMP in Synoviozyten einschloss. Psoriasin, RNase 7, hBD‐2,
hBD‐3undLL‐37wurdenhingegennichtnachgewiesen.
32
#S100A8 S100A9 HNP1‐3 Synovitisscore
CRPTherapie
Sy St G Sy St G Sy St G E R I Ges. S D N
1 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 0 0 0 x x x x
2 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 1 1 0 2 x x x x
3 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 + + 0 2 1 3 57 ‐ ‐ +
4 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 + ‐ 2 2 1 5 29 ‐ M +
5 0 ‐ + 0 ‐ ‐ 0 ‐ + 0 0 0 0 11 + M ‐
6 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 1 1 0 2 55 + M +
7 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 2 2 4 5 + M +
8 0,65 + + 0,34 + + 0,55 + + 1 2 0 3 33 + M ‐
Tabelle7:ImmunreaktivitätgegenüberS100A8,S100A9undHNP1‐3inRA:Sy–positiveSynovio‐
zyten in Prozent derGesamtsynoviozytenzahl; St – Immunreaktivität in eingewanderten Leuko‐
zytenimSynovialstroma:positiveZellenzudetektieren(+)odernicht(‐);G–Immunreaktivitätin
LeukozyteninBlutgefäßen:positiveZellenzudetektieren(+)odernicht(‐);Synovitisscore(E–An‐
zahl der Zellschichten inMembrana synovialis, R –Dichte residenter Zellen im Synovialstroma,
I–Anzahl infiltrierterZellen imSynovialstroma,Ges.–Synovitisscoregesamt);CRP (C‐reaktives
Protein) im Blut inmg/l; Therapie der Patienten zum Zeitpunkt der Biopsie: S – systemische
Kortikosteroide,D–DMARD(disease‐modifyinganti‐rheumaticdrugs),N–NSAID(non‐steroidal
anti‐inflammatorydrugs),M–Methotrexat,,x–keineInformationinderPatientenaktevorhanden
33
Abbildung8:ImmunreaktivitätgegenüberS100A8undS100A9inrheumatoiderArthritis(links:
S100A8inPräparat5–LeukozyteninBlutgefäßenpositiv;Mitte:S100A8inPräparat8–Syno‐
vialis und Stroma positiv; rechts: S100 A9 in Präparat 8 – Synovialis und Stroma positiv),
Vergrößerungen jeweils 10x in oberer Reihe und 40x in unterer Reihe, die die jeweiligen Aus‐
schnittederrotenBoxenzeigt
Abbildung9: Immunreaktivität gegenüberHNP1‐3 in rheumatoiderArthritis (links:HNP1‐3 in
Präparat 4 – Stroma positiv; rechts: HNP1‐3 in Präparat 8 – Synovialis und Stroma positiv),
Vergrößerungen jeweils 10x in oberer Reihe und 40x in unterer Reihe, die die jeweiligen Aus‐
schnittederrotenBoxenzeigt
34
Osteoarthrose(OA)
S100A9,HNP1‐3
EineExpressionvonS100A9undHNP1‐3konnteinallen4Präparatenidentifiziertwer‐
den.DieImmunreaktivitätwarjedochnurineingewandertenLeukozytenimSynovial‐
stroma oder in Leukozyten in Blutgefäßen zu detektieren, die Membrana synovialis
bliebinallenPräparatennegativ.
Die Gesamtpunktezahlen der Synovitisscores, die für jede Biopsie beurteilt wurden,
reichten von 0 (keine Synovitis) bis 5 (hochgradige Synovitis). Ein OA‐Patient erhielt
NSAID(„non‐steroidalantiinflammatorydrugs“)zumZeitpunktderBiopsie.
S100A8,LL‐37,Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3
In den vorliegendenPräparaten derOA konnte keinerlei Immunreaktivität gegenüber
S100A8,LL‐37,Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3nachgewiesenwerden.
Tabelle8:ImmunreaktivitätgegenüberS100A9undHNP1‐3inOA:Sy–positiveSynoviozytenin
Prozent der Gesamtsynoviozytenzahl; St – Immunreaktivität in eingewanderten Leukozyten im
Synovialstroma:positiveZellenzudetektieren(+)odernicht(‐);G– Immunreaktivität inLeuko‐
zyten inBlutgefäßen:positiveZellenzudetektieren(+)odernicht(‐);Synovitisscore(E–Anzahl
derZellschichten inMembranasynovialis,R–DichteresidenterZellen imSynovialstroma,I–An‐
zahlinfiltrierterZellenimSynovialstroma,Ges.–Synovitisscoregesamt);CRP(C‐reaktivesProtein)
imBlutinmg/l;TherapiederPatientenzumZeitpunktderBiopsie:S–systemischeKortikosteroide,
D–DMARD (disease‐modifyinganti‐rheumaticdrugs),N–NSAID (non‐steroidalanti‐inflamma‐
torydrugs),x–keineInformationinderPatientenaktevorhanden
#S100A9 HNP1‐3 Synovitisscore
CRPTherapie
Sy St G Sy St G E R I Ges. S D N
1 0 ‐ + 0 ‐ + 0 0 0 0 <5 x x +
2 0 ‐ + 0 + ‐ 1 1 0 2 8,7 ‐ ‐ ‐
3 0 + ‐ 0 + ‐ 2 2 1 5 <5 ‐ ‐ ‐
4 0 ‐ + 0 + + 1 1 0 0 <5 x x x
35
Abbildung 10: Immunreaktivität gegenüber S100 A9 und HNP1‐3 bei Osteoarthrose (links:
S100A9inPräparat2–Blutgefäßepositiv;Mitte:S100A9inPräparat3‐Stromapositiv;rechts:
HNP1‐3 inPräparat3, Stromapositiv),Vergrößerungen jeweils10x inobererReiheund40x in
untererReihe,diediejeweiligenAusschnittederrotenBoxenzeigt
Insgesamt konnte bei Osteoarthrose lediglich im Synovialstroma Immunreaktivität
gegenüberS100A9undHNP1‐3gezeigtwerden.DieMembranasynovialisbliebgänzlich
negativ. Immunreaktivität gegenüber S100 A8, LL‐37, Psoriasin, RNase 7, hBD‐2 und
hBD‐3warnichtzudetektieren.
GesundeSynovialis
S100A8,S100A9,HNP1‐3undhBD‐3
S100A8wurde in1von5gesundenSynovialispräparatengefunden. Immunreaktivität
zeigtenLeukozytenimSynovialstromasowiedieMembranasynovialismitdurchschnitt‐
lich16%positivenZellen.
IneinemanderenPräparatzeigtesichImmunreaktivitätfürS100A9imSynovialstroma
in eingewanderten Leukozyten. In der Membrana synovialis konnten jedoch keine
S100‐A9‐positivenZellenidentifiziertwerden.
36
HNP1‐3konntenin3von5Präparatennachgewiesenwerden.Hierzeigtensicheinzelne
positive Leukozyten im Synovialstroma und in Blutgefäßen.HNP1‐3‐positive Synovio‐
zytenkonnteninkeinemPräparatgefundenwerden.
In 1 von 5 Präparaten zeigten sich für hBD‐3 positive Zellen in Blutgefäßen. Die
MembranasynovialiszeigtekeineImmunreaktivität.
Psoriasin,RNase7,hBD‐2,LL‐37
IndenvorliegendenPräparatendergesundenSynovialiskonntekeineImmunreaktivität
fürPsoriasin,RNase7,hBD‐2undLL‐37nachgewiesenwerden.
Zusammenfassend konnte damit in gesunder Synovialis Immunreaktivität gegenüber
S100A8,S100A9,HNP1‐3undhBD‐3nachgewiesenwerden,wobeiSynoviozyteninder
Membrana synovialis nur in einem Präparat für S100 A8 positiv waren. Psoriasin,
RNase7,hBD‐2undLL‐37wurdennichtnachgewiesen.
#S100A8 S100A9 HNP1‐3 hBD‐3 Synovitisscore
CRPTherapie
Sy St G Sy St G Sy St G Sy St G E R I Ges. S D N
1 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 + ‐ 0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x
2 0,16 + ‐ 0 ‐ ‐ 0 + + 0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x
3 0 ‐ ‐ 0 + + 0 + + 0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x
4 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x
5 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ ‐ 0 ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ x x x x
Tabelle 9: Immunreaktivität gegenüber S100 A8, S100 A9, HNP1‐3 und hBD‐3 in gesunder
Synovialis: Sy – positive Synoviozyten inProzent derGesamtsynoviozytenzahl; St – Immunreak‐
tivität ineingewandertenLeukozyten imSynovialstroma:positiveZellen zudetektieren (+)oder
nicht (‐);G – Immunreaktivität inLeukozyten inBlutgefäßen:positiveZellen zudetektieren (+)
oder nicht (‐); Synovitisscore (E –Anzahl der Zellschichten inMembrana synovialis,R –Dichte
residenterZellenimSynovialstroma,I–AnzahlinfiltrierterZellenimSynovialstroma,Ges.–Syno‐
vitisscore gesamt); CRP (C‐reaktives Protein) im Blut in mg/l; Therapie der Patienten zum
Zeitpunkt derBiopsie (S – systemische Steroide,D –DMARD (disease‐modifying anti‐rheumatic
drugs), N – NSAID (non‐steroidal anti‐inflammatory drugs)), x – keine Information in der
Patientenaktevorhanden
37
Abbildung11: ImmunreaktivitätgegenüberS100A8undS100A9 ingesunderSynovialis (links:
S100A8inPräparat2‐SynovialisundStromapositiv;rechts:S100A9inPräparat3–Leukozyten
inStromaundBlutgefäßenpositiv),Vergrößerungenjeweils10xinobererReiheund40xinunterer
Reihe,diedenjeweiligenAusschnittderrotenBoxzeigt
Abbildung 12: Immunreaktivität in gesunder Synovialis gegenüber HNP1‐3 und hBD‐3 in
gesunderSynovialis (links:HNP1‐3 inPräparat2 ‐StromaundGefäßepositiv;Mitte:HNP1‐3 in
Präparat 3 ‐ Stroma und Gefäße positiv; rechts: hBD‐3 in Präparat 5 ‐ Gefäße positiv), Ver‐
größerungen jeweils10x inobererReiheund40x inuntererReihe,diedie jeweiligenAusschnitte
derrotenBoxenzeigt
38
3.2.ErgebnisseHaut
ImmunhistochemiePsoriasisvulgaris
S100A8,S100A9
S100A8wurde in allenEpidermisschichten sowie inderDermis starkexprimiert.Die
EpidermisscoresbetrugenimMittelwert4insowohlläsionalerPsoriasishautalsauchin
nichtläsionalerPsoriasissowiedengesundenKontrollen.
FürS100A9zeigte sicheinehöhere Immunreaktivität inder läsionalenHautderPso‐
riasis‐Patienten im Vergleich zu den anderen Proben. Der Mittelwert der Epidermis‐
scores betrug in Psoriasis‐Läsionen 3,5, in den Proben der nicht‐läsionalen Psoriasis‐
HautunddengesundenKontrollenlagendieScoresbeidurchschnittlich2,25bzw.2,5.
Abbildung13:ExpressionvonS100A8 in läsionalerPsoriasishaut (a)undnicht‐läsionalerPso‐
riasishaut(b)vonPatientP3sowieindergesundenKontrolleK3(c),Vergrößerungjeweils10x
Abbildung14:ExpressionvonS100A9 in läsionalerPsoriasishaut (a)undnicht‐läsionalerPso‐
riasishaut(b)vonPatientP2sowieindergesundenKontrolleK2(c),Vergrößerungjeweils10x
39
Einzelwerte Mittelwerte
Diagnose #S100A8 S100A9 S100A8 S100A9
E D E D E D E D
LäsionalePsoriasishaut
P1 4 +++ 4 ++
4 +++ 3,5 ++P2 4 +++ 4 +
P3 4 +++ 4 ++
P4 4 +++ 2 x
Nicht‐läsionalePsoriasishaut
P1 4 ++ 2 +
4 ++ 2,25 +P2 4 + 3 +
P3 4 ++ 2 x
P4 4 + 2 +
GesundeHaut
K1 4 + 4 +++
4 + 2,5 ++K2 4 + 2 0
K3 4 + 2 x
K4 4 ++ 2 x
Tabelle10: Immunreaktivität inHautprobengegenüberS100A8undS100A9–EinzelneWerte
der jeweiligen Präparate sowieMittelwerte derDiagnosegruppen läsionale, nicht‐läsionale Pso‐
riasishautundgesundeHaut;E–Epidermis,ImmunreaktivitätangegebenimEpidermisscore(von
0bis4Punkte);D–Dermis,Immunreaktivität indermalenLeukozyten(von0bis+++);x–keine
dermalen Leukozyteninfiltrate im Präparat vorhanden, P1‐4: Patienten 1‐4 – von jedem dieser
Patienten jeweils eine Probe aus läsionaler und eine aus nicht‐läsionaler Psoriasishaut; K1‐4:
gesunde Kontrollen der Patienten 1‐4, diemit diesen in Alter, Geschlecht und Lokalisation der
Biopsieübereinstimmen
40
HNP1‐3undLL‐37
HNP1‐3wurdenindenProbenderläsionalenPsoriasishautamstärkstenexprimiertmit
einemmittleren Epidermisscore von 1,5. Etwas schwächere Immunreaktivität zeigten
dienicht‐läsionalePsoriasishautmit0,75unddiegesundeHautmit0,5.DieDermiswar
ebenfallsindenPsoriasis‐Läsionenamstärkstengefärbt.
LL‐37wurdenurinderEpidermisderPsoriasispatientenexprimiert.Hierzeigtesichdie
ImmunreaktivitätinLeukozyteninfiltratenimStratumcorneumbeizweiläsionalenund
einer nicht‐läsionalen Psoriasishautprobe sowie in einigen dermalen Leukozyten. Die
gesundeHautbliebnegativ.
