evaluation of a genomic work flow for the detection of ...130476/fulltext01.pdf · 4 bacillus...
TRANSCRIPT
Examensarbete 10p C-nivå Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi VT 2005
Evaluation of a genomic work flow for the detection of Bacillus subtilis in
animal feed and food samples
Stina Lindberg
Handledare: Rickard Knutsson Statens veterinärmedicinska anstalt Resurslaboratoriet för beredskapsdiagnostik, avdelningen för bakteriologi
1
ABSTRACT
Bacillus anthracis is one of the most feared agents of biological warfare and causes the
deadly disease called anthrax. SVA (statens veterinärmedicinska anstalt) is working on a
project together with SLV (statens livsmedelsverk) where the target is to find rapid and
effective detection methods for Bacillus anthracis in animal feed and food samples. Bacillus
subtilis, which is harmless, was used in this study as a model organism to Bacillus anthracis.
A known concentration of vegetative Bacillus subtilis was spiked in animal feed and food
samples. The genomic work flow was based on automated DNA isolation and real time PCR.
The aim of the study was to screen for inhibitory components in the animal feed and food
samples using two different DNA isolation robots; Magnatrix 8000 and Biorobot EZ1. The
results showed that DNA of high quality was extracted from the samples with both robots.
However, the CT-value generated by the real time PCR showed considerable variation
depending on the sample matrix. Some samples, for instance egg and liver, were problematic
and gave low concentrations and high CT-values probably due to inhibitory components in the
samples. Further studies will be needed to solve these problems and optimize the methods that
were used in this study.
Keywords: Biorobot EZ1, DNA isolation, inhibitory components, Magnatrix 8000, real time
PCR
2
INNEHÅLL
Abstract……………………………………….. 1
Introduktion…………………………………... 3
Material/ Metoder…………………………….. 6
Förberedelser…………………………………. 6
Förstudier……………………………………. 8
Huvudstudie………………………………… 12
Resultat………………………………………. 14
Koncentrationsbestämningar……………….. 14
Jämförelsestudie av fyra
DNA-prepareringsmetoder………………….. 15
Test av två primerpar………………………... 16
Resultat från huvudstudien…………………. 17
Diskussion……………………………………. 18
Acknowledgement…………………………… 20
Referenser……………………………………. 21
3
INTRODUKTION
Bakteriesläktet Bacillus ingår i familjen Bacillaceae och består av mer än 50 olika arter. Alla
är grampositiva, sporbildande stavar (1). De växer inom ett brett temperaturområde från 15
till 45ºC. Tre kända arter är Bacillus anthracis, Bacillus cereus och Bacillus subtilis. Bacillus
anthracis orsakar sjukdomen anthrax som även kallas mjältbrand. Denna bakterie har två
plasmider; pX01 och pX02, som innehåller gener som bl.a. kodar för två
sjukdomsframkallande toxin och för en kapsel som skyddar bakterien mot fagocytos. Det
finns tre olika typer av anthrax; hudanthrax, intestinal anthrax och lunganthrax. Hudanthrax är
den vanligaste och mildaste formen och börjar som ett ”myggstick” på huden för att sedan
utvecklas till ett sår som täcks av en kolsvart skorpa. Hudanthrax förekommer i samband med
hudinfektioner kombinerat med hantering av anthraxsmittat livsmedel eller djur och kan botas
med antibiotika. Den intestinala formen förekommer efter intag av infekterad föda. De första
symtomen är kräkningar, diarré och magsmärtor. Lunganthrax smittoväg är genom inhalation
av anthraxsporer och de tidiga symtomen är influensaliknande. Intestinal- och lunganthrax är
de farligaste typerna av anthrax och leder ofta till döden. Symtomen för dessa två former av
anthrax är från början relativt milda, för att sedan plötsligt slå till med full kraft och skapa en
akut sjukdom. Detta karakteriseras av andnöd och desorientering följt av cirkulatorisk kollaps,
chock, koma och död, allt inom några timmar. I de fall då de dödliga formerna upptäcks tidigt
finns möjlighet för behandling, men detta försvåras av att de tidiga symtomen är så
svårupptäckta (2).
Bacillus cereus är fakultativt anaerob och förekommer i de flesta miljöer (1). B. cereus kan
orsaka flera olika sjukdomar. Gastroenterit orsakas av två olika enterotoxiner, ett värmestabilt
och ett värmelabilt. Det värmestabila enterotoxinet orsakar ”kräkningstypen” och kan
förekomma i kontaminerat ris. När riset kokas dör bakterierna men sporerna överlever. Om
riset sedan inte kylförvaras övergår sporerna till den vegetativa formen och en snabb
bakterietillväxt kan ske. Enterotoxinet som frigörs förstörs inte även om riset återuppvärms.
Efter intag av riset följer en inkubationstid på 1-6 timmar innan sjukdomen utbryter.
Det värmelabila enterotoxinet orsakar ”diarrétypen” och bildas i tunntarmen. Risklivsmedel är
kött, grönsaker, kryddor, torkade livsmedel och mjölk. Inkubationstiden är 6-24 timmar då
bakterierna förökar sig intestinalt och producerar toxinet. Bacillus cereus kan även ge upphov
till ögoninfektion i samband med ögonskada. Man tror att orsaken är tre olika toxiner som
interagerar med varandra; nekrotiskt toxin, cereolysin och phospholipas C. En tredje åkomma
orsakad av Bacillus cereus är intravenös kateterrelaterad sepsis.
4
Bacillus subtilis betraktas som icke-patogen och orsakar inga sjukdomar. Precis som Bacillus
cereus förekommer den i många olika miljöer, bland annat i vatten, jord och luft.
Påvisning av bakteriesläktet Bacillus kan ske fenotypiskt genom uppodling eller genom
detektion av toxin eller antikroppar mot toxin genom att utföra en ELISA. Påvisning genom
genotypiska metoder, dvs. att identifiera en för bakterien specifik DNA eller RNA-sekvens, är
ett fördelaktigare alternativ då dessa metoder går snabbare och har högre känslighet och
specificitet.
