eindhoven university of technology master meetopstelling voor … · dr. p.m. breepoel ir. j.h. de...
TRANSCRIPT
Eindhoven University of Technology
MASTER
Meetopstelling voor zuurstofbindingscurven van hemoglobine-oplossingen
Moonen, Jan
Award date:1981
Link to publication
DisclaimerThis document contains a student thesis (bachelor's or master's), as authored by a student at Eindhoven University of Technology. Studenttheses are made available in the TU/e repository upon obtaining the required degree. The grade received is not published on the documentas presented in the repository. The required complexity or quality of research of student theses may vary by program, and the requiredminimum study period may vary in duration.
General rightsCopyright and moral rights for the publications made accessible in the public portal are retained by the authors and/or other copyright ownersand it is a condition of accessing publications that users recognise and abide by the legal requirements associated with these rights.
• Users may download and print one copy of any publication from the public portal for the purpose of private study or research. • You may not further distribute the material or use it for any profit-making activity or commercial gain
Faculteit der Geneeskunde Afdeling Fysiologie Kath. Universiteit Nijmegen
Technische Hogeschool Eindhoven Vakgroep Analyse Fysische Meetmethoden
MEETOPSTELLING VOOR ZUURSTOFBINVINGSCURVEN
VAN HEMOGLOBINE-OPLOSSINGEN
Verslag van het afstudeerwerk, verricht op de afdeling
Fysiologie van de Katholieke Universiteit te Nijmegen
Afstudeerhoogleraar:
Coordinator:
Begeleiding:
Prof. Dr. J.A. Poulis
Dr. ir. H.J. van Ouwerkerk
Dr. P.M. Breepoel
Ir. J.H. de Koning
Op deze plaats wil ik allen bedanken die hun medewerking hebben verleend bij de totstandkoming van dit afstudeerwerk. Met name dank ik Jo Michels voor de prettige samenwerking bij het bouwen van de opstelling.
Nijmegen, april 1981 Jan Moonen
INHOUD
SAMENVATTING ................................................... BLZ.
1. INLEIDING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2. ZUURSTOFBINDINGSCURVE . . .. .. .. . . . . . .. . . . . .. .. . .. .. .. .. . . . .. .. .. . . 2 2.1. Klinisch belang ............................................ 2 2.2. Fysisch-chemische aspecten van hemoglobine. .. .............. 2 2.3. Standaard-dissociatiecurve ................................. 6 2.4. Bestaande apparatuur. ...............................•...... 8
a) Methode van Duvelleroy (1970) ........................... 8 b) Methode van Clerbaux (1975, 1976). ...................... 9 c) Methode van Si ck en Gersonde . .. .. .. .. . .. . . .. .. . . .. .. .. .. 9
2.5. Discussie .. .. .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . 11
3. MEETPRINCIPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3.1. Meting zuurstofspanning .. ~.. ......... ...... .... .. . . .... .... 12 3.2. Principe saturatiemeting.............. ... .... ...... ... .. ... 13
4. MEETOPSTELL I NG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4.1. Meetcel .................................................•.... 15 4.2. Optisch systeem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 4.3. Electronisch detectiesysteem ................................ 23
4.3.1. po2-meting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 4.3.2. Saturatiemeting ...................................... 24
4.4. Totale meetopstelling ....................................... 26
5. IJKINGEN, RESULTATEN ............................................. 28 5.1. IJking p02-electroden ....................................... 28 5.2. Lineariteit fotodiode ....................................... 29 5.3. Zuurstofbindingscurve ....................................... 30 5.4. Oxygenatie en deoxygenatie als functie van [KCl] en [Hb] .... 33
6. DISCUSS IE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 6.1. Meetmethode, meetnauwkeurigheid ............................. - 37 6.2. Randeffecten meetcel, modificaties .......................... 37 6.3. Maximale hemoglobine-concentratie en bijbehorende [Hb02]-
gradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
7. CONCLUSIES, VOORTZETTING VAN HET ONDERZOEK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 APPENDIX A: Invloed van de bandbreedte van de monochromatische lichtbundel op de lineariteit van de fotometer ................... 44
APPENDIX B: Schema saturatiemeter ................................ 47 APPENDIX C: Specificatie apparatuur .............................. 48 REFERENT I ES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
SAMENVATTING
Ter bepaling van zuurstofbindingscurven van hemoglobine-oplossingen
is een meetopstelling ontwikkeld gericht op het gebruik van kleine
monsters in een stilstaande diffusielaag.
De opstelling bevat twee onafhankelijke meetsystemen:
1) o2-detectiesysteem: de meting van de partiele zuurstofspanning
geschiedt met behulp van micro-po2-electroden.
2) Optisch systeem: de zuurstofverzadiging van de hemoglobine wordt
bepaald uit de optische absorptie bij twee golflengten.
In de meetcel (inhoud 6 µl) wordt de hemoglobine-oplossing geoxy
deerd resp. gedeoxygeneerd. De snelheid van dit proces is een functie
van de diffusie- en reactiesnelheden van zuurstof en hemoglobine. De
zuurstofbindingscurve ontstaat door gelijktijdige en continue re
gistratie van de zuurstofspanning en de verzadigingsgraad van de hemo
globi ne.
De meetopstelling is geijkt en er zijn enkele zuurstofbindings
curves gemeten.
- 1 -
1. INLEIVING
Hemoglobine is een eiwit waaraan reversibel zuurstof kan binden.
Het komt voor in de rode bloedlichaampjes en vervult een belangrijke
functie bij de zuurstofvoorziening van de diverse lichaamsdelen van
de mens. Met name het zuurstoftranspot over lange afstanden, als
convectief transport via de circulatie, steunt op de aanwezigheid
van hemoglobine.
De zuurstofbindingscurve van een hemoglobine-oplossing geeft gra
fisch het verband tussen de partiele zuurstofspanning in de oplossing
en de verzadigingsgraad van de hemoglobine. De partiele zuurstof
spanning is recht evenredig met de hoeveelheid fysisch opgeloste
zuurstof (wet van Henry). De verzadigings- of saturatiegraad van hemo
globine is gedefinieerd als de verhouding tussen het aantal aan hemo
globine gebonden moleculen zuurstof en het maximum aantal dat gebonden
kan warden.
Het doel van dit afstudeerwerk is het ontwikkelen van apparatuur
om snel en betrouwbaar zuurstofbindingscurven te meten van kleine
monsters (<< 1 ml) bloed of hemoglobine-oplossing. Omdat bestaande
meetapparaten niet aan de door ons te stellen eisen voldoen (zie 2.4.)
is een ander meetsysteem ontworpen, gebouwd en getest (resp. hoofdstuk
3, 4 en5).
Hoewel de meetopstelling nog niet definitief voltooid is, zijn er
reeds metingen verricht aan Hb-oplossingen.
Een uitbreiding van de apparatuur en een aanvulling van dit onder
zoek is beschreven in hoofdstuk 7.
Dit afstudeerwerk is verricht op de afdeling Fysiologie van de
Medische Faculteit te Nijmegen.
- 2 -
2. ZUURSTOFBINVINGSCURVE
2. 1. IGUnl6c.h be.lang
De zuurstofbindingscurve is een maat voor de zuurstofaffiniteit
van het bloed en indirect een indicatie voor het maximale o2 trans
port van de longen naar de weefsels.
Reeds in 1966 (Eliot et al.) werd verondersteld dat een abnormale
zuurstofaffiniteit van het bloed een der oorzaken kan zijn van een
hartinfarct; in betreffend onderzoek werd een verlaagde affiniteit
gemeten. Omtrent dit verband bestaat (nog) geen zekerheid omdat in
klinische studies de zuurstofaffiniteit van het bloed v66r het optre-
den van het infarct meestal onbekend is.
Indien inderdaad een relatie tussen de ligging:van de zuurstof-
bindingscurve en het optreden van een hartinfract zou bestaan, zal de
diagnostische betekenis van de meting van deze curve toenemen. Spe
culerend kan dan zelfs verwacht worden dat de klinische toepassing
onderzocht zal worden van een therapeutische beinvloeding van de ligging
en de vorm van de curve.
Tevens kan het belang blijken van de zuurstofbindingscurve van het
bloed dat gebruikt wordt in een extracorporale circulatie tijdens een
open hartoperatie bij patienten met hartischemie.
