Efficient concerted integration Efficient concerted integration by recombinant HIV-1 by recombinant HIV-1

integrase without cellular or integrase without cellular or viral cofactorsviral cofactors

Sapna Sinha, Michael H. Pursley and Duane P. Sapna Sinha, Michael H. Pursley and Duane P. GrandgenettGrandgenett

JOURNAL OF VIROLOGYJOURNAL OF VIROLOGY

Avril 2002Avril 2002

Différents types d’intégrationDifférents types d’intégration

Intégrase

Donneur ADN

Receveur

Intégration 1 LTR = Half-Site Integration

(HSI)

Intégration 2 LTR = Full-Site Integration

Integration Concertée(FSI)

CAGT ACTG GTCA TGAC

CAOH ACTG GTCA HOAC

2(pGpT)

CAOH ACTG GTCA HOAC

5’A C

TGAC

C A5’

CAGT

TGAC

CAGT

Formation d’extrémités 5’ sortantes : Processing

Transfert de brin

NOYAU

3’ 5’

5’ 3’

5’

5’

5’

5’

CYTOPLASME

3’

3’ Génome de la cellule hôte

ADN proviral

Duplications au niveau du Duplications au niveau du génome de l’hôtegénome de l’hôte

Au niveau de l’ADN cellulaire, l’intégration du génome viral entraîne une duplication de duplication de quelques paires de basesquelques paires de bases de chaque coté de l’ADN viral.

La taille de cette duplication est spécifique de spécifique de chaque viruschaque virus6 pb pour les virus ALSV

5 pb pour HIV-15 pb pour HIV-1 (Asante-Appiah and Skalka, 1997)

Etat des connaissancesEtat des connaissances 1° expériences avec INT purifiée – donneurs ADN linéaires – receveurs 1° expériences avec INT purifiée – donneurs ADN linéaires – receveurs

ADNADN efficacité et fidélité très variablesefficacité et fidélité très variables inefficacité de d’intégration concertée inefficacité de d’intégration concertée fidélité variable des duplications de 5 pbfidélité variable des duplications de 5 pb

EfficacitéEfficacité = 10% donneur intégré à la cible en 20 min à 37°C = 10% donneur intégré à la cible en 20 min à 37°C

Grande variabilité des résultatsGrande variabilité des résultats intervention de cofacteurs cellulaires ?intervention de cofacteurs cellulaires ? rINT de RSV: HMG 2 et HMG-I(Y) cellulaires rINT de RSV: HMG 2 et HMG-I(Y) cellulaires efficacité FSI efficacité FSI rINT HIV-1: HMG-I(Y) et NCrINT HIV-1: HMG-I(Y) et NC variation de l’activité de l’INT elle-même ?variation de l’activité de l’INT elle-même ?

rINT HIV-1 rINT HIV-1 in vitroin vitro inefficace seule pour FSI inefficace seule pour FSI Fidélité # 70%Fidélité # 70%

Anomalies de repliement ?Anomalies de repliement ? Agrégation ?Agrégation ?

Objectif de l’étudeObjectif de l’étude rINT de HIV-1wt peut-elle réaliser seule une rINT de HIV-1wt peut-elle réaliser seule une

intégration concertée efficace ?intégration concertée efficace ?

Ou nécessité de cofacteurs cellulaires ou viraux ?Ou nécessité de cofacteurs cellulaires ou viraux ?

StratégieStratégie Purification et utilisation INT recombinante purifiée à Purification et utilisation INT recombinante purifiée à

faible concentrationsfaible concentrations éviter l’agrégationéviter l’agrégation

Étude de la coexpression INT / protéines chaperonnes Étude de la coexpression INT / protéines chaperonnes GroEL-GroES chez des bactériesGroEL-GroES chez des bactéries

éviter les anomalies de repliement de rINTéviter les anomalies de repliement de rINT

Matériels et méthodes (1)Matériels et méthodes (1) Donneur LTR: ADN linéaire 480 pb Donneur LTR: ADN linéaire 480 pb

marqué marqué 3232P P SupFSupF sélection site restriction BglII unique

Receveur plasmide pGEM3

rINT Clonée dans pET11a expression dans cellules BL21(DE3)

Protéines chaperonnes plasmide pGroESL également exprimé dans BL21(DE3)

Matériels et méthodes (2)Matériels et méthodes (2) Purification de rINT BL21(DE3) : pET11a +/- pGroESL