Bacillus anthracis är en av de mest fruktade organismerna inom biologisk krigsföring och
orsakade exempelvis stor problematik år 2001 i USA då organismen spreds genom brev.
SVA bedriver tillsammans med SLV ett resurslaboratorium för beredskapsdiagnostik. Där
pågår ett forskningsprojekt initierat av krisberedskapsmyndigheten (KBM) som är inriktat
mot storskalig diagnostik vid avsiktlig smittspridning av mikroorganismer via livsmedel, djur
och vatten. Olika provbearbetningsstrategier studeras för att förbättra analyskedjans kapacitet
vid misstanke om smittspridning av B. anthracis. Genom detta hoppas man kunna analysera
ett större antal livsmedel- och djurprover så effektivt som möjligt.
Eftersom det innebär en större säkerhetsrisk att arbeta med B. anthracis användes i detta
projekt Bacillus subtilis som modellorganism. Avsikten är att sedan, när dessa metoder
fungerar på B. subtilis, gå vidare och testa dessa metoder med B. cereus och slutligen med B.
anthracis.
I detta projekt har några genotypiska metoder för detektion av Bacillus subtilis studerats.
Projektet gick ut på att ympa in en känd koncentration av Bacillus subtilis i 41 olika
djurfoderprover och livsmedelsprover, för att därefter rena fram bakterie-DNA från dessa
prover med två robotar. Syftet var att undersöka kvaliteten på det renade DNA:t med
avseende på renhet och koncentration. Detta för att hitta eventuella inhiberande faktorer som
kan finnas i djurfoder och livsmedel och försvåra en effektiv analys. Dessa faktorer måste i så
fall minimeras. Koncentrationen och renheten på det framrenade DNA:t analyserades med två
metoder; spektrofotometriskt och med realtids-PCR.
Realtids-PCR baseras på förändring i fluorescens, där fluorescensen är proportionell mot den
exponentiellt amplifierade PCR-produkten (se figur 2). Vid ett visst antal cykler överstiger
fluorescensen ett tröskelvärde. Det antal cykler som krävs för att överstiga tröskelvärdet
kallas för CT-värdet. CT-värdet blir lägre ju mer DNA som finns från början. I detta projekt
användes CT-värdet även som en indikation på hur inhiberande de olika djurfoder- och
livsmedelsproverna var. Högre CT-värde tyder på en större inhibering.
5
Det finns två olika typer av detektionssystem, specifika och icke-specifika. Specifika
detektionssystem använder sig av prober som binder specifikt till en viss DNA-sekvens.
Proberna är märkta med en fluorescerande substans (3). Ett exempel på en sådan probe är
TaqMan.
I detta projekt användes SYBR-green som är en icke-specifik metod (3). SYBR-green är en
substans som endast binder in till dubbelsträngat DNA och fungerar på liknande sätt som
etidiumbromid. I lösning är den svagt fluorescerande men sänder ut en starkt fluorescerande
signal när den bundit till DNA (4). Realtids-PCR med SYBR-green följs alltid av en
smältpunktsanalys för att kontrollera att rätt PCR-produkt har blivit amplifierad (3).
Smältpunktsanalysen utförs med andra ord istället för att göra en gelelektrofores på PCR-
produkten. Vid en viss temperatur smälter den dubbelsträngade PCR-produkten isär och blir
enkelsträngad, detta syns som en sänkning i fluorescensen (se figur 3). Olika längd och
sekvens hos PCR-produkten ger olika smältpunkt.
16S rRNA-genen, en gen hos Bacillus subtilis (5) har tidigare med framgång använts för att
detektera Bacillus subtilis med PCR. I detta fall användes dels denna gen, dels en kommersiell
PCR-assay specifik för bakteriesläktet Bacillus.
Frågeställningarna för detta projekt var; går det att med hjälp av robotar rena fram bakterie-
DNA med hög kvalité från djurfoder och livsmedel? Finns det inhiberande komponenter i
dessa prover som kan störa analysen? Vilken metod är att föredra?
6
METODER
FÖRBEREDELSER
Foderprover som skulle användas som provmatriser hämtades på avdelningen för foder på
SVA. Livsmedel som skulle användas som provmatriser inhandlades i en livsmedelsaffär.
Alla provmatriser numrerades M1-M41 (se tabell 1).
Stomachering
10,0g av vardera provmatris vägdes upp i varsin filterpåse som omgavs av en ytterpåse. 90ml
NaCl-lösning 0,86-0,90% (SVA, Uppsala) tillsattes och påsen inkuberades sedan i 30min i
rumstemperatur. Proverna stomacherades därefter i stomacher 400 circulator (Seward
www.sewardsearch.co.uk) i 2min med 230rpm. Vid stomachering pressas och bearbetas
provet mekaniskt till en lösning. Lösningen från vardera prov pipetterades över till falconrör.
Från falconrören pipetterades sedan 1ml lösning till eppendorfrör, 24st per prov.
Eppendorfrören och falconrören med resterande lösning lades i frysen i -70ºC för förvaring
till senare bruk.
7
Tabell 1. Översikt av provmatriser som använts i studien.