Abbildung15:Expression vonHNP1‐3 in läsionalerPsoriasishaut (a)undnicht‐läsionalerPso‐
riasishaut(b)vonPatientP1sowieindergesundenKontrolleK1(c),Vergrößerungjeweils10x
Abbildung 16: Expression von LL‐37 in läsionaler Psoriasishaut (a) und nicht‐läsionaler Pso‐
riasishaut(b)vonPatientP4sowieindergesundenKontrolleK4(c),Vergrößerungjeweils10x
41
Einzelwerte Mittelwerte
Diagnose #HNP1‐3 LL‐37 HNP1‐3 LL‐37
E D E D E D E D
LäsionalePsoriasishaut
P1 1 +++ 0 0
1,5 +++ 0,5 0P2 1 + 0 0
P3 3 +++ 1 +
P4 1 +++ 1 0
Nicht‐läsionalePsoriasishaut
P1 1 + 0 0
0,75 + 0,25 0P2 0 0 0 0
P3 1 0 0 +
P4 1 + 1 0
GesundeHaut
K1 1 + 0 0
0,5 + 0 0K2 1 + 0 0
K3 0 + 0 0
K4 0 0 0 0
Tabelle111:ImmunreaktivitätinHautprobengegenüberHNP1‐3undLL‐37–EinzelneWerteder
jeweiligenPräparatesowieMittelwertederDiagnosegruppen läsionale,nicht‐läsionalePsoriasis‐
hautundgesundeHaut;E–Epidermis,ImmunreaktivitätangegebenimEpidermisscore(von0bis
4Punkte);D–Dermis,ImmunreaktivitätindermalenLeukozyten(von0bis+++);P1‐4:Patienten
1‐4–von jedemdieserPatienten jeweilseineProbeaus läsionalerundeineausnicht‐läsionaler
Psoriasishaut;K1‐4:gesundeKontrollenderPatienten1‐4,diemitdieseninAlter,Geschlechtund
LokalisationderBiopsieübereinstimmen
42
Psoriasin(S100A7)undRNase7
Psoriasin konnte in allen Hautproben nachgewiesen werden. Die stärkste Immun‐
reaktivität zeigte sich jedoch in der Psoriasis vulgaris. Hier waren die Proben aus
Läsionen mit einem durchschnittlichen Epidermisscore von 3 stärker positiv als aus
nicht‐läsionalen Hautbiopsien der Patienten (Epidermisscore 1,75). Die gesunden
Kontrollen zeigtenhingegennur in einemPräparat eine leichtePositivität imStratum
corneum.
RNase 7 wurde ebenso in allen Gruppen nachgewiesen mit der stärksten Immun‐
reaktivität in denPsoriasisläsionen (Epidermisscore 2,5) und der schwächsten in den
gesundenKontrollen(Epidermisscore1,5).
Die Dermis zeigteweder in der Psoriasis noch in den gesunden KontrollenPsoriasin‐
oderRNase‐7‐positiveZellen.
Abbildung17:ExpressionvonPsoriasin in läsionalerPsoriasishaut(a)undnicht‐läsionalerPso‐
riasishaut(b)vonPatientP1sowieindergesundenKontrolleK1(c),Vergrößerungjeweils10x
Abbildung18:ExpressionvonRNase7 in läsionalerPsoriasishaut (a)undnicht‐läsionalerPso‐
riasishaut(b)vonPatientP1sowieindergesundenKontrolleK1(c),Vergrößerungjeweils10x
43
Einzelwerte Mittelwerte
Diagnose #Psoriasin RNase7 Psoriasin RNase7
E D E D E D E D
LäsionalePsoriasishaut
P1 3 0 2 0
3 0 2,5 0P2 3 0 3 0
P3 3 0 2 0
P4 3 0 3 0
Nicht‐läsionalePsoriasishaut
P1 3 0 2 0
1,75 0 1,75 0P2 1 0 2 0
P3 0 0 2 0
P4 3 0 1 0
GesundeHaut
K1 0 0 1 0
0,25 0 1,5 0K2 1 0 2 0
K3 0 0 1 0
K4 0 0 2 0
Tabelle12:ImmunreaktivitätinHautprobengegenüberPsoriasinundRNase7–EinzelneWerte
der jeweiligen Präparate sowie Mittelwerte der Diagnosegruppen läsionale, nicht‐läsionale
PsoriasishautundgesundeHaut;E–Epidermis, Immunreaktivitätangegeben imEpidermisscore
(von0bis4Punkte);D–Dermis,ImmunreaktivitätindermalenLeukozyten(von0bis+++);P1‐4:
Patienten1‐4–von jedemdieserPatienten jeweilseineProbeaus läsionalerundeineausnicht‐
läsionaler Psoriasishaut; K1‐4: gesunde Kontrollen der Patienten 1‐4, die mit diesen in Alter,
GeschlechtundLokalisationderBiopsieübereinstimmen
44
hBD‐2undhBD‐3
DieDefensinehBD‐2undhBD‐3ließensichnurinderEpidermisderPsoriasispatienten
nachweisen.HierwarendieLäsionendeutlichstärkerimmunreaktivalsdienicht‐läsio‐
nalenAreale:hBD‐2zeigteEpidermisscoresvon3in läsionalerund1,25innicht‐läsio‐
nalerPsoriasis,hBD‐3von1,75 in läsionalerund0,25innicht‐läsionalerPsoriasis.Die
gesunden Kontrollen zeigten keine Immunreaktivität. Die Dermis zeigteweder in der
PsoriasisnochindengesundenKontrollenhBD‐2‐oderhBD‐3‐positiveZellen.
Abbildung 19: Expression von hBD‐2 in läsionaler Psoriasishaut (a) und nicht‐läsionaler Pso‐
riasishaut(b)vonPatientP2sowieindergesundenKontrolleK2(c),Vergrößerungjeweils10x
Abbildung 20: Expression von hBD‐3 in läsionaler Psoriasishaut (a) und nicht‐läsionaler Pso‐
riasishaut(b)vonPatientP3sowieindergesundenKontrolleK3(c),Vergrößerungjeweils10x
45
Einzelwerte Mittelwerte
Diagnose #hBD‐2 hBD‐3 hBD‐2 hBD‐3
E D E D E D E D
LäsionalePsoriasishaut
P1 3 0 1 0
3 0 1,75 0P2 3 0 2 0
P3 3 0 2 0
P4 3 0 2 0
Nicht‐läsionalePsoriasishaut
P1 2 0 0 0
1,25 0 0,25 0P2 1 0 0 0
P3 1 0 0 0
P4 1 0 1 0
GesundeHaut
K1 0 0 0 0
0 0 0 0K2 0 0 0 0
K3 0 0 0 0
K4 0 0 0 0
Tabelle13: Immunreaktivität inHautprobengegenüberhBD‐2undhBD‐3–EinzelneWerteder
jeweiligenPräparatesowieMittelwertederDiagnosegruppen läsionale,nicht‐läsionalePsoriasis‐
hautundgesundeHaut;E–Epidermis,ImmunreaktivitätangegebenimEpidermisscore(von0bis
4Punkte);D–Dermis,ImmunreaktivitätindermalenLeukozyten(von0bis+++);P1‐4:Patienten
1‐4–von jedemdieserPatienten jeweilseineProbeaus läsionalerundeineausnicht‐läsionaler
Psoriasishaut;K1‐4:gesundeKontrollenderPatienten1‐4,diemitdieseninAlter,Geschlechtund
LokalisationderBiopsieübereinstimmen
46
Zusammenfassend wurde bei der Psoriasis vulgaris die stärkste Immunreaktivität
gegenüber S100 A8, S100 A9 undHNP1‐3 gezeigt. Auch die antimikrobiellen Peptide
Psoriasin, RNase 7, hBD‐2 und ‐3 sowie LL‐37 zeigten eine sehr hohe Positivität. Die
ImmunreaktivitätderläsionalenHauterreichtefastimmereinenhöherenepidermalen
Score als die nicht‐läsionale und die gesunde Haut. Die einzige Ausnahme bildet hier
S100A8,dasinallenPräparatenstarkexprimiertwurde.
Tabellarische Übersicht der einzelnen antimikrobiellen Peptide und ihrer Beurteilung
derjeweiligenImmunreaktivitätanhandderEpidermis‐Scores:
S100A8 S100A9 HNP1‐3 LL‐37 Psoriasin RNase7 hBD‐2 hBD‐3
Läsional 4 3,5 1,5 0,5 3 2,5 3 1,75
Nicht‐Läsional 4 2,25 0,75 0,25 1,75 1,75 1,25 0,25
Gesund 4 2,5 0,5 0 0,25 1,5 0 0
Tabelle14:VergleichderMittelwertederEpidermisscoresdereinzelnenAMP in läsionalerPso‐
riasishaut(n=4),nicht‐läsionalerPsoriasishaut(n=4)undingesunderHaut(n=4)
3.3. Vergleich der Immunreaktivität von AMP in Gelenk‐
probenmittelsFishertest
MithilfedesmodifiziertenexaktenFishertestswurdeuntersucht,obsichdieNachweise
derImmunreaktivitätderProbenvonPsoriasis‐Arthritis,rheumatoiderArthritis,Osteo‐
arthroseundgesunderSynovialisstatistischsignifikantvoneinanderunterschieden.Die
4DiagnosenwurdendabeigemeinsamaufHomogenitätderErgebnisseuntersucht.
Fürdie„gelenkpositiven“AMPhBD‐3,LL‐37,S100A8,S100A9undHNP1‐3wurdenalle3
beurteilten Parameter untersucht: Immunreaktivität in der Membrana synovialis, in
Leukozyten im Synovialstroma sowie in Leukozyten in Blutgefäßen.Mithilfe des Pro‐
gramms „R“ wurden die jeweiligen p‐Werte für alle Entitäten ermittelt. Alle p‐Werte
warengrößerals0,05.SomitkonntenkeinestatistischsignifikantenUnterschiedeinder
ImmunreaktivitätvonAMPzwischendenDiagnosengezeigtwerden.
47
p‐Wert
hBD‐3
Membranasynovialis –
LeukozytenStroma –
LeukozytenBlutgefäße 0,3333
LL‐37
Membranasynovialis –
LeukozytenStroma >0,999
LeukozytenBlutgefäße 0,6296
S100A8
Membranasynovialis >0,999
LeukozytenStroma >0,999
LeukozytenBlutgefäße 0,5494
S100A9
Membranasynovialis >0,999
LeukozytenStroma 0,8789
LeukozytenBlutgefäße 0,1274
HNP1‐3
Membranasynovialis >0,999
LeukozytenStroma 0,8128
LeukozytenBlutgefäße 0,9493
Tabelle15:Übersichtüberp‐Werte,diemitexaktemFishertestfürhBD‐3,LL‐37,S100A8,S100A9
und HNP1‐3 ermittelt wurden, um eine statistische Signifikanz zwischen Psoriasis‐Arthritis,
rheumatoiderArthritis,OsteoarthroseundgesunderSynovialiszuuntersuchen;„–“:keinp‐Wert
ermittelbar,daindieserGruppeallePräparatenegativwaren
3.4.ZusammenfassungderErgebnisse
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen an Hautproben von Psoriasis
vulgaris und Gelenkproben von Psoriasis‐Arthritis (PsA), rheumatoider Arthritis (RA)
undOsteoarthrose(OA)zeigteneinigeGemeinsamkeiten,unterschiedensichaberauch
inmehrerenPunkten.
Die Epidermis bei Psoriasis vulgaris zeigte starke Immunreaktivität gegenüber allen
untersuchten antimikrobiellen Peptiden Psoriasin, RNase 7, hBD‐2, hBD‐3, LL‐37,
S100A8,S100A9undHNP1‐3.DabeiproduziertennichtnureingewanderteLeukozyten
48
AMP,sondernvorallemauchdieKeratinozytenselbst.DesWeiterenwareindeutlicher
Unterschied der Psoriasisproben zu den gesundenHautproben zu erkennen: Die Epi‐
dermis in den Psoriasisläsionen zeigte eine deutlich stärkere AMP‐Expression als die
nichtläsionaleHaut der Psoriasispatienten.Amwenigsten Immunreaktivität konnte in
derHautdergesundenKontrollendetektiertwerden.
In der Synovialis wurde in der Membrana synovialis hingegen nur wenig Immun‐
reaktivität gefunden, die von den Synoviozyten ausging. Die Immunreaktivität wurde
hier vor allem in eingewanderten Leukozyten detektiert. Außerdem ließen sich nicht
alleuntersuchtenAMPindenProbenimmunhistochemischnachweisen.StarkeImmun‐
reaktivität war gegenüber S100 A8, S100 A9 und HNP1‐3 und in einzelnen Proben
gegenüberLL‐37 zu finden.Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3, die inderHaut sehr
stark exprimiertwurden, ließen sich in den Synovialisproben nicht nachweisen (Aus‐
nahme:einegesundeSynovialisprobemitfokalerImmunreaktivitätgegenüberhBD‐3).
Eine differenzielle Expression der Immunreaktivität bei RA im Vergleich zur
ImmunreaktivitätbeiPsAließsichnichterkennen.InbeidenArthritisformenwareine
ExpressionvonS100A8,S100A9undHNP1‐3sowievereinzeltvonLL‐37zudetektieren.
Die Immunreaktivität ging dabei vor allem auf eingewanderte Leukozyten zurück, in
einzelnenPräparatenwarenaberauchpositiveSynoviozytenzufinden.
InderOsteoarthrosehingegenwarennurvereinzeltpositiveLeukozyten imSynovial‐
stromaoder inBlutgefäßenzu identifizieren,dieImmunreaktivitätgegenüberS100A9
undHNP1‐3aufwiesen. Ähnlich verhielt es sich in den Präparaten der gesunden Pro‐
banden,indenennurvereinzeltfürS100A8,S100A9,HNP1‐3undhBD‐3positiveLeuko‐
zytenzufindenwarenunddieSynovialisgänzlichnegativwar.
