experimental clinical study of liver redox
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EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF LIVER REDOX STATUS INDUCED BY ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND TISSUTAL PARAMETERS. Guzzetti E. , Ferla F., Milani F., Accinni R., Aldrighetti L., Catena M., Ferla G. Liver Unit - Dipartimento di Chirurgia - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF
LIVER REDOXLIVER REDOXSTATUS INDUCED BY ISCHEMIA-STATUS INDUCED BY ISCHEMIA-
REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND
TISSUTAL PARAMETERS.TISSUTAL PARAMETERS.Guzzetti E., Ferla F., Milani F., Accinni R., Aldrighetti L., Catena M., Ferla G.
Liver Unit - Dipartimento di Chirurgia Istituto Scientifico San Raffaele
Università Vita-Salute San RaffaeleMilano
Controllo del sanguinamento Controllo del sanguinamento intraoperatorio: occlusione intermittente intraoperatorio: occlusione intermittente
del peduncolo vascolare epaticodel peduncolo vascolare epatico
Trasfusioni intraoperatorie di emazie Trasfusioni intraoperatorie di emazie concentrate o plasma fresco concentrate o plasma fresco congelato sono associate ad un congelato sono associate ad un peggioramento prognostico. peggioramento prognostico. 1, 21, 2
Occlusione intermittente del Occlusione intermittente del peduncolo vascolare epatico peduncolo vascolare epatico (manovra di Pringle): chiusura (manovra di Pringle): chiusura con uno strumento emostatico con uno strumento emostatico dell’intero ilo portobiliare (v.porta, dell’intero ilo portobiliare (v.porta, a.epatica, via biliare)a.epatica, via biliare)
1: Koobi DA, et al. Influence of transfusion on 1: Koobi DA, et al. Influence of transfusion on perioperative and long term outcone in patients perioperative and long term outcone in patients following hepatic resection for colorectal following hepatic resection for colorectal metastases. metastases. Ann Surg Ann Surg 2003;237:860-8702003;237:860-8702: Wu CC, et al. Prediction and limitation of hepatic 2: Wu CC, et al. Prediction and limitation of hepatic tumor resection without blood transfusion in tumor resection without blood transfusion in cirrhotic patients. cirrhotic patients. Arch Surg Arch Surg 1998;133:1007-10101998;133:1007-1010
Danno da ischemia e riperfusione (IR)Danno da ischemia e riperfusione (IR)Specie reattive dell’ossigenoSpecie reattive dell’ossigeno
• Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica 33. .
• Produzione di radicali liberi: specie reattive di Produzione di radicali liberi: specie reattive di ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) 44..
• Sistema antiossidante endogeno: molecole ed Sistema antiossidante endogeno: molecole ed enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai radicali liberi radicali liberi 55..
3: Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. 3: Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. Am J Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003;284:G15-G26 2003;284:G15-G26
4: Bayir H Reactive oxygen species. 4: Bayir H Reactive oxygen species. Crit Care MedCrit Care Med 2005;33(12):S498-S501. 2005;33(12):S498-S501.
5: Glantzounis G, et al. The contemporary role of antioxidant therapy in attenuating liver ischemia-5: Glantzounis G, et al. The contemporary role of antioxidant therapy in attenuating liver ischemia-reperfusion injury: a review. reperfusion injury: a review. Liver Transpl Liver Transpl 2005;11:1031-1047.2005;11:1031-1047.
Glutatione (GSH) Glutatione (GSH) ((L-L--glutamil-L-cisteinilglicina)-glutamil-L-cisteinilglicina)
• Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che può essere ossidato e ridotto. può essere ossidato e ridotto.
• Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina 66..
GSSG2 GSH
H2O2 2 H2OGlutatione Perossidasi (GPx)
2 NADP+ + 2H+ 2 NADPH
Glutatione Reduttasi (GR)
6: Wu G, et al. Glutathione metabolsim and its implication for health. 6: Wu G, et al. Glutathione metabolsim and its implication for health. J Nutr J Nutr 2004;134:489-492.2004;134:489-492.
Studio Clinico SperimentaleStudio Clinico Sperimentale
SCOPOSCOPO: studiare le variazioni dello stato redox cellulare, : studiare le variazioni dello stato redox cellulare, indotte dall’insulto ischemico-riperfusorio, analizzando indotte dall’insulto ischemico-riperfusorio, analizzando le alterazioni del GSH e dei suoi precursori a livello le alterazioni del GSH e dei suoi precursori a livello tissutale epatico e a livello plasmaticotissutale epatico e a livello plasmatico..
PAZIENTIPAZIENTI: : • • Totale: n°43. Totale: n°43.