Beteckning Provmatris Fabrikat/ kommentar Stomachering M1 Standardmjölk Arla Nej M2 Vispgrädde Arla Nej M3 Vaniljglass, ospädd, smält Blåvitt Nej M4 Vetemjöl Kungsörnen Ja M5 Majsmjöl Saltå kvarn Ja M6 Müsli Frebaco, müsli plus Ja M7 Florsocker Dan sukker Ja M8 Hamburgerdressing Kavli, amerikansk dressing Ja M9 Tonfisk i vatten Rainbow Ja M10 Chokladsås O´hoj, tub Ja M11 Svartpeppar mellanmalen Santa Maria Ja M12 Oregano Santa Maria Ja M13 Curry Santa Maria Ja M14 Fullkornsvälling Semper från 1år Ja M15 Fullkornsgröt Semper, mild Ja M16 Ketchup Felix Ja M17 Apelsinjuice JO Nej M18 Hel fodermajs Ja M19 Helt vete Ja M20 Jästfoder Yeesac Ja M21 Foderpellets Ja M22 Foderpellets För höns Ja M23 Maltkorn Ja M24 Foderpellets För nöt Ja M25 Hö Ja M26 Fodermjöl För svin Ja M27 Hel havre Ja M28 Miljödamm Foderfabrik Ja M29 Tilväxtfoder Kieman2, för svin Ja M30 Hamrahö Ja M31 Hundtorrfoder Ja M32 Hästkraftfoder Grovt Ja M33 Sojamjöl Ja M34 Kaviar Kalles Ja M35 Nötfärs Färsk Ja M36 Ägg Gula + vita Ja M37 Bröd Skogaholmslimpa Ja M38 Sallad Dole, Mini Family vacpac Ja M39 Ungnötslever Färsk Ja M40 Grishjärta Färskt Ja M41 Kycklinglever Fryst Ja
8
Uppodling av Bacillus subtilis
Kolonier av Bacillus subtilis stam ATCC 6633 togs från rutinlaboratoriet på SVA och
utströks på 2 hästblodagarplattor (SVA, Uppsala). Dessa inkuberades i 30ºC över natt.
Nästa dag togs kolonier från de två hästblodagarplattorna med sterila öglor till två falconrör
innehållande 40ml BHI-buljong (brain heart infusion, SVA Uppsala). Dessa inkuberades
sedan över natt i 30ºC.
10% glycerol användes som infrysningsmedium för att bevara cellernas viabilitet. 100µl
glycerol pipetterades till 48st eppendorfrör. Sedan pipetterades 1ml av BHI-buljongen från de
två falconrören till eppendorfrören, 24 eppendorfrör per falconrör. Eppendorfrören lades
sedan i frysen i -70ºC för förvaring till senare bruk.
FÖRSTUDIER
Koncentrationsbestämning av de frysta Bacillus subtilis-proverna
Ett av de frysta eppendorfrören med B. subtilis i BHI-buljong tinades. Därefter gjordes en
8-stegs seriespädning 1/10; 900µl BHI-buljong pipetterades till 8 eppendorfrör. Därefter togs
100µl från varje spädningssteg till nästa rör. 18 hästblodagarplattor lufttorkades för att få bort
kondens. Därefter togs 100µl från varje eppendorfrör till 2 hästblodagarplattor per rör och
racklades ut. Plattorna lades i en plastpåse och sattes i inkubatorn i 30ºC över natt. Dagen
därpå räknades kolonier på de olika plattorna.
Odling och koncentrationsbestämning av övernattskultur inför DNA-isolering
Ett eppendorfrör med B. subtilis togs från frysen och tinades. Därefter togs 100µl från detta
rör till ett falconrör innehållande 9,9ml BHI-buljong. Falconröret sattes i inkubatorn i
30ºC över natt, dvs. röret inkuberades totalt 18 timmar. Övernattskulturen i falconröret
seriespäddes därefter till 9 eppendorfrör på samma sätt som vid tidigare seriespädning.
Därefter togs 100µl från rör 3-8 till 2 hästblodagarplattor per rör och racklades ut. Plattorna
sattes i inkubatorn i 30ºC över natt. Dagen därpå räknades kolonier och koncentrationen av
övernattskulturen bestämdes. Koncentrationen av detta rör var viktig att känna till då likadana
övernattskulturer skulle användas till inympning av B. subtilis i djurfoder- och
livsmedelsproverna.
9
Jämförelsestudie av fyra DNA-prepareringsmetoder
Denna studie gjordes för att få en jämförelse mellan manuella kit och de robotar som skulle
användas i huvudstudien.
DNA från B. subtilis i BHI-buljong renades fram med två manuella kit; ”Genomic DNA
purification kit” (Gentra www.gentra.com) och ”High pure PCR template preparation kit”
(Roche www.roche-applied-science.com), samt med två robotar; Biorobot EZ1 (Qiagen
www.qiagen.com) och Magnatrix 8000 (Magnetic biosolutions www.magbio.com). Därefter
analyserades det framrenade DNA:t på Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Nanodrop
www.nanodrop.com) samt med realtids-PCR.
Med Biorobot EZ1 användes kitet ”DNA tissue kit” (Qiagen). Tre prover analyserades; 1ml
B. subtilis från frysen, 1ml övernattskultur av B. subtilis i BHI-buljong samt 1ml
övernattskultur av B. subtilis behandlat tre timmar med Proteinas k. Dessa prover spanns ner
till en pellet och späddes därefter med buffert G2 till en volym av 200µl. Detta för att roboten
tar en volym på 200µl.
Med Magnatrix 8000 användes kitet ”ChlamCAP bacterial DNA isolation kit” (Genpoint
www.genpoint.no). Endast ett prov bestående av övernattskultur av B. subtilis i BHI-buljong
analyserades. I jämförelsestudien studerades därför bara resultaten från övernattskultur av B.
subtilis i BHI-buljong från de fyra olika metoderna. Metodiken för de två robotarna redovisas
längre fram.
Preparation av DNA med ”Genomic DNA purification kit”
Prover som användes var 1ml övernattskultur av B. subtilis i BHI-buljong, samt 1ml B.
subtilis från frysen. Preparationen utfördes enligt protokoll för gram-positiva bakterier; först
utfördes cell-lysering genom att tillsätta 0.5ml cellsuspension till ett eppendorfrör som
centrifugerades i 5s i 13000-16000xg för att få en pellet. Supernatanten avlägsnades med en
pipett. 300µl ”Cell Suspension Solution” tillsattes till pelleten och pipetterades försiktigt upp
och ned några gånger tills pelleten lösts upp. 1,5µl ”Lytic Enzyme Solution” tillsattes och
röret vändes 25ggr och inkuberades därefter i 37ºC i 30min för att förstöra cellväggarna.