Somit stellte sich die Gewebeexpression von AMP bei Psoriasisarthritis und rheuma‐
toiderArthritisimRahmenderanalysiertenimmunhistochemischenFärbungendeutlich
verstärkt im Vergleich zur Expression in Osteoarthrose und gesunder Synovialis dar.
Mehr Präparate der PsA und der RA zeigten Immunreaktivität und in diesen produ‐
ziertenmehrZellenindenBiopsienAMP.
Im Vergleich der AMP‐Immunreaktivität in Hautbiopsien der Psoriasis vulgaris und
Gelenkbiopsien der PsA fällt auf, dass bei beiden Krankheitsmanifestationen S100A8,
S100A9,HNP1‐3undLL‐37nachzuweisenwaren.Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3
hingegenwurdennurinderHautvonPsoriasisvulgarisexprimiert.
49
4.Diskussion
4.1.Methoden
Untersuchungsmethoden
Mithilfe der Immunhistochemie wurden 12 Hautproben und 27 Gelenkproben aufge‐
arbeitet und auf die Expression antimikrobieller Peptide systematisch untersucht. Die
ImmunhistochemiebietetmehrereVorteile.ZumeinenistdieindieserArbeitgewählte
indirekte Immunhistochemiesehrspezifisch fürdasAntigen,damehrereSchrittenot‐
wendigsind,umschlussendlicheinepositiveFärbungzuerzielen.Darüberhinauskann
dieABC‐MethodedurchdenAufbau großerKomplexe auch ein anfangskleines Signal
lichtmikroskopischsichtbarwerdenlassen(Hsu,Raineetal.1981).Sowirdnebender
SpezifitätauchdieSensitivitäterhöht.DieImmunhistochemiebietetaußerdemdenVor‐
teil,dassdieArchitekturdesGewebeserhaltenbleibtundderUntersuchergenaudetek‐
tierenkann,inwelchenzellulärenStrukturensichdieImmunreaktivitätbefindet.Nach‐
teilighingegenist,dassfürdieImmunhistochemieGewebebiopsienentnommenwerden
müssen, die, je nach Gewebe, invasive operative Eingriffe nötig machen. Hautproben
sindvergleichsweiseeinfachzugewinnen,imFallvonGelenkprobenabermüssendiese
überArthroskopienoderoffeneOperationengewonnenwerden.
Um Synovialisproben entzündlicher Gelenkerkrankungen zu erhalten, wurden in der
vorliegendenArbeitBiopsienbeiPatientenentnommen,diesichaufgrundnotwendiger
GelenkersätzeOperationenunterziehenmussten. Sokonnten insgesamt27Synovialis‐
proben gewonnen werden. Aufgrund der teilweise sehr langen und schweren Krank‐
heitsverläufeerhieltendiemeistenPatientenzumZeitpunktderSynovialisbiopsiever‐
schiedeneimmunsuppressiveTherapien.SomitistbeiderInterpretationdervorliegen‐
denErgebnissezubedenken,dassdiePatientenzumgroßenTeilsystemischbehandelt
wurden.UmeinemöglichsthoheAussagekraftüberdieEinflüssevonEntzündungauf
dieAMP‐Immunreaktivitätmachen zukönnen,wurdevoneinerunabhängigenPerson
beiallenProbenein„Synovitis‐Score“nachKrennetal.bestimmt(Krenn,Morawietzet
al.2006).DerSynovitisscorebeurteiltdieVerdickungderMembranasynovialis,dieAn‐
50
zahl der Leukozyteninfiltrate im subsynovialen StromaunddasVorhandensein einge‐
wanderterLeukozyten(LymphozytenundPlasmazellen).DieBeurteilungwurdeannur
mitHämalaungefärbtenPräparatendurchgeführt.
DerSynovitisscorekannunabhängigvonderDiagnosezurBeurteilungderEntzündung
inderSynovialisverwendetwerden,weshalbergutgeeignet ist fürdie Interpretation
derErgebnissedervorliegendenArbeit.ZudemmussfürdieAnwendungkeinespezielle
Färbungdurchgeführtwerden.Kritisch ist,dassbeigroßenPräparatendieErgebnisse
desSynovitisscoreserheblichvariierenkönnen.WirberücksichtigtendaherdieEmpfeh‐
lungdesAutorsderPublikation,ineinemsolchenFallinAnalogiezurBeurteilungneo‐
plastischerVeränderungendasArealmitdenstärkstenVeränderungenzuuntersuchen
(höchsterSynovitisscore).
BeurteilungderHautproben
UmdieEpidermisderHautprobenzubeurteilenwurdeein„IHC‐Score“verwendet(Ver‐
gleich 2.2. Beurteilung der Hautpräparate). Der IHC‐Score bietet die Möglichkeit, die
AMP‐ExpressionindeneinzelnenEpidermisschichtenzubeurteilen(Wittersheimetal.
2013). Durch die Vergabe von Punkten für immunreaktive Epidermisschichten ergibt
sich die Möglichkeit, Mittelwerte in Diagnosegruppen zu bilden, die für Vergleiche
herangezogen werden können. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass nicht zwischen
fokalerunddiffuseroderzwischenschwacherundstarkerImmunreaktivitätinnerhalb
derEpidermisschichtendifferenziertwerdenkannundUnterschiedeinnerhalbdesPrä‐
paratesinderBewertungnichtzumAusdruckgebrachtwerdenkönnen.
NebenderEpidermiswurdedie Immunreaktivität inderDermisbeurteilt,dieaufein‐
gewanderteLeukozytenzurückzuführenwar.HierwurdedieIntensitätderImmunreak‐
tivitätbewertet.UnterschiedeinnerhalbdesPräparateskonntennichtdirektzumAus‐
druck gebrachtwerden,weshalb dieUntersucher eine über das gesamte Präparat ge‐
mittelterepräsentativeAussagetrafen.
UmvalideErgebnissezuerhalten,beurteilten2unabhängigeUntersucherverblindetdie
Präparate,d.h.dieUntersucherkanntendieDiagnosenderPatientennicht.
51
BeurteilungderGelenkproben
Bei den Proben von Patienten mit Psoriasis‐Arthritis, rheumatoider Arthritis, Osteo‐
arthroseundgesunderSynovialiswurden3Gesichtspunktebeurteilt:
1. ImmunreaktivitätinSynoviozyteninderMembranasynovialis
2. ImmunreaktivitätinLeukozytenimSynovialstroma
3. ImmunreaktivitätinLeukozyteninBlutgefäßenderSynovialis
UmdieImmunreaktivitätderSynoviozytenzuquantifizieren,wurdendiepositivenund
negativenZellenbei100facherVergrößerungimLichtmikroskopvon2voneinanderun‐
abhängigenUntersuchernausgezählt.DieseMethode gibt dieMöglichkeit, die Immun‐
reaktivitätmöglichst objektiv zu quantifizieren. Bei der Interpretation der Ergebnisse
solltedennochkritischberücksichtigtwerden,dassnichtdiekomplettenPräparateaus‐
gezähltwerdenkonntenundauchdiePräparateselbstnurkleineAusschnitteeinesge‐
samtenGelenkeszeigen.
Die separate Beurteilung von immunreaktiven Leukozyten, die in das Stroma einge‐
wandertsind,undLeukozyteninBlutgefäßengibtHinweisedarauf,inwieferndieseTeil
derPathologiederSynovialitisseinkönnten.EingewanderteLeukozytenkönnteneher
eineRolle in der Pathogenese spielen als imBlut zirkulierende Leukozyten, die gege‐
benenfallsnurzufälligimPräparatzusehensind.
4.2.ErgebnisseGelenke
Psoriasis‐Arthritis(PsA)
DieantimikrobiellenPeptideS100A8undS100A9fandensichin7von10PsA‐Proben.
ImmunreaktivitätwarvoralleminLeukozytenimSynovialstromaundinLeukozytenin
Blutgefäßenzufinden.DesWeiterenzeigtesicheineInduktionvonbeidenAMPinder
Membrana synovialis in einem Präparat, in dem durchschnittlich 31% der Zellen
S100A8und14%S100A9exprimierten.NachVerteilungundMorphologiehandeltees
sichhierbeiumSynoviozyten.
DieseBeobachtungendeckensichmitdenAngabenzuS100A8undS100A9inPsAbei
Kane et al. (Kane et al. 2003): In dieser Arbeit wurden Proben von Patienten mit
PsA(n=14)undPatientenmitrheumatoiderArthritis(RA,n=11)immunhistochemisch
52
aufdieExpressionvonS100A8 undS100A9 untersucht. Immunreaktivität zeigte sich
vorallemimsynovialenStroma,dieMembranasynovialiszeigtenurvereinzeltpositive
Zellen.DieProbenderPsAzeigtendabeivorallemImmunreaktivitätinperivaskulären
Infiltraten,wohingegeninderRAdieseAssoziationzudenBlutgefäßennichterkennbar
warunddiepositivenZellenehervereinzeltimSynovialstromalagen.
IndervorliegendenArbeitlässtsicheinähnlicherTrenderkennen:InderPsAzeigten5
von10ProbenImmunreaktivitätgegenüberS100A8und/oderS100A9inBlutgefäßen,
indenProbenderRAwareneshingegennur2von8Proben.Aufgrundder geringen
FallzahlenkonnteeinestatistischeSignifikanznichtnachgewiesenwerden.
Neben der Expression von S100A8und S100A9 im Synovialisgewebewurden in der
Literatur zudemerhöhteKonzentrationendieser Proteine im Serumund in der Syno‐
vialflüssigkeit von PsA‐Patienten beschrieben (Aochi et al. 2011; Cretu et al. 2014).
Neben ihrerantimikrobiellenWirkungwerdenS100A8undA9 immunmodulatorische
Funktionen zugeschrieben, wobei hier bisher nur Erkenntnisse über RA vorliegen:
S100A8stimuliertinvitroSynoviozytenvonRA‐PatientenzurProduktionvonIL‐6und
fördert damit die Differenzierung der TH‐17‐Zellen (Lee et al. 2013). Damit trägt
S100A8 zum Fortschreiten der Pathogenese der RA bei, was sich auch in klinischen
Beobachtungenwiderspiegelt:HoheKonzentrationenvonS100A8undS100A9werden
miteinererhöhtenKrankheitsaktivitätderRAassoziiert,umgekehrtsprechenniedrige
LevelfüreineRemission(Kangetal.2014).Hinweisedarauf,dassS100A8undS100A9
auchinderPsAeineRollespielen,zeigendieErkenntnissevonAdemowoetal.:Inder
Synovialis von PsA‐Patienten, bei denen TNF‐α‐Inhibitoren keine oder nur schwache
Wirkungen zeigten und die Krankheitsaktivität entsprechend hochwar,wurden hohe
KonzentrationenvonS100A8undS100A9nachgewiesen (Ademowoet al. 2014).Die
selektiveInhibitionvonS100A8stelltdamitauchfürdiePsAeinenmöglichenTherapie‐
ansatzdar,deneszuerforschengilt.
Immunreaktivität gegenüber HNP1‐3 fand sich in 8 von 10 Präparaten der PsA, vor
allem in Leukozyten im Synovialstromaund inBlutgefäßen. In einemPräparatwurde
zudemeineHNP1‐3‐ExpressioninSynoviozytengezeigtmitdurchschnittlich25%posi‐
tivenZellen.
HNP1‐3wirdvoralleminneutrophilenGranulozytenund ineinigenmonozytärenund
lymphozytären Zellreihen exprimiert (Agerberth et al. 2000; Lehrer 2004; Riepl et al.
53
2010), was sich auch in einigen Präparaten dieser Arbeit zeigte. Viele der positiven
Zellenkonntenaufgrundder typischenMorphologiemitdemseptierten,polymorphen
Zellkern als neutrophile Granulozyten identifiziert werden. Die Granulozyten zeigten
sichdabeisowohl inBlutgefäßenalsauch imsynovialenStroma.Dasiedortvermehrt
imFalleinerEntzündung,besondersbeiderPsA(Kruithofetal.2005),zufindensind,
stelltdieseinemöglicheErklärungfürdiehoheImmunreaktivitätgegenüberHNP1‐3in
derPsAdar. ImVergleichzudenSynovitisscoresderPräparate fällt auf,dass4von5
Präparaten,die imSynovitisscorePunkte füreingewanderteLeukozyten („I“= inflam‐
matory infiltrate)erhielten,und4von6Präparaten,diePunkte füreineerhöhteZell‐
dichte im Synovialstroma („R“ = density of resident cells) erhielten, Immunreaktivität
gegenüber HNP1‐3 im synovialen Stroma zeigten. Damit zeigte sich eine mögliche
Assoziation derHNP1‐3‐Expression mit einer erhöhten Zelldichte im Synovialstroma,
einervermehrtenEinwanderungvonLeukozytenunddamiteinerverstärktenEntzün‐
dungsaktivitätinderSynovialis.
EbensowieHNP1‐3wird auchLL‐37vor allem von neutrophilen Granulozyten expri‐
miert.BeidenimmunhistochemischenFärbungenfürLL‐37zeigtensichebenfallsposi‐
tiveZellen,dieaufgrundihrespolymorphen,septiertenZellkernesalsneutrophileGra‐
nulozytenidentifiziertwerdenkonnten.LL‐37wurdeinsgesamtdeutlichschwächerex‐
primiertalsHNP1‐3undwarnurvereinzeltin2von10Präparatenzufinden.
AngabenzurExpressionoderProduktionvonLL‐37oderHNP1‐3inPsAsindbislangin
derLiteraturnichtvorhanden.DaLL‐37inderHautvonPatientenmitPsoriasisüberdie
BildungvonKomplexenmiteigenerDNAplasmazytoidedendritischeZellenaktivieren
kann und LL‐37 damit eine wichtige Rolle in der Pathogenese zugeschrieben wird
(Landeetal.2007),istvonhohemInteresseherauszufinden,inwiefernLL‐37diePatho‐
genesederPsAimGelenkvorantreibenkönnte.
