efeitos de diferentes temperaturas sobre as cÉlulas

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

ÉRIKA RAMOS DE ALVARENGA

EFEITOS DE DIFERENTES TEMPERATURAS SOBRE AS CÉLULAS GERMINATIVAS E SOMÁTICAS DO TESTÍCULO

DE TILÁPIAS (Oreochromis niloticus) ADULTAS

Belo Horizonte 2008

ÉRIKA RAMOS DE ALVARENGA

EFEITOS DE DIFERENTES TEMPERATURAS SOBRE AS CÉLULAS GERMINATIVAS E SOMÁTICAS DO TESTÍCULO DE

TILÁPIAS (Oreochromis niloticus) ADULTAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Biologia Celular Orientador: Prof. Dr. Luiz Renato de França

Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas da UFMG

2008

“Efeitos de diferentes temperaturas sobre as células germinativas e somáticas do testículo de tilápias (Oreochromis niloticus) adultas” Dissertação defendida em 18/03/2008 Resultado: Banca examinadora

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Prof. Dr. Luiz Renato de França (Orientador)

Dedico este trabalho a minha família, especialmente, aos meus pais, Antônio e Dalva e avós Rosa e Líbia;

Aos meus irmãos, Tiago e Danielle; E ao sempre companheiro Marcos.

Obrigada por tudo!

AGRADECIMENTOS

Parafraseando Milton Nascimento, um peixe vivo não pode viver fora da água fria, assim, a

companhia de muitos foi fundamental na minha trajetória e na realização desse trabalho e,

dessa forma, não poderia deixar de agradecer:

À Deus por iluminar meu caminho e, principalmente, por colocar nele pessoas muito

especiais, sem as quais não seria possível a realização desse trabalho.

Ao professor Dr. Luiz Renato de França pela competente orientação, oportunidade,

incentivo e exemplo de dedicação ao trabalho e à Ciência.

À minha família, em especial, aos meus pais, Antônio Duarte de Alvarenga e Dalva de

Fátima Ramos de Alvarenga, meus irmãos Tiago e Danielle e avós Líbia e Rosa, pelo

exemplo de retidão, pelo amor incondicional e incentivo constante.

Ao Marcos, companheiro de todas as horas, pelo carinho, cuidado, incentivo e amor. E à

família Cabral, pela acolhida, conselhos e apoio.

Aos amigos do Laboratório de Biologia Celular, pelos inúmeros momentos de

aprendizagem, cooperação, incentivo e discussões científicas e não científicas: Amanda,

Carolina, Caroline, Dirceu, Edson, Daniel, Fernando, Gleide, Guilherme, Jaque, Julia,

Juliana, Leonardo, Luís Henrique, Marcelo, Rafael (companheiro nas discussões sobre

vários aspectos da espermatogênese em peixes), Robson, Samyra e Sérgio (companheiros

de viagem), Sarah (companheira inseparável do microscópio), Stella e professora Tânia.

Ao Adriano Moreira e Mara Lívia, técnicos e amigos do Laboratório de Biologia Celular, que

com muita paciência e alegria auxiliaram constantemente a realização do trabalho.

Aos membros que compuseram a banca examinadora, Dra. Elizete Rizzo, Dra. Cleida

Aparecida de Oliveira e Dra. Tânia Mara Segatelli, por terem aceitado o convite e pela

disponibilidade na análise do trabalho.

À chefe do Departamento de Morfologia, professora Dra. Gleydes Gambogi Parreira e ao

professor Dr. Hélio Chiarini-Garcia pela amizade.

Às amigas Juliana Coelho e Juliana Rocha, pelos vários anos de amizade pela

compreensão perante minha ausência, e às companheiras Magda e Gizele pela amizade e

pelas caronas, que muito me auxiliaram no término do trabalho.

Ao pessoal do laboratório de Ictiohistologia, pela amizade e acolhida durante meus

primeiros passos na pesquisa e por transmitirem a paixão em trabalhar com peixes:

Professora Dra. Elizete Rizzo, Professor Dr. Nilo Bazolli, Mônica, Hélio Batista, Regina,

Fábio, Kinulpe, Paula, Fernanda, Ralph, Fabrício, Roberto, Flávia e Santer.

Ao corpo administrativo e aos professores do curso de Biologia Celular, especialmente a

coordenadora do programa de pós-graduação, Annamaria Ravaro Vago.

A todos os professores que compartilharam seus conhecimentos, incentivaram o estudo e a

busca de conhecimento, em especial, àqueles que instigaram a curiosidade e a criatividade.

À secretária do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular, Iraídes, pelo auxílio e

dedicação.

A todos os amigos do programa de pós-graduação em Biologia Celular, pelos momentos de

aprendizado em conjunto e de descontração.

Aos amigos do Curso de Ciências Biológicas.

Às agências de fomento, que financiaram o desenvolvimento do projeto, CAPES, CNPq e

FAPEMIG.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização desse trabalho.

Meu muito obrigada!!!!

Esta dissertação foi realizada no Laboratório de Biologia Celular do Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, sob a orientação do Prof. Dr. Luiz Renato de França e com o auxílio das seguintes instituições: - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal Nível Superior (CAPES) - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). - Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG)

“Saltar sobre o vazio, pular de pico em pico. Não ter medo da queda. Foi assim que se

construiu a ciência: não pela prudência dos que marcham, mas pela ousadia dos que

sonham. Todo o conhecimento começa com o sonho. Mas sonhar é coisa que não se

ensina. Brota das profundezas do corpo, como a água brota das profundezas da terra.”

Rubem Alves

RESUMO

Ao longo do ciclo reprodutivo anual, variações nas condições ambientais, especialmente da temperatura, são responsáveis por alterações significativas nos testículos de grande número de espécies de peixes. Nesse grupo de vertebrados, apesar da temperatura ser considerada como importante modulador da atividade reprodutiva, existem poucos estudos que analisaram especificamente o efeito desse fator sobre parâmetros histológicos e morfométricos que permitem avaliar funcionalmente os testículos. Nesse contexto, o principal objetivo do presente estudo foi analisar os efeitos de diferentes temperaturas sobre os componentes do testículo, proliferação e apoptose das células germinativas e proliferação das células somáticas testiculares em tilápias (Oreochromis niloticus). Com esta finalidade, vinte e oito tilápias adultas mantidas em cada uma das temperaturas investigadas (20ºC, 25ºC, 30ºC e 35ºC) receberam injeção intracelomática de timidina triciada (1µCi/g por peso corporal) como marcador das células que se encontravam sintetizando DNA no momento da injeção. Os peixes foram sacrificados 2 horas após a injeção e fragmentos dos testículos foram fixados em glutaraldeído 4%, incluídos em glicol metacrilato e preparados para análise histomorfométrica e autoradiográfica. Dentre as células germinativas, o percentual de espermatogônias do tipo B intermediárias e finais e espermatócitos em pré-leptóteno foi maior em tilápias mantidas a 20°C em comparação com as demais temperaturas, enquanto a freqüência de diplóteno/espermatócitos secundários foi menor em peixes a 20°C quando comparados aos animais a 30°C. A apoptose de células germinativas foi maior nas tilápias mantidas a 20°C em comparação com 25°C, que é a temperatura considerada fisiológica para a reprodução das mesmas. O lúmen dos túbulos dos seminíferos foi menor nos peixes mantidos a 20°C e 25°C comparado com 35°C. Tilápias mantidas a 30-35°C mostraram menor índice de proliferação de células de Sertoli e de Leydig quando comparadas aos peixes mantidos a 20°C-25°C, sendo também obtida correlação positiva entre o índice de proliferação desses dois tipos celulares. A proliferação das células peritubulares mióides não sofreu variação significativa nas temperaturas investigadas. Em conclusão, pode-se sugerir um modelo de ação da temperatura em tilápias, no qual baixas temperaturas (20°C) induzem a renovação espermatogonial e altas temperaturas (30°C e 35°C) desencadeiam a rápida diferenciação das células germinativas, com conseqüente formação de grande número de espermatozóides. O atraso na evolução do processo espermatogênico que ocorre nas temperaturas mais baixas é acompanhado por maior proliferação de células de Sertoli e de Leydig e por apoptose das células germinativas. Testículos de tilápias mantidas a 20°C apresentaram características interessantes para a utilização dos mesmos como doadores no transplante de espermatogônias e no estudo de fatores que controlam a proliferação/diferenciação espermatogonial, bem como dos elementos somáticos do testículo.

ABSTRACT

During the annual reproductive cycle, environmental factors such as temperature are responsible for significant changes in the testes of a large number of fish species. In this group of vertebrates, despite the temperature being considered an important modulator of reproductive activity, there are few studies that specifically investigated the effect of this factor on histological and morphofunctional aspects of the testis. In this context, the main objective of this study was to analyze the effects of different temperatures on the structural components of the testis, proliferation and apoptosis of germ cells and proliferation of the somatic cells in tilapia (Oreochromis niloticus) testis. For this purpose, twenty-eight adult tilapias (Oreochromis niloticus) kept at the temperatures of 20°C, 25°C, 30°C and 35°C received one single intracelomic tritiated thymidine injection (~1µCi/G/BW), as a marker of cells that were synthesizing DNA at the time of thymidine injection. All fish were sacrificed approximately two hours after injection and testis fragments were fixed in 4% buffered glutaraldehyde, embedded in glycol methacrylate, and routinely prepared for histomorphometrical and autoradiographical analyses. Among the germ cells, the percentage of intermediate and final type B spermatogonia and preleptotene spermatocytes were higher in tilapia kept at 20°C in comparison with the animals kept in the other temperatures, while the percentage of diplotene/secondary spermatocytes was lower in fish kept at 20°C compared to the animals maintained at 30°C. Apoptosis of germ cells was higher in tilapia maintained at 20 °C compared with 25°C, which is considered the physiological temperature for the reproduction of this species. The volume density of the seminiferous tubule lumen was lower in fish kept at 20°C and 25°C in comparison to the animals kept at 35°C. Tilapias kept at higher temperatures (30-35°C) showed lower (p<0.05) index of Sertoli and Leydig cells proliferation when compared to fish kept at the temperatures of 20-25°C, and a positive correlation was observed between the proliferation rates of these two important somatic cell types. No clear trend was found for the proliferation rate of peritubular myoid cells at the four different temperatures investigated. In conclusion, we suggest a model for temperature action on tilapia testes where lower temperature (20°C) cause the spermatogonial renewal and higher temperatures (30-35°C) trigger the rapid differentiation of germ cells and the production of a large number of spermatozoa. The spermatogenic arrest or lower evolution of the spermatogenic process observed in lower temperatures is accompanied by the increased proliferation of Sertoli and Leydig cells and apoptosis of germ cells. Testes of tilapia kept at 20°C present interesting features that would for instance allow the utilization of these animals as donors for spermatogonial transplantation and the study of factors that control the spermatogonial proliferation/differentiation, as well as of the testis somatic elements.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Diversidade de vertebrados .................................................................................65

Figura 2 - Exemplar adulto de tilápia-nilótica (Oreochromis niloticus) .................................66

Figura 3 – Principais eventos do processo de diferenciação gonadal de tilápia XX e

XY..........................................................................................................................................67

Figura 4 - Localização e morfologia macroscópica dos testículos de tilápias sexualmente

maduras. ...............................................................................................................................68

Figura 5 - Arranjo do compartimento germinativo em tilápias nilóticas sexualmente

maduras.................................................................................................................................69

Figura 6 – Desenho esquemático e fotomicrografia de corte transversal de túbulo

seminífero de tilápia nilótica adultas, mostrando arranjo cístico da

espermatogênese..................................................................................................................70

Figura 7 - Fases da espermatogênese em tilápias nilóticas................................................ 71

Figura 8 - Corte transversal dos testículos de tilápias nilóticas adultas mostrando a

histologia panorâmica dos mesmos em diferentes temperaturas..........................................72 Figura 9 - Proporção de diferentes tipos de células germinativas em testículos de tilápias

nilóticas adultas mantidas em diversas temperaturas...........................................................73

Figura 10 – Proporção dos diferentes tipos de células germinativas em testículos de tilápias

nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas.........................................................73

Figura 11 – Apoptose de células germinativas em tilápias nilóticas adultas mantidas a

20°C.......................................................................................................................................74

Figura 12 - Percentual de apoptose em testículos de tilápias nilóticas adultas mantidas em

diferentes temperaturas.........................................................................................................75

Figura 13 - Percentual de lúmen dos túbulos seminíferos de tilápias nilóticas adultas

mantidas em diferentes temperaturas....................................................................................75

Figura 14 - Diferentes tipos de células de defesa presentes principalmente nos testículos de

tilápias nilóticas adultas mantidas a 20°C. ............................................................................76

Figura 15 - Freqüência dos cistos que compõem as fases espermatogênicas em tilápias


Figura 16 - Proliferação de diferentes tipos espermatogoniais em testículos de tilápias

nilóticas adultas. ....................................................................................................................78

Figura 17 - Percentual de cistos espermatogoniais marcados com timidina triciada em

tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas.............................................79

Figura 18 - Proliferação de células somáticas em testículos de tilápias nilóticas adultas

mantidas em diferentes temperaturas................................................................................... 80

Figura 19 - Percentual de células de Sertoli, de Leydig e peritubulares mióides marcadas

com timidina triciada em tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes

temperaturas..........................................................................................................................81

Figura 20 – Percentual de cistos de espermatogônias do tipo A e B, espermatócitos e

espermátides associados com as células de Sertoli ou próximos a células de Leydig e

peritubulares mióides em proliferação...................................................................................82

Figura 21 - Percentual de células de Sertoli em proliferação associadas com

espermatogônias marcadas e não marcadas com timidina triciada......................................83

Figura 22 - Índice apoptótico de células germinativas em tilápias nilóticas adultas mantidas

em diferentes temperaturas...................................................................................................84

Figura 23 - Modelo proposto para a ação da temperatura sobre a espermatogênese de

tilápias nilóticas adultas.........................................................................................................85

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Proporção dos diferentes componentes testiculares em tilápias nilóticas adultas


Tabela 2 - Freqüência relativa dos diferentes tipos de cistos espermatogênicos de tilápias


Tabela 3 - Índice de proliferação de cistos de espermatogônias em tilápias nilóticas adultas


Tabela 4 - Índice de proliferação de células somáticas testiculares em tilápias nilóticas

adultas mantidas em diferentes temperaturas.......................................................................89

Tabela 5 - Índice apoptótico de células germinativas em tilápias nilóticas adultas mantidas

em diferentes temperaturas...................................................................................................90

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA............................................. 15

1.1 Peixes teleósteos............................................................................................ 16

1.2 A tilápia nilótica (Oreochromis niloticus) ........................................................ 16

1.3 Testículos de teleósteos.................................................................................. 17

1.3.1 Desenvolvimento do testículo.......................................................................... 17

1.3.2 Estrutura dos testículos................................................................................... 18

1.4 Espermatogênese em teleósteos.................................................................... 19

1.4.1 Fase espermatogonial .................................................................................... 20

1.4.2 Fase espermatocitária..................................................................................... 21

1.4.3 Fase espermiogênica...................................................................................... 22

1.5 Células somáticas testiculares........................................................................ 23

1.5.1 Células de Sertoli............................................................................................ 23

1.5.2 Células de Leydig........................................................................................... 24

1.5.3 Células peritubulares mióides......................................................................... 24

1.5.4 Outras células somáticas testiculares............................................................ 25

1.6 Proliferação de células testiculares ............................................................... 25

1.7 Efeitos da temperatura na reprodução de teleósteos..................................... 27

1.8 Apoptose das células germinativas................................................................ 28

2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS..................................................................... 30

3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................ 33

3.1 Animais experimentais..................................................................................... 34

3.2 Marcação com timidina triciada....................................................................... 34

3.3 Fixação e coleta do material............................................................................ 34

3.4 Processamento histológico ............................................................................. 35

3.5 Processamento Rádio-autográfico.................................................................. 35

3.6 Morfometria..................................................................................................... 36

3.6.1 Percentual dos componentes testiculares....................................................... 36

3.6.2 Freqüência dos cistos espermatogênicos........................................................ 36

3.6.3 Índice de proliferação dos diferentes cistos de espermatogônias ................... 37

3.6.4 Índice de proliferação de células somáticas do testículo.................................. 37

3.6.5 Cisto espermatogênico associado às células somáticas em proliferação........ 37

3.6.6 Coordenação entre a proliferação de células de Sertoli e espermatogônias.... 37

3.6.7 Índice apoptótico das células germinativas....................................................... 38

3.7. Análises estatísticas.......................................................................................... 38

4. RESULTADOS.................................................................................................. 39

4.1 Biometria............................................................................................................ 40

4.2 Proporção dos componentes testiculares.......................................................... 40

4.2.1 Compartimento tubular....................................................................................... 40

4.2.2 Compartimento intertubular................................................................................ 41

4.3 Freqüência dos cistos espermatogênicos.......................................................... 41

4.4 Proliferação dos diferentes tipos de cistos de espermatogônias...................... 42

4.5 Proliferação de células somáticas testiculares.................................................. 42

4.6 Coordenação entre a proliferação de células de Sertoli e espermatogônias..... 43

4.7 Índice apoptótico das células germinativas........................................................ 44

5. DISCUSSÃO...................................................................................................... 45

5.1. Proporção dos componentes testiculares.......................................................... 46

5.1.1 Compartimento tubular e freqüência de cistos espermatogênicos.................... 46

5.1.2 Compartimento intertubular................................................................................ 48

5.2 Proliferação dos diferentes cistos de espermatogônias..................................... 49

5.3 Proliferação de células somáticas testiculares................................................... 51

5.4 Coordenação entre a proliferação de células de Sertoli e espermatogônias..... 56

5.5 Apoptose de células germinativas...................................................................... 57

5.6 Considerações finais........................................................................................... 59

6. CONCLUSÃO..................................................................................................... 62

7. ANEXOS - FIGURAS E TABELAS ................................................................... 64

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 91

1. INTRODUÇÃO

Introdução e Revisão de Literatura

1 – INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

1.1. Peixes teleósteos Os peixes constituem cerca de 50% do número de espécies de vertebrados (Fig. 1) e

exibem uma grande diversidade em sua biologia, morfologia e em habitats ocupados

(Nelson, 1994; Pough, 1999). Dentre os peixes, o táxon Teleostei constitui um dos grupos

mais abundantes e diversificados de vertebrados, sendo formado por aproximadamente 42

ordens, 431 famílias e 27 mil espécies, o que equivale a 96% dos peixes existentes (Nelson,

1994; Pudney, 1995; Pudney, 1996; Vazzoler, 1996; Le Gac & Loir, 1999; Nakatani et al.,

2001). O sucesso destes vertebrados é atribuído a uma série de adaptações que

aperfeiçoaram sua respiração, locomoção, nutrição e principalmente a reprodução (Moyle &

Cech, 1996), caracterizada pelas mais variadas estratégias reprodutivas (Hoar, 1969;

Nagahama, 1983; Borges Filho, 1987; Redding & Patiño, 1993; Pudney, 1995; Pudney 1996;

Vazzoler, 1996; Le Gac & Loir, 1999; Nakatani et al., 2001, Sato et al., 2003). Nesse

contexto, a liberação dos gametas para a fertilização externa; o desenvolvimento de órgãos

especializados para a fertilização interna; os variados tipos de comportamento e de cuidado

com a prole; e a migração reprodutiva, seja nas formas de “piracema” ou naquelas

acompanhadas por grandes alterações osmóticas, são exemplos da complexidade

reprodutiva dos teleósteos (Hoar, 1969; Borges Filho, 1987; Le Gac & Loir, 1999; Sato et al.,

2003).