Röret bör vändas några gånger under inkuberingen. Röret centrifugerades sedan i 13000-
16000x g i 1min för att få en pellet. Supernatanten pipetterades bort. För att lysera cellerna
tillsattes 300µl ”Cell Lysis Solution” till pelleten och pipetterades försiktigt upp och ned
några gånger tills pelleten lösts upp. Efter lysering utfördes en RNas-behandling; 1,5µl
”RNase A Solution” tillsattes till cell-lysatet och röret vändes upp och ned 25ggr för att
därefter inkuberas i 37ºC i 30min. Proteiner avlägsnades därefter genom att först kyla provet
10
till rumstemperatur. Sedan tillsattes 100µl ”Protein Precipitation Solution” till provet och
detta mixades på vortex i 20s. Sedan centrifugerades provet i 3min i 13000-16000xg.
Proteinerna formar då en pellet. Supernatanten som innehåller DNA:t pipetterades över till ett
1.5ml eppendorfrör innehållande 300µl 100% isopropanol. Detta rör vändes försiktigt 50ggr
och centrifugerades sedan i 13000-16000xg i 1min. DNA:t formas då till en pellet.
Supernatanten sögs bort och 300µl 70% etanol tillsattes till pelleten. Röret vändes några
gånger för att tvätta DNA-pelleten. Röret centrifugerades därefter i 13000-16000xg i 1min
och etanolen sögs sedan försiktigt bort med en pipett. Slutligen utfördes DNA-hydrering då
100µl ”DNA Hydration Solution” tillsattes till pelleten och röret inkuberades i 1 timme i 65ºC
eller över natt i rumstemperatur. DNA:t förvarades sedan i frys för senare analyser.
Preparation av DNA med ”High pure PCR template preparation kit”
Prover som användes var 1ml B. subtilis från frysen, samt 1ml övernattskultur av B. subtilis i
BHI-buljong. Förberedelser som gjordes var blandning av 50mg Lysozyme och 5ml Tris-HCl
samt tillsats av 4,5ml PCR-vatten till den burk med Proteinas K som medföljde ”kitet”.
Därefter följdes protokollet; 200µl bakterielösning pipetterades till ett 1,5ml eppendorfrör och
centrifugerades i 5min i 3000xg. Pelleten som då bildades resuspenderades i 200µl PBS. 5µl
lysozyme tillsattes och röret inkuberades därefter i 37ºC i 15min. Efter detta tillsattes 200µl
”Binding Buffer” och 40µl Proteinas K. Röret mixades på vortex och inkuberades i 70ºC i
10min. Sedan tillsattes 100µl isopropanol och röret mixades igen. Provet pipetterades över till
ett filterrör som sattes i ett uppsamlingsrör. Dessa rör centrifugerades i 1min i 8000xg.
Uppsamlingsröret med innehåll slängdes därefter bort och filterröret sattes i ett nytt
uppsamlingsrör. 500µl ”Inhibitor Removal Buffer” pipetterades i filterröret och rören
centrifugerades sedan 1min i 8000xg. Uppsamlingsröret med innehåll slängdes bort och ett
nytt uppsamlingsrör kombinerades med filterröret. 500µl ”Wash Buffer” tillsattes till
filterröret följt av centrifugering i 1min i 8000xg. Uppsamlingsröret med innehåll slängdes
och ett nytt uppsamlingsrör kombinerades med filterröret. Dessa rör centrifugerades i 10s i
13000xg och uppsamlingsröret slängdes. Filterröret sattes i ett 1,5ml reaktionsrör. För att
eluera DNA:t tillsattes 200µl föruppvärmd (70ºC) ”Elution Buffer” i filterröret. Rören
centrifugerades i 1min i 8000xg. Reaktionsröret innehöll därefter det eluerade DNA:t. DNA:t
förvarades sedan i frys för senare analyser.
11
Test av två olika primerpar inför huvudstudiens realtids-PCR
För att undersöka vilket primerpar som var bäst att använda till huvudstudiens utfördes fyra
PCR-analyser, två för varje primerpar. De primerpar som undersöktes var ”B. subtilis 5F
primer” och ”B. subtilis 3R primer” (5) (ABI www.abionline.com) samt det kommersiella
paret ”Bacillus primer upp” och ”Bacillus primer low” (Genpoint www.genpoint.no). ”B.
subtilis 5F och 3R primer” var 19 baspar långa. PCR-produkten var en 595 baspar lång
sekvens baserad på 16S rRNA genen (5). ”Bacillus primer upp” och ”Bacillus primer low”
var 19 respektive 21 baspar långa och PCR-produkten var 541 baspar lång.
Mastermixar som användes var ”Core kit” (Applied biosystems
www.appliedbiosystems.com), och ”SYBR Green PCR mastermix” (Applied biosystems).
Mastermixarna blandades till i ett renrum i en UV-bänk. ”Core kit” blandades enligt följande
(de volymer som anges gäller per DNA-prov och ska alltså multipliceras med det antal DNA-
prov som ska analyseras); 5µl 10xSYBR Green buffer, 6µl MgCl2 (25mM), 1µl dUTP
(20mM), 1µl dATP (10mM), 1µl dGTP (10mM), 1µl dCTP (10mM), 27,25µl ddH2O, 0,25µl
(5U/µl) TaqGold, 1µl 1% BSA, 2µl ”B. subtilis 5F primer” (arb-lösning) och 2µl ”B. subtilis
3R primer” (arb-lösning) eller 2µl ”Bacillus primer upp” (10pmol/µl) och 2µl ”Bacillus
primer low” (10pmol/µl), 0,5µl Amp Erase. Dessa reagenser blandades i ett eppendorfrör.
”SYBR Green PCR mastermix” blandades enligt följande; 2µl ”B. subtilis 5F primer” (arb-
lösning) och 2µl ”B. subtilis 3R primer” (arb-lösning) eller 2µl ”Bacillus primer upp”
(10pmol/µl) och 2µl ”Bacillus primer low” (10pmol/µl), 25µl SYBR Green PCR mastermix
samt 19µl ddH2O pipetterades i ett eppendorfrör.
48µl av varje mastermix pipetterades till provbrunnar på en mikrotiterplatta. 2µl templat
tillsattes till varje brunn förutom i den negativa kontrollen där istället 2µl ddH2O tillsattes.