In het menselijk bloed wordt zuurstof chemisch gebonden door het
proteine hemoglobine, dat vrijwel alleen in de rode bloedlichaampjes
voorkomt. Een rode bloedcel bevat 280.106 moleculen hemoglobine (in
't vervolg weergegeven met Hb) en het menselijk bloed bevat gemiddeld
- 3 -
5.106 rode bloedcellen per mm3 bloed. Ieder Hb molecuul kan 4 mole
culen o2 binden. Bij p02 = 10 kPa is menselijk bloed voor meer dan
90 % verzadigd en bevat 9xl0- 3 mol o2 per liter. Er is dan slechts -4 1,lxlO mol o2 fysisch opgelost (Bernards, 1979).
Proteinen bestaan uit lange ketens van aminozuren, de zgn. poly-
petide ketens. Het proteine Hb, met molecuulgewicht van 64500, bevat
vier ingewikkeld opgevouwen polypeptide ketens (globinen) en vier niet
peptide groepen die elk heemgroep of heem genoemd worden. Het belang
rijkste bestanddeel van een heem is een ijzerion (zie fig. 2.1.) dat
een molecuul o2 reversibel kan binden en zo voor o2 transport zorg
draagt. De heem is de oorzaak van de rode kleur van het bloed.
Iedere heemgroep is omgeven door een van de vier gevouwen peptide
ketens en wel zodanig dat door deze chemische structuur een reversibele
binding met o2 mogelijk is. Heern alleen kan zuurstof niet reversibel
binden. Hethemoglobinemolecuul is ongeveer bolvormig met afmetingen
64 ~ x 55 ~ x 50 ~. De vier heemgroepen liggen in het Hb-molecuul dicht
bij het oppervlak, waardoor gemakkelijk o2 wordt opgenomen en afge
staan, afhankelijk van de chemische structuur en het chemisch milieu
waarin het Hb-molecuul zich bevindt. De binding van o2 met Hb noemt
men oxygenatie, in tegenstelling tot oxidatie waarbij o2 atomair zo
sterk gebonden wordt, dat Hb (ferrohemoglobine) door de irreversibele
reactie overgaat in methemoglobine (ferrihemoglobine) dat geen o2 in
moleculaire vorm kan binden en afstaan.
- 4 -
CH3 ·~ CH= CH2
N N
Fe
N N
CH3 CH3
FiguWL Z.1. Structuurformule van een heemgroep (= ijzerporfyrine).
De vier polypeptide ketens blijken twee aan twee gelijk te zijn:
twee a-ketens en twee s-ketens (Perutz, 1968). Verder blijkt de zuur-
stofbinding samen te gaan met een structuurverandering: twee van de
vier ketens, namelijk de s~ketens, bewegen zodanig dat de ruimte tus-
sen de ketens bij o2-opname kleiner wordt en bij o2-afgifte grater.
De saturatiecurve van hemoglobine blijkt S-vormig te zijn (zie fig. 2.2.).
1
s
1 1.~ p02 ( kPa)
Figuur 2.2 Saturatiecurve van runderhemoglobine.
pH=7,4 Hb = 0,015 m mol/I
- 5 -
De saturatie van hemoglobine is gedefinieerd als de verhouding van
het aantal moleculen o2 door de hemoglobine gebonden en het aantal o2 moleculen dat maximaal door de hemoglobine gebonden kan warden. De
S-vorm van de saturatiekromme kan verklaard warden met de hypothese
van Adair dat de reactie van Hb met o2 in 4 trappen verloopt:
Hb 4 + 02 ( > Hb4 o2 Hb 4 o2 + 02 ( ) Hb4(02)2
Hb4(02)2 + 02 ( ) Hb4(02)3
Hb4(02)3 + 02 ( ) Hb4(02)4
We kunnen voor de saturatie dan de volgende uitdrukking opschrijven:
waarin [02] = zuurstofconcentratie
k1 t/m k4 = evenwichtsconstanten voor de vier reactie
trappen.
Om de S-vorm te verklaren is het oak noodzakelijk dat men aanneemt
dat er een wisselwerking bestaat tussen de heemgroepen van het
Hb-molecuul. Zou de binding van o2 aan de heemgroepen zuiver statis
tisch verdeeld zijn, dan zou de saturatiekromme immers hyperbolisch zijn.
Een molecuul o2 bindt namelijk gemakkelijker aan een Hb-molecuul
dat al een of meer zuurstofmoleculen gebonden heeft dan aan een Hb-
molecuul dat nag geen o2 bevat. Ook zal een Hb-molecuul dat maar een
molecuul o2 gebonden heeft, dit eerder loslaten dan een Hb-molecuul
dat meerdere o2 moleculen bevat. Door de structuurverandering van het
Hb-molecuul bij de binding van o2 aan een heemgroep verandert dus de
zuurstofaffiniteit van de drie overige heemgroepen.
- 6 -
De reactie van zuurstof met hemoglobine kan als volgt warden
weergegeven:
Oxyhemoglobine is een sterker zuur dan hemoglobine. Uit bovenstaande
evenwichtsreacties blijkt dat het percentage oxyhemoglobine niet alleen
afhankelijk is van de p02, maar tevens van de pH van de oplossing.
Tijdens het meten van de saturatiecurve dient men een buffer te gebrui
ken, dan wel tevens continu de pH te meten.
Behalve o2 kan ook CO gebonden warden aan het ijzeratoom van de heem
groep. Deze binding is veel stabieleren laat geen zuurstofopname meer
toe: bij inademing van CO treedt vergiftiging op. Omdat de affiniteit
van Hb voor CO veel grater is dan die voor o2, zijn zeer lage con
centraties CO al schadelijk voor de zuurstofopname.
Omdat de meeste gezonde mensen eenzelfde soort hemoglobine in hun
bleed hebben, zou verwacht kunnen warden dat de saturatiecurve van de
meeste proefpersonen dezelfde is. Het is echter gebleken dat de zuur
stofbinding bij bepaalde p02, behalve van het soort hemoglobine ook
nog van andere factoren afhankelijk is; zie onderstaande tabel.
Zuurstofbinding is afhankelijk van:
1) pH
2) temperatuur
3) organische fosfaten: Adenosinetriphosphate (ATP)
Inositol hexaphosphate (IHP)
2,3-Diphosphoglycerate (DPG)
- 7 -
4) pC02
5) co
6) Methemoglobineconcentratie
7) Ionensterkte
8) Medicijnen, chemicalien
9) Anorganische fosfaten
10) Zoutconcentratie.
Van bovenstaande parameters zijn de belangrijkste de pH, pC02, het
DPG-gehalte en de temperatuur. Om een indruk te krijgen van deze fac
toren, geeft o.a. Woodson (1977) alleen het effect voor de p50 , d.i.
de p02 waarbij de saturatie 50 % is. Voor menselijk bloed is onder
standaardcondities (d.i. pH= 7.4; T = 370 C; pC02 = 5.26 kPa; DPG =
5 mM/l) de p50 ongeveer 3,5 kPa. De invloed van de vier factoren is
in figuur 2.3. weergegeven. Zander opgave van deze fysisch-chemische
condities h~~ft een zuurstofbindingscurve weinig kwantitatieve bete
kenis.
p50
(kPa)
0 4
7.8 7.6
31 33
Figuur 2.3
8 12
7.!4 7.2
37 39 41
lnvloed van T , pH en
(Woodson, 1977).
16 20 DPG (m. molf i)
pH 7.0
43 T (°C)
DPG op de P50·
- 8 -
2.4. Beiita.ande appaJLa.:tUUJt
a) Methode van Duvelleroy (1970)
Principe: In een gesloten systeem wordt een bekend volume gedeoxy
geneerd bloed in contact gebracht met een bekend volume zuurstofgas.
De afname van de p02 in het gasvolume en de toename van de fysisch op
geloste o2 in het bloed wordt met po2 electroden gemeten (zie figuur
2.4.). De toename van de totale hoeveelheid zµurstof in het bloed is
gelijk aan de afname van de hoeveelheid zuurstof in het gas. De ver
zadiging kan men als volgt berekenen:
S = t-,,V02 gas-t-,,V02 bloed
{t-,, vo2 gas - t-,, vo2 bl oed } max
waarin t::.V02 gas= verandering van de totale hoeveelheid o2 in het gas
en t::.V02 bloed = verandering van de hoeveelheid fysisch opgelost o2
in bloed.
Radiometer (Kopenhagen) heeft tijdelijk een instrument in de handel ge
bracht dat werkt volgens het principe van Duvelleroy.
Ve ____ __. p02
meter i--------1
gas s
bloed - ....._--'----l p02
meter _________ __..
I I magn.
roerder
Figuur 2.4 Meetprincipe van Duvel leroy.
