默克Array Bridge蛋白质三维构象分析单克隆抗体高级结构研究

默克生命科学业务在美国和加拿大地区以MilliporeSigma品牌运营

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让您更懂

蛋白质高级结构 助力单克隆抗体生物仿制药开发 单克隆抗体(mAbs)是一类用于人类疾病治疗的药物，在目前生物制剂领域增长非常快速，根据目前的批准上市的商品化药物数量以及销售数字，可以预计到2020年全球销售额将达到1,250亿美元。随着进入市场的治疗性单克隆抗体的数量不断增加，生物仿制药的数量也会相应快速增加1。

美国食品和药物管理局(FDA)对生物仿制药的定义是指高度相似的生物制品，但是与FDA批准的现有原研药物没有临床意义的区别。

由于三维(3D)结构是这些分子生物功能的关键因素，并且具有高度的复杂性，因此单克隆抗体生物仿制药的生产极具有挑战性。单克隆抗体仿制药与它所基于的原研药物之间即使存在微小的结构差异，也会对分子的安全性、有效性和功能产生重大影响。

单克隆抗体的三维结构除了受到翻译后修饰的影响外，还受到一级、二级、三级和四级结构的共同作用。这种构象被称为高级结构(HOS)，这种构像不仅受潜在基因的影响，还会因为包括生产生物仿制药时的细胞系选择，以及温度、pH、光照等生物工艺条件以及配方方法等因素的影响。

由于仿制药开发过程中需要考虑的变量太多，通常情况下，生物仿制药物单抗与它所仿制的原研产品并不能保证完全相同。为了避免这些差异可能导致的众多问题，2015年FDA发布了指南建议，应该进行广泛、可靠的比较物理化学和功能研究，以评估生物仿制药物产品与原研药物产品的生物相似性2。

目前有很多可以分析蛋白高阶结构的理化方法，虽然这些检测方法都可以提供关于单克隆抗体（mAb）三维构象的有帮助的信息，但没有一种方法同时能满足高灵敏度和高性价比，例如：• 圆二色光谱

• 体积排阻色谱(SEC)

• 分析超速离心法 (AUC)

• 非变性电泳• 氢/氘交换质谱法(HDX/MS)

• 核磁共振波谱法以上这些方法自身均存在一些局限性，为了满足FDA日益增高的要求，越来越需要一种能够替代的现有的，并且具有更高通量的方法来分析单克隆抗体仿制药相对于原研药物的高级结构差别。默克生命科学现在为研究人员提供了一个全新的更加便利的解决方案，这个方法是源于美国Array Bridge公司，Array Bridge公司位于美国圣路易斯，在分子生物相似性检测方面具备丰富经验。

Antibodies to Light Chain

(Ab1-Ab6, Ab13-Ab17)

Antibodies to Heavy Chain Fab(Ab7-Ab12, Ab18-Ab22)

Antibodies to Heavy Chain Fab(Ab7-Ab12, Ab18-Ab22)

Antibodies to Heavy Chain CH2 and CH3

(Ab23-Ab34)

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蛋白质三维构象阵列技术2013年在《药理学前沿》（Frontiers in Pharmacology）杂志上，Array Bridge公司的Wang Xing等人发表了文献，其中描述了研制用于检测单克隆抗体复杂的高级结构的抗体阵列技术3。称为PCA（Protein Conformational Array technology）技术，通过对重叠区域的肽免疫原产生多克隆抗体(polyclonal,pAbs)，覆盖整个mAb结构，通过作者的研究结果证明，不同的市售单克隆抗体虽然具有几乎相同的氨基酸序列，但却具有不同的高级结构特征。

根据高级结构特征显示当抗体结构发生化学修饰或物理变化时，可使用多克隆抗体组合可检测到的不同单抗类型中明显的差异。每个pAb都识别线性结构或二级结构表位，当mAb以其正确折叠的本机形式出现时，这些表位可能无法部分或完全暴露。由于这些表位在mAb表面展开或折叠错误的变化，导致信号的变化。

抗体矩阵技术可以提供这些原研单抗的基本信息，用于分析比较这些产品的生物相似性，并检查可能导致新单抗临床相关效应的构象变化。

PCA技术使用与操作非常简便。基于易于操作的ELISA技术进行检测，该检测方法提供了快速、准确和灵敏的mAb高级结构检测，适用于mAb开发的所有阶段。

抗体阵列中分布着34种抗体。PCA技术通过pAb 阵列覆盖了整个mAb的氨基酸序列。

PCA Drug Compound Cat. No.

