evaluaciÓn de las propiedades fÍsico-quÍmicas,...

EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS,

MECÁNICAS Y BIOLÓGICAS DE SCAFFOLDS DE

HIDROXIAPATITA E HIDROXIAPATITA CON

RECUBRIMIENTO DE QUITOSANO OBTENIDAS POR

DIVERSOS MÉTODOS.

DEISY NATALI MESA OSPINA

POSGRADO EN INGENIERÍA DE MATERIALES

FACULTAD DE INGENIERÍA

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

MEDELLÍN, 2017

2

Evaluación de Recubrimientos de Quitosano sobre

Scaffolds de HA

EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS, MECÁNICAS Y BIOLÓGICAS DE SCAFFOLDS DE HIDROXIAPATITA E

HIDROXIAPATITA CON RECUBRIMIENTO DE QUITOSANO OBTENIDAS POR DIVERSOS MÉTODOS.

DEISY NATALI MESA OSPINA

Trabajo de grado para optar al título de Msc en Ingeniería de

Materiales

Directora

DIANA MARCELA ESCOBAR SIERRA Ing Met. Ph.D. en Ciencias Químicas

Grupo de Investigación en Biomateriales

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE INGENIERÍA

MEDELLÍN 2017

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Scaffolds de HA

AGRADECIMIENTOS

Mi primer agradecimiento sin sonar a cliché es para Dios porque en especial me ha

dado tanto, un poco más de lo que he merecido siempre, por sus tantas bendiciones,

amor, por no abandonarme a pesar de todo.

A mi asesora Diana Marcela Escobar docente del programa de Bioingeniería y

coordinadora del laboratorio de Biomateriales del Programa de Bioingeniería, porque

ha sido la única persona que se ha preocupado realmente por el apoyo tanto

académico como personal en esta investigación, me ha estimulado y corregido todo el

tiempo que ha sido necesario, dando un gran aporte intelectual y algunas bases

necesarias hasta para la vida.

A Andrés López gran amigo y persona, que hizo parte esencial en este proceso,

ayudándome con el trabajo de laboratorio, el apoyo y la compañía en momentos que

necesite de alguien, de una mano y un apoyo; que quede plasmado aquí mi gran

admiración y agradecimiento para estas dos últimas personas.

Al laboratorio de BIOMAT por el acceso a todas sus instalaciones, equipos, reactivos y

demás mientras estuve en experimentación. A los docentes Diego Giraldo y Ricardo

Aristizabal de Ingeniería de Materiales por el préstamo de algunos equipos para los

ensayos mecánicos y químicos respectivamente. A Dayana Meza del SEM por su gran

amabilidad y disposición siempre. A Sara Robledo y Victoria Ospina del PECET que

contribuyeron en una parte esencial del proyecto con las pruebas y ensayos biológicos

in vitro.

Y por último a mi Alma Mater la Universidad de Antioquia por existir y formarme en

todos los aspectos, porque en ella he pasado los mejores y peores momentos de mi

vida. Porque siempre la tendré en el corazón y no existe una Universidad que me

hubiese hecho sentir tan orgullosa de ser egresada…

¡Mil Gracias!

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Scaffolds de HA

TABLA CONTENIDO

ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................................................... 6

ÍNDICE DE TABLAS................................................................................................................... 12

GLOSARIO ............................................................................................................................... 14

ABREVIATURAS ....................................................................................................................... 16

RESUMEN ................................................................................................................................ 17

ABSTRACT ............................................................................................................................... 19

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y ALCANCES .................. 21

1.1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 21

1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................. 22

1.3. ALCANCE DEL PROYECTO ............................................................................................. 24

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 1 .......................................................................... 25

CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE ............................................................. 26

2.1. TEJIDO ÓSEO ................................................................................................................ 26

2.2. BIOMATERIALES DE USO EN MEDICINA REGENERATIVA ........................................... 35

2.3. CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE LOS BIOMATERIALES PARA IT .......... 62


CAPÍTULO 3. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ................................................. 74

3.1. OBJETIVOS.................................................................................................................... 74

3.2. MATERIALES Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL......................................................... 74

3.2.2.4. Preferencias de Diseño .......................................................................................... 79

3.2.5. Caracterización físico-química de scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo 83

3.2.6. Caracterización morfológica y superficial de los scaffolds de HA con y sin

recubrimiento de Qo .......................................................................................................... 84

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Scaffolds de HA

3.2.7. Caracterización mecánica de los scaffolds mediante ensayos de compresión ..... 92

3.2.8. Evaluación de la biocompatibilidad mediante ensayos biológicos in vitro ............ 93


CAPÍTULO 4. RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN ............................................................ 101

4.1. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE LOS SCAFFOLDS DE HA CON Y SIN

RECUBRIMIENTO DE Qo ....................................................................................................... 101

4.1.1. Obtención de los scaffolds de HA .......................................................................... 101

4.1.2. Obtención de los recubrimientos de Qo sobre scaffolds de HA ........................... 102

4.1.3. Fluorescencia de rayos X (FRX) .............................................................................. 103

4.1.4. Espectroscopía de dispersión de energía (EDS). .................................................... 104

4.1.5. Difracción de rayos X (DRX) ................................................................................... 105

4.1.6. Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR) ............................ 108

4.2. CARACTERIZACIÓN MORFÓLOGICA Y SUPERFICIAL DE LOS SCAFFOLDS ..................... 113

4.2.1. Estereomicroscopía de la superficie de los scaffolds ............................................ 113

4.2.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM) ............................................................ 115

4.2.3. Ensayo de degradabilidad in vitro en SBF .............................................................. 123

4.2.4. Porosidad e interconectividad de los scaffolds ..................................................... 130

4.2.5. Mojabilidad y adhesividad de los recubrimientos de Qo ..................................... 139

4.2.6. Trabajo de adhesión termodinámico (Wad) ........................................................... 143

4.3. CARACTERIZACIÓN MECÁNICA DE LOS SCAFFOLDS ..................................................... 144

4.3.1. Ensayo de resistencia mecánica a la compresión .................................................. 144

4.3.2. Correlación De Datos .............................................................................................. 151

4.4. CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS SCAFFOLDS ..................................................... 153

4.4.1. Citotoxicidad celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo ............... 153

4.4.2. Proliferación celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo ................ 155

4.4.3. Adhesión, interacción y morfología celular de los scaffolds de HA con

recubrimiento de Qo. ....................................................................................................... 157

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 4 ........................................................................ 165

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES ............................................................................................... 171

6


Scaffolds de HA

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama que representa los componentes del tejido óseo [3]. ...................... 27

Figura 2. Corte longitudinal para ilustrar el hueso cortical y trabecular a nivel

macroscópico (a) Corte longitudinal y transversal de hueso cortical ilustrando a nivel

microscópico las osteonas, la capilarización, el endiostio y el periostio (b) [2]. .............. 28

Figura 3. Tipos de células óseas [6]. ................................................................................... 30

Figura 4. Fases del remodelado óseo normal (BRU: Unidad de Remodelado Óseo; CL:

línea de cemento; OS: osteoide) [10]. ................................................................................ 33

Figura 5. Tipos de implantes para regeneración de tejido. ............................................... 34

Figura 6. Evolución histórica de las técnicas utilizadas para el tratamiento de diferentes

afecciones [11]. .................................................................................................................... 36

Figura 7. Ingeniería de tejidos aprovechada para regeneración de tejidos. Existen dos

estrategias diferentes in vivo e in vitro. Ambos métodos usan scaffolds porosos los

cuales son cargados con células [21]. ................................................................................. 38

Figura 8. Estructura química de la quitosano [31]. ............................................................ 47

Figura 9. Esquema en el que se representan los principales tipos de recubrimientos

superficiales sobre materiales [33]. .................................................................................... 54

Figura 10. Tipo de crecimiento de un cultivo celular (monocapa, en suspensión o

tridimensionales con esquema de las morfologías de las células en cultivo [60]. ........... 58

Figura 11. Tipos de cultivo de tejidos, adaptada y modificada de Handbook [58 y 60]. . 59

Figura 12. Diferentes cultivos celulares de acuerdo a su origen, modificación genética y

fenotípica [60]. ..................................................................................................................... 61

Figura 13. Esquema de procesos (unidad experimental y variables del diseño

experimental). ...................................................................................................................... 77

Figura 14. Esquema del procedimiento planteado para la obtención de scaffolds de HA

por la técnica gel-casting. ................................................................................................... 80

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Scaffolds de HA

Figura 15. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el

film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA. ................................... 82

Figura 16. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el

film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA. ................................... 83

Figura 17. Estereomicroscopio Zeiss DV4 con cámara digital incorporada. ..................... 84

Figura 18. Microscopio Electrónico de Barrido marca Jeol JSM-6490LV. ........................ 85

Figura 19. Obtención de degradabilidad in vitro en SBF. .................................................. 87

Figura 20. Montaje para la obtención del porcentaje de porosidad e interconectividad

de los scaffolds. ................................................................................................................... 88

Figura 21. Esquema del sistema de ángulo de contacto [10]. .......................................... 90

Figura 22. Imagen de los componentes del tensiómetro digital Krüss K-12. ................... 91

Figura 23. Tensiómetro de superficie (a) Método de placa de Wilhelmy (b) [11]. .......... 92

Figura 24. Ensayos de compresión para scaffolds en Máquina Universal Diggimes. ...... 93

Figura 25. Metodología general propuesta para los ensayos biológicos. ........................ 94

Figura 26. Línea celular SAOS2 (anclo dependientes) al microscopio óptico (X20 y X40).

.............................................................................................................................................. 95

Figura 27. Esquema del área de trabajo y disposición de materiales en campana de

cultivo celular para evaluación biológica in vitro, adaptada y modificada de [12]. ......... 95

Figura 28. Montaje para el ensayo de citotoxicidad con MTT. ......................................... 97

Figura 29. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting, sin sinterizar (a), con 50% de

sólidos (b) y con 60% de sólidos (c). ................................................................................. 101

Figura 30. Soluciones de Qo a diferentes concentraciones (a), scaffolds recubiertos en

solución de Qo (b). ............................................................................................................ 102

Figura 31. Imágenes obtenidas al SEM de scaffolds de HA por gel-casting (a) Espectros

EDS correspondiente a las superficies de los Scaffolds de HA (b). ................................. 104

8


Scaffolds de HA

Figura 32. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a)

scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con

menor tiempo de exposición (5min). ............................................................................... 106

Figura 33. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a) y

para scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con

mayor tiempo de exposición (30min). ............................................................................. 108

Figura 34. Espectro infrarrojo obtenido para el Qo (a), scaffolds de HA preparados por

gel - casting (b) y scaffolds de HA con recubrimientos de quitosano a diferentes

concentraciones (c – f) a mayor tiempo de exposición (20 min). ................................... 109

Figura 35. Espectro Infrarrojo de estándares de hidroxiapatita HAp (a), quitosano CS (b)

y partículas hibridas de HAp – CS a diferentes concentraciones (c y d) [14]. ................ 112

Figura 36. Scaffolds de HA preparados por gel-casting vistos con aumentos de 8X (a) y

16X (b) al estereomicroscopio. ......................................................................................... 113

Figura 37. Scaffolds de HA con recubrimientos de Qo observadas al estereomicroscopio

en aumentos de 8X y 16X. ................................................................................................. 114

Figura 38. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting observados al SEM en aumentos de

40X (a), 500X (b), 1000X (c) y 2500X (d). .......................................................................... 116

Figura 39. Scaffolds de HA reportados en la literatura observados al SEM a diferentes

aumentos, poros esféricos de 100–200 µm (a), superficie de scaffolds (b) [16, 17, 18].

............................................................................................................................................ 117

Figura 40. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de

Qo al 0.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 1000X. ..................... 118


Qo al 1%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 2000X. ......................... 118


Qo al 1.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 500X......................... 119


Qo al 2%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumentos de 500X. ......................... 119

9


Scaffolds de HA

Figura 44. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con

recubrimiento de Qo (0.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min) aumento de 500X.

............................................................................................................................................ 120


recubrimiento de Qo (1%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumentos de 2000X.

............................................................................................................................................ 120


recubrimiento de Qo (1.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 500X.

............................................................................................................................................ 121


recubrimiento de Qo (2%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 2000X.

............................................................................................................................................ 121

Figura 48. Gráfico de barras obtenido para la pérdida de peso de los scaffolds de HA con

y sin recubrimiento de Qo con su respectiva D.E. ........................................................... 125

Figura 49. Estadística descriptiva para datos de degradabilidad de las muestras. ........ 126

Figura 50. Gráfico de pH vs tiempo para scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo

para el menor tiempo de inmersión. ................................................................................ 128


para el mayor tiempo de inmersión. ................................................................................ 128

Figura 52. Representación de la degradación de las películas de Qo en SBF. ............... 126

Figura 53. Morfología celular en scaffold microporoso [29].. ......................................... 126

Figura 54. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA

patrón (sin recubrimiento de Qo) a 40X, 200X y 500X. .................................................. 133

Figura 55. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con

recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y menor tiempo de

inmersión (5 min) a 35X y 200X. ....................................................................................... 134

Figura 56. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con

recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y mayor tiempo de

inmersión (20 min) a 40X y 200X. ..................................................................................... 135

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Scaffolds de HA

Figura 57. Hueso esponjoso o trabecular al SEM 200X (Narváez, 2004) [35].. .............. 151

Figura 58. Estadística descriptiva para datos de porosidad de las muestras. .. ............. 151

Figura 59. Estadística descriptiva para datos de interconectividad de las muestras. .. . 151

Figura 60. Curva obtenida con el método de Washburn para los scaffolds de HA con

solución de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5 y 2%)... .................................. 151

Figura 61. Curva obtenida con el método de Washburn para los scaffolds de HA con

solución de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5 y 2%). .. ................................. 151

Figura 62. Curvas de tensión – Deformación para scaffolds de HA patrón y con

recubrimientos de Qo a menor tiempo de inmersión..................................................... 151


recubrimientos de Qo a mayor tiempo de inmersión. .. ................................................. 151

Figura 64. Scaffolds con y sin recubrimiento de Qo obtenidos después del ensayo de

compresión (a mayor tiempo de inmersión). .. ............................................................... 151

Figura 65. Estadística descriptiva para datos de resistencia mecánica de las muestras. ..

............................................................................................................................................ 151

Figura 66. Estadística descriptiva para datos de módulo elástico de las muestras. .. ... 151

Figura 67. Correlación de variables respuesta. . .. ........................................................... 151

Figura 68. Resultados de citotoxicidad mediante ensayo de MTT para las muestras de

los scaffolds evaluados y el control. . .. ............................................................................ 151

Figura 69. Evaluación in vitro: Las imágenes corresponden al cultivo de células Saos-2 en

presencia de los biomateriales luego de 48 horas de incubación. A: M1, B: M2, C: M3, D:

M4, E: M5 y F: Células sin biomaterial (Aumento 20X). . .. ............................................. 151

11


Scaffolds de HA

Figura 70. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M1 (scaffold de HA patrón). Las

flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de

cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. . .. ........................................................................... 151

Figura 71. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M2 (scaffold de HA con

recubrimiento 0,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al

material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. ............................. 159


recubrimiento 1% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al

material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. . ........................... 151


recubrimiento 1,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al

material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000, 3000 y 4000X. ................... 161


recubrimiento 2% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al

material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. ............................. 161

12


Scaffolds de HA

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Propiedades mecánicas del hueso cortical y trabecular [5]. ............................... 29

Tabla 2. Tipos de respuestas del tejido al implante [25]. .................................................. 41

Tabla 3. Propiedades de la Hidroxiapatita [31]. ................................................................. 44

Tabla 4. Métodos para modificación superficial de biomateriales [21]. .......................... 53

Tabla 5. Parámetros de las formulaciones generadas en el diseño de experimentos. ... 78

Tabla 6. Concentración de iones del SBF y plasma sanguíneo humano [3, 4]. ................ 86

Tabla 7. Orden, cantidad y peso fórmula de los reactivos para preparación de SBF. ..... 86

Tabla 8. Composición química de scaffolds de hidroxiapatita obtenidos por gel-casting.

............................................................................................................................................ 103

Tabla 9. Análisis químico por EDS para scaffolds de HA sin recubrimiento. .................. 105

Tabla 10. Comparación de valores de los difractogramas de rayos X. ........................... 107

Tabla 11. Bandas de vibración reportadas en la literatura [13]. .................................... 110

Tabla 12. Características obtenidas al SEM reportadas para los scaffolds de HA con

recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones y tiempos. .................................... 123

Tabla 13. Porcentaje de pérdida de peso de los scaffolds (Degradabilidad). ................ 124

Tabla 14. Resultados de Porosidad e Interconectividad para los scaffolds de HA con y sin

recubrimiento de Qo y su respectiva D.E. ........................................................................ 130

Tabla 15. Valores promedio de los tamaños de poro obtenidos al SEM. ....................... 136

Tabla 16. Ángulo de contacto para scaffolds de HA con las diferentes soluciones de Qo.

............................................................................................................................................ 140

Tabla 17. Tensión superficial y viscosidad de las soluciones de Qo a diferentes

concentraciones. ............................................................................................................... 141

13


Scaffolds de HA

Tabla 18. Trabajo de adhesión (Wad), para la interacción entre los sustratos

HA/recubrimientos Qo. ..................................................................................................... 143

Tabla 19. Propiedades mecánicas de los scaffolds de HA con y sin recubrimientos de Qo.

............................................................................................................................................ 146

Tabla 20. Resumen estadístico de datos de las variables respuesta.. ............................ 152

Tabla 21. Correlaciones de Pearson entre variables respuesta. ..................................... 152

Tabla 22. Porcentajes de viabilidad de células (Saos-2) cultivadas en los scaffolds

evaluados con y sin recubrimiento de Qo. ....................................................................... 154

Tabla 23. Porcentajes de proliferación celular (Saos-2) cultivadas en los scaffolds

evaluados con y sin recubrimiento... ................................................................................ 152

14


Scaffolds de HA

GLOSARIO

Biomaterial: Cualquier sustancia o combinación de sustancias, distinta de las drogas, de

origen sintético o natural, que puede ser usada por cualquier período de tiempo para

aumentar o reemplazar parcialmente o totalmente cualquier tejido, órgano o función

del cuerpo, con el fin de mantener o mejorar su función. Éstos deben cumplir unos

requisitos imprescindibles como no ser citotóxico, mutágeno, alergénico, cancerígeno,

ni radiactivo. Para que esto se cumpla deben ser química, mecánica, y clínicamente

compatibles y sus productos de degradación no deben ser tóxicos.

Biocompatibilidad: Capacidad de un material para cumplir su función en una aplicación

específica con una respuesta apropiada por parte del tejido. Capacidad de para cumplir

su función terapéutica sin producir efectos indeseados, sean locales o sistémicos, en el

beneficiario del tratamiento, pero sí originando la respuesta más apropiada a nivel

celular o tisular en esa situación concreta, optimizando así el efecto terapéutico

beneficioso más relevante de dicho tratamiento.

Biodegradabilidad: Un material biodegradable, es no tóxico y se disuelve al colocarlo en

el medio biológico. La composición del material debe ser tal que pueda ser disuelto

químicamente por los fluidos fisiológicos o bien consumido por los macrófagos.

Diseñado para degradarse gradualmente en el tiempo y ser remplazado por tejido

natural

Ingeniería de tejidos: Es la aplicación de principios y métodos de ingeniería para el

entendimiento de estructuras funcionales y el desarrollo de sustitutos biológicos para

restaurar, mantener o mejorar tejidos y sus funciones.

Scaffold: Son estructuras tridimensionales porosas que sirven como base o soporte y

poseen nutrientes esenciales para la proliferación celular. La traducción de la palabra

scaffold es andamio, pero en español se conoce como matriz o cuerpo poroso.

Recubrimiento: Corresponde a películas superficiales formadas con los productos de

una reacción o adhesión entre el sustrato y el medio circundante que se adhiere a dicha

superficie, constituyendo una barrera física cuyas características más apreciadas son

impermeabilidad, invisibilidad, tenacidad, baja solubilidad, aumento de la vida útil,

protección, etc.

15


Scaffolds de HA

Hidroxiapatita: La HA es un fosfato de calcio (Ca10(PO4)6OH) con composición similar a la

parte mineral del tejido óseo, es biocompatible y bioactiva, por lo cual es un material

ideal para regeneración ósea.

Quitosano: [poli (1-4)-β-D-glucosamina] es un biopolímero resultante de la N-

desacetilación de la quitina y se obtiene principalmente a partir de crustáceos, hongos y

algunas algas. Segundo polímero natural más abundante de la tierra y posee

comportamiento policationico capaz de atraer moléculas cargadas negativamente, que

da como resultado su naturaleza antibacteriana.

Gel-Casting: Este proceso consiste en la polimerización de una solución acuosa de polvo

cerámico y monómeros orgánicos para formar una espuma, obteniéndose cuerpos con

porosidad abierta e interconectada que posibilitan el crecimiento celular y la

vascularización en su interior al momento de ser implantados; mejorando así la

osteointegración del material.

Osteoinductividad: Es el proceso mediante el cual las células madre y osteoprogenitoras,

células pluripotenciales, son reclutadas en el sitio de regeneración ósea y estimuladas

para diferenciarse a osteoblastos.

Formazan: Es un compuesto artificial insoluble en agua, producto de la reducción de

sales de tetrazolio por deshidrogenasas y reductasas y es utilizado entre otras cosas

para pruebas con células para identificar la cantidad de células vivas por medio de

densitometría óptica. Tiene una variedad de colores de azul oscuro a rojo profundo a

naranja, dependiendo de la sal de tetrazolio original utilizado como sustrato para la

reacción.

Alamar Blue: Colorante indicador redox que produce un cambio colorimétrico y una

señal fluorescente en respuesta a la actividad metabólica. Es seguro y no tóxico y se

utiliza para el análisis cuantitativo de la viabilidad celular y la proliferación celular,

bioensayos de citoquinas y en estudios de citotoxicidad in vitro.

Proliferación celular: Es el incremento del número de células por división celular.

Resistencia mecánica: Capacidad de los materiales de soportar fuerzas que pasan a

través de ellos.

Módulo elástico: Indica la resistencia a la deformación de un material.

16


Scaffolds de HA

ABREVIATURAS

HA: Hidroxiapatita

Qo: Quitosano

IT: Ingeniería de tejidos

ASTM: American Society for Testing Materials

SBF: Fluido Corporal Simulado (Simulated Body Fluid)

SFB: Suero Fetal Bovino

SEM: Microscopía Electrónica de Barrido

EDS: Espectroscopia por electrones dispersos

DRX: Difracción de Rayos X

FTIR: Espectroscopia Infrarroja por transformada de Fourier

XRF: Espectroscopía de fluorescencia de rayos X

TGA: Análisis Termo gravimétrico

MO: Microscopia Óptica

MTT: Bromuro de 3-(5,4 dimetil tizol-2-I) -2-5 difenil tretrazolium)

Ti6Al4V: Aleación de titanio con aluminio al 6% y vanadio al 4%

BMP: Proteína morfogenética ósea

ECM: Matriz Extracelular

DMEM: Medio mínimo esencial para el cultivo celular

PMMA: Polimetil metacrilato

PVA: Polivinil alcohol

ANOVA: Análisis de varianza de una vía

MANOVA: Analisis multivariante de la varianza

UV: Ultravioleta visible

MPa: Megapascales

E: Módulo elástico

σ: Tensión

ɛ: Deformación

ρ: Densidad

17


Scaffolds de HA

RESUMEN

Un material ideal para reemplazar el hueso tiene que imitar al tejido que reemplaza

respondiendo de manera adecuada a sus requerimientos de forma y funcionamiento,

además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico sin inducir ningún

tipo de afección. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus cualidades

como estructura, funcionalidad y además ser tolerado adecuadamente por el

organismo. Generalmente, el tejido óseo extraído del propio paciente es el sustituto

que más se emplea, por ser el que facilita mejor su recuperación. Sin embargo, es

limitada la cantidad de tejido que puede ser auto trasplantado y a veces es necesaria

otra intervención quirúrgica, la cual puede resultar en un procedimiento traumático.

Por lo anterior, las investigaciones en el área de ingeniería de tejidos como alternativa

de solución para reemplazo óseo tienen como fundamento esencial el uso de

biomateriales usados para plataformas de crecimiento celular o soporte, conocidos

como scaffolds y el uso de células asociadas a éstos, esto exige que las variables de

estudio correspondan en lo posible al entorno real. Por otra parte, la literatura

especializada para ingeniería de tejidos muestra además un aumento en la tendencia

hacia el desarrollo de andamiajes con materiales compuestos por cerámica y adición de

polímeros, ya que la preparación de estos va a permitir la incorporación de propiedades

favorables de ambos componentes.

Debido a esta tendencia, en esta investigación se desarrollaron scaffolds de

hidroxiapatita (HA) con 50% de sólidos por medio de la técnica gel-casting basada en la

polimerización in situ de monómeros de acrilamida para formar un cuerpo poroso, estos

fueron recubiertos con un polímero natural biodegradable llamado Quitosano a

diferentes concentraciones mediante una metodología sencilla de inmersión a

diferentes tiempos de exposición y en condiciones ambientales. El recubrimiento de

Quitosano se realizó con el fin de verificar la influencia de este en las propiedades

mecánicas, la estabilidad de los scaffolds y el comportamiento celular, comparando con

las propiedades del hueso a fin de mejorar los prerrequisitos necesarios para un

implante ortopédico.

Este material fue evaluado in vitro mediante pruebas de citotoxicidad, proliferación, y

adhesión con el fin de observar las interacciones de las células óseas con el material,

18


Scaffolds de HA

con el fin de verificar su biocompatibilidad. Además, estos materiales fueron analizados

mediante ensayos mecánicos y técnicas de caracterización tales como difracción de

rayos X (XRD), espectroscopía infrarroja por transformada de fourier (FTIR) y

microscopía electrónica de barrido (SEM) para determinar la porosidad y la

interconexión, así como otras propiedades químicas, físicas y superficiales, entre otras.

Por último, con este proyecto se obtuvieron características de un material el cual puede

ser una buena alternativa en términos mecánicos y biológicos para ser utilizado en

campo de la ortopedia y regeneración de hueso.

Los resultados de todas las pruebas mostraron que los scaffolds de HA con

recubrimientos de quitosano presentaron en general buenas propiedades de resistencia

mecánica y de degradabilidad, adecuadas para su uso en regeneración de tejido óseo,

confirmando considerablemente mejoras en éstas y demostrando un blindaje eficaz y

eficiente de los scaffolds de HA en condiciones fisiológicas a mayor concentración de

quitosano con respecto a los scaffolds de HA sin recubrimiento. Los ensayos de

biocompatibilidad revelaron resultados favorables.

Palabras clave: Hidroxiapatita, quitosano, biopolímero, scaffold, biocompatibilidad,

ensayos in vitro, gel-casting, inmersión.

19


Scaffolds de HA

ABSTRACT

An ideal material for bone replacements needs to have the faculty of imitating the host

tissue reacting in a suitable manner to requirements of form and function, also

providing a proper response to the biological system without induce any kind of disease.

While the material interacts with tissue, simultaneously it must acquire its properties

like structure, functionality and be tolerated by the host. Generally, autologous implants

are the most often used due to their high compatibility and recuperation. However, this

option is limited for the amount of available tissue and these required a second surgery

which can do of this a traumatic procedure.

Therefore, researches around tissue engineering focused on find alternative solution for

the bone replacement have a main purpose the use of biomaterials as platform to

induce the cell growth, these structures are called as scaffolds, and the use of cells

associated with them, in this conditions is important to have the control of variables as

close as possible to the real environment. On the other hand, specialized literature in

tissue engineering shows an increasing trend toward the development of scaffolds

mixing ceramic and polymers with the purpose to improve and complement the

properties of both materials.

Due to this trend, in this research, scaffolds of Hydroxyapatite (HA) with 50% solids will

be produced by gel-casting based on polymerization in situ of acrylamide monomers to

form a porous body, and were coated with a biodegradable natural polymer chitosan

different concentrations, by the technique of dip coating at different times under

environmental conditions. The coating of chitosan is performed in order to verify

the influence of the mechanical properties, the stability of scaffolds and cell

behavior, compared to the properties of bone to improve the prerequisites for an

orthopedic implant.

This material will be evaluated in vitro using cytotoxicity, proliferation, adhesion test

and by observation of interactions of bone cells with the material in order to verify their

biocompatibility. Furthermore, these materials will be analyzed by mechanical tests and

characterization techniques such as X-ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared

spectroscopy (FTIR) and Scanning electron microscopy (SEM) to determine porosity and

interconnectivity as well as other properties. Finally with this project we expect to have

a good material which can be a good alternative in mechanical and biological terms to

be used in orthopedic field and bone regeneration.

20


Scaffolds de HA

The results of the tests indicated that scaffolds of HA with coatings of chitosan

presented in general good properties of mechanical resistance and degradability,

suitable for their use in regeneration of bone tissue, showing improvements and

demonstrating an efficient protection of HA scaffolds under physiological conditions at

higher concentration of chitosan with respect to uncoated HA scaffolds. The

biocompatibility tests revealed favorable results.

Key words: Hydroxyapatite, chitosan, biopolymers, scaffolds, biocompatibility, in vitro

tests, gel- casting, dip coating.

21


Scaffolds de HA

CAPÍTULO 1.

INTRODUCCIÓN, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y ALCANCES

1.1. INTRODUCCIÓN

Un material ideal para reemplazar o regenerar el hueso tiene que imitar al tejido

respondiendo de manera adecuada a sus requerimientos de forma y funcionamiento,

además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico sin inducir ningún

tipo de infección. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus cualidades y

ser tolerado adecuadamente por el organismo [1]. Generalmente, el tejido óseo

extraído del propio paciente es el sustituto que más se emplea, por ser el que facilita

mejor su recuperación. Sin embargo, es limitada la cantidad de tejido que puede ser

auto trasplantado y a veces es necesaria otra intervención quirúrgica ya que puede

presentarse infección o rechazo [2].

Debido a esto surge la ingeniería de tejidos como una disciplina necesaria debido a los

múltiples daños degenerativos a los que está expuesto el hueso ya sea por enfermedad

o traumatismo; con el empleo de factores bioactivos y de scaffolds como soportes

pueden obtenerse estructuras conductoras e inductoras, que proporcionan apoyo

mecánico e integridad al hueso y que permiten a su vez un crecimiento adecuado del

tejido natural [3].

La producción de scaffolds es una de las opciones que más se está empleando en la

actualidad debido a que se pueden utilizar células del propio paciente, lo que disminuye

el rechazo. Las características que deben cumplir éstos son las de biocompatibilidad, la

no generación de productos tóxicos de desecho, estructura de poros accesibles,

interconectados y de tamaño adecuado, además si éste es de un material

biodegradable la degradación no debe darse antes de que las células logren realizar una

proliferación adecuada. Para tal fin se han usado técnicas de síntesis de scaffolds

utilizando diversas técnicas y materiales, entre estos, algunos cerámicos bioactivos

como la Hidroxiapatita (HA), la cual debido a su capacidad de enlazarse directamente al

tejido óseo resulta ser idóneo para regeneración ósea, sin embargo, como presenta

muy baja resistencia, no es posible su implantación en lugares del cuerpo con altas

cargas mecánicas [4].

22


Scaffolds de HA

Por otra parte, cabe resaltar que la matriz ósea está compuesta por dos fases

principales; una inorgánica que es la fase dura compuesta por minerales de tipo fosfato

de calcio tipo apatitas y la orgánica compuesta por proteínas y colágeno, esta

asociación de materiales permite darle la resistencia necesaria para soportar las cargas.

Para tratar de simular este tipo de estructuras en la ingeniería de tejidos se ha dado una

mayor tendencia a desarrollar scaffolds híbridos con materiales compuestos de

cerámica y polímeros, buscando asociar las excelentes propiedades osteoconductivas

de los cerámicos, a su vez la flexibilidad y degradabilidad de los polímeros [5]. De ahí

que la preparación de compuestos de fosfatos de calcio y biopolímeros, permitan la

asociación de propiedades favorables de ambos componentes.

En los últimos años el quitosano ha mostrado grandes ventajas para aplicaciones

biomédicas, este polímero natural es no tóxico, biodegradable, biocompatible y

bioadhesivo, otra ventaja muy importante es su excelente propiedad de

bioestimulación, la cual facilita la reconstrucción y vascularización de los tejidos

dañados, además de poseer la capacidad para compensar las deficiencias de los

componentes celulares que conducen a la formación de cicatrices pequeñas [6].

1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos juega un papel muy importante;

específicamente el uso de sustitutos óseos, ya sea para reemplazar el tejido afectado o

para favorecer su regeneración. Un material ideal para reemplazo tiene que imitar al

tejido que reemplaza respondiendo de forma adecuada a sus requerimientos de forma

y funcionamiento, además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico

sin inducir infecciones. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus

cualidades y ser tolerado adecuadamente por el organismo.