RheumatoideArthritis(RA)
S100A8undS100A9wurdenjeweilsin2von8Präparatennachgewiesen.EinPräparat
schloss eine Expression in der Membrana synovialis ein mit 65% S100‐A8‐positiven
Synoviozytenund34%S100‐A9‐positivenSynoviozyten.
InderLiteraturfindensichbereitsmehrereUntersuchungenzuS100A8undS100A9bei
RA(Guetal.2002;Kane,Rothetal.2003;deSenyetal.2008;Bailletetal.2010;Lee,
54
Wooet al.2013).DieStudien zeigen,dassS100A8undS100A9 inRA inhohemMaß
produziert werden – im Serum, in Monozyten im peripheren Blut, in der Synovial‐
flüssigkeit und auch im Synovialisgewebe. Ferner konnte nachgewiesenwerden, dass
die gemessenenKonzentrationenvonS100A8undS100A9 im Serummit derKrank‐
heitsaktivitätderRAassoziiertsind,weshalbS100A8undS100A9aktuellalspotentielle
Marker sowohl für die Krankheitsaktivität der RA als auch für das Screening vor der
Diagnosestellungdiskutiertwerden(Kang,Wooetal.2014).
Besondersinteressantistdabei,dassdieKonzentrationvonS100A8undS100A9nicht
mit derAnzahl der neutrophilenGranulozyten in der Synovialflüssigkeit oder imBlut
derPatientenkorreliert(Baillet,Trocmeetal.2010),wieesbeianderenArthritidenmit
erhöhter S100A8‐ und S100A9‐Produktion in der Synovialflüssigkeit der Fall ist. Da
neutrophileGranulozytenS100A8undS100A9produzieren,wirddieProduktioninder
Synovialflüssigkeit bei den anderenArthritidenvor allemauf diese Zellpopulation zu‐
rückgeführt.BeiderRAhingegen,woauchbeiniedrigenZahlenvonneutrophilenGra‐
nulozytenhoheKonzentrationenvonS100A8undS100A9gemessenwurden,lässtsich
daher eine zusätzliche Produktion durch andere Zellen, beispielsweise Synoviozyten,
vermuten.
DieseVermutungließsichineinemPräparatdervorliegendenArbeitbestätigen,indem
sichImmunreaktivitätgegenüberS100A8undS100A9inderMembranasynovialiszeig‐
te(sieheauchAbbildung8,Präparat8,S.33).DieMorphologieundVerteilungderposi‐
tivenZellenlässtvermuten,dassessichumSynoviozytenhandelt,wobeiberücksichtigt
werdenmuss,dassdiepathologischenVeränderungenmitvermehrterZellzahlundein‐
gewandertenLeukozytentäuschenkönntenunddaherweitereUntersuchungenzurBe‐
stätigungderExpressionvonS100A8undS100A9inSynoviozytenvonnötensind.
Immunreaktivität gegenüberHNP1‐3war in5 von8Präparatennachweisbarundvor
allemauf in das Synovialstromaeingewanderte Leukozyten zurückzuführen. In einem
Präparatzeigte sichzusätzlicheineExpression inderMembranasynovialismiteinem
durchschnittlichen Anteil der positiven Synoviozyten von 55%. Diese Beobachtungen
decken sich mit den Angaben in der Literatur, wonach HNP1‐3 in RA vor allem im
synovialen Stroma in neutrophilen Granulozyten detektiert wurde und Immunreak‐
tivitätinSynoviozytennurvereinzeltvorhandenwar(Paulsenetal.2002;Riepl,Grassel
etal.2010).Dabeiisterkennbar,dassHNP1‐3 imVergleichzuOAinRAdeutlichindu‐
55
ziert ist (Riepl,Grasseletal.2010;Ahnetal.2013).DieAssoziationvonhohenHNP1‐
KonzentrationenmiterhöhtenCRP‐Werten,radiologischnachweisbarenErosionenund
positivemRheumafaktorbeidenRA‐Patienten gibtHinweise auf einemöglicheproin‐
flammatorische Wirkung von HNP1 (Ahn, Huang et al. 2013). Zudem führte die
Stimulation einerRA‐Synoviozyten‐KulturmitHNP1 zu einer Induktion von IL‐6, IL‐8
und den knorpeldestruierenden Matrix‐Metalloproteinasen MMP‐1 und MMP‐3 (Ahn,
Huang et al. 2013). AlsMechanismus der Induktion konnte die Phosphorylierung von
JNK(c‐JunN‐terminaleKinasen)undERK(extrazelluläreSignal‐regulierteKinase,syn.
MAPK=mitogen‐aktivierteProteinkinase)identifiziertwerden,dasichdieRA‐Synovio‐
zytennachGabevonJNK‐undERK‐InhibitorennichtvonHNP1stimulierenließen.So‐
mitwirktHNP1 in RA in vitro tatsächlich proinflammatorisch über die Induktion von
IL‐6undIL‐8undzugleichknorpeldestruierendüberdieInduktionvonMMP‐1und‐3.
Osteoarthrose(OA)
Inallen4Präparatenkonnteeine ImmunreaktivitätgegenüberS100A9nachgewiesen
werden,inLeukozyteninBlutgefäßenundinLeukozytenimSynovialstroma.DieMem‐
branasynovialisbliebinallenProbennegativ.
ImmunhistochemischeUntersuchungenzurExpressionvonS100A8undS100A9inOA
sindbislangnichtpubliziert,jedochwurdeperSpektrometrie(SELDI‐TOF‐MS–Surface‐
Enhanced Laser Desorption/Ionization Time‐Of‐Flight Mass Spectrometry) Synovial‐
flüssigkeitvonOA‐PatientenaufeineProduktionvonS100A8undS100A9untersucht
(Baillet,Trocmeetal.2010).NebenRAundanderenhochgradigenSynovialitiden(syste‐
mischerLupuserythematodes,M.Bechterew,Pseudogicht,juvenileidiopatischeArthri‐
tis)wurdenauchProbenvonPatientenmitOAuntersucht,umdieRAalshochgradige
SynovialitismitOAalsniedriggradigerSynovialitiszuvergleichen.EswurdeperSpek‐
trometrieeineProduktionvonS100A8undS100A9 inderSynovialflüssigkeitderOA
gefunden,die jedochdeutlichgeringerwaralsdie inderRA.GesundeProbenwurden
dabeinichtuntersucht,weshalboffenbleibt,inwieferndieinderOAgemessenenKon‐
zentrationenvondenphysiologischenabweichen.
Die indervorliegendenArbeitnachgewieseneExpressionvonS100A9 gingvorallem
aufLeukozyteninnerhalbderBlutgefäßluminazurück.DaLeukozyteninKapillarenim
VergleichzuresidentenZellenimGewebedurchdenBlutflussnureinerelativkurzeZeit
imGewebeverbringen,könntedieserklären,warumBailletetal.nurgeringeKonzen‐
56
trationendiesesAMPinderSynovialflüssigkeitvonOsteoarthroseprobenmessenkonn‐
ten.
WarumindervorliegendenArbeitkeinS100A8indenGelenkprobendetektiertwerden
konnte,könntefolgendermaßenerklärtwerden:1.WieimFallvonS100A9könnteauch
dieExpressionvonS100A8aufeinigewenigeLeukozyteninBlutgefäßenzurückgehen,
dieindenhistologischenSchnittennichterfasstwaren.2.DiebeiBailletetal.gemessene
ProduktionvonS100A8inOsteoarthrosegehtaufeineandereZellpopulationinderGe‐
lenkhöhleaußerhalbderSynovialiszurück.S100A8undS100A9werdenjedochinder
Regel von den gleichen Zelltypen gebildet, v.a. von neutrophilen Granulozyten und
Monozytenin frühenStadienund liegenextrazellulärvorallemzusammenalsHetero‐
dimer „Calprotektin“vor (Ehrchenetal.2009).Demnachkönnten indervorliegenden
Arbeit zufällig keine S100 A8‐positiven Zellen in den vorliegenden Schnitten erfasst
wordensein,wasbeieinerniedrigenFallzahlvonn=4möglichwäre.
S100A8undS100A9könnenaberauchgetrenntvoneinanderalsCalgranulinA(S100
A8)bzw.CalgranulinB(S100A9)vorliegen,wasamBeispielderPsoriasisläsionendeut‐
lichwird,indenenS100A8undS100A9zwarbeidevonsowohlKeratinozytenalsauch
vonneutrophilenGranulozytenexprimiertwerden,S100A8jedochvorrangigvonKera‐
tinozyten, S100A9 hingegen in höheremMaß von neutrophilen Granulozyten (Aochi,
Tsujietal.2011).Demnachkönnte inderOAgegebenenfallseinZelltypvorherrschen,
dereherS100A9exprimiert,wodurchindervorliegendenArbeitnurdiesesAMPdetek‐
tiertwurde.
HNP1‐3konnte inallen4PräparatenderOAnachgewiesenwerden, inLeukozyten im
Synovialstromaund/oderinBlutgefäßen.DieMembranasynovialiszeigtekeineImmun‐
reaktivität.
In der Literatur gibt es Vergleiche derHNP1‐3‐Expression vonOA als niedriggradiger
Synovialitis mit der von rheumatoider Arthritis als hochgradiger Synovialitis (Riepl,
Grasseletal.2010;Ahn,Huangetal.2013)undvonOAmitRA,pyogenerArthritisund
gesunder Synovialis (Paulsen,Pufe et al. 2002). Inder Synovialis zeigten sich immun‐
histochemischkeineUnterschiedezwischenOAundRA,inbeidenEntitätenfandensich
positive Zellen in der Membrana synovialis und in den darunter liegenden oberen
Schichten des Synovialstromas, diemithilfe derDoppel‐Immunfluoreszenz als neutro‐
phile Granulozyten charakterisiertwerden konnten. Unterschiede konnten nur in der
57
Konzentration vonHNP1‐3 in der Synovialflüssigkeit festgestellt werden, die deutlich
geringerinderOAwaralsinderRA(Riepl,Grasseletal.2010;Ahn,Huangetal.2013).
In der vorliegenden Arbeit war die Immunreaktivität gegenüber HNP1‐3 in der OA
geringer als in der RA und auch der PsA. Viele derHNP1‐3‐positiven Zellen konnten
durchdie typischeMorphologiemitdemseptierten,polymorphenZellkernalsneutro‐
phileGranulozyten identifiziertwerden.DieseBeobachtungkannerklären,warumdie
Immunreaktivität inderOAgeringerwarals inRAundPsA,da indergeringgradigen
SynovialitisderOAnurseltenneutrophileGranulozytenanzutreffensindimGegensatz
zudenhochgradigenEntzündungenPsAundRA(Kruithof,Baetenetal.2005;deLange‐
Brokaaretal.2012).
GesundeSynovialis
Immunreaktivität gegenüber S100 A8 und S100 A9wurde in jeweils einem Präparat
identifiziert,wobei in Synoviozytennur gegenüberS100A8 Immunreaktivität nachzu‐
weisenwar.
Immunhistochemische Untersuchungen zur Expression von S100 A8 und S100 A9 in
gesunden Synovialisproben finden sich nicht in der Literatur. Die Genexpression von
S100A8undS100A9 inmononukleärenZellenausdemperipherenBlut (nichtweiter
differenziert)wurdebeiGesundenmithilfe einesGen‐Microarraysuntersuchtundmit
RA‐undPsA‐Patientenverglichen(Gu,Marker‐Hermannetal.2002):DieRA‐undPsA‐
PatientenzeigteneinestarkerhöhteExpressionderGenevonS100A8undS100A9im
GegensatzzudenGesunden.
In denGelenkproben der vorliegendenArbeitwurde auch in der gesunden Synovialis
eineExpressionvonS100A8undS100A9detektiert.Dabeiistfraglich,inwieferndiese
ExpressionalsphysiologischzuwertenwaroderobdiewenigenPatienten,dieImmun‐
reaktivitätgegenüberS100A8undS100A9zeigten,eineReizungderSynovialishatten,
welche ggf. Grund für die Arthroskopiewar und dabei jedoch so schwach ausgeprägt
war,dasssichmakroskopischkeinePathologie feststellen ließ.SolcheineReizungder
SynovialiskönntezueinergeringenS100A8‐bzw.S100A9‐Expressiongeführthaben.
HNP1‐3 ließsich in3von5Präparaten inLeukozyten imSynovialstromaund inBlut‐
gefäßendetektieren, in Synoviozytenwurde keinHNP1‐3 exprimiert.Die Immunreak‐
tivität im Synovialstroma ging vor allem auf Granulozyten zurück, die vereinzelt im
58
Bindegewebezufindenwaren.PhysiologischerweiseistdieAnzahlneutrophilerGranu‐
lozyteningesundenGelenkengering,waserklärenkönnte,warumdieImmunreaktivität
gegenüberHNP1‐3indengesundenProbeneherspärlichwar.DieseErgebnissedecken
sich mit den Untersuchungen von Paulsen et al., bei denen ebenfalls einige wenige
GranulozytenimSynovialstromavonGesundenHNP1‐3exprimierten(Paulsen,Pufeet
al.2002).
4.3.TherapienderPatienten
DiespezielleMöglichkeit,GewebeprobenvonGelenkenverschiedenerArthritisentitäten
auf ihrevergleichendeExpressionanverschiedenenKlassenvonAMPzuuntersuchen,
ist in dieser Arbeit der Kooperationmit den Kollegen aus Leeds und Aachen zu ver‐
danken.WichtigzubeachtenbeiderBewertungderErgebnisseistdiemedikamentöse
Therapie,diediePatientenzumZeitpunktderBiopsieerhielten.HinweisezumEinfluss
vonMethotrexat(MTX),einemseitvielenJahreninderTherapieentzündlicherGelenk‐
erkrankungenetabliertenDMARD,findensichinderobenbereitserwähntenArbeitvon
DavidKane,inderProbenvonPsA‐Patienten,diesowohlvoralsauchnachBeginnder
MTX‐Therapie biopsiertwordenwaren, auf die Expression von S100A8 und S100A9
immunhistochemisch untersucht wurden (Kane, Roth et al. 2003). In den Präparaten
zeigten sich deutliche Reduktionen der AMP‐Expression unter der MTX‐Therapie, in
einigenPräparatenwarendieProteinesogargarnichtmehrnachweisbar.