Det templat som användes var B. subtilis-DNA från övernattskultur i BHI-buljong framrenat
med Biorobot EZ1.
Den PCR-maskin som användes var 7500 real time PCR system (Applied Biosystems).
Programmet som kördes hade en initial denaturation vid 95ºC i 4min och sedan 40 cykler med
denaturering vid 95ºC i 15sek, ”annealing” vid 58ºC i 45sek och elongering vid 72ºC i 35sek.
Under detta steg mättes fluorescensen. Till sist en slutlig elongering vid 72ºC i 7min. Detta
program följdes av en smältpunktsanalys; 95ºC i 15sek, 60ºC i 1min och slutligen 95ºC i
15sek.
12
HUVUDSTUDIE
Bakterie-DNA:t renades fram ur djurfoder- och livsmedelsproverna med två olika robotar;
Magnatrix 8000 och Biorobot EZ1. Samma kit användes som i ”jämförelsestudie av fyra
DNA-prepareringsmetoder”. Bägge robotarna använder sig av samma analysprincip,
magnetisk separation. För Biorobot EZ1 med kitet ”DNA tissue kit” går det till på följande
sätt: bakteriecellerna lyseras och magnetiska kulor tillsätts till provet. I närvaro av ett
kaotropiskt salt kommer det DNA som finns i provet att binda till den kiselyta som täcker de
magnetiska kulorna. Genom användning av en magnet kommer därefter en separation ske, då
DNA:t och de magnetiska kulorna hålls kvar vid magneten, medan resterande
provkomponenter tvättas bort. Slutligen elueras det framrenade DNA:t i ett skruvlocksrör (6).
Vid preparering med ”ChlamCAP bacterial DNA isolation kit” på Magnatrix 8000 ser
metodiken lite annorlunda ut. Där binds hela bakterien upp på de magnetiska kulorna. Sedan
sker lysering av cellerna (se figur 1.)
Figur 1. Analysprinicpen för ”ChlamCAP bacterial DNA isolation kit” på Magnatrix 8000 (Genpoint
www.genpoint.no)
13
Preparation av DNA med Biorobot EZ1 och programmet ”DNA tissue kit”.
Vid tre olika tillfällen preparerades DNA från alla provmatriser (se tabell 1) med 100µl
inympad B. subtilis från övernattskultur i BHI-buljong (ca 18h inkubering). Dessutom tillkom
ett prov bestående av endast övernattskultur av B. subtilis i BHI-buljong. Detta prov
fungerade som jämförelseprov.
Preparationen utfördes enligt protokoll: 200µl prov pipetterades till märkta 2ml skruvlocksrör.
Roboten startades genom att slå på strömbrytaren på robotens baksida. I menyfönstret valdes
”start” och ”1” för ”bacterial protocol”. Elueringsvolym valdes genom att trycka ”2”, vilket
motsvarar 75µl. Robot-luckan på framsidan öppnades och de två metallställen lyftes ur. I det
bakre stället sköts lösningsstrippar in så att ett ”klick” hördes. En lösningsstrip per prov
laddades. Stället skakades om så att magnetkulorna suspenderades. Stället sattes sedan
tillbaks i roboten. Det främre stället laddades med 1,5ml elueringsrör i första raden, ett rör per
prov. I andra raden laddades en pipettspetshylsa och en pipettspets per prov. Rad nummer tre
lämnades tom och rad nummer fyra laddades med 2ml skruvlocksrör innehållande proverna.
Robot-luckan stängdes och genom att följa menyfönstrets instruktioner kontrollerades att allt
var på rätt plats. Programmet startades genom att trycka på ”start”.
Preparation av DNA med roboten Magnatrix 8000 och kitet ”ChlamCAP bacterial DNA
isolation kit”
Alla provmatriser (se tabell 1) togs ut ur frysen, ett eppendorfrör per prov. Förutom dessa
prover tillkom även här ett jämförelseprov bestående av övernattskultur av B. subtilis i BHI-
buljong. Till alla provmatriser tillsattes 100µl övernattskultur av B. subtilis. Rören mixades på
vortex. 700µl av varje prov pipetterades sedan till varsin brunn på en 96-hålsplatta. 96-
hålsplattan och alla reagenser tillsattes till respektive position och behållare i maskinen.
DNA-prepareringen utfördes sedan genom ”ChlamCap bacterial DNA isolation kit” som finns
inprogrammerat i roboten.
Mätning av preparerat DNA på Nanodrop ND-1000 spectrophotometer
Allt DNA framrenat på Biorobot EZ1 och Magnatrix 8000 analyserades spektrofotometriskt.
Datorn tillhörande Nanodrop ND-1000 spectrophotometer startades och programmet ”nucleic
acid measurement” valdes på menyn. 2µl PCR-vatten pipetterades på detektorn och
kalibrering utfördes genom att trycka ”OK”. Därefter torkades detektorn av försiktigt med en
pappershanduk och en ny 2µl droppe med PCR-vatten laddades på detektorn. ”Blankning”
utfördes genom att trycka på ”blank”. Knappen ”measure” med en grön ”flagga” började lysa
14
grön vilket tyder på att det är klart att börja mäta DNA-proverna. Vattendroppen torkades av
från detektorn och 2µl av det första DNA-provet pipetterades på. Genom att trycka på
”measure” börjar Nanodrop att utföra mätningen. Det resultat som fås är koncentrationen
DNA (ng/µl) och DNA:ts renhet (A260/280 och A260/230). Resultatet läses av på skärmen. Det
gamla provet torkades sedan av och nästa prov pipetterades på tills alla prover var mätta.
Realtids-PCR på B. subtilis-DNA från provmatriserna
Allt B. subtilis-DNA framrenat med Biorobot EZ1 och Magnatrix 8000 från de olika
djurfoder- och livsmedelsproverna analyserades även med realtids-PCR.
Den ”Mastermix” som användes var ”Core kit” (för recept se sid. 11) med primerpar
”Bacillus upp” och ”low”. Maskinen och programmet som användes var samma som vid
testet av de två primerparen.
