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FERNANDA CARREGARO
Estudo das proteínas pequenas ricas em prolina (SPRRs) em câncer de cabeça e pescoço
Study of Small Proline Rich Proteins (SPRRs) in Head and Neck Cancer.
São Paulo 2012
RESUMO
As proteínas pequenas ricas em prolina (small proline-rich protein/SPRRs)
compreendem uma sub-classe específica de precursores da camada córnea, codificadas
por uma família multi-gênica do complexo de diferenciação epidérmica mapeado no
cromossomo 1q21. Vários estudos têm sugerido que as SPRs estão relacionadas com
proliferação epitelial elevada e processos malignos. O presente trabalho teve como
objetivo investigar a participação das SPRs no desenvolvimento de carcinomas
epidermóides de cabeça e do pescoço e no fenótipo da célula neoplásica. O perfil de
expressão de onze genes SPRRs foi avaliado em cinco linhagens celulares (FADU,
HEP-2, UM-SCC-38, SCC-9) e em carcinomas primários da cabeça e pescoço, utilizando
PCR em tempo real. Os tumores foram classificados em agressivos (A) e menos
agressivos (LA) dependendo da presença ou da ausência de células neoplásicas nos
nódulos linfáticos regionais. Os resultados revelaram baixa expressão de genes SPRRs
em todas as linhagens celulares, exceto o SPRR4. Por outro lado, foram observados
níveis elevados de transcritos de SPRR2G, SPRR4 e SPRR2E e níveis reduzidos de
transcritos de SPRR3 tanto nos grupos A e LA de carcinomas. A expressão ectópica de
SPRR2E resultou em menor capacidade de invasão celular em ensaio de câmara de
Boyden, bem como em mudança do fenótipo epitelial para fibroblastóide, mas não afetou
a proliferação celular ou a migração. Após o tratamento das células HEP-2 com a
proteína anti-inflamatória anexina A1 (peptídeo AC2-26), ocorreu um aumento
substancial de expressão da maioria dos SPRRs, sugerindo uma associação entre SPRs
e inflamação.
Os genes SPRRs possuem sequências altamente conservadas e, após uma
análise filogenética utilizando o método de neighbor-joining, os resultados indicaram um
grupo homogêneo, que incluiu SPRR2 e SPRR4, e um grupo mais heterogêneo com
SPRR1 e SPRR3. Aparentemente, a diversidade de sequência destes genes é baixa.
Isto sugere que o controle da dosagem da proteína pode ser mais importante para o
desempenho de sua função que a complexidade estrutural.
A compreensão da função das SPRs avançou bastante nos últimos anos, mas
muitas questões sobre o seu papel no processo neoplásico ainda permanecem sem
resposta. Muitos dados são ainda necessários para identificar sua associação com
outras proteínas e com vias de sinalização. Portanto, é importante melhorar nosso
conhecimento sobre a regulação e a função de cada RPN, para que as descobertas
obtidas na pesquisa básica sejam traduzidas em aplicações clínicas.
ABSTRACT
The small proline rich proteins (SPRs) constitute a specific sub-class of cornified
cell envelope precursors, encoded by a multi-gene family which are part of the epidermal
differentiation complex on chromosome 1q21. Several studies have suggested that the
SPRs are related to increased epithelial proliferation and to malignant processes. The
present work aimed to investigate the participation of SPRs in the development of head
and neck squamous cell carcinomas and in the phenotype of the neoplastic cell. The
expression profile of eleven SPRRs genes was evaluated in five cell lines (FaDu, HEP-2,
UM-SCC-38, SCC-9) and in primary carcinomas from head and neck, using real time
PCR. The tumors were classified as aggressive (A) and less aggressive (LA) depending
on the presence or absence of neoplastic cells in the regional lymph nodes. The results
revealed low expression of SPRRs genes in all cell lines, except SPRR4. Otherwise, high
levels of SPRR2G, SPRR4 and SPRR2E and low levels of SPRR3 transcripts were
observed in both A and LA carcinomas. Ectopic SPRR2E expression resulted in reduced
cell invasion evaluated by a Boyden chamber assay together with morphologic changes
from epithelial to fibroblast–like phenotype, but did not affected cell proliferation or
migration. After treatment of HEP-2 cell line with the anti-inflammatory protein annexin A1
(peptide Ac2-26), there was a substantial increase of expression of most SPRRs,
suggesting an association between SPRs and inflammation.
The SPRRs genes have highly conserved sequences and, after a phylogenetic
analysis using the neighbor-joining method, the results indicated a homogeneous group
including SPRR2 and SPRR4, and a more heterogeneous group with SPRR1 and
SPRR3. Apparently, the sequence diversity of these genes is low. This suggests that the
control of protein dosage may be more important to the performance of their function than
the structural complexity.
The understanding of the function of SPRs has advanced in the past years but
many questions on their role in the tumorigenic process still remain unanswered. Much
more data are required to recognize their association to other proteins and signaling
pathways. Therefore, it is important to improve our knowledge on the regulation and
function of each SPRs in order to translate findings from basic research into clinical
applications.