Generalmente, el tejido óseo extraído del propio paciente es el sustituto más

comúnmente empleado, por ser el que facilita la mejor recuperación. Sin embargo, es

limitada la cantidad de tejido que puede ser auto trasplantado y a veces es necesaria

otra intervención quirúrgica [7]. Por esto se hace necesario buscar otras alternativas de

regeneración, como por ejemplo, el uso de biocerámicas para la creación de

plataformas tridimensionales (scaffolds) que sirvan de estructura de soporte temporal

para hacer crecer las células óseas, y una vez implantados estos scaffolds se forme el

nuevo tejido.

Uno de los materiales más estudiados en este campo para la fabricación scaffolds es la

Hidroxiapatita [HA, Ca10 (PO4)6(OH)2], cuya composición química es similar a la del hueso

23


Scaffolds de HA

(fase inorgánica). Es un cerámico bioactivo debido a su capacidad de enlazarse

directamente al tejido óseo y es uno de los más utilizados debido a esta característica y

a las propiedades que posee de biocompatibilidad y osteointegración, está entre los

más importantes sustitutos del hueso humano en implantes [8], además ofrece diversas

posibilidades de conformación, siendo posible fabricar polvos, recubrimientos, cuerpos

densos y scaffolds; estos últimos pueden ser utilizados para el relleno de defectos óseos

o como plataformas de crecimiento celular [9].

La principal desventaja de este material es que presenta baja resistencia mecánica, sin

embargo, con el fin de mejorar esta propiedad y producir scaffolds cerámicos que

puedan ser usadas como scaffolds, se han desarrollado diferentes técnicas de

procesamiento entre las cuales están la infiltración de espumas poliméricas, el gel-

casting, la liofilización, el prototipado rápido y las combinaciones entre ellas, etc. A su

vez, con la utilización de agentes reticulantes se logra mejorar la resistencia mecánica y

otorgar porosidades que promuevan la adhesión, la migración, el crecimiento y la

proliferación celular, para una buena integración con el tejido circundante, a fin de

mejorar la respuesta biológica del hueso y ser un firme candidato como sustituto de

injertos óseos [2, 10].

Cabe resaltar además que la matriz ósea está compuesta por dos fases principales; una

inorgánica que es la fase dura compuesta por minerales de tipo fosfato y la orgánica

compuesta por proteínas y colágeno, esta asociación de materiales permite darle la

resistencia necesaria para soportar las cargas. Para tratar de simular este tipo de

estructuras en la ingeniería de tejidos se ha dado una mayor tendencia a desarrollar

scaffolds híbridos con materiales compuestos por cerámica y polímeros, buscando

asociar las excelentes propiedades osteoconductivas de los cerámicos, a su vez la

flexibilidad y degradabilidad de los polímeros. De ahí que la preparación de compuestos

de fosfatos de calcio y biopolímeros, permitan la asociación de propiedades favorables

de ambos componentes.

Por lo expuesto anteriormente y a la tendencia a desarrollar scaffolds para ingeniería de

tejidos con materiales cerámicos y poliméricos se plantea en este proyecto la

posibilidad de realizar un método alternativo que permita la obtención de estas

estructuras porosas con un cerámico comercial de hidroxiapatita por el método de gel-

casting y recubrirlas con películas de quitosano a diferentes concentraciones con el fin

de comprobar el efecto que pueda aportar este biopolímero sobre los scaffolds de HA

con respecto a sus diversas propiedades físicas, químicas, mecánicas y biológicas, con el

fin de determinar si cumplirán los requisitos de biocompatibilidad y biofuncionalidad

idóneos para ser considerados en la regeneración ósea.

24


Scaffolds de HA

1.3. ALCANCE DEL PROYECTO

Este proyecto empieza con una serie de fundamentos teóricos y un estado del arte que

contextualizan al lector, luego se detalla la obtención de los scaffolds de hidroxiapatita,

el desarrollo de los recubrimientos y de las técnicas de caracterización y por último, se

presentan los resultados obtenidos.

Básicamente se centra en los siguientes aspectos:

Capítulo 2. Marco teórico y Estado del arte: Se encuentran los fundamentos teóricos

sobre los elementos utilizados para desarrollar los materiales y recubrimientos de

estudio, las características de biomateriales en general, scaffolds y recubrimientos, las

técnicas de caracterización y un acercamiento a los cultivos celulares

Capítulo 3. Objetivos, Materiales y métodos: Se describen los objetivos planteados para

el desarrollo de la investigación y se detallan los materiales y métodos utilizados para

obtener los scaffolds y recubrimientos con el biopolímero, como caracterizarlos

química, física, mecánica y biológicamente y el diseño experimental aplicado a dicha

investigación.

Capítulo 4. Resultados y discusión: contiene los resultados obtenidos en proceso de

obtención y ensayos de caracterización, con una breve discusión y explicación de cada

uno de ellos.

Capítulo 5. Conclusiones: conclusiones generales extraídas de toda la experimentación y

los resultados obtenidos durante la investigación.

Cada capítulo cuenta con sus respectivas referencias bibliográficas; trabajos de

investigación, tesis, artículos científicos utilizados para la realización del proyecto,

patentes, libros y consultas de internet.

25


Scaffolds de HA

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CAPÍTULO 1

[1] R. Sastre, S. Aza, and J. San Román, Biomateriales. Castelló de la Plana: Faenza

Editrice Ibérica, 2004.

[2] C. A. Martínez and A. Ozols, “Biomateriales utilizados en cirugía ortopédica como

sustitutos del tejido óseo,” Rev. la Asoc. Argentina Ortop. y Traumatol., vol. 77, no. 2,

pp. 140–146, 2012.

[3] G. Wei and P. X. Ma, “Macroporous and nanofibrous polymer scaffolds and

polymer/bone-like apatite composite scaffolds generated by sugar spheres,” J. Biomed.

Mater. Res. - Part A, vol. 78, no. 2, pp. 306–315, 2006.

[4] C. B. Carter and G. Norton, Ceramic Materials: Science and Engineering, Second.

USA: Springer New york, 2013.

[5] C. Peniche, Y. Solís, N. Davidenko, and R. García, “Materiales compuestos de

quitosana e hidroxiapatita,” Biotecnología Aplicada, vol. 27, no. 3. Madrid - España, p.

10, 2010.

[6] S. K. Mishra and S. Kannan, “Development, mechanical evaluation and surface

characteristics of Chitosan/polyvinyl alcohol based polymer composite coatings on

titanium metal,” J. Mech. Behav. Biomed. Mater., vol. 40, pp. 314–324, 2014.

[7] U. Valle and U. Valle, “Desarrollo y caracterización de cementos óseos macroporosos

de fosfato de calcio,” vol. 37, p. 129, 2006.

[8] P. Sepulveda, J. G. P. Binner, S. O. Rogero, O. Z. Higa, and J. C. Bressiani, “Production

of porous hydroxyapatite by the gel-casting of foams and cytotoxic evaluation,” J.

Biomed. Mater. Res., vol. 50, no. 1, pp. 27–34, 2000.

[9] A. Woesz, M. Rumpler, J. Stampfl, F. Varga, N. Fratzl-Zelman, P. Roschger, K.

Klaushofer, and P. Fratzl, “Towards bone replacement materials from calcium

phosphates via rapid prototyping and ceramic gelcasting,” Mater. Sci. Eng. C, vol. 25,

no. 2, pp. 181–186, 2005.

[10] K. Zhao, Y. F. Tang, Y. S. Qin, and J. Q. Wei, “Porous hydroxyapatite ceramics by ice

templating: Freezing characteristics and mechanical properties,” Ceram. Int., vol. 37, no.

2, pp. 635–639, 2011.

26


Scaffolds de HA

CAPÍTULO 2.

MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE

2.1. TEJIDO ÓSEO

El conocimiento de la estructura, la fisiología, los mecanismos de formación y de

regeneración ósea son fundamentales para la medicina regenerativa y la ingeniería de

tejido óseo. Por esta razón se presenta a continuación un resumen de las características

del hueso bajo condiciones fisiológicas normales sin patologías.

2.1.1. Características generales del hueso

El tejido óseo, denominado comúnmente hueso forma la base o sostén del sistema

locomotor y constituye el esqueleto del organismo, y junto con los dientes es el tejido

más duro del cuerpo. Es una forma especializada de tejido conjuntivo que está

compuesto dentro del componente orgánico por matriz extracelular la cual se conoce

también como osteoide (conformada en un 90% por varios tipos de colágeno en su

mayoría tipo I y el 10% de proteínas no colágenas como son los proteoglucanos, las

proteínas multiadhesivas, factores de crecimiento, citocinas entre otras) y diferentes

tipos de células. En cuanto al componente inorgánico que está representado por un

65% del peso seco y está constituido por cristales de Hidroxiapatita [Ca10 (PO4)6(OH)2],

bicarbonato, citrato, magnesio, sodio y potasio; esto hace que una de las características

que distinga al tejido óseo de los otros tipos de tejidos conjuntivos sea la mineralización

de su matriz, la cual produce un tejido muy duro capaz de proveer sostén y protección

[1, 2].

Se muestra en la figura 1 un diagrama de los componentes del tejido óseo de forma

resumida.

27


Scaffolds de HA

Figura 1. Diagrama que representa los componentes del tejido óseo [3].

2.1.2. Estructura y fisiología del hueso

Existen dos variedades de tejido óseo atendiendo a sus características macroscópicas

(anatómicas); tejido óseo compacto y tejido óseo esponjoso o laminar, estos dos tipos

de hueso sólo se distinguen en el grado de porosidad y densidad, básicamente debido a

la organización y al nivel de mineralización de la matriz de colágeno. El tejido óseo

compacto se compone de un 80 a 90% de calcio, está formado por una masa ósea

densa, compacta sin espacios, el cual se encuentra en la porción más externa de todos

los huesos y en la mayor parte de la diáfisis de los huesos largos. El tejido óseo

esponjoso sólo tiene un 15 a 25% de calcio y está constituido por finas trabéculas

(delgadas espículas de tejido óseo anastomosadas) que se entrecruzan dando lugar a un

entramado en forma de red cuyos espacios están intercomunicados y albergan la

médula ósea. Este tipo de tejido está en la porción central de los huesos planos y en las

epífisis de los huesos largos, tiene una porosidad media del 75 al 95% y una densidad de

aproximadamente 0,2g/cm3 [4].

28


Scaffolds de HA

La unidad básica estructural del hueso es la osteona o sistema de Havers, que con un

tamaño de 200 µm se compone de láminas concéntricas de matriz colágena

mineralizada y contiene un canal central por el que pasan capilares y nervios. Estas

osteonas se agrupan y ordenan formando láminas que a la vez se unen para conformar

la parte cortical del hueso (figura 2) [2].

Figura 2. Corte longitudinal para ilustrar el hueso cortical y trabecular a nivel macroscópico (a) Corte longitudinal y transversal de hueso cortical ilustrando a nivel

microscópico las osteonas, la capilarización, el endiostio y el periostio (b) [2].

Por otra parte, es importante destacar que el tejido óseo en general tiene poros de

tamaño que van de 1 a 100 micras para el hueso cortical normal y de 200 a 400 micras

para el hueso trabecular, en este último el 55 al 70% de los poros están interconectados

[5]. Estos dos tipos de hueso también tienen diferentes propiedades mecánicas como se

observa en la Tabla 1.

29


Scaffolds de HA

Tabla 1. Propiedades mecánicas del hueso cortical y trabecular [5].

PROPIEDADES MECÁNICAS HUESO

CORTICAL

HUESO

TRABECULAR

Resistencia a la compresión (MPa) 150 - 230 2 - 12

Resistencia a la tracción (MPa) 100 - 150 10 - 20

Resistencia a la flexión (MPa) 100 - 240 ---

Deformación de pre-fallo (%) 1 - 3 5 - 7

Resistencia al agrietamiento (MPa·m1/2) 2 - 12 ---

Módulo elástico (MPa) 7000 - 30000 400 – 1700

Porosidad (%) 5 - 30 30 - 90

El hueso es un órgano muy importante y éste tiene que cumplir múltiples funciones

tanto a nivel mecánico como metabólico. Las funciones del tejido óseo son:

Mecánicas: La protección de los órganos internos (por ejemplo, el cráneo

protege el cerebro y las costillas protegen el corazón y los pulmones); además

da forma y apoyo al cuerpo, esto permite el movimiento a través de la

interacción con los músculos [5].

Síntesis: La producción de células rojas y blancas de la sangre en la medula ósea,

la cual se encuentra en la parte interior del hueso [5].

Metabólica: Es una fuente importante de minerales, tales como el calcio y el

fósforo, factores de crecimiento como la proteína morfogenética ósea (BMP) y

el factor de crecimiento transformante (TGF) y grasa (la de la médula ósea

amarilla que actúa como reserva de almacenamiento de ácidos grasos). Además,

el hueso amortigua la sangre contra los cambios de pH excesivos mediante la

absorción o liberación de sales, la desintoxicación de la sangre de metales

pesados almacenándolos y evitando su influencia en otros órganos [5].

En virtud de su contenido mineral, el tejido óseo sirve como sitio de depósito de calcio y

fosfato, los cuales pueden ser movilizados de la matriz ósea y captados por la sangre

según sea necesario para mantener las concentraciones adecuadas en todo el

organismo. Por consiguiente, además de sostén y protección, el tejido óseo desempeña

un papel secundario importante en la regulación homeostática de la calcemia

(concentración de calcio en la sangre) [1].

30


Scaffolds de HA

2.1.3. Células óseas

En la matriz ósea hay espacios llamados lagunas u osteoplastos, cada uno de los cuales

contiene una célula ósea u osteocito; estos son osteoblastos que quedan atrapados

entre la matriz ósea calcificada, dentro de cavidades llamadas lagunas óseas. El

osteocito extiende una gran cantidad de prolongaciones en túneles estrechos

denominados canalículos. Los canalículos atraviesan la matriz mineralizada para

conectar las lagunas contiguas y permitir el contacto entre las prolongaciones de

osteocitos vecinos. De esta manera se forma una red continua de canalículos y lagunas

con células y sus prolongaciones en toda la masa del tejido mineralizado. El tejido óseo

depende de los osteocitos para mantener su viabilidad ya que mantienen el intercambio

de sustancias nutritivas entre los vasos sanguíneos del tejido óseo y la matriz ósea y

depositan o extraen pequeñas cantidades de sales de calcio cuando el metabolismo del

hueso así lo requiere. Sin embargo, además de los osteocitos, en el tejido óseo hay

otros tipos de células, en la figura 3 se muestran las principales [2, 3, 6].

Figura 3. Tipos de células óseas [6].

2.1.3.1. Células osteoprogenitoras

Estas se derivan de células madre mesenquimáticas que se encuentran en las

superficies externas e internas de los huesos (periostio y endostio). Son células

indiferenciadas similares a los fibroblastos. Durante la formación del hueso, estas

células se dividen y se diferencian en dos tipos de células formadoras de tejido óseo: los

osteoblastos y los preosteoclastos, que darán origen a los osteocitos y osteoclastos

31


Scaffolds de HA

respectivamente. Son capaces de dividirse y proliferar para la formación y reparación

ósea. Asimismo, tienen la capacidad de diferenciarse a otros tipos celulares: adipocitos,

condroblastos y fibroblastos. Estructuralmente, son células de núcleo oval y cromatina

laxa, citoplasma escaso y con forma ahusada [7].

2.1.3.2. Osteoblastos

Son células que secretan la matriz extracelular del tejido óseo; una vez que la célula

queda rodeada por la matriz secretada pasa a llamarse osteocito. Son células

formadoras de tejido óseo y por su capacidad de dividirse, se asemejan a los

fibroblastos y los condroblastos. Secretan el colágeno y la sustancia fundamental que

constituyen el tejido óseo no mineralizado, sustancia osteoide o preósea, que es la

parte orgánica de la matriz ósea (colágeno tipo I, proteoglucanos y glucoproteínas) [7].

2.1.3.3. Osteoclastos

Son células móviles cuya función es la resorción ósea, están presentes en las superficies

óseas donde el hueso se está eliminando o remodelando (reorganizando) o donde el

hueso se ha lesionado, estos no están emparentados con los osteoblastos sino que

derivan de la fusión de células progenitoras hematopoyéticas mononucleares [1]. Son

células de gran tamaño o gigantes, multinucleadas (6 - 50 núcleos) y acidófilas. En su

ultra estructura se destaca un citoplasma granuloso y vacuolado. Cuando el osteoclasto

está en actividad, se apoya y adhiere directamente sobre la superficie ósea donde se

producirá el mecanismo de resorción, formando por debajo una excavación poco

profunda, que se denomina laguna de Howship. La superficie celular de los osteoclastos

que está en contacto con la matriz ósea posee microvellosidades y recibe el nombre de

superficie activa, borde rugoso o borde plegado [3, 7].

Las células osteoprogenitoras y los osteoblastos son precursores del desarrollo de los

osteocitos. Los osteoclastos son células fagocíticas producto de la fusión de células

progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea que dan origen a los linajes

granulocítico, neutrófilo y monocítico [1].

2.1.3.4. Células de revestimiento óseo

Estas permanecen en la superficie ósea cuando no hay crecimiento activo. Derivan de

aquellos osteoblastos que quedan después del cese del depósito óseo. En los sitios en

32


Scaffolds de HA

los que no se está produciendo remodelado del tejido óseo maduro, las superficies

óseas están revestidas por una capa de células aplanadas con citoplasma muy delgado y

orgánulos escasos más allá de la región perinuclear. Las células de revestimiento óseo

ubicadas en las superficies externas del hueso reciben el nombre de células periósticas

y las que tapizan las superficies internas con frecuencia se denominan células

endósticas. También se cree que intervienen en el mantenimiento y la nutrición de los

osteocitos incluidos en la matriz ósea subyacente y que regulan el movimiento del

calcio y el fosfato desde la sangre hacia el hueso y desde el hueso hacia la sangre [1].

2.1.3.5. Remodelado óseo

El remodelado óseo es una secuencia de eventos celulares que tiene como función

principal el rejuvenecimiento del esqueleto o reestructuración del hueso existente, este

proceso renueva anualmente un 3,5% del hueso cortical y alrededor de un 30% del

trabecular que está en constante formación y reabsorción. De manera secundaria

desempeña un papel preponderante en el control de la homeostasis mineral, mediante

la liberación al torrente sanguíneo de iones de calcio-fosforo [8].

A nivel microscópico, el remodelado óseo se produce en las unidades básicas

multicelulares, donde los osteoclastos reabsorben una cantidad determinada de hueso

y los osteoblastos forman la matriz osteoide y la mineralizan para rellenar la cavidad

previamente creada. En estas unidades hay osteoclastos, macrófagos, preosteoblastos y

osteoblastos que están regidos por una serie de factores, tanto generales como locales,

permitiendo el normal funcionamiento del hueso y el mantenimiento de la masa ósea.

Es importante destacar que cuando este proceso se desequilibra aparece la patología

ósea, bien sea por exceso (osteopetrosis) o por deterioro (osteoporosis) [9].

La remodelación se inicia cuando un conjunto de osteoclastos erosiona una cavidad en

la superficie ósea. En ausencia de osteoblastos, se establece un intervalo quiescente

(fase de inversión). En ese período la superficie irregular de la cavidad se alisa y se

deposita un estrato de sustancia de cemento. Posteriormente, un conjunto de

osteoblastos sustituye el hueso recientemente erosionado. El remodelado óseo es un

ciclo que se produce en 5 etapas sucesivas que son quiescencia, activación, reabsorción,

inversión y formación (figura 4) [10].

33


Scaffolds de HA

Figura 4. Fases del remodelado óseo normal (BRU: Unidad de Remodelado Óseo; CL: línea de cemento; OS: osteoide) [10].

2.1.4. Patologías óseas y su relevancia

Como se ha mencionado, el hueso es un tejido dinámico en constante formación y

reabsorción, que permite el mantenimiento del volumen óseo, la reparación del daño

tisular y la homeostasis del metabolismo fosforo/calcio [9]. Sin embargo este tejido

reacciona ante una gran diversidad de trastornos, muchos de las cuales tienen su origen

fuera del sistema esquelético. Estas reacciones sirven como espejo de enfermedades,

en el sentido que refleja la naturaleza de la anomalía subyacente. Por tanto, las

reacciones del hueso como órgano y como estructura son importantes en el diagnóstico

y tratamiento de los pacientes. Sin un adecuado conocimiento del hueso, como órgano

y estructura se corre el riesgo de diseñar productos terapéuticos no adecuados [11].

La osteoporosis, la enfermedad de Paget, la osteogénesis imperfecta, el raquitismo, la

osteomalacia, la displasia fibrosa entre otras, son solamente algunos de los trastornos

que pueden afectar muy seriamente tanto la calidad, como la cantidad de masa ósea en

el cuerpo. Todo esto genera uno de los mayores problemas de salud pública para

muchos países del mundo, además de los altos costos debido a los tratamientos. En la

mayoría de casos quienes requieren una intervención ya sea preventiva o curativa se

encuentran incapacitadas para pagar o acceder a dichos tratamientos y de no ser

tratadas oportunamente dichas patologías pueden llevar a que el paciente pierda sus

capacidades funcionales o afecte su calidad de vida [8].

34


Scaffolds de HA

2.1.5. Estrategias terapéuticas para la regeneración de tejido óseo

Tradicionalmente los defectos óseos se han tratado con terapias convencionales

implantando tejidos autólogos, alogénicos o xenogénicos o materiales sustitutos en

otros casos (figura 5). En las últimas décadas se ha incrementado de forma exponencial

la utilización de tejido óseo en la práctica habitual de la cirugía ortopédica y dental. No

obstante, las complicaciones vinculadas a la toma de injertos autólogos como son la

limitada cantidad de hueso a extraer y la morbilidad en el lugar de extracción (dolor,

infección, hematoma, hernias abdominales, etc.) y los potenciales riesgos de carácter

infeccioso e inmunológico (hepatitis, VIH, priones, etc.) en relación con los aloinjertos y

heteroinjeros han impulsado la búsqueda de alternativas diferentes a éstas [12].

Figura 5. Tipos de implantes para regeneración de tejido.

En la actualidad se cuenta con una gran variedad de implantes de materiales que no

tienen su origen en seres vivos como son los polímeros, cerámicos, metales o

composites cuyo fin es lograr productos con propiedades químicas, físicas y mecánicas

más parecidas al hueso y con los cuales se pueda lograr un mejor desempeño funcional

como sustitutos del injerto de hueso. Sin embargo, muchos de estos materiales

presentan varias desventajas, ya que están sujetos a la fatiga, fractura, toxicidad y

desgaste; por lo demás, no se remodelan con el tiempo. Por ejemplo se pueden

presentar problemas de integración del implante con los tejidos adyacentes, puesto que

35


Scaffolds de HA

no pueden adherirse a éste de forma correcta y de esta manera se crean deficiencias de

tipo mecánico [13].

A causa de obstáculos como la escasez de donantes, la transmisión de enfermedades, la

morbilidad del sitio de extracción y la incapacidad de los materiales para remodelarse y

reaccionar ante condiciones fisiológicas, ninguno de los tratamientos convencionales ha

podido suplir todas las necesidades a la hora de tratar problemas relacionados con la

pérdida o deterioro del tejido óseo; por lo tanto, se hace necesaria la búsqueda de

soluciones alternas. Esta creciente necesidad de órganos ha llevado a los investigadores

a plantear la posibilidad de utilizar células y materiales de diversa naturaleza para la

reconstrucción de órganos y tejidos, para dar así nacimiento a una disciplina conocida

como Ingeniería de Tejidos (IT) que es definida como el uso de los principios y métodos

de la ingeniería, la biología, la bioquímica y las ciencias de la vida orientados a la

comprensión de la estructura y la función de los tejidos normales y patológicos de los

mamíferos, y el consecuente desarrollo de sustitutos biológicos para restaurar,

mantener o mejorar las funciones de los organismos [14, 15].

En todos los casos, estos materiales tienen que cumplir una serie de requisitos ya que

son considerados biomateriales, por tanto deben ser biocompatibles con el organismo

receptor, es decir, no generar rechazo, ni daños, deben tener una determinada vida

media para desarrollar su tarea y aportar las prestaciones necesarias para realizar bien

la función a la que van destinados [16]. A continuación se destacan algunos materiales

de uso común en medicina regenerativa, su clasificación y características.

2.2. BIOMATERIALES DE USO EN MEDICINA REGENERATIVA

La ciencia de los Biomateriales es una disciplina que surge a partir de la necesidad de

reparar o reconstruir tejidos u órganos del cuerpo humano que han sido dañados ya sea

por enfermedades, defectos congénitos, accidentes traumatológicos, entre otros. Esta

es una ciencia interdisciplinar donde intervienen especialistas en muchas áreas que van

desde la medicina hasta la ingeniería y se desarrolló rigurosamente en la segunda mitad

del siglo XX, ofreciendo actualmente múltiples tratamientos favorables contra las

diferentes afecciones humanas [11]. La figura 6 muestra de forma esquemática la

evolución histórica del concepto y aplicación de técnicas a lo largo del tiempo para el

tratamiento de las afecciones sin tener en cuenta su causa.

36


Scaffolds de HA

Figura 6. Evolución histórica de las técnicas utilizadas para el tratamiento de diferentes afecciones [11].

Un biomaterial es cualquier sustancia o combinación de sustancias de origen natural o

sintético, solas o en combinación con drogas como parte de un dispositivo en el

tratamiento, aumento o remplazo de algún tejido u órgano sin causar daño agudo o

crónico al huésped mientras mantiene su efectividad física y biológica durante su vida

útil in vivo [17]. Estos pueden ser utilizados sin incompatibilidades como dispositivos

biomédicos y además colocarse en contacto con los tejidos vivos sin provocar daños o

alteraciones. Por lo anterior deben cumplir los requerimientos de la aplicación

específica para la cual son diseñados además de presentar una alta biocompatibilidad al

ser evaluado su comportamiento in vitro e in vivo [18].

En la actualidad, el uso de biomateriales tiene aplicación en casi todos los sistemas del

organismo humano y existe un rango muy amplio de materiales útiles para todo tipo de

aplicaciones biomédicas, estos se pueden clasificar según su naturaleza química en

metales, polímeros, cerámicos y compuestos; sin embargo mantener el equilibrio entre

la biocompatibilidad y las propiedades mecánicas de estos restringen su uso en esta

área. Entre los biomateriales más empleados se encuentran los metales y sus

aleaciones, los cuales fueron los primeros usados para implantes y actualmente son los

37


Scaffolds de HA

más usados por su resistencia mecánica y a la corrosión. Los polímeros también son

ampliamente utilizados por su variedad de composiciones, facilidad de producción con

diferentes modelos geométricos y con determinadas propiedades, pueden ser rígidos o

blandos y algunos resultan adecuados para reemplazos temporales por su composición

biodegradable. Las cerámicas también son muy útiles por su alta estabilidad y dureza, y

por último están los compuestos que son una combinación artificial de dos o más

materiales que difieren en forma o composición donde cada constituyente va a

mantener su identidad física o química. Todos tienen un amplio espectro de

aplicaciones de acuerdo a una necesidad específica [18, 19].

Cabe resaltar que son muchas las enfermedades y lesiones que requieren una

intervención quirúrgica para implantar un biomaterial o un dispositivo médico. En

general, los índices de éxito de dichas intervenciones son elevados, pero todavía hay

aspectos mejorables entre los que cabe destacar el diseño de técnicas quirúrgicas

menos agresivas, la anticipación del tratamiento de las enfermedades degenerativas y

la mejora de los biomateriales y dispositivos implantables [20].

La medicina regenerativa ha traído grandes expectativas para un número significativo

de enfermedades humanas actuales en todo el mundo. Enfermedades, tales como la

enfermedad de Parkinson, el Alzheimer, la osteoporosis, lesiones de columna, el cáncer,

entre otras pueden tratarse en un futuro próximo con métodos que tienen como

objetivo la regeneración de tejidos enfermos o dañados El objetivo ideal de la medicina

regenerativa es la de la regeneración in vitro o in vivo de un órgano funcional complejo

que consta de un andamio o Scaffold hecho a partir de materiales sintéticos o naturales

que se han cargado con células vivas. Debido a esto surge la ingeniería de tejidos, un

campo de investigación que tiene como objetivo desarrollar sustitutos para los órganos

y los tejidos dañados por enfermedad o accidentes, evitando los trasplantes que

requieren un donante o minimizando de alguna forma el riesgo al rechazo. Lo que se

busca es desarrollar tejidos a partir de las propias células del paciente. En primer lugar,

las células se cultivan fuera del cuerpo, en un soporte apropiado que simula el entorno

externo de la célula y posteriormente, cuando su crecimiento es el adecuado, se

trasplanta al cuerpo, figura 7 [21].

38


Scaffolds de HA

Figura 7. Ingeniería de tejidos aprovechada para regeneración de tejidos. Existen dos estrategias diferentes in vivo e in vitro. Ambos métodos usan scaffolds porosos los

cuales son cargados con células [21].

El término ingeniería de tejidos fue acuñado oficialmente en un taller de la National

Science Fundation en 1988 abarcando principios y métodos de las ciencias de la vida y

de la ingeniería. Para estos desarrollos se construyen pequeños andamios que sirven

para definir la forma del órgano a reemplazar. El reto de la ingeniería de tejidos es

imitar lo que sucede en la naturaleza. En términos generales la ingeniería tisular tiene

como objetivo fabricar tejidos u órganos similares a los tejidos u órganos originales de

un paciente que, dañados o enfermos, deben ser sustituidos [15,22].

La ingeniería de tejidos requiere 3 componentes críticos: Las células, los niveles

adecuados de moléculas biofuncionales solubles e insolubles y el scaffold para el

soporte de las células en crecimiento y formación de tejidos. Este último actúa como

una matriz extracelular que permite la fijación de células temporalmente y la

adaptación al medio ambiente. Para lograr el objetivo final de la formación de tejido, el

andamio debe poseer varias características muy importantes, que incluyen la

biocompatibilidad, la formación de subproductos de degradación no tóxicos, estructura

de la porosidad accesible (poros interconectados) y la degradación del andamio en un

tiempo apropiado que permita la invasión de células y la reestructuración del tejido.

Para la infiltración de células en los andamios, el diámetro de poro debe ser lo

suficientemente grande para la invasión celular y la migración dentro del andamio. La

39


Scaffolds de HA

porosidad y la interconectividad de los poros debe ser lo suficientemente grande para la

distribución celular adecuada, pero lo suficientemente pequeña para evitar el

desprendimiento de las células por el flujo de fluidos corporales [23]. Es importante

destacar que el diseño apropiado del scaffold y la evaluación de su estructura tras su

fabricación, son muy importantes para obtener las características requeridas y

adecuadas para ser usado en reparación de tejido óseo.

La clasificación de los biomateriales puede realizarse atendiendo a su comportamiento

cuando se implantan o bien atendiendo a su naturaleza química [16].

2.2.1. Clasificación de biomateriales según su naturaleza química

Entre los biomateriales más usados en ingeniería de tejidos se encuentran los siguientes

grupos:

2.2.1.1. Metales y sus aleaciones

Fueron los primeros materiales utilizados para los implantes y actualmente son los más

usados por su buena resistencia mecánica y a la corrosión [17]. Los metales han sido

muy utilizados como biomateriales con dos propósitos principales los cuales son la

fabricación de prótesis para reemplazar una parte del cuerpo (articulaciones, placas

craneales, clavos, etc.), o implantes utilizados en la estabilización y ayuda al proceso

normal de reparación de un tejido (por ejemplo, unión de huesos rotos). Entre los

metales más utilizados con estos fines cabe destacar las diferentes clases de aceros

inoxidables, las aleaciones de Co-Cr (con Mo y Ni), el titanio y sus aleaciones (con Al, V,

Ni), entre otros. Uno de los problemas que pueden presentar este tipo de materiales es

la liberación de productos al medio lo que produce consecuentemente, una

determinada reacción tisular adversa [16].

2.2.1.2. Polímeros

Son ampliamente usados por sus grandes posibilidades, presentan una amplia variedad

de composiciones, son fáciles de producir, con diferentes modelos geométricos y con

determinadas propiedades, son versátiles, pueden ser rígidos, fluidos o blandos, de

origen natural o sintético y son adecuados para reemplazos temporales por su

composición biodegradable. Las aplicaciones biomédicas de los polímeros se pueden

clasificar atendiendo a la función que desempeña el polímero en cuestión. Una de las

aplicaciones biomédicas más importantes de los polímeros es su utilización como

40


Scaffolds de HA

suturas, liberación de fármacos, apósitos para heridas, matrices de crecimiento celular,

membranas de diálisis, entre otros [16].