In der vorliegendenArbeitwurdenmehrerePatienten zumZeitpunkt derBiopsiemit
MTXbehandelt.DarunterwareinPsA‐Patient,indessenProbekeineImmunreaktivität
gegenüberS100A8undS100A9nachgewiesenwurde.ObdiesanderMTX‐Behandlung
lag,bleibtoffen. InderGruppederRAwurdenmehrerePatientenmitMTXbehandelt.
EinigedieserProbenzeigtenhingegeneinemituntersehrstarkeExpressionvonS100A8
und S100 A9, darunter auch Immunreaktivität in Synoviozyten der Membrana
synovialis. Andere RA‐Präparate unter MTX‐Therapie wiederum zeigten keine
ExpressionderbeidenAMP.DamitstelltsichdieFrage,wiedieseUnterschiedezustande
kamen – warum exprimierten einige Patienten unter MTX‐Therapie S100 A8 und
S100A9undanderePatientennicht?Möglichwäre,dassgenaudiePatienten,dietrotz
MTX‐TherapieeineS100A8/A9‐Expressionzeigten,schlechtaufMTXansprachen.4der
59
5 RA‐Patienten zeigten unter MTX erhöhte CRP‐Werte und leicht‐ odermittelgradige
Synovialitiden imSynovitisscore.DaS100A8/A9bereitsalspotentielleMarker fürdie
KrankheitsaktivitätderRAbeschriebensind(Kang,Wooetal.2014),sollte inZukunft
ebenfalls eine Assoziation zumTherapieansprechen von z.B.MTX untersuchtwerden.
DieErforschungderMechanismen,diebeiArthritispatientenzurExpressionderproin‐
flammatorischenAMP S100A8und S100A9 trotzMTX‐Therapie führen, könntemög‐
licherweise neue Therapieansätze hervorbringen. Außerdem könnten möglicherweise
AMPalsBiomarker zurQuantifizierungderWirksamkeit genutztwerden:Regelmäßig
gemessene Konzentrationen der AMP (bevorzugt im Serum) könnten ein weiteres
Instrument zur Messung der Krankheitsaktivität und damit der Beurteilung des
Therapieerfolgesdarstellen.
Hinweise darauf, dass nicht generell davon ausgegangen werden kann, dass immun‐
suppressive Medikamente die AMP‐Expression hemmen, finden sich bei Riepl et al.
(Riepl, Grassel et al. 2010): Zunächst wurde erwartet, dass das immunsuppressive
Hormon Kortisol die Expression des proinflammatorischwirkendenHNP1‐3hemmen
würde. Untersuchungen der HNP1‐3‐Produktion von Synoviozytenkulturen zeigten
jedoch,dassKortisolwederalleindieProduktionmindertenochsynergistischeEffekte
zusammenmitNoradrenalin,dasHNP1‐3hemmt,erzeugte.
MitdenAngabenzudermedikamentösenTherapiederPatientenfindensichindervor‐
liegendenArbeitHinweise,welcheantimikrobiellenPeptide trotzverschiedenerMedi‐
kamente indenSynovialisprobenexprimiertwurden(VergleichTabellen6‐8,S.2929‐
34).Weitergehende Untersuchungen, möglichst an noch nicht therapierten Patienten,
sindaufgrunddergeringenFallzahlenunbedingterforderlich.
4.4.VergleichderGelenkerkrankungen
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Unterschiede und Gemeinsamkeiten in der
Expression antimikrobieller Peptide zwischen den untersuchten Gelenkentzündungs‐
entitätenherauszufinden.BetrachtetmandievorliegendenErgebnissederAMP‐Expres‐
sionvonrheumatoiderArthritisundPsoriasis‐Arthritis,erkenntmanzunächstvieleGe‐
meinsamkeiten.BeideEntitätenzeigenkeineExpressionvonPsoriasin,RNase7,hBD‐2
undhBD‐3.GemeinsamistderPsAundderRAaußerdemdieImmunreaktivitätgegen‐
60
überS100A8,S100A9undHNP1‐3,diestärkeristalsdieImmunreaktivitätgegenüber
dengenanntenAMPinOAunddengesundenKontrollen(VergleichTabellen6‐9,S.29‐
36).LL‐37wurdenurinPsAdetektiert,jedocheherspärlichineinzelnenLeukozytenim
Synovialstroma.
AMP‐ExpressioninderMembranasynovialis
S100A8,S100A9undHNP1‐3wurdennichtnurimSynovialstromavonPsAundRAex‐
primiert,sondernwurdenauchinderMembranasynovialisinSynoviozytendetektiert.
AuchwenndieErgebnissenichtstatistischsignifikantwaren,fälltauf,dassdieExpres‐
sionvonS100A8,S100A9undHNP1‐3nurindenSynoviozytenvonPsAundRAzude‐
tektierenwar, inderOsteoarthroseunddergesundenSynovialis(mitAusnahmeeines
einzelnen S100 A8‐positiven Präparates) die Expression hingegen auf das Synovial‐
stromabeschränktwar.
Alle Synoviozyten‐positiven Präparate erhielten im Rahmen des „Synovitis‐Scores“ 1
oder2PunkteinderKategorie„VerdickungderMembranasynovialis“,umgekehrtließ
sich jedoch bei vielen anderen Präparaten, die ebenfalls 1 oder 2 Punkte für die Ver‐
dickung des Membrana synovialis erhielten, keine Immunreaktivität in Synoviozyten
nachweisen.DieVerdickungscheintalsoingewisserWeiseVoraussetzungfürdieAMP‐
Expression inSynoviozytenzusein, istabernichtalleinentscheidend. Indenanderen
KriteriendesSynovitisscores„DichteresidenterZellenimSynovialstroma“und„Anzahl
infiltrierterZellenimSynovialstroma“warkeineAssoziationzwischenAMP‐Expression
undeinerhohenPunktzahlimSynovitisscoreerkennbar.
In der Literatur wird die Expression einzelner antimikrobieller Peptide in der Deck‐
schichtderSynovialisebenfallsfürhochgradigentzündlicheSynovialitidenbeschrieben.
Bei Kane et al. zeigten die Epithelien von RA und PsA vereinzelt Immunreaktivität
gegenüberS100A8undS100A9,unterschiedensichdabeijedochnichtvoneinander.
S100A8undA9
Deutlich stärker als in derMembrana synovialiswar die Immunreaktivität gegenüber
S100A8undS100A9 imSynovialstroma.HierzeigtensichzudemUnterschiede inder
ExpressionderAMPzwischenPsAundRA:InderImmunhistochemiezeigtensichinder
PsA Infiltrate von S100‐A8‐und S100‐A9‐positiven Leukozyten vor allem perivasal. In
denProbenderRAexprimiertenhingegennureinzeln imStromaliegendeLeukozyten
61
S100A8und/oderS100A9.DieAssoziationzudenBlutgefäßen,wiesieinderPsAvor‐
herrschte,warinderRAnichtzuerkennen.EineUntersuchungvonYoussefetal.zeigt
dieAbhängigkeitderExpressionvonS100A8undS100A9vonderNähezurKnorpel‐
Pannus‐Region in der rheumatoiden Arthritis. Nah an dieser Junktionszone, wo be‐
sonders viele Phagozyten zu finden sind, ließ sich eine hohe Immunreaktivität de‐
tektieren.Weit entfernt von derKnorpel‐Pannus‐Region hingegenwurden in denRA‐
ProbennurwenigS100A8undS100A9exprimiert(Youssefetal.1999).
DaS100A8undS100A9vorallemvonPhagozytengebildetwerdenundimRahmenvon
EntzündungenalsproinflammatorischeZytokineagieren (Ehrchen, Sunderkotteret al.
2009), ist es nicht verwunderlich, dass in der Osteoarthrose, einer niedriggradigen
Synovialitis,wenigerImmunreaktivitätdetektiertwurdealsindenhochgradigenSyno‐
vialitidenPsoriasis‐ArthritisundrheumatoiderArthritis.
HNP1‐3
HNP1‐3wurdeinallenEntitätennachgewiesen,wobeidiestärksteImmunreaktivitätin
der Psoriasis‐Arthritis und der rheumatoiden Arthritis identifiziert wurde. In beiden
Arthritidenwaren imVergleichzurOsteoarthroseunddengesundenKontrollenmehr
HNP1‐3‐positive Leukozyten im Synovialstroma und in synovialen Blutgefäßen detek‐
tierbar, die Immunreaktivitätwar stärker in den einzelnen Zellen undnur in der PsA
und der RAwurdeHNP1‐3 im Synovialisepithel exprimiert. Signifikante Unterschiede
zwischendenPsA‐unddenRA‐Probenkonnten jedochnichtgefundenwerden. Inbei‐
den Gruppen ging die Immunreaktivität vor allem auf eingewanderte Leukozyten im
Synovialstroma zurück, die häufig aufgrund ihrerMorphologie als neutrophile Granu‐
lozytenidentifiziertwerdenkonnten.
Untersuchungen zur Expression vonHNP1‐3 in Psoriasis‐Arthritis sind bisher in der
Literaturnichtbeschrieben.Zur rheumatoidenArthritishingegen findensichmehrere
Untersuchungen, die allesamt erhöhte Konzentrationen vonHNP1‐3 in Synovialis und
SynovialflüssigkeitzeigtenundunsereErgebnissedamitbestätigten(Paulsen,Pufeetal.
2002; Bokarewa et al. 2003; Riepl, Grassel et al. 2010;Ahn,Huang et al. 2013). Auch
konnte einMechanismus, der zu einer erhöhten Expression dieses AMP führt, bereits
identifiziertwerden(Riepl,Grasseletal.2010):NoradrenalinkannimgesundenGelenk,
wenn es durch sympathischeNervenendigungen in hohenDosen freigesetztwird, die
HNP1‐3‐Expressionüberβ2‐Rezeptorenhemmen.DadieseNervenendigungeninderRA
62
durch die vorherrschende Entzündung geschädigt sind und damit die Noradrenalin‐
freisetzung vermindert ist, ist die Hemmung der HNP1‐3‐Expression über β2‐Rezep‐
toren, die nur bei hohenKonzentrationen stimuliertwerden, nichtmöglich.WieNor‐
adrenalin hemmt auch TNF‐α unter physiologischen Bedingungen die Expression von
HNP1‐3.DurchstetighoheTNF‐α‐KonzentrationeninderRAsinddieTNF‐α‐Rezeptoren
jedoch desensibilisiert und die Hemmung der HNP1‐3‐Expression ist damit abge‐
schwächt.DamitfehleninderRAzweiMechanismenzurHemmungderHNP1‐3‐Expres‐
sion.
Da HNP1‐3 selbst auch eine proinflammatorische Wirkung zugeschrieben wird
(Soehnlein et al. 2008;Presicce et al. 2009), liegt nahe,dass erhöhteHNP1‐3‐Konzen‐
trationenzueinererhöhtenKrankheitsaktivitätführenkönnen,wassichmitklinischen
Beobachtungendeckt.DemnachkorreliertbeiRA‐PatientendieHöhederHNP1‐3‐Kon‐
zentrationinderSynovialisflüssigkeitmitderLeukozytenzahlimBlut(Bokarewa,Jinet
al.2003)undistebensodeutlichhöher,wennbeidenPatientenradiologischErosionen,
ein CRP >2mg/dl im Blut oder ein positiver Rheumafaktor nachweisbar sind (Ahn,
Huang et al. 2013). Diese Assoziation von HNP1‐3 mit einer erhöhten Krankheits‐
aktivität inrheumatoiderArthritis istauchinderPsAdenkbar,daindervorliegenden
ArbeiteinedeutlicheInduktionvonHNP1‐3indenProbenderPsAdetektierbarwarund
allePatientenaufgrundihresschwerenKrankheitsverlaufesoperativGelenkersätzeer‐
haltenmussten.
IndervorliegendenArbeitwurdeImmunreaktivitätgegenüberHNP1‐3auchinBiopsien
beiOsteoarthrosedetektiert.BetrachtetmandiepositivenPräparateunterdemLicht‐
mikroskop, fällt auf, dass zwar in allen Präparaten positive Zellen zu finden sind, die
Immunreaktivität jedochdeutlichschwächer istals inderRAoderderPsA. InderOA
exprimierennur einzelneZellen imSynovialstromaHNP1‐3.WieauchbeiderRAund
derPsAsindvieledieserZellenaufgrund ihrer typischenMorphologiealsneutrophile
Granulozytenidentifizierbar,nuristdieAnzahlinderOAdeutlichgeringer.Daebenfalls
ingesundenProbenindervorliegendenArbeitsowieinderLiteratur(Paulsen,Pufeet
al.2002)einzelneHNP1‐3‐positiveGranulozyten imSynovialstromagefundenwurden,
stelltsichdieFrage,inwieferneineniedrigeHNP1‐3‐Expressionphysiologischistundob
HNP1‐3inderOsteoarthroseüberhauptvermehrtexprimiertwird.
63
LL‐37
LL‐37wurde in2PsA‐Probendetektiert, in rheumatoiderArthritishingegen fandsich
keinerleiImmunreaktivitätgegenüberdemCathelicidin.Dabeiseianzumerken,dassdie
Immunreaktivität gegenüberLL‐37 inderPsoriasis‐Arthritis nur inwenigenZellen zu
detektierenwar.InderLiteraturfindensichkeineUntersuchungenzurExpressionvon
LL‐37 in PsA, jedoch eine Publikation zu rheumatoider Arthritis (Paulsen, Pufe et al.