I – INTRODUÇÃO
Aspectos básicos dos tecidos epiteliais normais
Os tecidos de vertebrados são didaticamente divididos em dois grandes grupos: os
epiteliais, geralmente com pouca substância intercelular, e os mesenquimais que, ao
contrário, são mais ricos em material extracelular (Junqueira & Carneiro, 2004).
Os tecidos epiteliais são formados por células cubóides ou colunares ligadas entre si
por meio de estruturas de adesão. Suas características morfológicas, como forma das
células e estratificação, variam com a função que desempenham e compreendem a base da
classificação desses tecidos. Em geral são agrupados em epitélio simples e estratificado e
em um tipo intermediário denominado transicional. O primeiro deles apresenta uma camada
de células em contato com a membrana basal e pode exibir um aspecto pseudoestratificado
quando os núcleos se encontram em níveis variáveis. No estratificado, somente as células
das camadas inferiores estão ligadas à membrana basal e são mitoticamente ativas,
enquanto as do estrato intermediário sofrem processos de diferenciação. Quando
queratinizadas (queratinócitos), as células do estrato superficial podem morrer se também
corneificadas pela adição de uma camada proteinácea na superfície citoplasmática da
membrana celular (revisto por Bragulla & Homberger, 2009). Um resumo da classificação
dos epitélios e exemplos de localização no organismo são apresentados na Figura 1.
O citoesqueleto das células epiteliais é formado pela interação de microfilamentos,
microtúbulos e filamentos intermediários. Os microfilamentos são formados por moléculas de
actina globular (G-actina) reunidas em actina filamentosa (F-actina) e se ancoram à
membrana celular por proteínas como as plectinas. Os microtúbulos resultam da associação
de moléculas de - e -tubulina e compreendem as maiores estruturas filamentosas do
citoesqueleto. Os filamentos intermediários, ao contrário dos anteriores, não são polarizados
e agregam-se em feixes de diâmetro variável que servem de arcabouço para os demais
componentes do citoesqueleto, mas também são fundamentais para traduzir estímulos do
ambiente em mudanças de expressão gênica. Nas células epiteliais, os filamentos
intermediários são formados por queratinas encontradas apenas em vertebrados (revisto por
Bragulla & Homberger, 2009).
Os epitélios revestem superfícies internas e externas do organismo, formam glândulas,
separam compartimentos, regulam a troca de moléculas e atuam como órgãos sensoriais.
Um dos melhores exemplos é a epiderme, um epitélio estratificado queratinizado
corneificado que, juntamente com seus apêndices (penas e escamas em aves e répteis,
pelos e unhas em mamíferos), teve um papel importante na colonização do ambiente
terrestre durante a evolução. Esse tecido se especializou em defender o organismo de
insultos externos, incluindo danos físicos (injúria mecânica, radiação ultravioleta/UV),
químicos (substâncias irritantes, alergênicas, espécies reativas de oxigênio/ROS), infecção
por microorganismos (bactéria, fungo e vírus), perda de água e calor (Proksch, 2008). Essa
proteção é dada particularmente para as camadas celulares suprabasais por diferentes
enzimas destoxificantes e de reparo bem como por proteínas e vitaminas antioxidantes,
reduzindo os riscos de carcinogênese (Schafer & Werner, 2011).
Diferentemente da epiderme, outros tecidos epiteliais estratificados são não-
queratinizados e revestem superfícies internas do organismo, incluindo parte da cavidade
oral, esôfago e trato anogenital, que não estão submetidas ao mesmo grau de trauma
mecânico que a pele. Os epitélios simples não estratificados, por outro lado, se
especializaram em funções de absorção ou secretórias e revestem órgãos como o intestino,
o fígado e o rim (revisto por Presland & Dale, 2000; Presland & Jurevic, 2002; McLean,
Irvine, 2007).
Muito do conhecimento atual sobre a organização e as funções dos tecidos epiteliais
deriva de estudos de doenças hereditárias ou fortemente associadas a fatores ambientais.
Com a utilização de ferramentas de Biologia Molecular tem sido possível estudar animais
modelo e investigar a estrutura de proteínas produzidas por esses tecidos e entender sua
estrutura e funcionamento.
O processo de diferenciação das células epiteliais
A diferenciação celular no epitélio tem início com a migração de células da membrana
basal para as camadas superiores. Em sequência, ocorre perda de atividade mitótica,
diferenciação e morte celular, cada fase caracterizada pela presença de proteínas
específicas (Candi et al., 2005). Embora a proliferação seja característica das camadas mais
basais, onde as células pluripotentes devem residir, figuras mitóticas podem também ser
detectadas em camadas mais superficiais durante processos de cicatrização, neoplásicos e
inflamatórios (Alberts et al., 2002).
Nos epitélios estratificados queratinizados, como a epiderme e a mucosa da gengiva e
do palato duro, as células seguem um programa de diferenciação que resulta na formação
de uma superfície mecanicamente resistente, composta de células mortas corneificadas,
sem núcleo e sem organelas citoplasmáticas, preenchidas por filamentos de queratina
(revisto por Presland & Dale, 2000; Presland & Jurevic, 2002).