Centrifugation

Tampon + sonicationsurnageant

culot

+ NaClLavages et centrifugationssurnageant

culot+ NaCl 1Mcentrifugation

surnageantINT 60% pureté

Seph

Hép

1 22’ INT >90%

pureté

+ tampon standard (Mg++)

3h

+ IPTG

Résultats (1)Résultats (1) Expression rINT dans BL21(DE3) Expression rINT dans BL21(DE3)

Niveau d’expression et de pureté indépendants de GroES et Niveau d’expression et de pureté indépendants de GroES et GroELGroEL

Stabilité des extraits INT /NaCl 1MStabilité des extraits INT /NaCl 1M

Lys

at

cell

ula

ire

T0

Lys

at

cell

ula

ire

IPT

GMatMatéériels et mriels et mééthodes (2)thodes (2)

INT recombinante purifiéeBL21(DE3) : plasmide INT +/ - pGroESL

Centrifugation

Tampon + sonicationsurnageant

culot

+ NaClLavages et centrifugationssurnageant

culot+ NaCl 1Mcentrifugation

surnageantINT 60% pureté

SephHép

1 22’

INT >90% pureté

+ tampon standard (Mg++)

surnageants

+ + chaperonchaperonss

Résultats (2)Résultats (2) Purification rINT et transfert de brinPurification rINT et transfert de brin éviter agrégation rINT en solution : faible concentrations

sur colonnes: utilisation totalité extrait NaCl 1M sur colonne 1

fractions les plus riches en INT colonne 2

rINT purifiée à basse concentration reste active HSI et FSI

Résultats identiques avec/sans GroES GroEL

Fractions 38 à 49- +

0 0 chaperonchaperons, 20 s, 20 min, min, 37°C37°C

Résultats (3)Résultats (3)

ConnaissancesConnaissances

Zn++, Mg++ et détergents non ioniques perturbent l’association des sous-unités d’INT

perturbation activité

Tampon standard contient Mg+Tampon standard contient Mg+++

Suppression Mg++ Suppression Mg++ ajout 10% glycérolajout 10% glycérol pureté identiquepureté identique transfert de brin transfert de brin

comparablecomparable

Activité rINT indépendante de la présence de Zn++, Mg++ et glycérol dans les tampons

Influence de la composition des tampons sur Influence de la composition des tampons sur activité rINT ?activité rINT ?

3-4: + chaperons, Seph x2 5-6: + chaperons, Hép-Seph7-8: Hép-Seph

Résultats (4)Résultats (4) Fidélité des duplications 5pb lors de Fidélité des duplications 5pb lors de l’intégration concertéel’intégration concertée

Utilisation préférentielle U5U5 pour intégration

Fidélité # 70%70% sans chaperonssans chaperons selon les études par les protéines chaperons ? séquençage de la zone d’insertion

Présence de protéines chaperons n’augmente pas la fidélité des duplications 5 pb

Résultats (5)Résultats (5) Comparaison qualitative des activités des Comparaison qualitative des activités des rINTrINT

Action des protéines chaperonsAction des protéines chaperons

3-7: 0 chaperons, gamme [rINt] 9-13: + chaperons, gamme [rINt]

9: reproductible concentration seuil rINT nécessaire

autre étude: chaperons améliorent très légèrement HSI -FSI

Action de Zn++Action de Zn++Zn++ stimule la multimérisation

des su d’INT et stimule légèrement HSI

Légère FSI

RésuméRésumé HIV rINT capable d’effectuer aussi bien HSI que FSI sans cofacteurs HIV rINT capable d’effectuer aussi bien HSI que FSI sans cofacteurs in in

vitrovitro

Modèle:

Modalités de préparation et d’utilisation de rINT influent Modalités de préparation et d’utilisation de rINT influent

sur ses facultés de polymérisation sur ses facultés de polymérisation

sur l’efficacité de l’intégration concertéesur l’efficacité de l’intégration concertée

Limites: Limites:

Étude Étude in vitroin vitro: intervention d’autres protéines chaperons : intervention d’autres protéines chaperons in vivoin vivo ? ?

Perspectives:Perspectives:

Mutagénèse dirigée pour étudier les interactions structurales nécessaires à Mutagénèse dirigée pour étudier les interactions structurales nécessaires à l’association en tétramèresl’association en tétramères

Détergents non ioniques

+

Zn++ +

+