• • Gruppo P: n° 36 (occlusione del Gruppo P: n° 36 (occlusione del peduncolo peduncolo vascolare eseguita)vascolare eseguita)
• • Gruppo NP: n°7 (occlusione del Gruppo NP: n°7 (occlusione del peduncolo peduncolo vascolare non eseguita – vascolare non eseguita – controllo)controllo)
MATERIALI E METODI:MATERIALI E METODI:
MODALITA’ DI CAMPIONAMENTOMODALITA’ DI CAMPIONAMENTO
Campioni plasmaticiCampioni plasmatici – prelievo di 12 ml di sangue venoso – prelievo di 12 ml di sangue venoso con il seguente timing:con il seguente timing:
• • T1: preoperatorioT1: preoperatorio•• T2: al termine dell’interventoT2: al termine dell’intervento•• T3: 1T3: 1a a giornata postoperatoriagiornata postoperatoria•• T4: 4T4: 4aa giornata postoperatoria giornata postoperatoria
Campionamento eseguito presso l’U.F. di Chirurgia Generale Campionamento eseguito presso l’U.F. di Chirurgia Generale Epatobiliare – Epatobiliare –
Liver Unit (HSR) in collaborazione con il Dipartimento di Chirurga Liver Unit (HSR) in collaborazione con il Dipartimento di Chirurga dell’Università degli Studi di Milano (H.Sacco)dell’Università degli Studi di Milano (H.Sacco)
Campioni tissutaliCampioni tissutali - prelievo di biopsie epatiche con il seguente timing:- prelievo di biopsie epatiche con il seguente timing:
• • T1: prima della fase ischemicaT1: prima della fase ischemica
• • T2: dopo 10 min. di ischemiaT2: dopo 10 min. di ischemia
• • T3: dopo 20 min. di riperfusioneT3: dopo 20 min. di riperfusione
Campioni tissutaliCampioni tissutali• Cisteina (ridotta e totale)Cisteina (ridotta e totale)• Cisteinil-glicina (ridotta e totale)Cisteinil-glicina (ridotta e totale)• Glutatione (ridotto e totale)Glutatione (ridotto e totale)• Attività dell’enzima Glutatione perossidasiAttività dell’enzima Glutatione perossidasi• Attività dell’enzima Glutatione reduttasiAttività dell’enzima Glutatione reduttasi
Campioni plasmaticiCampioni plasmatici• CisteinaCisteina• Cisteinil-glicina Cisteinil-glicina • Glutatione Glutatione • Attività dell’enzima Glutatione perossidasiAttività dell’enzima Glutatione perossidasi• Attività dell’enzima Glutatione reduttasiAttività dell’enzima Glutatione reduttasi
MATERIALI E METODIMATERIALI E METODI
Analisi eseguite presso il Laboratorio di Biochimica Analisi eseguite presso il Laboratorio di Biochimica Clinica – Clinica –
Istituto di Fisiologia Clinica CNR (H.Niguarda)Istituto di Fisiologia Clinica CNR (H.Niguarda)
RISULTATI:RISULTATI:CARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONECARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONE
VariabileVariabile Gruppo PGruppo P Gruppo Gruppo NPNP
N° pazientiN° pazienti 3636 77Età media (range) [anni]Età media (range) [anni] 54 (30-79)54 (30-79) 54 (26-83)54 (26-83)Sesso (maschi/femmine) [n]Sesso (maschi/femmine) [n] 18/1818/18 4/34/3Diagnosi [n]Diagnosi [n] Metastasi da neoplasia del colonMetastasi da neoplasia del colon 1717 22 EpatocarcinomaEpatocarcinoma 99 22 Neoplasie della colecistiNeoplasie della colecisti 22 22 Iperplasia nodulare focaleIperplasia nodulare focale 11 11 Metastasi non da neoplasia del colonMetastasi non da neoplasia del colon 22 ColangiocarcinomaColangiocarcinoma 33 EmangiomaEmangioma 22Concomitante epatopatia [n]Concomitante epatopatia [n] Fegato sano/HCV/pregressa CTFegato sano/HCV/pregressa CT 26/2/826/2/8 3/2/23/2/2
RISULTATI:RISULTATI:RESEZIONI EPATICHERESEZIONI EPATICHE
VariabileVariabile Gruppo PGruppo P Gruppo NPGruppo NPProcedura chururgica principale [n]Procedura chururgica principale [n] Epatectomia destraEpatectomia destra 1414 22 SegmentectomiaSegmentectomia 66 44 Nodulectomie multiple <5Nodulectomie multiple <5 11 11 BisegmentectomiaBisegmentectomia 77 Epatectomia sinistraEpatectomia sinistra 55 MesoepatectomiaMesoepatectomia 22 Epatectomia destra estesa al IV Epatectomia destra estesa al IV segm.segm.