As queratinas são as proteínas predominantes do citoesqueleto em todos os epitélios.
Pertencem à superfamília de filamentos intermediários e são classificadas em tipo I (ácidas)
e II (básicas) de acordo com suas propriedades bioquímicas e seqüência de aminoácidos.
São resistentes à digestão pelas proteases tripsina e pepsina e são insolúveis em ácidos
diluídos, álcalis, água e solventes orgânicos, mas solúveis em uréia (Steinert et al., 1982;
Steinert et al., 1985). Reúnem-se aos pares para compor filamentos que se estendem do
núcleo até a membrana, formando estruturas para suportar o estresse e manter o formato e
a viabilidade das células (Steinert, 2001).
Os filamentos de queratina são ancorados a complexos de adesão no lado interno da
membrana celular, tais como os desmossomos, assegurando que os queratinócitos
permaneçam conectados e que ocorra transferência de forças mecânicas entre células
vizinhas (Hanakawa et al., 2002). Os desmossomos são formados por dois grupos principais
de proteínas: as proteínas de adesão transmembrânicas da família das caderinas
(desmogleínas e desmocolinas) e as proteínas citoplasmáticas de ancoragem (como
placoglobina, desmoplaquina, placofilina, envoplaquina e periplaquina) (Alberts et al., 2002;
Presland & Jurevic, 2002).
Os tecidos epiteliais expressam diferentes pares de queratina dependendo do tipo de
célula e do estágio de diferenciação. A maioria dos epitélios estratificados expressa o par de
queratinas 5 e 14 (K5/K14) na camada basal proliferativa. As camadas suprabasais,
normalmente pós-mitóticas e em processo de diferenciação, expressam outros pares de
queratinas. Por exemplo, na epiderme, são expressas as queratinas K1 e K10 enquanto, na
mucosa oral, são expressas K4 e K13 (Figura 2) (Bragulla, Homberger, 2009; Presland;
Jurevic, 2002).
Em paralelo à síntese de queratinas específicas, as células epiteliais produzem outras
proteínas bem como lipídeos. Em estágios avançados da diferenciação, as células adquirem
grânulos querato-hialinos com profilagrina, o precursor da filagrina, que é responsável pela
agregação de filamentos de queratina em pacotes densos. Essa agregação promove o
colapso da célula em uma forma achatada característica das camadas superficiais e inicia o
processo de corneificação (Candi et al., 2005), com síntese de uma série de proteínas. Entre
elas, estão a loricrina (a mais abundante), a involucrina, as proteínas pequenas ricas em
prolina (small proline-rich protein / SPRs) e as LEPs (late envelope proteins) (Kalinin et al.,
2001; Marshall et al., 2001). Essas proteínas unem-se por ligações dissulfeto e
isopeptídicas, catalisadas por transglutaminases dependentes de cálcio (Steinert; Marckov,
1995), resultando em um envelope protéico insolúvel, ideal para a função protetora dos
tecidos subjacentes (Martinet et al., 1990). Pelo menos na epiderme, esse processo parece
depender da ativação de Notch, uma família de proteínas transmembrânicas que atuam na
sinalização celular e podem induzir ativar genes do programa de diferenciação (Okuyama et
al. 2008).
A Figura 3 mostra as camadas celulares do epitélio queratinizado durante a
diferenciação e suas proteínas.
Figura 2: Estrutura de epitélio estratificado (A) queratinizado da epiderme e de alguns sub-sítios da cavidade bucal e (B) não-queratinizado da mucosa oral, indicando os tipos de queratinas (K) e as queratinopatias associadas aos genes dessas queratinas. IBS, ictiosa bolhosa de Siemens; EHK, hiperqueratose epidermolítica; PC-1, paquioníquia congênita tipo I; EB simplex, epidermólise bolhosa simplex (modificado de Presland; Jurevic, 2002).
A B
Figura 1: Classificação dos epitélios em simples, transicional e estratificado corneificado e queratinizado, e exemplos de cada classe (modificado de Presland; Jurevic, 2002; Bragulla, Homberger, 2009, Candi et al., 2005).