AvaBridge Avastin Bevacizumab ABK0001

CampBridge Campath Alemtuzumab ABK0003

EpoBridge Erythropoietin Hematopoietin ABK0010

HercBridge Herceptin Trastuzumab ABK0007

HumiBridge Huimera Adalimumab ABK0005

RemiBridge Remicade ABK0009

RituBridge Rituxan Rituximab ABK0004

SynaBridge Synagis Palivizumab ABK0006

LuceBridge Lucentis Ranibizumab ABK0014

FilBridge Neupogen Filgrastim ABK0012

EnbrBridge Enbrel Etanercept ABK0011

DenoBridge Prolia Denosumab ABK0013

ErbiBridge Erbitux Cetuximab ABK0002

InnoBridge Novel Novel Mab ABK0008

GoliBridge Simponi Golimumab ABK0015

UsteBridge Stelara Ustekinumab ABK0016

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默克PCA ELISA试剂盒

InnoBridge

PCA (Protein Conformational Array) ELISAs是针对多种已经上市的治疗型单克隆抗体开发的试剂盒产品。我们也同时提供通用型单抗蛋白高级结构检测试剂盒，可以检测更多种类的单克隆抗体高级结构。比较候选生物仿制药单抗与原研药物的高级结构，目前默克可以提供包括InnoBridge PCA ELISA产品，以及下方表格中用于部分已经上市的热门单抗药物高级结构检测的试剂盒。在这些单抗药物中，韩国仿制药公司Celltrion，已经于2016年使用RemiBridge试剂盒向FDA提交英夫利昔单抗类似药物CT-P134申请，并且成功获批。

大多数获得许可用于治疗的单克隆抗体属于IgG1亚型，它具有与免疫系统体液和细胞成分相互作用的能力。许多这些产品的序列比对表明，它们共享几个相对保守的序列区域，即使在抗体的可变区域内，依据这个特点我们准备了一个称为InnoBridge的通用试剂盒。

InnoBridge PCA ELISA试剂盒含有多个pAbs，覆盖IgG1不同保守序列区域。这使得研究人员能够快速、简便地检测一种新的单克隆抗体的保守序列。InnoBridge的另一个用途是作为一种质量控制的工具，确保在mAb的生产过程中，蛋白高级结构（HOS）不变。在生产过程的每个阶段，研究人员都可以采用InnoBridge作为质量控制措施，以评估蛋白高级结构(HOS)的变化。

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利用PCA ELISAs分析过程开发中的蛋白高级结构（HOS）

利用PCA ELISAs分析单抗高级结构(HOS)数据，增加申报数据价值

4.0 BackgroundControlOxidation55CpH3pH9.5

3.53.02.5

OD 2.0

1.51.00.5

pAb1

pAb2

pAb3

pAb4

pAb5

pAb6

pAb7

pAb8

pAb9

pAb1

0

pAb1

1

pAb1

20

Ab1

Ab2

Ab3

Ab4

Ab5

Ab6

Ab7

Ab8

Ab9

Ab10

Ab11

Ab12

Ab13

Ab14

Ab15

Ab16

Ab17

Ab18

Ab19

Ab20

Ab21

Ab22

Ab23

Ab24

Ab25

Ab26

Ab27

Ab28

Ab29

Ab30

1.2

1.0

OD

Region

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Comparison of three lots of innovator molecule and a candidate BioSimilar