1. 2. A tilápia nilótica (Oreochromis niloticus)

A tilápia nilótica (Fig. 2) (Oreochromis niloticus) é um teleósteo pertencente à ordem

Perciformes e família Cichlidae (Nelson, 1994). Essa espécie possui crescimento rápido,

dieta onívora, alta viabilidade das larvas, maturidade sexual precoce (entre 4 e 5 meses de

idade) e desova de 2 em 2 meses em temperatura acima de 24ºC. Além disso, a tilápia

apresenta boa adaptabilidade e tolerância à alta densidade de indivíduos, aos baixos teores

de oxigênio dissolvido e às grandes variações nas condições ambientais (Beamish, 1970;

Silva, 1987; Vilela et al., 2003). Todas essas características favoráveis associadas ao sabor

agradável de sua carne fazem da tilápia uma espécie de grande interesse econômico

(Fitzsimmons, 2000). Essa espécie, originária de águas tropicais da África e Oriente Médio,

está atualmente espalhada por 85 países, sendo o terceiro peixe mais cultivado após as

carpas e salmonídeos (Fessehaye, 2006). Em 2005, a produção mundial de tilápias

alcançou aproximadamente 1 milhão e 700 mil toneladas, movimentando cerca de US$ 1,8

17


bilhões de dólares nesse mesmo ano (FAO, 2005; Fessehaye, 2006; Rad et al., 2006;).

Portanto, o conjunto das qualidades altamente positivas relatadas acima torna as tilápias

excelente modelo experimental para se investigar a biologia reprodutiva de peixes

teleósteos com alto potencial produtivo (Stickney, 2000).

1.3. Testículos de teleósteos

1.3.1. Desenvolvimento do testículo O sucesso reprodutivo de animais adultos de qualquer espécie depende do

desenvolvimento normal de suas gônadas. Este desenvolvimento se inicia nos primeiros

estágios de formação do embrião e envolve processo de diferenciação bastante plástico e

complexo (Devlin & Nagahama, 2002; Strüssmann & Nakamura, 2002). Semelhante ao que

ocorre em outros vertebrados, as células germinativas primordiais de teleósteos originam-se

do mesoderma extra-embrionário no início da gastrulação e migram para a crista genital

(Nakamura et al., 1998). Assim, ao colonizar a gônada primitiva, as células germinativas

primordiais se associam às células somáticas e passam a ser denominadas de gonócitos, os

quais, potencialmente, podem se diferenciar em ovogônias ou espermatogônias (Foyle,

1993; Yoshizaki et al., 2002). Diferentemente das fêmeas, os gonócitos nos peixes machos

normalmente permanecem quiescentes até o início do processo espermatogênico, que

ocorre mais tardiamente (Strüssmann & Nakamura, 2002).

A diferenciação sexual em algumas espécies de teleósteos machos parece estar sob

forte controle genético, podendo não requerer a produção de esteróides sexuais (Devlin &

Nagahama, 2002). Por outro lado, esta diferenciação parece requerer esteróides sexuais em

determinadas espécies, estando este fenômeno aparentemente associado a fatores

ambientais, principalmente a temperatura (Wang & Tsai, 2000; Baroiller & D’Cotta, 2001;

Devlin & Nagahama, 2002; Strüssmann & Nakamura, 2002). Outros fatores exógenos tais

como pH da água, densidade populacional, hierarquia e outras condições diversas nas quais

os hormônios esteróides sofrem alterações, também podem exercer influência sobre a

diferenciação gonadal (Nakamura et al., 1998; Bairoller et al., 1999; Devlin & Nagahama,

2002; Rowell et al., 2002). Neste contexto, hormônios esteróides como 17-α-

metiltestosterona e 17-β estradiol têm sido bastante utilizados para promover reversão

sexual em peixes (Yamamoto, 1969; Nakamura et al., 1998; Baroiller & D’Cotta, 2001).

A tilápia nilótica é um peixe gonocorístico, com sistema de determinação sexual

XX/XY (Harvey et al., 2002). Suas células germinativas primordiais estão localizadas no

mesoderma próximo ao intestino dorsal no dia da eclosão das larvas e na crista gonadal 3

dias pós-eclosão (dpe) (Ijiri et a.l, 2007). A meiose das células germinativas inicia-se nas

18


gônadas XX de 25 a 30 dpe e nas gônadas XY só após a diferenciação sexual (Kobayashi

et al., 2000). Sob o microscópio de luz, os primeiros sinais de diferenciação sexual

aparecem em tilápias aos 23-26 dpe (Fig. 3), com a formação da cavidade ovariana nas

gônadas XX e dos ductos eferentes nas gônadas XY (Nakamura et al, 1998).

Recentemente, a análise do padrão de expressão de 17 genes que codificam enzimas

esteroidogênicas, fatores de transcrição e Amh (hormônio anti-Mülleriano) revelou

considerável dimorfismo sexual na abundância de transcritos durante o desenvolvimento de

gônadas XX e XY, especialmente para os genes foxl2 (forkhead box L2), cyp19a1a

(citocromo p450, família 19, subfamília A, polipeptídeo 1a) e Dmrt1 (doublesex and mab-3

related transcription factor 1) (Ijiri et al., 2007). A expressão do fator de transcrição foxl2 e da

aromatase cyp19a1a é aumentada nas gônadas XX no 5° dpe, sugerindo importante papel

desses genes na diferenciação ovariana. Em contrapartida, Dmrt1 possui possivelmente

importante papel na diferenciação testicular, com expressão específica em gônadas XY a

partir do 6° dpe. Dessa forma, em tilápias-nilóticas, a expressão diferencial de genes nas

gônadas XX e XY durante o período de 5-6 dpe é crítica para o desenvolvimento de ovários

e testículos a partir das gônadas indiferenciadas (Ijiri et al., 2007).

1.3.2. Estrutura dos testículos Os testículos de peixes estão localizados na cavidade celomática, em posição dorsal

ao tubo digestivo, ventral ao mesonefro e ventro-lateral à bexiga gasosa, encontrando-se

presos à parede corporal e à bexiga gasosa pelo mesórquio (Fig. 4). Macroscopicamente, os

testículos da maioria dos teleósteos estudados são órgãos pares, podendo estar parcial ou

totalmente fundidos entre si, apresentam tamanho similar entre o direito e o esquerdo e são

freqüentemente alongados, embora existam outras formas como lobulados e foliáceos (Le

Gac & Loir, 1999).

À semelhança de outros vertebrados, o testículo de peixes teleósteos exerce as

funções de produção de gametas (espermatogênica) e endócrina (esteroidogênica),

possuindo para isto dois compartimentos principais: (a) o compartimento tubular ou

germinativo onde se encontram células somáticas (de Sertoli e peritubular mióide) e células

germinativas que formam os espermatozóides a partir de espermatogônias tronco, num

evento biológico complexo denominado processo espermatogênico; e (b) o compartimento

intertubular ou intersticial, no qual estão presentes as células de Leydig com função

esteroidogênica, vasos, nervos, células e fibras do tecido conjuntivo (Billard, 1990; Koulish

et al., 2002; Vilela et al., 2003)

De acordo com o arranjo do compartimento germinativo, os testículos de peixes

ósseos podem ser classificados em duas categorias: testículo tubular anastomosado e

19


testículo lobular (Parenti & Grier, 2004). O testículo tubular anastomosado possui

compartimento germinativo formado por alças e túbulos ramificados que se interconectam

da periferia até o ducto testicular principal. Esse tipo de testículo é encontrado em táxon de

teleósteo primitivo como no celacanto Latimeria chalumnae. No testículo lobular, o

compartimento germinativo apresenta formato digitiforme terminando em fundo cego na

periferia ventro-lateral do testículo. Esse tipo de testículo é encontrado em teleósteos

derivados e essa característica é possivelmente uma sinapomorfia de Neoteleósteos

(Parenti & Grier, 2004). Quanto à distribuição de espermatogônias, os testículos lobulares

podem ainda ser classificados em restritos e irrestritos (Grier et al., 1980). Nos testículos

lobulares restritos, as espermatogônias estão confinadas na porção distal dos lóbulos,

sendo esse tipo de testículo característico de Anterinomorpha. Os testículos lobulares

irrestritos apresentam espermatogônias distribuídas por toda sua extensão e estão

presentes em Percomorpha (Parenti & Grier, 2004).

A tilápia-nilótica apresenta testículos pares e alongados, de superfície lisa e tamanho

semelhante entre o direito e o esquerdo (Silva & Godinho, 1983). Externamente, este órgão

é revestido por delicada cápsula de tecido conjuntivo, a túnica albugínea, da qual partem

septos fibrosos em sentido radial delimitando os túbulos seminíferos que apresentam a

mesma disposição radiada destes septos (Fig. 5). Estes lóbulos convergem para um sistema

de ductos eferentes, que desembocam, por sua vez, no ducto testicular principal, o qual se

une ao ducto testicular principal do outro testículo, formando o ducto espermático que

desemboca na papila urogenital (Silva, 1987). Quanto ao arranjo do compartimento

germinativo, os túbulos seminíferos de tilápias apresentam extremidade distal em fundo

cego, voltada para a periferia do testículo, e a extremidade proximal, terminando nos ductos

eferentes localizados ventralmente (Silva, 1987; Vilela, 2003). De acordo com essas

características, Parenti & Grier (2004) classificaram os testículos das tilápias como lobulares

irrestritos. Apesar das espermatogônias serem observadas ao longo de todo o túbulo

seminífero, células de Sertoli imaturas e espermatogônias indiferenciadas concentram-se

preferencialmente na extremidade distal dos túbulos seminíferos, próximo à albugínea

(Silva, 1987; Vilela, 2003; Schulz et al., 2005).

1.4. Espermatogênese em teleósteos

O processo espermatogênico é um evento cíclico, altamente organizado e coordenado,

no qual as espermatogônias diplóides se diferenciam em espermatozóides maduros

haplóides. Baseado em características morfofuncionais, este processo pode ser dividido em

três fases: (a) fase proliferativa ou espermatogonial, caracterizada pela auto-renovação das

espermatogônias tronco e proliferação espermatogonial, com a divisão mitótica das

20


espermatogônias comprometidas com a espermatogênese; (b) fase meiótica ou

espermatocitária, na qual o material genético é duplicado, recombinado e segregado, fase

esta importante para a diversidade genética entre membros de uma mesma espécie; e (c)

fase de diferenciação ou espermiogênica, em que as espermátides passam por

transformações morfogenéticas que culminam na formação dos espermatozóides (Russell et

al., 1990; Sharpe, 1994; Eddy, 1999). Após essas etapas ocorre ainda a espermiação, na

qual os espermatozóides são liberados para o lúmen do compartimento germinativo e a

maturação espermática, em que o gameta, morfologicamente preparado, torna-se

funcionalmente apto para fertilizar o ovócito (Schulz & Miura, 2002; Miura & Miura, 2003;

Schulz, 2003; Weltzien et al., 2004).

Na maioria das espécies de teleósteos já investigados, o processo espermatogênico

ocorre em cistos ou espermatocistos (Fig.6), formados quando células de Sertoli envolvem

uma única espermatogônia do tipo A ou primária (Grier, 1993; Pudney, 1993; Pudney, 1995;

Koulish et al., 2002). As células germinativas derivadas desta espermatogônia primária

dividem-se sincronicamente para constituir um clone de células germinativas que é

envolvido por um número variado de células de Sertoli, dependendo do tipo de cisto

(espermatogonial, espermatocitário e espermiogênico) (Vilela et al., 2003; Schulz et al.,

2005). Estes cistos encontram-se apoiados na túnica própria dos túbulos seminíferos, que é

formada por camada acelular denominada de membrana basal e pelas células peritubulares

mióides (Koulish et al., 2002).

De acordo com Vilela (2003), em tilápias nilóticas, a seqüência das células

espermatogênicas a partir da espermatogônia primária até a formação de espermatozóide

segue o seguinte esquema: espermatogônia do tipo A (primária) espermatogônias do tipo

B (em torno de 7 gerações) espermatócitos primários espermatócitos secundários

espermátides espermatozóides (Fig. 7).

1.4.1. Fase espermatogonial

Usualmente, a disposição da cromatina nuclear e o tamanho do núcleo, aliado ao

número de células germinativas por cisto, são parâmetros utilizados como referências para

se distinguirem os diferentes tipos espermatogoniais (Matta et al., 2002; Vilela, 2003;

Cardoso, 2007). Em mamíferos, já está bem estabelecido que as espermatogônias são

classificadas em indiferenciadas [do tipo A isoladas (Ais), pareadas (Apr) e alinhadas (Aal)],

estando as espermatogônias tronco provavelmente incluídas entre as indiferenciadas (Ais),

e diferenciadas [do tipo A (A), intermediária (In) e do tipo B (B)] (De Rooij, 1998; De Rooij &

Russell, 2000; De Rooij, 2001).

21


A espermatogênese se inicia com uma espermatogônia primária ou do tipo A isolada

ou espermatogônia tronco (Schulz & Miura, 2002). As espermatogônias primárias ou do tipo

A são as maiores células germinativas na maioria das espécies de teleósteos e apresentam

um núcleo proeminente e claro, com pouca heterocromatina, contendo um ou dois nucléolos

evidentes (Miura, 1999; Schulz & Miura, 2002; Lo Nostro et al., 2003; Nóbrega, 2006).

Diferente do que ocorre em mamíferos, as espermatogônias primárias em teleósteos não

mantêm contato direto com a membrana basal do túbulo seminífero, sendo encontradas

sempre envolvidas por células de Sertoli, formando o cisto de células germinativas ou

espermatocisto (Billard, 1984).

As espermatogônias primárias dão origem as espermatogônias secundárias ou do tipo

B caracterizadas por reduzido tamanho, em comparação com as espermatogônias A, e

núcleo mais densamente corado (Billard, 1969; Schulz & Miura, 2002). As espermatogônias

B sofrem sucessivas divisões mitóticas que resultam em aumento geométrico do seu

número. Durante as divisões, essas células permanecem conectadas por pontes

citoplasmáticas devido à citocinese incompleta, o que possibilita a troca de moléculas entre

as células germinativas e o desenvolvimento sincrônico das mesmas (Schulz & Miura, 2002;

Lo Nostro et al., 2003; Nóbrega, 2006).

Merece ser mencionado que, à semelhança de mamíferos, existem consideráveis

diferenças em relação ao número de gerações de espermatogônias diferenciadas nas

espécies de peixes (Billard, 1969; Billard, 1990; Schulz & Miura, 2002; Vilela, 2003;

Cardoso, 2007; Almeida et al., 2008). Em guppy (Poecilia reticulata), por exemplo, as

espermatogônias sofrem 14 divisões mitóticas, enquanto a enguia japonesa (Anguilla

japonica) apresenta 10 divisões. Em tilápias nilóticas, zebrafish (Danio rerio) e bacalhau

(Gadus morhua) foram identificadas 7, 9 e 11 gerações espermatogoniais, respectivamente

(Schulz & Miura, 2002; Schulz et al., 2005; Cardoso, 2007; Almeida et al., 2008). O número

de divisões mitóticas das espermatogônias é importante parâmetro, pois constitui um dos

fatores determinantes do rendimento da espermatogênese (número de espermátides

formadas a partir de uma espermatogônia diferenciada) (França & Russel, 1998; De Rooij &

Russell, 2000).

1.4.2. Fase espermatocitária As espermatogônias do tipo B sofrem a última divisão mitótica e originam os

espermatócitos primários (Schulz & Miura, 2002). A prófase da primeira divisão meiótica é

longa e subdividida em cinco estágios com características próprias e denominados de pré-

leptóteno, leptóteno, zigóteno, paquíteno e diplóteno. No estágio inicial, os espermatócitos

primários em pré-leptóteno, com características morfológicas semelhantes às

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espermatogônias secundárias ou do tipo B, realizam a última síntese de DNA nas células

germinativas (Russel et al., 1990). No estágio seguinte, espermatócitos em leptóteno

apresentam aumento do volume celular e distribuição homogênea de cromatina no núcleo.

Nos espermatócitos em zigóteno ocorre espessamento cromossômico, início de pareamento

dos cromossomos homólogos e formação do complexo sinaptonêmico, sendo este último

visível somente sob microscopia eletrônica de transmissão (Billard, 1984; Billard, 1986; Grier

& Neidig, 2000; Nóbrega, 2006). Este complexo persiste até o final do estágio de paquíteno

que é a fase mais longa da prófase meiótica, na qual ocorre a recombinação e a segregação

gênica, importante para a diversidade de indivíduos da mesma espécie, com os

cromossomos apresentando-se completamente pareados e compactos. Os paquítenos

aumentam também de tamanho antes de se transformarem em diplótenos que se dividem

para formar os espermatócitos secundários. Essas células, caracterizadas pela morfologia

arredondada, citoplasma escasso e núcleo com cromatina condensada, passam

rapidamente por uma segunda divisão meiótica para produzir células haplóides,

denominadas de espermátides (Billard, 1969; Silva, 1987; Russell et al., 1990; Quagio-

Grassioto & Carvalho, 1999; Lo Nostro et al., 2003).

1.4.3. Fase espermiogênica

Na fase espermiogênica, as espermátides sofrem marcante remodelamento e redução

de tamanho, que pode chegar a perda de 80-90% do volume nuclear e celular em algumas

espécies (Schulz & Miura, 2002). Essa redução se deve basicamente pela máxima

condensação da cromatina, alcançada geralmente pela substituição das histonas pelas

protaminas no núcleo, o que permite maior compactação do DNA; e pela eliminação do

excesso de citoplasma (corpo residual), que é usualmente fagocitado pelas células de

Sertoli (Saperas et al., 1993; França et al., 1994; Saperas et al., 1994; Saperas et al., 1997,

Schulz & Miura, 2002; Saperas et al., 2006). Durante a espermiogênese também ocorre a

formação do flagelo e da peça intermediária onde se concentram as mitocôndrias. Ainda

nesta fase ocorrem o desaparecimento das pontes citoplasmáticas e o rompimento dos

cistos, com liberação dos espermatozóides no lúmen dos túbulos seminíferos (Alfert, 1956;

Sprando et al., 1988). Pelo fato de a fecundação ocorrer através da micrópila do ovócito,

merece ser ressaltado que o acrossomo não é formado na maioria das espécies de

teleósteos (Koulish et al., 2002; Schulz & Miura, 2002).

De acordo com Silva (1987), as espermátides de tilápias passam por três fases de

diferenciação, compreendidas pela fase inicial (E1) com a migração centriolar e crescimento

do flagelo, a fase intermediária (E2) com o início da condensação nuclear e formação da

fossa nuclear, e a fase final (E3) com o término da condensação nuclear, formação da peça

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intermediária e eliminação do excesso de citoplasma. Essas marcantes alterações

morfológicas que ocorrem na fase espermiogênica resultam na formação dos

espermatozóides, que são células altamente especializadas e equipadas para alcançar e

fertilizar os ovócitos (Russell et al., 1990; Stoumboudi & Abraham, 1996).

1.5. Células somáticas testiculares

O desenvolvimento e a função do epitélio seminífero estão intimamente relacionados com

o desenvolvimento dos elementos somáticos do testículo, como as células de Sertoli, de

Leydig e peritubulares mióides (França et al., 2000; Matta et al., 2002; Schulz & Miura, 2002;

Cupp & Skinner, 2005; França & Chiarini-Garcia, 2005; França et al, 2005; Fijak &

Meinhardt, 2006).