2002): Per RT‐PCR konnte LL‐37 in Synovialisproben von Patienten mit RA nachge‐
wiesen werden. Warum in der vorliegenden Arbeit mittels Immunhistochemie keine
Immunreaktivität nachgewiesen werden konnte, könnte folgendermaßen begründet
werden: LL‐37wird in vielen Epithelien des Körpers exprimiert, aber auch von ver‐
schiedenen Zellen des angeborenen Immunsystemwie natürlichen Killerzellen, Mast‐
zellenundneutrophilenGranulozyten (Vandammeetal.2012).Besondersdieneutro‐
philenGranulozytensindinrheumatoiderArthritisindenGelenkenineinerhohenZahl
zu finden, jedoch vor allem in der Synovialflüssigkeit und nicht in der Synovialis. Die
neutrophilen Granulozyten diapedieren von Chemokinen angelockt zunächst von den
BlutgefäßenderSynovialisindassynovialeStroma,wandernimAnschlussdaranjedoch
raschindieSynovialflüssigkeit(Harris1990).MitdergeringenAnzahlneutrophilerGra‐
nulozyten im Synovialisgewebe sinkt damit auch dieWahrscheinlichkeit, histologisch
ImmunreaktivitätgegenüberLL‐37nachzuweisen.
Zusammenfassend lässtsichfeststellen,dassdiehöchsteImmunreaktivitätgegen‐
übermehrerenAMP,vorallemS100A8,S100A9undHNP1‐3, indenProbenderPso‐
riasisarthritis und der rheumatoiden Arthritis detektiertwurde. In der Osteoarthrose
unddengesundenKontrollenwarenauchverschiedeneAMPnachweisbar,dieExpres‐
sionwar jedoch schwächer als in denhochgradigen Synovialitiden.Dabei überwiegen
dieGemeinsamkeitenvonRAundPsAin ihrerAMP‐Expression.Unterschiedekonnten
inderExpressionvonLL‐37(nurinPsAdetektiert)undS100A8/A9(beiPsAinAssozia‐
tion zu den Leukozyten in Blutgefäßen, bei RA vereinzelt im Synovialstroma liegende
positiveLeukozyten)festgestelltwerden.
Dass AMP vorwiegend in hochgradigen Synovialitiden exprimiertwerden, unterstützt
dieVermutung,dasseinigeAMP insterilenGelenkentzündungenwiederPsAundder
RAvorallemimmunmodulatorischeFunktionenerfüllenundaufgrunddesFehlensvon
Mikroben ihre antimikrobielle Wirkung eher im Hintergrund steht. Das Fehlen von
64
Mikroorganismenals InduktorenderAMP‐Expression,wiebeispielsweiseanderHaut,
woMikrobeninKeratinozyteneineExpressionvonAMPinduzierenkönnen(Vergleich
4.5.ErgebnisseHaut),lässtdenSchlusszu,dassinderSynovialisvonPsAundRAandere
InduktionsmechanismenzurExpressionvonAMP imVordergrundstehen.Dabeiwäre
es denkbar, dass IL‐17 eine Rolle spielt, denn IL‐17 ist in der PsA in hohemMaß zu
finden(Menonetal.2014)undkannzudemdieExpressionfolgenderAMPinKeratino‐
zyten induzieren: S100A8, S100A9,Psoriasin, hBD‐2undRNase 7 (Liang et al. 2006;
Simanski et al. 2013). In der vorliegenden Arbeit wurden in der PsA S100 A8 und
S100A9 nachgewiesen, was IL‐17 nach oben genannter Hypothese stimuliert haben
könnte. Fraglich ist jedoch,warumhBD‐2,PsoriasinundRNase7nicht auch induziert
wurden. Möglich ist, dass dafür der notwendige Induktionsmechanismus durch Bak‐
terienfehlte,dennauchinderphysiologischsterilenSynovialisistunterpathologischen
Bedingungen eine Induktion vonAMPdurchBakterienmöglich: In pyogenerArthritis
mitnachgewiesenemBefallvonStaphylococcusaureusoderStaphylococcusepidermidis
wurdeeineExpressionvonhBD‐2inderSynovialisimmunhistochemischnachgewiesen
(Varogaetal.2009).Denkbaristalso,dassindensterilenArthritidenPsAundRAdurch
proinflammatorischeZytokineimRahmenderEntzündungeineAMP‐Expressionstimu‐
liertwird,aufgrunddernichtvorhandenenbakteriellenNormalfloradasProfilderAMP
jedochandersistalsdasderHautbeiPsoriasis.
4.5.ErgebnisseHaut
S100A8undS100A9
Die beiden S100‐Proteine S100 A8 und S100 A9 werden in gesunder Haut nur in
geringemMaß,inPsoriasisläsionenhingegenstarkexprimiert(Kerkhoffetal.2012).Bei
S100A8 gehtdieExpression stärkeraufdieKeratinozyten selbst zurück,S100A9 hin‐
gegen wird vermehrt von neutrophilen Granulozyten exprimiert (Aochi, Tsuji et al.
2011).DieErgebnissedervorliegendenArbeitdeckensichgrößtenteilsmitdiesenAn‐
gaben.S100A9wurdeauchhierindenPsoriasisläsionenverstärktnachgewiesen(Epi‐
dermisscoredurchschnittlich3,5imVergleichzu2,25beinicht‐läsionalerHaut).Auchin
der Dermis waren in den Läsionenmehr S100 A9‐positive Zellen zu detektieren. Be‐
trachtetman die vorliegenden Ergebnisse zur S100A8‐Expression, findetman jedoch
65
UnterschiedezubisherigenArbeiten.IndendermalenLeukozytenlässtsichindenPro‐
ben der Psoriasisläsionen eine höhere S100 A8‐Expression als in den nichtläsionalen
odergesundenProbendetektieren.InderEpidermisjedochwurdeindervorliegenden
ArbeitinallenProbenImmunreaktivitätgegenüberS100A8inallenEpidermisschichten
nachgewiesen.BeiderBewertungderErgebnissemussdieAuswertungmittelsdesIHC‐
Scoresgenauerbetrachtetwerden:BeidenErgebnissenzurS100A8‐Expressionkönnte
der IHC‐Score an seine Grenzen stoßen, da er nicht berücksichtigt, wie stark oder
schwach die Immunreaktivität ist und ob sie fokal oder diffus in den einzelnen Epi‐
dermisschichten zu finden ist. Betrachtet man die Präparate dieser Arbeit im Licht‐
mikroskop,sofälltauf,dasszwarauchindennichtläsionalenundgesundenProbenalle
Epidermisschichten Immunreaktivität gegenüber S100 A8 aufweisen, die Immun‐
reaktivitätaberdeutlichschwächerals indenPsoriasisläsionenundzudemhäufignur
fokalausgeprägtist.WürdenStärkederExpressionsowiedieDifferenzierungzwischen
fokalunddiffuszusätzlichimIHC‐Scoreberücksichtigt,würdederScoreallerdingsun‐
übersichtlicher und schlechter für Vergleiche heranziehbar sein, da keineMittelwerte
mehr gebildet werden könnten. Deshalb wurden diese beiden Kriterien nicht in den
Scoreaufgenommen.
WelcheMechanismenzudererhöhtenExpressionvonS100A8undS100A9inPsoriasis‐
läsionenführen,istnichtabschließendgeklärt.EsgibtHinweise,dassIL‐22,IL‐17Aund
IL‐17F(inderPsoriasispathogenesezentraleproinflammatorischeZytokine)sowieein
Epithel‐assoziierterWachstumsfaktor (LEDGF, lens epithelium‐derived growth factor)
in Keratinozyten die Expression der AMP induzieren können (Liang, Tan et al. 2006;
Takeichietal.2010).S100A8undS100A9 selbst tragenwiederumüberverschiedene
MechanismenzurEntstehungderPsoriasisbei – siehemmendieDifferenzierungund
fördern die Proliferation der Keratinozyten und induzieren die Produktion der proin‐
flammatorischen Zytokine IL‐6, IL‐8 und TNF‐α, die wiederum weitere Immunzellen
anlocken(Nukuietal.2008).ZudemfördernsiedieAngiogenese, indemsieEndothel‐
zellen zur Proliferation und Formation neuer Blutgefäße anregen (Lee et al. 2012).
S100A8undS100A9fungierendamitalsproinflammatorischeZytokineinderPsoriasis‐
pathogeneseundkönntensomitaucheinneuestherapeutischesZieldarstellen.
66
HNP1‐3undLL‐37
Immunreaktivität gegenüberHNP1‐3war inder vorliegendenArbeit vor allem in den
Psoriasisläsionen detektierbar. Die Immunreaktivität ging dabei vorrangig auf einge‐
wanderteLeukozytenzurück.SozeigtezumeinendieDermisvielepositiveneutrophile
Granulozyten (im Lichtmikroskop durch die typische Morphologie identifiziert) und
anderepositivemononukleäreZellen,aberauchinderEpidermiswarImmunreaktivität
zu finden.Diesewar vor allem in Akkumulationen von neutrophilen Granulozyten im
Stratum corneum, den sogenannten Munroschen Mikroabszessen, nachzuweisen. In
einemPräparatwurdejedochauchImmunreaktivitätinKeratinozytendetektiert.Inder
LiteraturfindensichebenfallsHinweisedarauf,dassdieExpressionvonHNP1‐3inder
EpidermisnichtnuraufGranulozyten,sondernauchaufKeratinozytenzurückzuführen
ist (HarderundSchröder2005).ZweiUmständegaben inderArbeitvonHarderetal.
Hinweise auf die HNP1‐3‐Expression in Keratinozyten: Zum einen wurde Schuppen‐
materialvonchronischenPlaques,dieinderRegelkeineodernursehrwenigeneutro‐
phileGranulozytenenthalten,verwendetundzumanderenindenSchuppendieKonzen‐
trationen der Neutrophilen‐Marker Myeloperoxidase und Laktoferrin bestimmt, die
beidenuringeringerKonzentrationnachweisbarwaren.DieHNP1‐3‐Konzentrationwar
jedochhoch.DamitwurdeindieserArbeitgezeigt,dassdieHNP1‐3‐Expressionnichtauf
neutrophile Granulozyten zurückging, jedoch konnte nicht bewiesenwerden, dass die
HNP1‐3‐ExpressionaufdieKeratinozytenzurückzuführenwar.IneinemPräparatinder
vorliegendenArbeitkonntedieExpressionvonHNP1‐3inKeratinozytendetektiertwer‐
den,wobei sie in den hohenEpidermisschichten am stärksten und im Stratumbasale
nichtnachzuweisenwar.
LL‐37wurde indervorliegendenArbeitnur inderHautderPsoriasispatientendetek‐
tiert, die Proben der gesunden Kontrollen blieben gänzlich negativ. Die Immun‐
reaktivität ging sowohl auf neutrophile Granulozyten in Munroschen Mikroabszessen
zurück als auch aufKeratinozyten selbst undwar am stärksten inder läsionalenPso‐
riasishautnachweisbar.AuchinderDermiswurdeineinigenneutrophilenGranulozyten
eineLL‐37‐Expressionnachgewiesen.
DieseErgebnissedeckensichmitAngabeninderLiteratur,wonachinderPsoriasisdas
AMP LL‐37 induziert ist und vor allem von Keratinozyten und neutrophilen Granulo‐
zytenexprimiertwird(Frohmetal.1997). JedochkönnenauchandereZellenwieNK‐
ZellenoderT‐ZellendiesesAMPexprimieren(Agerberth,Charoetal.2000).LL‐37trägt
67
nichtnurmitseinerantimikrobiellenWirkunggegenübermehrerenGram‐positivenund
Gram‐negativenBakterien(Larricketal.1995)zur Immunabwehrbei.LL‐37 sollauch
maßgeblich die Entstehung der Psoriasis begünstigen können (Batycka‐Baran et al.
2014): Es kann mit körpereigener DNA aus zerfallenen Zellen Komplexe bilden, die
plasmazytoide Zellen über TLR‐9, der in gesunder Haut nur mikrobielle DNA bindet,
erkennen. Diese Bindung führt zur Aktivierung der plasmazytoiden dendritischen
Zellen, die daraufhin IFN‐α produzieren (Lande, Gregorio et al. 2007). IFN‐α aktiviert
myeloidedendritischeZellen,dieimaktiviertenZustanddieDifferenzierungvonTH‐1‐
und TH‐17‐Zellen induzieren, welche dann über Zytokine wie IL17‐A und –F, IL‐22,
TNF‐αund IFN‐γKeratinozytenweiter stimulieren können (Nestle et al. 2009). Somit
kann LL‐37 entscheidend zur Entstehung der Psoriasis beitragen, indem es die
AktivierungderplasmazytoidendendritischenZellenermöglicht.
PsoriasinundRNase7
Eine Expression von Psoriasin konnte in der vorliegenden Arbeit in den Proben der
PsoriasispatientenundauchindengesundenKontrollennachgewiesenwerden.Inden
Psoriasisläsionen wurde starke Immunreaktivität detektiert, in den nichtläsionalen
ProbenderPsoriasispatientenwardie Immunreaktivität etwas schwächerund inden
gesunden Kontrollen wurden nur fokal einige Psoriasin‐positiven Keratinozyten im
Stratumcorneumnachgewiesen.DieseAngabendeckensichmitAngabenausderLite‐
raturzurExpressionvonPsoriasin.PsoriasinwirdkonstitutivvongesunderHautexpri‐
miert,dieExpressionschwanktjedochstarkinAbhängigkeitvonderKörperlokalisation
(Gläseretal.2005).InderPsoriasishingegenistPsoriasinstarkinduziert,waszurerst‐
maligen Isolierung und weiteren Charakterisierung aus psoriatischen Keratinozyten
führte (Celis et al. 1990; Madsen et al. 1991). Die Funktionen des AMP sind dabei
vielfältig. Äußerst wichtig für den Schutz der gesunden Haut und besonders der
barrieregestörtenPsoriasishautistdieantimikrobielleFunktionvonPsoriasin.Bereitsin
sehr geringen Konzentrationen wirkt Psoriasin bakterizid gegen Escherichia coli, in
höherenKonzentrationenaußerdemgegenPseudomonasaeruginosaundStaphylococcus
aureus.AufPsoriasinwird,daesvongesunderHautkonstitutivgebildetwird,dienatür‐
liche Resistenz der Haut auf die Besiedlung von und Infektionen mit E. coli zurück‐
geführt (Gläser, Harder et al. 2005). Neben der antimikrobiellen Funktion werden
Psoriasinauch chemotaktischeWirkungen aufGranulozyten,MonozytenundLympho‐
68
zyten zugeschrieben (Wolf et al. 2008).Psoriasin stimuliert neutrophile Granulozyten
zur Produktion reaktiver Sauerstoffverbindungen und proinflammatorischer Zytokine
wie IL‐6, IL‐8 und TNF‐α (Zheng et al. 2008). Die Produktion von Psoriasin kann
wiederumselbstdurchproinflammatorischeZytokine induziertwerden: IL‐17A, IL‐22
undTNF‐α(Hegyietal.2012).EineHemmungvonPsoriasinkönntesomit theoretisch
einen möglichen therapeutischen Nutzen darstellen. Denkbar ist dabei jedoch, dass
nebenderproinflammatorischenWirkungauchdieantimikrobielleWirkungvermindert
würde,wasdiePsoriasisläsionengegebenenfallsanfälligermachenkönntefürInfektio‐
nen.