Reference Lot 1

Reference Lot 2

Reference Lot 3

Candidate BioSimilar

在建立单克隆抗体制造工艺时，需要对各种条件进行仔细的优化。由工程细胞系、培养基和添加剂选择以及工艺开发引起的变化可能导致治疗用单抗的高级结构（HOS ）发生变化。以下数据是我们使用RituBridge PCA ELISA试剂盒检测的数据，显示了各种极端条件：氧化、高温和高pH -对单克隆抗体Rituxan（利妥昔单抗）高级结构的影响，Rituxan（利妥昔单抗）单克隆抗体用于治疗各种形式的CD20阳性非霍奇金淋巴瘤。虽然这三种条件下都会导致单抗分子结构展开，但每种情况下展开的模式都有显著差异，在每种测试条件下都会产生不同的高级结构（HOS）变化，这个也是每个单抗独特的“指纹”。

使用RituBridge PCA ELISA 1(3)测定氧化、温度和pH值变化对Rituxan的影响，。当之前被折叠的表位暴露时，会检测出光密度的峰值，这表明高级结构（HOS）发生了变化。

PCA ELISAs除了评价外部理化条件对单抗的影响外，还可用于比较多批次的生物仿制药与原研单抗药物的生物相似性。下面的数据清楚地说明了候选生物仿制药物与参照的原研药物之间的极好的相似性，仅有Ab9区域存在可能的偏差。

值得注意的是，尽管生物仿制药可能表现出与原研药物不同的高级结构（HOS)的信号指示，但这些变化也可能并不总是与临床相关。PCA ELISA检测的数据为支持研发人员向FDA提交的证据提供了重要的价值。

通过与5个不同批次的原研药物与生物仿制药物的比较，说明了4个区域(5、9、17和30)可能存在性能偏差。

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基于于Luminex液相芯片的高通量InnoPlex PCA用于创新单抗药物开发

96孔板

微球编号 21

10种独特的红色染料浓度

微球编号 26

6.5 微米

磁性微球由染料混合物染色多因子检测：多个分析物，同时检测

pAB-1

pAB-13

pAb-22

pAB-34

捕捉抗体

报告荧光 (Strep/PE)

待测物

夹心法免疫检测

10种独

特的

红外

染料

浓度

xMAP® 技术来源于Luminex®公司

InnoPlex是一种基于CHO细胞株IgG1保守结构的新型用于单克隆抗体高级结构检测的PCA技术。我们通过结合Luminex多因子检测技术，开发一种被称为InnoPlex的多重检测的方法，我们将该方法的基础上通量可以提高到每板可以检测约45种化合物。

InnoPlex将Luminex公司的xMAP技术与InnoBridge ELISA技术结合起来，可以同时检测多种分析物，使用不同颜色编码的专用微球和不同的染料组合。通过将pAbs固定在这些珠子的表面，现在可以在96孔板的一个孔中同时筛选34个目标表位。

8

例数据：可进行多重因子检测的Ritubridge &InnoBridge成为RituPlex和InnoPlex，高通量PCAs。

1. Ecker, D. M., Jones, S. D., & Levine, H. L. (2014). The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs, 7(1), 9-14. doi:10.4161/19420862.2015.989042

2. Center for Drug Evaluation and Research. (2015, April 28). Quality Considerations in Demonstrating Biosimilarity of a Therapeutic Protein Product to a Reference Product. Retrieved from https://www.fda.gov/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm290967.htm

3. Wang, X., Li, Q., & Davies, M. (2013). Development of antibody arrays for monoclonal antibody Higher Order Structure analysis. Frontiers in Pharmacology, 4. doi:10.3389/fphar.2013.00103

4.