1.5.1. Células de Sertoli As células somáticas do interior dos túbulos seminíferos em teleósteos são funcional e

morfologicamente homólogas àquelas observadas em mamíferos (Grier, 1975; Billard, 1990;

Grier, 1993; Pudney, 1993; Batlouni et al., 2005; Schulz et al., 2005). De maneira geral, as

células de Sertoli dos peixes são achatadas e formam a parede de cistos que contém no seu

interior células espermatogênicas (de espermatogônias a espermátides) que se

desenvolvem de maneira sincronizada (Silva, 1987; Pudney, 1993; Koulish et al., 2002;

Batlouni et al., 2005; Schulz et al., 2005). Assim, nesse tipo de arranjo não ocorre a

compartimentalização do epitélio seminífero em porções basal e adluminal, não existindo,

portanto, o compartimento basal (Billard, 1990).

A sobrevivência das células germinativas é dependente de sua íntima associação com

as células de Sertoli, que são responsáveis por criar um microambiente favorável e propício

para a espermatogênese no interior dos cistos (Schulz & Miura, 2002). Portanto, à

semelhança de outros vertebrados, atribuem-se às células de Sertoli de peixes diversas

funções, como: a) o fornecimento de nutrientes e inúmeros outros fatores (moléculas de

sinalização, etc.) importantes para as células germinativas; b) mediação da ação do FSH e

de andrógenos na espermatogênese; c) fornecimento de suporte físico (sustentação) para

as células espermatogênicas; d) participação no processo de liberação (espermiação) das

espermátides para o lúmen tubular; e) formação da barreira de células de Sertoli; f)

fagocitose do excesso de citoplasma (corpos residuais) resultante da liberação das células

espermiadas; g) fagocitose de células germinativas apoptóticas; e h) secreção de fluido, de

proteínas e de vários fatores de crescimento (Billard, 1970; Billard, 1986; Russel et al., 1990;

Schulz & Miura, 2002; Cupp & Skinner, 2005; França & Chiarini-Garcia, 2005). A secreção

24


de fatores diversos deve também ocorrer em direção ao compartimento intertubular, estando

a mesma provavelmente envolvida com os mecanismos de regulação parácrina de outros

tipos celulares do testículo tais como células mióides, células de Leydig e células

musculares lisas dos vasos (Loir et al., 1995), à semelhança do que ocorre em mamíferos

(Russell & Griswold, 1993; Sharpe, 1994; Hedger & Meinhardt, 2003).

1.5.2 Células de Leydig

As células de Leydig, isoladas ou em grupos, são geralmente encontradas próximas à

vasos sangüíneos ou no tecido conjuntivo da cápsula testicular (Silva, 1987; Pudney, 1996;

Koulish et al., 2002; Lo Nostro et al., 2004; Nóbrega & Quagio-Grassiotto, 2007). A ultra-

estrutura das células de Leydig descrita para vários teleósteos evidencia seu potencial

esteroidogênico pela presença de retículo endoplasmático liso bem desenvolvido e

mitocôndrias com cristas tubulares (Guraya, 1976; Billard et al., 1982; Nagahama, 1983;

Dodd & Sumpter, 1986; Borges Filho, 1987; Loir, 1990; Cauty & Loir, 1995; Grier et al.,

1989; Pudney, 1996; Cinquetti & Dramis, 2003; Lo Nostro et al., 2004; Nóbrega & Quagio-

Grassiotto, 2007).

Semelhante a outros teleósteos, as células de Leydig de tilápias são ovais, de

citoplasma levemente corado e com o núcleo denso, central e esferoidal (Silva, 1987;

Cavaco et al., 1999; Matta et al., 2002; Lo Nostro et al., 2004; Nóbrega & Quagio-Grassiotto,

2007). Ao microscópio eletrônico, essas células apresentam retículo endoplasmático liso

abundante, com cisternas e vesículas ocupando a maior parte do citoplasma. Além disso,

possuem mitocôndrias com cristas tubulares, gotas lipídicas de dimensões e opacidade

variáveis, ribossomos livres e aparelho de Golgi (Silva, 1987).

1.5.3. Células peritubulares mióides

As células peritubulares mióides, principal componente da parede dos túbulos

seminíferos, participam da regulação parácrina da função testicular e, junto com as células

de Sertoli, são responsáveis pela formação da lâmina basal (Loir et al., 1995; Rossi et al.,

2002; Schulz et al., 2005). As células peritubulares mióides secretam várias substâncias

componentes da matriz extracelular (fibronectina, colágenos dos tipos I e IV e

proteoglicanas) e fatores de crescimento como PmodS (Fator peritubular que modula a

função das células de Sertoli), IGF-I (Fator de crescimento semelhante a insulina), activina-A

e TGF-β (Fato de crescimento transformante beta) que regulam a função parácrina das

células de Sertoli. As células peritubulares mióides, por serem células contráteis, expressam

marcadores de citoesqueleto (α-isoactina, F-actina e miosina) cujos filamentos são

25


arranjados longitudinal e circularmente em relação ao maior eixo do túbulo seminífero. A

atividade desses filamentos é responsável pela contração dos túbulos seminíferos que

resulta em movimentação de fluidos e propulsão dos espermatozóides (Grier et al., 1989;

Loir et al., 1995; Rossi et al., 2002; França & Chiarini-Garcia, 2005).

Semelhante a outros vertebrados, as células peritubulares mióides de tilápias

apresentam citoplasma delgado com grande número de filamentos, núcleo fusiforme, central

e com cromatina em massas eletrondensas distribuídas por toda sua extensão (Silva, 1987;

Vilela, 2003; Cinquetti & Dramis, 2003; Lo Nostro et al., 2004; França & Chiarini-Garcia,

2005).

1.5.4. Outras células somáticas testiculares

Além das células de Sertoli, de Leydig e peritubulares mióides, outros tipos celulares

como fibroblastos e leucócitos também podem ser encontrados nos testículos de teleósteos

(Silva, 1987; Loir et al., 1995; Grier & Taylor, 1998; Chavez-Pozo et al., 2003; Chavez-Pozo

et al., 2005a; Chavez-Pozo et al., 2005b; Nóbrega, 2006). Em trutas e tilápias, por exemplo,

fibroblastos típicos estão presentes, usualmente localizados em regiões centrais do

compartimento intersticial (Silva, 1987; Loir et al., 1995). Em algumas espécies de peixes, a

ocorrência de leucócitos, como granulócitos acidófilos e células semelhantes a macrófagos,

varia ao longo do ciclo reprodutivo, indicando um papel fisiológico dos mesmos na função

testicular (Loir et al., 1995; Grier & Taylor, 1998; Chavez-Pozo et al., 2003; Chavez-Pozo et

al., 2005a; Nóbrega, 2006). Nesse sentido, macrófagos intersticiais são escassos em

testículos em maturação e durante a espermiação, mas numerosos e com amplos

fagolisossomos na regressão testicular (Loir et al., 1995; Grier & Taylor, 1998). Uma maior

proporção de granulócitos acidófilos também ocorre em testículos durante o processo de

regressão (Chavez-Pozo et al., 2003; Chavez-Pozo et al., 2005a; Nóbrega, 2006). Estudos

buscando elucidar a função dessas células foram conduzidos recentemente e demonstraram

que os granulócitos acidófilos produzem IL-1β, um regulador positivo para a proliferação

espermatogonial (Chavez-Pozo et al., 2005a; Nóbrega, 2006). Além disso, a produção

dessa citocina pode ser regulada por hormônios sexuais durante o ciclo reprodutivo. Essas

são provavelmente as primeiras evidências da importância de células do sistema imune para

a função testicular e de possíveis mecanismos envolvidos na complexa interação entre

sistema imune e sistema reprodutor em peixes teleósteos (Chavez-Pozo et al., 2003).

1.6. Proliferação de células testiculares

26


Recentemente, demonstrou-se a proliferação de células somáticas testiculares em

peixes adultos como no bagre-africano (Clarias gariepinus), tilápia-nilótica, Sparus aurata,

Danio rerio (Zebrafish), Squalus acanthias (dogfish), Pimelodus maculatus e Serrasalmus

spilopleura (Schulz et al., 2005; Chaves-Pozo et al., 2005a; McClusky, 2005; Nóbrega, 2006;

Cardoso, 2007). Diferente de mamíferos, nos quais é considerado que as células de Sertoli

não proliferam após a puberdade, a espermatogênese em peixes é associada com a

proliferação desse tipo celular (França & Russell, 1998; Schulz et al., 2005; Bouma & Cloud,

2005; Chaves-Pozo et al., 2005a; McClusky, 2005; Nóbrega, 2006). A proliferação da célula

de Sertoli foi demonstrada no estágio de regressão do ciclo reprodutivo em uma variedade

de espécies de peixes (Bouma & Cloud, 2005; Nóbrega, 2006). Em S. aurata e P.

maculatus, o pico de proliferação das células germinativas e das células somáticas

testiculares ocorre em momentos distintos do ciclo reprodutivo. Nessas espécies, a taxa de

proliferação de células de Sertoli é maior no início da espermatogênese e menor no período

reprodutivo/pós-reprodutivo. Em C. gariepinus, S. aurata e S. acanthias a atividade mitótica

das células de Sertoli e das células germinativas é assincrônica, ou seja, a proliferação

desses dois tipos celulares geralmente não ocorre concomitantemente no mesmo cisto

(McClusky, 2005; Schulz et al., 2005, Chaves-Pozo et al., 2005a). Vilela et al. (2003)

demonstrou que o número de células de Sertoli por cisto aumenta até o estágio de

espermatócito e estabiliza durante os estágios pós-meióticos em tilápias. Embora o

mecanismo de controle da proliferação desse tipo celular em peixes seja desconhecido, é

sugerido que o FSH estimula, enquanto os hormônios tiroidianos inibem a proliferação das

células de Sertoli (Matta et al., 2002; Bouma & Cloud, 2005). Além disso, o IGF-1 tem ação

estimuladora da proliferação de células de Sertoli em S. acanthia e o receptor de IGF-1 foi

encontrado em células de Sertoli de trutas arco-íris (Dubois & Callard, 1993; Le Gac et al.,

1996). Recentemente, foi demonstrado que a proliferação de células de Sertoli pode

também ser induzida por 17-β estradiol (E2) em S. aurata (Chavez-Pozo et al., 2007). À

semelhança de mamíferos (Russell & Griswold, 1993; Hess et al., 1993, França et al., 1995;

Sharpe et al., 2003), a proliferação das células de Sertoli é considerada o fator primário

responsável pelo aumento do testículo e da produção espermática nos teleósteos (Matta et

al., 2002; Bouma & Cloud, 2005; Schulz et al., 2005).

Além de células de Sertoli, células intersticiais, provavelmente precursoras de células

de Leydig, e células peritubulares mióides, apresentam atividade proliferativa durante a

espermatogênese em teleósteos (Chaves-Pozo et al., 2005a; Schulz et al., 2005; Nóbrega,

2006). Talvez pelo fato das células de Sertoli produzirem AMH, que é um inibidor para a

proliferação de células de Leydig (Mendis-Handagama & Ariyaratne, 2001), esse tipo celular

em divisão nos testículos de tilápias foi identificado predominantemente no parênquima

testicular próximo aos ductos espermáticos, onde cistos espermatogênicos mais avançados

27


e células de Sertoli mais diferenciadas são predominantes (Schulz et al., 2005). A

proliferação de células de Leydig ou do seu precursor também foi detectada em outras

espécies de peixes, como em P. maculatus, Oncorhynchus mykiss e S. aurata, sendo

provavelmente regulada por 17β-estradiol (Bouma & Nagler, 2001; Bouma et al., 2003;

Chaves-Pozo et al., 2005a; Schulz et al., 2005; Nóbrega, 2006). Estudos sobre a

proliferação de células peritubulares mióides são escassos e os mecanismos envolvidos

com o seu controle são desconhecidos. Em tilápias, essas células apresentam considerável

atividade proliferativa, provavelmente para se ajustar ao intenso crescimento em

comprimento dos túbulos seminíferos (Schulz et al., 2005).

1.7. Efeitos da temperatura na reprodução de teleósteos

Na maioria das espécies de teleósteos, os ciclos reprodutivos ocorrem em função de

variações das condições ambientais, sendo a temperatura e o fotoperíodo considerados os

mais potentes moduladores da atividade reprodutiva (Borg, 1982; Billard, 1986; Koger et al.,

1999; Shimizu, 2003; Quintana et al., 2004; Vera et al., 2007). Embora o modo pelo qual a

temperatura modula os eventos reprodutivos em peixes não seja ainda bem estabelecido,

vários autores relataram efeito direto da temperatura sobre a síntese e liberação de

gonadotrofinas em peixes, que sob baixas temperaturas apresentam concentrações de

gonadotrofinas reduzidas, podendo este aspecto representar fator limitante para a

progressão normal do processo espermatogênico (Yu & Peter, 1990; Fraser et al., 2002).

Fraser e colaboradores (2002) demonstraram que a temperatura influencia a síntese do

neurotransmissor GABA e a liberação de LH estimulada por GABA em peixe dourado

(goldfish), sendo esse um possível sítio de atuação da temperatura para modulação da

atividade reprodutiva. Além disso, recentemente tem sido sugerido que o papel da

temperatura na tradução da informação sazonal e no controle do ritmo reprodutivo anual

pode estar relacionado com seus efeitos na produção de melatonina (Masuda et al., 2003;

Vera et al., 2007).

Variações de temperatura também alteram o tempo de duração do processo

espermatogênico em teleósteos (Egami & Hyodo-Taguchi, 1967; Billard, 1968; Vilela et al.,

2003). Assim, nas espécies Oryzias latipes, P. reticulata e O. niloticus, a duração da

espermatogênese é mais curta quando esses peixes são mantidos em temperaturas mais

elevadas do que a temperatura considerada fisiológica para a reprodução das mesmas

(Egami & Hyodo-Taguchi, 1967; Billard, 1968; Vilela et al., 2003). Essas alterações na

duração da espermatogênese eventualmente causam apoptose e estão provavelmente

relacionadas com mudanças no ciclo celular, principalmente nas fases G2 e M (Cobb et al.,

1999; Liu et al., 2000; Eddy, 2002). Em ratos, por exemplo, o aumento na temperatura

28


corporal resulta em aumento na síntese de ciclinas D1, o que altera a progressão do ciclo

celular (Han et al., 2002). No nosso conhecimento, entretanto, dados na literatura a respeito

dos efeitos de diferentes temperaturas na atividade mitótica de células somáticas

testiculares, na taxa de proliferação e apoptose nos cistos espermatogoniais de teleósteos

são escassos. A atuação da temperatura na reprodução de peixes é particularmente crítica,

uma vez que esses animais apresentam temperatura corporal próxima da temperatura

ambiente (Schulz & Miura, 2002).

1.8. Apoptose das células germinativas

A apoptose parece ser necessária para o desenvolvimento adequado e a fertilidade

da maioria dos organismos (Baum et al., 2005). Em vertebrados adultos, a apoptose de

células germinativas é parte integral da espermatogênese, ocorrendo normalmente em

várias fases do desenvolvimento destas células (Roosen-Runge, 1977; Blanco-Rodríguez &

Martínez-Garcia, 1996; Blanco-Rodríguez, 2001). Essas apoptoses representam papel muito

importante na homeostase da espermatogênese, refletindo diretamente na produção

espermática característica de cada espécie (Sharpe, 1994; França & Russell, 1998; Sinha-

Hikim & Swerdloff, 1999; França et al., 2005). Além de participar do controle de densidade

celular (De Rooij & Russell, 2000), fornecendo um balanço adequado do número de células

somáticas e células germinativas, a apoptose também atua como checkpoint, eliminando as

células germinativas anormais (Baum et al., 2005).

Existem poucos relatos na literatura relacionados com perdas celulares (apoptoses)

durante o processo espermatogênico normal em teleósteos, e o possível mecanismo das

mesmas (Schulz & Miura, 2002). No entanto, os poucos dados disponíveis sugerem que

estas perdas podem se situar na faixa de 30 a 40% para o guppy (Billard, 1969) e tilápia-

nilótica (Matta et al., 2002), respectivamente. Apoptoses em células germinativas de peixes

já foram observadas em todas as fases da espermatogênese, entretanto, a predominância

de morte celular em espermatogônias, espermatócitos ou espermátides parece variar de

acordo com a espécie (Prisco et al., 2003; Vilela, 2003; Baum et al., 2005; McClusky, 2005;

Nóbrega, 2006; Cardoso, 2007; Almeida et al., 2008).

Além de ocorrerem normalmente durante o processo espermatogênico, as apoptoses

podem ser induzidas por remoção de suporte hormonal e fatores de crescimento, ou por

estímulos regulatórios não-hormonais tais como estresse ao calor, toxinas testiculares,

agentes quimioterápicos e danos cromossomais (Billard, 1982; Schulz & Miura, 2002; Vera

et al., 2005; Setchell, 2006). Esses sinais de ativação iniciam mecanismos intracelulares de

controle e execução, que culminam com a ativação de caspases localizadas no citoplasma

29


das células germinativas (Sinha-Hikim & Swerdloff, 1999; Sinha-Hikim et al., 2003; Vera et

al., 2004; Vera et al., 2005; Setchell, 2006).

Semelhante a outros vertebrados, a apoptose na espermatogênese de peixes,

envolve provavelmente maquinaria de sinalização característica, incluindo proteínas Bcl-2,

p53, Fas e caspases (Huichin et al., 2003; Andreu-Vieyra et al., 2005; Baum et al., 2005;

Migliarini et al., 2005). Os membros da família Bcl-2 são proteínas constituídas por

elementos pró-apoptóticos (Bax, Bak, Bcl-xS, Bad) e anti-apoptóticos (Bcl-2, Bclw, Bcl-xL,

Mcl, A1) (Sinha-Hikim & Swerdloff, 1999; MacGregor, 2001). A presença de mRNA do pró-

apoptótico Bak foi detectada durante a espermatogênese em Torpedo marmorata, sugerindo

que a apoptose de células germinativas de peixes pode ocorrer através da via mitocondrial

de morte celular com o envolvimento dos membros da família Bcl-2 (Prisco et al., 2003;

Baum et al., 2005). A proteína supressora de tumor p53 desempenha importante função na

regulação da proliferação e morte celular através de apoptose. Diversos trabalhos têm

mostrado que a p53 está envolvida com a apoptose de células espermatogênicas (Almon et

al., 1993; Rotter et al., 1993; Sinha-Hikim & Swerdloff, 1999). Esses trabalhos demonstraram

que células germinativas portadoras de danos no DNA apresentam grande aumento na

quantidade de p53, a qual pode agir interrompendo o ciclo celular para correção do dano

cromossomal ou desencadear o processo de apoptose (Bennett, 1999; Richburg, 2000;

Huichin et al., 2003). Caspases 3 e 8 e o sistema Fas/Fas L foram identificadas em

testículos de Carassuis auratus tratados com GnRH e caspase 3 foi expressa em testículos

de Gobius niger submetidos ao cádmio, sugerindo que estas proteínas também estão

envolvidas com o desencadeamento da apoptose de células testiculares de peixes, pelo

menos, em condições não fisiológicas (Andreu-Vieyra et al., 2005; Baum et al., 2005;

Migliarini et al., 2005).