2.4.b. Methode vdn CleJtbdux (7975, 7976)
Bij deze methode worden T, pH en pC02 nauwkeurig constant gehouden:
T binnen o,oos° C, pC02 binnen o,07 kPa ~n de pH binnen een interval
van 0,002.
Er wordt gebruik gemaakt van een bloedmonster van 10-12 ml. Dit bleed
wordt d.m.v. een peristaltische pomp rondgepompt in een circuit waarin
de po2 polarografisch en de verzadiging S fotometrisch gemeten worden.
Verder is er een gascircuit waarmee gassen van nauwkeurig
bekende samenstelling in contact gebracht kunnen worden met het bloed.
De twee circuits komen bij elkaar in een tonometer waarin de gasopname
door het b 1 oed p 1 aa ts vi ndt. In het b 1 oedci rcu.i t mo gen p02, pC02 en pH
niet veranderen tussen plaatsen waar de p02 en de verzadiging S worden
gemeten. In het gascircuit mogen de gassamenstelling en de gasdruk niet
varieren.
2.4.c. Methode Vdn Si.ck en GeJL6onde
De te onderzoeken hemoglobine-oplossing bevindt zich op de bodem
van een bolvormige diffusiekamer. De diffusiekamer is aan onder- en
bovenzijde afgesloten door plexiglas. Het laagje Hb-oplossing {laag
dikte: 0,02-0,05 mm) wordt geoxygeneerd en gedeoxygeneerd afhankelijk
van de samenstelling van het gas in de diffusiekamer.
De saturatie (S) van hemoglobine wordt fotometrisch bepaald; de
lichtbundel is gericht in verticale richtjng. De ro2 wordt met een po2~
electrode gemeten in het gas in de diffusiekamer.
- 10 -
2
A=436 nm
FiguuJt Z.4. Schema van de diffusiekamer
1) instromingskanaal voor ijkgas, 2) diffusiecapillair,
3) po2-electrode, 4) Hb-oplossing.
De samenstelling van het gas in de diffusiekamer kan op 2 manieren
gevarieerd warden:
a) instroming via kanaal l;
b) diffusie via dun capillair (kanaal 2).
De meetprocedure is als volgt. Eerst wordt ijkgas door de diffusie
kamer geleid (in via 1, uit via 2). Na equilibratie in de diffusie-
kamer wordt doorstroomopening 1 gesloten en wordt diffusiegas langs
het capillair geleid. In het capillair, in de diffusiekamer en in de
Hb-oplossing vindt diffusie plaats.
Het diffusieproces in vloeistof verloopt veel langzamer dan het
diffusieproces in gas. Hierdoor is er een relaxatie-effect tussen de
p02 in de vloeistof en het gas (zie ook 4.1.). De saturatiecurve gemeten
tijdens oxygenatie is dan ook verschillend van de curve gemeten tijdens
deoxygenatie.
Aminco (American Instrument Company) heeft een meetapparaat in de
handel gebracht (Hem-o-scan) dat werkt volgens het principe van Sick
en Gersonde.
I
- 11 -
Niet alleen clinische toepassingen, maar voornamelijk het toe
komstig wetenschappelijk onderzoek aan hemoglobine-oplossingen en
bloed stelt eisen aan onze opstelling:
- Met het oog op onderzoek aan rattebloed en vissehemoglobine dat zeer
kwetsbaar is, is gesteld dat het monster tijdens het experiment moet
stilstaan.
Bij kleine proefdieren is slechts een beperkte hoeveelheid bloed ter
beschikking (< 1 ml).
- Om oak in een later stadium de saturatie van bloed te kunnen meten,
moet de opstelling geschikt zijn voor oplossingen waarvan de [Hb]
3 a 4 x 10-3 mol/liter is; dit is de concentratie in de rode bloed
lichaampjes.
- De meting van een zuurstofbindingscurve mag maximaal een uur bedragen.
Aan de eerste en tweede eis wordt niet voldaan bij meting volgens
het principe van Duvelleroy (a) of Clerbaux (b). Een meetopstelling
die werkt volgens het principe van Sick en Gersonde (c), de zgn.
Hem-a-scan, is binnen de afdeling Fysiologie gestest, maar gaf geen
reproduceerbare metingen (zie 2.4.c.).
Deze bevindingen gaven aanleiding tot het ontwikkelen van een
nieuwe meetopstelling. Toetsing van de gekozen opstelling aan de
eisen wordt beschreven in hoofdstuk 7: Conclusies.
- 12 -
3. MEETPRINCIPE
Er dienen in principe 2 grootheden in de stilstaande vloeistof
gemeten: de zuurstofspanning (p02) en de verzadigingsgraad (S) van
van de hemoglobine.
De p02 wordt m.b.v. micro-po2-electroden gemeten, die werken vol
gens het principe van de zgn. Clark-electrode (Kimmich, 1969). Een
Clark-electrode is een bipolaire electrode, d.w.z. kathode en anode
zijn d.m.v. een gas-permeabel membraan gescheiden van de te onderzoeken
oplossing. Tussen de kathode en anode wordt een spanningsverschil aan
gebracht (-0,7 V) waardoor de bij de kathode aanwezige zuurstof wordt
gereduceerd volgens:
--) 40H
en aan de anode: Ag -~> Ag++ e
Tussen het membraan en de anode en kathode bevindt zich een buffer
oplossing (NaH2Po4-H 3P04).
De fysisch opgeloste o2 wordt gereduceerd aan de kathode en er ont
staat een o2-gradient naar het kathode-oppervlak. Het gevolg is dat o2-
moleculen in de richting van het kathode-oppervlak diffunderen. Het
teflon-membraan (dikte 6 µm) beperkt de diffusiesnelheid van de o2-
moleculen en bij een spanningsverschil van-0.7 V wordt alle zuurstof
gereduceerd, die door het teflon-membraan diffundeert; de p02 aan het
kathode-oppervlak is nul. Het aantal moleculen o2 dat door het membraan
diffundeert is recht evenredig met het partieel drukverschil voor o2 over het membraan, en dus evenredig met de p02 in de vloeistof grenzend
- 13 -
aan de buitenzijde van het membraan. Door het gebruik van een mem
braan is de electrodestroom in principe onafhankelijk van het medium.
De verzadigingsgraad van de hemoglobine wordt bepaald aan de hand
van absorbtiemetingen aanhethemoglobinelaagje. Onder (licht-)ab
sorptie of extinctie wordt verstaan de logaritoe van de verhouding
tassen de energie na absorptie en de energie v66r absorptie: I
E = log~ Principe van de saturatiemeting berust op
het feit dat Hb en Hb02 een verschillend absorptiespectrum hebben. In
figuur 3.1. is een gedeelte van de absorptiespectra weergegeven.
10
5
0 578 542 A, (nm)
F ,tg Ull!t 3 • 1 • Absorptiespectra van hemoglobine voor 0, 20, 40, 60,
80 en 100 % verzadiging (Wodick, LUbbers, 1973).
- 14 -
De lichtintensiteit wordt gegeven door de wet van Lambert-Beer:
I = Io.10-e.c.d
waarin I = intensiteit na absorptie
I0
= intensiteit voor absoptie
E = extincie Coefficient
c = concentratie
d = laagdikte.
Voor twee kleurstoffen (Hb en Hb02) is de intensiteit:
= 10
. 10{-d(E1[Hb]t.s - E2(1-S)[Hb]t)}
= I .lO{-d[Hb]t(E1S+(l-S)E2)} 0
waarin El' E2 = extinctiecoefficient Hb02 en Hb
S = saturatiegraad
In feite zou men kunnen volstaan met het meten van de absorptie bij
een bepaalde A, die gekozen wordt in een gebied waar de extinctie-
coefficient van Hb en die van Hb02 veel verschillen (met Hb02 wordt
bedoeld de volledig geoxygeneerde vorm van hemoglobine: Hb4(o2)4).
Om te kunnen corrigeren voor eventuele veranderingen in [Hb] en
laagdikte tijdens het experiment wordt tevens de absorptie gemeten
bij een A waarvoor beide extinctiecoefficienten gelijk zijn (E3);
de laatstgenoemde golflengte is de isobestische golflengte \.; de eerst-- I
genoemde duiden we aan met \s(~aturatiemeting).
- 15 -
In het isobestisch punt is de extinctie onafhankelijk van 5:
E = [Hb]t.£3.d
Als we de extinctie voor beide A's op elkaar delen, houden we een
signaal over dat afhankelijk is van een variable 5 en van twee con-
stanten k1 en k2
d [Hb]t (£ 15+(1-5)£2)
d [Hb]t £ 3
Het signaal is dan evenredig met de saturatiegraad (zie ook Appendix A).