11
Tipo di resezione [n]Tipo di resezione [n] Maggiore/MinoreMaggiore/Minore Anatomica/Non AnatomicaAnatomica/Non Anatomica Singola/MultiplaSingola/Multipla
22/1422/1433/333/330/630/6
2/52/54/34/35/25/2
Durata media del clampaggio (range) Durata media del clampaggio (range) [min.][min.]
39 (10-86)39 (10-86) --
RISULTATI:RISULTATI:OUTCOME PERIOPERATORIOOUTCOME PERIOPERATORIO
VariabileVariabile Gruppo PGruppo P Gruppo NPGruppo NPPerdite ematiche medie (range) [ml]Perdite ematiche medie (range) [ml]Trasfusioni di EC intraoperatorie [U]Trasfusioni di EC intraoperatorie [U]
460 (100-460 (100-1500)1500)
44
400 (100-400 (100-700)700)
11Indici biochimici di funzionalità Indici biochimici di funzionalità epaticaepatica Picco ALT [media(ds)] Picco ALT [media(ds)] U/LU/L 493 (427)493 (427) 358 (256)358 (256) Picco AST [media(ds)] Picco AST [media(ds)] U/LU/L 503 (405)503 (405) 351 (226)351 (226) Picco bilirubina totale [media(ds)] Picco bilirubina totale [media(ds)] mg/dlmg/dl
1,42 (0,87)1,42 (0,87) 2,06 (1,07)2,06 (1,07)
Picco PT-INR [media(ds)] Picco PT-INR [media(ds)] 1,24 (0,21)1,24 (0,21) 1,17 (0,13)1,17 (0,13)Complicanze postoperatorie [n]Complicanze postoperatorie [n] Fistola biliareFistola biliare Insufficienza epaticaInsufficienza epatica Versamento pleuricoVersamento pleurico Infezione polmonareInfezione polmonare EmorragieEmorragie Fibrillazione atrialeFibrillazione atriale
444422111111
11----------
Degenza postoperatoria media Degenza postoperatoria media (range) [gg](range) [gg]
13,7 (5-66)13,7 (5-66) 8,4 (6-16)8,4 (6-16)
Mortalità postoperatoriaMortalità postoperatoria -- --
DATI BIOCHIMICIDATI BIOCHIMICICome varia la concentrazione degli Come varia la concentrazione degli antiossidanti tiolici in seguito a danno antiossidanti tiolici in seguito a danno
ischemico-riperfusorio?ischemico-riperfusorio?
RISULTATI: RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONECISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE
Cisteina
10
15
20
25
30
35
1 2 3
timing
mM
/gr
prot
Cisteina
10
15
20
25
30
35
1 2 3
timing
mM
/gr
prot
Cisteinilglicina
1,50
2,50
3,50
4,50
1 2 3
timing
m M/g
r pro
t
Cisteinilglicina
1,50
2,50
3,50
4,50
1 2 3
timing
m M/g
r pro
t
Glutatione
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
1 2 3
timing
mM
/gr p
rot
Glutatione
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
1 2 3
timing
mM
/gr p
rot
Riduzione delle Riduzione delle concentrazioni tissutali concentrazioni tissutali di glutatione e dei suoi di glutatione e dei suoi precursoriprecursori
Gruppo PGruppo P
Gruppo NPGruppo NP
Come varia lo stato ossidoriduttivo Come varia lo stato ossidoriduttivo degli antiossidanti tiolici in seguito degli antiossidanti tiolici in seguito
a danno ischemico-riperfusorio?a danno ischemico-riperfusorio?
Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra forma ridotta e totale dei composti tiolici, e forma ridotta e totale dei composti tiolici, e soprattutto del glutatione. soprattutto del glutatione.
RISULTATI: RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, STATO REDOX DI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA,
GLUTATIONEGLUTATIONE
Rapporto R/T composti Rapporto R/T composti tiolicitiolici
Gruppo PGruppo P Gruppo NPGruppo NP
T1T1 T2T2 T3T3 T1T1 T3T3
Cisteina R/TCisteina R/T 0,290,29 0,370,37 0,440,44 0,260,26 0,310,31
Cisteinil-glicina R/TCisteinil-glicina R/T 0,360,36 0,510,51 0,620,62 0,540,54 0,570,57
Glutatione R/TGlutatione R/T 0,450,45 0,530,53 0,710,71 0,610,61 0,920,92
Perché aumenta la concentrazione di GSH Perché aumenta la concentrazione di GSH ridotto?ridotto?