2.2.1.3. Cerámicos

Las cerámicas como biomateriales a pesar de que son mecánicamente débiles o frágiles

resultan muy llamativas debido a que son materiales químicamente inertes, lo que

sugiere que no suelen desencadenar respuestas no deseadas en el tejido en el que se

implantan y no son susceptibles a ataque microbiano. Estas son muy estables,

resistentes al desgaste y se comportan como buenos aislantes térmicos y eléctricos.

Todas estas propiedades son ventajosas para el desarrollo de prótesis óseas. Bajo este

calificativo se incluye a la alúmina (óxido de aluminio), la hidroxiapatita (fosfatos

cálcicos) y los denominados biovidrios (composición basada en SiO2 - CaO - Na2O - P2O5

y algunos que contienen MgO y K2O) [11, 19, 24]. Sus principales características se

mencionarán con más detalle en siguientes apartados.

2.2.1.4. Compuestos

Es la combinación artificial de dos o más fases de materiales que difieren en forma o

composición y consigue una conjunción de las propiedades de cada una de estas por

separado. Cada constituyente mantiene su identidad física o química. Los composites

tienen un amplio espectro de aplicaciones, las amalgamas dentales se encuentran

dentro de este grupo, las matrices de colágeno- hidroxiapatita [11,16].

En la actualidad, el uso de los biomateriales está generalizado existiendo una clara

complementariedad entre las opciones que ofrece cada grupo de materiales

mencionados anteriormente. Estos biomateriales tienen su aplicación en casi todos los

sistemas del organismo humano.

2.2.2. Clasificación de biomateriales según la respuesta del tejido

La evaluación de un material para ser usado en implantes o prótesis pasa

necesariamente por el análisis del tipo de reacción que induce en la interfaz

biomaterial-tejido, la cual a su vez, determina el mecanismo de adhesión al tejido. Es

ampliamente aceptado que ningún material probado hasta ahora en un tejido vivo

puede considerarse totalmente inerte ya que se ha demostrado que todos generan una

respuesta en dicho tejido, afectando invariablemente el proceso normal de curación.

41


Scaffolds de HA

Generalmente se acepta la existencia de cuatro clases de respuesta tisular y cuatro

formas de adhesión del biomaterial al tejido [25].

La Tabla 2 resume de manera precisa las clases de respuesta del tejido al material

implantado.

Tabla 2. Tipos de respuestas del tejido al implante [25].

MATERIAL RESPUESTA

Material tóxico Genera tejido circundante y provoca una reacción

adversa con el receptor

Material inerte No tóxico y biológicamente inactivo. Se forma un tejido

fibroso de espesor variable alrededor del implante

Material bioactivo No tóxico y biológicamente activo. Se forma un enlace

interfacial entre el implante y el tejido huésped

Material biodegradable No tóxico y se degrada. El tejido circundante reemplaza

el material que se disuelve.

Los materiales que se utilizan actualmente para reemplazos óseos y articulares en

general son de naturaleza metálica, esto es debido a sus propiedades y alta resistencia

mecánica, sin embargo tienen varios inconvenientes por ejemplo en el caso de los

aceros inoxidables estos no tienen la capacidad de establecer interacciones con el tejido

óseo para promover su regeneración, debido a su respuesta inerte no propician una

integración con el organismo lo que puede afectar directamente al tejido circundante

por alteración directa del entorno químico, ya sea por cambios electroquímicos que

afectan el comportamiento o la conducta celular, liberación de iones metálicos que

pueden afectar el metabolismo celular, inducción de una reacción de inflamación

crónica por liberación de los productos de corrosión, etc. Otro problema de este tipo de

materiales resulta de las elevadas propiedades mecánicas comparadas con el tejido

óseo las cuales generan problemas de aflojamiento por apantallamiento de tensiones

[16, 26].

El objeto de este trabajo es presentar una vista general del potencial de un material

biocerámico como es la hidroxiapatita la cual ha sido altamente estudiada y la cual será

recubierta con un polímero natural llamado quitosano con el fin de modificar su

superficie para otorgar una respuesta más favorable cuando estén en contacto con el

tejido y reforzar las propiedades mecánicas, se exponen a continuación las

características de los biomateriales cerámicos en especial la HA haciendo énfasis en una

de sus características primordiales, la bioactividad. Por otro lado se muestra también la

42


Scaffolds de HA

información de los polímeros naturales más utilizados en ingeniería de tejidos para

regeneración tisular, centrándose en el quitosano.

2.2.3. Biocerámicos usados en Ingeniería de tejidos

Las cerámicas utilizadas en la reparación y reconstrucción de partes de cuerpo dañadas

o enfermas se denominan biocerámicas [18, 24]. La norma ISO/TR 10993-9 (1994)

define una biocerámica como un material cerámico diseñado para lograr un

comportamiento fisiológico específico al ser usado en la construcción de prótesis u

órganos artificiales internos [11]. Tradicionalmente la cerámica ha estado limitada en

cuanto a sus aplicaciones, por su fragilidad, su baja resistencia mecánica a la tracción

y/o flexión y a su baja resistencia al impacto; sin embargo, a partir de finales de los años

sesenta, se han desarrollado nuevas cerámicas con propiedades mejoradas y su uso se

ha extendido considerablemente [26].

Los trabajos de investigación y desarrollo de biomateriales para sustitución ósea a nivel

mundial actualmente están centrados en el desarrollo de andamios bioactivos,

osteoconductores y sustancias osteoinductoras capaces de estimular las células

osteoprogenitoras en el sitio de la lesión, característica de los biocomposites cerámico -

proteína. Los materiales sintetizados de mayor interés incluyen hidroxiapatita

particulada y en forma de andamios (scaffolds), biocerámicos y biocomposites,

hidroxiapatita con óxidos biocompatibles (ZrO2, TiO2) y biocerámicos con polímeros

como colágeno y/o factores de crecimiento [27,28].

2.2.3.1. Vidrios bioactivos y vitrocerámicas

Los materiales bioactivos (vidrios y vitrocerámicas), se unen directamente al hueso a

través de una capa de HA biológicamente activa, la cual proporciona la unión interfacial

con el tejido. Dicha fase es química y estructuralmente equivalente a la fase mineral

constituyente del hueso y la responsable de la unión interfacial. Los vidrios bioactivos

forman parte de un grupo especial de cerámicos bioactivos que son capaces de

promover una respuesta biológica específica en la interface del material, lo que resulta

en la formación de una unión entre los tejidos y el material. L. Hench define el

concepto de bioactividad, de forma simple, como la característica de un material

implantado que le permite formar una unión con el tejido vivo [11].

La posibilidad de enlazar químicamente el hueso con vidrios de cierta composición fue

demostrada por primera vez por Hench y col. en 1969. El primer vidrio bioactivo

desarrollado por estos investigadores fue el denominado Bioglass® 45S5, el cual

43


Scaffolds de HA

presenta una gran bioactividad, pudiendo incluso unirse a los tejidos blandos. Es

también la composición de biovidrio más estudiada. Su composición en porcentaje de

peso es 45% SiO2, 24.4% CaO, 24.5% Na2O y 6% P2O5. A partir de este descubrimiento

de Hench de que algunos vidrios pertenecientes al sistema SiO2-CaO-Na2O-P2O5 no

inducen la formación de tejido fibroso al ponerlos en contacto con el tejido circundante,

sino que interactúan con él formando una unión química, se despertó un gran interés

en el desarrollo y utilización de los vidrios y vitrocerámicas bioactivos como materiales

biomédicos [29].

Entre otras propiedades importantes de los vidrios bioactivos se encuentran su falta de

elasticidad, resistencia a la corrosión, son inertes a los tejidos, buena adherencia a los

tejidos, alta resistencia a la compresión y al desgaste. Aunque las cerámicas y los vidrios

no sufren corrosión, presentan alguna forma de degradación cuando son expuestos al

medio biológico [25]. La limitación fundamental en la aplicación de los vidrios bioactivos

deriva de sus relativamente bajas propiedades mecánicas, sobre todo en zonas donde

se involucren esfuerzos mecánicos. Para intentar obviar estas limitaciones se ha

recurrido a diferentes métodos para proporcionar resistencia a dichas estructuras

vítreas y de esta manera permitir su utilización en implantes [11].

2.2.3.2. Hidroxiapatita (HA)

La hidroxiapatita (HA) es un fosfato de calcio cuya fórmula química (Ca10 (PO4)6(OH)2 es

similar a la del mineral óseo, se utiliza comúnmente como una biocerámica debido a sus

propiedades biológicas de biocompatibilidad, bioactividad y osteoconductividad, es el

candidato ideal para ingeniería tisular debido a que es muy utilizada en aplicaciones

como cirugía oral y cráneo-facial, odontología, cirugía ortopédica, traumatología y como

relleno óseo en cirugías tumorales. Está ampliamente estudiada en clínica y además

existen más de 50 preparados comerciales disponibles en el mercado, esto la hace más

fácil de obtener. Las cerámicas de este tipo influyen positivamente en la diferenciación

y proliferación celular, pero la fragilidad inherente y baja resistencia a la tracción de las

estos materiales limitan sus aplicaciones médicas. Sin embargo la HA es muy utilizada como

reemplazo de partes pequeñas de hueso, relleno de cavidades en odontología y recubrimiento

de superficies metálicas para implantes, entre otras aplicaciones. Existen diversos métodos de

obtención de este material ya sea por precipitación acuosa, síntesis hidrotérmica, procesado en

sólido, hidrólisis, sol-gel entre otras. Los procedimientos o condiciones bajo las cuales se

sintetiza pueden influir en sus características físicas y químicas, por esta razón sus propiedades

pueden variar ampliamente, los rangos promedio se observan en la Tabla 3. Estos datos

resultan importantes ya que al compararlos con las propiedades mecánicas de la mayoría de las

prótesis metálicas o poliméricas, estas pueden ajustarse a condiciones más similares a las del

tejido óseo [30, 31].

44


Scaffolds de HA

Tabla 3. Propiedades de la Hidroxiapatita [31].

PROPIEDADES CARACTERÍSTICA

Densidad Teórica 3,156 g/ml

Dureza 5 Mohs

Esfuerzo de Tensión 40 - 100 MPa

Esfuerzo de Flexión 20 – 80 MPa

Esfuerzo de Compresión 100 – 900 MPa

Tenacidad a la fractura ≈ 1 MPa m0.5

Módulo de Young 70 – 120 GPa

Debido a que la aplicación clínica de este material está muy limitada por su baja

resistencia mecánica, se ha investigado la producción de compuestos de hidroxiapatita

con otros materiales, para su uso potencial en aplicaciones como biomateriales. Estas

investigaciones han dado como resultado material con mejores propiedades mecánicas

sin deteriorar sus propiedades bioactivas [31].

2.2.4. Polímeros usados en Medicina Regenerativa

2.2.4.1. Generalidades de los polímeros

Los polímeros son compuestos formados por unidades más pequeñas (monómeros)

habitualmente repetidas, unidas por enlaces covalentes, estos compuestos forman con

frecuencia grandes macromoléculas (biopolímeros, plásticos). Estos pueden ser,

termoplásticos, termoestables o elastómeros, según su comportamiento térmico. Los

primeros son polímeros compuestos por cadenas poliméricas unidas entre sí por

fuerzas débiles de Van der Waals y fuerzas dipolo‐dipolo, al aumentar la temperatura,

rompen sus fuerzas de atracción y se vuelven fluidos pudiendo ser fácilmente

moldeables. Se pueden disolver con cierta facilidad, para formar films y otras

estructuras. Además, presentan cierta facilidad a la degradación gracias a la hidrólisis o

por la acción de proteínas y polisacáridos [32,33]. Por otro lado se encuentran los

polímeros termoestables, los cuales, presentan unas cadenas poliméricas unidas entre

sí por enlaces covalentes (reticulación) lo que le confiere unas características diferentes

en función del grado de estos enlaces. Estos no se pueden fundir y no se pueden

disolver sin romper su estructura interna. Y por último están los elastómeros que suelen

ser normalmente polímeros termoestables de bajo grado de reticulación, pero pueden

ser también termoplásticos, tienen normalmente una estructura amorfa [33].

45


Scaffolds de HA

Algunos polímeros también se pueden caracterizar por su biodegradabilidad. El término

biodegradación hace referencia a la transformación y deterioro que se produce en el

polímero debido a la acción de enzimas y/o microorganismos como bacterias, hongos y

algas. La biodegradación puede ser parcial o total. La primera consiste en la alteración

en la estructura química del material y la pérdida de propiedades específicas. Por

contra, en la total el material es degradado totalmente por la acción de

microorganismos con la producción de CO2 (bajo condiciones aeróbicas) y metano (bajo

condiciones anaeróbicas), agua, sales minerales, biomasa o temperatura [32,34].

En el área de la Ingeniería de Tejidos un material biodegradable se caracteriza por que

puede ser absorbido por el cuerpo humano una vez implantado en éste. Esta es una

característica que actualmente los hace útiles en diversos productos destinados a

aplicaciones médicas que están en contacto con sistemas biológicos como son las

suturas, encapsulamiento de fármacos, plasmas, matrices de crecimiento celular entre

otros [32].

Los materiales poliméricos en general tienen una amplia variedad de aplicaciones en el

campo de la implantología médica ya que presentan propiedades físicas, químicas y

mecánicas más cercanas a las de los tejidos vivos, que en su mayor parte están

formados por polímeros naturales, como las proteínas y los polisacáridos. Además, son

de fácil procesado y pueden obtenerse en diversas formas Actualmente existen

numerosos polímeros utilizados en el campo biomédico entre los cuales se pueden

encontrar los artificiales y los naturales. Los primeros se obtienen por procesos de

polimerización controlados por el hombre a partir de materias primas de bajo peso

molecular y los segundos provienen directamente de la naturaleza en esta categoría se

encuentran también los biológicos (proteínas, ácidos nucleicos entre otros) [35].

2.2.4.2. Polímeros artificiales

El uso de polímeros artificiales en el área de los biomateriales está muy extendido y

entre sus aplicaciones más comunes se encuentran las prótesis articulares (polietileno),

suturas quirúrgicas (polipropileno y poliamida), injertos vasculares (poliésteres), la

fabricación de matrices y los sistemas de liberación de medicamentos; para estos los

polímeros degradables desarrollados más utilizados son los poli-α-hidroxi ésteres,

especialmente el ácido poliláctico (PLA) y el ácido poliglicólico (PGA), la policaprolactona

(PCL) y el poli vinil alcohol (PVA). Estos scaffolds poliméricos sintéticos poseen las

ventajas de la fiabilidad del origen de los polímeros y de la reproducibilidad de su

síntesis mediante IT [32, 34, 36].

46


Scaffolds de HA

2.2.4.3. Polímeros naturales

El desarrollo de andamios (scaffolds) que permitan la adhesión celular y el crecimiento

de tejidos ha ganado especial importancia en los últimos años. Los biopolímeros

orgánicos, especialmente el colágeno y el quitosano han sido los más usados como

componentes principales para tales andamios. Estos materiales tienen algunas

limitaciones desde el punto de vista de sus propiedades mecánicas por lo cual hay una

mayor tendencia a la utilización de materiales compuestos o reforzados, sin embargo

con respecto a la biocompatibilidad los polímeros naturales ofrecen el mayor potencial

[35].

2.2.4.3.1. Colágeno

El colágeno es la proteína fibrosa principal del cuerpo y un constituyente importante de

la matriz extracelular natural (ECM), es también el componente orgánico principal del

hueso, cartílago y tendones, además es conocido como promotor de la interacción de

las células específicas, tales como señales de reconocimiento celular, adhesión y

migración celular, diferenciación y expresión de genes, etc. Se describen varios tipos de

colágeno que varían en sus estructuras de orden superior y funciones, y se numeran

con cifras romanas según el orden de su descubrimiento (del tipo I al tipo XIX) [37, 38].

Esta macromolécula estructural de la ECM en su conformación incluye uno o varios

dominios con una forma característica de triple hélice. A lo largo de las fibrillas de

colágeno hay puntos específicos que sirven como sitios de nucleación para los cristales

minerales del hueso. Las fibrillas de colágeno guían la precipitación y el crecimiento de

cristales de nano-apatita para formar una arquitectura nano-estructurada que consiste

en nano cristales de HA orientados uniaxialmente. Su estructura molecular,

microestructura y macroestructura únicas le dan al hueso la propiedad de resistir la

carga dinámica. Por lo anterior los andamios hechos a partir de colágeno se han

utilizado en una variedad de aplicaciones debido a un sin número de propiedades, tales

como la baja antigenicidad, es hemostático y sus propiedades mecánicas [37, 38, 39].

2.2.4.3.2. Quitosano

El quitosano es un polímero natural el cual posee una estructura cristalina altamente

organizada y está compuesto por 2–amino–2–desoxi–D–glucosa (glucosamina) y 2–

acetamida–2–desoxi–D–glucosa (N acetilglucosamina) unidas por enlaces glicosídicos β-

1-4 (figura 8), se obtiene por desacetilación termo alcalina de la quitina, la cual es el

segundo polisacárido más abundante en la naturaleza, después de la celulosa. Se

47


Scaffolds de HA

encuentra disponible en la naturaleza en los caparazones de moluscos, algunos hongos

y algas. Cuando el quitosano se disuelve en un medio ácido diluido, los grupos amino se

protonan y las cargas positivas resultantes confieren un comportamiento poli-

electrolito similar a las macromoléculas. Posee propiedades físico-químicas únicas que

incluyen la biocompatibilidad, la actividad antimicrobiana, biodegradabilidad y una

excelente capacidad para formar películas o films, lo que ha atraído el interés científico

e industrial en muchos campos como la biotecnología, la farmacéutica, la biomedicina,

el tratamiento de aguas residuales, la cosmética y la ciencia de los alimentos, entre

otros [19, 27, 40].

Figura 8. Estructura química de la quitosano [31].

También es importante destacar que el quitosano es un candidato adecuado para la

aplicación como recubrimiento de protección contra la corrosión de sustratos

metálicos, y desprendimiento (pérdida de material) de los cerámicos frágiles debido a

sus propiedades específicas, tales como son la buena capacidad de formación de

películas, la buena asociación a las superficies metálicas o cerámicas y la versatilidad

asociada con la facilidad de funcionalización química [40].

2.2.5. Características y desarrollo de scaffolds para IT

La ingeniería de tejidos se basa en el uso, de forma conjunta o separada, de tres

elementos críticos: (1) cultivo de células, (2) niveles adecuados de moléculas

biofuncionales solubles e insolubles que son compuestos químicos que tienen un efecto

o causan una reacción en el tejido vivo y actúan enviando señales químicas (factores de

crecimiento por ejemplo), (3) estructuras tridimensionales o andamios (Scaffolds) para

soporte de las células en crecimiento y formación de tejidos. Este último actúa como

una matriz extracelular que permite la fijación de células temporalmente y la

adaptación al medio ambiente. Para lograr el objetivo final de la formación de tejido, el

andamio debe poseer varias características muy importantes, que incluyen la

biocompatibilidad, la formación de subproductos de degradación no tóxicos, estructura

de la porosidad accesible (poros interconectados) y la degradación del andamio en un

tiempo apropiado que permita la invasión de células y la reestructuración del tejido.

48


Scaffolds de HA

Para la infiltración de células en los andamios, el diámetro de poro debe ser lo

suficientemente grande para la invasión celular y la migración dentro del andamio,

mientras que la porosidad y la interconectividad de los poros debe ser lo

suficientemente grande para la distribución celular adecuada pero lo suficientemente

pequeña para evitar el desprendimiento de las células por el flujo de fluidos corporales

[23]. Por esto es importante un diseño apropiado y la evaluación de su estructura tras la

fabricación con el fin de obtener las características requeridas y adecuadas para su uso

como scaffold.

2.2.5.1. Tamaño de poro e interconectividad

Los scaffolds usados para IT como se mencionó anteriormente deben tener una

estructura porosa interconectada y una alta porosidad que permita la difusión de

nutrientes a las células dentro de su arreglo y la correcta invasión o migración celular.

Esta estructura debe tener una interconectividad suficiente para eliminar los productos

de desecho fuera del andamiaje, al igual que los productos derivados de la degradación

del material y así eliminarlos del cuerpo sin interferencia con otros órganos o tejidos

generando productos de alta toxicidad. El tamaño de poro es importante debido a que

las células en primer lugar interaccionan vía ligandos (grupos químicos) en la superficie

del material, para ello, los biomateriales sintéticos derivados de materiales

extracelulares naturales, poseen ligandos como Arg-Gly-Asp (RGD), mientras que a los

andamios fabricados sintéticamente se les deben incorporar sintéticamente ligandos

para que se puedan acoplar las proteínas [23, 33].

Es importante resaltar que cuando se implanta un nuevo material existe una respuesta

de vascularización con respecto a la invasión, esto da lugar a todos los mecanismos

necesarios que hacen frente a este cuerpo extraño, este mecanismo de integración es

lento y suele llevar 3 semanas o más para scaffolds sintéticos pequeños, por esta razón

la distancia a donde llegan estas vascularizaciones es importante a tener en cuenta

cuando se diseña el scaffold ya que se debe permitir que todos los nutrientes y factores

necesarios lleguen a todos los puntos del material con el fin de facilitar el proceso de

distribución de los vasos en el tejido [33].

2.2.5.2. Tridimensionalidad

Los tejidos in vivo se construyen en estructuras tridimensionales, por lo tanto el cultivo

de células en 3D se asemejará en gran medida a los escenarios in vivo. Se ha

demostrado que el cultivo en dos dimensiones (2D) o en tres dimensiones afecta al

49


Scaffolds de HA

fenotipo celular. Estas diferencias pueden ser el resultado de la interacción entre las

integrinas y los receptores, los eventos producidos por las señales y la diferente

composición de las proteínas de la matriz extracelular (ECM). Bajo el sistemas de cultivo

2D, la superficie cubierta con las proteínas de la ECM confieren rigidez a las células, esta

es una de las mayores diferencias entre el 2D y el 3D. Esta diferencia de la rigidez de la

matriz causa un nivel diferente y una distribución da la adhesión y resulta en una

respuesta y una regulación en las señales producida en tumores [33].

2.2.5.3. Topografía superficial

La modificación de la topografía superficial y la rigidez del material es otro punto que

mejora la interacción entre el implante y el tejido. Un aspecto fundamental en un

biomaterial es el mimetismo con el ambiente celular o lo que es lo mismo la interacción

célula‐superficie. La respuesta biológica al biomaterial se controla mediante la química y

la estructura de la superficie, algunos materiales pueden ser depositados en la

superficie de un biomaterial para para mejorar su bioactividad, vascularización y/o

biocompatibilidad. En esta interacción célula‐superficie existen dos parámetros

importantes que caracterizan la superficie, estos son la hidrofilicidad y la carga [23, 33].

2.2.5.3.1. Hidrofilicidad

La hidrofilicidad es un aspecto que afecta en gran medida el comportamiento de las

células en un biomaterial. La mayoría de las células se adhieren exclusivamente a

superficies que tengan receptores apropiados a su efecto. En el caso de no tener estos

receptores, como es el caso de la mayoría de los biomateriales sintéticos, estas células

no se adhieren. Sin embargo, la absorción de proteínas en biomateriales da como

resultado la adhesión celular sobre la superficie con una hidrofilicidad de 20° a 40° de

ángulo de contacto en agua [33].

2.2.5.3.2. Carga

Además de la hidrofilicidad superficial, otro punto importante para la adhesión celular

es la carga positiva de la superficie. Los polímeros que poseen cargas positivas en la

superficie a pH fisiológico aproximadamente 7.4, aumentan la adhesión de las células y

el crecimiento en presencia de proteínas. Las células prefieren superficies hidrofílicas y

cargadas positivamente que las superficies neutras o negativas. Algunos ejemplos

demuestran que los condrocitos por ejemplo aumentan su adhesión en superficies de

PLLA o PGLA recubiertas con polilisina (proteína cargada positivamente). Por

50


Scaffolds de HA

consiguiente, un andamio cargado positivamente puede inducir de mejor forma la

formación de un tejido [33].

2.2.5.4. Scaffolds de materiales compuestos para IT

Actualmente hay una mayor tendencia a desarrollar scaffolds para ingeniería de tejidos

con materiales compuestos tanto cerámicos como poliméricos, esto se basa tanto en

las excelentes propiedades osteoinductivas y osteoconductivas de los biocerámicos

como en la degradabilidad y estabilidad mecánica de los polímeros, por lo que resulta

importante hacer referencia a trabajos no sólo de scaffolds de HA, sino además sobre

HA con diversos compuestos obtenidos por diversas técnicas [41]. La adhesión de

células a los scaffolds es a menudo una necesidad, ya que así el andamio posea macro

poros completamente interconectados, existe una mortalidad celular muy alta y la

supervivencia se restringe a aquellas células que se encuentran en la superficie [30].

Con la incorporación de componentes bioactivos a los scaffolds se confiere al

compuesto la propiedad de osteoinducción y el asocio de polímeros biodegradables

aumenta la afinidad de los materiales por las proteínas [42].

Las diferentes características encontradas en scaffolds compuestos de tipo

(cerámico/polímero) han sido variadas, por ejemplo en el año 1999 Shikinami encontró

que la HA y el ácido poliláctico mejoraban las propiedades mecánicas y las acercaba a

las del hueso cortical además aumentaba la reabsorbibilidad, bioactividad y

osteoconductividad de éste [43], se resalta la facilidad de procesarlos por técnicas

específicas de conformación por presión en caliente como las empleadas por Ignjatovic

y Uskokovic quienes al variar la presión del proceso obtuvieron diferentes grados de

porosidad en estos materiales [44].

También han sido evaluados por otros investigadores como Seok y colaboradores en

2004 cementos óseos bioactivos integrados de hidroxiapatita natural de hueso en

polvo, asociados con polímeros degradables como son el quitosano y estables como el

polimetil-metacrilato (PMMA) para su uso en cirugías ortopédicas, como la

vertebroplastia o como relleno óseo [45]. En 2005 Gallardo y colaboradores reportaron

la obtención de scaffolds tridimensionales de compuestos de fosfatos de calcio y

quitosano para su utilización en ingeniería de tejido óseo, demostrando que estos

sistemas exhibían una rápida diferenciación y crecimiento de osteoblastos y mostraban

efectos osteogénicos [46].

Existen además reportes mostrados por Degirmenbas en 2006 sobre biocompuestos de

nanohidroxiapatita con colágeno y alcohol polivinilo (PVA), en los cuales se realizan

51


Scaffolds de HA

mezclas de estos materiales para comparar características como la elasticidad y el

tamaño de los poros, según este investigador, el colágeno y el alcohol polivinilo tienen

un gran potencial para utilizarse en aplicaciones de ingeniería de tejidos como en la

reparación y reconstrucción de huesos [47]. Lee y colaboradores obtuvieron por su

parte un soporte formulado asociando de varios polímeros como quitosana, GAG,

colágeno y lo cargaron además con un factor de crecimiento TGF-β1 para promover la

regeneración articular mediante la liberación controlada de éste. Los autores

demostraron que la adición de quitosano al soporte mejoró las propiedades mecánicas

y la estabilidad del enrejado formado por las macromoléculas de colágeno, e inhibieron

la acción de las colagenasas, mejorando la regeneración del tejido [39].

Cabe resaltar que a nivel mundial los lugares donde más se han realizado estudios y

avances sobre biocompuestos cerámico/polímero y recubrimientos poliméricos son

México, China, Rusia, Europa, Estados Unidos y Cuba. La mayoría de estos países

realizan este tipo de investigaciones para evitar la importación de materiales o del

producto final en sí [41].

Por otra parte a nivel nacional, en el año 2013 se realizó un proyecto en el grupo de

Biomateriales del programa de Bioingeniería de la Universidad de Antioquia relacionado

con la producción de scaffolds cerámicos por González Jazmín en el cual se evaluaron

las propiedades de scaffolds de hidroxiapatita, obtenidos por gel-casting e infiltración

en espumas poliméricas, en este se optimizó la técnica de obtención de scaffolds

cerámicos haciendo un amplio estudio sobre la reología de las suspensiones y se llegó a

obtener unas buenas propiedades mecánicas para estos comparando con lo reportado

en la literatura [48].

En la última década, se ha reportado la fabricación de matrices porosas mediante

diferentes técnicas, entre las que se destacan: gas foaming, solvent casting/particulate

leaching, rapid prototyping, H2O2 foaming, liofilización, etc, que permiten el

procesamiento de materiales metálicos, cerámicos (hidroxiapatita, fosfato tricálcico) y

poliméricos, de origen natural (colágeno, ácido hialurónico, fibrinógeno, quitosano) o

sintético (policarbonatos, polímeros de ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA),

entre otros [49].

De acuerdo con lo anterior, el reto de la ingeniería de tejidos óseos es diseñar matrices

tridimensionales capaces de imitar las propiedades naturales del hueso, que

proporcionan una ayuda temporal para la regeneración del tejido, y balancear la

degradación y la pérdida de las propiedades mecánicas con el crecimiento y la

formación del hueso. Si se optimizan estos aspectos, se puede esperar que las

alternativas sintéticas simulen de manera precisa las propiedades del hueso natural. El

52


Scaffolds de HA

uso de matrices o scaffolds con los cuales se puedan controlar las funciones de las

células osteoblásticas se encuentra todavía en sus primeras etapas de investigación en

el país; se espera que la expansión de este campo permita desarrollar nuevas terapias y

tecnologías para la reparación y regeneración del tejido óseo.

2.2.6. Obtención de recubrimientos sobre biomateriales

Cuando la superficie no es adecuada para el crecimiento celular y para la integración, la

modificación superficial cobra mayor sentido, ya que el fin es determinar como la célula

va a interactuar con el material que actúa como soporte. Como se ha mencionado la

topografía es una de las señales físicas más importantes para las células, esta influye en

la adhesión, la proliferación y la diferenciación celular y más recientemente se ha

mostrado que también guía el comportamiento celular en gran medida; en algunas

aplicaciones guiar la orientación de la célula es esencial para lograr un tejido funcional.

Las señales químicas en forma de diversas biomoléculas, tales como proteínas

adhesivas o factores de crecimiento también influyen en el comportamiento celular, por

ejemplo, la fibronectina y la laminina son capaces de mejorar la adhesión de diferentes

tipos de células, por lo tanto se han hecho esfuerzos considerables para modificar

superficies de biomateriales químicamente por inmovilización de estas biomoléculas

[33, 50, 51].

Por otra parte, también pueden ser depositados o se pueden añadir en bajas

concentraciones diferentes elementos o compuestos en los materiales base con el fin

de que reaccionen de forma espontánea, ya sea reforzando o mejorando una

propiedad, por ejemplo, los recubrimientos de apatita nanocristalina producida por

métodos sol-gel o electrodeposición por pulso se han utilizado comúnmente para

mejorar la osteointegración de dispositivos ortopédicos, también la deposición de

polielectrólitos con cargas positivas como el quitosano pueden ser útil para sistemas de

liberación de fármacos [52] y funcionalización superficial de las superficies de los

biomateriales [53].

Debido a que la topografía parece tener un papel tan esencial en guiar el

comportamiento de las células in vivo, actualmente se está utilizando como una

herramienta para el control de la regeneración de tejidos. Una amplia variedad de

técnicas se han usado para producir características específicas en superficies de

biomateriales, algunos métodos dan lugar a una topografía ordenada con un patrón

controlado regularmente, mientras que otros conducen a la topografía desordenada

con orientación aleatoria; en la tabla 4 se describen algunas técnicas comunes para

obtener patrones organizados aleatoriamente como desmezcla de polímero, ataque

químico y litografía coloidal [21].

53


Scaffolds de HA

Tabla 4. Métodos para modificación superficial de biomateriales [21].

LITOGRAFÍA SUAVE

Litografía suave es el término general para diferentes

técnicas basada en el uso de un sello elastomérico

(hecho comúnmente de poli-dimetilsiloxano (PDMS))

para estructurar una superficie de un material. Este

sello se produce mediante el uso de un patrón

específico y se utiliza para reproducir el modelo en un

sustrato.

* Moldeo por microtransferencia: Ver Figura 9(a) para

más detalles.

* Impresión por microcontacto: Ver Figura 9(b) para

más detalles. Esto se utiliza para transferir moléculas

desde el sello a un sustrato en una forma geométrica

controlada.

* Micromoldeo en capilares: Un sello PDMS se coloca

en el sustrato que se modela para formar una red de

canales vacíos entre el sustrato y el sello. Se coloca

una gota de polímero en un extremo de los canales y

después los canales están ocupados por capilaridad. El

sello de PDMS se retira después del curado.

* Moldeo por replica: El patrón de PDMS se utiliza

como un molde para la infiltración de otro polímero,

que después de restablecido, dará una réplica

negativa del PDMS.

Figura 9. (a) Moldeo por microtransferencia (b) Impresión

por microcontacto.