4. MEETOPSTELLING
4. 1 • Mee.tc.d
In de meetcel bevindt zich de te onderzoeken oplossing die tijdens
het experiment geleidelijk van de geoxygeneerde toestand overgaat naar
de gedeoxygeneerde toestand en/of omgekeerd.
De meetcel heeft twee gasdoorlatende membranen (teflon), waardoor
zuurstofuitwisseling mogelijk is tussen sample en omgeving. Het zuur
stoftransport ~n het sample, nodig voor de oxygenatie en deoxygenatie
van de oplossing, vindt plaats door diffusie van o2 en Hb02 (5cholander,
Wittenberg); hierdoor is er een relaxatietijd tussen de p02 in de vloei
stof en de p02 in het omringende gas. De relaxatietijd neemt kwadratisch
toe met de afstand tot het grensvlak vloeistof-membraan.
In een inhomogeen monster is er gelijktijdige diffusie en chemische
reactie van zuurstof en hemoglobine. De snelheid waarmee deze processen
plaatsvinden bepaalt de totale tijdsduur van een experiment (een curve).
De diffusiecoefficient van o2 en Hb02, resp. D0 en DHbO , zijn afhanke-2 2
- 16 -
kelijk van de hemoglobineconcentratie, [Hb]. Voor [Hb] = 10-3 iiier -5 cm2 -7 2 is Do2 = 1,7.10 ~s~ en DHb = 5.10 cm /s (Kreuzer, 1970). De oxy-
genatie en deoxygenatie van hemoglobine kan sterk vereenvoudigd warden
voorgesteld door de reactie:
waarin k (= reactiesnelheid voor dissociatie)
k1(= reactiesnelheid voor combinatie)
-1 = 42,5 sec 9 ml
= 3· 10 mol.s. (Hoofd, 1970).
De afmetingen van de meetcel in de diffusierichting is dus van invloed
op de meettijd van een curve. Omdat de meetcel slechts twee (evenwijdige)
zuurstofdoorlatende wanden heeft, vindt diffusie van zuurstof en hemo-
globine slechts in een richting plaats, namelijk loodrecht op de per
meabele wanden (zie 6.2.). In deze richting ontstaat een tijdafhanke
lijke o2 en Hb02 gradient in de oplossing. Een voorbeeld van berekende
o2 en Hb02 profielen is gegeven in figuur 4.1. ----------·---·--~------~-
-r-----------------.-20
1
s
0.5
0 0
10
0.5
Figuur 4.1 Theoretische o2 en S profielen.
Hb 1 , 5 m mo I I I ( Spaan, 1973) •
p02 (kPa)
- 17 -
In de meetcel wordt de p02 en de saturatie gemeten op de plaats
waar de o2 en Hbo2 gradienten klein zijn, namelijk midden tussen de
permeabele wanden.
De saturatie wordt bepaald met behulp van absorptiemetingen in een
lichtbundel evenwijdig aan de permeabele wanden. Om een smalle licht
bundel nauwkeurig te localiseren gebruiken we glasvezels als lichttrans
missiesysteem. De glasvezels liggen alle in een plat vlak evenwijdig
aan het xz-vlak op y = ~ L; zie figuur 4.2. Een rij fibers dient als
lichtgeleiding van de bron naar het monster, de andere rij fibers ge
leidt een deel van de uittredende bundel naar de detector. We meten dus
de absorptie van een zeer smalle strook (65 µm) precies in het midden
van de meetcel.
Aan een zijde van de meetcel bevinden zich tussen de fibers tevens
drie p02-electroden (platinadraden, ingesmolten in glas; als zwarte
stippen weergegeven in de tekening; de platinadragen fungeren als kathode).
Aan weerszijden van de rij fibers bevindt zich een zilveren plaatje dat
fungeert als anode.
De meetcel is weergegeven in figuur 4.2. De afmetingen zijn ~ x 1 x 12 mm
in resp. y, z en x richting. ~ glasvezels: 65 µm; doorsnede po2-electrode: + - 50 µm; doorsnede platinadraad (kathode): 20 µm.
F~guuJt 4.2.
- 18 -
P°i
Schets van de meetcel. De wanden op y = 0 en y = L
zijn gasdoorlatend.
De rechthoekige meetcel uit figuur 4.2. wordt gevormd door de puntige
uiteinden van 4 beitels tegen elkaar te klemmen zoals in de twee onder
staande foto1s (en in fig. 4.3.) is afgebeeld. De vier beitels worden in
een kunstofhouder (PVC) geklemd.
- 19 -
, I II' I. II"!" II I" "I'"'/" 1111111/1111I1111 /II II I'''' I'''' I'" 1111111111111111I111 1 'l:S1 2 3 4 5 6 · 7 8
Foto 1. Vier beitels met in het midden de meetcel.
Foto Z. Schets van 3 beitels in de houder. In de houder is aan
boven- en onderkant een canule om de meetcel te vullen
met vloeistof.
I
I
-·;r~ -;.=----+j) ' I \ I
--~---------.:..t--
F.igu.uJt 4. 3. a.
- 20 -
0
0
Links: gaskamer met toe en afvoer
Rechts: beitel met fibers en twee
canulen.
1 2
- - - - -IE ;ll1
~ 0.5mm 1~
02 02 I 1mm I
I I ,~
I I I ,- - - -I
3
4
Figu.U!l. 4. 3. b.
Voorzijde van de vier
beitels in uiteindelijke toe-
stand; in het centrum de diffusie-
kamer.
De vier wiggen zijn niet exact puntvormig, maar hebben een vlakke
zijde aan de voorkant, zodat er een rechthoekige ruimte overblijft als
de wiggen tegen elkaar geklemd zijn, deze ruimte is de meetcel; zie fi-
guur 4.3. Twee wiggen (no 1 en 3 uit fig. 4.3.b.) bevatten aan de voor-
kant, grenzend aan de rechthoekige ruimte, een gaskamer waar voordurend
gas doorheen kan warden geleid; over deze gaskamer is een teflonmembraan
- 21 -
gespannen. De twee andere Wiggen (2 en 4) bevatten glasfibers en een
ervan de p02-electroden. Deze zijn dan ook voorzien van een buffer
oplossing via twee canulen grenzend aan de rij glasfibers (fig. 4.3.a.).
De glasvezels liggen niet over de volle lengte van de meetcel; dit van-
wege mogelijk ongunstige randeffecten. Dok over deze wig wordt een tef-
lonmembraan gespannen zodat er slechts een zeer dunne vloeistoffilm van
deze bufferoplossing achterblijft tussen membraan en p02-electroden.
Elke wig is aan het andere uiteinde vierkant gemaakt om draaiing om
zijn eigen as te voorkomen. Het rechthoekig meetkanaal wordt aan de twee
uiteinden afgesloten door een rubber dop waardoor via een canule de
vloeistof wordt ingebracht.
4 • 2 • Opw c.h '-' Y'-' :teem
De zuurstofsaturatie van de hemoglobine wordt bepaald aan de hand van
absorptiemetingen, verricht bij twee verschillende golflengten Ai en As.
De waarden van Ai en As zijn niet voor iedere Hb-oplossing dezelfde. In
de opstelling moet de golflengte dus instelbaar zijn. De instelling
voor Ai is tamelijk kritisch: de piek-golflengte moet precies in het
isobestisch (zie 3.2.) punt liggen en de bandbreedte, ~A, moet klein
zijn, zie figuur 4.4.
-/imax 1
0.5
0
I
I I
-1-. I I
F.lguUJt 4. 4. Frequentiekarakteristiek van de doorgelaten lichtbundel.
- 22 -
Met behulp van een monochromator met instelbare spleetbreedte (en
dus bandbreedte) wordt de monochromatische bundel voor A; gerealiseerd.
De bundel behorende bij As wordt verkregen met een interferentiefilter;
tiAs = 1-10 nm. Figuur 4.5. is een schematische weergave van het licht
systeem.
F~guWL 4.5. Schema van de lichtkanalen.
Als lichtbron gebruiken we een Hg-Xe booglamp (Oriel, model 6158).
De lichtbundel afkomstig van de lamp wordt d.m.v. een glasplaatje ge
splitst: het grootste deel (90 %) gaat naar de monochromator en slechts
een klein gedeelte naar het interferentiefilter. Seide lichtbundels wor
den periodiek onderbroken door middel van een roterende vlinder (chopper)
en daarna m.b.v. een lenzenstelsel geconcentreerd op de glasfibers, zodat
de fibers monochromatisch licht doorzenden afwisselend met golflengte Ai
en As. Een fotodiode detecteert de doorgelaten lichtbundel.