RNase 7 konnte in der vorliegenden Arbeit ebenfalls sowohl in Psoriasisläsionen als
auchinnichtläsionalerPsoriasishautsowieingesunderHautdetektiertwerden,wobei
die Immunreaktivität in der läsionalen Psoriasishaut am stärksten war. Diese
konstitutiveExpressionvonRNase7 ingesunderHautunddie induzierte inPsoriasis‐
läsionenwurden in der Literatur ebenfalls beschrieben (Harder et al. 2002).RNase7
kennzeichneteinestarkeantimikrobielleAktivitätsowohlgegenGram‐positiveErreger
(Staphylococcusaureus,Propionibacteriumacnes)alsauchgegenGram‐negativeErreger
(Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecium (einen vancomycin‐
resistentenStamm))sowiedenHefepilzCandidaalbicans(HarderundSchröder2002).
Die Konzentrationen, bei denen RNase 7 in vitro bereits antimikrobiell wirkt, sind
äußerstgering,wasRNase7zumpotentestenbisherbekanntenAMPmacht(Harderund
Schröder2002;HarderundSchröder2005).
Induzierbar ist RNase 7 durch IL‐1β, TNF‐α, IFNγ, IL‐17A und über den Kontakt mit
Bakterien (Harder und Schröder 2002; Simanski, Rademacher et al. 2013). Inwiefern
RNase 7 weitere immunmodulatorische Funktionen erfüllt und zur Pathogenese der
Psoriasisbeiträgt,istbisherunklar.
hBD‐2undhBD‐3
Die humanen β‐Defensine hBD‐2 und hBD‐3 wurden nur in der Haut der Psoriasis‐
patienten nachgewiesen – in der läsionalen Psoriasishaut war die Immunreaktivität
deutlich stärker als in der nichtläsionalen. Diese Ergebnisse decken sichmit Angaben
der Literatur, wonach hBD‐2 und hBD‐3 in Psoriasisläsionen stark induziert sind
(Harder, Bartels et al. 1997; Harder et al. 2001).Die Funktionen der Defensine sind
dabeivielfältig.ZumeinenhabensieantimikrobielleWirkungen:HBD‐2wirktvorallem
69
bakterizidgegenGram‐negativeBakterienwieEscherichiacoliundPseudomonasaerugi‐
nosa.Außerdem zeigt es eine antimikrobielleWirkung gegen Candida albicans, gegen
Gram‐positiveBakterienhingegenwirkthBD‐2nurinhohenKonzentrationenbakterio‐
statisch (Harder,Bartels et al. 1997). ImGegensatzdazu zeigthBD‐3bakterizideWir‐
kung gegen sowohl Gram‐negative als auch Gram‐positive Bakterien, darunter auch
multiresistente Erreger wieMethicillin‐resistente Staphylococcus‐aureus‐(MRSA)‐Stäm‐
meundVancomycin‐resistenteEnterococcus‐faecium‐(VRE)‐Stämme (Harder,Bartels et
al. 2001). Besonders in Hinblick auf die Pathogenese der Psoriasis zeigen hBD‐2 und
hBD‐3 weitere interessante immunmodulatorische Funktionen: Sie wirken chemo‐
taktischaufT‐ZellenunddendritischeZellen,hBD‐2zusätzlichaufMastzellenundhBD‐3
zusätzlich auf Monozyten/Makrophagen (Oppenheim et al. 2005). Dazu stimulieren
hBD‐2 und hBD‐3 Keratinozyten sowohl zur Differenzierung als auch zur Produktion
proinflammatorischerZytokinewie IL‐6, IL‐10undMCP‐1(monocytechemoattractant
protein1)(Niyonsabaetal.2007).DarüberhinausstimulierenhBD‐2und ‐3wieauch
LL‐37dieAufnahmevoneigenerDNAinKomplexendurchplasmazytoidedendritische
Zellen, diedadurch aktiviertwerdenunddiePathogenesederPsoriasisweiter voran‐
treiben(Tewaryetal.2013;Landeetal.2014).Dievielfältigenimmunmodulatorischen
Funktionen der β‐Defensine spiegeln sich in der klinischenBeobachtungwieder, dass
erhöhte Serumwerte von hBD‐2mit einer erhöhten Krankheitsaktivität der Psoriasis,
gemessenamPASI‐Score(PsoriasisAreaandSeverityIndex),assoziiertsind(Jansenet
al.2009).Somitzeigensich,wieauchbeiPsoriasin,Vor‐undNachteilederInduktionder
β‐Defensine:AufdereinenSeitekönnensiediePsoriasisläsionenmit ihrerantimikro‐
biellen Wirkung schützen, auf der anderen Seite können sie mit ihren proinflamma‐
torischenFunktionendiePathogenesevorantreiben.
4.6.VergleichHaut–Gelenk
ImVergleichderExpressionderantimikrobiellenPeptideinderHautderPsoriasisvul‐
garis mit der Expression in der Synovialis der Psoriasis‐Arthritis finden sich sowohl
UnterschiedealsauchGemeinsamkeiten.
Auffallend ist,dassPsoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3nur inderPsoriasisderHaut
detektiert wurden. In den PsA‐Proben hingegen wurde keinerlei Immunreaktivität
70
gegenüberdiesenAMPnachgewiesen. InderBetrachtungder Induktionsmechanismen
dieser AMP in der Haut fällt auf, dass neben verschiedenen proinflammatorischen
Zytokinen alle durch den Kontakt der Keratinozyten mit Bakterien induziert werden
können (Harder und Schröder 2002; Gläser,Harder et al. 2005;Harder und Schröder
2005). Da die Gelenkhöhle jedoch steril ist und die Synoviozyten somit keinen
Bakterienkontakt haben, ist dieser Induktionsmechanismus in der Psoriasisarthritis
nicht möglich. Interessant ist bei dieser Überlegung die Betrachtung der Unter‐
suchungenvonVarogaetal.:HierwurdeeineExpressionvonhBD‐2inSynovialisproben
vonPatientenmitpyogenerArthritisbeschrieben(Varoga,Klostermeieretal.2009).Bei
allen Patienten wurde Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis in der
Gelenkhöhle nachgewiesen – die nunmehr infizierte Synovialis wurde durch den
Bakterienkontakt zurExpression vonhBD‐2 stimuliert. Synoviozyten sinddemnach in
derLage,β‐Defensinezuexprimieren.ObdiesauchfürPsoriasinundRNase7zutrifft,ist
weiterhinunklar.FürPsoriasinbeispielsweisewäreesdenkbar,pyogeneArthritiden,die
durchEscherichia colihervorgerufenwurden, zu untersuchen, da diesesBakterium in
KeratinozytendieExpressionvonPsoriasininduziert(Gläser,Harderetal.2005).
NebenBakterien sind auch proinflammatorische Zytokine in der Lage, die Expression
vonAMPzuinduzieren,wiebeispielsweiseIL‐17,das inKeratinozytendiehBD‐2‐und
diePsoriasin‐Expressionstimuliert(Liang,Tanetal.2006).IL‐17wirdzwarauchinder
PsA in hohem Maß von CD‐8+‐T‐Zellen produziert (Menon, Gullick et al. 2014), nur
bleibt hier die Induktion vonhBD‐2undPsoriasin aus. Dieses Beispiel zeigt die Kom‐
plexität der AMP‐Induktion. Betrachtet man IL‐17 weiter, so fällt auf, dass es neben
hBD‐2 und Psoriasin weitere AMP in Keratinozytenkulturen induziert: S100 A8 und
S100A9.DiesebeidenAMPwiederumwurdennichtnurinderEpidermisderPsoriasis
vulgaris, sondern auch in der Synovialis der Psoriasis‐Arthritis in mehreren Proben
nachgewiesen.WährenddieImmunreaktivitätinderHautsowohlinderEpidermisals
auchinderDermisstarkwar,zeigtesichinderSynovialisdieExpressionvonS100A8
undS100A9vorallemimSynovialstromaineingewandertenLeukozyten.Synoviozyten
zeigtenhingegennur ineinemPräparat Immunreaktivität. In jedemFall istdie Induk‐
tionvonS100A8undS100A9besondersinteressantzubetrachten,dasichdieseAMPin
derPathogenesederPsoriasisalsstarkproinflammatorischwirkendeZytokinegezeigt
haben(VergleichS100A8undS100A9,S.64).DemnachstelltsichdieFrage,inwiefern
sieauchinderPathogenesederPsAproinflammatorischwirken.ErsteHinweisedarauf
71
gibt es bereits, da in experimentell induzierten Arthritiden S100A8 und S100A9 die
Produktion von knorpeldestruierenden MMP (Matrixmetalloproteinasen) stimulierten
undzudemS100A8undS100A9miteinervermehrtenKrankheitsaktivitätinderRAin
Verbindunggebrachtwerden(vanLentetal.2008;Kang,Wooetal.2014).Außerdem
vermindertMethotrexatbeiPsoriasispatientendieExpressionvonS100A8undS100A9
(Kane,Rothetal.2003),wasebenfalls indirekt füreineproinflammatorischeWirkung
derAMPimGelenksprechenkönnte.DennochsindgenaueInduktionsmechanismenin
denLeukozytenderPsAundauchindenSynoviozytenbisherunbekanntundsolltenin
derZukunftweitererforschtwerden.
HNP1‐3 und LL‐37, die vor allem von neutrophilen Granulozyten exprimiert werden,
wurden ebenfalls in der Psoriasis der Haut und in der Synovialis der PsA detektiert.
HNP1‐3wurdevorallemvonLeukozyten,dieinvielenFällenaufgrundihrertypischen
MorphologiealsneutrophileGranulozyten identifiziertwerdenkonnten,exprimiert. In
der Haut wurde zusätzlich in einem Präparat Immunreaktivität in Keratinozyten
nachgewiesen und auch in der Psoriasisarthritis zeigte sich in einer Probe eine In‐
duktioninSynoviozyten.AuchHNP1‐3wirdeineInduktionknorpeldestruierenderMMP
zugeschrieben(Ahn,Huangetal.2013),wobeidieseUntersuchungenbishernuranRA‐
Probengemachtwurden.
LL‐37wurdeebenfallsinderPsoriasisderHautsowiederSynovialisderPsAdetektiert.
Während die Immunreaktivität in der Haut sowohl auf neutrophile Granulozyten in
StratumcorneumundDermisalsauchaufKeratinozytenselbst zurückging, zeigten in
derSynovialisderPsAnureinzelneeingewanderteLeukozytenimSynovialstromaeine
LL‐37‐Expression.DaLL‐37 inderPathogenesederPsoriasis inderHautmitderAkti‐
vierungplasmazytoiderdendritischerZelleneinewichtige, initialeRollezugeschrieben
wird (VergleichHNP1‐3undLL‐37, S. 66), ist es von großem Interessedurchweitere
Untersuchungenzuverstehen,inwiefernLL‐37auchinderPsoriasisarthritiszurPatho‐
genesebeiträgt.
4.7.ZusammenfassungundAusblick
Psoriasiswird nach heutigemKenntnisstand als chronisch inflammatorische System‐
erkrankung angesehen, zu der neben den Hautläsionen verschiedene assoziierte Er‐
72
krankungengehören,u.a.diePsoriasis‐Arthritis(PsA).Da30%derPsoriasis‐Patienten
in Deutschland zusätzlich zu Hautläsionen eine Psoriasis‐Arthritis entwickeln, ist die
Erforschung von Unterschieden und Gemeinsamkeiten der beiden Ausprägungen von
hohemInteresse.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Expression antimikrobieller Peptide
(AMP)inderEpidermisvonPsoriasisläsionenundderSynovialisvonPsoriasis‐Arthritis
(PsA).UmdieErgebnissederAMP‐Expressionbesserinterpretierenzukönnen,wurden
neben denPsA‐Proben (n=10) auch Proben von Patientenmit rheumatoiderArthritis
(RA, n=8), Osteoarthrose (OA, n=4) sowie gesunden Kontrollen (n=5) gewonnen und
von den Patienten der Psoriasis‐Hautläsionen (n=4) zusätzlich Proben aus makro‐
skopisch gesunder Haut sowie Proben von Hautgesunden gleichen Alters, gleichen
Geschlechts und gleicher Lokalisation der Biopsie. Die arthroskopisch gewonnenen
Synovialisproben (n=27) und die bioptisch gewonnenen Hautproben (n=12) wurden
mithilfe der Immunhistochemie auf die Expression verschiedener Klassen von AMP
untersucht: Psoriasin (S100 A7), Ribonuklease 7 (RNase 7), die humanen β‐Defensine
hBD‐2 und hBD‐3, das Cathelicidin LL‐37, S100 A8 (Calgranulin A), S100 A9 (Calgra‐
nulinB) und die humanen α‐DefensineHNP1‐3 (humane neutrophile Peptide 1‐3).Die
Präparatewurden lichtmikroskopisch von 2 unabhängigen Gutachtern analysiert. Zur
BeurteilungderHautprobenwurdeeinEpidermisscore,derdieImmunreaktivitätinden
einzelnenSchichtenderOberhautbewertete,verwendet.WeiterhinwurdedieImmun‐
reaktivität in der Dermis beurteilt. Die Synovialisproben wurden nach 3 Gesichts‐
punkten analysiert: 1. Immunreaktivität in Synoviozyten der Membrana synovialis,
2.Immunreaktivität in eingewanderten Leukozyten imSynovialstromaund3. Immun‐
reaktivität in Leukozyten, die inBlutgefäßen zu erkennenwaren. Zudemwurde licht‐
mikroskopischvoneinemweiterenunabhängigenGutachterverblindet für jedeProbe
einSynovitisscorezurBeurteilungderEntzündungsaktivitätbestimmt.