* Micromoldeo asistido por disolvente: Un disolvente

se usa para humedecer el sello PDMS, que se coloca

contra el sustrato. El sustrato se disuelve por el

disolvente y el líquido resultante es moldeado con el

patrón de PDMS. Después de la evaporación del

disolvente y la solidificación del sustrato, se obtiene

una estructura complementaria al PDMS.

LITOGRAFÍA COLOIDAL DESMEZCLA DE POLÍMERO

Este utiliza una solución nanocoloidal para actuar

como una máscara de ataque. La solución se dispersa

como una monocapa sobre un sustrato y se

autoensambla electrostáticamente. En los alrededores

las partículas nanocoloidales (también de las propias

partículas) se graban con un bombardeo de haz de

iones reactivos creando así un patrón sobre el

sustrato, permite recubrimientos de áreas extensas

con reducido número de defectos.

Este se basa en la separación de fase espontánea sea

por calentamiento, centrifugación, entre otras de una

mezcla de polímeros en el marco del proceso de

ruptura o fundición sobre un sustrato (silicio, vidrio,

etc.). La forma (poros, cintas, etc) y el tamaño de las

características se pueden modular por cualquier

cambio en la relación o la concentración del polímero.

El control preciso de la altura (dirección vertical)

puede ser alcanzado hasta un tamaño > 13nm.

ESTAMPADO EN CALIENTE LITOGRAFÍA E-BEAM O HAZ IÓNICO (EUV)

El material se calienta hasta un punto intermedio

entre la temperatura de transición vítrea (Tg) y la

temperatura de fusión (Tf) y después la herramienta

se presiona contra el material uniaxialmente para

producir un patrón.

Este utiliza la exposición a partículas para producir un

patrón que puede ser revelado químicamente en un

segundo paso, o se puede utilizar directamente para

iniciar el injerto de polímeros, mediante el rastreo de

un haz energético de electrones.

54


Scaffolds de HA

Por otra parte en la Figura 9 se muestran otras formas de modificación superficial, éstas

pueden emplearse dependiendo de los fines deseados. En general, la modificación

superficial se divide en dos categorías (1) la modificación de los átomos, compuestos o

moléculas existentes en la superficie mediante alteración química o física y (2) un

recubrimiento de la superficie existente con un material de composición diferente. En

función del material, pueden obtenerse unas características u otras dependiendo del

tipo de tratamiento empleado [33].

Figura 9. Esquema en el que se representan los principales tipos de recubrimientos superficiales sobre materiales [33].

55


Scaffolds de HA

2.2.7. Cultivos celulares in vitro en la Ingeniería de tejidos

Los ensayos de citotoxicidad in vitro se incluyen en los estudios de la primera fase de

evaluación de los biomateriales e implantes. La evaluación citotóxica constituye una vía

simple, rápida y económica para obtener una valiosa información acerca de la

biocompatibilidad de los biomateriales y de la interacción substrato/célula. Estos

estudios pueden ser realizados directamente sobre un material o sobre una extracción

de éste, utilizándose métodos in vivo y por sistemas de cultivo celular. Los cultivos

celulares son sistemas ideales para el estudio y observación de un determinado tipo de

células bajo condiciones específicas, dado que estos sistemas no presentan con la

complejidad que un sistema in vivo conlleva, debido al gran número de variables que

interaccionan [54,55].

Las células se encuentran normalmente en un microambiente complejo. Este está

formado por matriz extracelular, citokinas, factores de crecimiento, así como células

adyacentes. Cuando una célula se une a un substrato y forma adherencias, se generan

fuerzas desde el citoesqueleto hasta estas uniones adhesivas. Se cree que las células

crean unas adherencias más resistentes en relación directa a la rigidez del sustrato [56].

Con el ambiente apropiado, la mayoría de estas células sean vegetales o animales

pueden vivir, multiplicarse e incluso expresar propiedades diferenciadas en una placa

de cultivo. Este método permite que se puedan observar mediante microscopía o ser

analizadas bioquímicamente, así como comprobar los efectos de añadir o retirar

diferentes moléculas específicas como factores de crecimiento, entre otras

posibilidades [32].

El cultivo de tejidos comenzó en el año 1907, mediante la experimentación en

neurobiología y la denominada hipótesis neuronal, que estableció que cada fibra

nerviosa es la prolongación de una única célula nerviosa y no el producto de la fusión de

muchas. La mayoría de las células para cultivo celular, requieren de un substrato sólido

sobre el que crecer y dividirse. En la actualidad los cultivos celulares suelen llevarse a

cabo sobre placas a las que se adhieren las células, migran y proliferan [32].

Los cultivos preparados directamente de tejido sin división celular se denominan

cultivos primarios. En muchos casos las células de un cultivo primario pueden hacerse

proliferar hacia un gran número de cultivos secundarios, de esta forma se pueden

cultivar de manera repetida durante días, semanas o meses. Estas células expresan

muchas veces propiedades adecuadas a su origen celular, como la producción de matriz

extracelular específica, entre otras [32].

56


Scaffolds de HA

Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, entre las que se pueden

citar las siguientes:

Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden

controlar todos los factores del medio: físico-químicos (pH, temperatura,

presión osmótica, niveles de O2, CO2, tensión superficial, etc) y fisiológicos

(hormonas, factores de crecimiento, densidad celular, etc). Esto es cierto sólo

para algunas líneas celulares para las que se han determinado los denominados

medios definidos (aquel en el que se conocen todos y cada uno de s

componentes que lo forman y la concentración exacta en que se encuentran)

[57,58].

Caracterización y homogeneidad de la muestra. Las células en cultivo de una

línea celular (cultivo primario propagado) o de una línea continua son

homogéneas, con morfología y composición uniformes. Se pueden obtener con

facilidad un número elevado de réplicas idénticas, con lo que se supera el grave

problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de

animales de experimentación [23,58].

Economía. Suponen un bajo costo en el uso de reactivos, drogas o materiales a

estudiar pues al realizarse en volúmenes reducidos y con un acceso directo de

las células al sustrato las cantidades requeridas son mucho más bajas que en un

animal completo. Es diferente el coste de investigación de un nuevo material en

cantidades del orden del gramo (para el estudio en animales) que con pocos

miligramos [57,58].

Motivaciones éticas. La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de

muchos miles de animales de experimentación. El cultivo celular no puede

reemplazar siempre al ensayo in vivo pero es una alternativa válida en muchas

situaciones. Incluso un cultivo celular primario permite realizar experimentos

que suponen el sacrificio de uno o pocos animales, pero con ellos se pueden

ensayar un número de condiciones experimentales que pueden suponer si el

estudio se hace con animales de experimentación el sacrificio de decenas o

cientos [57,58].

Un cultivo celular exitoso depende en gran medida del mantenimiento de las células,

estas deben estar libres de contaminación por microorganismos tales como

micoplasma, bacterias, hongos y virus, por lo tanto es importante la esterilización de

materiales, medios de cultivo y reactivos, ya que son fuentes de contaminación

biológica por microorganismos las superficies de trabajo e incubadoras sucias, las

57


Scaffolds de HA

partículas en el aire y las deficientes técnicas de asepsia. El cultivo celular estéril

depende de una serie de procedimientos para reducir la probabilidad de contaminación

por estas fuentes [58, 59].

El medio de cultivo también es esencial para conseguir un ambiente adecuado para el

desarrollo y mantenimiento celular, este además de poseer los factores de crecimiento

necesarios para un tipo específico de células, debe contener los factores nutricionales

adecuados, tener un pH, temperatura y osmolaridad correctos y paralelamente es

necesario que aporten los gases esenciales como oxígeno y dióxido de carbono [32].

En el proceso del establecimiento del cultivo celular se seleccionan las células que

crecerán según numerosos criterios. Así solo formarán el cultivo aquellas células que

sean por una parte capaces de superar el proceso de disgregación, y por otra, capaces

de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión [58]. A

continuación se amplía más sobre este tema.

2.2.7.1. Clasificación y tipos de cultivos celulares

El cultivo celular permite el mantenimiento, la supervivencia y/o multiplicación in vitro

de células provenientes de órganos específicos o de linajes celulares tratando de

conservar al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Una de estas

propiedades es la capacidad de adherencia a superficies, lo que permite que las células

crezcan ya sea en monocapa o en suspensión (figura 10) [60]. El crecimiento en

monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esa forma inician la

proliferación. Muchas líneas celulares son anclo dependientes, es decir no inician la

proliferación hasta que se han adherido al sustrato, este es el modo normal de

proliferación de la mayor parte de las células, con excepción de las células

hematopoyéticas maduras. Por otro lado el crecimiento en suspensión es propio de

aquellas células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato,

independientes de anclaje, y es propio de las células hematopoyéticas, algunas líneas

celulares transformadas y de células procedentes de tumores. Es de destacar que en

todo tejido existe una fracción o tipo celular que es capaz de crecer en suspensión. A

pesar de que su origen no está claro se cree que se trata de células cepa (stem cells)

indiferenciadas [58].

Esta propiedad de adherencia está en general asociada con el tipo de célula de la cual

derivan y depende del tipo de proteínas presentes en su superficie. Se sabe que muchos

cultivos celulares se encuentran anclados a una superficie celular debido a que

58


Scaffolds de HA

sintetizan proteínas relacionadas con la matriz extracelular la cual está encargada de

mantener unidas a las células y posee un papel regulador sobre las mismas in vivo.

Algunas de las macromoléculas involucradas son la colágena, la fibronectina, la laminina

y el proteoglucano, las cuales establecen interacciones con las proteínas de la

membrana citoplásmica de la célula, denominadas integrinas, CAMs y cadherinas. Estas

proteínas además de mantener unidas a las células también participan en la transmisión

de señales del exterior hacia el interior de las células. En cultivos en monocapa, la

interacción de este conjunto de proteínas se da por medio de las adhesiones focales

[60].

Figura 10. Tipo de crecimiento de un cultivo celular (monocapa, en suspensión o tridimensionales con esquema de las morfologías de las células en cultivo [60].

Hay varios métodos para iniciar un cultivo (figura 11), los tipos más comunes que se

pueden encontrar son:

Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o

mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa

adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite

su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo

de las generaciones. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad

celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en

59


Scaffolds de HA

el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento

[58,61].

Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos extraídos de un

organismo que se coloca in vitro en un medio artificial o se adhiere a una

superficie en la que proliferan las células de la periferia del explante. Esto

constituye un cultivo primario [58,61].

Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o

mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa

adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite

su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo

de las generaciones. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad

celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea al predominar en

el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento [58,

61].

Figura 11. Tipos de cultivo de tejidos, adaptada y modificada de Handbook [58 y 60].

60


Scaffolds de HA

En la actualidad los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la

posibilidad de propagación, así como por las ventajas en la cuantificación,

caracterización y reproducibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de

interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con

importantes éxitos. La medicina regenerativa, que pretende conseguir la regeneración,

total o parcial, de los tejidos que han perdido masa celular, utiliza técnicas de trasplante

celular para implantar células troncales o células madre. Con respecto al tejido óseo

recientemente se han publicado varios estudios sobre el cultivo de células madre

humanas y su diferenciación sobre scaffolds celulares como ya se ha descrito. Las

células madre mesenquimales humanas son una fuente interesante de células ya que

pueden extraerse de la médula ósea, expandirse y diferenciarse a osteoblastos in vitro.

El número de células madre aisladas de médula ósea es muy pequeño, por lo que se

necesita realizar una condensación de la fase con mayor riqueza de éstas para la

siembra de scaffolds, el proceso requiere un paso de diferenciación intermedio por lo

que se necesitan de 3 a 4 semanas en cultivo para demostrar la formación de hueso en

una matriz de HA cálcica [32].

2.2.7.2. Líneas celulares

Cuando las células se mantienen en cultivo, por regla general conservan su carácter

original. Cada tipo celular parece tener una memoria de su desarrollo y estar fija en su

forma especializada, aunque pueden suceder algunos cambios o transformaciones

limitadas. Las células madre en cultivo en cambio pueden continuar dividiéndose y se

diferencian en uno o más tipos celulares, cada célula madre en particular sirve para la

regeneración de un tejido concreto. Existen diferencias muy importantes entre una

línea celular continua, una línea primaria o un cultivo primario (figura 12) [32,58].

Cultivo primario y subcultivo: Es un cultivo establecido a partir de un tejido u

órgano (células aisladas por digestión tisular). Las células mantienen la viabilidad

un periodo de tiempo limitado y no se reproducen en cultivo. En general en

cultivo presentan una reducción en el número total de células vivas a lo largo del

tiempo, se caracterizan por estar constituidos por diferentes tipos de células

(por lo que a veces pueden recibir el nombre de cocultivos) cuya morfología es

predominantemente la de las células del órgano del que fueron aisladas, sus

cromosomas tienen un número diploide, su crecimiento in vitro es limitado y

presentan inhibición por contacto generada por vías de señalización intra e

intercelulares. Estas células son consideradas como cultivo primario hasta que

se subcultiven con éxito (es decir, sean transferidas, con o sin dilución, de un

recipiente de cultivo a otro). Ejemplos: hepatocitos obtenidos de hígado adulto,

neuronas, etc. [58, 60].

61


Scaffolds de HA

Línea primaria. Es un cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se

mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproducción de las células

en el cultivo (cultivos secundarios). Las células pueden crecer a una velocidad

constante en diversos subcultivos sucesivos, recibiendo cada uno de ellos el

nombre relacionado con el pase. Ejemplos: fibroblastos dérmicos,

queratinocitos, células endoteliales de aorta bovina (BAEC), células endoteliales

de cordón umbilical (HUVEC), etc [58].

Línea celular establecida (continua). Células que se diferencian genética y

morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de

tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario por medio de

una pérdida de regulación debido al subcultivo continuo o mediante

transfección con oncogenes, o el tratamiento con agentes carcinogénicos. Las

líneas celulares continuas son aquellas que han demostrado posibilidades de ser

subcultivadas in vitro por lo menos 70 pases indefinidamente y que presentan

características genotípicas diferentes al tejido del cual fueron originadas. Las

líneas celulares continuas pueden ser transfectadas con genes específicos para

la producción de proteínas de interés, se les conoce como líneas celulares

transformadas genéticamente. En general, algunas de estas líneas se

caracterizan por no tener inhibición por contacto y crecer de manera indefinida

e independiente del número de pases o subcultivos [60].

Figura 12. Diferentes cultivos celulares de acuerdo a su origen, modificación genética y

fenotípica [60].

62


Scaffolds de HA

2.3. CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE LOS BIOMATERIALES PARA IT

La caracterización de materiales se refiere al establecimiento de las características de

un material determinado a partir del estudio de sus propiedades físicas, químicas,

estructurales, entre otras. Existen para ello distintas técnicas de caracterización, de

acuerdo al interés o uso que se vaya a dar a dicho material. Una vez conocidas las

características del material puede establecerse la naturaleza del mismo, así como sus

posibles aplicaciones. Las diferentes técnicas disponibles (cromatografía, difracción de

rayos X, espectroscopía infrarroja, microscopía electrónica de barrido, microscopía de

sonda de barrido, análisis térmico diferencial, etc.), plantean requerimientos específicos

en cuanto a cantidad de muestra, geometrías de probetas particulares o procesos de

acondicionamiento previos de los materiales a ensayar. Algunas de las técnicas son de

naturaleza “destructiva” y otras “no destructiva”, las cuales proporcionan información

cualitativa y cuantitativa, absoluta o complementaria, brindando resultados de mayor o

menor resolución o sensibilidad [11].

La superficie de cualquier material muestra las características específicas diferentes de

sus zonas internas, existen una serie de fenómenos de tipo mecánico (fricción y

desgaste) o químico (corrosión, degradación) que afectan exclusivamente la superficie

de los cuerpos. Es por esto que cada vez se utilizan más las técnicas de modificación

superficial con el objetivo de mejorar estos comportamientos, es necesario por ende

conocer con mayor precisión las técnicas disponibles para caracterizar estas superficies

y cuantificar de este modo su comportamiento durante el tiempo de vida útil [62].

2.3.1. Propiedades físico-químicas, superficiales y mecánicas de biomateriales

para Ingeniería de Tejidos

La identificación de los constituyentes de un material propuesto para ser utilizado en

medicina regenerativa o ingeniería de tejidos permite evaluar su riesgo y los datos

obtenidos pueden ser utilizados en la estimación total de la seguridad biológica de

éstos, cualquiera de los elementos de un material o aditivos utilizados en el proceso de

fabricación o síntesis pueden ser potencialmente biodisponible o tóxico. Las

características exigidas por el cuerpo humano hacen que las propiedades requeridas en

los materiales utilizados en prótesis o materiales de regeneración sean muy restrictivas.

La información obtenida a partir de la caracterización físico- química de los

biomateriales facilita su identificación y la selección de las pruebas de toxicidad

biológica que se requieren para demostrar su seguridad [63].

Entre las características físico-químicas más significativas de los materiales utilizados en

medicina regenerativa se incluyen aspectos como la forma y estado del material (sólido,

63


Scaffolds de HA

líquido o gas, etc), la adsorción superficial de los componentes químicos de la sangre, la

absorción de fluidos, los cambios de estado físico al estar contacto acto con fluidos

biológicos, las propiedades adhesivas y electroquímicas, los efectos de los procesos de

esterilización, entre otras [63].

Las técnicas físico-químicas que se utilizan para una completa caracterización de los

materiales pueden clasificarse en: microscópicas, espectroscópicas, de difracción y

análisis térmico. Estas proporcionan información valiosa para evaluar o predecir las

diversas propiedades de los materiales como son su composición, estructura, topología,

topografía, morfología, etc. Entre ellas se pueden encontrar la difracción de rayos X, la

espectroscopia infrarroja y fotoelectrónica, la microscopía óptica y electrónica, entre

otras [64].

Por otro lado la morfología y la topografía de las superficies son propiedades en los

biomateriales que también han tomado un especial significado en los últimos años. Por

ejemplo se ha determinado la importancia que hay en la caracterización de las

superficies para determinar la seguridad biológica o biocompatibilidad de los materiales

minimizando las reacciones del organismo frente a un cuerpo extraño. Se ha

demostrado también la relación que hay entre la integración de los tejidos con algunas

superficies que tienen una configuración, forma o rugosidad determinadas y facilitan

con esto la adhesión celular (osteointegración por ejemplo) y a su vez tratan de evitar la

adhesión microbiana [53,65].

Otro aspecto que se debe considerar son las propiedades mecánicas, la caracterización

de este tipo incluye aspectos como la dureza, la tenacidad, la elasticidad, la plasticidad,

características de desgaste dinámico, la estabilidad mecánica con el tiempo, entre otras.

El cambio de cualquiera de estas propiedades puede provocar la inestabilidad de

algunos implantes o prótesis disminuyendo así su funcionalidad y vida útil de servicio. El

incremento de la resistencia mecánica de los materiales implica un incremento en los

costos de obtención, la mejor opción consiste en la modificación superficial para

mejorar dichas propiedades [62, 63, 66].

2.3.2. Evaluación de la biocompatibilidad de Scaffolds usados para IT

En la actualidad un biomaterial debe cumplir una serie de requisitos para ser

considerado en aplicaciones de regeneración, entre estos se encuentra el ser

biocompatible, es decir, debe ser aceptado por el organismo y no provocar que éste

desarrolle sistemas de rechazo ante su presencia [33]. Los estudios de

biocompatibilidad evalúan el potencial tóxico de un elemento, éstos pueden ser

64


Scaffolds de HA

realizados directamente sobre un material o sobre una extracción de éste, utilizándose

sistemas de cultivo celular o métodos in vivo. Los estudios in vitro son el primer paso

que se suele utilizar para la comprensión de la interacción substrato/célula y la no

toxicidad de los materiales. Los cultivos celulares son sistemas ideales para el estudio y

observación de un determinado tipo de células bajo condiciones específicas, dado que

estos sistemas no presentan la complejidad que un sistema in vivo conlleva debido al

gran número de variables que interaccionan allí [35].

Con respecto a ensayos in vitro de cerámicas bioactivas para ingeniería de tejidos Zhang

ha publicado diversos trabajos en los que obtuvo andamiajes porosos de biopolímeros

reforzados con HAp en polvo y de compuestos de fosfatos de calcio/quitosano,

incorporando biovidrio para el cultivo de células osteoblásticas humanas (MG63). En

todos los materiales compuestos hubo una proliferación o diferenciación solamente de

células osteoblásticas (proliferación fenotípica). El empleo de soportes de quitosano con

biovidrios de fosfatos de calcio evita la rápida degradación en un medio fisiológico, lo

que trae consigo la liberación de subproductos ácidos que pudieran afectar la

diferenciación de las células osteoblásticas [67].

Por su parte Zhao y colaboradores prepararon un enrejado 3D de

HAp/quitosana/gelatina (compuesto con estructura similar al hueso humano) mediante

precipitación in situ, para inducir una adhesión, crecimiento y diferenciación

osteogénica favorable de un cultivo de células mesenquimales humanas, empleando

estas matrices en ingeniería de tejido óseo [68].

Diversos estudios a nivel mundial han demostrado que los biocompuestos son

prometedores respecto a los materiales convencionales y técnicas utilizadas en la

actualidad en la ingeniería clínica y de tejidos. En cuanto a lo que se ha realizado en

Latinoamérica para la fabricación de espumas de HA por diferentes técnicas, se

encontró que Gallegos y colaboradores, analizaron el desempeño estructural de

espumas de HA fabricadas por el método de polímero soluble en agua y comparando

los resultados experimentales con modelos numéricos y teóricos concluyeron que los

modelos propuestos pueden ser usados para predecir con exactitud, el desempeño

mecánico-estructural de las espumas de HA para diferentes valores de porosidad [69].

Para Colombia se reporta un trabajo de Duran y colaboradores en 2012 titulado

Adhesión de osteoblastos sobre andamios de PLA-PLG-hidroxiapatita-quitosano por

electroactivación, el objetivo era explicar el aumento de la adhesión de células como

resultado del cambio en la hidrofilia de una matriz de regeneración celular, variando el

intercambio iónico intracelular, inducida por la aplicación de la adición de elementos

bioactivos a los polímeros [70].

65


Scaffolds de HA

Por otra parte, recientemente en el año 2014 fue reportado por Plazas un estudio

acerca de la presencia en la superficie de un material polimérico (policaprolactona) de

partículas de apatita o vidrios bioactivos obtenidas por técnicas de recubrimiento, para

inducir y acelerar el crecimiento de tejido óseo cuando este material se implanta para la

regeneración o reparación ósea, en el cual se concluyó que para obtener un material

con un buen balance entre las propiedades mecánicas y biológicas buscadas se debe

complementar el estudio con cultivos de células y ensayos in vivo, en condiciones

adecuadas para la evaluación de materiales tridimensionales [71].

A nivel mundial sólo por mencionar una investigación Dutta y otros han realizado

estudios in vivo en dos tipos de espumas de HA, la primera obtenida a partir de una

matriz polimérica diseñada por prototipado rápido con poros macroscópicos y otro

usando una matriz de estructura porosa convencional; evaluando la ventaja de la

arquitectura controlada proporcionada por la técnica. Concluyeron que la espuma con

poros macroscópicos presentó mayor neoformación ósea, en comparación con el otro

tipo de espuma. Como hallazgo importante encontraron cantidades significativas de

nuevo hueso en los poros con un tamaño menor a 100 µm [72].

Esta información es importante si se tiene en cuenta que la idea principal de realizar

este tipo de investigaciones en Colombia es proponer nuevos materiales que puedan

ser fabricados con mejores propiedades a menores costos, evitando la importación de

este tipo de productos, para ofrecer un material más económico en el mercado y fácil

de obtener con las materias primas del país, aunque la técnica y los materiales han sido

ampliamente estudiados. El estado actual en cuanto al desarrollo de scaffolds de HA y

compuestos HA/polímeros para ingeniería de tejidos en el Colombia, muestra en

general que se han hecho estudios de los materiales, la optimización de los protocolos

de obtención, caracterizaciones físicas, químicas y mecánicas, en general, sin embargo

con respecto a su comportamiento biológico in vitro e in vivo si se adelantan estudios al

respecto la información es muy limitada.

La mayoría de investigaciones encontradas se basan en materiales compuestos pero

donde la matriz principal es el polímero y se refuerza para mejorar la osteointegración

con cerámico tipo fosfatos de calcio o biovidrio, en menores proporciones. También se

encuentran algunas investigaciones en las cuales estos compuestos se utilizan como

recubrimientos de materiales metálicos para prótesis, como la mezcla de polímeros e

hidroxiapatita, adelantada por investigadores para obtener implantes o prótesis más

biocompatibles y livianas, sin embargo la utilización de polímeros naturales utilizados

como recubrimientos sobre materiales cerámicos no es muy común, ni está muy

referenciada hasta el momento.

66


Scaffolds de HA


CAPÍTULO 2

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74


Scaffolds de HA

CAPÍTULO 3.

OBJETIVOS Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

3.1. OBJETIVOS

3.1.1. Objetivo General

Evaluar las propiedades de scaffolds de hidroxiapatita producidos por gel-casting

e hidroxiapatita con recubrimiento de quitosano producidos por gel-

casting/inmersión.

3.1.2. Objetivos Específicos

Obtener scaffolds de HA producidos por gel-casting e hidroxiapatita con

recubrimientos de quitosano producidos por gel-casting e inmersión.

Evaluar las propiedades físico-químicas y mecánicas de los scaffolds obtenidos

por medio de diversas técnicas de caracterización.

Determinar el comportamiento biológico in vitro de los scaffolds de

hidroxiapatita mediante ensayos de citotoxicidad, adhesión y proliferación

celular.

Comparar las propiedades de los scaffolds obtenidas por las diversas técnicas

con el fin de determinar la más adecuada para uso como matrices de

regeneración ósea.

3.2. MATERIALES Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

3.2.1. Materiales

Para el desarrollo de los scaffolds se utilizó como material sólido hidroxiapatita

comercial marca Strem Chemicals, el dispersante fue ácido metacrílico marca Aldrich

75


Scaffolds de HA

Chemical Co, el monómero utilizado fue acrilamida marca Merck, el iniciador Persulfato

de amonio marca Aldrich Chemical Co, el catalizador TEMED marca Merck, como

surfactantes se usaron el tergitol marca α químicos Ltda y el dodecil sulfato de sodio

marca J.T Baker.

Para la obtención de los recubrimientos sobre los scaffolds de HA se utilizó quitosano

comercial marca Sigma-Aldrich con porcentaje de desacetilación >75% y ácido acético

glacial marca Panreac como disolvente de éste. Todas las soluciones acuosas se

prepararon con agua desionizada a pH neutro.

3.2.2. Diseño de experimentos y tratamiento estadístico de los datos

3.2.2.1. Identificación de elementos del experimento

Unidad experimental: Scaffolds de Hidroxiapatita (HA) con recubrimientos de

quitosano obtenidos por inmersión fueron las unidades experimentales del

trabajo de investigación sobre las que se realizaron las diferentes medidas y se

obtuvieron las variables respuesta.

Variables de control o factores: En esta investigación se tienen dos factores los

cuales son (1) la concentración de quitosano en cuatro niveles (0.5, 1, 1.5 y 2%)

y (2) el tiempo de recubrimiento en dos niveles (5 y 20 minutos).

Variables de entrada (constantes): Las constantes del experimento fueron (1) la

composición de los scaffolds de HA ya que la cantidad y tipo del entrecruzante,

dispersante, iniciador y catalizador se mantendrá iguales en la síntesis de los

scaffolds por medio de la técnica gel-casting, (2) el pH (neutro) debido a la

aplicación para la cual serán aplicados los scaffolds ya que cualquier cambio

puede afectar el comportamiento y la biocompatibilidad del material, (3) la

temperatura de sinterización para la consolidación de la estructura de los

scaffolds se hace a temperaturas muy altas para obtener mejor resistencia en

este caso se llevaron hasta 1200°C, (4) el tamaño de los scaffolds con el fin de

evaluar las propiedades a las mismas condiciones se obtienen scaffolds en un

molde asegurando tamaño y peso similares.

Factores molestia: Entre estos se encuentran (1) la temperatura ambiente y la

humedad, ya que esto sólo puede ser controlado en los procesos de secado y

sinterización, sin embargo en la síntesis, preparación de los scaffolds y

76


Scaffolds de HA

obtención de los recubrimientos no, esto puede influenciar en los reactivos y las

reacciones, por ende en las variables respuesta, (2) la contaminación ambiental

ya que los scaffolds serán para aplicación biomédica, por ende se debe evaluar

su biocompatibilidad con diversas pruebas in vitro, sin embargo, en el proceso

de síntesis de scaffolds y obtención de recubrimientos es difícil controlar la

contaminación ambiental ya que el lugar en el cual se obtienen las muestras no

está aislado, ni desinfectado y los materiales y equipos no tienen las condiciones

de asepsia favorables.

Aleatorización: Para mejorar los factores molestia mencionados se realizó una

aleatorización del experimento; realizando mediciones sin seguir un orden

específico. Todos los experimentos se realizaron por triplicado, pero el orden de

los experimentos fue aleatorio en diferentes días y épocas del año para así evitar

sesgamiento. La aleatorización se hizo con ayuda de la función sample en R para

las corridas.

Variables respuesta: En el experimento se evaluaron diversas variables como

respuesta (1) la degradabilidad o pérdida de peso la cual es importante para

determinar el efecto del recubrimiento polimérico sobre la estabilidad (no

desintegración del material) y las propiedades mecánicas, (2) el tamaño de poro

y (3) la interconectividad, (4) la resistencia a la compresión y (5) el módulo de

elasticidad , debido a que el comportamiento mecánico del hueso es

anisotrópico y viscoelástico ya que sus propiedades mecánicas son sensibles

tanto a la velocidad de deformación como al tiempo de aplicación de la carga,

(6) la citotoxicidad, que mide la supervivencia y proliferación celular, se

determina mediante el método MTT, los valores de viabilidad celular ideales

para los biomateriales son del 75 % al 100%, esto es un indicador de que el

material no presentan toxicidad para los tipos de líneas celulares que sean

estudiadas.

Interacciones: se dan entre dos factores cuando los niveles de uno de ellos

varían con respecto a los niveles del otro. Por lo tanto al tratarse de un diseño

factorial los tratamientos se forman combinando los niveles de los factores en

estudio en este caso entre la concentración del polímero y el tiempo de

recubrimiento.

A continuación se muestra en la figura 13 un esquema resumido de la unidad

experimental sus variables de entrada, factores, ruido y las variables respuesta.

77


Scaffolds de HA

Figura 13. Esquema de procesos (unidad experimental y variables del diseño

experimental).

3.2.2.2. Descripción del pre muestreo

La prueba piloto se realizó solo para evaluar y seleccionar la técnica más adecuada para realizar los recubrimientos de quitosano sobre los scaffolds de HA, estas técnicas seleccionadas fueron (1) inmersión y (2) aspersión del polímero, las cuales se realizaron con el fin de garantizar un recubrimiento homogéneo y significativo sobre la muestra. Se realizó este pre muestreo debido a la restricción del presupuesto por los altos costos de los reactivos, material de síntesis y caracterización, además del tiempo que se requiere para obtener cada muestra. Esta evaluación se hizo para las propiedades mecánicas (resistencia a la compresión y módulo de elasticidad) y obtención de la porosidad (interconectividad y tamaño de poro).

3.2.2.3. Planteamiento experimental

Una vez determinada la técnica de recubrimiento se estudió la influencia de los

parámetros mediante el uso de un diseño de experimentos factorial mezclado. Se

variaron dos factores experimentales, el factor “Concentración Qo” (cuatro niveles) y el

factor “Tiempo de recubrimiento” (dos niveles) generándose una matriz experimental

de ocho formulaciones a estudiar (véase la tabla 5), como variables respuesta se

escogieron la degradabilidad (Y1), interconectividad (Y2), porosidad (Y3), resistencia a la

78


Scaffolds de HA

compresión (Y4) y módulo elástico (Y5). Debido a las múltiples respuestas que se

obtienen, el análisis estadístico es multivariado. Para este estudio fueron realizadas tres

réplicas de cada formulación. Todas las respuestas de las formulaciones se compararon

con scaffolds de HA sin recubrimiento.

Tabla 5. Parámetros de las formulaciones generadas en el diseño de experimentos.

Formulación Factores Respuestas

Concentración Qo (%)

Tiempo (min)

Y1 Y2 Y3 Y4 Y5

M1 0.5 5 Y11 Y21 Y31 Y41 Y51

M2 0.5 20 Y12 Y22 Y32 Y42 Y52

M3 1 5 Y13 Y23 Y33 Y43 Y53

M4 1 20 Y14 Y24 Y34 Y44 Y54

M5 1.5 5 Y15 Y25 Y35 Y45 Y55

M6 1.5 20 Y16 Y26 Y36 Y46 Y56

M7 2 5 Y17 Y27 Y37 Y47 Y57

M8 2 20 Y18 Y28 Y38 Y48 Y58

M9 0 0 Y19 Y29 Y39 Y49 Y59

La descripción de los datos se presenta por medio de análisis exploratorios con gráficos como histogramas, diagramas box-plot y gráficos de medias para cada nivel. Se realizó un chequeo de normalidad de los datos, pruebas de independencia y varianza constante, todo a través de pruebas gráficas y estadísticas. La comparación de los datos se efectuó por medio de test de hipótesis o contrastes de

hipótesis, con lo que se pudo determinar si las medias de los valores fueron diferentes o

iguales.