Om variaties in de intensiteit van de ingaande monochromatische
bundels te meten, wordt een klein gedeelte (± 10 %) van de bundels d.m.v.
glasplaatjes afgesplitst naar detectoren. Deze leveren referentiesignalen
I0
en 101 op voor beide kanalen. De signalen van de drie detectoren wor
den naar een electronisch detectiesysteem geleid waar voor beide kleuren
de absorptie bepaald wordt.
- 23 -
4 • 3 • Elecilto YLl6 c.h detectiu y.td.eem
De electrodestroom ie' die ontstaat door reductie van zuurstof aan
de kathode is van de grootte-orde 10-9 ampere. De electrodestroom wordt
in een po2 versterker omgezet in een spanning volgens onderstaand schema:
V= - i R + V e pol.
vpol.
0 0
FigULllL 4.6. Principe schema van de po2-versterker.
De operationele versterker A heeft de volgende eigenschappen:
1. een te verwaarlozen kleine biasstroom (< 10- 14 A);
2. grate signaal-ruis-verhouding; de eigenruis van de versterker is
minder dan 10 µV.
De uitgansspanning van de operationele versterker A is: VA= -ie.R + Vpol'
Na compensatie voor de polarisatiespanning, Vpol' is de uitgangsspanning
(grootte-orde: 1 volt) evenredig met de electrodestroom ie.
- 24 -
4.3.2. Sa.tuJr..a.,tleme-tlng
Het signaal van de fotodiode die het getransmitteerde licht meet,
wordt naar twee fasegevoelige versterkers (ook wel Lock-in-Amplifier
genoemd) geleid. Elke fasegevoelige versterker heeft als referentie
signaal een blok-spanningssignaal dat afkomstig is van de chopper-unit
en dezelfde frequentie heeft als die waarmee de lichtbundels onder
broken warden. Het principe van een fasegevoelige versterker is:
1. het ingangssignaal wordt vermenigvuldigd met het referentiesignaal;
2. alleen de gelijkspanningscomponent van dit product wordt versterkt
(laagdoorlaatfilter). In formule
A sin w0 t x [s sin (w0 t + 0) + Ci (sin wit) J
ref. meetsignaal ruis
=~cos 0 + ~ cos(2w0 t + 0) + F(t)
Alleen de gelijkspanningscomponent ~cos 0 passeert het laagdoorlaat
filter. Het faseverschil 0 is afhankelijk van de positie van de chopper
schijf t.o.v. de lichtbundel(s) en van de instelbare fasedraaiing van
de fasegevoelige versterker.
De chopperschijf is zodanig gepositioneerd dat de beide meetsignalen
(Ai en As) t.o.v. elkaar ongeveer 90° in fase verschillen; dit is
schematisch weergegeven in figuur 4.7.
- 25 -
-------·---
b Ref. As
a As
a A· I
b Ref. A. I
~t F.lg u.uJt 4 • 7 • a) Meetsignalen voor Ai en As;
b) Referentiesignalen.
Bij elke versterker is de fase van het referentiesignaal z6 ingesteld
dat ~ = 90° voor een van beide meetsignalen. Het resultaat is dat elke
versterker ongevoelig is voor een kleur, en de maximale gevoeligheid
heeft voor de andere kleur. Elke versterker geeft dus de intensiteit
van een golflengte.
We krijgen dus 4 signalen: voor iedere A een referentiesignaal (I0),
gemeten door de referentiediode, en de doorgelaten lichtintensiteit (I).
Van deze 4 signalen wordt de logaritme genomen en daarna warden de twee
signalen behorende bij een A naar een verschilversterker geleid. Aan de
uitgang van deze verschilversterker vinden we dus voor Ai:
IA. 1 =logy:-:-- = E3.[Hb].d
OA. 1
voor As: log IA - log IOA = (E1S+{l-S)E2) [Hbt].d s s
De uitgangssignalen van de verschilversterkers warden op elkaar gedeeld;
het uiteindelijke signaal is evenredig met de verzadiging S (zie 4.4. en
6. 2.).
IR
- 26 -
4 • 4 • T o.:ta.le meeA:o p.6tei.Ung
rn-figuur 4.8. is een schets gegeven van de totale meetopstelling.
De lichtbundel afkomstig van de lamp is een evenwijdige bundel (te re
aliseren m.b.v. een convergerende lens in het lamphuis). Na een warmte
filter wordt de bundel gesplitst. De twee evenwijdige bundels worden ge
convergeerd om nauwkeuriger onderbroken te kunnen worden door de micro
chopper (0 schijf: 3 cm). Met behulp van een spiegel en een cylindrische
lens worden de bundels op de fibers gericht. Na absorptie en verstrooiing
door het monster wordt een klein gedeelte van de ingaande bundels ge
detecteerd. Voor de detectie zie 4.3.
M
A-=588
f=50 L
L L
A.=578 nm f=25 f=50 cm
D
Figuur 4.8a. Schematische weergave van de lichtkanalen.
Li = lichtbron M =monochromator
IF = interferentie-filter L = lens
D = fotodiode f = brandpuntafstand
L Cil. = cilindrische lens
IR = infra-rood filter
g = glasvezel
Ch = chopper
M
F
D
Driver
Ei.gu.uJt 4. 8. b.
I OAi
90° L.1.
L. I.
Schema totale meetopstelling
log
log
I
" .......
- 28 -
5. IJK1NGEN, RESULTATEN
De drie micro-electroden van een beitel zijn afzonderlijk geijkt in
water. Na ongeveer 2 uren polariseren heeft de electrodestroom een
stabiele waarde bereikt.
Van de electroden zijn stroom-spanning karakteristieken gemeten
en ijklijnen bepaald. Een ijklijn geeft bij bepaalde polarisatie-
spanning het verband tussen de gemeten electrodestroom ie en de aan
gelegde zuurstofspanning p02.
De p02
wordt gevarieerd door de samenstelling van het gas in de
beitels te veranderen d.m.v. een gasmengpomp. De electrodestroom ie
wordt gemeten nadat deze een stabiele waarde heeft bereikt. De elec
tr~destroom ie is recht evenredig met het uitgangssignaal (Ve) van
de p02-versterker (zie 4.4.1.).
In figuur 5.1. is de ijklijn weergegeven van een micro-p02-elec
trode gemeten bij Vpol = 800 mV. Er blijkt een lineaire relatie tus
sen ie en p02 te warden gevonden. De getekende rechte is bepaald
m.b.v. lineaire regressie; de correlatiefactor is 0,9996. Het ruis
niveau van iedere meting is kleiner dan 0,05 kPa en de electroden ver
tonen een drift van minder dan 0,1 kPa per uur. De electroden hebben
een responstijd (90 % van de eindwaarde) van minder dan 1 sec en zijn
dus voor ans doel (~po2 = 10 kPa in een uur) snel genoeg.
De electrische isolatie van de micro-electroden bleek bij de huidige
constructie van de beitel echter na verloop van tijd slecht te warden,
waardoor er een 11 lek 11 -stroom ontstaat. De po2-meting werd oak instabiel.
Mogelijk is dit te wijten aan de inwerking van chemicalien (fosfaat
buffer, petroleumether of Trichloorethyleen) of water op de
kunststofbeitel of op de gebruikte lijm. Gebruik van ander materiaal
en/of andere verlijming is voor een stabiele po2-meting noodzakelijk.
- 29 -
p02-IJkingen in Hb-oplossingen zijn nog niet verricht. Het is te ver
wachten dat de ijkingen onafhankelijk zijn van het monster omdat de elec-
trade altijd in zijn eigen milieu meet: bufferoplossing + membraan; 98 a 99 % van de po
2-gradient staat over het teflonmembraan + bufferoplossing.
-9 . De electrodestroom bedraagt bij p02 = 10 kPa: 2,4.10 A. D1t komt
-15 -overeen met 6.10 mol o2 per sec (4e + o2 + H 20~40H ). De flux door
het laagje Hb-oplossing bedraagt bij (de}oxygenatie van 0,1 mol/l in
-13 30 min: 5.10 mol o2 per sec. De consumptie van zuurstof door de elec-
trode is te verwaarlozen t.o.v. de totale flux,(bij grotere [Hb] neemt
de o2
flux toe; consumptie is dan relatief kleiner).