30

2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Justificativa e Objetivos

2 – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Dados da literatura demonstram variações da proliferação de células testiculares

somáticas e de células germinativas, bem como apoptose de células germinativas ao longo

do ciclo reprodutivo anual em peixes e sugerem que as condições ambientais participariam

dessas alterações (Chavez-Pozo, 2005; McClusky, 2005; Nóbrega, 2006). Dentre os fatores

ambientais, a temperatura é considerada importante modulador da atividade reprodutiva em

peixes, incluindo-se os aspectos relativos à função testicular e ao processo

espermatogênico (Borg, 1982; Billard, 1986; Koger et al., 1999; Shimizu, 2003; Quintana et

al., 2004). Entretanto, no nosso conhecimento, são poucos os estudos que avaliam

especificamente o efeito desse fator sobre vários parâmetros histológicos e morfométricos

que permitem avaliar funcionalmente os testículos de teleósteos, o que torna interessante a

investigação de tais parâmetros em peixes mantidos em diferentes temperaturas. Esse tipo

de investigação pode resultar em informações que permitem a melhor compreensão da

regulação da função testicular e, especialmente, da atuação de fatores ambientais na

sincronização do ciclo reprodutivo de peixes, o que pode fornecer subsídios para o manejo

de espécies em condições naturais ou em cativeiro. Além disso, o estabelecimento de um

padrão de modificações testiculares que pode ser induzido por fatores externos permite

manipular a atividade reprodutiva para induzir determinadas respostas desejadas nos

animais. Como exemplos, podem ser citados a manipulação do fotoperíodo para atrasar a

maturação sexual, o que permite crescimento adequado do animal para a piscicultura

(Schulz et al., 2006) e a utilização de determinada osmolaridade da água para manter peixes

reprodutivamente imaturos, o que possibilita a utilização dos testículos desses animais como

modelo experimental de estudos in vitro de fatores que regulam a espermatogênese (Miura

et al., 1991; Miura et al., 2002; Miura et al., 2003b; Miura et al., 2006). Diante da

possibilidade de melhor compreensão dos efeitos da temperatura sobre a função testicular e

da sua utilização para a manipulação da atividade reprodutiva em peixes, o presente estudo

tem como principais objetivos avaliar os efeitos de diversas temperaturas (20ºC, 25ºC, 30ºC

e 35ºC) sobre a função testicular de tilápias nilóticas sexualmente maduras e,

especificamente, sobre os diversos componentes do testículo, proliferação e apoptose das

células germinativas e proliferação das células somáticas testiculares. Com tal finalidade,

testículos de tilápias mantidas em quatro diferentes temperaturas foram submetidos as

seguintes análises:

• Morfometria através da determinação do percentual (%) da área ocupada pelos

diferentes componentes do parênquima testicular.

32

Justificativa e Objetivos

• Avaliação da freqüência dos seguintes cistos espermatogênicos: espermatogônia do

tipo A; espermatogônias do tipo B iniciais, intermediárias e finais; espermatócitos

primário em pré-leptóteno; leptóteno/zigóteno; paquíteno; diplóteno/espermatócito

em metáfase ou anáfase; espermátides iniciais, intermediárias e finais.

• Avaliação do percentual de cistos de espermatogônias em proliferação, incluindo

espermatogônias do tipo A localizadas no fundo dos túbulos seminíferos, próximas à

albugínea e espermatogônias do tipo A localizadas ao longo dos túbulos seminíferos;

espermatogônias do tipo B iniciais, intermediárias e finais.

• Determinação do índice de proliferação das células de Sertoli, de Leydig e

peritubulares mióides.

• Identificação do tipo de cisto espermatogênico associado às células de Sertoli ou

próximo às células de Leydig e peritubulares mióides marcadas pelo radioisótopo.

Nessa análise também foi observado se a proliferação das células de Sertoli e das

espermatogônias ocorre simultaneamente ou não.

• Determinação, através de microscopia de luz, do percentual de cistos

espermatogênicos em apoptose e intensidade da mesma, em cada uma das três

fases espermatogênicas (espermatogonial, espermatocitária e espermiogênica).

33

3. MATERIAL E MÉTODOS

Material e Métodos

3 - MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Animais experimentais

Foram utilizadas 28 tilápias nilóticas sexualmente maduras da linhagem chitralada

(também conhecida como tailandesa) provenientes da Estação de Aqüicultura Geneforte,

Pedro Leopoldo, MG. No laboratório, os peixes foram inicialmente mantidos em caixas

plásticas de 250 litros de água na temperatura de 25°C para aclimatação e, posteriormente,

foram subdivididos em quatro grupos experimentais com sete animais em cada um deles,

mantidos nas temperaturas 20°C, 25°C, 30°C e 35°C por uma semana. Os animais foram

alimentados ad libitum com ração comercial (Laguna - Socil) para peixes e submetidos a um

fotoperíodo de 12h de luz e 12h de escuridão. Como procedimentos auxiliares na

manutenção da qualidade da água utilizaram-se aeradores e filtros biológicos. Todos os

procedimentos realizados com os animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e

Experimentação Animal (CETEA/UFMG), protocolo de número 197/2006.

3.2. Marcação com timidina triciada

A timidina triciada é um radioisótopo que se incorpora ao núcleo de células que estão

sintetizando DNA no momento da injeção. Tais células no testículo de peixes compreendem

eventualmente células somáticas testiculares em atividade proliferativa, os diferentes tipos

de espermatogônias, os espermatócitos primários em pré-leptóteno/leptóteno, ocorrendo

nestes espermatócitos a última síntese de DNA em células da linhagem espermatogênica.

Após uma semana nas diferentes temperaturas, todas as 28 tilápias receberam

injeção intracelomática de timidina triciada em solução aquosa estéril ([methyl-H3]

Thymidine, atividade específica de 3,03 TBq/mmol. 82 Ci/mmol, Amersham Life Science

England), na concentração de 1mCi/ml. Esta solução foi injetada na parede ventral do corpo,

próximo à papila urogenital, utilizando agulha hipodérmica estéril descartável.

Aproximadamente 100 μCi (0,1ml) para cada 100g de peso corporal foram injetados em

dose única para cada animal. Aproximadamente duas horas após a injeção, os animais

foram sacrificados tendo os seus testículos coletados para análise radioautográfica.

3.3. Fixação e coleta do material

As tilápias foram sacrificadas por overdose do anestésico quinaldina adicionado na

água. Em seguida, os peixes foram medidos para obtenção de comprimento total, pesados e

35

Material e Métodos

a cavidade celomática de cada animal foi aberta para a coleta dos testículos. A fixação de

fragmentos dos testículos foi realizada por imersão em glutaraldeído a 4% em tampão

fosfato 0,05 M, pH 7,2-7,4, por 24 horas a 4 °C. Após a fixação, os testículos foram

identificados e armazenados em tampão fosfato 0,05 M na geladeira até o processamento

histológico.

3.4. Processamento histológico

Para análises histológicas e morfométricas, os testículos foram desidratados em

concentrações crescentes de álcool (70%, 80%, 90% e 100%) e pré-infiltrados com glicol

metacrilato (GMA) (Leica Historesin Embedding Kit, Leica Instruments), sendo a primeira

pré-infiltração realizada por seis horas e a segunda por aproximadamente 12 horas. A

infiltração foi realizada em GMA puro durante 24 horas. Em seguida, os fragmentos

testiculares foram incluídos na mesma resina acrescida de endurecedor até a polimerização

completa da mesma. Após esta etapa, os fragmentos foram seccionados com navalhas de

vidro (4µm de espessura) em micrótomo manual (Sorvall JB4 Dupont Instruments) e

colocados em lâminas para o processamento radioautográfico e análises histológicas e

morfométricas.

3.5. Processamento Rádio-autográfico

Lâminas histológicas com fragmentos de testículos foram submetidas ao processo de

emulsionamento em câmara escura. Essas lâminas foram mergulhadas em recipiente

contendo emulsão radioautográfica Kodak NTB-2 mantida líquida em banho-maria a 45°C.

Após uma hora, ainda em câmara escura e à temperatura ambiente, os cortes com emulsão

já secos foram acondicionados em caixas de lâminas com proteção adequada contra luz e

armazenados a 4 °C por 3-4 semanas.

Após o período de sensibilização, as lâminas foram reveladas utilizando-se solução

Kodak D-19 (1:1) durante 4 minutos. Em seguida, os cortes foram lavados em água

destilada por alguns segundos e fixados em fixador Kodak F5 por 5 minutos. Para retirada

do fixador, as lâminas permaneceram em água destilada por no mínimo 5 minutos. Essas

etapas foram desenvolvidas em câmara escura e à temperatura de 15°C. Posteriormente, as

lâminas foram secadas a temperatura ambiente, coradas com azul de toluidina e borato de

sódio a 1% e montadas com Entellan (Merck). As análises histológicas e morfométricas

foram realizadas em microscópio de luz Olympus.

36

Material e Métodos

3.6. Morfometria A identificação dos diferentes tipos de cistos espermatogênicos foi realizada a partir

do diâmetro nuclear e das características morfológicas descritos por Vilela (2003) para as

células germinativas de tilápias. Para as análises morfométricas, utilizaram-se secções do

testículo que apresentavam túbulos seminíferos com cistos contendo células germinativas

em várias fases do desenvolvimento, conforme ilustrado nas Figuras 5 e 6. Apenas para a

determinação do percentual de proliferação de espermatogônias A localizadas no fundo dos

túbulos seminíferos, próximas à albugínea (SPGA-f) foi analisada a extremidade distal

destes túbulos.

3.6.1. Percentual dos componentes testiculares

Os percentuais dos componentes testiculares foram estimados em aumento de

1000x, utilizando-se retículo com 441 interseções (pontos) por campo, acoplado a ocular do

microscópio. Para cada animal foram analisados 25 campos aleatórios, perfazendo-se um

total de 11025 pontos. Os componentes testiculares avaliados foram os seguintes:

A) Compartimento tubular: espermatogônias do tipo A (SPGA), espermatogônias do

tipo B iniciais (SPGB1/2), intermediárias (SPGB3/4/5) e finais (SPGB6/7), espermatócitos em

pré-leptóteno (Pl), leptóteno/zigóteno (L/Z), paquíteno (P), diplóteno/espermatócitos em

metáfase ou anáfase e esperrmatócitos secundários (D/M), espermátide inicial (E1),

intermediária (E2) e final (E3), espermatozóide (Z), lúmen, célula de Sertoli (CS), túnica

própria e células em apoptose.

B) Compartimento intertubular: célula de Leydig (CL), células de defesa

(principalmente, mastócitos e macrófagos), vasos e outros (fibras e outras células do tecido

conjuntivo).

A média do percentual de cada componente testicular foi calculada para seis animais

de cada uma das temperaturas analisadas. 3.6.2. Freqüência dos cistos espermatogênicos Para determinar a freqüência dos diferentes cistos espermatogênicos

(espermatogônias do tipo A; espermatogônias do tipo B iniciais, intermediárias e finais,

espermatócitos em pré-leptóteno; leptóteno/zigóteno; paquíteno; diplóteno/espermatócito em

meiose; e espermátide inicial, intermediária e final) foram analisados 400 cistos por animal.

A média da freqüência de cada cisto foi calculada para cada temperatura.

37

Material e Métodos

3.6.3. Índice de proliferação dos diferentes cistos de espermatogônias Nesse estudo foram analisados os seguintes tipos espermatogoniais:

espermatogônias do tipo A localizadas no fundo dos túbulos seminíferos, próximas à

albugínea (SPGA-f); espermatogônias do tipo A localizadas ao longo dos túbulos

seminíferos (SPGA-t); espermatogônias do tipo B iniciais (SPGB1/2), intermediárias

(SPGB3/4/5) e finais (SPGB6/7). Para cada tipo espermatogonial, determinou-se o número

de cistos marcados com o radioisótopo em 100 cistos analisados. Os valores do índice de

proliferação dos diferentes cistos de espermatogônias, obtidos para cada animal, foram

usados para o cálculo da média de proliferação dessas células germinativas nas diferentes

temperaturas investigadas.

3.6.4. Índice de proliferação de células somáticas do testículo Esta avaliação foi feita através da contagem do número de células de Sertoli, de

Leydig e peritubulares mióides marcadas com timidina triciada em 1000 células analisadas.

Desta forma, determinou-se o percentual de cada uma dessas células em proliferação por

animal. Posteriormente, a média da porcentagem de proliferação de cada tipo celular foi

calculada para os animais de uma mesma temperatura.

3.6.5. Cisto espermatogênico associado às células somáticas em proliferação

Para avaliar o tipo de cisto espermatogênico [espermatogonial (SPGA e SPGB),

espermatocitário (SPTC) ou espermiogênico (SPTD)] associado ou próximo às células

somáticas testiculares em proliferação, aproximadamente 600 células de Sertoli e

peritubulares mióides e cerca de 1700 células de Leydig marcadas com o radioisótopo foram

analisadas. O percentual de células somáticas em proliferação associadas ou próximas aos

diferentes cistos espermatogênicos foi expressa para cada uma das temperaturas

investigadas.

3.6.6. Coordenação entre a proliferação de células de Sertoli e espermatogônias

Para analisar a sincronia/assincronia entre a proliferação das células de Sertoli e

espermatogônias, determinou-se o percentual de células de Sertoli marcadas com timidina

triciada associadas com espermatogônias dos tipos A e B marcadas e não marcadas pelo

radioisótopo. Nessa análise, foram avaliadas no total cerca de 150 células de Sertoli em

proliferação associadas com espermatogônias do tipo A e aproximadamente 240 células de

38

Material e Métodos

Sertoli associadas com espermatogônias do tipo B provenientes de animais mantidos nas

diferentes temperaturas.

3.6.7. Índice apoptótico das células germinativas

Células apoptóticas foram identificadas por suas características morfológicas tais

como condensação nuclear, retração celular e, principalmente, pelo fato das mesmas se

apresentarem com maior intensidade de coloração através do corante azul de toluidina

(Neves et al., 2002). Para a obtenção do índice apoptótico (IA), realizou-se a contagem de

100 espermatogônias do tipo A e 1000 espermatogônias do tipo B, espermatócitos e

espermátides e utilizou-se a seguinte fórmula para cada um desses tipos celulares:

IA (%) = n° de células em apoptose X100/ n° total de células

Os valores obtidos para cada animal foram utilizados para o cálculo da média do

índice apoptótico nas diferentes temperaturas.

3. 7. Análises estatísticas

Os resultados obtidos foram analisados com o auxílio do programa STATISTICA 3.11

(statSoft, Inc., Tulsa, Oklahoma, USA, 1995), sendo estimadas as médias, desvios e erros

padrões da média (EPM). Os dados obtidos foram expressos como média ± EPM, exceto

para a proporção de cistos espermatogênicos associados com células somáticas em

proliferação e para o percentual de células de Sertoli marcadas com timidina triciada

associadas com espermatogônias dos tipos A e B marcadas e não marcados pelo

radioisótopo. Nesses casos, os percentuais obtidos nas diferentes temperaturas foram

analisados pelo teste qui-quadrado (χ2). Em relação aos valores médios utilizou-se análise

de variância (ANOVA) e o teste Student-Newman-Keuls do programa STATISTICA 3.11.

Para os dados que apresentaram variâncias diversificadas nos grupos experimentais, como

proporção de apoptose e de células de defesa e índice apoptótico, foi utilizada a

transformação logarítmica. Análise de correlação de Pearson também foi realizada entre

diversos parâmetros investigados. O nível de significância considerado foi de p < 0,05.

39

4. RESULTADOS

Resultados

4 - RESULTADOS

4.1. Biometria Todas as tilápias analisadas no presente estudo foram consideradas sexualmente

maduras por apresentarem espermatogênese completa. O comprimento total e o peso corporal

médio desses animais foi de 14,4cm ± 0,4 e 53,7g ± 5,7, respectivamente. Os dados

biométricos foram utilizados para distribuir os animais nas diferentes temperaturas de modo a

formarem grupos experimentais homogêneos com relação ao peso corporal e comprimento

total. Os peixes apresentaram peso testicular variando entre 0,01g e 0,94g, com média de 0,34g

± 0,05 e IGS de 0,7 ± 0,12, sendo que não foram observadas variações estatisticamente

significativas entre os grupos experimentais.

4.2. Proporção dos componentes testiculares 4.2.1. Compartimento tubular A histologia panorâmica dos testículos e a proporção dos componentes testiculares das

tilápias nilóticas mantidas nas temperaturas de 20°C, 25°C, 30°C e 35°C estão mostradas na

Figura 8 e Tabela 1, respectivamente. A proporção de compartimento tubular não foi alterada

significativamente pela temperatura, ocupando aproximadamente 83-84% do testículo. Nesse

compartimento, as células germinativas ocuparam em média o percentual de 84,4% ± 1,8;

84,5% ± 1,9; 75,43% ± 3,8 e 71,9% ± 5,16 nas temperaturas de 20°C, 25°C, 30°C e 35°C,

respectivamente. Independentemente da temperatura, os espermatócitos constituíram a maior

proporção de células germinativas no epitélio seminífero, enquanto as espermatogônias do tipo

A ocuparam a menor proporção (Fig. 9). Dentre as células germinativas, a proporção de

espermatogônias do tipo B, especificamente as intermediárias e finais, sofreu influência

significativa da temperatura, apresentando maior proporção em tilápias mantidas a 20°C (Fig.

10). Semelhante às espermatogônias do tipo B, a proporção de espermatócitos em pré-

leptóteno foi maior na temperatura mais baixa (p<0,05). Para as demais células germinativas,

não foi observada diferença significativa (p>0,05) em termos de proporção nas temperaturas

analisadas. Tanto apoptose que acometia células individuais quanto a morte celular que atingia

um grupo de células germinativas foi observada no presente estudo (Fig. 11). A proporção de

células germinativas em apoptose foi maior em animais mantidos a 20°C em comparação com a

41

Resultados

temperatura de 25°C, que é considerada a temperatura fisiológica para a reprodução de tilápias

(Fig. 12), sendo também maior do que a observada nos peixes mantidos a 35°C.

As células de Sertoli apresentaram proporção relativamente constante entre as

diferentes temperaturas investigadas, constituindo em média cerca de 3 % do compartimento

tubular. A proporção de túnica própria também não apresentou mudança significativa entre os

grupos experimentais e ocupou em média aproximadamente 4% do túbulo seminífero. A

proporção de lúmen, entretanto, variou com a temperatura, apresentando-se menor nas

temperaturas mais baixas (20°C e 25°C) comparado a 35°C (Fig. 13).

4.2.2. Compartimento intertubular

No compartimento intertubular, o tecido conjuntivo ocupou em média cerca de 55% nos

animais mantidos nas quatro temperaturas investigadas (20°C: 53,7% ± 4,0; 25°C: 54,5% ± 6,4;

30°C: 53,2%± 5,9 e; 35°C: 56,4% ± 8,0). As células de Leydig constituíram o tipo celular

predominante nesse compartimento, ocupando nele, em média, o percentual de 33,4% ± 4,2 a

20°C, 36,7% ± 8,1 a 25°C, 41,6% ± 6,6 a 30°C e 36,8% ± 8,3 a 35°C. A proporção desse

importante componente testicular não apresentou diferença estatística (p>0,05) nos animais

mantidos nas temperaturas estudadas.

