dspace cover page - eth z › mapping › eserv › ... · 2020-03-26 · -i-inhaltsverzeichnis a...

Research Collection

Doctoral Thesis

Untersuchungen über Oligonucleotide mit 2-Deoxy-D-ribose, 2,3-Dideoxy-D-glucopyranose und D-Allopyranose alsZuckerbausteine

Author(s): Giger, Alfred

Publication Date: 1992

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000694127

Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted

This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For moreinformation please consult the Terms of use.

ETH Library

https://doi.org/10.3929/ethz-a-000694127

http://rightsstatements.org/page/InC-NC/1.0/

https://www.research-collection.ethz.ch

https://www.research-collection.ethz.ch/terms-of-use

Diss. ETH Nr. 9975

UNTERSUCHUNGEN ÜBER OLIGONUCLEOTIDE MIT

2-DEOXY-D-RIBOSE, 2,3-DIDEOXY-D-GLUCOPYRANOSE UND

D-ALLOPYRANOSE ALS ZUCKERBAUSTEINE

ABHANDLUNG

zur Erlangung des Titels

DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN

der

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE

ZÜRICH

vorgelegt von

ALFRED GIGER

dipl. Chem. ETH

geboren am 17. September 1964

von Entlebuch LU

Angenommen auf Antrag von

Prof. Dr. A. Eschenmoser, Referent

Dr. Ch. Leumann, Korreferent

Zürich 1992

Für Andrea,meinen Vater

und in Erinnerung an

meine Mutter

Ich danke meinem verehrten Lehrer

Herrn Prof. Dr. A. Eschenmoser

unter dessen Leitung ich diese Arbeit ausführen durfte, für sein Interesse an

deren Entstehen, für die anregenden Diskussionen, sowie für die von Ihm

grosszügig gewährte wissenschaftliche Freiheit, dank der auch das eine oder

andere zuweilen überraschende Resultat zustande gekommen war.

Ich danke allen Mitgliedern der Gruppe für die angenehme Atmosphäre,die während meiner Doktorandenzeit geherrscht hat und für den fleissigen

Besuch unseres Weihnachtsfestes im E 33.

Ich will auf keinen Fall versäumen, die Grillparties auf der Terrasse zu

erwähnen, die vom harten Kern der Gruppe (Reto Fischer, Andreas Helg,Peter Lohse und Markus Tarköy) mit bemerkenswerter Häufigkeit veran¬

staltet wurden.

Ich erinnere mich mit grosser Dankbarkeit an den viel zu früh

verstorbenen Dr. J. Schreiber, der mir mit vielen Tips und Hilfen im

Umgang mit der HPL-Chromatographie zur Seite stand. Eine bessere

Kombination von Berater und Techniker konnte man sich nicht vorstellen.

Frau Dr. Dorothea Felix danke ich herzlich dafür, dass Sie für alle

grösseren und kleineren Sorgen immer ein offenes Ohr hatte.

Ich danke allen Leuten, mit denen ich in 'meinem' Labor - dem E 33 -

arbeiten konnte, für das Ertragen meines Ordnungswahns und weiterer

meiner angenehmen und unangenehmen Eigenschaften. Diese tapferenLeute sollten nicht ungenannt bleiben, es waren: Dr. Christian Leumann,

Dr. Robert P. Hammer (Ihm danke ich auch für das Ueberlassen einiger

Resultate.), Dr. Nicolas W. Hird (Seine berühmt-berüchtigten FOAD-Parties

werden unvergesslich bleiben.), Katrin Groebke und Elke Karaus.

Zuhause mussten nicht nur Andrea, sondern auch unsere Freunde Ursula

und Markus meine Launen während der Zeit der Dissertation aushalten.

Ursula danke ich speziell für die Hilfe bei der Uebersetzung des Summarys.Ganz spezieller Dank gebührt Dr. Christian Leumann, der mich in das

grosse, weite Feld der DNA-Chemie führte und mich durch manches

undurchdringlich erscheinende Dickicht leitete. Er war es auch, der unsere

monatliche Zusammenkunft zum Literaturaustausch initiierte. Ich möchte

ihm an dieser Stelle noch für das Ueberlasen einiger seiner Resultate

danken. Ich danke ihm besonders für die grosse Hilfsbereitschaft bei der

Korrektur der Dissertation und für die Uebernahme des Korreferates.

Diese Arbeit wurde vom Stipendienfonds der Basler Chemischen

Industrie und vom Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der

wissenschaftlichen Forschung unterstützt.

-I-

Inhaltsverzeichnis

A Zusammenfassung VII

B Summary X

C Allgemeiner Teil 1

C.l Einleitung und Problemstellung 1

C.2 Synthese der Nucleosidbausteine 10

C.2.1 ß-Homo-deoxyuridin 10

C.2.2 Synthese der a-Nucleosidbausteine 15

C.2.2.1 a-Homo-deoxyadenosin 15

C.2.2.2 a-Homo-thymidin 17

C.2.3 ß-Homo-deoxy-7-carbaadenosin 18

C.2.4 ß-D-Allpyranosyl-isoguanin 27

C.3 Herstellung der Oligonucleotide 33

C.4 Das Paarungsverhalten der Homo-DNA 41

C.4.1 Einführung in die Methodik der DNA Untersuchung 41

C.4.2 Die AT-Paarung 50

C.4.2.1 Einleitende Bemerkungen 50

C.4.2.2 Alternierende AT-Sequenzen von Homo-DNA 51

C.4.3 Die AU-Paarung 55

C.4.4 Zum Problem der AC-Paarung 61

C.4.4.1 Alternierende AC/CA-Sequenzen von Homo-DNA 61

C.4.4.2 Nicht alternierende AC-Sequenzen von Homo-DNA 71

a) Blockweise AC-Sequenzen von Homo-DNA 71

b) ein weiterer Hinweis für die Antiparallelität der 73

AA-Paarung

C.4.5 Gemischtbasige Oligonucleotide 77

C.4.5.1 Schmelzverhalten der einzelnen Oligonucleotide 77

a) DNA-Oligonucleotide 78

-n-

b) Homo-DNA-Oligonucleotide 78

C.4.5.2 Zur Frage der Strangorientierung 84

C.4.5.3 Kreuzungsexperimente von Homo-DNA mit DNA - ein 89

weiterer Beweis für die Autonomie der Homo-DNA

C.4.6 ct-Homo-DNA-Oligonucleotide 93

C.4.7 Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltende Oligonucleo- 96