De lichtintensiteit in homogeen medium wordt gegeven door de wet
van Lambert-Beer:
waarin s = extinctiecoefficient
c = concentratie
d = laagdikte
De absorptie is gedefinieerd als log Io = scd = log I0 - log I. r
Het optisch systeem is geijkt bij twee golflengten: 650 nm en 595 nm.
Het doel hiervan was, controle van het lineair berband tussen de loga-
ritme van het signaal gemeten door de fotodiode (I) en de concentratie (C).
De [Hb] van de afzonderlijke monsters werd bepaald met behulp van
een double beam spectrofotometer (Perkin-Elmer model 124) (0,1 m mol/l
< [Hb] < 3 m mol/l). De intensiteit van de lichtbundel is zowel v66r
(= I ) als na absorptie (= I) gemeten. De intensiteit v66r en na absorptie 0
wordt logaritmisch geconverteerd (zie appendix B). Het resultaat van
- 30 -
de ijking (voor A = 598) is gegeven in figuur 5.2. De gemeten ab
sorptie is uitgezet tegen de [Hb] van het monster. De rechte lijn
is verkregen met lineaire regressie; correlatiecoefficient: 0,999.
De ijking is oak uitgevoerd voor A = 650 nm; bijbehorende correlatie
coefficient = 0,998.
De conclusie is dat het absorptiesignaal na logaritmische conversie
inderdaad evenredig is met de concentratie Hb.
Wegens het defect raken van de p02-electroden (zie 5.1.) zijn er
slechts enkele zuurstofbindingscurven gemeten. De eerder vermelde in-
stabil iteit van de p02-electrode is ontstaan voordat het optisch systeem
volledig was ont~ikkeld, d.w.z. de zuurstofbindingscurven zijn gemeten bij 1
golflengte zonder referentiekanaal. We9ens tijdgebrek was het in dit af
studeeronderzoek niet mogelijk om nieuwe beitels met p02-electroden
te maken.
De curve van figuur 5.3. is gemeten met een stabile p02-electrode,
echter met een onvolledig optisch meetsysteem.
De totale meettijd bedraagt ongeveer 15 minuten. De onnauwkeurig
heid in de meting van de saturatiecurve wordt hoofdzakelijk bepaald
door de ruis in het saturatiesignaal {alleen ruis in verticale rich
ting). Het optisch meetsysteem is daarna belangrijk verbeterd (zie 5.4.).
In de literatuur zijn geen zuurstofbindingscurven vermeld die onder
deze condities {fig. 5.3.) gemeten zijn. Wel is de p50 bekend onder
deze condities (Breepoel, 1981), nl. 1,9 kPa. p50 is de p02 waarbij
S = 0,5. De p50 is een indicatie voor de zuurstofaffiniteit van de
hemoglobine en voor de ligging van de zuurstofbindingscurve. Er is
dus goede overeenstemming tussen experiment en literatuur gegegevens.
- 31 -
4 •
0 0 5 10 15 20 p0
2 (kPa)
Figuur 5.1
E
1
0.5
00
IJking micro-po2-electrode.in water. V 1 = 800 mV. po .
T = 20°C. Correlatiefaktor : 0,9996
•
/ / . •
1 2 3 [H~ (m.mol;I.)
Figuur 5.2 Gemeten extinctie als functie van de
hemoglobineconcentratie .. .l= 598 nm . .1.1.= 1 nm.
Correlatiecoefficient : 0,999
1
s
05
1
s
- 32 -
2 4 6 8 10 p02 (kPa)
Figuur 5.3 Saturatiecurve van runderhemoglobine.
Gemeten bij : pH = 6,8 T = 20° C
Hb = 1 m mol/l. s.As = 650 nm.
0.5 - - - - - - -
I I I I I 0.1 - - - - - - - - -1- - ---- - - - -
0 I
0 8 2 t 90 4 6
t (min.)
Figuur 5.5 Oeoxygenatie en oxygenatie van runderhemoglobine.
Hb = 0,078 m mol/1. KCl = 0,5 mol/1. T = 20°c.
- 33 -
Hoewel de getoonde curve onnauwkeurig is, kan geconcludeerd warden,
dat men in principe met deze opstelling zuurstofbindingscurven kan
meten: beide onafhankelijke meetsystemen (p02 en S) zijn tegelijker
tijd getest en geven (binnen meetonnauwkeurigheid in S) reproduceer
bare resultaten.
5.4. Oxygena;tle en deoxygena;tie.tijd a1...6 nunc;t,i_e van [KCl] en [Hb]
Na optimalisering van het fotometersysteem zijn er een aantal (de)
oxygenatie-experimenten verricht.
Bij een Serie experimenten is de invloed van de zoutconcentratie,
[KCl] op de (de)oxygenatietijd gemeten (fig. 5.7.). Bij de tweede serie
is de oxygenatietijd als functie van [Hb] gemeten.
Figuur 5.5. geeft het verloop van de saturatie tijdens een deoxy
genatie- resp. oxygenatieproces. De saturatie is bepaald uit de ver
houding van de absorpties bij twee golflengten As en Ai (zie 3.2.:
meetprincipe). Ieder experiment is twee keer verricht; de onderlinge
verschillen in oxygenatie- en deoxygenatietijden is minder dan 2 %.
Uit vergelijking van figuur 5.3. met figuur 5.5. blijkt dat saturatie
metingen m.b.v. 4 lichtkanalen aanzienlijk nauwkeuriger zijn dan met
1 kanaal; de ruis in betreffende metingen is 4 a 5 % resp. 1 %.
In figuur 5.6. zijn de resultaten vermeld van 5 verschillende ex
perimenten, nl. met [KCl] is 0 - 0,01 - 0,05 - 0,1 en 0,5 mol per
liter. Verticaal is uitgezet de tijdsduur voor 50 % en 90 % deoxyge
natie, t 50 en t90 • Horizontaal is p50 uitgezet. Stijgende zoutcon
centratie verlaagt de zuurstofaffiniteit van hemoglobine en verhoogt
de p50 (Breepoel, 1981). Verlaging van de zuurstofaffiniteit betekent
een snellere deoxygenatie. Kwantitatieve interpretatie is (nog) niet
mogelijk, omdat er geen literatuur gegevens zijn omtrent de relatie
tussen deoxygenatietijd en p50 , zowel theoretisch als experimenteel.
500 t (s)
400
300
200
100
- 34 -
Figuur 5.6 Deoxygenatietijden t 50 en t 90 als functie van de P50 .
0.5
100 200 300 400 t (s)
Figuur 5.7 Oxygenatietijden t 50 en t 90 als functie van de
hemoglobineconcentratie.
- 35 -
In figuur 5.7. is de oxygenatietijd uitgezet tegen de [Hb]. Het
verband tussen oxygenatietijd en [Hb] kan afgeleid warden uit de
advancing front theory (Spaan, 1973). Deze theorie geeft een benade-
ring voor de plaats van het oxygenatiefront in de oplossing. Uit
gangspunten zijn: een scherpe overgang tussen de volledig geoxyge
neerde hemoglobine en de hemoglobine met initiele verzadiging S en
een recht o2-profiel; zie figuur 5.4. en figuur 4.2.
Voor een stilstaande laag kan het verband tussen [Hb] en oxygenatie
tijd als volgt warden afgeleid:
Totale hoeveelheid o2 in de oplossing:
Zuurstofflux door permeable wand is gelijk de toename van de hoeveel-
heid o2 in de oplossing:
-o0 .P0
= x(t).~~(t) O P0
a0 + k.CHb} 2 2
1 d{x(t)}2 = 2 dt {~po aO + k.CHb}
2
CHb = Hb-concentratie
p0
= partiele zuurstofspanning
ao = oplosbaarheidscoefficient 02 2
x(t) = breedte van het o2-profiel.
k.x(t) = afstand van het Hb02 front tot x = 0 (evenredigheidsconst. k).
- 36 -
Uit bovenstaande formule volgt een lineair verband tussen [Hb] en
de tijd waarop het front een bepaalde plaats x(t) bereikt (d.i. een
maat voor de oxygenatietijd).
Uit figuur 5.7. blijkt, vanwege het lineair verband, een goede
overeenkomst tussen experiment en advancing front theory.
1--------~
s
< x(t) ) 0 +-(-----..,:---:-:---~)
k.x(t)
F,i,g. 5. 4. o2 en Hb02 profi e 1 vo 1 gens advancing front theory.
- 37 -
6. V1SCUSSIE
6.1. Mee.tme.:thode, mee;tn.a.uw~eu/Ughe,,i,d
De bepaling van de zuurstofverzadigingsgraad aan de hand van ab
sorptiemetingen bij 2 golflengten en 4 lichtbundels geeft een belang
rijke verbetering in de signaal-ruis-verhouding t.o.v. absorptiemetin
gen bij 1 golflengte en 1 of 2 lichtbundels.