Células de defesa (Fig. 14), especialmente macrófagos e mastócitos, foram observadas

no compartimento intertubular dos testículos de tilápias mantidas em todas as temperaturas

investigadas, com tendência (p= 0,079) a maior proporção desses tipos celulares nos peixes a

20°C. Interessantemente, alguns animais mantidos a 20°C apresentaram proporção maior

desses tipos celulares e, nesses casos, macrófagos foram observados não apenas no espaço

intertubular, como também no compartimento tubular, sendo encontrados tanto no lúmen quanto

no epitélio germinativo.

4.3. Freqüência dos cistos espermatogênicos

De maneira geral, a freqüência dos diferentes tipos de cistos espermatogênicos foi

semelhante nas quatro temperaturas investigadas (Fig. 15). Entretanto, a freqüência de cistos

de espermatogônias do tipo B intermediárias foi maior (p<0,05) em tilápias mantidas a 20°C e a

freqüência de diplóteno/meiose foi maior (p<0,05) em peixes mantidos a 35°C em comparação

com a temperatura de 20°C. Além disso, independente da temperatura, cistos de

espermatogônias do tipo B, espermatócitos e espermátides apresentaram freqüência

42

Resultados

semelhante (p>0,05) entre si, mas diferiram da freqüência obtida para as espermatogônias do

tipo A (Tab. 2).

4.4. Proliferação dos diferentes tipos de cistos de espermatogônias

A marcação dos diferentes tipos espermatogoniais está mostrada na Figura 16. De

maneira geral, o índice de proliferação dos cistos de espermatogônias (Tab. 3 e Fig.17) não foi

afetado (p>0,05) pela temperatura, embora seja observada uma tendência da proliferação de

espermatogônias do tipo A decrescer com o aumento da temperatura e das espermatogônias

do tipo B em ser menor a 20°C. Apenas para espermatogônias do tipo B intermediárias

(SPGB3/4/5) foi obtido menor percentual (p<0,05) de cistos que incorporaram timidina em

animais a 20°C comparados a 30°C. Independente da temperatura, todas as espermatogônias

do tipo B apresentaram índice de proliferação maior do que as do tipo A. Entre as

espermatogônias do tipo A, aquelas que se encontravam no fundo dos túbulos seminíferos, ou

seja, próximas à albugínea, apresentaram índice de proliferação menor (p<0,05) do que as que

se localizavam ao longo do túbulo seminífero.

4.5. Proliferação de células somáticas testiculares

Células testiculares somáticas marcadas com timidina triciada são mostradas na Figura

18. Tilápias mantidas nas temperaturas mais altas (30°C e 35°C) apresentaram menor índice de

proliferação (p<0,05) de células de Sertoli comparado com os peixes mantidos nas

temperaturas de 20°C e 25°C (Tab. 4 e Fig. 19). Padrão semelhante foi observada para as

células de Leydig, cujo índice de proliferação foi significativamente maior em peixes mantidos a

20°C em comparação com as maiores temperaturas (30 °C e 35°C). Já a proliferação das

células peritubulares mióides não variou nas diferentes temperaturas investigadas. Correlação

positiva (r=0,63; p<0,01) foi obtida entre o índice de proliferação de células de Sertoli e de

Leydig.

A temperatura não alterou significativamente (p>0,05) o padrão de cistos

espermatogênicos associados com as células de Sertoli marcadas (Fig. 20). Assim, em todas as

temperaturas investigadas essas células proliferaram associadas preferencialmente a

espermatogônias, particularmente, com espermatogônias do tipo B. Tanto para as células de

Leydig quanto para as células peritubulares mióides, a temperatura influenciou (p<0,05) o

padrão de cistos espermatogênicos próximos a essas células somáticas em proliferação.

43

Resultados

Entretanto, houve correlação positiva entre o percentual de cistos de espermatogônias do tipo A

e do tipo B, espermatócitos e espermátides próximos à células de Leydig (r= 0,69; p<0,01) e

mióides (r=0,85; p<0,0001) em proliferação com a proporção desses cistos espermatogênicos

nas diferentes temperaturas investigadas. Nesse sentido, a proporção de espermatogônias do

tipo B, por exemplo, é maior a 20°C e, portanto, o percentual de células de Leydig e mióides em

proliferação próximas a esse tipo celular também é maior nessa temperatura. Isso pode indicar

que a proliferação dessas células somáticas não acompanha um tipo de célula germinativa

específico e as diferenças no percentual dos cistos espermatogênicos próximos a essas células

em divisão reflete apenas as mudanças na constituição de células germinativas do epitélio

seminífero com a temperatura. A correlação entre a proporção dos diferentes cistos

espermatogênicos e o percentual desses cistos associados com as células de Sertoli marcadas

com timidina não foi significativa (r= 0,08; p= 0,8) nas diferentes temperaturas investigadas.

Esse resultado indica que as células de Sertoli proliferam preferencialmente associadas a

espermatogônias, independentemente da temperatura.

4.6. Coordenação entre a proliferação de células de Sertoli e espermatogônias

A proporção de proliferação simultânea de célula de Sertoli e espermatogônias do tipo A

e de célula de Sertoli e espermatogônias do tipo B (Fig. 21) foi semelhante nas tilápias mantidas

nas diferentes temperaturas (p>0,05). Das espermatogônias do tipo A envolvidas por células de

Sertoli marcadas com timidina, 3,5% delas encontrava-se em proliferação. Ou seja, raramente

se observou esses dois elementos proliferando em um cisto ao mesmo tempo, o que poderia

indicar que a proliferação desses diferentes tipos celulares é assincrônica. Entretanto,

considerando-se a média e o desvio padrão da taxa de proliferação desse tipo espermatogonial

(7,3 % ± 4,5), a pequena proporção de divisão dessas células germinativas associadas com

células de Sertoli marcadas com timidina poderia apenas refletir a baixa taxa de proliferação

dessas células. Assim, tendo como referência a proporção de espermatogônias do tipo A em

proliferação por espermatogônias do tipo A totais analisadas no presente estudo (206 em 2800),

o teste qui-quadrado (χ2) revelou que embora haja uma tendência (p<0,1) de proliferação

assincrônica, a taxa de proliferação dessas espermatogônias associadas com as células de

Sertoli marcadas é semelhante a taxa de proliferação encontrada para esse tipo de célula

germinativa.

Por outro lado, dos cistos de espermatogônias do tipo B associados com células de

Sertoli em proliferação, aproximadamente 38% deles apresentavam-se marcados pelo

44

Resultados

radioisótopo. Considerando que cerca de 50% (4.088 em 8.400) dos cistos desse tipo

espermatogonial encontrava-se em proliferação, foi observada uma preferência significativa

(p<0,001) das células de Sertoli em divisão por cistos de espermatogônias do tipo B que não

estavam proliferando (62%). Assim, embora sejam freqüentemente encontradas células de

Sertoli e espermatogônias do tipo B proliferando simultaneamente em um mesmo cisto, a

proliferação assincrônica ocorre preferencialmente entre esses tipos celulares.

4.7. Índice apoptótico das células germinativas Os valores do índice apoptótico (Tab. 5 e Fig. 22) apresentaram grande variação entre

os animais do presente estudo. Desse modo, apesar da morte de espermatócitos e

espermátides ter sido mais elevada nos animais mantidos a 20°C, esses dados não foram

estatisticamente significativos e, portanto, a temperatura aparentemente não afetou o índice

apoptótico dos diferentes tipos de células germinativas em tilápias. Entretanto, o padrão de

predominância de apoptose foi alterado pela temperatura. Assim, animais mantidos nas

temperaturas de 20°C e 25°C não mostraram diferenças na proporção de apoptose entre os

tipos de células germinativas, enquanto peixes a 30°C apresentaram predominância (p<0,05) de

morte celular em espermatogônias do tipo A e para animais a 35° C, maior índice apoptótico

(p<0,05) foi encontrado nas espermatogônias do tipo A e espermátides.

45

5. DISCUSSÃO

Discussão

5 – DISCUSSÃO

5.1. Proporção dos componentes testiculares

5.1.1. Compartimento tubular e freqüência de cistos espermatogênicos

A morfometria foi amplamente utilizada no presente estudo, principalmente por permitir

investigar como a estrutura testicular se comporta em condições fisiológicas e experimentais

(França et al., 1994; Russell & França, 1995; Rocha et al., 1999; França et al., 2000; Matta et

al., 2002; Vilela et al., 2003; Schulz et al., 2005; Auharek, 2007). Apesar do número de estudos

quantitativos sobre a espermatogênese de peixes ter crescido nos últimos anos (Matta et al.,

2002; Vilela et al., 2003; Schulz et al., 2005; Nóbrega, 2006; Almeida et al., 2008), ainda há

poucos trabalhos pormenorizados da estrutura testicular nessa classe de vertebrados. Isso se

deve principalmente à estrutura lobular e o arranjo cístico da espermatogênese, que tornam

difícil o estudo quantitativo do processo espermatogênico (Billard, 1990). Assim, para melhor

compreender os efeitos da temperatura na espermatogênese de tilápias, foram utilizadas

diversas análises quantitativas, como a proporção dos diferentes componentes testiculares, a

contagem da freqüência de cistos espermatogênicos e o percentual de apoptose de células

germinativas e da proliferação das espermatogônias e das células somáticas testiculares.

Nessa seção serão discutidos os dados da proporção dos diversos constituintes do

compartimento tubular juntamente com a freqüência dos cistos espermatogênicos. Nos túbulos

seminíferos de tilápias, os componentes que sofreram alterações com a temperatura foram a

proporção e a freqüência das espermatogônias do tipo B, a proporção de espermatócitos em

pré-leptóteno e de lúmen dos túbulos seminíferos e a freqüência de diplóteno/meiose. A

apoptose de células germinativas também apresentou diferenças nas temperaturas investigadas

e será discutido posteriormente na seção 5.5. Os percentuais dos demais componentes

testiculares não apresentaram variações estatisticamente significativas entre os animais

mantidos nas diferentes temperaturas. Esses resultados podem indicar que esses componentes

não são sensíveis às mudanças de temperaturas investigadas no presente estudo ou

alternativamente o tempo de manutenção das tilápias nas diferentes temperaturas não foi

suficiente para evidenciar alterações.

De maneira geral, a proporção e a freqüência de espermatogônia do tipo B intermediária

e a proporção de espermatogônia do tipo B final e de pré-leptóteno foi maior em tilápias

mantidas a 20°C comparado com os animais nas demais temperaturas investigadas.

Inversamente, a freqüência de diplóteno/meiose foi menor em peixes mantidos a 20°C

47

Discussão

comparado com 35°C. Vilela et al. (2003) demonstrou que a fase meiótica é sensível a

mudanças de temperaturas, sendo que tilápias mantidas a 20°C apresentaram atraso

espermatogênico em espermatócitos em paquíteno, enquanto a 30°C essa fase da

espermatogênese é consideravelmente acelerada. Uma vez que a formação de células

germinativas meióticas é desacelerada nas temperaturas mais baixas, era esperada uma menor

freqüência de células em fases posteriores a espermatócitos em paquíteno, como ocorreu para

as células germinativas em diplóteno/meiose na temperatura de 20°C. As diferenças de

freqüência e proporção de células pré-meióticas nos peixes mantidos em diferentes

temperaturas podem ser explicadas por uma teoria proposta por Clermont e Mauger (1974;

1976), de acordo com a qual, as células germinativas em estágios mais avançados de

desenvolvimento controlam as células em estágios menos avançados. Essa teoria é baseada

em observações desses autores de que, em mamíferos, a eliminação por raios-X de

espermatócitos e espermátides arredondadas resultou em aumento da proliferação de

espermatogônias do tipo A, efeito esse bloqueado pela administração de extratos testiculares

com células em todos os estágios da espermatogênese. Observações semelhantes foram feitas

em estudos com transplante de espermatogônias, nos quais a diferenciação das células-tronco

espermatogoniais transplantadas diferiu entre animais receptores que apresentavam células

germinativas endógenas daqueles previamente tratados para a depleção dessas células

(Shinohara et al., 2002). Células germinativas pré-meióticas co-cultivadas com células nos

estágios meiótico e pós–meiótico apresentavam menor taxa de incorporação de timidina triciada

no peixe Squalus acanthias (Piferrer & Callard, 1995), o que indica que a teoria proposta por

Clermont e Mauger (1974; 1976) pode também ser aplicada a esse grupo de vertebrados,

apesar do arranjo das células germinativas no epitélio dos túbulos seminíferos diferir entre

peixes e mamíferos.

A temperatura alterou consideravelmente a proporção de lúmen, sendo esse menor nas

tilápias mantidas nas temperaturas de 20°C e 25°C, comparado a 35°C. A menor duração do

processo espermatogênico nas tilápias mantidas nas temperaturas mais altas (Vilela, 2003)

poderia explicar, pelo menos em parte, essa alteração. Nesse caso, a maturação de

espermatócitos e espermátides com conseqüente liberação de espermatozóides é acelerada

nos animais mantidos nas temperaturas mais altas, o que contribui para uma maior proporção

do lúmen dos túbulos seminíferos. Outra explicação para esse fato poderia envolver um balanço

da proporção de células de Sertoli imaturas/maduras nos testículos de tilápias. Em mamíferos, o

encerramento da proliferação de células de Sertoli coincide com a formação de lúmen dos

túbulos seminíferos, que é mantido pela secreção de fluidos pelas células de Sertoli, sendo

48

Discussão

considerado o melhor indicador morfofuncional do status de maturação desse tipo celular

(Russel et al., 1989). Aplicando esses conceitos da espermatogênese de mamíferos e

considerando que em peixes células de Sertoli imaturas (com capacidade de proliferação) e

maduras estão presentes nos testículos de animais adultos, a variação da proporção de lúmen

poderia ser explicada da seguinte forma: um balanço da proporção de células de Sertoli

imaturas/maduras estaria a favor de células de Sertoli imaturas em animais nas temperaturas

mais baixas, evidenciado pela maior proliferação desse tipo celular; e a favor de células de

Sertoli maduras nas tilápias mantidas nas temperaturas maiores, as quais apresentaram maior

proporção de lúmen. Também não podem ser descartados possíveis efeitos das temperaturas

mais elevadas na secreção de fluidos pelas células de Sertoli, secreção essa em parte regulada

através dos andrógenos (Sharpe, 2005; De Gendt et al., 2004) e, em menor parte, pelo FSH

(Ghosh et al., 1992; Swanlund et al., 1995).

5.1.2. Compartimento intertubular

Diferente do compartimento germinativo, o compartimento intersticial tem sido

relativamente pouco estudado em peixes (Chaves-Pozo et al., 2005a). O interstício pode sofrer

alterações ao longo do ciclo reprodutivo anual (Silva, 1987; Chavez-Pozo et al., 2005a;

Nóbrega, 2006), o que pode indicar que fatores ambientais como, por exemplo, a temperatura,

poderiam atuar nessas mudanças. Entretanto, a temperatura não alterou significativamente a

proporção do interstício em tilápias, nem dos diferentes componentes intertubulares, como o

tecido conjuntivo e as células de Leydig. Mas, vale ressaltar a tendência do efeito desse fator na

proporção de mastócitos e macrófagos, que foram chamados em conjunto de células de defesa

no presente trabalho. Portanto, pode-se especular que a temperatura seria capaz de controlar a

ocorrência de células de defesa no testículo, o que foi evidenciado pela tendência de maior

percentual desse tipo celular em tilápias mantidas a 20°C. Corroborando esses dados, estudo

realizado por Ruiz et al. (2001) demonstrou que a exposição de tilápias a temperaturas baixas

(3-5 min a 5-10°C) produziu estresse fisiológico, caracterizado por mudanças imunológicas e

fenotípicas imediatas. Embora ainda não se tenha uma idéia clara do papel desses tipos

celulares, trabalhos realizados com diversas espécies de peixes, tais como Sparus aurata,

Centropomus undecimalis, Padogobios martensi, Symbranchus marmotatus, S. acanthias e

Pimelodus maculatus, demonstraram que a presença de células do sistema imune é fisiológica

nos testículos desses animais (Piferrer & Callard, 1995; Grier & Taylor, 1998; Ciquete & Dramis,

2003; Chaves-Pozo et al., 2003; Lo Nostro et al., 2004; Chaves-Pozo et al., 2005a; Nóbrega,

2006). Em C. undecimalis, P. maculatus e S. aurata, por exemplo, a ocorrência de células do

49

Discussão

sistema imune sofreu variações durante o ciclo reprodutivo (Grier & Taylor, 1998; Chaves-Pozo

et al., 2005a; Nóbrega, 2006). Nas duas primeiras espécies, maior proporção de granulócitos foi

observada em testículos em regressão gonadal, caracterizados pela presença de

compartimento germinativo constituído apenas por células de Sertoli e espermatogônias (Grier

& Taylor, 1998; Nóbrega, 2006). Funcionalmente, essas células defesa, chamadas por alguns

autores de centros melanomacrofágicos, podem participar da remodelação dos testículos que

ocorrem durante a regressão testicular e são, dessa forma, importantes para a manutenção do

ciclo reprodutivo anual em peixes (Grier & Taylor, 1998).

Estudos em S. acanthias e S. aurata indicaram outras funções para as células de

defesa no testículo de peixes (Piferrer & Callard, 1995; Chaves-Pozo et al., 2005a; Chaves-

Pozo et al., 2005b). A ocorrência de leucócitos, tais como granulócitos acidófilos e de

macrófagos foi observada no compartimento intersticial durante a espermatogênese, enquanto

no final da espermiação, essas células eram encontradas em associação com a membrana

basal, próximas a cistos contendo células germinativas em degeneração (Chaves-Pozo et al.,

2005a). Além disso, nessa espécie a diminuição da proliferação espermatogonial durante a

espermiação e o seu aumento durante o período pós-espermiação coincidem com o aumento

da infiltração de granulócitos acidófilos (Chaves-Pozo et al., 2005a). Esse fato, associado com a

capacidade desses granulócitos acidófilos testiculares em produzir IL-1β, que é um regulador

positivo para a proliferação de espermatogônias em mamíferos, sugere que essas células

também podem estar envolvidas com a regulação do ciclo celular das espermatogônias

(Chaves-Pozo et al., 2003; Chaves-Pozo et al., 2005a). Em S. acanthias, a proliferação das

espermatogônias foi inibida quando essas células germinativas eram co-cultivadas com o órgão

epigonal, um órgão linfomielóide no pólo maduro do testículo, ou com secreções de granulócitos

(Piferrer & Callard, 1995). Pelo fato destes estudos indicarem que células do sistema imune

podem atuar no controle da proliferação espermatogonial, pode-se especular que as diferenças

com relação à proporção, freqüência e índice de proliferação de espermatogônias do tipo B de

tilápias mantidas a 20°C comparados aos animais nas demais temperaturas poderiam ser

decorrentes, pelo menos em parte, da presença de células do sistema imune no testículo.

5.2. Proliferação dos diferentes cistos de espermatogônias

No presente estudo, observou-se tendência de decréscimo do índice de proliferação de

espermatogônia do tipo A com o aumento da temperatura e menor índice de proliferação de

espermatogônias do tipo B em tilápias mantidas a 20°C, entretanto, os valores foram

estatisticamente significativos apenas para espermatogônias do tipo B intermediárias nos

50

Discussão

animais mantidos a 20°C em comparação com os peixes na temperatura de 30°C. Esse

resultado poderia indicar que a renovação de espermatogônias do tipo A seria induzida em

tilápias mantidas a 20°C e a rápida proliferação de espermatogônias do tipo B, com

conseqüente diferenciação e formação de espermatozóides seria desencadeada em

temperaturas mais altas. Talvez a manutenção das tilápias nas diferentes temperaturas por um

maior período de tempo poderia evidenciar melhor esses efeitos.