Se estudiaron con un diseño simple, en el que intervienen sólo dos factores. Para el

factor A (concentración de quitosano) hay 4 niveles (a) y para el factor B (tiempo de

inmersión) hay dos niveles (b), cada réplica del experimento contiene todas las posibles

combinaciones de tratamientos, es decir contiene los ab tratamientos posibles.

Para el análisis estadístico de la matriz generada en el diseño del experimento propuesto, el Análisis de Varianza se realizó mediante la tabla de ANOVA, utilizando el programa estadístico Statgraphics Centurion versión 16.1.11, el cual es una herramienta de análisis de datos que combina una amplia gama de procedimientos analíticos con gráficos interactivos para proporcionar un entorno integrado de análisis, este software incluye funciones estadísticas avanzadas, capaces de proporcionar

79


Scaffolds de HA

rigurosos análisis, con ayuda de los datos entregados por este programa se evaluaron los efectos principales y las interacciones entre los factores de entrada planteados en el proyecto, con respecto a los factores de salida, para los experimentos realizados con cada parámetro de recubrimiento de Qo sobre los scaffolds de HA.

3.2.2.4. Preferencias de Diseño

El modelo estadístico para las variables de este diseño será:

𝑦𝑖𝑗= 𝜇 + 𝜏𝑖 + βj + (𝜏β)ij + 𝜀𝑖𝑗, 𝑖=1,2,…….,𝑎 𝑦 𝑗=1,2,…….,𝑛.

Donde 𝑦𝑖𝑗 es la variable respuesta de los scaffolds que representa la observación

correspondiente al nivel (i) del factor concentración de polímero y al nivel (j) del factor

tiempo de inmersión.

𝜇 es la media global de las variables respuestas

𝜏𝑖 es el efecto asociado al 𝑖- ésimo % concentración de polímero.

Βj es el efecto asociado al j- ésimo tiempo de inmersión.

(𝜏β)ij es el efecto producido por la interacción entre la concentración del polímero y el

tiempo de inmersión.

𝜀𝑖𝑗 es el componente del error aleatorio con distribución normal, media cero y varianza

constante σ2~N(0, σ2).

El diseño seleccionado consiste en un experimento con dos factores, y los datos

adquiridos tanto para la degradabilidad, porosidad e interconectividad, resistencia

mecánica y módulo elástico, como para la citotoxicidad han sido tratados y analizados

por medio de medidas de tendencia central, como interpretación de la media, la

mediana, los valores máximos y mínimos. Para determinar si los datos tienen o no una

distribución normal se plantearán las siguientes pruebas de hipótesis:

Ho: los datos siguen una distribución normal.

Ha: los datos no siguen una distribución normal.

Todos los análisis se realizaron por triplicado y se expresaron como la media ± desviación estándar (S.D). Se utilizó la prueba de Tukey utilizando el software estadístico para probar la significancia de la media (P <0,05).

Posteriormente se hizo un análisis de varianza ANOVA con sus respectivas hipótesis.

80


Scaffolds de HA

3.2.3. Fabricación de scaffolds de HA

La obtención de los scaffolds o cuerpos porosos se realizó siguiendo el método de gel-

casting descrito por J. González [1]. Utilizando un porcentaje de sólidos del 50% de HA,

y realizando una modificación en el tiempo de agitación reportado. El procedimiento se

hizo en una cámara de vacío con atmósfera de nitrógeno (N2) para evitar reacción con

el oxígeno (O2) lo cual inhibe la polimerización de los monómeros.

Para este proceso inicialmente se mezclaron durante 3 minutos con un agitador

magnético (BOECO, Germany) el agua destilada y el monómero (acrilamida). Luego se

adicionó esta solución en un recipiente polimérico que contenía el polvo de HA y el

iniciador (persulfato de amonio), esto se mezcló durante 10 minutos con la ayuda de un

agitador mecánico (IKA Labortechnik-RW 20n) para romper los aglomerados de las

partículas del polvo (es importante resaltar que las aspas del agitador se recubren con

algún tipo de cinta para evitar la contaminación de las mezclas). Pasado este tiempo se

adicionó el entrecruzante (bisacrilamida) y el dispersante (ácido metacrílico), para

obtener una adecuada homogenización de los componentes. Se adicionó luego de 3

minutos el catalizador (TEMED) y se siguió homogenizando durante 5 minutos más.

Posteriorimente se agregaron los surfactantes (tergitol y dodecil sulfato de sodio) para

la generación de la espuma. Finalmente se realizó el vaciado en los moldes dejando

dentro de la cámara durante 30 minutos para completar el proceso de polimerización.

La figura 14 muestra el esquema seguido en el proceso.

Figura 14. Esquema del procedimiento planteado para la obtención de scaffolds de HA por la técnica gel-casting.

81


Scaffolds de HA

Una vez obtenidos los moldes se realizó un tratamiento térmico, el cual inició con un

secado a temperatura ambiente durante 24 horas para eliminar el exceso de humedad,

seguido por un secado en estufa a (70°C ± 1°C) por 15 horas, para quitar por completo

la humedad del scaffold y proporcionar resistencia en verde para la manipulación de las

muestras, finalmente los scaffolds se sinterizaron hasta (1200°C± 1°C) subiendo

1°/minuto por 3 horas con incrementos graduales de 300ºC/min, con el fin de

consolidar la estructura porosa y así generar una mayor resistencia mecánica [1].

Algunos scaffolds de HA obtenidos serán usados como patrones con el fin de comparar

sus propiedades con los scaffolds que serán recubiertos con quitosano a diferentes

concentraciones.

3.2.4. Obtención de los recubrimientos de quitosano sobre los scaffolds de HA

3.2.4.1. Preparación de las soluciones de quitosano

El quitosano comercial fue diluido en ácido acético glacial (1% v/v) para preparar

soluciones poliméricas a diferentes concentraciones (0.5%, 1%, 1.5%, 2% p/v), todas las

diluciones se prepararon con agua destilada, una agitación a 700 rpm por 2h en un

agitador magnético (BOECO, Germany) a temperatura ambiente.

3.2.4.2. Obtención de los recubrimientos sobre los scaffolds

La técnica de inmersión también conocida como dip-coating se basa en producir un recubrimiento sobre una superficie determinada mediante la inmersión de la muestra tratando de controlar los siguientes parámetros:

- Velocidad de entrada de la muestra en la solución. - Tiempo de inmersión. - Velocidad de salida de la muestra de la solución.

Debido a que la entrada y salida del material en la solución se realiza de forma manual, es difícil controlar este parámetro, sin embargo se realiza atando el scaffold con hilo delgado a un soporte metálico de altura constante y se deja caer lentamente, igualmente para la extracción se retira lentamente el scaffold de la solución de quitosano. En la siguiente imagen de la figura 15 se puede observar el proceso de Inmersión o Dip-

coating utilizado para recubrir los scaffolds de HA en solución de quitosano a diferentes

concentraciones.

82


Scaffolds de HA

Figura 15. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA.

Scaffolds de HA de radio 3 mm, altura 4 mm y peso (0,7 a 1,0 g) aproximadamente

fueron recubiertos por inmersión en 50 ml de solución de quitosano a diferentes

concentraciones en condiciones ambientales.

Para activar químicamente la superficie de los cuerpos poroso de HA se realizó un

lavado de estos con etanol al 70% v/v y seguidamente con abundante agua destilada,

para eliminar los excesos de grasa, partículas, impurezas y residuos. Luego se dejaron

en el ultrasonido por 5 min a 60Hz y se secaron a 70°C durante 1 hora.

Los scaffolds activados son suspendidos en las soluciones de quitosano y se dejan

inmersos durante dos tiempos diferentes (5 y 20 min), con el fin de evaluar la influencia

del tiempo, una vez se retiran de la solución, éstos fueron irradiados con luz ultravioleta

durante 10 minutos en una cámara de flujo laminar marca ESCO con longitud de onda

de 280 nm, este proceso se realizó para mejorar la adhesión del recubrimiento (esta

adhesión se da por el efecto de la fotoxidación por irradiación con UV) [2]. Una vez

transcurrido este tiempo se secaron a 40°C durante 2 horas en una estufa marca

BINDER. Luego de la inmersión y el secado los scaffolds se lavaron suavemente con

etanol al 70% y agua destilada para eliminar los residuos y excesos de material y fueron

son secados nuevamente.

En la Figura 16 se resume todo el proceso seguido para la obtención de los

recubrimientos de quitosano sobre los scaffolds de hidroxiapatita.

83


Scaffolds de HA

Figura 16. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA.

3.2.5. Caracterización físico-química de scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo

3.2.5.1. Fluorescencia de rayos X (FRX)

Se realizó un análisis de la composición química y se determinó la relación molar Ca/P

por medio de la técnica FRX por perlado, con un espectrómetro de fluorescencia de

rayos X marca Thermo, modelo Optim´x para los scaffolds de HA obtenidos siguiendo el

método de gel-casting, los cuales fueron utilizados como patrones sobre los cuales se

hicieron los recubrimientos de quitosano por el método de inmersión.

3.2.5.2. Difracción de rayos X (DRX)

Las muestras de polvo de los scaffolds recubiertos se obtienen por molienda usando un

mortero cerámico. El DRX se realizó utilizando un difractómetro de rayos X marca XPert

PANalytical Empyrean Series II con detector Pixel 3D usando radiación CuKα (0,154 nm),

en un rango 2θ de 5 a 60°, se hicieron a una velocidad de barrido de 4°/min y tamaño

de paso de 0,04°, este ensayo se realizó con el fin de verificar la obtención de los

recubrimientos de Qo sobre los scaffolds de HA, para determinar las fases del

compuesto orgánico e inorgánico y la cristalinidad de las muestras.

84


Scaffolds de HA

3.2.5.3. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)

Los scaffolds en polvo se mezclaron con bromuro de potasio (KBr) grado

espectroscópico en una relación muestra:KBr de 1:100 p/p, para realizar una pastilla

con lo cual se lleva a cabo el análisis a temperatura de 24°C. Los espectros de

transmisión de las muestras se realizaron usando un espectrofotómetro Shimadzu IR

AFFINITY-1 en un rango de número de onda (ν) desde 400 hasta 4000 cm-1 con

resolución de 4 cm-1 con un número de barridos de 16. Este análisis muestra las bandas

características y la presencia de los grupos funcionales principales del quitosano y la HA,

también del carbonato asociado a la apatita y la posible interacción entre los

componentes.

3.2.6. Caracterización morfológica y superficial de los scaffolds de HA con y sin

recubrimiento de Qo

3.2.6.1. Estereomicroscopía

Las muestras secas se observaron a 8X y 16X en un estereomicroscopio marca Zeiss DV4

combinado con cámara digital incorporada (figura 17), con el fin de obtener

información estructural y superficial de los recubrimientos, homogeneidad, morfología

y porosidad de los scaffolds, entre otras características. Se utilizó el estereomicroscopio

ya que permite observar la estructura tridimensional de éstos, aunque su aumento es

menor que el del microscopio óptico.

Figura 17. Estereomicroscopio Zeiss DV4 con cámara digital incorporada.

85


Scaffolds de HA

3.2.6.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM) y Espectroscopia de dispersión de

energía (EDS).

Se empleó microscopía electrónica de barrido (SEM) para caracterizar la morfología,

tamaño de poro, tipo de porosidad e interconectividad de los scaffolds de HA y las

características de los recubrimientos de Qo, por otra parte la espectroscopia de energía

dispersa (EDS) se usó para verificar la distribución homogénea de las fases y observar

cambios químicos al realizar la fabricación de los compuestos. Para esto empleó un

Microscopio electrónico de barrido (SEM) marca Jeol JSM-6490LV con EDS incorporado

marca Oxford Instrument INCA PentaFETx3 para análisis químico ya que permite

conocer los elementos y la proporción con que se encuentran en la muestra (figura 18).

Las muestras fueron recubiertas con una capa de oro y observadas a altas

magnificaciones (50X, 100X, 500X, 1000X, 2000X). El ensayo se realizó en la Sede de

Investigación Universitaria (SIU) de la Universidad de Antioquia.

Figura 18. Microscopio Electrónico de Barrido marca Jeol JSM-6490LV.

3.2.6.3. Análisis de degradabilidad in vitro en SBF

La disolución de los scaffolds de HA recubiertos con diferentes concentraciones de

quitosano fue realizada en una solución fisiológica (SBF: Simulated Body Fluid) cuya

concentración iónica es casi equivalente al plasma del cuerpo humano (tabla 6). Para la

preparación del fluido corporal simulado (SBF) se utilizó el protocolo publicado por T.

Kokubo y colaboradores [3, 4].

86


Scaffolds de HA

En la tabla 7 se muestra el orden, la cantidad, la pureza y el peso molecular de los

reactivos usados para preparar 1000 mL de solución.

Tabla 6. Concentración de iones del SBF y plasma sanguíneo humano [3, 4].

Fluido

Concentración iones (mM)

Na+ K+ Mg2+ Ca2+ Cl- HCO3- HPO4

2- SO42-

Plasma sanguíneo 142,0 5,0 1,5 2,5 103,0 27,0 1,0 0,5

SBF (original) 142,0 5,0 1,5 2,5 148,8 4,2 1,0 0

SBF (nuevo y

mejorado)

142,0 5,0 1,5 2,5 103,0 4,2 1,0 0,5

Nota: El SBF es ajustado a pH neutro 7.25 a 36,5°C con Tris o HCl

Tabla 7. Orden, cantidad y peso fórmula de los reactivos para preparación de SBF.

Orden Reactivo Cantidad (g) Peso fórmula

1 NaCl 8,035 58,44

2 NaHCO3 0,355 84,01

3 KCl 0,225 74,55

4 K2HPO4 . 3H2O 0,231 228,22

5 MgCl2 . 6H2O 0,311 203,30

6 1.0M HCl 39 ml ---

7 CaCl2 0,292 110,98

8 Na2SO4 0,072 142,04

9 Tris 6,118 121,13

10 1.0M HCl 0 - 5ml ---

Las muestras de peso y área aproximados de 1.0 g y 0.4 cm2 respectivamente se

introdujeron en 50 ml de SBF a pH neutro (7.0) y se incubaron a 37°C por 21 días, se

realizaron mediciones del pH cada 1, 7, 14 y 21 días con un pH metro pH2000 Cii.

Pasado este tiempo las muestras fueron removidas de la solución y lavadas con etanol

al 70% v/v y abundante agua destilada, posteriormente se secaron por 24 horas a 40°C

y se pesaron en una balanza de precisión Sartorious, KAIKA LTDA, en la figura 19 se

muestra este proceso. La pérdida de peso (degradación) se expresa como el porcentaje

del peso inicial como sigue en la ecuación 1 [5]:

87


Scaffolds de HA

% 𝑃 = 𝑊𝑖−𝑊𝑓

𝑊𝑖∗ 100% (1)

Donde P es el porcentaje de pérdida de peso (%), Wi es el peso inicial de la muestra seca

(g) y Wf es el peso final de la muestra pasados los 21 días de inmersión e incubación en

SBF (g).

Figura 19. Obtención de degradabilidad in vitro en SBF.

3.2.6.4. Porcentaje de Porosidad e Interconectividad de Scaffolds

El procedimiento para hallar la porosidad e interconectividad presente en cada uno de

los cuerpos porosos se realizó según lo reportado por por Liu et al. [6].

Inicialmente se obtuvo el peso neto de las muestras en seco (Wnet), seguidamente se

saturaron con agua destilada según la norma NTC 4321-3, cuyo procedimiento es

detallado a continuación:

88


Scaffolds de HA

En un beaker con agua se sumergió la muestra asegurando mínimo 5 cm de agua

alrededor de ella, se llevó a ebullición por 2 horas (ver Figura 20), luego se deja enfriar a

temperatura ambiente con la muestra aún dentro del agua, después se extrae del

beaker y se seca superficialmente con una toalla de papel y posteriormente fue pesada

(Wsat).

Figura 20. Montaje para la obtención del porcentaje de porosidad e interconectividad de los scaffolds.

Luego con estos valores y utilizando la ecuación (2) se determina la porosidad másica

(Φm) que se define también como la capacidad de absorción de agua:

𝜑𝑚 =(𝑊𝑠𝑎𝑡−𝑊𝑛𝑒𝑡)

𝑊𝑛𝑒𝑡 * 100 (2)

Mediante la fórmula (3) se determinó la porosidad abierta (Φa) que se refiere al porcentaje de poros comunicados con el exterior:

𝜑𝑎 =𝑊𝑠𝑎𝑡−𝑊𝑛𝑒𝑡

𝜌𝑎𝑉 (3)

Luego se obtuvieron los valores para la porosidad total (Φt) que corresponde a la suma

de los poros abiertos y cerrados existentes en la muestra con respecto al volumen total,

con ayuda de la ecuación (4):

𝜑𝑡 = 1 − 𝜌

𝜌∗ (4)

Para obtener la interconectividad de los poros (𝑃𝑖) que se refiere al porcentaje de poros

comunicados entre sí se utiliza la ecuación (5):

𝑃𝑖 =𝜑𝑎

𝜑𝑡 (5)

89


Scaffolds de HA

Donde V es el volumen del cuerpo poroso, ρ* es la densidad real del material, ρ es la

densidad aparente del scaffold y ρa es la densidad teórica del agua (1 g/cm3), se utiliza la

densidad teórica de la HA como de 3.156 g/cm3 [7].

Además de las mediciones de porosidad de los scaffold con el método de Liu, se

realizaron mediciones a través de análisis de imágenes usando el software acoplado al

SEM el cual permite procesar las imágenes a una escala de colores grises y finalmente

medir el tamaño de los distintos poros obtenidos, sacando un promedio de valores

cuantitativos de estos.

3.2.6.5. Adhesividad de los recubrimientos de Qo

Una de las propiedades superficiales más importantes de controlar en un recubrimiento

es su capacidad de adhesión. Esta adhesión depende fundamentalmente de la

estructura de la superficie, y por consiguiente de su energía libre de superficie. Los

fenómenos que se manifiestan en la interacción son la elevación, depresión capilar y la

mojabilidad, muy importantes cuando se utilizan recubrimientos [8].

Asumiendo que se tiene una superficie sólida de alta energía donde los fenómenos de

adsorción y la presión de difusión son importantes, se debe considerar de manera

explícita el trabajo de adhesión, el cual viene dado por la ecuación (6) [9]:

𝑊𝑎𝑑 = 𝛾𝐿 (1 + 𝑐𝑜𝑠𝜃) (6)

La determinación de Wad que es el trabajo de adherencia del líquido sobre la superficie

sólida se basa en la ecuación de Young-Dupré donde γL corresponde la tensión

superficial del líquido (solución de quitosano) y theta (θ) es el ángulo de contacto

obtenido [9], en este caso, entre la superficie del scaffold de HA con cada solución de

polímero a las diferentes concentraciones.

Se evaluó en esta investigación el trabajo de adhesión de los recubrimientos de

quitosano a diferentes concentraciones en contacto con scaffolds de HA, esto se realizó

mediante la medición de los ángulos de contacto y la tensión superficial, obtenidos por

métodos de capilaridad e inmersión que serán descritos a continuación.

90


Scaffolds de HA

3.2.6.5.1. Análisis de Mojabilidad: Ángulo de contacto de los scaffolds de

HA con recubrimientos de Qo

Para analizar la mojabilidad que tiene una superficie se utilizó el método de ángulo de

contacto. Mediante este método, se obtuvo información sobre el recubrimiento

obtenido y la hidrofobicidad de la superficie.

El ángulo de contacto se midió con una gota de un líquido (solución de quitosano) sobre

un sólido (Scaffolds de HA). De esta manera se contabiliza la energía entre las tres

interfaces presentes: sólido-vapor (𝛾𝑆𝑉), sólido-líquido (𝛾𝑆𝐿) y líquido-vapor (𝛾𝐿𝑉) [8, 9,

10].

El ángulo de contacto (θ) se puede determinar por los métodos de gota, elevación

capilar, entre otros y mediante la ecuación de Young (7) que se muestra a continuación:

𝛾𝑆𝑉 = 𝛾𝑆𝐿 + 𝛾𝐿𝑉 ∗ 𝑐𝑜𝑠𝜃 (7)

En la figura 21 se puede observar cómo se representa este sistema.

Figura 21. Esquema del sistema de ángulo de contacto [10].

En esta investigación se midió la adhesión entre las soluciones de quitosano y el

sustratos sólido (HA), empleando el método de Celda de Washburn o de sorción. La

teoría de Washburn (1921) indica que si un sólido poroso se pone en contacto con un

líquido de modo que el sólido no se sumerja en el líquido, sino que simplemente esté

tocando su superficie, entonces se produce un ascenso del líquido a través de los poros

por capilaridad. El método resultante de esta teoría sirve para determinar

principalmente dos propiedades de materiales sólidos porosos y de materiales

absorbentes tales como: la velocidad de absorción de líquido y el ángulo de contacto

promedio [8, 9, 10].

91


Scaffolds de HA

El equipo utilizado para este ensayo fue un tensiómetro digital Krüss con referencia K-

12. Este equipo permitió medir el ángulo de contacto entre el sustrato sólido y la gota

de la solución líquida (agua destilada como referencia y las soluciones de Qo a

diferentes concentraciones) a temperatura ambiente de 24,2°C. Para la medición

mediante el método Washburn un tubo de vidrio se llenó de la muestra sólida y se puso

en contacto con el líquido de ensayo. La solución líquida fue estirada como resultado de

la acción capilar. El aumento de la masa del tubo, que estaba suspendido de un sensor

de fuerza, se determinó con respecto al tiempo de la medición. El proceso se describe

por la ecuación de Washburn (8):

𝑚2

𝑡 =

𝑐∗𝜌2∗𝜎∗𝑐𝑜𝑠𝜃

η (8)

Donde m = Masa; t = Tiempo flujo; σ = Tensión Superficial del líquido; c = Capilaridad

constante del sólido; ρ = Densidad del líquido; θ = Ángulo de contacto; η = Viscosidad

del líquido [8].

Si el ángulo de contacto fuera mayor que 90° no se podría medir con este método, ya

que no se daría la humectación de la muestra sólida.

El diseño y montaje del tensiómetro digital comprende tres componentes

fundamentales: Mecánico, Óptico y Tratamiento de imagen. La Figura 22, muestra una

imagen del conjunto de los componentes del equipo utilizado.

Figura 22. Imagen de los componentes del tensiómetro digital Krüss K-12.

Para determinar el ángulo de contacto mediante la ecuación 3 se debió obtener,

además, la viscosidad del líquido (soluciones de quitosano a diferentes

concentraciones). Se obtuvo este parámetro a temperatura ambiente (23°C ± 1°C) con

92


Scaffolds de HA

un viscosímetro de Brookfield modelo LVT (basado en el principio de radio infinito)

utilizando un beacker de 500 ml como cilindro exterior. Se realizaron determinaciones a

gradientes de velocidad ascendentes 0 - 30 rpm en 10 minutos y luego descendentes

comprobando que no tuvieran un comportamiento tixotrópico.

3.2.6.5.2. Tensión superficial de los recubrimientos de Qo

Dado que la tensión superficial de un fluido está asociada a la cantidad de energía

necesaria para aumentar su superficie por unidad de área se llevó a cabo este ensayo

en el tensiómetro Krüss con referencia K-12, mediante el método de Placa de Wilhelmy,

la solución de quitosano a diferentes concentraciones (muestra líquida) se colocó en un

recipiente y una placa fina de platino de geometría conocida, la medida de la fuerza se

hace uniendo la placa a una balanza sensible de torsión y un dispositivo de elevación

sea para bajar la placa hacia la superficie del líquido o elevar la superficie del líquido

hacia la placa que se sumergió dentro de ella como se observa en la figura 23.

Figura 23. Tensiómetro de superficie (a) Método de placa de Wilhelmy (b) [11].

En la ecuación presentada en la figura 19 (b) la tensión superficial se denota por (γ), la

medición de la fuerza actuando sobre el plato es (F), el perímetro del plato (L) y el

ángulo de contacto del plato y el líquido es (θ).

3.2.7. Caracterización mecánica de los scaffolds mediante ensayos de compresión

Las propiedades mecánicas de los scaffolds obtenidos con y sin recubrimientos de

quitosano a diferentes concentraciones, se determinaron mediante ensayos uniaxiales

93


Scaffolds de HA

de compresión sobre las muestras cilíndricas bajo la Norma ASTM D882 utilizando una

máquina universal de ensayos marca Diggimes, con una celda de carga con capacidad

para 4900 N, velocidad de carga de 5 mm/min y con un límite de desplazamiento o

deformación hasta el 75% (figura 24). Se utilizaron scaffolds cilíndricos homogéneos en

su superficie, de altura y áreas similares para todos los ensayos y sus réplicas, se obtuvo

mediante este ensayo el módulo de elasticidad y la resistencia a la compresión, con el

fin de compararlas y determinar los valores más adecuados para su uso como soportes

celulares óseos.

Figura 24. Ensayos de compresión para scaffolds en Máquina Universal Diggimes.

3.2.8. Evaluación de la biocompatibilidad mediante ensayos biológicos in vitro

La respuesta celular fue estudiada mediante diversos ensayos in vitro de citotoxicidad,

proliferación y adhesión. El ensayo de citotoxicidad permitió estudiar el efecto tóxico

del material sobre un tipo determinado de células, se hizo con el método MTT por

contacto indirecto. La adhesión y la proliferación son comportamientos celulares

indicadores de la funcionalidad celular. La adhesión celular es el proceso mediante el

cual la célula se ancla a un substrato y condiciona en gran parte eventos posteriores

como la proliferación y la diferenciación. Por lo tanto, los resultados de estos dan una

buena idea sobre el tipo de respuesta que se puede esperar al utilizar este tipo de

biomateriales in vivo.

En la figura 25 se muestra de manera global un diagrama de la metodología seguida

para los diversos ensayos biológicos los cuales serán descritos en detalle en los

numerales a continuación.

94


Scaffolds de HA

Figura 25. Metodología general propuesta para los ensayos biológicos.

3.2.8.1. Línea celular para evaluación biológica (SAOS2)

Para todos los ensayos se emplearon células provenientes de la línea celular SAOS2

(ATCC HTB-85) obtenidas de células de osteosarcoma humano de tipo osteoblástico,

ampliamente en estudios biológicos (Adquiridas del banco de células ATCC: American

Type Cell Collection en Estados Unidos). Las células SAOS2 que crecen de forma

adherente, se cultivaron en medio McCoy (Sigma/Aldrich) suplementado con suero fetal

bovino (SBF Invitrogen) al 10%, se mantuvieron en botellas de cultivo y fueron

incubadas en condiciones estándar (5% CO2 en el aire, temperatura de 37°C y 100% de

humedad relativa), durante una semana. En la figura 26 puede observarse una

fotografía de este tipo de células obtenida al microscopio óptico a un aumento de 40X,

donde se observan claramente las diferencias en su morfología ya que son tipo

adherente estas se anclan al substrato y tienen forma aplanada.

95


Scaffolds de HA

Figura 26. Línea celular SAOS2 (anclo dependientes) al microscopio óptico (X20 y X40).

3.2.8.2. Equipos y material para cultivo biológico celular

Para la realización de los ensayos in vitro fue necesario obtener el cultivo biológico con

la línea celular de interés (SAOS2), para esto es importante contar con los equipos y

materiales adecuados. El cultivo celular se llevó a cabo en una cabina de flujo laminar la

cual se mantuvo en forma limpia y ordenada, desinfectando cada elemento colocado en

la cabina con etanol al 70%. La disposición de elementos dentro de la campana de

cultivo celular se describe a continuación y se muestra en la figura 27, pero se puede

modificar para incluir elementos adicionales en otras aplicaciones específicas.

Figura 27. Esquema del área de trabajo y disposición de materiales en campana de cultivo celular para evaluación biológica in vitro, adaptada y modificada de [12].

96


Scaffolds de HA

Para la realización del cultivo celular en cuarto limpio fueron necesarias las siguientes condiciones, equipos y materiales:

• Un espacio amplio de trabajo (Cabina limpia), con los recipientes de cultivo celular en

el centro.

• Reactivos y medios de cultivo en la parte posterior derecha para permitir el fácil

pipeteado.

• Pipeta en la parte delantera derecha, donde se puede llegar fácilmente.

• Gradilla en el centro con los reactivos adicionales cerca del cultivo celular.

• Recipiente pequeño a la izquierda con solución de hipoclorito para el descarte de los

residuos líquidos y sólidos.

Una vez establecida la línea celular osteoblástica en los recipientes adecuados se ubicó

en una incubadora para proporcionar el entorno adecuado para su crecimiento y

proliferación, controlando la temperatura, la humedad y la concentración de gases. La

limpieza frecuente de esta incubadora es esencial para evitar la contaminación de los

cultivos celulares.

El cultivo celular exitoso depende en gran medida del mantenimiento de las células

libres de contaminación por microorganismos como micoplasma, hongos, bacterias y

virus. Por lo tanto, todos los materiales usados son sometidos a esterilización y

desinfección. El manejo de las técnicas asépticas adecuadas proporciona una barrera

para los microorganismos y reducen el efecto adverso de la contaminación.

Todas las muestras fueron esterilizadas con óxido de etileno para todos los ensayos

descritos a continuación.

3.2.8.3. Ensayo de citotoxicidad

Los estudios de citotoxicidad se hicieron utilizando el método MTT, este ensayo se basa

en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol

(MTT) realizado por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto

coloreado de color azul llamado formazan, permitiendo determinar la funcionabilidad

mitocondrial de las células tratadas. Este método ha sido muy utilizado para medir

supervivencia y proliferación celular. La cantidad de células vivas es proporcional a la

cantidad de formazan producido, esto se presentan en los resultados. La lectura se hizo

mediante densidad óptica (D.O) y los valores de absorbancia se obtuvieron en relación a

la media del blanco [13].

97


Scaffolds de HA

Los ensayos se realizaron en dos experimentos independientes y con dos replicas por

ensayo.

Para este ensayo se tomó la botella de cultivo con las células osteoblásticas y se

descartó el sobrenadante, seguidamente se adicionaron 2ml de Phosphate Buffer Saline

(PBS) para hacer lavados y eliminar rastros del medio de cultivo, una vez eliminado el

PBS se adicionaron 1,5 ml de tripsina (Invitrogen) a una concentración de 1X con el fin

de desprender las células y se ubicaron en la incubadora a 37°C durante 10 minutos.

Pasado este tiempo las células se desprendieron de la botella dando golpes suaves, el

contenido de la botella se dispuso en un tubo falcón de 15 ml que contenía 4ml de

medio de cultivo McCoy con SBF al 10% lo cual inactivó la tripsina. El falcon con el

contenido celular se llevó a centrifugación durante 10 minutos a 1300 rpm. Pasado este

tiempo se recuperó el precipitado del fondo del tubo y se dispuso a realizar el conteo

celular en cámara Neubauer. Se adicionó sobre cada muestra una suspensión celular de

10.000 cel/cm2, el plato se llevó a la incubadora a 37ºC por 72 h.

Una vez pasado el tiempo de incubación, se procedió a despegar las células de cada

muestra evaluada con ayuda de la pipeta, se adicionaron 50 μl a cada pozo del reactivo

MTT a una concentración de 5mg/ml y se llevó a incubación a 37°C durante 4 horas.

Pasado este tiempo se adicionaron 100 μl de la solución de parada la cual está

compuesta por 10% de Dodecil Sulfato de Sodio (SDS -Fisher) y 50% de Isopropanol esta

se utilizó para disolver los cristales de formazan.

En la figura 28 se observa el procedimiento seguido para el ensayo de citotoxicidad

mediante la prueba MTT.

Figura 28. Montaje para el ensayo de citotoxicidad con MTT.

98


Scaffolds de HA

La producción de cristales de formazan se determinó mediante un lector de Elisa con

filtro de 570 nm (longitud de onda del formazan) y con los datos arrojados se obtuvo el

porcentaje de células vivas para cada material.

3.2.8.4. Proliferación celular

Se procedió de igual manera que para el ensayo de citotoxicidad en la primera parte

variando la concentración celular a 5.000 cel/cm2 pero la proliferación celular fue

determinada utilizando reactivo Alamar Blue o azul de alamar. Los osteoblastos fueron

sembrados sobre el material en platos de cultivo en medio McCoy con suero fetal

bovino al 10%. Se incubaron durante 72 horas a 37ºC, 5%CO2 (tiempo suficiente para

que las células comenzaran la etapa de diferenciación).Pasado el tiempo de incubación

se procedió a adicionar el reactivo a cada muestra y se llevó a incubación a 37°C

durante 1 hora y 30 minutos.