Verstoringen door variaties in de lichtsterkte en de hemoglobine
concentratie worden geminimaliseerd.
Hoewel de meetopstelling niet gethermostatiseerd is, blijkt zowel
de saturatie als de gemeten zuurstofspanning weinig drift te vertonen
als gevolg van temperatuurveranderingen; voor beide signalen is de
drift in een uur kleiner dan 0,5 %.
De micro-electroden worden na verloop van tijd instabiel, waarschijn-
1 ijk t.g.v. slechte isolatie. Bij goede isolatie voldoen de gebruikte
micro-po2-electroden aan vereiste meetnauwkeurigheid.
Zoals eerder vermeld, bevat de diffusiekamer twee gasdoorlatende
wanden (teflon-membraan). De diffusiekamer, in perspectief weergege
ven in figuur 6.1. heeft de afmetingen ~ x 1 x 12 mm; de wanden
waardoor gasuitwisseling met de omgeving plaatsvindt, hebben de af
metingen 1 x 12 mm.
In figuur 6.2. is de voorzijde van een beitel met gaskamer en
van een beitel met glasvezels getekend. In de tekening is te zien dat
de gaskamer (lengte 9,5 mm) wegens constructietechnische redenen
korter is dan de meetcel (lengte 12 mm); in de meetcel zijn er dode
ruimten met betrekking tot de gasuitwisseling met de omgeving.
1 mm
/ /
/ /
/ /
( ) 0.5 mm
- 38 -
/
A B
FiguuJt 6.Z. A: Perspectief-tekening meetcel
B: Voorzijde van een beitel met gaskamer (links)
en van een beitel met p02 electroden en glas
fibers (rechts).
Hierdoor zou men kunnen verwachten dat de responstijd voor een stap
vormi ge verandering van de po2 in de gasfase, in het midden van de
meetcel kleiner is dan die aan de randen.
Om het effect van de dode ruimte te kunnen meten, zijn er tussen
de glasvezels op verschillende plaatsen po2-electroden aangebracht.
Bij een stapvormige verandering van de po2 in de gasfase is op Z pla.a.:t.l>en
gelijktijdig het verloop van de p02 in de Hb-oplossing gemeten: in
het midden en op 2,5 mm afstand tot het midden (afstand tussen canule
buisjes: 7 mm). Bij experimenten met een (de)oxygenatie van 10 minuten
- 39 -
of meer zijn er geen meetbare verschillen gemeten tussen de zuurstof
spanningen gemeten door beide electroden.
Bij huidige constructie van de meetcel kan de meettijd voor 1
saturatiecurve 1 uur bedragen (sterk afhankelijk van [Hb] en p50 ).
Indien men een saturatiecurve sneller wil meten, zou men de afmetingen
van de meetcel in diffusierichting kunnen verkleinen; d.w.z. de voor
zijde van de p02-beitels smaller maken. De afstand tussen de o2-permeabele
wanden wordt namelijk bepaald door de beitels met glasvezels.
Een van de eisen aan de meetopstelling is, dat ook van geconcenteer
de hemoglobine-oplossingen de zuurstofbindingscurve gemeten kan warden.
Naarmate de [Hb] toeneemt, wordt het transmissiesignaal zwakker en
stijgt de diffusietijd voor het laagje Hb-oplossing.
Het meetsignaal van de fotodiode blijkt voor 620 <A< 800 nm ruim
voldoende om nauwkeurig de saturatiegraad te kunnen meten van Hb
oplossingen met Hb-concentratie van 3 m mol/l.
De p02 en de saturatie warden gemeten waar de gradienten van o2 en
S minimaal zijn, namelijk in het midden van het laagje. De nauwkeurig
heid van de saturatiemeting wordt mede bepaald door de saturatie
gradient ter plaatse van de glasvezels. Voor het afschatten van de max.
gradient in S die er tijdens het deoxygenatieproces over de glasvezels
staat, kiezen we als uitgangspunt dat een laagje met [Hb] = 3 m mol/l
in een uur tijd gedeoxygeneerd wordt.
(
- 40 -
0.5mm
65um glasvezel
FiguuJL 6.3. Hb02-gradient in de oplossing.
)
De zone preci es in het midden van de meetce 1 (fig. 6. 3.) wordt
gedeoxygeneerd t.g.v. diffusie van o2 en Hb02. De Hb02 diffusie levert
in deze situatie de belangrijkste bijdrage {advanding front theory).
De deoxygenatie van deze zone wordt bepaald door de Hb02-gradient
langs de rij glasvezels.
Hb02 flux bij de fiberranden is:
JHbO -DHbO d [Hb0 2]
= dx 2 2
-2.10-7. d [Hb02]
( m21 ) = dx cm .s
[Hb] = 3 mM +per cm3: 3.10-6 mol Hb.
Flux per cm2 oppervlak is gelijk aan Hb02-afname per seconde.
afname per sec: 3.10-6 mol Hb per cm3 3600
In volume-element met afmetingen: 70 µm x 1 cm x 1 cm [Hb02] afname:
3.10-6 4 · 70.10- mol Hb per sec. 3600
- 41 -
Dit is gelijk aan 2 x de Hb02-flux:
X 3.70 .
10-10 -7 d [Hb02] mol
2 jO"Q'O" = +2.lO dx 2 cm .s
d [Hb02] -3 + dx = 0,015.10
mol cm4
+ Concentratiegradient: 15.10-6 mol 15.70.10-lO lllO~ over 70 µm cm4 = cm
= 10-7 mo~ over 70 µm cm
= 10-4 ~over 70 µm = 0,1 m mol
over 70 µm
= 0,05 mM over 35 µm.
Op grand van deze ruwe afschatting is er in de zone tussen de fibers
een saturatieverschil van 1 a 2 %.
- 42 -
7. CONCLUSIES, VOORTZETTING VAN HET ONVERZOEK
Met betrekking tot de gestelde eisen heeft de ontwikkelde opstelling
voor meting van zuurstofbindingscurven de volgende eigenschappen:
1. de benodigde monsterhoeveelheid is klein (6 µl);
2. er kan gemeten warden in geconcentreerde hemoglobine-oplossingen
([Hb] = 3 m mol/liter);
3. de meettijd voor een saturatiecurve (deoxygenatie + oxygenatie)
van een oplossing met [Hb] = 3 m mol/l en [KCl] =0,5 mol/l bedraagt
een uur.
Voor lagere Hb-concentraties is de meettijd minder dan een uur. Met
behulp van micro-po2-electroden kan men de p02 in het monster nauwkeurig
(0,05 kPa) meten. De metingen zijn goed reproduceerbaar (relatieve af
wijking < 1 %). De electrische isolatie van de p02-electroden ver
slechtert na verloop van tijd; mogelijk is dit te wijten aan de in
werking van chemicalien op de isolatie.
Absorptiemetingen verricht bij twee golflengten en 4 lichtkanalen
geven een aanzienlijke verbetering in de signaal-ruis-verhouding t.o.v.
metingen verricht aan een of twee lichtkanalen.
Er zijn zuurstofbindingscurven gemeten in een situatie waarin het
optisch systeem slechts gedeeltelijk gebruikt is (een golflengte, zon
der referentie). Oxygenatie- endeoxygenatie-experimenten tonen aan dat
met de volledige opstelling de meting van de saturatie veel nauwkeuriger
kan.
Dit onderzoek zal verder voortgezet warden binnen de afdeling Fysio
logie van de Katholieke Universiteit te Nijmegen. De voortzetting zal
in eerste instantie gericht zijn op het (opnieuw) fabriceren van micro-
- 43 -
p02-electroden en het meten van zuurstofbindingscurven.
Suggesties voor andere experimenten zijn:
- Het meten van de invloed van bijvoorbeeld pH, temperatuur, zout
concentratie, pC02 op de p50 en op de ligging van de zuurstofbindings-
curve.
- Het doen van experimenten waarbij de meetcel slechts een gasdoorlatende
wand heeft. Door het tijdsverloop van p02 en S te meten na stap-
vormige verandering van de P0 aan de gasdoorlatende wand kunnen theo-2
retische zuurstof- en saturatieprofielen (Spaan, 1976) geverifieerd
worden.
In toekomstig onderzoek kan de mogelijkheid bestudeerd worden om
gelijktijdig pH-meting te verrichten en zuurstofbindingscurven van bloed
te meten. Hierdoor kan het meten van zuurstofbindingscurven ook in de
kliniek van toepassing zijn.