A menor incorporação de timidina triciada na temperatura de 20°C pode estar

relacionada ao atraso na duração do processo espermatogênico nas temperaturas mais baixas.

Apesar das diferentes espécies de teleósteos reproduzirem em temperaturas variadas (Cyr et

al., 1998; Watts et al., 2004; Hatakeyama & Akiyama, 2007; Pörter et al., 2007), em várias

espécies de peixes já foi demonstrado que a temperatura é um importante fator que altera a

duração e eficácia do processo espermatogênico, especialmente, nas fases meiótica e

espermiogênica (Egami & Hyodo-Taguch, 1967; Billard, 1968; Shimizu, 2003; Vilela et al.,

2003). Nesse sentido, na espécie de peixe P. reticulata, a espermatogênese é acelerada com o

aumento da temperatura entre os limites de 20°C a 30°C, entretanto, a espermatogênese não

se completou em temperaturas extremas (15°C e 34,5°C) (Billard, 1968). Em O. latipes, à

temperatura de 25°C, os espermatozóides marcados com radioisótopos aparecem com 12 dias

e a 15°C em 21 dias (Egami & Hyodo-Taguchi, 1967). Em tilápias, a duração do processo

espermatogênico é mais curta nos animais mantidos em temperaturas mais elevadas (30°C e

35°C) em comparação com a temperatura considerada fisiológica (~25ºC) para a reprodução

dessa espécie (Vilela et al., 2003). Diante desses dados, Vilela et al. (2003) sugeriu que as

alterações no ritmo de progressão das células germinativas podem estar relacionadas com

mecanismos de regulação do ciclo celular que envolve as proteínas Hsp-70, ciclinas A e B,

quinase Cdk1 e o MPF (maturation-promoting factor), que são importantes na transição da fase

G2-M do ciclo celular. Os trabalhos da literatura descritos acima ressaltam a influência espécie-

específica da temperatura na duração das fases meiótica e espermiogênica, entretanto, o

presente trabalho apresenta evidências também de alteração da duração da fase

espermatogonial.

Independentemente da temperatura, as espermatogônias do tipo A e do tipo B

apresentaram índice de proliferação de aproximadamente 10% e 50%, respectivamente, o que

sugere que a duração do ciclo celular difere consideravelmente entre esses tipos

espermatogoniais. Dados semelhantes foram encontrados em bagre africano, utilizando a

marcação por 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) para a identificação de células em proliferação.

Nessa espécie, foi observado que o índice de marcação das espermatogônias do tipo A era

51

Discussão

cinco vezes menor que das espermatogônias do tipo B, indicando que a duração do ciclo celular

dessas últimas é cinco vezes mais curto (Schulz & Miura, 2002; Schulz et al., 2005). Diferenças

com relação à taxa de proliferação dos diferentes tipos espermatogoniais também foram

encontradas no peixe S. acanthia em experimentos in vivo e in vitro (Piferrer & Callard, 1995;

McClusk, 2005). Em enguia japonesa, o tratamento de machos imaturos com gonadotrofina

coriônica humana estimulou a proliferação de espermatogônias iniciais em todos os peixes,

entretanto, essa proliferação cessou após 4 ou 5 divisões mitóticas em alguns animais (Miura et

al., 1997). Esses dados da literatura juntamente com os resultados do presente trabalho

sugerem que espermatogônias do tipo A e do tipo B apresentam diferentes índices de

proliferação que refletem, provavelmente, distintos mecanismos regulatórios que atuam sobre

esses tipos celulares. Possivelmente, diferentes mecanismos regulatórios são necessários para

o adequado balanço entre a renovação das espermatogônias tronco e a diferenciação

espermatogonial.

Interessantemente, o índice de proliferação das espermatogônias do tipo A que se

localizavam no fundo dos túbulos seminíferos, próximas à túnica albugínea (SPGA-f), foi menor

do que o obtido para as espermatogônias do tipo A localizadas ao longo dos túbulos

seminíferos (SPGA-t). Considerando essa observação e os dados da literatura que indicam que

as espermatogônias-tronco constituem o grupo de células espermatogoniais com o menor

índice de proliferação (De Rooij, 1998; De Rooij, 2001; Kubota & Brinster, 2006), as

espermatogônias do tipo A encontradas no fundo dos túbulos seminíferos de tilápias poderiam

ser um subtipo de espermatogônia mais indiferenciada. Além desse possível subtipo

espermatogonial, na extremidade distal dos túbulos seminíferos também são encontradas

células de Sertoli com características de células imaturas (Vilela, 2003), não podendo ser

descartada a existência de células de Sertoli tronco. Observações semelhantes foram feitas por

Grier & Taylor (1998) em uma outra espécie de peixe perciforme (C. undecimalis), na qual foi

considerado que essas células localizadas na extremidade distal possivelmente desempenham

um papel crucial no alongamento dos túbulos seminíferos e podem ser a fonte mais importante

de células germinativas no testículo entre as estações reprodutivas.

5.3. Proliferação de células somáticas testiculares

Em peixes, novos cistos são continuamente formados quando as células de Sertoli

envolvem uma única espermatogônia do tipo A (Koulish et al., 2002). Em seguida, para

acompanhar o desenvolvimento das células germinativas, é necessário o aumento do número

de células de Sertoli (Vilela et al., 2003). Nesse sentido, pelo fato de normalmente

52

Discussão

apresentarem crescimento contínuo, em teleósteos adultos a proliferação de células de Sertoli é

essencial para o crescimento testicular, para a manutenção dos sucessivos ciclos reprodutivos

e para o aumento da produção espermática final da espécie (Koulish et al., 2002; Matta et al.,

2002; LoNostro et al., 2003; Vilela et al., 2003; Schulz et al., 2005). No presente estudo, apesar

da proporção de células de Sertoli não apresentar variações nas diferentes temperaturas

investigadas, o índice de proliferação dessas células foi maior nas tilápias mantidas a 20°C e

menor naquelas a 30°C e 35°C. Estudos da proliferação de células de Sertoli em peixes ao

longo do ciclo reprodutivo anual foram realizados em P. maculatus e S. aurata (Chaves-Pozo et

al., 2005a; Nóbrega, 2006). Nessas espécies, maior proliferação de células de Sertoli foi

encontrada em testículos na classe regredida e no início da maturação gonadal, que coincidiu

com a alta proporção de espermatogônias no testículo (Chaves-Pozo et al., 2005a; Nóbrega,

2006). Nas tilápias investigadas no presente estudo, o percentual e a freqüência de cistos de

espermatogônias do tipo B foram maiores na temperatura de 20°C, esse resultado juntamente

com o fato de que as células de Sertoli proliferam preferencialmente associadas a

espermatogônias pode explicar o maior índice de proliferação da célula de Sertoli a 20°C. Além

disso, foi observada preferência das células de Sertoli em proliferarem associadas com cistos

de espermatogônias do tipo B que não se encontravam em proliferação. Desde que o índice de

proliferação de espermatogônias do tipo B intermediárias é menor a 20°C, esse fato pode

também ter contribuído para a maior proliferação de células de Sertoli nessa temperatura. É

interessante notar que o efeito da temperatura na proliferação de células de Sertoli foi mais

proeminente que o observado para a atividade proliferativa das células germinativas. Esse

resultado pode ser explicado, pelo menos em parte, por um modelo de proliferação de células

somáticas e germinativas em peixes proposto por Nóbrega (2006). De acordo com esse autor, a

proliferação de células de Sertoli antecede a proliferação espermatogonial, garantindo número

adequado de células somáticas para suportar o posterior crescimento do cisto.

A proliferação de células de Sertoli isoladas no epitélio germinativo descontínuo,

formado por trechos de células de Sertoli entremeados por alguns poucos e dispersos cistos de

espermatogônias, foi observada em S. acanthias e em Serassalmus spilopleura (McClusky,

2005; Nóbrega, 2006). Nas tilápias investigadas no presente estudo, a proliferação de células

de Sertoli isoladas foi detectada em pequena proporção, enquanto em S. spilopleura a divisão

de células de Sertoli ocorre apenas quando elas estão isoladas (não fazem parte do cisto) ou

quando associadas a cistos de espermatogônias que não estão em divisão (Nóbrega, 2006).

Essas células isoladas podem eventualmente constituir uma população de células de Sertoli

que ainda não envolveu as células germinativas ou, alternativamente, serem provenientes de

53

Discussão

cistos espermiados, que podem, então, se dividir e novamente envolver espermatogônias. O

destino das células de Sertoli de peixes após a espermiação é ainda incerto, embora se

especule que as mesmas podem sofrer degeneração ou se integrarem aos ductos espermáticos

(Grier, 1981; Pudney, 1993). A transformação de células de Sertoli das paredes dos cistos

rompidos em células dos ductos eferentes foi observada em poecilídeos e em Leporinus

silvestri, mas não foi evidenciada em tilápias (Hurk et al., 1974; Andrade & Godinho, 1983; Silva,

1987). Nessa última espécie, células de Sertoli com características de degeneração também

não foram encontradas (Vilela, 2003). Uma vez que existem evidências de que as células de

Sertoli de tilápias não se degeneram nem se transformam em células dos ductos espermáticos,

pode-se considerar a possibilidade dessas células serem incorporadas a novos cistos após a

espermiação. De fato, a ocorrência de proliferação de células de Sertoli isoladas ou associadas

com espermátides observadas no presente estudo, de certa forma, corrobora essa hipótese.

A proliferação de células intersticiais, provavelmente precursoras de células de Leydig,

ocorre em determinados períodos do ciclo reprodutivo, sendo observada exclusivamente

durante a maturação gonadal em S. aurata (Chaves-Pozo et al, 2005a) e durante a regressão

testicular em P. maculatus (Nóbrega, 2006). A proliferação de células intersticiais também foi

demonstrada em testículos regredidos de trutas (O. mykiss) quando submetidos a 17-β estradiol

(E2) in vitro o que indica que sob determinados estímulos, provavelmente E2, precursoras de

células de Leydig proliferam e se diferenciam em células esteroidogênicas (Bouma et al., 2003).

A ocorrência de proliferação durante um período restrito do ano indica que possivelmente

fatores ambientais, como por exemplo, a temperatura, atuem na proliferação desse tipo celular.

De fato, o índice de proliferação das células de Leydig foi significativamente maior em peixes

mantidos a 20°C em comparação com as maiores temperaturas (30°C e 35°C). Dados da

literatura quanto aos efeitos da temperatura nas células de Leydig são escassos. Em

mamíferos, os dados disponíveis relatam que o aumento da temperatura (de 33°C para 37°C)

de co-cultura de células de Sertoli com células de Leydig imatura de ratos resultou em aumento

da proliferação destas células esteroidogênicas e diminuição da produção de testosterona e da

expressão de receptores de LH (Wu & Murono, 1996). Além disso, um outro estudo in vitro

demonstrou que a resposta das células de Leydig a alta temperatura (45°C por 10 minutos)

inclui a ativação de MAPKs (família de proteína quinase serina/treonina) relacionadas a

sobrevivência e morte celular (Gorostizaga et al., 2005). Assim, os resultados de presente

trabalho juntamente com os dados da literatura sugerem que a temperatura regula a

proliferação e a função das células de Leydig em mamíferos e, pelo menos, a proliferação

desse tipo celular em teleósteos.

54

Discussão

Conforme descrito por Vilela (2003), células de Leydig marcadas encontravam-se

predominantemente na região próxima dos ductos espermáticos, onde possivelmente células

espermatogênicas mais avançadas e células de Sertoli diferenciadas predominavam

nos túbulos seminíferos. Ainda de acordo com esse autor, essa distribuição de células de

Leydig marcadas seria esperada, desde que as células espermatogênicas a partir da prófase

meiótica requerem maior aporte de andrógenos (Schulz & Miura, 2002; Vilela, 2003). Baseando-

se em dados de mamíferos, nos quais o hormônio anti-müleriano (AMH) produzido pelas células

de Sertoli inibe a proliferação e maturação das células de Leydig (Fynn-Thompson et al., 2003)

e em trabalhos realizados em peixes, nos quais o AMH foi expresso predominantemente pelas

células de Sertoli em contato com espermatogônias (Yoshinaga et al., 2004), Schulz e

colaboradores (2005) sugerem que a distribuição das células de Leydig em proliferação ao

longo dos túbulos seminíferos de tilápias estaria relacionada ao efeito desse hormônio. Nesse

caso, a porção distal dos túbulos seminíferos, onde se encontram predominantemente

espermatogônias e células de Sertoli, apresentaria maior concentração de AMH, que, então,

inibiria a proliferação das células esteroidogênicas nessa porção do testículo. Devido a

possibilidade de fatores parácrinos produzidos por células do túbulo seminífero influenciarem a

proliferação das células de Leydig (De Gendt et al., 2005), foi analisado o tipo de cisto

espermatogênico próximo às células de Leydig marcadas por timidina triciada. Os dados obtidos

corroboram as hipóteses sugeridas por Vilela (2003) e Schulz et al. (2005), uma vez que as

células de Leydig marcadas encontravam-se preferencialmente próximas a espermatócitos e

espermátides. Aparentemente a temperatura influenciou o padrão de distribuição dos cistos

espermatogênicos associados com as células de Leydig marcadas, entretanto, a análise de

correlação demonstrou que essas alterações foram decorrentes das mudanças de proporção de

cistos de espermatogônias, espermatócitos e espermátides nas diferentes temperaturas

investigadas.

Correlação positiva foi observada entre a proliferação de células de Sertoli e de Leydig,

sendo que ambos os tipos celulares apresentaram maior índice de proliferação em tilápias

mantidas a 20°C. A coordenação entre a proliferação desses dois tipos de células somáticas

também foi observado em tilápias e em ratos hipotireóidicos e em suínos, nos quais o aumento

do número de célula de Sertoli foi acompanhado por um maior número de células de Leydig no

testículo (Hardy et al., 1993; Mendis-Hagahama et al., 1998; França et al., 2000; Matta et al.,

2002). Os resultados encontrados no presente estudo, juntamente com dados da literatura,

permitem especular que (1) um mesmo estímulo induz a proliferação tanto das células de Sertoli

55

Discussão

quanto das células de Leydig e/ou (2) que a proliferação das células de Leydig seria regulada

pelas células de Sertoli, possivelmente, através de fatores parácrinos.

Evidências de que a primeira hipótese é valida em peixes vêm de estudos que

demonstram que E2 estimula tanto a proliferação de células de Sertoli (Chavez-Pozo et al.,

2007) quanto à de células de Leydig (Bouma et al., 2003), ou seja, um mesmo fator controla a

atividade proliferativa dessas duas células somáticas testiculares. Além disso, estudos em

peixes sugerem que o receptor de FSH apresenta afinidade não só para o FSH, como também

para o LH. De maneira oposta, o FSH pode estimular a síntese de andrógenos pelas células de

Leydig, possivelmente, através da ativação de receptores de LH (Miwa et al., 1994; Oba et al.,

1999; Bogerd et al., 2001; Schulz & Miura, 2002). Assim, os efeitos de E2 sobre a atividade

proliferativa das células de Sertoli e de Leydig e a possível promiscuidade dos receptores de

FSH e LH em peixes corroboram a hipótese de que um mesmo estímulo desencadeie a

proliferação dessas duas células somáticas testiculares.

Favorecendo a segunda hipótese, co-cultura de células de Sertoli imaturas e de Leydig

de ratos resultou em aumento da síntese de DNA e do número das células de Leydig. Além

dessas mudanças, a produção de testosterona e o nível de receptores de LH foram reduzidos

nas células de Leydig co-cultivadas (Wu & Murono, 1994). Esses mesmos efeitos foram

observados quando as células de Leydig eram cultivadas com meio obtido de cultura de célula

de Sertoli. Entretanto, a proliferação das células de Leydig foi interrompida quando esse meio

era previamente fervido ou tratado com tripsina. Esses dados indicaram que um fator protéico

produzido pelas células de Sertoli participa da regulação da proliferação das células de Leydig

(Wu & Murono, 1994). Além disso, o aumento da temperatura da co-cultura, de 33°C para 37°C,

ocasionou aumento da secreção de fator mitogênico pelas células de Sertoli e da

responsividade a tal fator pelas células de Leydig, indicando que essa secreção parácrina e

conseqüente proliferação de células de Leydig podem ser influenciadas pela temperatura (Wu &

Murono, 1996). Esses dados descritos acima sugerem a existência de interação funcional,

mediada por fatores parácrinos, entre as células de Sertoli e de Leydig, cuja secreção pode ser,

pelo menos em parte, regulada pela temperatura.

Estudos em mamíferos indicam que as células peritubulares mióides podem estar

envolvidas na elaboração da membrana basal (Dym, 1994), na modulação das células de

Sertoli e da espermatogênese através da produção de fatores específicos (Skinner & Fritz,

1985; Verhoven et al., 2000), no crescimento dos cordões seminíferos (Konrad et al., 1998) e na

proteção dos testículos contra vírus (Dejucq et al., 1998; Dejucq & Jégou, 2001; Melaine et al.,

2003). Em peixes, estudos que abordam as funções desse tipo celular são escassos e os dados

56

Discussão

disponíveis na literatura sugerem que as células mióides nesse grupo de vertebrados poderiam

formar uma rede contrátil capaz de facilitar a expulsão dos espermatozóides dos túbulos

seminíferos durante a espermiação (Grier et al., 1989). Ainda, a capacidade proliferativa destas

células contribuiria para o crescimento intenso que ocorre nos túbulos seminíferos (Vilela, 2003;

Schulz et al., 2005). No presente estudo, o padrão de proliferação de células mióides não foi

alterado nas diferentes temperaturas investigadas. No nosso conhecimento, não existem dados

a esse respeito na literatura. Estudos das células peritubulares mióides no peixe P. martensi

também não evidenciou alterações ultra-estruturais nesse tipo celular ao longo do ciclo

reprodutivo anual (Cinquetti & Dramis, 2003).

Aparentemente a temperatura influenciou apenas o padrão de associação de células

mióides marcadas com cistos de espermatogônias do tipo B, entretanto, a análise de correlação

entre a proporção de cistos espermatogênicos e o percentual de cistos associados a células

mióides em proliferação nas diferentes temperaturas sugere que esse efeito foi decorrente da

maior proporção desse tipo de célula germinativa na temperatura de 20°C. As células

peritubulares mióides proliferaram preferencialmente próximas a cistos de espermatócitos,

independentemente da temperatura. Esses resultados podem sugerir que (1) as células mióides

apresentam um padrão de proliferação homogêneo ao longo dos túbulos seminíferos, conforme

também observado por Vilela (2003), e a preferência de associação com espermatócitos

apenas reflete a maior proporção desse tipo de cisto espermatogênico nos túbulos seminíferos;

ou (2) as células mióides proliferam preferencialmente com espermatócitos para se adequar ao

grande volume alcançado por esse tipo de cisto (Vilela, 2003). A alta plasticidade das células

peritubulares mióides quanto a sua capacidade de distensão talvez influencie a sua dinâmica de

proliferação e, provavelmente, dificulta a identificação de um padrão de proliferação para esse

tipo celular.