Los valores de fluorescencia fueron determinados a 530nm de excitación y 590 nm de

emisión en un fluorómetro. Los porcentajes de proliferación fueron calculados y se

representan en los resultados. Los ensayos se realizaron en dos experimentos

independientes y con dos replicas por ensayo.

3.2.8.5. Adhesión e interacción celular

Para la adhesión celular se utilizaron igualmente células de la línea celular SAOS2, ya

que este tipo de células como se ha mencionado anteriormente son anclo dependientes

por lo que permiten observar la adherencia al material.

Los ensayos se realizaron en dos experimentos independientes y con dos replicas por

ensayo. Las imágenes se muestran en los resultados.

El plato con las células cultivadas sobre el material en medio de cultivo McCoy se llevó a

incubación a 37ºC y 5%CO2 por 48 horas. Pasado este tiempo de incubación se observó

la adhesión celular sobre las muestras. Una vez se obtuvieron las células fijadas y

deshidratadas, las muestras se secaron y recubrieron con oro para ser observadas al

SEM, se analizan la adhesión, la morfología y proliferación celular sobre cada uno de los

scaffolds con y sin recubrimiento de Qo.

99


Scaffolds de HA


CAPÍTULO 3

[1] J. González, M. Escobar, C.P. Ossa, Manufacturing and characterization of



[2] H. A. Duran, D. Pena, C. Vásquez, Adhesión de osteoblastos sobre andamios de PLA-

PLG-hidroxiapatita-quitosano por electroactivación. Dyna Revista Facultad Nacional de

Minas [online]. Vol.79, n.176, pp. 99-104. ISSN 0012-7353, 2012.

[3] T. Kokubo and H. Takadama, How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity?

Biomaterials, vol. 27, N°. 15, p.p. 2907–2915, 2006.

[4] A. Nouri, R. Castro, J. L. Santos, C. Fernandes, J. Rodrigues, and H. Tomás, Calcium

phosphate-mediated gene delivery using simulated body fluid (SBF). Int. J. Pharm., vol.

434, N°1–2, p.p. 199–208, 2012.

[5] S. K. Mishra and S. Kannan, Development, mechanical evaluation and surface

characteristics of Chitosan/polyvinyl alcohol based polymer composite coatings on

titanium metal, J. Mech. Behav. Biomed. Mater., vol. 40, p.p. 314–324, 2014.

[6] J. Liu y X. Miao, “Porous alumina ceramics prepared by slurry infiltration of expanded

polystyrene beads,” Journal of Materials Science, vol. 40, no. 23, pp. 6145–6150, Sep.

2005.

[7] E. Díaz y D. Martínez, Obtención de hidroxiapatita utilizando el método de

sinterización. Universidad Industrial de Santander. Bucaramanga (2007).

[8] M. Avilés, Desarrollo y caracterización de una capa de biopolímero sobre titanio con

efectos antibacterianos. Universidad Politécnica de Cataluña. Barcelona, 2013.

[9] K. L. Mittal, Contact Angle, Wettability and Adhesion, Volume 6. ISBN

9789004169326. Leiden - Boston, 2009.

100


Scaffolds de HA

[10] G. L. García, Influencia del acabado superficial sobre la resistencia de juntas

adhesivas para fijación de elementos cilíndricos. Universidad Nacional de Colombia.

Facultad de minas. Medellín, 2006.

[11] P. Ghosh, Surface Tension, in Colloid and Interface Science, Asoke K. Grosh,PHI

Learning Private, p. 24. New Delhi, India, 2009.

[12] M. Harrison, I. Rae, Handbooks in Practical Animal Cell Biology: General techniques

of cell culture. Cambridge University Press. Published in the United States of America by

Cambridge University Press. ISBN 0 521 57364 5. New York, 1997.



101


Scaffolds de HA

CAPÍTULO 4.

RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

Los datos estadísticos del diseño experimental descritos en la metodología se presentan

en cada numeral correspondiente a los ensayos para cada variable respuesta, esto con

el fin de facilitar la comprensión y son descritos mediante tablas y gráficos arrojados por

los programas estadísticos Statgraphics y R.

4.1. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE LOS SCAFFOLDS DE HA CON Y SIN

RECUBRIMIENTO DE Qo

4.1.1. Obtención de los scaffolds de HA

Todos los scaffolds de HA fueron obtenidos basados en un protocolo, establecido por el

laboratorio de Biomateriales de la Universidad de Antioquia mediante la técnica de gel-

casting, por González, J [1], sin embargo, a este protocolo se le variaron el tiempo de

agitación (aumento) y la cantidad de sólidos (HA). En la figura 29 pueden observarse los

scaffolds obtenidos sin sinterizar (a), con 50% sólidos (b) y con 60% sólidos (c):

Figura 29. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting, sin sinterizar (a), con 50% de sólidos (b) y con 60% de sólidos (c).

Los scaffolds con 50% de sólidos (HA) que se muestran en la figura 29 (b) se observaron

con una forma adecuada y presentaron resistencia a la manipulación sin

desprendimiento, los poros aparentemente interconectados y bien distribuidos, para

los scaffolds que tenían un 60% de sólidos se observaron poros más cerrados y de

mayor tamaño, debido a que la HA se precipitó en el fondo de los recipientes de

102


Scaffolds de HA

moldeo, resultando con una apariencia menos homogénea, más aglomerados en su

base como se observa en la figura 29 (c) y eran difícilmente manipulables al tacto, ya

que tenían una tendencia a desmoronarse en la parte superior.

Luego de un pre-muestreo y de que se establecieran las condiciones adecuadas para su

desarrollo (buena distribución de la porosidad, fácil manejo, entre otros.), los scaffolds

seleccionados para la realización de los recubrimientos fueron los que tenían un 50% de

sólidos (HA), debido a que estos presentaron características físicas y de manipulación

más convenientes para el desarrollo del proyecto.

4.1.2. Obtención de los recubrimientos de Qo sobre scaffolds de HA

Los scaffolds obtenidos por la técnica de gel-casting con el 50% de sólidos se

recubrieron con soluciones de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5, 2%) y

tiempos (5 y 20 min). En la figura 30 (a) se observan las soluciones preparadas de Qo

con las que se recubrió cada uno de los scaffolds, al aumentar la concentración de

quitosano se observó una disminución de la transparencia, aumento en la coloración y

en la viscosidad. En la figura 30 (b) se muestran los scaffolds luego de su inmersión en

las soluciones de Qo (sin secado).

Figura 30. Soluciones de Qo a diferentes concentraciones (a), scaffolds recubiertos en solución de Qo (b).

El uso de esta técnica resulta importante debido a que el recubrimiento obtenido forma

enlaces de tipo secundarios (Van der Waals) entre la superficie de contacto que une el

film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso la HA [2]. Por tanto la

adhesión que se obtiene entre el quitosano y la HA se espera que sea la adecuada para

proporcionar las condiciones óptimas y mejorar las características con respecto a los

scaffolds de HA sin recubrimiento.

103


Scaffolds de HA

4.1.3. Fluorescencia de rayos X (FRX)

En el análisis FRX fueron identificados los compuestos en los scaffolds de hidroxiapatita

obtenidos por gel-casting con 50% de sólidos utilizados como patrones (sin

recubrimiento de quitosano), este análisis se realizó para diversas muestras obtenidas

inicialmente (tabla 8) con el fin de determinar la reproducibilidad del método y

compararlo con lo reportado en la literatura.

Tabla 8. Composición química de scaffolds de hidroxiapatita obtenidos por gel-casting.

Con los datos obtenidos en la tabla 8, se calcularon los valores de la relación molar Ca/P

para los scaffolds de HA obtenidos por gel- casting sin recubrimientos de quitosano, con

su desviación estándar.

Como se observa la relación molar obtenida para las muestras fue de 1,70 ± 0,02, los

scaffolds de HA obtenidos sugieren que hay una reproducibilidad del método ya que

como puede observarse la desviación estándar y la distribución de los datos es baja, se

obtienen valores que están en el rango de [0,68 – 1,72].

Teniendo la información anterior en cuenta, se sabe que la HA que se encuentra en el

hueso natural está constituida principalmente por fósforo y calcio en una relación molar

de 1,67 idealmente, el valor obtenido para esta relación en la tabla 8 sugiere que la fase

mineral de los scaffolds es hidroxiapatita no estequiométrica, ya que al comparar estos

datos se comprueba la similitud, y aunque no son exactamente iguales, se encuentra

cerca al rango y existen además en la literatura valores reportados que sugieren que

esta relación de Ca/P puede variar desde 1,0 hasta 2,16, siendo por ejemplo las apatitas

biológicas carbonatadas, presentan un aumento en la relación Ca/P. La mayoría de

estudios aseguran que el valor estequiométrico de la hidroxiapatita es de 1,67, sin

embargo, otros más recientemente han atribuido a la hidroxiapatita un valor

estequiométrico de relación Ca/P que oscila entre 0,98 y 2,85 para el tejido óseo

lamelar adulto [3]. Este dato varía dependiendo de la calcificación del hueso, la

madurez, la presencia de otros compuestos, entre otros.

Scaffold de HA

Compuesto Peso (%) Elemento Peso (%) Moles Relación Ca/P

CaO 60,81 ± 0,24 Ca 43,48 ± 0,17 1,08 1,70 ± 0,02

P2O5 43,68 ± 0,24 Px 19,30 ± 0,11 0,62

104


Scaffolds de HA

4.1.4. Espectroscopía de dispersión de energía (EDS).

Con ayuda de esta técnica se realiza una caracterización química de la composición de

los scaffolds de HA con el fin de especificar sus componentes, establecer su pureza y

determinar la relación Ca/P para asegurar que la relación molar siga siendo la más

cercana al hueso. En la figura 31 se observa una imagen obtenida al SEM para scaffolds

de HA obtenidos por gel-casting sin recubrimiento (utilizados como patrón) y un EDS

correspondiente a la zona señalada mostrando los elementos químicos presentes, se

observa el Ca, P y O como componentes principales indicando que se trata de scaffolds

de HA, se observa además que no hay presencia de otros componentes o impurezas en

cantidades significativas.

Figura 31. Imágenes obtenidas al SEM de scaffolds de HA por gel-casting (a) Espectros

EDS correspondiente a las superficies de los Scaffolds de HA (b).

Adicionalmente en la tabla 9 se muestra la composición química y los porcentajes de

estos elementos para varias áreas analizadas de los scaffolds de HA, la relación calcio/

fosforo promedio con su respectiva desviación estándar.

105


Scaffolds de HA

Tabla 9. Análisis químico por EDS para scaffolds de HA sin recubrimiento.

Elemento Peso (%) Ca/P

O 35,8 ± 1,8

1,61 ± 0,05 P 18,5 ± 1,0

Ca 38,3 ± 0,9

De los datos obtenidos en los espectros de EDS para los scaffolds de HA se observa que

no hay elementos diferentes a los correspondientes a la HA y que la relación Ca/P se

encuentra en los rangos reportados para hueso de 1,67 mencionado anteriormente.

Al analizar los resultados de las tablas (8 y 9) obtenidos por las técnicas de FRX y EDS

conviene destacar la escasa diferencia entre los valores medios obtenidos con los dos

métodos. Sin embargo estas variaciones pueden deberse a la diferencia en la técnica y

sensibilidad de los métodos. El EDS es un método semi-cuantitativo el cual no es tan

sensible como otros métodos ópticos, por lo tanto no se considera adecuado para los

elementos ligeros o de bajo peso molecular, se puede presentar solapamiento de picos

y además detecta mayores cantidades de ruido en las señales, entre otros, estos

factores pueden afectar en el análisis de las muestras, este tipo de análisis es

complementario a medidas posteriores con otras técnicas más precisas. Por otro lado,

con la técnica FRX, debido a que la longitud de onda es única para cada elemento, esta

permite hacer una inequívoca identificación del elemento y además permite hacer

análisis cuantitativos, ya que la intensidad de los rayos X es proporcional a la

concentración del elemento [4].

4.1.5. Difracción de rayos X (DRX)

Esta caracterización resulta muy importante a la hora de estudiar la estabilidad de las

fases y determinar la cristalinidad de la HA, además de la presencia del quitosano como

recubrimiento. El análisis de los difractogramas permitió identificar los picos relevantes

de los materiales utilizados y estudiar la forma (amorfa o cristalina) de dichos

componentes, ya que estas propiedades pueden afectar las características de absorción

de agua y la biodegradabilidad sobre todo en los polímeros [5].

Los difractogramas de rayos X para los scaffolds de HA fabricados por gel-casting con y

sin recubrimientos de Qo se muestran en las figuras 32 y 33 para el menor y mayor

tiempo de exposición al recubrimiento respectivamente (5 y 20 min). En los

difractogramas los asteriscos (*) denotan los picos característicos del quitosano y los

círculos (o) denotan los picos de la hidroxiapatita. La figura 32 (a) muestra un

difractograma para scaffolds de HA sin recubrimiento, este se utilizó como patrón de

106


Scaffolds de HA

comparación con los scaffolds recubiertos con Qo. Este espectro patrón muestra una

alta cristalinidad y sus picos característicos de mayor intensidad en 2θ = 31.7°, 32.2°,

32.9°, y unos de menor intensidad en 25.9°, 40, 46.7° y 49.4° lo que corresponde con lo

reportado en la literatura para la HA sintética [6].

Para los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones con

menor tiempo de exposición (5 min), mostrados en las figuras 32 (b, c, d), se observa en

los difractogramas unas zonas más amorfas y con picos de menor intensidad en 10° y

20° que son característicos para el quitosano a las diferentes concentraciones con

variaciones muy pequeñas en la intensidad [7,8,9], sin embargo para los scaffolds de HA

con recubrimientos de Qo al 0,5% en la figura 32 (e) no hay presencia del pico en 20°, lo

que indica que en la muestra no había presencia de este polímero, esto puede dar una

leve idea de que cuando los scaffolds se recubren con menores concentraciones y

tiempos de exposición no hay una adhesión suficiente entre la superficie sólida y el

polímero.

Figura 32. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a) scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con

menor tiempo de exposición (5min).

107


Scaffolds de HA

Adicionalmente se observa en la tabla 10 los valores de los picos obtenidos para

scaffolds de HA, el quitosano comercial utilizado para los recubrimientos de los

scaffolds y los scaffolds obtenidos con el recubrimiento de Qo.

Tabla 10. Comparación de valores de los difractogramas de rayos X.

Picos 2θ

(°)

Qo comercial Scaffold HA

(patrón)

Scaffolds de HA

recubiertos con Qo

Primarios 9 - 10 32.2, 33.9, 34.9

11 y 20 Qo

19 - 20 32,33,34 HA

Secundarios 25.9, 46.7 y 49.4 26 y 47 HA

Menor Intensidad 30 28.8, 34.0 y 53.2 28, 50 y 53 HA

En la figura 33 se muestran igualmente los difractogramas para los scaffolds de HA con

y sin recubrimiento para un mayor tiempo de exposición al recubrimiento (20 minutos),

se observan igualmente los picos característicos.

Como era de esperar, todos los picos de HA se observan para todos los espectros DRX y

los picos característicos de quitosano para los scaffolds con recubrimientos, para la

menor concentración de 0,5% de Qo figura 33 (e) a diferencia de la figura 32 (e) si se

observó un pico en 20° típico del quitosano de baja intensidad. Esto puede indicar que

en poco tiempo es más difícil que la superficie de la HA sea recubierta por el quitosano,

ya que como se observa en los gráficos a medida que aumentan la concentración de

quitosano y los tiempos de exposición al recubrimiento, la intensidad de los picos de

quitosano también se ve aumentada, aunque en algunos sea poco perceptibles.

La cristalinidad de las muestras observadas en los difractogramas, en general, resulta de

la interacción intermolecular entre cadenas a través de enlaces de hidrogeno

intermolecular, enlaces de van der Waals (fuerzas atractivas o repulsivas que incluyen

atracciones entre átomos, moléculas y superficies, que constituyen las fuerzas

intermoleculares que dan cohesión a una estructura) que se forman entre la superficie

de la HA y el Qo (comportamiento catiónico), ya que es una unión de tipo mecánico que

se da debido a las cargas de ambos materiales (adhesión electrostática) [7].

108


Scaffolds de HA

Figura 33. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a) y para scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con

mayor tiempo de exposición (30min).

4.1.6. Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR)

La figura 34 muestra el espectro FTIR del quitosano utilizado para los recubrimientos

(a), los scaffolds de HA preparados por gel – casting sin recubrimiento (b) y los scaffolds

de HA recubiertos con las diferentes concentraciones de Qo 0.5% (c), 1% (d) 1,5% (e) y

2% (f) obtenidas en el mayor tiempo de inmersión (20 min). Se observan los grupos

funcionales característicos en las bandas de absorción. En los espectros los asteriscos

(*) denotan los picos característicos del quitosano (Qo) y los círculos (o) denotan los

picos de la hidroxiapatita (HA).

109


Scaffolds de HA

Figura 34. Espectro infrarrojo obtenido para el Qo (a), scaffolds de HA preparados por gel - casting (b) y scaffolds de HA con recubrimientos de quitosano a diferentes

concentraciones (c – f) a mayor tiempo de exposición (20 min).

La figura 34 (a) corresponde a un espectro con las bandas principales para el quitosano,

puede observarse un pico para el grupo amida I en aproximadamente 1630 cm-1, en

1550 cm-1 para NH2, en la banda 1200 cm-1 para la amida III y en 3450 para el grupo de

tensión OH–, estas bandas corresponden a valores muy similares reportados en la

literatura [8, 9]

En la figura 34 (b) se observan las bandas características para la HA. Los picos alrededor

de 630 cm-1 y 3570 cm-1 corresponden al estiramiento de los grupos hidroxil –OH

presentes en la HA o la absorción de agua. Se observan además las bandas de absorción

110


Scaffolds de HA

del fosfato PO43- en aproximadamente 1024 cm-1 y en 560 cm-1 una de las señales más

importantes para la HA [10, 11]. Una HA típica muestra bandas para un espectro FTIR en

(3600, 3569, 3578, 3448 y 633) cm-1 correspondientes a grupos OH-; bandas en (474,

571, 601, 692, 1032 ≈ 1087, 1092, 1040) cm-1 correspondientes a grupos PO43- y bandas

entre (870, 1420 y 1480) cm-1 si la muestra contiene grupos CO3- [10].

En los espectros de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo a diferentes

concentraciones figura 34 (c - f) son observadas bandas características del grupo

carboximetil del Qo (*) los cuales aparecen alrededor 1580 y 1400 cm-1. Como era de

esperarse todos los picos de HA y Qo son observados para los scaffolds recubiertos [12,

13]. Estos espectros de FTIR indicaron también un desplazamiento de bandas

características de la amina (1630 cm-1) y la amida (1550 cm-1) en el quitosano para

reducir el número de onda en el compuesto como resultado de la interacción entre el

quitosano y la HA, a través de enlaces de hidrógeno entre -NH2 y -OH, así como la

quelación entre -NH2 y Ca2+ [13]. Puede observarse además en estos espectros que la

magnitud de estas bandas se volvió más débil y estrecha debido a la hibridación in situ.

La estructura fina e intensa de las señales pertenecientes a los espectros (c, d, e y f)

representa un claro indicio de la elevada estabilidad que posee el recubrimiento

obtenido, la cual aumenta con el aumento de la concentración de quitosano, como se

observa en el gráfico.

Es importante destacar que algunos picos característicos del quitosano se solapan por

los de hidroxiapatita, además de la aparición de una banda distinta que se detectó en

1550 cm-1, lo que significa la formación de un enlace -C=N- debido a la interacción entre

la HA y el quitosano en los scaffolds recubiertos.

Las bandas características principales de los diferentes grupos funcionales presentes en

scaffolds de HA con recubrimientos de Qo se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11. Bandas de vibración reportadas en la literatura [13].

Compuesto Asignación Frecuencia Infrarroja (cm-1)

Qo Amina –NH2 1544

Qo Amida –CONH2 1631

Qo Metileno –CH2 2887

HA PO4 555

HA PO4 1024

HA Carbonato CO32 1382

HA OH estructural 3431

111


Scaffolds de HA

El FTIR de la figura 34 reveló la presencia de fases características en las muestras de HA

con y sin recubrimiento, lo que concuerda con lo mostrado en los análisis de DRX y la

literatura.

En la figura 35 se muestran los espectros infrarrojos reportados en la literatura por

Ruphuy y col. (2016) para una pasta de hidroxiapatita HAp pulverizada (a) y quitosano

CS (b) usados como muestras estándar, los espectros de ambas muestran las bandas

típicas de sus grupos principales, para la HAp se observa el grupo fosfato PO4 en picos a

1093 y 1032 cm-1 y bandas en 3567 cm-1 para el grupo hidroxilo OH, mientras que las

bandas en 3421 y 1653 cm-1 se asignan al agua absorbida. Los grupos característicos del

quitosano también se confirmaron en el correspondiente espectro (b), donde la banda a

3468 cm-1 fue asignada al modo de estiramiento del grupo OH, solapada con el modo

de estiramiento de NH. Los picos a 1300-1450 cm-1 pueden corresponder a una

combinación de CN-NH, CH2-OH y bandas CH3.

Para los espectros en (c y d) correspondientes a partículas híbridas de HAp y CS

presentan todas las bandas típicas de los grupos característicos de la HAp y el

quitosano, lo que demuestra que las partículas de HAp se incorporan en una matriz de

quitosano dando lugar a productos finales con diferentes propiedades [14]. Esta

información corrobora lo que sucede igualmente con los espectros mostrados en esta

investigación donde se observó una coincidencia para los picos característicos para los

materiales estándar (HA y Qo) y para los recubrimientos de Qo sobre los scaffolds de HA

los espectros muestran algunos cambios en las bandas de vibración y corrimientos,

obteniéndose un material con características de ambos, pero propiedades diferentes.

112


Scaffolds de HA

Figura 35. Espectro Infrarrojo de estándares de hidroxiapatita HAp (a), quitosano CS (b) y partículas hibridas de HAp – CS a diferentes concentraciones (c y d) obtenido por

Ruphuy y col. (2016) [14].

113


Scaffolds de HA

4.2. CARACTERIZACIÓN MORFÓLOGICA Y SUPERFICIAL DE LOS SCAFFOLDS

La morfología y superficie de las muestras se analizó mediante Microscopía estereoscópica y Microscopía electrónica de barrido (SEM). A continuación, se muestran las fotografías de los scaffolds de HA con y sin recubrimientos en seco y se hace una breve descripción de algunas características de su estructura, morfología y porosidad.

4.2.1. Estereomicroscopía de la superficie de los scaffolds

El estereomicroscopio tiene la capacidad de mostrar objetos de mayor tamaño con

profundidad, una característica muy importante a la hora de evaluar un scaffold, sin

embargo, esto se da a muy bajos aumentos. En la figura 36 se muestran las fotografías

de scaffolds de HA sin recubrimientos tomadas en el Estereomicroscopio marca Zeiss

DV4 con aumentos de 8X y 16 X respectivamente.

Figura 36. Scaffolds de HA preparados por gel-casting vistos con aumentos de 8X (a) y

16X (b) al estereomicroscopio.

Se observa en éstos una estructura totalmente porosa, este tipo de morfología se debe

a la utilización de la técnica de gel-casting la cual permite obtener poros

interconectados, homogéneos y de diferentes tamaños que pueden ir desde los 200 µm

hasta los 800 µm aproximadamente. Esta información cuantitativa se corrobora mejor

con las imágenes obtenidas al SEM.

En la figura 37 se observan algunas fotografías de scaffolds de HA con recubrimientos

de Qo a diferentes concentraciones 1,5% y tiempos de inmersión 5 y 20 min (a y b

114


Scaffolds de HA

respectivamente) y 2% y tiempos de inmersión 5 y 20 min (c y d respectivamente)

obtenidos por gel-casting/inmersión, a menores concentraciones no se logra obtener

en este equipo con tan pocos aumentos imágenes del recubrimiento debido a las

características del film de Qo que se forma sobre la superficie de HA. La adhesividad y

transparencia de éste dificulta observarlo claramente, sin embargo en las imágenes se

resalta mediante flechas azules la presencia del recubrimiento como zonas brillantes en

algunas partes de los scaffolds, sin embargo pese a esto se observan las características

de porosidad interconectada y superficie que concuerdan con las imágenes obtenidas

en la figura 36 para los scaffolds no recubiertos. Otra característica importante de

destacar es que no se presenta aparentemente taponamiento de los poros por la

presencia de los recubrimientos para ninguna de las concentraciones, esta información

será corroborada también con las imágenes obtenidas al SEM.

Figura 37. Scaffolds de HA con recubrimientos de Qo observadas al estereomicroscopio

en aumentos de 8X y 16X.

115


Scaffolds de HA

Debido a la porosidad de todas las muestras es difícil diferenciar defectos, fisuras u

otras características importantes para estas; sin embargo, se observa la similitud en la

morfología para cada scaffold, su estructura porosa e interconectada y en los scaffolds

con recubrimiento hay presencia de una capa semi-transparente y brillante

perteneciente al Qo. Los recubrimientos tienen superficies irregulares debido a la

variación en el tamaño de las partículas de polvo dispersadas en cada substrato

mediante la técnica de inmersión.

La porosidad es un efecto relevante a la hora de explicar el comportamiento mecánico y

biológico de los scaffolds, debido a que estos representan concentradores de tensiones

cuando tienen un mayor tamaño, ya que si se someten a grandes esfuerzos estos

pueden conectarse formando planos de falla que alteran su desempeño; además se

puede producir el desprendimiento del recubrimiento. Sin embargo, obtener una

estructura porosa es importante debido a que esta característica está relacionada con la

proliferación e interacción celular, ya que deben estar en un rango adecuado para que

se den estos fenómenos celulares.

4.2.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM)

La caracterización de las muestras mediante SEM permitió establecer la morfología,

uniformidad, distribución de los poros, además de otras características superficiales

para su posterior análisis. Se realizaron evaluaciones, tanto en la zona superficial, como

en un corte transversal, para observar la composición química y estructura de las

muestras obtenidas. Estas imágenes de scaffolds de HA (andamiajes para regeneración

tisular) con y sin recubrimiento de Qo están constituidos mediante canales (poros

interconectados), las cuales se muestran a continuación y se hace una descripción y

análisis de su distribución, morfología externa e interna, microestructura superficial

porosa y tamaño e interconectividad de los poros, características que dan idea de la

importancia de estos materiales como soporte para el cultivo de las células, las cuales

pueden promover o suspender el crecimiento celular y la circulación de nutrientes [15].

En la figura 38 se muestran fotografías al SEM de scaffolds de HA obtenidos por gel-

casting sin recubrimientos de Qo a diferentes aumentos de 40X (a), 500X (b), 1000X (c)

y 2500X (d).

116


Scaffolds de HA

Figura 38. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting observados al SEM en aumentos de 40X (a), 500X (b), 1000X (c) y 2500X (d).

Como se observa en la figura 38 (a), para los scaffolds de HA obtenidos por gel-casting,

la geometría de los poros es bastante similar a lo reportado en la literatura, se observa

además una estructura macroporosa y altamente interconectada con tamaño de poro

comprendido en el intervalo de los 100 a 600 µm. Este tipo de morfología y dimensión

de poro ha demostrado ser adecuado para fines en ingeniería de tejido óseo [15, 16,

17].

En la figura 38 (b) se muestra más de cerca uno de los poros abiertos de la estructura, el

cual se conecta con otro poro más pequeño que va hacia el interior de la muestra, lo

que supone que los poros están interconectados y se observan interconexiones entre

los 100 y 400 micrómetros aproximadamente.

117


Scaffolds de HA

En las figuras 38 (c) y (d) se muestra la superficie de la HA la cual se presenta en forma

de cristales característicos y algunas partículas aglomeradas, las cuales corresponden a

lo reportado en la literatura para scaffolds obtenidos de HA por diferentes técnicas

como las que se muestran en la figura 39 (a) y (b) [16, 17, 18].

Figura 39. Scaffolds de HA reportados en la literatura observados al SEM a diferentes

aumentos 500X, 1000X y 2000X, poros esféricos de 100–200 µm (a), superficie de scaffolds (b) [16, 17, 18].

En las figuras 40 a 43 a continuación se muestran las fotografías obtenidas al SEM (a)

con su respectivo EDS (b) para los scaffolds de HA recubiertos con las diferentes

concentraciones de Qo (0.5%, 1%, 1.5% y 2%) obtenidos por gel-casting/inmersión para

el menor tiempo (5min), en aumentos de 500X, 1000X y 2000X.

118


Scaffolds de HA

Figura 40. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 0.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 1000X.


Qo al 1%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 2000X.

119


Scaffolds de HA

Figura 42. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 1.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 500X.

Figura 43. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 2%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumentos de 500X.

Se observa en estas imágenes la superficie característica de la HA en forma de cristales, una estructura porosa e interconectada para todos los scaffolds obtenidos, sin embargo en las diferentes fotografías al SEM de los scaffolds de HA sin recubrimiento los cristales de HAP están presentes como bloques, mientras que en los scaffolds con recubrimientos de Qo, el recubrimiento se deposita como una película o film con granos de material orgánico sobre los scaffolds de HA, revistiendo estos bloques.

120


Scaffolds de HA

El grosor de estos recubrimientos es delgado, pero es difícil de cuantificar numéricamente sus espesores (pueden estar entre 1 y 2 µm aproximadamente). Es importante resaltar la presencia de Carbono mostrada en los EDS para todos los scaffolds con recubrimiento de Qo, a menor concentración del polímero disminuye la cantidad de C en el espectro.

En las figuras 44 a 47 a continuación se muestran igualmente las fotografías al SEM (a) y

su respectivos EDS (b) para los scaffolds de HA recubiertos con las diferentes

concentraciones de Qo (0.5%, 1%, 1.5% y 2%) obtenidos por gel-casting/inmersión para

el mayor tiempo (20 min), en aumentos de 500X, 1000X y 2000X.

Figura 44. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (0.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min) aumento de 500X.

Figura 45. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (1%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumentos de 2000X.

121


Scaffolds de HA

Figura 46. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (1.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 500X.

Figura 47. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (2%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 2000X.

Al comparar las imágenes al SEM de los scaffolds con y sin recubrimiento de quitosano

(a los diferentes tiempos de inmersión) no se observan diferencias significativas en

cuanto a porosidad, sin embargo, si hay diferencias en cuanto a su superficie y

presencia de una capa o film orgánico que bordea los cristales de la HA en sobre todo

en el caso de los scaffolds con recubrimientos al 1, 1.5, y 2%. Se puede apreciar en estos

que el film de Qo está distribuido homogéneamente sobre la superficie de los scaffolds

122


Scaffolds de HA

de HA, formando una estructura igualmente porosa, esto sugiere una buena adhesión

(aunque no fue corroborado directamente con esta técnica), sin embargo cabe resaltar

que a medida que se aumentó la concentración de quitosano la capa adherente que se

forma sobre los scaffolds es relativamente más gruesa y en los que están recubiertos

con el 2% de Qo se ve un leve taponamiento de los poros en algunas zonas. Para los

demás la morfología permanece semejante lo que indica que la incorporación de

diferentes porcentajes de Qo no afecta la morfología de la muestra, sin embargo, es

importante resaltar los componentes presentes en el EDS, la presencia del C del

material orgánico (Qo) favorece la respuesta biológica.

En las imágenes de todos los especímenes se observó que los poros estaban

interconectados debido a que las paredes que forman las cavidades son discontinuas.

Los recubrimientos en los scaffolds de HA se componen de diferentes cantidades,

espesores y orientaciones para cada una de las concentraciones de Qo utilizadas, lo que

se corrobora en el EDS con la composición química y presencia de Carbono (C) atribuido

al quitosano ya que los demás elementos que componen este material no son

detectados por esta técnica. Las concentraciones más bajas de polímero (0.5 %Qo en

ambos tiempos) generan superficies de recubrimiento más suaves sobre los scaffolds

sin embargo hay mayor cantidad de zonas desiertas que no presentan recubrimiento

del material orgánico Qo, lo que indica que hubo poca impregnación o adhesión de las

partículas del polímero durante el método de inmersión.