Epitélio transicional
Epitélio da bexiga
urinária
Epitélio simples
Endotélio
Mesotélio
Epitélio da traquéia
Células secretoras das
glândulas salivares
Epitélio estratificado
queratinizado ou
corneificado
Gengiva e palato duro
Epiderme
EPITÉLIO
A B
Figura 3: Camadas celulares do tecido epitelial queratinizado durante o processo de diferenciação e proteínas presentes em cada uma delas (modificado de Candi et al., 2005). K=queratina; TG=transglutaminase; SPR= proteínas pequenas ricas em prolina
O processo de formação do envelope corneificado da epiderme foi resumido por
Kalinin et al. (2001) em três etapas principais (Figura 4). Na primeira etapa, a
periplaquina e a envoplaquina, juntamente com a involucrina, associam-se com a
membrana plasmática em uma maneira dependente de cálcio. Nesse momento, a
tranglutaminase 1 é expressa e liga-se à membrana onde promove ligações cruzadas
entre as plaquinas, a involucrina e outras proteínas desmossômicas, o que resulta em
mudanças drásticas nas propriedades dinâmicas das junções celulares e nas interações
do citoesqueleto. Em uma segunda etapa, as células das camadas suprabasais
acumulam corpos lamelares, derivados do complexo de Golgi, que contêm lipídeos
posteriormente liberados no meio extracelular após fusão desses corpos lamelares com a
membrana plasmática. Na etapa final, a transglutaminase 3 promove ligações cruzadas
entre a loricrina, que é insolúvel, e a as SPRs, que são muito solúveis. Isto resulta na
solubilização da loricrina. Ao mesmo tempo, a maioria das organelas, microtúbulos,
microfilamentos e outras proteínas juncionais são degradadas. Os filamentos de
queratina consistindo principalmente dos tipos 1, 2e e 10, ligam-se às moléculas
remanescentes de plaquinas, involucrina, loricrina e SPRs. As células mortas
corneificadas mostram basicamente pacotes de filamentos intermediários e estão
embebidas em lamelas lipídicas, formando uma barreira mecânica permeável à água.
K5, K14, TG2
TG1, TG5
DESMOGLEÍNA-2,-3, 4
TG3, K1, K10, DESMOGLEÍNA-1
DESMOCOLINA-1
LORICRINA, PROFILAGRINA, INVOLUCRINA, SPRs
INVOLUCRINA LIPÍDEOS
LORICRINA
FILAGRINA K
DIF
ER
EN
CIA
ÇÃ
O T
ER
MIN
AL
Figura 4: Etapas da formação do envelope corneificado das células da epiderme, segundo Kalinin et al. (2001), com modificações.
Os genes que codificam as proteínas exclusivas do envelope corneificado (loricrina,
SPRs, involucrina e LEPs) possuem uma organização similar e estão mapeados em uma
mesma região cromossômica (1q21) conhecida como “complexo de diferenciação da
epiderme” (Mischke et al., 1996; Martin et al., 2004). Da mesma forma, sua estrutura
protéica apresenta semelhanças, com alto conteúdo de lisina e glutamina. Essas
características sugerem que esse grupo evoluiu de um gene ancestral após várias
duplicações (Figura 5) (Backendorf & Hohl, 1992).
As proteínas pequenas ricas em prolina (SPRs)
As proteínas SPRs compreendem uma sub-classe específica de precursores da
camada córnea, codificados por uma família multi-gênica mapeada no complexo de
diferenciação epidermal (Figura 6A) (Gibbs et al., 1993). Essa família compreende onze
membros, todos com dois exons constitutivos, o segundo com a região codificadora
completa. São eles: dois genes SPRR1 (A e B) sendo que o SPRR1A possui duas
isoformas, seis genes SPRR2 (A, B, D, E, F, G), um único gene SPRR3 (também com
duas isoformas) e um SPRR4, além de um pseudogene SPRR2C (Gibbs et al., 1993;
Cabral et al., 2001; Fischer; Backendorf, 2007). As sequências nucleotídicas das
isoformas de SPRR1A possuem similaridade acima de 90%, mas os produtos proteicos
são idênticos; o mesmo é válido para as isoformas de SPRR3 (Gibbs et al., 1993; De
Heller-Milev et al., 2000).
As proteínas SPRs (6 a 18 kDa) possuem uma estrutura similar, com os terminais
amino e carboxila ricos em lisina (K) e glutamina (Q), e um domínio central de motivos
turn- , com 2-20 repetições de oito ou nove unidades ricas em prolina (P) (Figuras 6B e
7). As regiões ricas em lisina e glutamina dos N- e C-terminais são substratos de
transglutaminases para ligações cruzadas, que criam uma rede de proteínas,
particularmente com a abundante loricrina, e conferem resistência mecânica ao envelope
córneo (Steinert et al., 1998; Kartasova et al., 1996). O domínio central, rico em glicina
(G) e serina (S), forma uma estrutura flexível não organizada, que contribui para a
elasticidade do envelope (Candi et al., 2005).
Embora os N- e C-terminais mostrem similaridade com outras proteínas (como
involucrina e loricrina), a região central varia tanto no número de repetições quanto na
seqüência consenso e é responsável pela classificação das SPRs (Cabral et al., 2001;
Backendorf et al., 1992). Uma das classificações proposta (Cabral et al., 2001) considera
dois grupos de SPRs: o primeiro (SPR-1A ou cornifina-A ou 19kDa pancornulina; SPR-
1B, SPR-3 ou esofagina ou cornifina-B ou 22KDa pancornulina; e SPR-4) caracterizado
por N-terminal longo e C-terminal curto, um motivo repetido de 8 aminoácidos e maior
diversidade na região central, e o segundo grupo (SPR-2) caracterizado por N-terminal
curto e C-terminal longo e um motivo repetido de 9 aminoácidos.