RESULTAT
Koncentrationsbestämning av de frysta B. subtilis-proverna
Efter räkning av kolonier från hästblodagarplattorna erhölls följande resultat: 1,4x107 CFU/ml
Koncentrationsbestämning av övernattskultur inför DNA-isolering
Efter räkning av kolonier från hästblodagarplattorna erhölls följande resultat: 7,0 x107 CFU/ml
15
Jämförelsestudie av fyra DNA-prepareringsmetoder
Med Gentras kit blev renheten dålig. När proven späddes 10ggr blev resultatet bättre. Till
denna studies realtids-PCR användes primerpar ”3R” och ”5F” trots att det visat sig att
primerpar ”Bacillus upp och low” ger bättre resultat (se tabell 3). Detta berodde på att det
andra primerparet inte fanns tillgängligt vid detta försök.
Tabell 2. Resultat från övernattskultur av B. subtilis analyserad med Nanodrop och realtids-PCR. Metod Konc (ng/µl) A260/280
1) A260/2302) CT Tm
Gentras kit 16,7 2,58 0,08 39,83 75,0 Roches kit 25,1 1,83 1,42 39,29 75,0 EZ1 32,1 1,45 0,41 39,88 74,2 Magnatrix 17,3 1,49 0,18 39,66 74,6 1) Värdet bör ligga mellan 1,4-2,0 2) Värdet bör ligga >1,8 Test av två olika primerpar Rätt PCR-produkt blev amplifierad för bägge paren. Primerparet ”3R” samt ”5F” ska ge en
PCR-produkt med smältpunkt vid ca 80ºC (7). Primerparet Bacillus “low” och “upp” ska ge
en PCR-produkt med smältpunkt vid ca 85ºC (7). Primerparet ”low” och ”upp” gav dock ett
lägre CT-värde och alltså en tidigare detektion, varför detta primerpar användes till
huvudstudiens PCR-analyser.
Tabell 3. Resultatet för test av två primerpar. Resultatet är medelvärdet för de två mastermixar som användes i denna studie. Primerpar CT Tm Bacillus primer low + primer upp 15,69 85,1 B.subtilis primer 3R + 5F 26,76 79,9
16
Resultat från huvudstudien Tabell 4. B. subtilis-DNA preparerat med Biorobot EZ1 och Magnatrix 8000. Resultat från mätning på Nanodrop ND-1000 spectrophotometer samt PCR-resultat. Magnatrix 8000 Biorobot EZ1 Prov Konc1) A260/280
2) A260/2303) CT Tm Konc A260/280 A260/230 CT Tm
Mjölk 26,0 1,51 0,15 20,17 84,9 7,7 1,84 0,30 17,65 84,7 Vispgrädde 7,4 1,27 0,07 33,60 84,9 21,0 1,39 0,03 19,11 85,0 Vaniljglass 5,9 1,20 0,38 25,22 85,2 7,0 1,50 0,18 17,24 85,4 Vetemjöl 2,7 1,05 0,27 29,47 85,2 29,8 1,85 1,05 18,74 85,0 Majsmjöl 13,9 1,28 0,18 27,85 85,6 12,6 1,85 0,59 19,11 85,0 Müsli 12,6 1,72 0,27 28,67 85,2 5,8 1,93 0,36 19,73 85,0 Florsocker 21,5 1,42 0,23 18,37 84,9 3,6 2,13 0,31 19,80 85,4 Dressing 14,6 1,35 0,03 21,84 84,6 9,8 1,31 0,34 20,33 85,4 Tonfisk 13,8 1,46 0,24 24,13 84,9 2,0 3,87 0,20 19,68 84,7 Chokladsås 42,7 1,32 0,07 23,58 84,9 8,0 1,84 0,34 17,23 85,0 Svartpeppar 39,4 1,33 0,07 22,67 84,9 4,6 1,44 0,34 18,13 85,4 Oregano 19,1 1,44 0,24 18,69 85,2 12,4 1,32 0,45 16,65 85,4 Curry 0,2 -0,09 0,03 31,31 83,9 75,0 1,31 0,47 21,99 83,1 Välling 2,7 2,19 0,18 29,11 85,2 10,4 1,63 0,36 20,10 85,4 Fullkornsgröt 2,9 1,66 0,12 36,50 85,2 6,3 1,46 0,30 21,00 85,0 Ketchup 18,5 1,46 0,14 23,54 84,9 4,1 1,34 0,31 21,22 85,0 Apelsinjuice 2,1 3,26 0,25 36,35 84,9 10,5 1,93 0,50 18,52 84,4 Fodermajs 2,7 6,17 0,08 26,48 84,9 6,9 1,49 1,33 19,54 84,7 Helt vete 10,9 1,44 0,22 22,38 85,6 1,1 0,76 0,73 20,11 85,4 Jästfoder 0,8 -1,78 0,28 31,39 85,6 22,8 1,75 1,41 18,10 85,4 Foderpellets 26,3 1,76 0,13 29,34 85,2 5,4 1,38 0,55 21,09 85,7 Foderpellets 5,9 1,73 0,06 28,21 85,6 16,0 1,75 1,03 31,13 82,0 Maltkorn 15,6 1,27 0,20 21,60 85,2 1,4 0,75 0,47 28,73 85,1 Foderpellets 13,0 1,43 0,04 29,89 84,2 3,4 1,37 0,46 36,64 80,9 Hö 14,4 1,29 0,32 23,60 84,9 3,0 1,28 0,80 32,30 84,8 Fodermjöl 18,4 1,50 0,19 25,13 85,2 2,4 1,18 0,66 31,82 84,1 Hel havre 15,5 1,25 0,24 22,31 85,6 2,4 0,90 1,01 32,78 84,5 Miljödamm 4,8 1,46 0,27 30,52 85,6 34,9 1,73 1,79 34,21 82,0 Tilväxtfoder 13,5 1,72 0,17 26,03 85,6 8,1 1,40 1,19 34,15 82,3 Hamrahö 18,5 1,32 0,43 23,67 85,6 3,9 1,48 0,41 30,43 84,8 Hundtorrfoder 5,3 1,11 0,28 23,46 85,2 4,9 1,73 0,45 29,97 85,1 Hästkraftfoder 25,9 1,68 0,22 28,14 83,9 13,0 1,40 0,65 29,67 85,1 Sojamjöl 8,0 1,68 0,35 33,85 84,5 8,1 1,46 0,63 31,07 84,8 Kaviar 1,9 1,64 0,36 35,47 84,5 2,1 0,86 0,18 39,07 84,8 Nötfärs 2,5 1,37 0,09 33,53 84,5 10,2 1,88 1,16 36,15 83,4 Ägg 0,0 0,01 0,00 - 65,7 0,1 0,04 0,00 - 66,4 Bröd 11,2 1,54 0,11 36,00 85,1 3,6 1,18 0,43 33,70 84,8 Sallad 9,9 1,36 0,57 34,59 84,1 1,6 0,98 0,28 33,87 84,8 Ungnötslever 19,3 1,85 0,81 38,26 82,0 40,4 1,80 1,72 32,63 84,1 Grishjärta 9,5 1,73 0,46 30,04 84,1 2,7 1,04 0,47 28,47 85,1 Kycklinglever 1,8 5,06 0,56 - 66,4 159,7 1,84 2,10 36,07 84,1 B.sub4) 17,3 1,49 0,18 29,54 84,8 9,0 1,55 0,51 27,76 84,8 Negativ - 66,1 - 65,3 Medelv 12,93 1,52 0,22 27,86 84,9 10,95 1,53 0,62 25,49 84,57 Stdav 9,83 1,01 0,16 5,31 0,67 13,75 0,51 0,42 6,98 1,08 Max 42,70 6,17 0,81 38,26 85,60 75,00 3,87 1,79 39,07 85,70 Min 0,20 -1,78 0,03 18,37 82,00 1,10 0,75 0,03 16,65 80,90 1)ng/µl 2)Värdet bör ligga mellan 1,4-2,0 3) Värdet bör ligga >1,8 4) Övernattskultur av B. subtilis