5.4. Coordenação entre a proliferação de células de Sertoli e espermatogônias

A temperatura não alterou a coordenação da proliferação das células de Sertoli com as

espermatogônias, de modo que, em todas as temperaturas investigadas foi identificada uma

tendência de proliferação assincrônica entre as células de Sertoli e espermatogônias do tipo A e

uma preferência das células de Sertoli em proliferarem nos cistos de espermatogônias do tipo B

que não se encontravam em divisão. Resultados bastante semelhantes foram obtidos em bagre

africano, nos quais raramente foi observada proliferação simultânea entre células de Sertoli e

espermatôgonias do tipo A e quando as células de Sertoli BrdU-positivas estavam associadas a

57

Discussão

células germinativas também marcadas, essa proliferação simultânea ocorria

predominantemente entre as células de Sertoli e espermatogônias do tipo B (87,5%) (Schulz et

al., 2005). Conforme também demonstrado no presente trabalho, embora a proliferação

simultânea das espermatogônias e células Sertoli ocorra num mesmo cisto (Koulish et al., 2002;

Schulz et al., 2005), análises quantitativas indicam predominância de relação inversa entre a

proliferação desses tipos celulares em peixes (Chaves-Pozo et al, 2005a; McClusk, 2005;

Schulz et al., 2005; Nóbrega, 2006) e em mamíferos (Schlatt et al., 1999). Tendo como

referência o índice de proliferação das espermatogônias do tipo A, a análise estatística pelo

teste qui-quadrado indicou que a baixa proliferação das células de Sertoli e das

espermatogônias do tipo A, poderia garantir a proliferação assincrônica entre esses tipos

celulares. Alternativamente, pode-se especular que diferentes mecanismos atuam sobre as

células de Sertoli e espermatôgonias, de modo a garantir períodos de proliferação distintos

entre esses tipos celulares. Nesse caso, vias regulatórias diferentes poderiam assegurar uma

proliferação de células de Sertoli que antecede a divisão de espermatogônias, o que resulta em

um número adequado de células somáticas para acompanhar o crescimento dos cistos durante

a espermatogênese (Schulz & Miura, 2002; Chavez-Pozo et al., 2005a; Nóbrega, 2006).

5.5. Apoptose de células germinativas

Utilizando características morfológicas, no presente trabalho pôde-se identificar

apoptose que acometia células individuais ou que atingia um grupo de células. A morte de

células germinativas individuais foi descrita por Callard (1998), que também observou que cistos

espermatogoniais imaturos raramente apresentaram apoptose de todas as células germinativas

do mesmo. Espermatogônias coalesceram para formar células gigantes multinucleadas em

cistos espermatogênicos de S. acanthias, um fenômeno provavelmente facilitado pela abertura

ou dissolução das pontes intercelulares entre as células germinativas (Pudney, 1995; McClusky,

2005). A apoptose de células germinativas desempenha basicamente dois papéis na

espermatogênese, ela participa do controle de densidade celular, fornecendo um balanço

adequado do número de células somáticas e células germinativas e atua como um checkpoint,

eliminando as células germinativas anormais (Baum et al., 2005). No presente estudo, a

proporção de apoptose foi maior em tilápias mantidas a 20°C comparado com os peixes das

demais temperaturas investigadas. Esse resultado indica que a morte de células germinativas

em peixes pode ser desencadeada em temperaturas não favoráveis a reprodução. Em

58

Discussão

mamíferos, animais criptorquídicos ou submetidos a tratamento para aumentar a temperatura

escrotal demonstraram elevada apoptose de células espermatogênicas, principalmente nas

fases meiótica e espermiogênica, embora a fase mais afetada possa ser espécie-específica

(Setchell, 1998; Setchell, 2006). Os mecanismos envolvidos com essa morte de células

germinativas induzida pelo calor podem envolver a produção de espécies reativas de oxigênio,

a proteína supressora de tumor p53, a translocação do fator pró-apoptótico Bax do citoplasma

para a posição perinuclear, a liberação do citocromo c da mitocôndria, várias caspases e o

sistema Fas/Fas ligante (Setchell, 2006).

Em teleósteos, informações sobre a influência do estresse térmico nas diferentes fases

do processo espermatogênico são escassos. Em tilápias, provavelmente devido a grande

variação individual, não se evidenciaram alterações do índice apoptótico decorrentes da

temperatura para os diferentes tipos de células germinativas. Entretanto, para os animais

mantidos a 20°C e 25°C, o índice apoptótico não variou entre os tipos de células germinativas,

enquanto nos peixes mantidos nas temperaturas mais altas (30°C e 35°C), esse índice foi

menor para espermatogônias do tipo B e espermatócitos. Dessa forma, a temperatura alterou o

tipo de célula germinativa que preferencialmente sofre apoptose em tilápias. Observação

semelhante foi feita por Billard (1969) em guppys, nos quais as temperaturas de 15ºC e 34,5ºC

causaram perdas celulares em espermatogônias e espermátides, respectivamente. Outros

estudos em peixes relatam especificidade com relação ao tipo de célula germinativa que

preferencialmente sofre apoptose durante a espermatogênese (Billard, 1969; Chaves-Pozo et

al., 2005a; McClusky, 2005; Nóbrega, 2006; Cardoso, 2007; Almeida et al., 2008). Nesse

sentido, maior proporção de apoptose foi descrita na fase espermatogonial em P. reticulata, S.

aurata, S. acanthias e Gadus morhua (Billard, 1969; Chaves-Pozo et al., 2005a; McClusky,

2005; Almeida et al., 2008) e nas fases espermatocitária e espermiogênica em Torpedo

marmorata, S. spilopleura e Danio rerio (Prisco et al., 2003; Nóbrega, 2006; Cardoso, 2007). Em

mamíferos, as perdas celulares ocorrem principalmente nas fases espermatogonial e meiótica,

podendo também ser observadas durante a espermiogênese em algumas espécies (França &

Russell, 1998). Essas diferenças observadas quanto ao tipo de células germinativas que

predominantemente sofre apoptose podem ser decorrente de variações espécie-específicas

conforme descrito acima ou por diferenças na metodologia empregada para a identificação e

quantificação da apoptose. Com relação a essa segunda possibilidade, diferentes metodologias

têm sido utilizadas para quantificar a apoptose na espermatogênese de peixes. No trabalho

realizado por McClusky (2005), por exemplo, um cisto espermatogênico era considerado em

apoptose quando apresentava mais que três células positivas para TUNEL. Em G. morhua, a

59

Discussão

quantificação de morte celular foi feita analisando-se a porcentagem de cistos de

espermatogônias, espermatócitos e espermátides em apoptose em 100 cistos

espermatogênicos que apresentavam células positivas para TUNEL (Almeida et al., 2008). No

presente estudo a quantificação de apoptose foi realizada através da contagem do número de

morte celular em 100 espermatogônias do tipo A e em 1000 espermatogônias do tipo B,

espermatócitos e espermátides.

5.6. Considerações finais

Dados da literatura com relação aos efeitos de diferentes temperaturas na função

testicular de peixes são limitados. Entretanto, existe considerável gama de trabalhos em

mamíferos que avaliaram os efeitos da exposição dos testículos a temperatura mais elevadas

(Vogler et al, 1991; Vogler et al, 1993; Setchell, 2006; Bergh e Soder, 2007; Jung & Schuppe,

2007; Sato et al., 2007). Nesses estudos chamam a atenção a considerável variação individual

com relação à resposta a exposição ao calor (Setchell, 2006). Nesse sentido, dos seis búfalos

estudados por Vogler et al, (1991; 1993), dois demonstraram um grande aumento de

espermatozóides anormais (mais de 60%), enquanto os outros tiveram poucos efeitos,

apresentando apenas 23% de células anormais. Essa grande variação de resposta também foi

observada nos peixes do presente estudo, evidenciado, por exemplo, pelos altos valores de erro

padrão do percentual de apoptose e células do sistema imune. Essa variação da resposta

individual é decorrente provavelmente da diferente constituição genética dos animais que

confere diferentes graus de resistência às mudanças de temperaturas.

Os efeitos da temperatura sobre a reprodução podem ser decorrentes de sua ação direta

e/ou indireta, através da mediação hormonal. Como exemplos de efeitos diretos da temperatura

podem ser citados a influência desse fator em processos celulares e moleculares tais como as

propriedades da membrana, a homeostase de íons, o influxo de cálcio, cascatas de sinalização

(cAMP, cGMP e proteínas quinases A e C) que podem afetar processos de fosforilação de

proteínas e a expressão de ciclinas (proteínas importantes para a progressão do ciclo celular)

(Rensing & Ruoff, 2002; Jang et al., 2005). Com relação aos efeitos indiretos da temperatura, a

via precisa pela qual esse fator atua no sistema neuroendócrino ainda não foi ainda desvendada

(Quintana et al., 2004). Entretanto, em muitos trabalhos a temperatura é considerada como um

dos principais fatores ambientais responsável pela sincronização do ciclo reprodutivo anual em

peixes, de modo que, altas temperaturas aumentam a liberação basal de gonadotrofinas e a

responsividade do GnRH, que induz, por sua vez, a recrudescência gonadal, caracterizada pelo

aumento do IGS e dos níveis de testosterona (Razane et al., 1988; Lin et al., 1996; Yu & Peter,

60

Discussão

1990; Fraser et al., 2002; Masuda et al., 2003; Quintana et al., 2004; Vera et al., 2007). Uma vez

que os níveis hormonais não foram medidos nas tilápias por nós investigadas, deve-se

considerar que os efeitos da temperatura relatados no presente trabalho podem ser decorrentes

tanto de suas ações diretas quanto das indiretas.

Várias características observadas nos testículos de tilápias mantidas a 20°C são

semelhantes às observadas em testículos em regressão ou regredidos de espécies de peixes

de reprodução descontínua (Grier & Taylor, 1998; Chaves-Pozo et al, 2005a; McClusk, 2005;

Nóbrega, 2006). Dentre essas características podem ser citadas a maior proporção de

espermatogônias, menor proporção de lúmen, maior proliferação de células de Sertoli e de

Leydig e a tendência de maior proporção de células de defesa (Chaves-Pozo et al, 2005a;

McClusk, 2005; Nóbrega, 2006). Por outro lado, tilápias mantidas nas temperaturas mais altas,

particularmente a 35°C, apresentaram características de testículos em maturação/maturação

final, especialmente devido à presença de lúmen amplo, menor proporção de espermatogônias

e menor proliferação de células de Sertoli (Chaves-Pozo et al., 2005a; McClusk, 2005; Nóbrega,

2006). Pelo fato da tilápia ser um peixe de reprodução contínua, esses dados permitem

especular que a temperatura pode induzir alterações testiculares, semelhantes àquelas

observadas em peixes sazonais, mesmo em espécies que reproduzem durante todo o ano,

indicando ao animal o período mais adequado para a reprodução. No entanto, merece ser

mencionado que outros fatores, tais como fotoperíodo, precipitação pluviométrica,

disponibilidade de alimento, condutividade e pH da água e oxigênio dissolvido, podem também

influenciar nessa importante atividade (Vazzoler, 1996; Bazzoli, 2003; Quintana et al., 2004;

Andrade & Braga, 2005; Alvarenga et al., 2006).

Por fim, diante dos resultados obtidos no presente estudo pode-se especular o seguinte

modelo de ação da temperatura sobre a espermatogênese de tilápias (Fig. 23): baixas

temperaturas induzem a renovação espermatogonial e altas temperaturas, que provavelmente

indicam melhores condições para a reprodução dessa espécie, desencadeiam a rápida

diferenciação das células germinativas, com conseqüente formação de um grande número de

espermatozóides. A parada espermatogênica que ocorre nas temperaturas mais baixas é

geralmente acompanhada pela maior proliferação de células somáticas testiculares e por

apoptose de células germinativas. Provavelmente, esse aumento do número de células

somáticas e a apoptose e reabsorção de células germinativas são importante para preparar o

testículo para dar continuidade a espermatogênese, quando a temperatura voltar a ser

favorável. A proliferação de células de Sertoli antecede a proliferação de células germinativas e

assegura número adequado desse tipo celular para acompanhar o desenvolvimento das células

61

Discussão

germinativas quando a temperatura for novamente adequada para a reprodução. Do mesmo

modo, maior proliferação de células de Leydig nas temperaturas mais baixas poderia garantir a

expansão do número desse tipo celular, que então se diferenciaria e cumpriria suas funções

esteroidogênicas, essenciais para as fases meiótica e espermiogênica, quando a temperatura

atingir valor propício para a produção de espermatozóides. Talvez a manutenção das tilápias

por período mais prolongado nas diferentes temperaturas analisadas no presente estudo

poderia melhor evidenciar as alterações propostas por esse modelo. No entanto, merece ser

ressaltado que essa abordagem não foi realizada pelo fato do nosso laboratório não permitir as

condições necessárias para manter os peixes por muito tempo na temperatura de 20°C.

Caso as alterações observadas nas tilápias mantidas a 20°C permanecessem por

período mais prolongado de tempo, poderia se especular pelo menos duas aplicações

interessantes desses animais no estudo da espermatogênese em peixes. Primeiramente, eles

constituiriam excelentes doadores para o transplante de espermatogônias, uma vez que, a

maior renovação espermatogonial e apoptose de células germinativas mais avançadas

resultariam em um maior pool de espermatogônias do tipo A, que são consideradas as células

germinativas mais indiferenciadas em peixes. Uma segunda aplicação seria no estudo de

fatores que controlam a espermatogênese em peixes. Nesse caso, testículos de tilápias

mantidas a 20°C, os quais apresentariam a predominância de espermatogônias do tipo A,

poderiam ser utilizados como modelo para estudo in vitro de fatores que controlam a

espermatogênese. Utilizando-se esse modelo, poderiam ser testados hormônios ou fatores

parácrinos candidatos ao controle do balanço proliferação/diferenciação de espermatogônias.

Nesse caso, seriam evidenciados os fatores que induzem a diferenciação espermatogonial, com

conseqüente formação de espermatozóides, uma vez que os testículos no início do trabalho

experimental apresentariam predominância de espermatogônias do tipo A.

62

6. CONCLUSÃO

Conclusão

6 – CONCLUSÃO

De maneira geral, as investigações feitas no presente estudo permitem concluir que:

1. Mesmo sendo um peixe de reprodução contínua, as tilápias nilóticas analisadas no

presente estudo apresentaram várias alterações testiculares decorrentes da variação

da temperatura, podendo este fator ambiental ser considerado como importante

modulador da atividade reprodutiva nessa espécie de teleósteo.

2. Os resultados encontrados sugerem um modelo de ação da temperatura em tilápias,

no qual baixas temperaturas induzem a renovação espermatogonial e altas

temperaturas, que provavelmente indicam melhores condições para a reprodução

dessa espécie, desencadeiam a rápida diferenciação das células germinativas, com

conseqüente formação de grande número de espermatozóides. O atraso na evolução

do processo espermatogênico que ocorre nas temperaturas mais baixas é

geralmente acompanhado pela maior proliferação de células somáticas testiculares e

por apoptose de células germinativas. Provavelmente, esse aumento do número de

células somáticas e a morte e reabsorção de células germinativas são importantes

para preparar o testículo para dar continuidade à espermatogênese, quando a

temperatura voltar a ser favorável para a reprodução dessa importante espécie de

peixe.

3. Caso as alterações observadas nas tilápias mantidas a 20°C permanecessem por

período mais prolongado de tempo, poderia se especular que esses animais

apresentariam maior renovação espermatogonial e apoptose de células germinativas

mais avançadas. Nos testículos desses animais, esses processos celulares

provavelmente resultariam em maior pool de espermatogônias do tipo A, que são

consideradas as células germinativas mais indiferenciadas. Testículos com essas

características apresentariam algumas aplicações interessantes no estudo da

espermatogênese em peixes, como por exemplo, a sua utilização como doadores

para o transplante de espermatogônias e no estudo de fatores que controlam a

proliferação e diferenciação espermatogonial, bem como dos elementos somáticos

do testículo.

64

7. ANEXOS - FIGURAS E TABELAS

Figura 1 - Diversidade de vertebrados. As áreas do diagrama correspondem ao número aproximado de espécies atuais em cada grupo. Nomes comuns aparecem no interior do círculo interno e os nomes formais dos grupos estão nas partes externas do diagrama Fonte: Pough et al., 2003.

Figuras e Tabelas

65

Figura 2 - Exemplar adulto de tilápia nilótica (Oreochromis niloticus).

Figuras e Tabelas

66

Figura 3 – Principais eventos do processo de diferenciação gonadal de tilápias XX e XY. No 7° dia pós-eclosão (dpe) as gônadas de tilápias são indiferenciada (A). Os primeiros sinais de diferenciação sexual observados ao microscópio aparecem aos 23-26 dpe, sendo que no 30°dpe é observada o alongamento da gônada (seta) para a formação da cavidade ovariana nos animais XX (B) e uma fenda (seta) que indica o início da formação dos ductos eferentes nas gônadas XY (C). No 70° dpe, as gônada XX (D) e XY (E) já são completamente distintas. Barra =10 (A-C) e 50 µm (D e E). Fonte: Ijiri et al., 2008.

Figuras e Tabelas

67

Bexiga urinária

TESTÍCULOBexiga natatória

Papila urogenitalÂnus

IntestinoIntestino Estômago

Rim

Papila urogenital

Figura 4 - Localização (A e B) e morfologia macroscópica (C) dos testículos de tilápias sexualmente maduras.

A B

C

Figuras e Tabelas

68

Albugínea

Parênquima

testicular

Corte longitudinal

Figura 5 - Arranjo do compartimento germinativo em tilápias nilóticas sexualmente maduras, mostrando túbulos seminíferos (*) com disposição radial e com extremidade distal em fundo cego. Em cada túbulo seminífero, a porção listrada em verde corresponde a região analisada no presente estudo

*

Figuras e Tabelas

69

*

Ducto testicular principal

Figura 6 - Desenho esquemático (A) e fotomicrografia (B) de corte transversal de túbulo seminífero de tilápia nilótica sexualmente madura, mostrando arranjo cístico da espermatogênese. EG = epitélio germinativo; SPGA = espermatogônia do tipo A; SPGB = espermatogônia do tipo B; SPTC1 = espermatócito primário; M1 = espermatócito na metáfase da meiose 1; M2 = espermatócito na metáfase da meiose 2; SPTD = espermátide; SPZ = espermatozóide; CS = célula de Sertoli; CL = célula de Leydig; CPM = célula peritubular mióide; TP = túnica própria; Mb = membrana basal; T = túbulo seminífero; L = lúmen; Mt = mastócitos; Mc = macrófagos; Fb = fibroblástos; VS = vasos sanguíneos.