DieErgebnissederUntersuchungenzeigteneinemitunterstarkeInduktionvonS100A8,
S100A9,HNP1‐3undLL‐37indenHautläsionenderpsoriatischenEpidermisundinder
SynovialisderPsA,dieaucheineExpressionvonS100A8,S100A9undHNP1‐3inSyno‐
viozytenderMembranasynovialiseinschloss.
Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3hingegenwurdennur in der Epidermis der Pso‐
riasis detektiert, die Synovialisproben zeigten keine Immunreaktivität. Die Synovialis‐
73
probenderrheumatoidenArthritiszeigteneinähnlichesExpressionsmusterwiedieder
PsA:S100A8,S100A9undHNP1‐3wurdenmitunterstarkexprimiert,sowohlimSyno‐
vialstromaalsauchinderMembranasynovialis.InderOsteoarthroseunddengesunden
KontrollenwardieExpressionderAMPschwächerundnurvereinzeltinLeukozytenim
Synovialstromazudetektieren.
In der Literatur wurde bereits berichtet, dass S100 A8 und S100 A9 mit ihren
proinflammatorischen Funktionen wie der Induktion der IL‐6‐, IL‐8‐ und TNF‐α‐
Produktion in Keratinozyten vorantreiben können. Im Gelenk können AMP ebenfalls
proinflammatorisch wirken: S100 A8, S100 A9 und HNP1‐3 können die Produktion
knorpeldestruierender Proteinasen sowie proinflamma‐torischer Zytokine in
experimentellenArthritideninduzieren.
Aufgrund der in dieser Arbeit nachgewiesenen Expression von S100A8, S100A9und
lässtsichdaherspekulieren,dassS100A8,S100A9undHNP1‐3auchdiePathogenese
derPsAmitihrenvielfältigenproinflammatorischenFunktionenvorantreibenkönnten.
DadieKonzentrationenvonS100A8undS100A9imSerumvonPsoriasispatientenvor
allemmitderKrankheitsaktivitätderPsAundwenigermitderStärkedesHautbefalls
(gemessenamPASI‐Score)assoziiertsind,istvongroßemInteresseherauszufinden,wo
unddurchwelcheZellendieseAMPgebildetwerden.HierliefertdievorliegendeArbeit
äußerst interessante Hinweise, da gezeigt werden konnte, dass die Immunreaktivität
gegenüberS100A8undS100A9vorallemaufverschiedene,entzündungsbedingtindas
SynovialstromaeingewanderteLeukozytenzurückzuführenwarundauchvereinzeltin
Synoviozyten in derMembrana synovialis eine Expression derAMPdetektiertwurde.
EinähnlichesExpressionsmusterwurdefürdievorwiegendvonneutrophilenGranulo‐
zytenexprimiertenAMPHNP1‐3nachgewiesen.
WieinderPsAwurdeauchinderRAImmunreaktivitätgegenüberS100A8,S100A9und
HNP1‐3 in vorwiegend entzündungsbedingt eingewanderten Leukozyten im Synovial‐
stromanachgewiesen,wobei ebenfalls auch inSynoviozytenderMembrana synovialis
eineExpressiondetektiertwurde.StatistischsignifikanteUnterschiede inderAMP‐Ex‐
pressionderPsAundderRAwurdennicht festgestellt.Auffälligwar jedoch,dassPsA
und RA als hochgradige Synovialitiden stärkere Immunreaktivität gegenüber den
genanntenAMPzeigtenalsdieOsteoarthroseunddiegesundenKontrollen.
74
EineAssoziationzwischenImmunreaktivitätundSynovitisscoreoderImmunreaktivität
undTherapiederPatientenwarinkeinerGelenkentzündungerkennbar.
Psoriasin,RNase7,hBD‐2undhBD‐3wurdennurinderHautderPsoriasisdetektiert.In
keiner der untersuchten Arthritiden der vorliegenden Arbeit wurden diese AMP ex‐
primiert.Dabereitsbekanntist,dassimFalleeinerbakteriellenInfektiondesGelenkes
hBD‐2 induzierbar ist, lässt sich vermuten, dass in der sterilen PsA die Induktion der
AMPdurchMikroorganismenausbleibtundBakteriennichtwieanderHautalspotente
Induktorenfungierenkönnen.
Die Erforschung der Pathogenese der Psoriasis an derHaut und amGelenk hat unter
anderemzumZiel,neueVerfahrenzuentwickeln,umbeiPatientenmiteinerPsoriasis
derHaut,wiesietypischerweiseinderKrankheitsgeschichtezunächstvieleJahreallein
auftritt,einebeginnendezusätzlichePsAfrühzeitigdiagnostizierbarzumachenunddie
Patienten einer effektiven Therapie zuzuführen. Idealerweise würde man dabei die
Diagnosestellenwollen,bevorersteBeschwerdenunddamitverbundeneSchädenam
Gelenkentstehen.EineMöglichkeitwäredieder„Screeningmarker“,diediePsAcharak‐
terisieren und von der Psoriasis der Haut abgrenzen könnten. In regelmäßigen Ab‐
ständen könnten dieseMarker aus dem einfach zu gewinnenden Blutserum von Pso‐
riasispatientenbestimmtwerden,umdieEntwicklungeinerPsAfrühzeitiganzuzeigen.
Zum Nachweis von Serumproteinen als Frühmarker einer PsA gibt es bereits erste
Studien. Bis zur klinischenAnwendbarkeit vonAMP als Screeningmarker ist derWeg
jedochnochweit:WeitereUntersuchungensolltenangestrebtwerden,daweiterhinun‐
klar ist, welche Funktionen AMP in der Pathogenese der PsA spielen und für welche
Entzündungsmechanismensiestehen.ErstwenndazuweitereErkenntnissevorliegen,
kann deutlich werden, was eine Erhöhung eines AMP im Serum im Sinne eines
Screeningmarkersbedeutet. ImnächstenSchrittmüsstenUntersuchungenzeigen,dass
eine Erhöhung der Screeningmarkermit einer erhöhtenKrankheitsaktivität, einer be‐
stimmten Komorbidität o. ä. assoziiert ist. Für S100 A8 und S100 A9 beispielsweise
konntebereits gezeigtwerden,dassdieKonzentrationen imSerumvor allemvonder
Krankheitsaktivität der PsA abhängen und weniger von der Stärke des Hautbefalls.
DemnachkönntenS100A8undS100A9alsScreeningmarkergeeignetseinoderauchals
MarkerzumTherapiemonitoring.
75
Ein weiteres Ziel der Erforschung von AMP und ihrer Wirkungen ist der Er‐
kenntnisgewinn zur therapeutischen Nutzbarkeit der Moleküle. Da für mehrere AMP
eineproinflammatorischeWirkunginGelenkenbeschriebenist,wäreesinteressantzu
untersuchen, inwiefern eine Hemmung die Entzündung und damit die Krankheits‐
aktivitätmildernkönnte.Kritischzubeachtenistdabeidiegleichzeitige,fürdieImmun‐
abwehräußerstwichtigeantimikrobielleFunktionderAMP,derenHemmungschwere
InfektionenzurFolgehabenkönnte.
ZusammenfassendzeigtdieseArbeit,dassdieSystemerkrankungPsoriasisnichtnurzu
einer Induktion von AMP an der Haut führen kann, sondern in der Psoriasisarthritis
ebenfallszueinerInduktionvonS100A8,S100A9,HNP1‐3undLL‐37inderSynovialis.
Gleichzeitig zeigen sich Unterschiede zwischen Haut und Gelenk: Die AMP Psoriasin,
RNase7,hBD‐2undhBD‐3,dieinhohemMaßinderHautderPsoriasisexprimiertwer‐
den,ließensichnichtinderSynovialisderPsoriasisarthritisdetektieren.SogibtdieAr‐
beitHinweiseaufUnterschiedeundGemeinsamkeitenderhochaktivenundkomplexen
AMP,diemitihrenvielfältigenFunktionennichtnurwichtigeRolleninderPsoriasisder
Haut,sondernebenfallsinderPsoriasisarthritiseinnehmenkönnen.
76
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82
Danksagung
ZuerstmöchteichmichbeimeinerDoktormutter,FrauProf.Dr.med.RegineGläser,für
dieÜberlassungdiesesspannendenThemasunddieausgezeichneteBetreuungbedan‐
ken.DankihrerBegeisterung,ihrerMotivation,ihresEngagementsundihrerabsoluten
Zuverlässigkeit ist dieseArbeitmöglich geworden. Ich bin sehrdankbar, dass ichTeil
ihrerArbeitsgruppeseindurfte.
DesWeiterenmöchteichFrauChristelMartensen‐KerlfürdieexzellenteEinführungin
dieArbeitstechniken danken. Ihre stetigeHilfsbereitschaft und nette Zusammenarbeit
habendasGelingenderExperimenteermöglicht.
MeinDankgilt ebenfallsHerrnProf.Dr. rer.nat. JürgenHarder für seineDiskussions‐
bereitschaft,HilfeunddieimmerneuenIdeen.
FürdieBereitstellungderProbenunddieguteZusammenarbeitbeiderErstellungvon
VeröffentlichungenmöchteichProf.DennisMcGonagle,Dr.RichardCuthbertundKaren
HenshawausLeeds,England,danken.DievielenDiskussionenhabensehrvielSpaßge‐
macht.
SehrdankbarbinichAnne‐KathrinFiegefürdieHilfebeiderBeurteilungderPräparate,
ihreGeduldundMotivation.
EbensodankbarbinichHerrnProf.Dr.med.IvoLeuschnerfürdiefachkundigeMitbe‐
urteilungderSynovialispräparate.
Dankbar bin ich ebenfalls Herrn Dipl. Inform. Jürgen Hedderich für die fachkundige
BeratungimBereichStatistik.
Danken möchte ich außerdem Herrn Prof. Dr. med. Thomas Schwarz für die Bereit‐
stellungdesArbeitsplatzesinderUniversitäts‐HautklinikKiel.
FürdienetteAtmosphäre imLabormöchte ichaußerdemVera,Gela,BenteundSteffi
danken.
MeinDankgiltaußerdemmeinerFamilie–meinenElternundGeschwistern,diemich
immerunterstützen,undmeinemDaniel fürseinegeduldigeHilfe inallenLayout‐und
SoftwarefragenundseineUnterstützungundMotivation.MeinerTochterSophiamöchte
ich für ihre verlässlichen Schlaf‐ undWachphasen danken, diemir genug Zeit für die
ArbeitließenundFreudeindenPausengemachthaben.
83
Lebenslauf
PersönlicheDaten
HenrikeEdithTessieBierkarre,geb.Kosfeld
Geborenam20.April1987inWesterland/Sylt
SchulischeAusbildung
08/1993–07/1997 Hochtorgrundschule,NeustadtinHolstein
08/1997–01/2004 Kreisgymnasium,NeustadtinHolstein
01/2004–07/2004 HillcrestHighSchool,Hamilton,Neuseeland
07/2004–06/2006 AbituramOstseegymnasiumTimmendorferStrand
Hochschulausbildung
10/2006–12/2012 StudiumderHumanmedizinanderChristian‐Albrechts‐
UniversitätzuKiel
08/2008 ErsterAbschnittderärztlichenPrüfung
10/2009 BeginnderDoktorarbeitinderKlinikfürDermatologie,
UniversitätsklinikumKielbeiFrauProf.Dr.RegineGläser
Sommersemester2011 Erasmus‐AuslandssemesterinAmiens,Frankreich
PraktischesJahr2011/12 Dermatologie–UniversitätsklinikKiel
InnereMedizin–FlensburgerKliniken
Chirurgie–NorthernGeneralHospital,Sheffield,England
12/2012 ZweiterAbschnittderärztlichenPrüfung
ÄrztlicheWeiterbildung
Seit01/2015 AssistenzärztininderKlinikfürAnästhesiologiedes
StädtischenKlinikumsBraunschweig
84
Veroffentlichungen
Originalarbeit:
Henrike Bierkarre, Jürgen Harder, Richard Cuthbert, Paul Emery, Richard Reece, Ivo
Leuschner,UlrichMrowietz,JürgenHedderich,DennisMcGonagle,RegineGläser(2016):
DifferentialExpressionofAntimicrobialPeptidesinPsoriasisandPsoriaticArthritisasa
NovelContributoryMechanismsforSkinandJointDiseaseHeterogeneity,Scandinavian
JournalofRheumatology2016;45(3):188‐96.DOI10.3109/03009742.2015.1091497
Abstract:
H.Kosfeld, I. Leuschner, J.Harder,U.Mrowietz,R. Cuthbert,K.Henshaw,P. Emery,D.
Varoga,T.Pufe,R.Reece,D.McGonagleandR.Gläser(2011):Differentialexpressionof
antimicrobial peptides in synovial tissue of psoriatic arthritis indicating a diverse
pathogeneticconceptofskinandjointdisease?ExperimentalDermatology20:185‐18
Posterpräsentation bei der Jahrestagung der ADF (Arbeitsgruppe dermatologischer
Forschung)inTübingen