Figura 5: Diagrama hipotético mostrando a evolução dos genes SPRRs, involucrina e loricrina a partir de um ancestral comum. Os domínios N- e C- terminal, conservados em cada proteína, estão representados por quadrados. O domínio central com repetições está representado pelos símbolos: triângulo (loricrina); losango (involucrina); círculos (SPRR1, SPRR2 e SPRR3). A letra n representa o número de repetições: 6 para SPRR1, 3 para SPRR2, 14 para SPRR3, e 39 para involucrina. As setas pontilhadas indicam uma rota alternativa, que liga a evolução das SPRR1 e SPRR3 com a involucrina (duplicação do domínio N-terminal). H, similaridade entre os membros da mesma sub-família. D, divergência dos genes (modificado de Gibbs et al., 1993).
Loricrin Involucrin SPRR3 SPRR1 SPRR2
progenitores
ancestrais
Figura 6: (A) Representação esquemática do complexo de diferenciação epidermal no cromossomo 1 (1q21), 151,930,000-153,620,000 pb, mostrando a posição dos genes SPRRs. (B) Alinhamento das sequências de aminoácidos das proteínas SPRs. Os N- e C-terminais são indicados por seta dupla e os aminoácidos idênticos em uma posição específica em pelo menos cinco SPRs são mostrados em cinza. As repetições de 8-9 aminoácidos são indicados por retângulos nas sequências de SPR-IA, SPR-2A, SPR-3 e SPR-4 (modificado de Henry et al., 2012).
A
B
SPR-1A SPR-1B SPR-2A SPR-2B SPR-2D SPR-2E SPR-2F SPR-2G SPR-3 SPR-4
SPR-1A SPR-1B SPR-2A SPR-2B SPR-2D SPR-2E SPR-2F SPR-2G SPR-3 SPR-4
SPR-1A SPR-1B SPR-2A SPR-2B SPR-2D SPR-2E SPR-2F SPR-2G SPR-3 SPR-4
cromossomo 1
S100 – fusão LCE SPRs
involucrina loricrina
S100
Figura 7: (A) As proteínas SPRs possuem 3 domínios: N-terminal, central e C-terminal. O domínio central não possui uma estrutura ordenada e mostra alta motilidade. (B) Os resíduos utilizados pelas transglutaminases (setas) estão principalmente localizados nos N-e C-terminais. (C) As regiões ricas em glutamina (Q) e lisina (K) (em azul) dos N- e C-terminais são substratos de transglutaminases para ligações cruzadas, que criam uma rede de proteínas e conferem resistência mecânica ao envelope córneo. O domínio central, rico em glicina e serina (em vermelho), forma uma estrutura flexível não organizada, que contribui para a elasticidade do envelope (modificado de Candi et al., 2005).
A
B C
N - TERMINAL DOMÍNIO CENTRAL C - TERMINAL
N - TERMINAL DOMÍNIO CENTRAL C - TERMINAL
EXPANSÃO
A ativação dos genes SPRRs é modulada in vitro por fatores indutores de
diferenciação, como forbol, retinóides, monofosfato de adenosina (AMP) cíclico e
interferon (Candi et al., 2005). Sua expressão também é afetada in vivo por radiação
UV, especialmente no caso dos genes SPRR2 (Tong et al., 2006).
A análise do promotor de SPRR2A, SPRR3, SPRR1A e 1B tem revelado a
presença de sítios Oct-11, Ets, AP-1, ATF, ISRE, TRE e GC Box que se ligam a
diferentes fatores de transcrição (Fischer et al., 1996; 1999; Sark et al., 1998; Reddy et
al., 2003). Mais recentemente, Fischer e cols. (2007) detectaram elementos de resposta
dependentes de cálcio no promotor do SPRR3, reforçando a idéia de que esses íons
possuem um papel importante na regulação das SPRs e na diferenciação terminal dos
queratinócitos. A participação de diferentes elementos no controle da expressão dessa
família gênica sugere que, durante sua evolução, a diversidade das seqüências
reguladoras recebeu mais atenção que a diversificação da estrutura. Isso implica que o
controle da dosagem protéica é mais importante para o desempenho de sua função que a
complexidade estrutural (Cabral et al., 2001).
As classes de SPRs mostram um padrão altamente específico de expressão
diferencialmente regulada em vários tipos de epitélio durante o envelhecimento ou em
situações de doenças e, como já referido acima, em resposta a estímulos ambientais
(revisto por Fischer et al., 1996). Sua seqüência contém resíduos de serina e treonina
que são substratos para quinases e, portanto, podem ser fosforilados em cascatas de
sinalização (Fischer et al., 1999).
A proteína SPR-I tem sido observada em epiderme e mucosa oral, incluindo língua
e gengiva, a SPR-2 em epiderme folicular e interfolicular e em papilas linguais e a SPR-3
não tem sido detectada na epiderme, mas está presente em epitélio escamoso interno
como o da cavidade bucal e do esôfago (Hohl et al, 1995; De Heller-Milev et al., 2000;
Lee et al., 2000). O banco de dados UNIGENE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)
confirma a presença de transcritos desses genes em vários sítios anatômicos,
principalmente em cavidade oral, laringe e faringe.