Retrieved from https://www.fda.gov/downloads/advisorycommittees/committeesmeetingmaterials/drugs/arthritisadvisorycommittee/ucm484860.pdf

5. Song, Y., Yu, D., Mayani, M., Mussa, N., & Li, Z. J. (2018). Monoclonal antibody higher order structure analysis by high throughput protein conformational array. MAbs, 10(3), 397-405. doi:10.1080/19420862.2017.1421880

RituBridge ELISA 1-34抗体与xMAP技术(RituPlex)多因子技术结合的性能，对照已知的低pH处理的生物相似治疗单抗。

利用Luminex xMAP®技术，利用INNOPLEX多重PCA分析技术，检测了一种新的治疗单抗(未知生物相似物)在pH诱导应力下的变化。

10000

9000

8000

7000

6000

5000

4000

MFI

MFI

3000

2000

1000

Ab1

Ab2

Ab3

Ab4

Ab5

Ab6

Ab7

Ab8

Ab9

Ab10

Ab11

Ab12

Ab13

Ab14

Ab15

Ab16

Ab17

Ab18

Ab19

Ab20

Ab21

Ab22

Ab23

Ab24

Ab25

Ab26

Ab27

Ab28

Ab29

Ab30

Ab31

Ab32

Ab33

Ab34

0

候选生物类似药物在酸性和碱性条件下诱导应力

Control vs. pH3

BiosimilarpH3pH9.5

25000

20000

15000

10000

5000

pAb1

pAb2

pAb3

pAb4

pAb5

pAb6

pAb7

pAb8

pAb9

pAb1

3

pAb1

4

pAb1

5

pAb1

6

pAb1

7

pAb1

8

pAb1

9

pAb2

0

pAb2

1

pAb1

0

pAb1

1a+b

pAb1

2

pAb2

3

pAb2

4

pAb2

5

pAb2

6

pAb2

7

pAb2

8

pAb2

9

pAb3

0

pAb3

1

pAb3

2

pAb3

3

pAb3

4

pAb2

20

ControlpH3

10000

9000

8000

7000

6000

5000

4000

MFI

MFI

3000

2000

1000

Ab1

Ab2

Ab3

Ab4

Ab5

Ab6

Ab7

Ab8

Ab9

Ab10

Ab11

Ab12

Ab13

Ab14

Ab15

Ab16

Ab17

Ab18

Ab19

Ab20

Ab21

Ab22

Ab23

Ab24

Ab25

Ab26

Ab27

Ab28

Ab29

Ab30

Ab31

Ab32

Ab33

Ab34

0

Biosimilar candidate stressed under acidic and basic conditions

Control vs. pH3

BiosimilarpH3pH9.5

25000

20000

15000

10000

5000

pAb1

pAb2

pAb3

pAb4

pAb5

pAb6

pAb7

pAb8

pAb9

pAb1

3

pAb1

4

pAb1

5

pAb1

6

pAb1

7

pAb1

8

pAb1

9

pAb2

0

pAb2

1

pAb1

0

pAb1

1a+b

pAb1

2

pAb2

3

pAb2

4

pAb2

5

pAb2

6

pAb2

7

pAb2

8

pAb2

9

pAb3

0

pAb3

1

pAb3

2

pAb3

3

pAb3

4

pAb2

20

ControlpH3

治疗性单克隆抗体具有免疫原性的可能性是一个此前已得到充分证明的问题，在2018年发表的一篇文章中阐明了这一问题的重要性。在他们的研究中，作者证明了InnoPlex方法在开发治疗性抗体时适用于HOS分析，生成的PCA数据与传统方法(如体积排阻色谱法)的蛋白质稳定性结果相关相关性很好5。

本研究的作者还发现了单克隆抗体之间的各种结构差异，其中一个重要的观察是，加工条件导致抗体聚集，从而导致抗体表位的暴露显著增加。他们指出，这是可能导致一种引起免疫原性的“外来”分子。

产品参考文献

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Cat. No. 40-006 (with full Gen 5 Software)

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上海上海市浦东新区东育路227弄3号前滩世贸中心（二期）C栋15-18层电话：(021)20338288传真：(021)50803042邮编：200126

北京北京市朝阳区将台路甲2号诺金中心25层电话：(010)59072688

邮编：100016传真：(010)59072699

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邮编：

电话：传真：

510623

(020)32255366 (021)32255380

成都成都市锦江区人民南路二段1号仁恒置地广场1706室电话：(028)80740222 传真：(028)80740227邮编：610016

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