17
Figur 2. Resultat från analys med realtids-PCR på 30 olika provmatriser spikade med B. subtilis preparerade med Magnatrix 8000 kombinerat med ”ChlamCAP bacterial DNA isolation kit”. Resultatet visar att DNA har amplifierats i samtliga provmatriser. En hög variation i CT-värde mellan de olika provmatriserna förekommer dock.
Figur 3. Resultat av smältpunktsanalysen vid realtids-PCR för ovanstående 30 provmatriser. Smältpunkten ligger vid 85˚C vilket tyder på att rätt PCR-produkt amplifierats.
18
Figur 4. Den vänstra linjen är mjölk och den högra är grädde. Mjölken har ett lågt CT-värde och alltså en tidig detektion. Grädde är mer problematisk och har ett högt CT-värde. Gräddens högre fettinnehåll skulle kunna vara en inhiberande komponent.
DISKUSSION
Av de manuella kiten från Roche och Gentra gav Roches kit en högre DNA-koncentration och
en bättre renhet (se tabell 2). Detta kit var även lättare att använda och tog kortare tid. Ett
problem som uppstod vid användning av båda kiten var att vid centrifugeringen av det frysta
B. subtilisprovet bildades ingen tydlig pellet. Detta kan bero på glycerolen som fanns i B.
subtilis-provet. De andra två proverna som bestod av övernattskultur av B. subtilis innehöll
ingen glycerol och vid preparation av dessa prover uppstod inte detta problem. Problemet
löstes genom att centrifugera provet en gång till. Renheten blev dålig med Gentras kit. När
proverna späddes 10ggr blev renheten betydligt bättre. Förmodligen innehåller ”DNA
hydration solution” som medföljer kitet, komponenter som interfererar med Nanodrop vid
mätning av DNA:t. Vid jämförelsestudien mellan robotarna och de manuella kiten var
resultaten relativt likvärdiga (se tabell 2). Att använda robotarna till preparering av DNA ur
djur- och livsmedelsproverna i denna studie var dock det bästa alternativet då vi ville ha
möjligheten att preparera många prover samtidigt. Detta underlättas självklart genom att
använda robotar istället för manuella kit. Magnatrix är den mest effektiva av de två robotarna
eftersom denna robot tar 96 prover åt gången medan Biorobot EZ1 endast tar 6 prover.
Biorobot EZ1 är dock mindre i storlek och kan tex. få plats i en LAF-bänk vilket kan vara
nödvändigt vid hantering av misstänkt smittade prover.
19
Vid test av de två primerparen blev rätt PCR-produkt amplifierad för bägge paren (se tabell
3). Det kommersiella primerparet ”low” och ”upp” gav dock en tidigare detektion och därför
användes detta primerpar till huvudstudiens PCR-analyser.
Provmatrisresultaten (se tabell 5) uppvisade en väldigt hög variation. Olika provmatriser gav
olika DNA-koncentrationer vid mätning på Nanodrop ND-1000 spectrophotometer. Detta
beror på att vissa provmatriser innehåller komponenter som kan interferera både med DNA-
isoleringen och vid mätning på Nanodrop. En annan orsak till att resultaten hade så hög
variation vid mätning på Nanodrop kan vara att DNA-proverna inte skjuvades innan mätning.
Vid skjuvning bearbetas provet mekaniskt vilket medför att provet blir mer homogent.
Resultatet varierade också beroende på om provet var preparerat med Biorobot EZ1 eller med
Magnatrix 8000. Ett exempel på detta är prov M41, kycklinglever, som gav mycket låg DNA-
koncentration vid preparering på Magnatrix, men däremot mycket hög koncentration vid
preparering på EZ1. Detta kan bero på att analysprincipen ser lite olika ut för de två
robotarna. Eftersom lysering av bakterien sker innan uppbindning till de magnetiska
partiklarna vid preparering på Biorobot EZ1 kan även ospecifikt DNA som finns i
provmatrisen bindas upp till de magnetiska partiklarna och ge en felaktigt hög koncentration
DNA. Vid preparering med ”ChlamCap bacterial DNA isolation kit” på Magnatrix 8000
binds hela bakterien till partiklarna vilket leder till att endast bakterie-DNA:t renas fram.