São interessantes as referências de expressão das SPR em órgãos nos quais não
há epitélio escamoso estratificado, como útero (Song et al., 1999) e ovário de roedores
(Tesfaigzi, Carlson, 1996b). No momento, não existem explicações para esses achados,
mas é possível que tais proteínas levem à predisposição de metaplasia escamosa nesses
tecidos (Jetten et al 1996; Song et al., 1999) ou estão envolvidas em morte celular
programada e adaptação a estímulos ou insultos (Cabral et al., 2001).
Em condições de doença, a SPR-I e a SPR-2 foram observadas em epiderme
psoriática em níveis muito mais altos que em epiderme normal (Hohl et al, 1995; Hoffjan
& Stemmler, 2007) e em muitas outras lesões inflamatórias de pele (De Heller-Milev et
al., 2000; Jarzab et al., 2010). Associação de psoríase com polimorfismos nos genes
SPRRs também já foram citadas (Kainu et al., 2008).
Os transcritos de SPRR1 já foram detectados com níveis elevados em
camundongos expostos à fumaça do cigarro (Tesfaigzi et al., 1996). Do mesmo modo,
um aumento da expressão de SPR-2 no intestino delgado foi referida após indução de
inflamação gastrointestinal por substâncias alergênicas (Zimmermann et et al., 2005) e a
SPR-1 em metaplasia escamosa ocular autoimune (Li et al., 2008). Esses achados
podem estar relacionados com a ativação da proliferação epidérmica e com a presença
de citocinas inflamatórias, ou com a ativação de elementos que respondem a hormônios
(Oct-11) ou interferon (ISRE) presentes na região promotora de SPRRs (De Heller-Milev
et al., 2000).
Em relação a processos neoplásicos, a literatura é relativamente escassa. Em uma
busca no banco de dados MEDLINE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) limitada para
humanos e utilizando os termos MESH “Cornified Envelope Proline-Rich Proteins” e
“Neoplasia”, foram obtidos 32 artigos (acessado em 08/07/2012), alguns deles não
diretamente relacionados com as proteínas SPRs. Um resumo dos dados é apresentado
na Tabela 1 e alguns desses artigos são comentados a seguir.
Por exemplo, Cho e colaboradores (2010) detectaram expressão elevada de SPR-3
em tumores colorretais, o que foi associado a invasão linfovascular. Esses autores
também observaram que a indução de expressão dessa proteína resultava em
proliferação celular acelerada, ativação da via AKT e níveis de p53 diminuídos. O mesmo
foi referido em câncer de mama por Kim e colaboradores (2012), mas com associação a
estágios menos avançados da doença. Por outro lado, níveis baixos de SPR-3 (Abraham
et al. 1996, Zhang et al. 2008; Zinovyeva, 2010) foram detectados em carcinomas de
esôfago, ao contrário dos tecidos normais correspondentes.
Em relação a outras SPRs, tanto expressão elevada da proteína (SPR-I) como
expressão diminuída de transcritos (SPRR1A e SPRR2A) foram descritas pela literatura
em carcinomas epidermóides de pulmão (Hu et al, 1998) e de esôfago, respectivamente
(Luo et al., 2004).
Na carcinogênese cutânea, De Heller-Milev e colaboradores (2000) observaram
expressão diferencial de SPRR3 em queratoacantoma, ceratose liquenóide, doença de
Bowen e carcinoma epidermóide de pele, e concluíram que essa proteína pode ser
utilizada como diagnóstico.
Em relação aos carcinomas de cabeça e pescoço, Nishitani e colaboradores (2002),
estudando queratinócitos humanos orais normais antes e após imortalização por HPV 16,
observaram uma expressão basal alta de SPR-2 nesses últimos, associada com
proliferação celular e sugeriram sua participação em estágios iniciais da carcinogênese
oral. Resultados opostos foram observados Lohman e colaboradores (1997b), que
detectaram níveis reduzidos de SPR-2 em linhagens de queratinócitos derivadas de
carcinoma epidermóide de língua e pele. Dois estudos de nosso grupo (Silveira et al.,
2008; Polachini et al., comunicação pessoal) também revelaram baixos níveis de
transcritos dos genes SPRR2F, SPRR2E e SPRR3 em bibliotecas SAGE de tumores de
laringe, ou da proteína SPR-3 em carcinoma oral, respectivamente. Em vista dos
resultados contraditórios e escassos da literatura e considerando a freqüência desses
carcinomas na população, torna-se interessante a investigação do papel das proteínas
SPRs no fenótipo celular de carcinomas de cabeça e pescoço.
Tabela 1. Alterações de expressão dos genes SPRRs e de seus produtos em neoplasias e linhagens celulares.