RISULTATI: RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DEL GLUTATIONESTATO REDOX DEL GLUTATIONE
ATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASIATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI
GR
50
55
60
65
70
75
80
85
90
1 2 3
timing
U/g
r pro
t
GR
50
55
60
65
70
75
80
85
90
1 2 3
timing
U/g
r pro
t
Lieve incremento Lieve incremento dell’attività della dell’attività della glutatione reduttasi glutatione reduttasi al termine della fase al termine della fase riperfusoria.riperfusoria.
Gruppo PGruppo P
Gruppo NPGruppo NP
Gruppo PGruppo P
Gruppo NPGruppo NP
CONCLUSIONI: CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALIANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI
1.1. Consumo di glutatione e dei suoi precursori.Consumo di glutatione e dei suoi precursori.
La scarsità di glutatione potrebbe essere il La scarsità di glutatione potrebbe essere il fattore limitante l’attività della glutatione fattore limitante l’attività della glutatione reduttasi.reduttasi.
2.2. Condizione intracellulare di stress ossidativo, Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato con miglioramento dello stato ossidoriduttivo del glutatione al termine della ossidoriduttivo del glutatione al termine della fase riperfusoria (mantenuta attività fase riperfusoria (mantenuta attività dell’enzima glutatione reduttasi).dell’enzima glutatione reduttasi).
RISULTATI: RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI CAMPIONI PLASMATICI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA,
GLUTATIONEGLUTATIONE
Cisteina
100150200250300350
1 2 3 4
timing
Mm/
L
Cisteina
100150200250300350
1 2 3 4
timing
Mm/
L
Cisteinil glicina
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4
timing
m M/L
Cisteinil glicina
0
10
20
30
40
50
60
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1 2 3 4
timing
m M/L
Glutatione
012345
6789
10
1 2 3 4
timing
m M/
Glutatione
012345
6789
10
1 2 3 4
timing
m M/
Livelli basali preoperatori Livelli basali preoperatori ridotti di GSH. ridotti di GSH.
Consumo nell’immediato Consumo nell’immediato postoperatorio, seguito da un postoperatorio, seguito da un progressivo recupero.progressivo recupero.
Alterazioni più evidenti nel Alterazioni più evidenti nel gruppo P.gruppo P.
Gruppo PGruppo P
Gruppo NPGruppo NP
Val. riferimentoVal. riferimento
Gruppo PGruppo P
Gruppo NPGruppo NP
Val. riferimentoVal. riferimento
RISULTATI: RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICICAMPIONI PLASMATICIATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASIATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI
GR
20
30
40
50
60
70
80
90
1 2 3 4
timing
U/L
GR
20
30
40
50
60
70
80
90
1 2 3 4
timing
U/L
Notevole incremento Notevole incremento dell’attività dell’attività dell’enzima dell’enzima glutatione reduttasi glutatione reduttasi nel postoperatorio.nel postoperatorio.
Gruppo PGruppo P
Gruppo NPGruppo NP
Val. riferimentoVal. riferimento
Gruppo PGruppo P
Gruppo NPGruppo NP
Val. riferimentoVal. riferimento
GR
50
55
60
65
70
75
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85
90
1 2 3
timing
U/g
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t
GR
50
55
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65
70
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85
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1 2 3
timing
U/g
r pro
t
Campione tissutale
CONCLUSIONI: CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI PLASMATICIANALISI SU CAMPIONI PLASMATICI
Livelli scarsi di GSH a livello basale Livelli scarsi di GSH a livello basale preoperatorio. preoperatorio.
Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un progressivo incremento della concentrazione progressivo incremento della concentrazione plasmatica di GSH e precursori, e ad un plasmatica di GSH e precursori, e ad un miglioramento del loro stato ossidoriduttivo miglioramento del loro stato ossidoriduttivo (notevole aumento dell’attività della glutatione (notevole aumento dell’attività della glutatione reduttasi).reduttasi).
CONCLUSIONICONCLUSIONI
1.1. Riscontro a livello preoperatorio di scarse Riscontro a livello preoperatorio di scarse riserve intracellulari di glutatione.riserve intracellulari di glutatione.
2.2. Consumo di precursori del glutatione, che Consumo di precursori del glutatione, che impedisce la produzione del glutatione stesso.impedisce la produzione del glutatione stesso.
3.3. Condizione intracellulare di stress ossidativo, Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato ossidoriduttivo con miglioramento dello stato ossidoriduttivo nelle giornate postoperatorie. nelle giornate postoperatorie.
4.4. Simile trend di modifica delle concentrazioni Simile trend di modifica delle concentrazioni tissutali e plasmatiche di GSH e precursori.tissutali e plasmatiche di GSH e precursori.