Otra característica importante a resaltar de los recubrimientos de Qo sobre los scaffolds

de HA es la apariencia de éstos, ya que todas las películas que se formaron exhibieron

una morfología superficial uniforme y lisa, se observan además flexibles, no quebradizas

y sin grietas, ni tampoco partículas de quitosano no disuelto sobre éstos, por lo tanto, la

mejora de las propiedades mecánicas con el recubrimiento de quitosano puede inhibir

el desprendimiento severo de partículas y el colapso de la estructura de los scaffolds de

HA. Esta observación podría estar relacionada con la buena deposición o adhesión que

se produjo entre el Qo y la superficie de HA mediante la adaptación de una metodología

sencilla durante la inmersión en el polímero. Esto puede explicarse debido a que el

quitosano es mucho más reactivo que otros polímeros naturales. Puede ser definido

como una poliamina lineal de alto peso molecular con grupos amino e hidroxilo

reactivos. Se comporta como un polielectrolito catiónico y por debajo de pH 6,5

presenta una alta densidad de carga, por lo tanto, este se adhiere fácilmente a las

superficies cargadas negativamente, en este caso el sustrato de HA [19].

En la tabla 12 se muestra de forma resumida algunas características que se observaron

para los scaffolds con y sin recubrimiento de Qo al SEM.

123


Scaffolds de HA

Tabla 12. Características obtenidas al SEM reportadas para los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones y tiempos.

Nomenclatura Observaciones

0,5% - 1T Poros interconectados, sin aparente taponamiento.

0,5% - 2T Poros interconectados, sin aparente taponamiento.

1% - 1T Poros interconectados, sin aparente taponamiento.

1% - 2T Poros interconectados, capa de polímero embebiendo la superficie

del scaffold, sin aparente taponamiento.

1,5% - 1T Poros interconectados y leve taponamiento con formación de capa

delgada sobre algunas zonas en la superficie del scaffold.

1,5% - 2T Poros interconectados con formación de capa aparentemente gruesa

y leve taponamiento en algunas zonas.

2% - 1T Poros interconectados y leve taponamiento en algunas zonas

2% - 2T

Poros interconectados y formación de capas de polímeros levemente

gruesas sobre la superficie del scaffold y taponamiento de poros en

algunas zonas

Patrón HA Estructura macroporosa, porosidad interconectada, superficie

rugosa, no hay recubrimiento polimérico.

*Nota: 1T = 5min, 2T=20min

4.2.3. Ensayo de degradabilidad in vitro en SBF

Esta prueba fue planteada para determinar el porcentaje de pérdida de masa, como

indicativo de degradación de los scaffolds, se realizaron ensayos de gravimetría, para los

cuales se consideraron los datos de peso inicial (Wi) de las muestras antes de su

inmersión en la solución, así como también los valores de los pesos húmedos (Wf). Cada

muestra fue introducida en un recipiente cubierto totalmente que contenía SBF con

temperatura aproximadamente constante de 37°C.

Los datos de degradabilidad fueron registrados y reportados en la tabla 13 para los

scaffolds con y sin recubrimiento de quitosano.

124


Scaffolds de HA

Tabla 13. Porcentaje de pérdida de peso de los scaffolds (Degradabilidad).

Recubrimiento de Qo (concentración y tiempo)

Pérdida Peso ± D.E (%)

0,5% - 1T 6,76 ± 3,76

0,5% - 2T 3,92 ± 0,19

1% - 1T 6,12 ± 2,90

1% - 2T 4,44 ± 1,11

1,5% - 1T 4,52 ± 0,11

1,5% - 2T 2,95 ± 0,98

2% - 1T 4,27 ± 0,25

2% - 2T 1,31 ± 0,74

Patrón HA 8,85 ± 0,83

Nota: 1T = 5min, 2T = 20 min (Inmersión)

Los análisis de estos datos del ensayo de degradación permitieron obtener información

sobre la variación de la masa, hinchamiento, pérdida de material y posible protección

de los scaffolds de HA con la formación de películas de Qo sobre estos, en un sistema

de degradación hidrolítica y por cambios de pH, mostrando diferentes resultados para

cada concentración de polímero. Cambios superficiales fueron detectados mediante la

variación del pH y desintegración del material, los cuales fueron relacionados con la

transferencia de carga a través de la interfase polímero/solución y cerámico/polímero y

que están directamente relacionadas con la pérdida de masa del polímero, cabe resaltar

que al hablar de degradabilidad se refiere a la desintegración de la estructura de los

scaffold de HA, ya que por ser el film de Qo sobre la superficie de estos tan delgado, es

casi imperceptible algún cambio en el peso con respecto solo al polímero.

En la figura 48 se muestra estos datos en forma de gráficos de columnas, con su

respectiva desviación estándar, para mejor visualización y análisis de los resultados

obtenidos.

125


Scaffolds de HA

Figura 48. Gráfico de barras obtenido para la pérdida de peso de los scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo con su respectiva D.E.

De los datos obtenidos se puede deducir que el valor de pérdida de masa mayor se

presentó en los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento) indicando un aumento en la

degradación del material. Finalmente, el valor más bajo se observó en los scaffolds de

HA con una concentración mayor de Qo y tiempo de inmersión (2%Qo - 2T), puede

destacarse además de este gráfico que a medida que va disminuyendo la concentración

de Qo y el tiempo de inmersión utilizados para recubrir los scaffolds de HA la pérdida de

masa aumenta en gran medida, lo que indica que a mayores porcentajes de Qo y mayor

tiempo de inmersión hay una mayor resistencia a la degradación o pérdida de material

debido a la estabilidad y compactibilidad que les proporcionó a los scaffolds de HA la

capa de polímero que se formó sobre estos, mejorando además sus propiedades

mecánicas y de desintegración.

Una variedad de polímeros hidrolíticamente degradables se han desarrollado y probado

en aplicaciones como scaffolds para ingeniería de tejidos, entre estos se encuentra el

quitosano, su comportamiento biodegradable y capacidad para formar films sobre una

superficie es una ventaja para esta área, además de la cirugía reconstructiva ya que

estos materiales no tienen que ser retirados y pueden dejar espacio para la

regeneración de tejidos mientras se degradan por procesos naturales y dan espacio a la

vascularización del tejido con mayor rapidez actuando además como barreras

protectoras y mejorando las propiedades mecánicas cuando es integrado a otro tipo de

materiales como la HA.

6,76

3,92

6,12

4,44 4,52

2,95

4,27

1,31

8,85

3,77

0,20

2,90

1,11

0,11

0,99 0,25 0,74 0,83

DEGRADABILIDAD (%)

PÉRDIDA DE PESO (%) D.E

126


Scaffolds de HA

Es importante este ensayo debido a que la degradación del quitosano se debe

principalmente a la susceptibilidad de ser hidrolizado enzimáticamente. Las

macromoléculas son comúnmente degradadas fuera de las células a unidades mono o

diméricas por la acción de exoenzimas y esos productos son absorbidos por las mismas.

Y es debido a su biodegradabilidad que el quitosano abre un gran potencial económico

y benéfico en el área de los empaques y películas o recubrimientos, dada las similitudes

con los materiales sintéticos [20]. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la

biodegradación depende del tamaño del implante, de su forma, densidad, lugar de

implantación y peso molecular del material empleado.

La comparación de los datos se efectuó por medio de test de hipótesis o contrastes de

hipótesis, con lo que se pudo determinar si las medias de los valores fueron diferentes o

iguales.

Para la degradabilidad se plantearon las siguientes hipótesis nula y alterna:

Ho(D): la degradabilidad para todas las muestras es igual µD1 = µD2 = µD3 = µD4

Ha(D): la degradabilidad para alguna muestra es diferente µD1 ≠ µD2

Figura 49. Estadística descriptiva para datos de degradabilidad de las muestras.

127


Scaffolds de HA

Como se observa en los gráficos de la figura 49, la distribución de los datos de degradabilidad es levemente asimétrica sesgada poco a la derecha (sesgo positivo), sin presencia de datos atípicos. Para la degradabilidad se obtiene un P-valor = 0,00018, por lo tanto, se rechaza la hipótesis nula para alfa (α) = 0,05, que dice que la degradabilidad para todos los % de concentración de polímero es igual.

En este ensayo también se determinó a su vez el cambio de pH que experimentaron

cada uno de los scaffolds de HA con y sin recubrimiento sumergidos en la solución de

SBF durante los 21 días. En las figuras 50 y 51 se muestran los resultados de este ensayo

para el menor y mayor tiempo de inmersión respectivamente. La determinación del pH

de los medios hidrolíticos experimentó variaciones apreciables, donde se obtuvo un

aumento del pH a valores alcalinos rápidamente para todos los scaffolds de HA con y sin

recubrimiento de Qo, excepto para los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 2% y

mayor tiempo de inmersión, donde los valores se mantuvieron más estables.

Figura 50. Gráfico de pH vs tiempo para scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo para el menor tiempo de inmersión.

7

7,5

8

8,5

9

9,5

0 7 14 21

pH

Tiempo (días)

pH vs Tiempo

0,5%Qo - 1T

1%Qo - 1T

1,5%Qo - 1T

2%Qo - 1T

HA patrón

128


Scaffolds de HA


para el mayor tiempo de inmersión.

Puede verse de las gráficas anteriores que las películas de quitosano más delgadas

(menor concentración de Qo) tienen una mayor permeabilidad a la solución de SBF, el

pH aumenta más rápidamente en los scaffolds con menor concentración de polímero y

a menores tiempos de inmersión (5 min). Esta propiedad se ve mejorada en los

recubrimientos de mayor concentración de polímero y mayores tiempos de inmersión

(20 min) debido a que demuestran aumento de la permeabilidad, por lo que la

interacción e intercambio de iones se ve disminuida.

Los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento de Qo), muestran cambios de pH mucho

más alcalinos con respecto a los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo, cabe

destacar que estos cambios de pH tan altos no son adecuados para mejorar la viabilidad

celular, por ejemplo el pH en la sangre humana tiene una gama muy estrecha de

alrededor de 7,35 a 7,45. El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el

rango de 6,0 a 8,0. Si el pH del cuerpo se desvía de este rango las células dejan de

funcionar correctamente y pueden obstaculizar la eficiencia de la química y las

funciones del organismo [21]. El comportamiento de la degradación fue similar en todos

los casos y se caracterizó por una degradación lenta cambios de pH muy altos en los

primeros días, más notorios en los scaffolds de HA sin recubrimiento.

7

7,5

8

8,5

9

9,5

0 7 14 21

pH

Tiempo (días)

pH vs Tiempo

0,5%Qo - 2T

1%Qo - 2T

1,5%Qo - 2T

2%Qo - 2T

HA patrón

129


Scaffolds de HA

La Figura 52 representa un esquema que muestra cómo sería la degradación de las

películas de Qo en solución SBF. En la imagen se observan tres interfaces:

polímero/electrolito, capa adsorbida/polímero y cerámico/polímero. Se observa que la

película obtenida y degradada presenta inicialmente un posible hinchamiento las

primeras horas debida a la penetración de la solución acuosa en el polímero, después se

presenta la degradación de la película, la cual está asociada a una disminución de la

masa del recubrimiento, aumentando el comportamiento resistivo por la formación de

poros y a la captura de electrolitos en estos poros. Después de penetrar en los poros, la

propagación del electrolito entre el cerámico y la película delgada, aumenta la fracción

del área del cerámico expuesto a la solución. Al mismo tiempo, la capa de Qo disminuye

su valor inicial, lo cual confirma un aumento de heterogeneidades superficiales por la

capa parcialmente degradada.

Figura 52. Representación de la degradación de las películas de Qo en SBF

Los cambios que se producen en el pH se deben principalmente a la interacción entre

los iones calcio y fosfato del electrolito y el scaffold de HA, ya que hay presencia de una

interfase relacionada con adsorción, formando productos en la superficie del polímero

que está en constante degradación. Cabe destacar que los productos de degradación

del Qo son la glucosamina o la N-acetil glucosamina, los cuales se dispersan en el

organismo sin ningún efecto tóxico en el mismo [22].

Los biomateriales poliméricos degradables poseen un alto potencial para ser aplicados

como recubrimientos en las prótesis para regeneración ósea. Por tal motivo se hace

necesario estudiar las propiedades de biodegradación de estos materiales con el fin de

determinar su estabilidad durante los procesos de osteointegración con el cuerpo

humano en la rehabilitación de huesos fracturados o en los reemplazos por enfermedad

ósea [23].

130


Scaffolds de HA

4.2.4. Porosidad e interconectividad de los scaffolds

A continuación, en la tabla 14 se presentan los resultados obtenidos de porosidad

(abierta, másica, y total) e interconectividad obtenidas para los scaffolds de HA con y sin

recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones y tiempos de inmersión en el

polímero.

Tabla 14. Resultados de Porosidad e Interconectividad para los scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo y su respectiva D.E.

En la tabla 14 se comparan los tamaños de poro obtenidos para los diferentes

tratamientos. Todos los scaffolds presentaron alta porosidad e interconectividad entre

el 70 y 85% de porosidad total y entre el 45 y 70% de interconectividad

aproximadamente, ambos datos con desviaciones estándar relativamente bajas. Se

observó que todos los scaffolds tienen tamaño de poros bien definidos y semejantes

antes y después de ser recubiertos con quitosano, la mayor influencia en este

parámetro la da el recubrimiento, ya que se observa una disminución en la

interconectividad a medida que aumenta la concentración de Qo usada como

recubrimiento y el tiempo de inmersión.

El tamaño de poro medio es un aspecto esencial en scaffolds para ingeniería tisular. Es

importante destacar que si los poros son demasiado pequeños las células no pueden

migrar hacia el centro de la matriz por tanto la difusión de nutrientes y la eliminación de

productos de desecho serán limitados. De modo contrario si los poros son demasiado

grandes se produce una disminución en el área superficial específica y la unión de

células disponibles será limitada. Sin embargo, la relación entre el tamaño de los poros

Nomenclatura

Porosidad Abierta (%)

Porosidad

Másica (%)

Porosidad Total (%)

Interconectividad

(%)

HA patrón 49,92 ± 12,8 96,93 ± 5,5 82,17 ± 1,0 66,89 ± 7,8

0,5%Qo - 1T 54,81 ± 7,1 91,87 ± 11,7 80,34 ± 1,2 68,15 ± 7,8

0,5%Qo - 2T 53,15 ± 0,8 70,71 ± 0,9 76,40 ± 0,2 69,55 ± 0,8

1%Qo - 1T 46,05 ± 3,5 70,29 ± 5,7 79,24 ± 0,1 54,86 ± 0,2

1%Qo - 2T 44,10 ± 0,9 65,12 ± 1,7 75,46 ± 5,3 53,73 ± 1,6

1,5%Qo - 1T 44,89 ± 5,4 90,29 ± 7,3 83,42 ± 0,6 54,72 ± 4,8

1,5%Qo - 2T 37,22 ± 5,6 75,85 ± 1,3 78,78 ± 3,1 46,52 ± 4,4

2%Qo - 1T 42,71 ± 2,1 64,77 ± 17,7 78,15 ± 7,0 54,99 ± 7,6

2%Qo - 2T 42,83 ± 3,0 80,21 ± 1,2 83,67 ± 0,1 49,39 ± 1,2

131


Scaffolds de HA

del scaffold y la actividad de las células es poco conocida y como resultado hay informes

contradictorios en la literatura sobre el tamaño óptimo de los poros requerido para el

éxito de la ingeniería tisular. Estudios previos en ingeniería de tejidos óseos han

indicado que el intervalo de tamaños de poro medios (96 a 150 µm) facilita una unión

óptima. Otros estudios han demostrado la necesidad de poros más grandes (300 a 800

µm) para un crecimiento óseo exitoso en scaffolds. Estos resultados contradictorios

indican que debe establecerse un equilibrio entre la obtención de la unión celular

óptima y facilitar el crecimiento del tejido óseo [24, 25, 26].

En estudios más recientes se ha discutido sobre el efecto del tamaño medio de los

poros en scaffolds y se ha determinado en ingeniería de tejido óseo un tamaño de poro

> 100 µm son deseables, así como una alta interconectividad de éstos, con el fin de

facilitar la fijación y la proliferación de las células, el crecimiento interno de nuevo tejido

formado y la mejora de la vascularización [25].

Por otro lado, las porosidades típicas reportadas en la literatura varían entre un amplio

rango que va desde el 40 al 92% [25, 26, 27, 28], los resultados obtenidos en la

experimentación se encuentran dentro de este rango.

En la figura 53 se muestra un esquema de como las células que se unen a los scaffolds

microestructurados aplanándose, por lo tanto presentan una morfología similar a la

asumida en la superficie plana.

Figura 53. Morfología celular en scaffold microporoso [29].

En lo que respecta a la IT ósea, específicamente el tamaño ideal del poro está

reportado que varía entre 100 y 500 μm [30, 31]. Para que se dé una correcta

osteogénesis, es necesaria una adecuada vascularización del tejido, por lo que los poros

son un elemento significativo y no solo la presencia de estos, sino además el control de

132


Scaffolds de HA

su tamaño medio. Se consigue una adecuada vascularización del tejido con poros de

aproximadamente 200 micrómetros [32]. Distintos estudios parecen mostrar que, poros

de tamaño inferior a 50 μm favorecen la formación de tejido fibroide (que desencadena

un aumento en la producción y deposición de matriz extracelular y por tanto algunas

enfermedades), poros menores de 100 μm, favorecen el desarrollo de tejido osteoide, y

poros de tamaño mayor de 100 μm, dan lugar a la formación de hueso mineralizado

[33].

El objetivo del scaffold es la interacción celular, para ello, es necesaria la presencia de

determinados grupos químicos o ligandos, en la superficie del material. La superficie

disponible dentro de un poro, va a influir en la cantidad de ligando que pueden

adherirse al constructo, que influirá directamente en la adhesión celular. Esto depende

de la mediada del tamaño de los poros en el scaffold. Por tanto, los poros deben ser lo

suficientemente grandes para permitir que las células migren a la estructura, donde

finalmente quedarán ancladas a los ligandos, pero lo suficientemente pequeño para

establecer una superficie específica suficientemente alta, lo que lleva a una mínima

densidad de ligando que permite la unión eficiente de un número crítico de las células

al scaffold. El tamaño de los poros dependerá fundamentalmente del tipo de célula que

sea necesaria, así como de los ligandos que estas células requieran [33].

Además de las mediciones cuantitativas de porosidad e interconectividad de los scaffold

obtenidas anteriormente con ayuda del protocolo de Liu y colaboradores [34], se

obtuvo la medición de los tamaños de poro promedio para todos los scaffolds de HA

con y sin recubrimientos de Qo a través de un análisis usando el software de la

herramienta del SEM procesando las imágenes a una escala de colores negro y blanco.

En la figura 54 se observan las imágenes obtenidas a partir de SEM para los scaffold HA

patrón, es decir, sin ningún recubrimiento de polímero con algunas medidas de los

tamaños de sus poros.

En las figuras 55 y 56 se muestran los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a

diferente concentración y menor tiempo de inmersión (5 min) y mayor tiempo de

inmersión (20 min) respectivamente. Se observan igualmente las estructuras porosas

para cada scaffold y una serie de líneas (verdes) que muestran los diámetros de los

poros con sus respectivas medidas, también se puede observar la capa de polímeros

sobre algunos de éstos, principalmente los de mayor concentración.

133


Scaffolds de HA

Figura 51. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento de Qo) a 40X, 200X y 500X.

134


Scaffolds de HA

Figura 52. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y menor tiempo de

inmersión (5 min) a 35X y 200X.

135


Scaffolds de HA

Figura 53. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y mayor tiempo de

inmersión (20 min) a 40X y 200X.

136


Scaffolds de HA

En la tabla 15 se muestra de manera resumida los tamaños de poro y su promedio

obtenidos mediante estas imágenes al SEM (debido a la cantidad de muestras y poros

se escogieron al azar sólo 4 de éstos para cada scaffold).

Tabla 15. Valores promedio de los tamaños de poro obtenidos al SEM.

Con ayuda del software del SEM se obtuvieron los tamaños de poro promedio para los

diferentes scaffolds, de las figuras 54-56 y la tabla 15 se observa que la gran mayoría de

probetas presentaron un tamaño de poro adecuado según lo reportado en la literatura,

es decir oscilan entre los 150 y 400 micrómetros [34]. No tan pequeños como para no

permitir el paso de células a través del scaffold, pero no tan grandes como para debilitar

las propiedades mecánicas del mismo. Los tamaños de los poros presentan para la

mayoría de los scaffolds con y sin recubrimiento valores muy similares, sin embargo hay

una alta dispersión en los datos como puede verse en la tabla 15, donde se observan

medidas de poros grandes y poros pequeños, sin embargo estos están dentro del rango

aceptado.

Por otra parte, se buscó evidenciar mediante estas imágenes que los scaffolds con

recubrimientos presentaran porosidad interconectada y que no hubiesen

taponamientos de los poros por la presencia de las películas de recubrimiento de Qo,

esto se evidenció en la figura 55 (flechas azules) para los scaffolds con recubrimientos a

mayores concentraciones y tiempos de inmersión (1,5 y 2%Qo, 20 min), debido a la

viscosidad de las soluciones de quitosano y los tiempos de exposición al polímero

(20min), pudo darse este fenómeno, en el que dichos scaffolds presentaron

taponamiento de algunos de sus poros internos.

Nomenclatura

Poro 1 (µm)

Poro 2 (µm)

Poro 3 (µm)

Poro 4 (µm)

Tamaño de poro Promedio (µm)

D.E

HA patrón 442,72 236,27 162,44 97,32 234,68 198,19

0,5%Qo - 1T 293,67 250,7 276,21 186,47 251,76 75,80

0,5%Qo - 2T 411,36 390,5 284,28 330,33 346,61 57,30

1%Qo - 1T 388,86 244,37 320,1 302,1 346,62 61,35

1%Qo - 2T 231,97 325,24 380,78 340,3 313,86 76,60

1,5%Qo - 1T 442,72 407,95 241,31 284,77 319,57 111,69

1,5%Qo - 2T 291,24 278,03 225,36 234,49 344,19 34,85

2%Qo - 1T 306,03 225,08 94,52 177,2 264,88 91,10

2%Qo - 2T 487,76 400,53 204,44 302,12 200,71 131,27

137


Scaffolds de HA

Cabe resaltar que el tejido óseo se puede clasificar en dos tipos principalmente; el

hueso trabecular y el cortical. El material básico de ambos huesos pareciera ser el

mismo y la distinción entre ellos estaría dada por el grado de porosidad y su

distribución. El rango de porosidad del hueso cortical es de 5% al 30%, mientras que en

el hueso esponjoso es del 30% al 90%. La porosidad del hueso no es fija y puede

cambiar con el transcurso del tiempo en respuesta a una alteración de cargas,

enfermedad y envejecimiento [35].

En lo que respecta al hueso esponjoso, también conocido como poroso o trabecular

(figura 57), está compuesto de una red interconectada de placas y barras que reciben el

nombre de trabéculas, que a su vez, están compuestas de cristales de hidroxiapatita

dentro de una matriz de fibras de colágeno.

Figura 57. Hueso esponjoso o trabecular al SEM 200X (Narváez, 2004) [35].

De los datos obtenidos en este ensayo (cualitativos y cuantitativos) puede observarse la

similitud con las características del hueso trabecular como son el tamaño de poro, la

apariencia, rugosidad, porosidad e interconectividad y composición en comparación

con los scaffolds, rasgos que los hacen adecuados para su uso en ingeniería de tejidos

ósea.

Para la porosidad se plantearon las siguientes hipótesis nula y alterna:

Ho(P): la porosidad para todas las muestras es igual µp1 = µp2 = µp3 = µp4

Ha(P): la porosidad para alguna muestra es diferente µp1 ≠ µp2

En las figuras 58 y 59 se muestran los datos graficados con su respectiva distribución

para la porosidad y la interconectividad de las muestras.

138


Scaffolds de HA

Figura 58. Estadística descriptiva para datos de porosidad de las muestras.

Estos datos presentan una distribución bimodal de los datos cuantitativos alrededor de dos modos separados. Sugiere dos poblaciones separadas de distribución normal de las que se extraen los datos. El Box – plot presenta un sesgo a la derecha y no se observan datos atípicos. Para la porosidad el P-valor = 0, por lo tanto por ser mayor a 0.05 se rechaza la hipótesis

nula para alpha (α) = 0.05, por lo tanto la porosidad para todas las muestras no es igual.

Para la interconectividad se presentan las siguientes hipótesis nula y alterna:

Ho(I): la interconectividad para todas las muestras es igual µI1 = µI2 = µI3 = µI4

Ha(I): la interconectividad para alguna muestra es diferente µI1 ≠ µI2

139


Scaffolds de HA

Figura 59. Estadística descriptiva para datos de interconectividad de las muestras.

La tendencia de los datos muestra una distribución sesgada y bimodal, con sesgamiento positivo (hacia la derecha) y sin presencia de datos atípicos. La tendencia de los valores no es central y están levemente dispersos. Para la interconectividad el P – valor = 3,32859x10-8. Por lo tanto se rechaza la hipótesis nula para alpha (α) = 0,05. Para las muestras los valores de interconectividad no son iguales.

4.2.5. Mojabilidad y adhesividad de los recubrimientos de Qo

En este ensayo se evaluó la capacidad de humectación y se determinaron los ángulos de

contacto para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo con ayuda del método Celda de

Washburn (debido a que este permite medir el ángulo de contacto y la energía libre de

superficie de materiales porosos y/o materiales absorbentes).

En sistemas absorbentes o sea cuando el líquido penetra el sustrato, el ángulo de

contacto cambiará continuamente como una función del tiempo. Debido a que estos

sistemas no son estáticos sino dinámicos, el procedimiento de medida empleado para

medir el ángulo de contacto debe ser con tensiómetro [36].

140


Scaffolds de HA

La medición del ángulo de contacto se utilizó para evaluar que tan adherentes fueron

los recubrimientos de Qo realizados sobre los scaffolds de HA, y que tanto se mejoró la

mojabilidad del material sólido con cada recubrimiento a las diferentes concentraciones

de polímero que se usaron durante el desarrollo del proyecto, propiedad bastante

importante en el caso de usar éste material para fabricar implantes o dispositivos

protésicos, ya que se busca que durante la vida útil de éste no se generan trombos o

rechazo del material, además de mejorar la hidrofobicidad de la superficie.

En la figura 60 se muestra los tipos de contacto, ángulo y mojabilidad que pueden darse

en un líquido sobre un sustrato sólido con rugosidad o porosidad.

Figura 60. Ejemplos de diferentes mojados superficiales [36].

En la tabla 16 se muestran los valores de los ángulos de contacto obtenidos para los

scaffolds de HA con las soluciones de Qo a diferentes concentraciones empleadas (0.5,

1, 1.5, 2%) y como un control se obtuvo el ángulo de contacto de la superficie de HA

con agua destilada.

Tabla 16. Ángulo de contacto para scaffolds de HA con las diferentes soluciones de Qo.

Nomenclatura Ángulo de contacto (º)

0.5%Qo

0

1%Qo

1.5%Qo

2%Qo

Agua 81

141


Scaffolds de HA

Se considera que un líquido moja a un sólido cuando el ángulo de contacto es inferior a

90º. Esto sólo se produce cuando la tensión superficial del líquido es igual o inferior a la

energía superficial del sustrato, en caso contrario se dice que tal líquido no moja al

sólido en cuestión [36].

De la tabla 16 se observa que para todas las concentraciones de quitosano usadas sobre

los scaffolds de HA se obtuvo un ángulo de contacto de cero grados (0º), es un caso

extremo donde el líquido se expande sobre el sólido, lo que indica que se da un mojado

completo o perfecto sobre las superficie sólida de HA, para el agua destilada presenta

un ángulo de contacto de (81º) lo que indica que el sustrato de HA presenta una alta

mojabilidad y adhesión con respecto a ambas soluciones siendo mejor para los

recubrimiento de Qo a las diferentes concentraciones. Esto puede deberse a varias

razones entre las cuales están la rugosidad superficial de la muestra y/o porosidad del

scaffold o las bajas tensiones superficiales de las diferentes concentraciones de

quitosano obtenidas con el método de Placa de Wilhelmy las cuales se muestran en la

tabla 17. En general todos los adhesivos tienen una tensión superficial muy baja (30 a

47mN/m), lo que los hace tener una fuerza de cohesión muy alta al sustrato y por tanto

tienen una excelente mojabilidad [37].

Tabla 17. Tensión superficial y viscosidad de las soluciones de Qo a diferentes concentraciones.

Nomenclatura Tensión superficial

(mN/m)

Viscosidad

(cP*)

0.5%Qo 31,40 76

1%Qo 30,04 272

1.5%Qo 29,25 1060

2%Qo 29,60 2519

Agua 72,20 0,902

* 1 Poise (P) = 10-1 Pa·s

Estos resultados corresponden con los obtenidos por Fernández, Zamani, Morris y otros

[38, 39, 40].

Con respecto a la tabla 17 no se observan cambios sustanciales en la tensión superficial

de las soluciones para las diferentes concentraciones de Qo pero si hay una variación

pronunciada de la viscosidad, como era de esperarse debido a que al aumentar la

concentración de Qo la solución se tornaba más espesa (viscosa).

142


Scaffolds de HA

Sin embargo, es necesario aclarar que la medida de los ángulos de contacto está

sometida a severas limitaciones y estos valores deben considerarse con reserva, debido

a que ciertos aspectos limitan sus resultados, como son el líquido seleccionado y la

rugosidad de la superficie. Además, otro factor importante es la porosidad del sustrato

sólido el cual está íntimamente relacionado con el ángulo de contacto, debido

principalmente a los fenómenos de capilaridad. Una mayor porosidad disminuye theta

(θ) en sistemas con un buen mojado [36, 41]

En la figura 61 se muestran las curvas típicas obtenidas en la medición del ángulo de

contacto por el método de Washburn.

Figura 61. Curva obtenida con el método de Washburn para los scaffolds de HA con solución de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5 y 2%).

A partir de los datos de m2 Vs t de cada líquido (solución de Qo) sobre los scaffolds de

HA se construyeron las curvas presentadas en la figura 59 y mediante la aplicación de la

ecuación propuesta por Washburn (8).

𝑚2

𝑡 =

𝑐∗𝜌2∗𝜎∗𝑐𝑜𝑠𝜃

η (8)

Esta ecuación presenta la relación entre las características de un líquido que penetra

por capilaridad a través de un material, el ángulo de contacto formado en la interfase

(θ) y la velocidad a la cual ocurre la absorción, representada por la relación entre la

masa (m) y el tiempo transcurrido (t) [42].

143


Scaffolds de HA

Como se ha mencionado antes, en materiales absorbentes o porosos cuando el líquido

penetra en el sustrato, el ángulo de contacto cambiará continuamente como una

función del tiempo, al representar la masa de la fase líquida versus el tiempo se aprecia

que en general todas las curvas presentan un comportamiento similar sigmoideo, las

cuales inician en cero y aumentan su pendiente (positiva) rápidamente y finalizan con

una suavización en esta pendiente, llegando a alcanzar una leve estabilidad sobre todo

para las concentraciones de 1.5 y 2% de Qo, que son más viscosas.

4.2.6. Trabajo de adhesión termodinámico (Wad)

Finalmente, como se mencionó en el apartado anterior para el cálculo del trabajo de

adhesión termodinámico (Wad) se empleó la ecuación de Young - Dupré que relaciona

los parámetros de interacción entre los scaffolds porosos de HA al entrar en contacto

con los recubrimientos líquidos de Qo a las diferentes concentraciones. En la tabla 18 se

reportan los valores del trabajo de adhesión termodinámico obtenidos mediante la

solución de la ecuación.

Tabla 18. Trabajo de adhesión (Wad), para la interacción entre los sustratos HA/recubrimientos Qo.

Material del sustrato HA

Interacción substrato/recubrimiento (mN/m)

0.5%Qo 1%Qo 1.5%Qo 2%Qo Agua

62,8 60,1 58,0 59,2 128,3

Se observa entonces de la tabla 18 que para ángulos de contacto 0º el trabajo de

adhesión entre el sólido y el líquido es igual al trabajo de cohesión del líquido o sea

(Wad = 2γL); por lo tanto, el líquido se adhiere espontáneamente sobre la superficie, ya

que para el sistema es indiferente si el líquido se encuentra en contacto consigo mismo

o con el sólido. Cuando la superficie es rugosa y el ángulo de contacto es mayor que

90º, la adhesión puede no ocurrir, por otra parte si θ fuera igual a 180º el líquido no

moja ni se adhiere sobre el sólido. En consecuencia, el aumento de la rugosidad en

estos casos convierte a la adhesión en un hecho menos probable [43].

Según esto el efecto del recubrimiento sobre el trabajo de adhesión (Wad) para cada

una de las interacciones substrato/recubrimiento es prácticamente similar, sus valores

indican que la función básica que desempeñó el Qo es simplemente la de facilitar el

mojado de la superficie del sustrato. La etapa siguiente al proceso de humectación se

llama penetración; en ella, el vehículo ingresa por capilaridad al interior de los poros de

144


Scaffolds de HA

las partículas del sustrato sólido o bien a los intersticios del conjunto de partículas o

agregados. Para asegurar la rápida penetración de la fase líquida es necesario un alto

valor de la tensión superficial del mismo, así como también un muy bajo valor del

ángulo de contacto; debido a que estas dos hipótesis son contradictorias, se concluye

que para lograr un resultado efectivo el requisito fundamental es asegurar un ángulo de

contacto cercano a 0º aún con valores moderados de la tensión superficial [43].