Estudo No. de amostras
Tecido de origem de linhagens (L) Lesão pré-maligna ou Tumor primário (T)
Tecido normal (N)
Linhagem celular/outras Nível de expressão de genes SPRRs e de seus produtos SPRs
Elevado Reduzido
Robinson et al. (1994) 3 (T) Queratocisto odontogênico SPR-1A
Yaar et al. (1995) 1 (N) Queratinócitos normais (L) Carcinoma de pele
SCC12F SPRR1
Abraham et al. (1996) 6 (T) Carcinoma de esôfago SPRR3
Lohman et al. (1997) (L) Carcinoma de língua (L) Carcinoma de pele (L) Queratinócitos normais
SCC4, SCC12B2, SCC12F2, SCC13 SCC15 NHK
SPRR2
Fujimoto et al. (1997) 11 Pele - Doenças inflamatórias e proliferativas (N) Mucosa oral normal e pele normal
SPRR1A SPRR1B
Hu et al. (1998) 63 (T) Carcinoma de pulmão SPR-1
DeMuth et al. (1998) (L) Epitélio brônquico maligno (L) Epitélio brônquico normal
H446, H82, N417, A549, A427, H2126, Calu-1, SW900, H520, H322, H661, H460
SPRR1
De Heller-Milev et al. (2000) 80 Pele – Dermatoses (T) Doença de Bowen, queratoacantoma, carcinoma
SPR-1 e SPR-2 SPR-3
Zucchini et al. (2000) 6 (T) Carcinoma anal SPRR2A
Lau et al. (2000) (L) Carcinoma broncogênico (L) Epitélio traqueobronquial
HTBE, HBE1, BEAS-2B H460
SPRR1 e SPR-1
Lee et al., (2000) (L) Queratinócitos normais de gengiva NHGK SPR-1
Patterson et al. (2001) (L) Epitélio brônquico e queratinócitos normais (L) Diferentes neoplasias
HBE1, BEAS-2B A549, NCI-H520, H358, A431, H661, Caco-2, A172
SPRR1B
Nishitani et al. (2002) (L) queratinócitos orais imortalizados por HPV (L) Queratinócitos orais normais
HOK16E6E7 NHOK
SPRR2
Jarnik et al. (2002) 1 (N) Pele normal de camundongos knockout para loricrina
SPR-1
Tesfaigzi et al. (2003) (T) Carcinoma de pulmão (L) Carcinoma de pulmão e ovário
CL25, I033, NCIH596, SK-MES-1, CHO
SPRR1B
Katou et al. (2003) 21 (N) Pele normal SPR-2 SPR-3
Luo et al. (2004) 8 (T) Carcinoma de esôfago SPRR1A e SPRR2A
Kimchi et al. (2005) 24 (T) Carcinoma de esôfago (T) Metaplasia de Barretts
SPRR3
Tong et al. (2006) 1 (L) Epitélio córneo normal HCEC SPR-1 e SPR-2
Li et al., 2008 68 (T) Metaplasia escamosa ocular SPRR1B
Zhang et al. (2008) 8 (T) Carcinoma de esôfago (L) Carcinoma de esôfago
EC9706, KYSE30, KYSE150 KYSE180, KYSE410, KYSE450, KYSE510,NEC
SPR-3
Silveira et al. (2008) 3 bibliotecas SAGE
3 (T) Carcinoma de laringe Bibliotecas SAGE de laringe SPRR2F, SPRR2E e SPRR3
Maru et al. (2009) 11 (T) Carcinoma de esôfago SPRR2C
Cho et al. (2010) 35 (T) Carcinoma colorretal (L) Carcinoma colorretal (L) Cólon normal
FHC, CCD841, AMC5 SPR-3
Jarzab et al. (2010) 33 Pele - Dermatite atópica SPRR1A e SPRR2C
Zinovyeva et al. (2010) 21 (T) Carcinoma de esôfago SPRR3
de A Simão et al. (2011) 84 (T) Carcinoma de esôfago SPRR3 isoforma 1
Pasini et al. (2012) 69 (T) Carcinoma de cavidade oral SPRR2B
Kim et al. (2012) 241 (T) Carcinoma de mama SPRR3
Carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é uma neoplasia maligna que
atinge a cavidade oral, a faringe e a laringe. Compreende 95% de todos as neoplasias de
cabeça e pescoço e é o sexto tipo mais frequente de câncer. São esperados
aproximadamente 600 mil novos casos por ano no mundo, dos quais dois terços com lesões
em estágios avançados ao diagnóstico e/ou envolvimento de linfonodos regionais (Yan et al.,
2010) e apenas 40-50% com sobrevida acima de 5 anos (revisto por Leemans et al., 2010).
No Brasil, são estimados para o ano de 2012 cerca de 14 mil novos casos de câncer oral e 6
mil de laringe (Ministério da Saúde, 2012).
Os principais fatores de risco para CECP são o tabagismo e o consumo de bebidas
alcoólicas (Hashibe et al., 2009). Existem fortes evidências, tanto epidemiológicas quanto
experimentais, de que a infecção por papilomavírus (HPV) do tipo 16 também é responsável
por uma fração dos tumores de cabeça e pescoço, em especial os de orofaringe (IARC,
2007).