- 44 -
APPENVIX A: Invloed van de bandblteeclte van de monochJr.oma..tl6che Li.ch,t-
bu.ndel op de Li.ne.aJU;te,lt van de notomde.Jt
De bandbreedte vanhetmonochromatisch licht uit kanaal met golf
lengte As is afhankelijk van het interferentiefilter; de gebruikte
interferentiefilters voor A = 578 nm en A = 650 nm hebben een band-
breedte van respectievelijk 3 nm en 6 nm. Omdat het verschil tussen de
extinctiecoefficienten EHb en EHbO afhankelijk is van A, zie figuur A-1, 2
is de extinctie niet exact l ineair met de saturatie S. Onderstaande be-
rekening geeft een schatting van de fout in de meting van S, als men
veronderstelt dat de extinctiecoefficient evenredig is met S.
10 -- -------- £ *
5
0 542 578
A (nm)
Figu.Wt A-7. Absorptiekarakteristiek van hemoglobine met
S = 0, 20, 40, 60, 80 en 100 %.
- 45 -
De totale intensiteit gemeten door de fotodiode is:
(1)
(2)
waarin I0
(A) = emissiespectrum van de lichtbron
g(A) = responskarakteristiek van de fotodiode
c = concentratie
d = laagdikte
E = extinctiecoefficient
Als ~E geen functie is van A, dan is de extinctie evenredig met S:
deze term is onafhankelijk van S
Als ~E = ~E(A), dan vervangen we ~E door de som van een constante term
E* en een correcti~eterm oE: ~E = E* + oE.
Schrijven we h(A) voor I0
(A)9(A), dan wordt formule (2):
I = J h (A)exp(-cdEHb) exp (-cdE*.S)exp(-cdoE.S)dA
~A
= exp(-CdE*.S) f h(A)exp(-CdEHb)exp(-cdoE.S)dA oA
(4)
(5)
- 46 -
£Hb is ongeveer 40.106 cm2/mol Hb (in fig. A.1. is£ in cm2/mol Fe)
6£ is 24.106 cm 2/mol Hb
0£ < 4.106 cm2/mol Hb
eds 0£ < 0,03 voor [Hb] < 0,5 m mol/l.
De laatste e-macht uit formule (4) is te benaderen door:
1 - cdSo£ (fout in benadering: 1 °100).
De formule voor de intensiteit wordt:
I = exp(-cdS£*)J h(A)exp(-cd£Hb) (1-cdSo£}dA 6A
Stel we nemen de maximale waarde voor 0£ (= 4.106 cm2/mol Hb) dan is
cdSo£ = 0,03 s
Stel J h(A)exp(-cd£Hb)dA = i0, dan wordt de intensiteit: 6A
log I = - 0,434 cdS£* - log i0
+ log (1-0,03 ,$)
Een goede benadering voor log (1-0,03;S) is 0,434 (-0,03 S) (fout: 0,5 °/oo).
De gemeten extinctie, log I, blijkt dus in zeer goed benadering even
redig te zijn met de saturatiegraad S. Voor A = 650 nm geldt een ana
loge beschouwing.
Ref . .As
-r-------'--__J L. I. r-----:-1 ___ -J log
goo
H20~al0 Hb ~al 1o(-Ecd)
0
L.1. r----------1 log
log
I log a/
0
rY".:=~.ltV:r:~ I I
----..-""L ,......, I I I
logal0 - ECd
I I I
I I -,....~.....:.l_,j~/ I
I I L _________ j
- 48 -
APPENV1X C: SpecA.6iccttie appaJta..tu.u.Jt
Lichtbron:
Monochronometer:
Hg-Xe booglamp, 200 W. Oriel, model 6291;
continu emissie-spectrum: 0,03 W/nm.
Oriel, model 7240
Spleetbreedte
280 µm
120 µm
50 µm
bandbreedte
2 nm
1 nm
0,5 nm
Interferentiefilters: Type: Balzers
Fotodiode:
L.I. Amplifiers:
Chopper:
/.. = 594, 650 nm
United Detector Technology. Type: Pm - lODFP
Lineaire output: 10- 11 W tot 10-3 W
Frequentie respons: 15 MHz
Gevoeligheid: 0,1 µA/µW.
Princeton Applied Research, model 5101
Gevoeligheid: 1 µV - 250 mV
Tijdconst: 1 ms - 30 s
Rofin, type 7510
8-delige chopperschijf; 20 Hz < f < 2 kHz.
- 49 -
REFERENTIES
BERNARDS, J.A., L.N. BOUMAN: Fysiologie van de mens, 3e druk, 1979 Bohn, Scheltema en Hlkema, Utrecht, 1979, Oosthoek's Uitgeversmaatschappij B.V.
BOLDT, M., K. HARBIG, G. WEIDEMANN, D.W. LUBBERS: A sensitive dual wavelength microspectrophotometer for the measurement of tissue fluorescence and reflectance. PflUgers Arch. 385: 167-173, 1980.
BREEPOEL, P.M., F. KREUZER, M. HAZEVOET: Interaction or organic phosphates with bovine hemoglobin. PflUgers Arch. 389: 227-235, 1981.
CLERBAUX, Th.: Methodes pur determiner la courve de dissociation de l'hemoglobine. Bull. europ. Physiopath. resp . ...!£.: 487, 1976.
DOLMAN, D., S.J. GILL: Membrane-covered thin-layer optical cell for gasreaction studies of hemoglobin. Anal. Biochem. 87: 127-134, 1978.
DUVELLEROY, M.A., R.G. BUCKLES, S. ROSENKAIMER, C. TUNG, M.B. LAVER: An oxyhemoglobin dissociation analyzer. J. Appl. Physiol. 28: 227, 1970.
ELIOT, R.S., H. MIZUKAMI: Oxygen affinity of hemoglobin in persons with acute myocardial infarction and in smokers. Circulation 34: 331-336, 1966.
GOLDSTEIN, S.R., G.I. PETERSON, R.V. FITZGERALD: A miniature fiber optic pH sensor for physiological use. J. Biochem. Engin. 102: 141, 1980.
IMAIZUMI, K., K. IMAI, I. TYUMA: On the validity of the spectrophotometric determination of oxygen saturation of hemoglobin. J. Biochem. 83: 1707-1713, 1978.
KIMMICH, H.P., F. KREUZER: Catheter p02 electrode with low flow dependency and fast response. Respir. Physiol. l= 100-110, 1969.
De KONING, J., G. GIJSBERS: Gefaciliteerd transport van zuurstof door een hemoglobine of myoglobine film. Afstudeerverslag, T.H.E., 1974.
KREUZER, F., L.J.C. HOOFD: Facilitated diffusion of oxygen in the presence of hemoglobin. Respir. Physiol. _!! :280-302, 1970.
KREUZER, F., Z. TUREK: Influence of the position of the oxygen dissociation curve on the oxygen supply to tissues. In: High Altitude Physiology and Medicine, vol. I; W. Breugel and R.A. Zink {eds.), series Topics in Environmental Physiology and Medicine, Springer Verlag, New York, 1981.
- 50 -
LANDSMAN, M.L.J. et al.: A fiberoptic reflection densitometer with cardiac output calculator. PflUgers Arch. 379: 59-69, 1979.
PERUTZ, M.F.: X-Ray analysis of hemoglobin. Science 140: 863-869, 1963.
SCHOLANDER, P.F.: Oxygen transport through hemoglobin solutions. Science 131: 585-590, 1960.
SICK, H., K. GERSONDE: Theory and application of the diffusion technique for measurement and analysis of o2-binding properties of very autoxidizable hemoproteins. Anal. Biochem. 47: 46-56, 1972.
SPAAN, J.A.E.: Transfer of oxygen into haemoglobin solution. PflUgers Arch. 342: 289-306, 1973.
SPAAN, J.A.E.: Oxygen transfer inlayers of hemoglobin solution. Dissertatie, T.H.E., 1976.
WEAST, R.C. et al.: Handbook of Chemistry and Physics. The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, U.S.A., 1978/79
WILLARD, MERRIT and DEAN: Instrumental Methods of Analysis. 5th edition. D. van Ostram Company, New York, 1974.
WITTENBERG, J.B.: The molecular mechanism of hemoglobin facilitated oxygen diffusion. J. Biol. Chem. 241: 104-114, 1966.
WOODSON, R.D.: o2 Transport: DPG and Pso· A.T.S. News, 3,. 2, 22, 1977.