Por tanto, el trabajo de humectación o mojabilidad que refiere en términos energéticos

a la inmersión de un cuerpo sólido en el seno de un líquido, considera el desarrollo del

proceso de humectación en tres etapas importantes (adhesión, penetración y

propagación o extensión). Por consiguiente y haciendo un análisis de los datos de las

tensiones superficiales y ángulo de contacto obtenidos los valores bajos para las

diferentes concentraciones de Qo otorgaron mejores resultados durante el proceso de

humectación y adhesividad sobre el sustrato que con respecto al control utilizado

(agua) para la cual se tiene un valor adecuado de ángulo de contacto (θ < 90º), sin

embargo la fuerza para unión o adhesividad aplicada debe ser mayor para unir estas

dos interfaces, que para las soluciones de Qo.

4.3. CARACTERIZACIÓN MECÁNICA DE LOS SCAFFOLDS

4.3.1. Ensayo de resistencia mecánica a la compresión

Los recubrimientos obtenidos tienen una alta aplicabilidad cuando se necesita proteger

a un substrato del desgaste, la degradación, desintegración, corrosión, entre otros, a la

vez que pueden utilizarse como barreras térmicas, entre otras amplias y extensas

aplicaciones. La propia naturaleza de este tipo de recubrimientos y sus espesores, hace

que sus propiedades mecánicas sean difíciles de determinar. Además, la remoción del

recubrimiento, sin utilizar métodos químicos que podrían dañar el recubrimiento, es

relativamente difícil lo que dificulta adicionalmente dicha evaluación. La determinación

de propiedades mecánicas es útil a la hora de comparar las condiciones a las que se

realizó el recubrimiento y permite seleccionar mejor un recubrimiento para una

aplicación concreta [44].

Las propiedades elasto-plásticas de los scaffolds de HA fabricados con y sin

recubrimientos de Qo fueron evaluadas mediante ensayos uniaxiales de compresión

sobre las muestras cilíndricas porosas. Para ello, se empleó una máquina

electromecánica universal de ensayos (DIGIMESS), con una velocidad de la deformación

145


Scaffolds de HA

de 5mm/min, límite en el desplazamiento de 75% y carga máxima de 500 N. De los

datos obtenidos se muestran las curvas de tensión - deformación en las figuras 62 y 63.

Figura 62. Curvas de tensión – Deformación para scaffolds de HA patrón y con recubrimientos de Qo a menor tiempo de inmersión.


recubrimientos de Qo a mayor tiempo de inmersión.

146


Scaffolds de HA

Las películas de quitosano más delgadas (menor concentración de Qo y tiempo de

inmersión) tienen una resistencia a la compresión más baja, pero mayor capacidad de

deformación. Esta propiedad se ve mejorada en los recubrimientos con mayor

concentración de polímero a mayores tiempos de inmersión, debido a que demuestran

aumento de la rigidez y la resistencia mecánica y una leve disminución en el módulo

elástico. En ambas gráficas se observa que las curvas de la HA patrón tuvieron menor

resistencia mecánica y baja pendiente.

A su vez, en la tabla 19 se resumen los datos promedio obtenidos de las curvas de

Tensión/Deformación para la resistencia a la compresión y el módulo de elasticidad

para cada uno de los materiales evaluados y su respectiva desviación estándar.

Tabla 19. Propiedades mecánicas de los scaffolds de HA con y sin recubrimientos de Qo.

Recubrimiento Qo (%)

Tiempo de inmersión (min)

Resistencia Máxima (σ) (MPa)

Módulo Elástico (Y) (MPa)

0,5 5 3,72 ± 1,55 601,40 ± 26,07

0,5 20 5,27 ± 1,66 470,15 ± 33,64

1 5 5,76 ± 3,40 845,00 ± 53,35

1 20 6,34 ± 3,20 623,17 ± 24,51

1,5 5 7,54 ± 2,70 1005,32 ± 46,91

1,5 20 7,77 ± 2,99 897,39 ± 22,64

2 5 8,07 ± 2,12 1452,27 ± 38,74

2 20 9,80 ± 2,73 2929,71 ± 48,71

HA patrón --- 2,68 ± 1,04 287,99 ± 36,30

Según algunas investigaciones reportadas en la literatura por Choi y colaboradores

(1990), Rho y colaboradores (1993), M. E. Navarro (2005) y A. Bernadette (2013) entre

otros, para el hueso trabecular la resistencia mecánica a la compresión oscila entre 2,2

y 10 MPa y el módulo elástico puede variar entre los 400 y 1700 MPa [45, 46, 47,48].

Como se observa en la tabla 19 la mayoría de los scaffolds de HA con recubrimiento de

Qo tienen valores de resistencia mecánica dentro del rango reportado en la literatura

incluyendo los scaffolds patrón (sin recubrimiento), sin embargo sus valores son muy

bajos con respecto a los otros, por lo que cabe resaltar que la capa de polímero

funcionó de manera positiva con respecto a esta propiedad observándose un aumento

en estos valores para los scaffolds con concentraciones de Qo y tiempos de inmersión

147


Scaffolds de HA

mayores. Las desviaciones estándar en general no son muy altas para estos valores lo

cual significa que los datos están menos dispersos y que se encuentran más cercanos al

promedio.

Sin embargo al observar los datos del Módulo de elasticidad (Y), se muestra que para los

scaffolds de HA patrón (cuadro rojo) estos valores de pendiente fueron muy bajos con

respecto a los scaffolds con recubrimientos de Qo y para los scaffolds con mayor

concentración de 2% Qo y tiempo de inmersión 20 min (cuadro azul), ambos valores

difieren en un buen porcentaje con respecto a los valores reportados para hueso

trabecular, esta propiedad los hace poco atractivos para su uso en ingeniería de tejidos

óseo.

La determinación de estas propiedades mecánicas es útil a la hora de comparar las

condiciones de obtención del material y permite seleccionar mejor un recubrimiento

para una aplicación concreta. En este estudio se han evaluado la resistencia máxima y el

módulo de elasticidad de scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes

concentraciones obtenidos por inmersión a dos tiempos (5 y 20 min).

Se han observado importantes diferencias respecto al valor que se obtiene para los

sustratos de HA sin recubrimientos. El daño en los ensayos mecánicos se produce de

forma importante a través de los poros que lo constituyen, indicando que éstas son

zonas de unión relativamente débiles, sin embargo, debido a la presencia de un

recubrimiento polimérico se ayuda a mejorar la cohesión y éste actúa como una especie

de adhesivo, por lo tanto, estas propiedades o resistencia al daño pudieron ser

mejoradas. Dada la propia naturaleza de este tipo de recubrimientos, sus espesores y a

la anisotropía de las muestras, hace que sus propiedades mecánicas sean difíciles de

determinar, sin embargo, se han relacionado las propiedades mecánicas analizadas con

la estructura de los recubrimientos.

En la figura 64 se observan algunas de las muestras obtenidas de los scaffolds de HA con

y sin recubrimiento de Qo (a mayor tiempo de inmersión) luego de ser sometidos al

ensayo de compresión.

148


Scaffolds de HA

Figura 64. Scaffolds con y sin recubrimiento de Qo obtenidos después del ensayo de compresión (a mayor tiempo de inmersión).

Se observa como a medida que aumenta la concentración de Qo la integridad de los

scaffolds se ve mejorada, el recubrimiento de Qo actuó como un adhesivo que permitió

mantener las partículas juntas aún luego de someterlos a los ensayos, no hubo tanta

desintegración del material, como en el caso de los scaffolds de HA patrón y con

recubrimiento de 0,5% Qo donde las muestras se destruyeron completamente.

Para la resistencia mecánica se presentan las siguientes hipótesis nula y alterna:

Ho(R): la resistencia mecánica para todas las muestras es igual µR1 = µR2 = µR3 = µR4

Ha(R): la resistencia mecánica para alguna muestra es diferente µR1 ≠ µR2

Los datos obtenidos para resistencia a la compresión y el módulo elástico fueron

graficados y se muestran en las figuras 65 y 66 a continuación:

149


Scaffolds de HA

Figura 65. Estadística descriptiva para datos de resistencia mecánica de las muestras.

La distribución de los datos para la resistencia mecánica muestra una distribución más

normal, sin sesgamientos, la tendencia de los datos es central y sin presencia de datos

atípicos.

Para la resistencia mecánica el P-Valor = 0,000028 por lo tanto se rechaza la hipótesis nula para alpha = 0,05. Por lo tanto, todos los valores para todas las muestras son diferentes. Para el módulo elástico se presentan las siguientes hipótesis nula y alterna:

Ho(M): el módulo elástico para todas las muestras es igual µM1 = µM2 = µM3 = µM4

Ha(M): el módulo elástico para alguna muestra es diferente µM1 ≠ µM2

150


Scaffolds de HA

Figura 66. Estadística descriptiva para datos de módulo elástico de las muestras.

Para el módulo elástico puede verse que la distribución de los datos esta sesgada a la derecha (sesgo positivo), Para la mayoría de las muestras la distribución tiene tendencia normal sin embargo hay presencia de un dato atípico por lo que se presentan asimetría. La distribución de los datos es muy grande, sin tendencia media central. Aquí el P-valor = 0,0050, por lo que se rechaza la hipótesis nula, todos los datos de Módulo elástico son diferentes. Por otro lado, la tabla 20 muestra el resumen estadístico para cada una de las variables

de los datos seleccionados. Incluye las medidas de tendencia central, medidas de

variabilidad, y las medidas de forma. De particular interés aquí son la asimetría y la

curtosis estandarizada normalizada, que se puede utilizar para determinar si la muestra

proviene de una distribución normal. Los valores estadísticos fuera del rango de -2 a +2

indican desviaciones significativas de la normalidad, que tenderían a invalidar muchos

de los procedimientos estadísticos que normalmente se aplican a estos datos. En este

caso, solamente el Módulo Elástico (MPa) muestra valores de asimetría y curtosis

estandarizados fuera del rango esperado como se observa en rojo.

151


Scaffolds de HA

Tabla 20. Resumen estadístico de datos de las variables respuesta.

Degradabilidad

(%)

Interconectividad

(%)

Porosidad

(%)

Resistencia

Mecánica

(MPa)

Módulo

Elástico

(MPa)

Promedio 4,79333 57,6444 79,7367 6,32778 1012,49

Desviación

Estándar 2,20375 8,42728 2,92459 2,24135 794,519

Coef. de

variación 45,9752% 14,6194% 3,66781% 35,4209% 78,4719%

Valor Mínimo 1,31 46,52 75,46 2,68 287,99

Valor Máximo 8,85 69,55 83,67 9,8 2929,71

Rango 7,54 23,03 8,21 7,12 2641,72

Asimetría

estándar 0,50204 0,517296 0,0400659 -0,274584 2,53435

Curtosis

estándar 0,318492 -0,849645 -0,726987 -0,292487 2,94808

4.3.2. Correlación De Datos

En la figura 67 se muestra una matriz de dispersiones divariadas para todos los pares de

variables. En la matriz, cualquier par de variables es graficado dos veces, una con la

primera variable sobre el eje X y una con esa variable sobre el eje Y. Esta gráfica se usa

frecuentemente para identificar aquellas variables que están altamente

correlacionadas, así como puntos lejanos ocasionales. De esta manera juzgar las

relaciones que existen entre las variables.

Figura 654. Correlación de variables respuesta.

152


Scaffolds de HA

Statgraphics presenta los coeficientes de correlación como una matriz, de la cual se

muestra una sección a continuación en la tabla 21, esto entrega las correlaciones de

Pearson entre cada par de variables. Estos coeficientes de correlación oscilan entre -1 y

+1 y miden la fuerza de la relación lineal entre las variables. Entre mayor sea el valor

absoluto de la correlación, más fuerte es la relación lineal entre las dos variables.

También se muestra en paréntesis el número de pares de valores de datos utilizados

para calcular cada coeficiente. El tercer número en cada ubicación de la tabla es un

valor P (negrilla) que pone a prueba la significación estadística de las correlaciones

estimadas. Los valores de P inferiores a 0,05 indican correlaciones que no son cero

estadísticamente significativas en el nivel de confianza del 95,0%.

Tabla 20. Correlaciones de Pearson entre variables respuesta.

Degradabilidad (%)

Interconectividad (%)

Porosidad (%)

Resistencia Mecánica

(MPa)

Módulo Elástico (MPa)

Degradabilidad (%) 0,6522 0,0526 -0,9049 -0,7177

(9) (9) (9) (9)

0,0569 0,8932 0,0008 0,0295

Interconectividad (%)

0,6522 -0,1073 -0,8276 -0,5820

(9) (9) (9) (9)

0,0569 0,7836 0,0059 0,1001

Porosidad (%)

0,0526 -0,1073 0,1390 0,4558

(9) (9) (9) (9)

0,8932 0,7836 0,7214 0,2175

Resistencia Mecánica (MPa)

-0,9049 -0,8276 0,1390 0,8162

(9) (9) (9) (9)

0,0008 0,0059 0,7214 0,0073

Módulo Elástico (MPa)

-0,7177 -0,5820 0,4558 0,8162

(9) (9) (9) (9)

0,0295 0,1001 0,2175 0,0073

Los siguientes pares de variables tienen valores de P por debajo de 0,05. Lo que significa

que tienen alta correlación entre ellas.

Degradabilidad (%) y Resistencia Mecánica (MPa)

Degradabilidad (%) y Módulo Elástico (MPa)

Interconectividad (%) y Resistencia Mecánica (MPa)

Resistencia Mecánica (MPa) y Módulo Elástico (MPa)

En la tabla anterior se observa también que algunos pares de variables muestran

correlaciones significativas, sin embargo otros no, como son:

153


Scaffolds de HA

Degradabilidad (%) e Interconectividad (%)

Degradabilidad (%) y Porosidad (%)

Interconectividad (%) y Porosidad (MPa)

Interconectividad (%) y Módulo Elástico (MPa)

Resistencia Mecánica (MPa) y Porosidad (%)

Módulo Elástico (MPa) y Porosidad (%)

4.4. CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS SCAFFOLDS

4.4.1. Citotoxicidad celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo

Los ensayos de citotoxicidad in vitro se incluyen en los estudios de una primera fase de

evaluación de los biomateriales implantables. La evaluación citotóxica constituye una

vía simple, rápida y económica para obtener una valiosa información acerca de la

biocompatibilidad de los biomateriales. Se han realizado en este estudio ensayos de

citotoxicidad, proliferación y adhesión «in vitro», basados en metodologías de detección

bioquímica (MTT y Alamar Blue) y morfológicas (microscopía SEM) con el fin de

establecer el grado de biocompatibilidad y en adelante se muestran los resultados.

En el ensayo de citotoxicidad por contacto indirecto la cantidad de formazan producido

se evalúo mediante medidas de absorbancia en un espectrofotómetro y está

relacionado con el número de células viables, es decir, el número de células

metabólicamente activas dentro del cultivo. En este caso se partió de células de

osteoblastos congeladas de la línea Saos2. Se decidió utilizar esta línea celular debido a

que los scaffolds van a estar en contacto directo con el hueso y serán recubiertos por el

mismo. Por eso es más conveniente la utilización de células osteoblásticas humanas.

Las muestras fueron definidas en los resultados como M1 a M5, donde M1 corresponde

al scaffold de HA sin recubrimiento usado como patrón de comparación, de M2 a M4

corresponden a los scaffolds con recubrimiento a mayor tiempo de inmersión (20 min) y

aumentando la concentración desde 0,5 a 2% respectivamente y MC corresponde a un

control negativo, o sea células sembradas en medio de cultivo, sin el biomaterial y

corresponden sus resultados al 100% de la viabilidad celular o ausencia de citotoxicidad.

Los resultados de esta prueba se resumen en la tabla 22 y son expresados como el

porcentaje de viabilidad de las células Saos-2 cultivadas con los biomateriales

(scaffolds).

154


Scaffolds de HA

Tabla 21. Porcentajes de viabilidad de células (Saos-2) cultivadas en los scaffolds evaluados con y sin recubrimiento de Qo.

MATERIAL VIABILIDAD Saos-2 (%) MTT

M1 41,9 ± 1,8

M2 60,0 ± 3,9

M3 65,5 ± 1,0

M4 97,1 ± 7,2

M5 82,9 ± 1,0

MC 100 ± 0,05

De la tabla 22 se observa que los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo (M2 a M5)

en general no presentan citotoxicidad significativa ya que no se produce la muerte

celular, caso contrario para la muestra M1 correspondiente a los scaffolds de HA patrón

(sin recubrimiento) los cuales muestran porcentajes bajos para la viabilidad celular en

MTT, estos pueden clasificarse como ligeramente citotóxicos. Se resalta que esta

característica evaluada es mejorada para los scaffolds de HA recubiertos con mayores

porcentajes de Qo (1,5 y 2%), donde se observan los valores más altos de viabilidad.

Los resultados de citotoxicidad celular para las condiciones estudiadas se muestran igualmente en la figura 68:

Figura 68. Resultados de citotoxicidad mediante ensayo de MTT para las muestras de los scaffolds evaluados y el control.

0

20

40

60

80

100

M1 M2 M3 M4 M5 MC

41,9

60 65,5

97,1

82,9

100

1,8 3,9 1 7,2

1 0,05

Via

bili

dad

Cel

ula

r (%

)

Muestras evaluadas

CITOTOXICIDAD

VIABILIDAD Saos-2 (%) D.E

155


Scaffolds de HA

Se observa que para casi todas las condiciones de estudio no se presentan efectos

tóxicos para el desarrollo de la vida celular, sin embargo para los scaffolds de HA patrón

si, sin embargo tampoco se presentan para estos un valor de citotoxicidad superior al

25% por lo que no se consideran severamente tóxicos [49]. El MTT demuestra la

ausencia de citotoxicidad (supervivencia > 90%) para las mayores concentraciones de

Qo (1,5 y 2%) y para los scaffolds de HA patrón existe una toxicidad media inicial (≈40%)

[50].

4.4.2. Proliferación celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo

La proliferación celular es la medida del número de células que se dividen en un cultivo.

Para este ensayo las condiciones iniciales son las mismas que para la citotoxicidad en el

apartado anterior, con utilización de reactivo Alamar blue y un tiempo de incubación

mayor. El ensayo ha tenido resultados óptimos para casi todas las muestras de scaffolds

de HA con recubrimiento de Qo y se observan en la tabla 23.

Tabla 23. Porcentajes de proliferación celular (Saos-2) cultivadas en los scaffolds

evaluados con y sin recubrimiento.

MATERIAL PROLIFERACIÓN Saos-2 (%)

Alamar Blue

M1 47, 9 ± 3,0

M2 85,7 ± 0,8

M3 86,9 ± 3,0

M4 99,9 ± 3,8

M5 99,9 ± 5,7

MC 100 ± 2,0

Con respecto a este ensayo se observa de la tabla 23 que para todos los casos

exceptuando los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento) hay un alto porcentaje de

proliferación celular lo que indica que al estar en contacto las células con los extractos

de material estás han aumentado en cantidad, con el tiempo de incubación. Si se

comparan los resultados de actividad celular de las células en contacto con los

materiales y los del control negativo de citotoxicidad se puede ver que la proliferación

no llega al mismo nivel sin embargo su valor es muy similar aumentando a medida que

aumenta la concentración de Qo, sobre todo para los scaffolds con recubrimientos de

mayor concentración 1.5 y 2% de quitosano (M4 y M5) donde hay un alto porcentaje

incluso comparable con el control (MC). En resumen, a partir de los ensayos biológicos

realizados se puede llegar a la conclusión que la superficie de los scaffolds de HA con

156


Scaffolds de HA

recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones no son citotóxicos y mejoran la

proliferación celular osteoblástica, en todos los casos.

Las imágenes obtenidas al microscopio óptico en el ensayo de proliferación se muestran

en la figura 69 en un aumento de 20X, estas corresponden al cultivo de células Saos-2

en presencia de los scaffolds con y sin recubrimiento luego de 48 horas de incubación,

la imagen A pertenece a los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento), de la B a la E

scaffolds de HA con recubrimientos de 0.5, 1, 1.5 y 2% respectivamente y F serían las

células sin biomaterial en medio de cultivo.

Figura 69. Evaluación in vitro: Las imágenes corresponden al cultivo de células Saos-2 en presencia de los biomateriales luego de 48 horas de incubación. A: M1, B: M2, C: M3, D:

M4, E: M5 y F: Células sin biomaterial (Aumento 20X).

157


Scaffolds de HA

Los osteoblastos son células adherentes las cuales crecen en monocapa adheridas a un

sustrato. Por lo que su aspecto se ve plano y su núcleo es pronunciado. De la figura 69

(A) se observa que para los scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento) hay muy poco

crecimiento celular, una insignificante cantidad de células son observadas en el plato de

cultivo sin llegar a formarse una monocapa celular, lo que indica que para esta muestra

no existe proliferación celular activa.

Con respecto a los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo figura 69 (B-E) si se

observa una mayor proliferación llegándose a la confluencia celular en algunos casos,

sin embargo esta propagación se observa aún más en los scaffolds de HA recubiertos

con quitosano al 1,5 y 2%, lo que indica que estas concentraciones podrían indicar un

aumento en la osteoconductividad y osteoinductividad, factores importantes en la

osteointegración de los scaffolds. Sin embargo para determinar esto se deben

establecer curvas de crecimiento, que tienen el inconveniente de requerir de mucho

tiempo. Para los scaffolds con 0.5 y 1% de Qo aunque existe un grado un buen grado de

proliferación y adhesión, no son tan altos como el control. En general para todos los

platos de cultivo la morfología de las células no muestra modificaciones en ninguno de

los casos, tienen cuerpo celular ensanchado, multipolar, con pseudópodos.

Para el control (células sin biomaterial) figura 69 (F) el desarrollo del cultivo es óptimo y

hay una mayor cantidad de células con alta adhesión y ausencia de alteraciones

celulares internas o externas, se ha dado una proliferación muy activa, estando bien

unidas al sustrato y formándose una monocapa celular continua, esto es un

comportamiento normal cuando hay un medio de cultivo rico en nutrientes sin material

o un agente externo que interfiera en su diferenciación y crecimiento.

En general no se observan fenómenos de muerte celular por necrosis y/o apoptosis ni

alteraciones morfológicas celulares en ninguna de las imágenes pero en los scaffolds

patrón como se ha mencionado la proliferación se ve reducida en un alto porcentaje,

produciéndose pérdida de superficie ocupada por muerte celular.

4.4.3. Adhesión, interacción y morfología celular de los scaffolds de HA con

recubrimiento de Qo.

La evaluación cualitativa de la adhesión celular se basó en la observación al SEM de las

células sobre el material a estudiar. Estas células están especializadas en el

establecimiento y mantenimiento de la estructura de la matriz extracelular, en cuya

función son muy importantes las interacciones célula-célula y célula-sustrato. Esta es

una línea celular establecida, disponible y bien caracterizada la cual ha demostrado

resultados reproducibles en muchos experimentos. Se analizó la respuesta biológica de

158


Scaffolds de HA

células humanas con carácter osteoblástico sobre las cinco superficies de scaffolds para

determinar aquella con mejor comportamiento en términos de adhesión celular.

En las figuras 70 a 74 se muestran las fotografías obtenidas al SEM de colonización de

osteoblastos (Saos2) sobre los scaffolds evaluados (M1 a M5). La caracterización de las

muestras permitió establecer la morfología, uniformidad, y distribución de las células

sobre la superficie de los scaffolds con y sin recubrimientos de Qo.

Figura 70. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M1 (scaffold de HA patrón). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de

cultivo, aumentos de 1000 y 3000X.

159


Scaffolds de HA

Figura 71. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M2 (scaffold de HA con recubrimiento 0,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al

material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X.

160


Scaffolds de HA

Figura 72. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M3 (scaffold de HA con recubrimiento 1% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al


161


Scaffolds de HA

Figura 73. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M4 (scaffold de HA con recubrimiento 1,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al

material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000, 3000 y 4000X.

162


Scaffolds de HA

Figura 74. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M5 (scaffold de HA con recubrimiento 2% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al


163


Scaffolds de HA

Todos los scaffolds de las figuras 70 a la 74 mostraron estructuras con una porosidad

interconectada y la topografía irregular característica de este tipo de materiales

utilizados para la regeneración celular. Las propiedades de la superficie son esenciales

para la adhesión celular y la proliferación. Todas estas imágenes mostraron los scaffolds

con células o capas de éstas adheridas en su superficie, adecuadamente.

Los resultados de las fotografías para este ensayo mostraron, además, que la adhesión

de osteoblastos es favorecida por las superficies de los scaffolds de HA recubiertas con

las diferentes concentraciones de Qo, superando los scaffolds de HA patrón (figura 70).

Esto demuestra que las superficies con recubrimiento sobre todo a mayor

concentración de Qo tienen una mejor osteoinducción (figuras 73 y 74). Este

incremento posiblemente se debe a la interacción celular como consecuencia de las

características únicas de los scaffolds y en particular las propiedades superficiales por la

presencia del polímero (topografía, naturaleza química, mojabilidad y energía

superficial).

Los scaffolds de HA con y sin recubrimientos de Qo mostraron crecimiento adecuado de

células óseas. Sin embargo la incorporación de quitosano parece incentivar los procesos

celulares lo que se manifiesta en andamios con formación de matriz extracelular,

debido a que el depósito y maduración de la matriz ósea extracelular es más destacado

en los andamios con quitosano sobre todo para las concentraciones de 1, 1.5 y 2 %, con

una aparente adecuada distribución y cobertura de las células donde se aprecia mucho

mejor la formación de una monocapa celular perfectamente distribuida con presencia

de extensiones o filopodios que permiten la interacción célula-sustrato

adecuadamente.

Como se observa en las fotografías algunas células están aisladas o formando

agrupaciones. Para los scaffolds de HA patrón su morfología es globosa, poco aplanadas

y sin prolongaciones, lo que indica que ha habido poca diferenciación, proliferación

celular y una mínima adhesión al sustrato. Para los scaffolds de HA con Qo a menor

concentración (0,5%) las células son un poco menos elevadas, por tanto, viables,

aunque con un nivel bajo de adhesión al sustrato comparados con los demás. En las

imágenes con recubrimientos de Qo al 1, 1.5 y 2 % aunque existe un grado bueno de

proliferación y de adhesión, las células, aunque carecen de largas prolongaciones se

muestran aplanadas, exhibiendo morfologías particulares, específicamente para el Qo al

2% se ha dado una proliferación muy activa, estando bien unidas al sustrato y

formándose una monocapa celular continua sobre toda la superficie del scaffold.

164


Scaffolds de HA

A pesar que se evidenció depósito y maduración de matriz ósea extracelular en todos

los scaffolds, es evidente una diferencia entre los que tienen recubrimiento de Qo y el

patrón, donde se manifestó menor presencia de células inmersas en la matriz.

Cabe destacar que el tejido óseo está formado principalmente por las células óseas

(osteoblastos, osteocitos, células de recubrimiento y osteoclastos) y por su matriz

extracelular. La matriz ósea extracelular a nivel ultra estructural está constituida por

fibras de colágeno (en su mayoría tipo I) rodeadas e infiltradas por un compuesto

mineral formado principalmente por fosfatos de calcio, glicoproteínas transmembrana,

proteoglicanos y glicolípidos; la matriz extracelular interactúa con la célula cumpliendo

funciones de soporte y participando en procesos como migración, diferenciación y

comunicación [51]. Los scaffolds porosos de material compatible con la matriz

extracelular y presencia de estructuras compatibles con células inmersas dentro de ella

se depositan y se incluyen en el. Se observa en las fotografías que la mayoría de las

estructuras celulares dentro de su matriz, ocupan los espacios de los poros de los

scaffolds, estos dejan de permanecer abiertos y son reemplazándose por las células

conectadas entre sí.

Por último, es importante resaltar que los resultados dados por algunas técnicas de

caracterización mencionadas anteriormente como son DRX, FTIR y SEM son relevantes a

pesar de que no dan información con respecto a las variables respuesta, ya que éstas

dan una idea del comportamiento químico, físico y estructural de los scaffolds

permitiendo la identidad y composición química del material, la obtención de

información cualitativa y cuantitativa de los compuestos y la formación de enlaces, y

determinación de la presencia del recubrimiento de quitosano sobre la superficie de

éstos. Además, permitieron explicar su comportamiento superficial, mecánico y

biológico. Factores clave a la hora de seleccionar cuál de los tratamientos resultó ser el

más adecuado para su uso en ingeniería de tejidos óseo.

165


Scaffolds de HA


CAPÍTULO 4.

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Scaffolds de HA

CAPÍTULO 5.

CONCLUSIONES

Los métodos utilizados para la obtención de los scaffolds y sus recubrimientos

fueron sencillos, lo que aumenta su reproducibilidad. Los recubrimientos de

quitosano Qo fueron depositados sobre sustratos de hidroxiapatita HA con

ayuda de la técnica de inmersión. La formación de un film de quitosano

proporcionó una mejorada resistencia a la degradabilidad y mecánica, así como

una mejor capacidad biológica y de interacción celular en los scaffolds.

Se han obtenido estructuras recubiertas altamente porosas, utilizando el

método de gel casting/inmersión, las observaciones al SEM de la

microestructura indican una porosidad interconectada, una morfología y

tamaño de poro que logran generar un efecto importante en la adhesión celular,

la proliferación y la difusión de nutrientes haciendo a los scaffolds adecuados

para una potencial aplicación en la ingeniería de tejido óseo. La porosidad de los

scaffolds tiene una gran influencia en las propiedades mecánicas, ya que ésta es

uno de los principales inconvenientes con respecto a su aplicación en la

ingeniería de tejidos en condiciones donde se deben soportar altas cargas. La

adición de otro material polimérico como recubrimiento sobre los scaffolds de

HA ayudó a mejorar la resistencia a la compresión, pero la alteración de la

microestructura (tamaño y forma de poro, la interconectividad, etc) del material

fue inevitable, debido a que a medida que la concentración de Qo se

aumentaba, la posibilidad de presentar taponamiento en los poros era mayor.

Los recubrimientos de quitosano se desarrollan como una alternativa

prometedora para preservación y conservación de estructuras tridimensionales

con las ventajas de su bajo costo y facilidad de procesamiento. En el

recubrimiento de quitosano, las grandes moléculas de quitosano están ligadas y

deshidratadas para generar un recubrimiento osmótico. La superioridad de

estos recubrimientos radica en que permiten una dispersión uniforme de las

partículas y generan enlaces de hidrógeno con moléculas de quitosano a través

del grupo hidroxilo de la superficie, lo que significa la posibilidad de

proporcionar mejores propiedades mecánicas y una buena permeabilidad. En el

proceso de conservación o protección, los recubrimientos de quitosano

suprimen el tránsito del oxígeno, dióxido de carbono y vapor de agua y por tanto

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Scaffolds de HA

restringen el deterioro del material base, esto se pudo observar en las pruebas

de degradabilidad.

El ensayo MTT en scaffolds de HA recubiertos con Qo no ha mostrado toxicidad

para ninguna de las concentraciones usadas, lo cual es un requisito esencial para

su potencial aplicación biomédica. Sin embargo, los resultados negativos en los

ensayos de citotoxicidad para los scaffolds de HA usados como patrones (sin

recubrimiento), da una idea que se debe tener mayor cuidado en la síntesis

inicial y revisar los protocolos existentes en la literatura ya que a pesar de la

protección que genera el recubrimiento, si estos presentan productos

intermedios tóxicos pueden involucrar la biocompatibilidad de los scaffolds a

largo plazo.

La obtención de recubrimientos de Qo sobre scaffolds de HA con el método de

inmersión ha sido poco estudiado lo que resulta interesante debido a que se

logra obtener información relevante de propiedades como la adhesividad y el

tipo de interacción que presenta este polímero sobre sustratos cerámicos como

la HA, de la cual no se encuentra mucha información en la literatura.

Con respecto a la concentración y el tiempo de inmersión de los scaffolds en la

solución de quitosano, a pesar de que en general todos los scaffolds

presentaron buenas propiedades físico-químicas, biológicas y mecánicas, los que

tenían mayores concentraciones de Qo y tiempos de inmersión (1.5% y 2% y 20

min) presentaron las mejores características para ser usados como scaffolds en

regeneración de tejido óseo, debido a sus excelentes propiedades

oseoinductivas obtenidas en las pruebas de viabilidad, proliferación y adhesión

celular así como sus propiedades mecánicas (resistencia a la compresión y

módulos elásticos muy cercanos al hueso).

evaluaciÓn de las propiedades fÍsico-quÍmicas,...

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