A conduta clínica do CECP ainda é difícil apesar do grande avanço na compreensão
de sua etiologia. Não existem ainda terapias eficazes e pouco agressivas que atuem apenas
nas células malignas e não tenham qualquer efeito sobre as células normais (Mehrotra et al.,
2011). Embora lesões iniciais sejam mais facilmente tratadas e curadas, sua detecção não é
simples e suas características morfológicas não possuem valor prognóstico suficiente para
cálculo do risco da doença (Molinolo et al., 2009).
A evolução clínica e a resposta à terapia dos CECPs são bastante variáveis, mesmo
nos casos histologicamente semelhantes (Takes et al., 1998). Alguns pacientes, por
exemplo, manifestam lesões múltiplas no mesmo sítio anatômico ou em outros sítios do trato
aerodigestivo superior, uma situação provavelmente relacionada com a exposição crônica de
toda a mucosa a insultos carcinogênicos, explicada por Slaughter e colaboradores (1953),
como cancerização de campo. Essas características tornam a investigação das alterações
desencadeadas durante o processo de malignização muito importante na identificação de
marcadores úteis para o rastreamento de pessoas em risco de desenvolver a doença ou de
apresentar lesões múltiplas e para a previsão do curso da doença ou da resposta à terapia
(Wreesmann et al., 2004).
O modelo da progressão molecular dos tumores de cabeça e pescoço sugere que a
hiperplasia benigna já contém algumas alterações genéticas, como a inativação do gene
p16INK4A. Segundo esse modelo, a progressão clínica para displasia, carcinoma in situ e
invasivo está associada a outras alterações, como mutações no gene TP53, amplificação do
gene da ciclina D1 e EGFR, inativação do PTEN, além de deleções de diferentes segmentos
do genoma (revisto por Leemans et al., 2010). Tais alterações contribuem para o fenótipo
neoplásico que, de acordo com Hanahan e Weinberg (2011), está relacionado com
proliferação celular aumentada, insensibilidade a fatores supressores de crescimento,
resistência a apoptose, angiogênese sustentada, reprogramação do metabolismo energético,
evasão ao ataque imune e capacidade para invasão e metástase. Se essas características
puderem ser bloqueadas por um fármaco, provavelmente será possível deter ou alterar o
curso do processo tumoral.
No presente, os marcadores de prognóstico mais utilizados nas decisões sobre o
tratamento a ser utilizado em CECP são o sítio do tumor primário e a presença de
metástases regionais ou distantes (Greenman et al., 2000). Entretanto, a determinação do
status nodal não é simples. No caso de avaliação clínica, os resultados falsos positivos e
falsos negativos são frequentes. A avaliação por exames histopatológicos resulta algumas
vezes em falhas na detecção da doença metastática. A precisão do estadiamento pode,
entretanto, ser melhorada com a utilização de técnicas moleculares (Becker et al., 2004).
Um ponto crítico no estudo dos tumores de cabeça e pescoço é a definição da sub-
população de células iniciadoras, que comportam-se como células tronco. Existem indícios
de que essas células residem em nichos perivasculares na fronte invasiva e, como outras
células tronco, são indiferenciadas e com capacidade de renovação limitada (Zhang et al.,
2012). Hombach-Klonisch et al. (2008) sugerem que nos carcinomas de cabeça e pescoço,
as células em diferenciação dos compartimentos supra-basais do epitélio desviam-se da rota
de diferenciação pré-determinada e transformam-se em células neoplásicas.
II - CONCLUSÕES
As principais conclusões obtidas no presente trabalho estão descritas abaixo:
1- Por análise de agrupamento, a família de genes SPRRs mostra dois clados
principais: o primeiro com um grupo bastante similar (SPRR2A, B, D, E, F e
pseudogene SPRR2C) e provavelmente dois membros ancestrais (SPRR2G e
SPRR4), e o segundo clado mais heterogêneo, com os genes SPRR1 e SPRR3.
2- Os genes SPRRs apresentam ausência ou baixa expressão em linhagens de
carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço em relação a queratinócitos bucais
normais, com exceção do gene SPRR4.
3- Em amostras de CECP, os genes SPRRs exibem heterogeneidade de expressão
entre os diferentes sítios, embora o padrão observado em laringe e soalho de boca
seja bastante similar e com elevação de níveis de transcritos. Nos carcinomas de
língua os genes SPRRs apresentam redução de expressão. Apenas o gene SPRR3
mostra redução significativa de expressão em carcinomas orais e de laringe.
4- A expressão dos genes SPRRs não está associada à presença de metástase
linfonodal.
5- A proteína anti-inflamatória anexina A1 inibe a expressão da maioria dos genes
SPRRs, exceto de SPRR2B, SPRR2C, SPRR3 e SPRR4.
6- A indução duradoura da expressão do gene SPRR2E resulta na mudança de
fenótipo epitelial para fibroblastóide e uma significativa redução da invasão celular.
7- A inserção dos genes SPRR4 e SPRR2E em vetor de clonagem mostra-se técnica
apropriada para experimentos futuros de expressão heteróloga, produção e
purificação das proteínas.
III –REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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