Kvoten A260/280 såg oftast bra ut, vilket tyder på att provet inte är förorenat av proteiner.
Kvoten A260/230 däremot var genomgående lägre än vad det borde vara. Detta kan bero på
organiska föreningar som finns kvar i provet.
Nanodrop användes i denna studie mer som ett komplement till den realtids-PCR som
utfördes. Den ingår alltså egentligen inte i den analyskedja som är tänkt att användas om ett
riktigt utbrott skulle inträffa. Fördelen med Nanodrop är att den tar små volymer och är snabb
och enkel att använda. En nackdel med Nanodrop är att detektionsgränsen ligger vid 10ng/µl.
Resultat under detta värde har alltså en viss osäkerhetsfaktor.
Det är inte enbart DNA-prepareringen och mätningen på Nanodrop som kan störas av olika
komponenter från provmatriserna. Provmatriserna innehåller även komponenter som kan
verka inhiberande på PCR-analysen. Resultatet blir ett högt CT-värde, dvs. en sen detektion.
För att öka PCR-analysens robusthet måste dessa inhibitorer karakteriseras (8). Vad gäller
djurfoder och livsmedel kan inhibering ske på grund av ett antal vanligt förekommande
ämnen såsom lipider, salt och proteiner (9).
Utifrån erhållna resultat verkar fett-och kolesterolrika livsmedel vara problematiska
provmatriser. Ett tydligt exempel på det är att mjölk gick bra att analysera medan grädde som
20
innehåller mer fett skapade problem (se figur 4). Provmatrisen bestående av ägg var också
problematisk. I princip inget DNA renades fram, varken med EZ1 eller Magnatrix och därav
blev det inte heller någon detektion vid PCR-analysen. Ägg innehåller mycket kolesterol
(10) som kan vara en PCR-inhiberande komponent.
I övrigt verkar det som att provmatriser bestående av kött t.ex. ungnötslever och nötfärs
skapar vissa problem. Detta kan bero på att kött innehåller mycket DNA som kan störa och
försvåra en specifik framrening av endast B. subtilis-DNA. Om detta främmande DNA inte
renas bort helt kan det dessutom påverka PCR-analysens känslighet och specificitet (9). En
annan svår matris var kaviar, som också den är relativt fett-och kolesterolrik samtidigt som
den innehåller mycket DNA.
Smältpunkten låg på ca 85°C för de flesta provmatriser, vilket tyder på att rätt PCR-produkt
amplifierats. I de två fall då det inte blev någon detektion, dvs. för provmatriserna bestående
av ägg och kycklinglever blev smältpunkten mycket lägre. Detta är ett resultat av ”primer
dimer”, då de två primerparen bundit till varandra. Den smältpunkt som fås är den temperatur
då primerparen smälter isär.
Det Taq-polymeras som användes i detta projekt är känsligt för inhiberande faktorer (11). Ett
alternativ för att skapa en mer robust PCR-analys är att använda sig av ett annat DNA-
polymeras. I en tidigare studie visade det sig att man genom att använda Tth DNA- polymeras
kunde minska de inhiberande effekterna till stor del (9). Det skulle kunna vara en möjlig
lösning för de provmatriser som skapade problem i denna studie. Till skillnad från Taq-
polymeraset innehåller Tth-polymeraset en högre koncentration KCl samt ämnen som gör
PCR-analysen mer effektiv, såsom Tween 20 och glycerol. Resultatet blir att man får en
snabbare detektion vid lägre DNA-koncentrationer (8).
Sammanfattningsvis kan man säga att de två robotarna EZ1 och Magnatrix är bra metoder för
att preparera B. subtilis-DNA ur komplexa djur- och livsmedelsprover. Resultatet är dock
mycket varierande och vissa provmatriser skapade problem på grund av inhiberande faktorer.
Fortsatta studier krävs därför för att även dessa provmatriser ska kunna analyseras effektivt.
ACKNOWLEDGEMENT
Jag vill tacka Rickard Knutsson på SVA, Cecilia Dahlberg på livsmedelsverket, mina
opponenter Göte Swedberg, Lisa H. Ekbom och Suzanna Törnquist.
21
REFERENSER
1. K.A. Lampel, D. Dyer, L. Kornegay, P.A. Orlandi. 2004. Detection of Bacillus spores
using PCR and FTA filters. Journal of food protection. 67: 1036-1038
2. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, R.H. Yolken. 1995. Manual of
Clinical Microbiology 349-355. American Society for microbiology, Massachusetts
avenue N.W, Washington DC.
3. Quantitative and qualitative PCR Technology catalouge. 2002. 4-10 Eurogentec,
Searing, Belgien.
4. M.T. Dorak. Real-time PCR http://dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html
5. P. Wattiau, M.E. Renard, P. Ledent, V. Debois, G. Blackman, S.N. Agathos. 2001. A
PCR test to identify Bacillus subtilis and closely related species and its application to
the monitoring of wastewater biotreatment. Applied Microbiology and Biotechnology
56: 816-819.
6. EZ1 DNA handbook. 2004. 7-8 Qiagen.
7. J. Meinkoth , G. Wahl. 1984. Hybridization of nucleic acids immobilized on solid
supports. Analytical biochemistry 138: 267-284.
8. R. Knutsson, C. Löfström, H. Grage, J. Hoorfar, P. Rådström. 2001. Modeling of 5´
Nuclease Real-Time Responses for optimization of a High- Throughput Enrichment
PCR Procedure for Salmonella enterica. Journal of Clinical Microbiology 40: 52-60.
9. C. Löfström, R. Knutsson, C. Engdahl Axelsson, P. Rådström. 2004. Rapid and
Specifik Detection of Salmonella spp. in Animal Feed Samples by PCR after Culture
Enrichment. Applied and Environmental Microbiology 70: 69-75.