TPTP

EGEG

L

InterstInterstííciocio

CSCS

CPMCPM

A

B

TT

SPTC1

CPM CS

SPGB

SPZ

SPTD

L

CLCL

M-1M-2

Túbulo seminífero

SPGA

CL

Figuras e Tabelas

70

MtMc

Fb

VS

TPMb

Figura 7: Fases da espermatogênese em tilápias nilóticas. Fase espermatogonial: espermatogônia do tipo A indiferenciada (Aind), espermatogônia do tipo A diferenciada (A) e espermatogônias do tipo B (B1-B7); Fase espermatocitária: espermatócitos primários em pré-leptóteno (Pl), leptóteno (L), zigóteno (Z), paquíteno (P), diplóteno (D); espermatócitos em meiose I (M-1), espermatócito secundário (S); espermatócitos em meiose II (M-2); Fase espermiogênica: espermátide inicial (E1), intermediária (E2) e final (E3).

espermatozóide

M-1

E3 E2E1

B3

B1A ind B2

DP

Z

L

Pl

M-2S

Fase espermatocitária

B4

B6B5

B7

A

Fase espermatogonial

Fase espermiogênica

Figuras e Tabelas

71

35°C

25°C20°C

30°CFigura 8 – Corte transversal dos testículos de tilápias nilóticas adultas mostrando a histologia panorâmica dos mesmos em diferentes temperaturas. Podem ser observados a albugínea (A), o parênquima testicular (B), ducto testicular principal (C) e o lúmen dos túbulos seminíferos (setas vermelhas). Barra = 500 μm

BB

B

B

AA

C C

C

C

Figuras e Tabelas

AA

72

Figuras e Tabela

Proporção de células germinativas

0

10

20

30

40

50

60

SPGA SPGB SPTC SPTD Spz

%

20°C 25°C 30°C 35°C

a

a

a

a

a a a

a

b b b

a a a

a a a

a a a

FIGURA 9 – Proporção de diferentes tipos de células germinativas em testículos de tilápias nilóticas adultas mantidas em diversas temperaturas. Espermatogônias do tipo A (SPGA); espermatogônias do tipo B (SPGB); espermatócitos (SPTC); espermátides (SPTD); espermatozóides (Spz). Para cada tipo de célula germinativa, letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05).

FIGURA 10 – Proporção dos diferentes tipos de células germinativas em testículos de tilápias nilóticas adultas mantidas em diversas temperaturas. Espermatogônias do tipo A (SPGA); espermatogônias do tipo B iniciais (SPGB1/2), intermediárias (SPGB3/4/5) e finais (SPGB6/7); espermatócitos primários em pré-leptóteno (Pl), leptóteno/zigóteno (L/Z), paquíteno (P), diplóteno/espermatócitos secundário(D/M); espermátides iniciais (E1), intermediárias (E2) e finais (E3); espermatozóides (Spz). Asteriscos (*) indicam diferença estatística (p<0,05) na proporção de SPGB3/4/5, SPGB6/7 e Pl em tilápias mantidas a 20°C comparado com os peixes mantidos nas demais temperaturas analisadas.

Proporção de células germinativas

0

5

10

15

20

25

30

SPGAB1/B

2

B3/4/5

B7/8 PLL/Z P

D/M E1 E2 E3 Z

%

20°C 25°C 30°C 35°C

**

*

73

A

BFigura 11 – Apoptose de células germinativas (setas) em tilápias nilóticas adultas mantidas a 20°C. Este tipo de morte celular pode acometer células germinativas individuais (A) - detalhe no canto superior direito – e também várias células em um mesmo tipo de cisto (B). Barra=10 μm.

74

Figuras e Tabelas

Figuras e Tabela

Percentual de Apoptose

00,2

0,40,60,8

11,2

1,41,6

20°C 25°C 30°C 35°C

%

a

ab

b b

FIGURA 12 - Percentual de apoptose em testículos de tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05).

Percentual de Lúmen Tubular

0

5

10

15

20

25

20°C 25°C 30°C 35°C

%

b

ab

a a

FIGURA 13 - Percentual de lúmen dos túbulos seminíferos de tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas. Letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05).

75

A

BFIGURA 14 - Diferentes tipos de células de defesa (setas) presentes principalmente nos testículos de tilápias nilóticas adultas mantidas a 20°C. Mastócito (A) presente no interstício e macrófago (B) no epitélio germinativo. Barra = 10μm.

Figuras e Tabelas

76

Figuras e Tabela

Freqüência de cistos espermatogênicos

05

10152025303540

SPGA SPGB SPTC SPTD

%

20°C 25°C 30°C 35°C

aB aB aB aB aB aB aB aB aB aB aB aB

aA

aA aA aA

FIGURA 15 - Freqüência dos cistos que compõem as fases espermatogênicas em tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas. SPGA = cistos de espermatogônias do tipo A; SPGB = cistos de espermatogônias do tipo B; SPTC = cistos espermatocitários; SPTD = cistos espermiogênicos. Para o mesmo tipo celular, letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística (p<0,05) entre as diferentes temperaturas. Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística (p<0,05) entre os diversos tipos de cistos espermatogênicos, independentemente da temperatura.

77

A B

C DFIGURA 16 - Proliferação de diferentes tipos espermatogoniais (setas) em testículos de tilápias nilóticas adultas. Espermatogônias do tipo A (A); espermatogônias do tipo B iniciais (B), intermediárias (C) e finais (D). Barra = 10μm.

Figuras e Tabelas

78

Figuras e Tabela

Índice de proliferação de espermatogônias

010203040

50607080

SPGA-f SPGA-t SPGB1/2 SPGB3/4/5 SPGB6/7

%

20°C 25°C 30°C 35°C

abD bD abD

aD aC aC aC

aB

aC aC aC aC aC

aB aB aB aA aA aA aA

FIGURA 17 - Percentual de cistos espermatogoniais marcados com timidina triciada em tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas. Espermatogônias do tipo A localizadas na extremidade distal dos túbulos seminíferos (SPGA-f) e espermatogônias do tipo A localizadas ao longo dos túbulos seminíferos (SPGA-t), espermatogônias do tipo B iniciais (SPGB1/2), intermediárias (SPGB3/4/5) e finais (SPGB6/7). Para um mesmo tipo celular, letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística (p<0,05) entre as temperaturas avaliadas. Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística (p<0,05) entre os tipos celulares, independentemente da temperatura.

79

A B

C D

E FFIGURA 18 - Proliferação de células somáticas (setas) em testículos de tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas. A-D: Células de Sertoli marcadas com timidina triciada associadas com diferentes cistos de células germinativas nas temperaturas de 20°C (A), 25°C (B), 30°C (C) e 35°C (D). E-F: célula de Leydig (E) e peritubular mióide (F) marcadas com o radioisótopo em tilápias mantidas a 25°C. Barra = 10μm.

Figuras e Tabelas

80

Figuras e Tabela

Índice de proliferação de célula de Sertoli

0

0,5

1

1,5

2

2,5

20°C 25°C 30°C 35°C

%

Índice de proliferação de células de Leydig

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

20°C 25°C 30°C 35°C

%

Índice de proliferação de células mióides

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

20°C 25°C 30°C 35°C

%

a

a a a

b b

ab

a

c c

b

a

C

B

A

FIGURA 19 - Percentual de células de Sertoli (A), de Leydig (B) e peritubulares mióides (C) marcadas com timidina triciada em tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas. Para cada tipo de célula somática, diferentes letras indicam diferença estatística (p<0,05).

81

Figuras e Tabela

Percentual de cistos espermatogênicos associados a células de Sertoli em proliferação

05

1015202530354045

SPGA SPGB SPTC SPTD Isolada

%

20°C 25°C 30°C 35°C

Percentual de cistos espermatogênicos próximos a células de Leydig em proliferação

05

1015202530354045


%

20°C 25°C 30°C 35°C

Percentual de cistos espermatogênicos próximos a células mióides em proliferação

05

1015202530354045


%

20°C 25°C 30°C 35°C

A

B

*

**

C

*

FIGURA 20 – Percentual de cistos de espermatogônias do tipo A (SPGA) e do tipo B (SPGB), espermatócitos (SPTC) e espermátides (SPTD) associados com as células de Sertoli (A) ou próximos a células de Leydig (B) e peritubulares mióides (C) em proliferação. Isolada = célula de Sertoli marcada com timidina aparentemente não associada a cisto espermatogênico ou células de Leydig e peritubular mióide em proliferação próximas a epitélio germinativo descontínuo. Asterisco (*) indica diferença significativa na proporção do cisto espermatogênico próximo à célula somática marcada nas temperaturas avaliadas.

82

Figuras e Tabela

Proliferação de células de Sertoli associadas com SPGA

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

20°C 25°C 30°C 35°C

CS associadas com SPGA não marcadas com timidina CS associadas com SPGA marcadas com timidina

Proliferação de células de Sertoli associadas com SPGB

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

20°C 25°C 30°C 35°C

CS associadas com SPGB não marcadas com timidinaCS associadas com SPGB marcadas com timidina

B

A

FIGURA 21 - Percentual de células de Sertoli (CS) em proliferação associadas com espermatogônias marcadas e não marcadas com timidina triciada. A) CS associadas com espermatogônia do tipo A (SPGA) e; B) CS associadas com espermatogônia do tipo B (SPGB). Não foi observado efeito aparente (p>0,05) da temperatura no percentual de células de Sertoli em proliferação associadas com SPGA e SPGB marcadas pelo radioisótopo.

83

Figuras e Tabela

Apoptose dos diferentes tipos de células germinativas

01

23

456

78

910

20°C 25°C 30°C 35°C

%

SPGA SPGB SPTC SPTD

a a

a

a

a

a a

a

a

ab

b b b b

a a

FIGURA 22 - Índice apoptótico de células germinativas em tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas. SPGA: espermatogônia do tipo A; SPGB: espermatogônias do tipo B; SPTC: espermatócitos; SPTD: espermátides. A) Para uma mesma temperatura, letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05) do índice apoptótico entre os tipos de células germinativas. Não foram detectados efeitos da temperatura (p>0,05) sobre o índice apoptótico dos diferentes tipos de células germinativas (ver Tabela 5).

84

FIGURA 23 - Modelo proposto para a ação da temperatura sobre a espermatogênese de tilápias nilóticas adultas: o balanço entre renovação/diferenciação das células germinativas é voltado para a renovação espermatogonial nas baixas temperaturas (A) e para a rápida diferenciação com conseqüente formação de um grande número de espermatozóides nas altas temperaturas (B), que provavelmente indicam melhores condições para a reprodução dessa espécie. A parada espermatogênica que ocorre nas temperaturas mais baixas é geralmente acompanhada pela maior proliferação de células somáticas testiculares e apoptose de células germinativas, processos esses provavelmente importantes para preparar o testículo para dar continuidade a espermatogênese, quando a temperatura voltar a ser favorável. CG= células germinativas; CS= células de Sertoli; CL= células de Leydig.

A) ↓ T°C

B) ↑ T°C

Diferenciação

Renovação

Proliferação de CS Proliferação de CL

Diferenciação

Renovação

Diferenciação de CL Proliferação de CS

Figuras e Tabelas

85

Apoptose de CG

Figuras e Tabelas

TABELA 1 - Proporção (%) dos diferentes componentes testiculares em tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas (média ± EPM).

20°C 25°C 30°C 35°C

Compartimento tubular 83,6 ± 1,5 a* 83,1 ± 2,9 a 82,4 ± 1,2 a 84,6 ± 1,4 a

SPGA 3,9 ± 0,7 a 4,8 ± 1,8 a 2,9 ± 0,7 a 3,5 ± 0,9 a

SPGB1/B2 1,3 ± 0,2 a 1,1 ± 0,3 a 0,9 ± 0,2 a 0,9 ± 0,2 a

SPGB3/4/5 9,6 ± 1,5 a 5,6 ± 0,7 ab 3,6 ± 0,4 b 4,3 ± 1,4 b

SPGB7/8 9,4 ± 1,0 a 5,4 ± 0,8 b 6,1 ± 0,9 b 4,3 ± 1,0 b

Pl 1,7 ± 0,3 a 0,9 ± 0,2 b 0,7 ± 0,1 b 0,5 ± 0,1 b

L/Z 9,10 ± 1,4 a 8,1 ± 1,1 a 8,8 ± 1,4 a 10,2 ± 3,2 a

P 16,9 ± 1,5 a 18,4 ± 2,6 a 15,8 ± 1,0 a 15,1 ± 2,4 a

D/M 1,8 ± 0,2 a 3,1 ± 0,6 a 2,9 ± 0,4 a 3,6 ± 0,8 a

E1 2,7 ± 0,9 a 4,4 ± 0,6 a 3,3 ± 0,6 a 2,2 ± 0,4 a

E2 9,0 ± 2,9 a 9,7 ± 1,2 a 10,5 ± 1,1 a 7,9 ± 1,6 a

E3 3,8 ± 1,2 a 6,5 ± 1,1 a 5,6 ± 1,1 a 6,4 ± 1,6 a

Spz 1,3 ± 0,4 a 2,5 ± 1,1 a 1,8 ± 0,5 a 1,7 ± 0,6 a

Lúmen 5,1 ± 1,2 a 4,9 ± 1,3 a 13,4 ± 3,1 ab 18,4 ± 4,4 b

CS 3,1 ± 0,3 a 2,9 ± 0,3 a 2,6 ± 0,6 a 2,8 ± 0,8 a

Apoptose 1,2 ± 0,2 a 0,5 ± 0,1 b 0,8 ± 0,2 ab 0,4 ± 0,2 b

Túnica própria 3,7 ± 0,5 a 4,5 ± 0,7 a 3,6 ± 0,3 a 2,7 ± 0,2 a

Compartimento intertubular 16,4 ± 1,7 a 16,9 ± 3,2 a 15,8 ± 1,3 a 17,6 ± 3,2 a

CL 5,5 ± 0,8 a 7,1 ± 2,4 a 6,9 ± 0,9 a 5,6 ± 1,5 a

Células de defesa 1,3 ± 0,7 a 0,1 ± 0,03 a 0,06 ± 0,02 a 0,14 ± 0,1 a

Vasos sangüíneos 0,9 ± 0,2 a 1,1 ± 0,3 a 0,8 ± 0,1 a 0,9 ± 0,1 a

outros 8,6 ± 0,7 a 8,5 ± 1,4 a 8,9 ± 1,0 a 8,4 ± 1,6 a

* Na mesma linha, letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). Espermatogônias do tipo A (SPGA); espermatogônias do tipo B iniciais (SPGB1/2), intermediárias (SPGB3/4/5) e finais (SPGB6/7); espermatócitos primários em pré-leptóteno (Pl), leptóteno/zigóteno (L/Z), paquíteno (P), diplóteno/espermatócitos em meiose (D/M); espermátides iniciais (E1), intermediárias (E2) e finais (E3); espermatozóide (Spz); células de Sertoli (CS); células de Leydig (CL); células de defesa (mastócitos e macrófagos); outros (fibras e células do tecido conjuntivo).

86

TABELA 2 - Freqüência relativa (%) dos diferentes tipos de cistos espermatogênicos em tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas (média ± EPM).

20°C 25°C 30°C 35°C

SPGA 17,2 ± 2,1 a* 19,8 ± 4,4 a 16,1 ± 2,0 a 13,8 ± 1,9 a

SPGB1/2 3,7 ± 0,5 a 3,0 ± 0,2 a 3,9 ± 0,4 a 3,2 ± 0,5 a

SPGB3/4/5 15,8 ± 1,8 a 11,4 ± 0,9 b 10,9 ± 0,8 b 10,3 ± 1,2 b

SPGB6/7 13,2 ± 1,5 a 11,2 ± 1,1 a 11,6 ± 1,1 a 12,0 ± 0,9 a

PL 1,6 ± 0,3 a 1,0 ± 0,1 a 1,2 ± 0,2 a 0,9 ± 0,2 a

L/Z 9,0 ± 0,7 a 9,0 ± 1,05 a 10,8 ± 0,9 a 9,8 ± 0,9 a

P 15,6 ± 1,8 a 15,0 ± 0,8 a 14,9 ± 1,1 a 17,1 ± 1,0 a

D/M 2,5 ± 0,3 a 3,2 ± 0,3 a 3,8 ± 0,5 ab 5,2 ± 0,7 b

E1 4,1 ± 0,7 a 4,4 ± 0,6 a 4,9 ± 0,9 a 4,6 ± 0,9 a

E2 10,9 ± 2,9 a 11,7 ± 1,0 a 12,8 ± 1,6 a 13,4 ± 1,7 a

E3 6,3 ± 1,9 a 10,3 ± 1,4 a 9,2 ± 1,4 a 10,0 ± 1,5 a

* Na mesma linha, letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). Espermatogônias do tipo A (SPGA); espermatogônias do tipo B iniciais (SPGB1/2), intermediárias (SPGB3/4/5) e finais (SPGB6/7); espermatócitos primários em pré-leptóteno (PL), leptóteno/zigóteno (L/Z), paquíteno (P), diplóteno/espermatócitos em meiose (D/M); espermátides iniciais (E1), intermediárias (E2) e finais (E3).

87

20°C 25°C 30°C 35°C

SPGA-f 3,4 ± 0,9 a* 3,0 ±1,0 a 2,4 ± 0,8 a 1,9 ± 0,7 a

SPGA-t 10,6 ± 1,9 a 6,0 ± 1,7 a 6,9 ± 1,4 a 5,7 ± 1,3 a

SPGB1/2 40,7 ± 2,9 a 49,6 ± 3,9 a 48,1 ± 2,0 a 47,4 ± 2,1 a

SPGB3/4/5 58,7 ± 1,9 a 65,4 ± 2,9 ab 67,9 ± 1,5 b 65,4 ± 1,8 ab

SPGB6/7 35,14 ± 2,2 a 37,9 ± 2,9 a 36,1 ±1,6 a 34,3 ± 2,7 a

TABELA 3 - Índice de proliferação (%) de cistos de espermatogônias em tilápias nilóticas adultas mantidas em diferentes temperaturas (média ± EPM).

* Na mesma linha, letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05). Espermatogônias do tipo A localizadas na extremidade distal dos túbulos seminíferos (SPGA-f) e espermatogônias do tipo A localizadas ao longo dos túbulos seminíferos (SPGA-t), espermatogônias do tipo B iniciais (SPGB1/2), intermediárias (SPGB3/4/5) e finais (SPGB6/7).

88

TABELA 4 – Índice de proliferação (%) de células somáticas testiculares em tilápias nilóticas adultas

mantidas em diferentes temperaturas (média ± EPM).

20°C 25°C 30°C 35°C

Célula de Sertoli 2,0 ± 0,2 a* 1,2 ± 0,1 b 0,5 ± 0,1 c 0,3 ± 0,05 c

Célula de Leydig 3,3 ± 1,1 a 1,8 ± 0,6 ab 0,6 ± 0,2 b 0,5 ± 0,06 b

Célula mióide 1,1 ± 0,3 a 1,4 ± 0,3 a 2,8 ± 0,7 a 1,2 ± 0,3 a

* Na mesma linha, letras diferentes indicam diferença estatística (p<0,05).

89

TABELA 5 - Índice apoptótico (%) de células germinativas em tilápias nilóticas adultas

mantidas em diferentes temperaturas (média ± EPM). 20°C 25°C 30°C 35°C

SPGA 1,17 ± 0,47 aA* 1,16 ± 0,31 aA 2,83 ± 0,87 aA 1,16 ± 0,40 aA

SPGB 0,61 ± 0,25 aA 0,50 ± 0,37 aA 0,56 ± 0,13 aB 0,14 ± 0,05 aB

SPTC 1,37 ± 0,59 aA 0,19 ± 0,08 aA 0,39 ± 0,20 aB 0,08 ± 0,03 aB

SPTD 5,89 ± 3,13 aA 0,97 ± 0,32 aA 1,46 ± 0,55 aAB 1,44 ± 0,3 aA

* Para cada linha, letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística (p<0,05) do índice apoptótico das células germinativas entre as temperaturas avaliadas. Para cada coluna, letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa (p<0,05) do índice apoptótico entre os tipos de células germinativas. SPGA: espermatogônias do tipo A; SPGB: espermatogônias do tipo B; SPTC: espermatócitos; SPTD: espermátides.

90

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências bibliográficas

93

8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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efeitos de diferentes temperaturas sobre as cÉlulas

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