tide

C.4.7.1 Einführung 96

C.4.7.2 Homo-deoxy-7-carbaadenosin und die Aufklärung der 97

AA-Paarung

C.4.7.3 Beitrag von Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthalten- 101

den Oligonucleotiden zur AC-Paarung

C.4.7.4 Einige neue Informationen zur AT-Paarung 102

C.4.7.5 Der Purin-Purin-Purin Triplex 104

C.5 Herstellung und Eigenschaften von Oligonucleotiden 110

der Allopyranosyl - Reihe mit ß-D-AUopyranosyl-isoguanin

C.5.1 Einleitung 110

C.5.2 Hexamer- und Octameroligonucleotide von ß-D-Allopy- 115

ranosyl-isoguanin

C.5.3 Allo(Gg) und allodg) 118

C.5.4 Allo(G4l4) und allo(GI)4 134

C.5.5 Untersuchungen zur Frage der Strangorientierung von 142

Allopyranosyl-NA (parallel / antiparallel)C.5.6 Zusammenfassung der Eigenschaften von Allopyra- 146

nosyl-NA Oligonucleotiden, die Isoguanin enthalten

C.5.6.1 Gedanken zur Basenpaarung im G2I und im I2G Triplex 146

C.5.6.2 Zusammenfassung der UV-Schmelzkurven und 148

CD-Spektren

C.5.7 Ein Vergleich der GI-Basenpaarung von Homo-DNA vs. 150

Allopyranosyl-NA

D Experimenteller Teil 154

D.l Allgemeine Bemerkungen 154

-m-

D.2 Abkürzungen 164

D.3 Lösungsmittel und Reagenzien 166

D.4 ß-Homo-deoxyuridin 170

D.4.1 l-(4',6'-Di-0-acetyl-^3'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)- 170

uracil

D.4.2 H2',3'-Dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)uracil 173

D.4.3 l-{2',3'-Dideoxy-6'-0-[(4/4'-dimethoxytriphenyl)methyl]- 174

ß-D-glucopyranosyl}uracil

D.4.4 l-{4'-CH(2-Cyanoethoxy)(N,N-diisopropylarnino)phos- 176

phino]-2',3'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)me-

thyl]-ß-D-glucopyranosyl}uracil

D.4.5 l-(2'^'-Dideoxy-6'-(4,4,-dimethoxy)-triphenylmethyl- 179

4'-0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)-propionyl]-ß-D-

glucopyranosyD-uracil (Aktivester von ddU)

D.4.6 l-(2',3'-Dideoxy-6'-(4,4'-dimethoxy)-triphenylmethyl- 181

4'-0-[3-(CPG-amido)-propionyl]-ß-D-glucopyranosyl)-

uracil (ddU-CPG-Träger)

D.5 a-Homo-deoxyadenosin 182

D.5.1 N6-Benzoyl-9-(2'^'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl)adenin 182

D.5.2 N6-Benzoyl-9-{2',3'-dideoxy-6'-0-](4,4'-dimethoxytriphe- 184

nyl)methyl]-a-D-glucopyranosyl}adenin

D.5.3 N6-Benzoyl-9-(4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N4Sf-diisopropyl- 186

amino)phosphino]-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)me-

thyl]-2',3'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl}adenin

-IV-

D.5.4 N«-Benzoyl-9-{2'^'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphe- 189

nyl)methyl]-4'-0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)propionyl]

-ct-D-glucopyranosyl}adenin und N6-Benzoyl-9-{2',3'-di-

deoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)methyl]-4,-0-[3-(CPG-

amido)propyl]-a-D-glucopyranosyl}-adenin

D.6 a-Homo-thymidin 190

D.6.1 l-(4',6'-Di-0-acetyl-2',3'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl)- 190

thymin

D.6.2 l-(2',3'-Dideoxy-a-D-glucopyranosyl)thymm 191

D.6.3 l-{2'^'-Dideoxy-6'-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)methyl]- 192

a-D-glucopyranosy1) thymin

D.6.4 l-{4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropylamino)phos- 194

phino]-6'-0-[(4,4'-dirnethoxytriphenyl)methyl]-2',3'-di-

deoxy-a-D-glucopyranosyl)thymin

D.6.5 l-{2',3'-Dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphenyl)methyl]- 197

4'-0-[3-(4-nirro-phenoxycarbonyl)-propionyl]-a-D-gluco-

pyranosyljthymin und l-{2',3'-Dideoxy-6'-0-[(4,4'-dime-

thoxytriphenyl)methyl]-4'-0-[3-(CPG-amido)-propyl]-a-D-

glucopyranosyljthymin

D.7 6-Chlor-7-carbapurin 198

D.7.1 2-Cyano-4,4-diethoxy-ethylbutanoat 198

D.7.2 4-Amino-5-(2',2'-diethoxy)ethyl-6-hydroxy-2-mercapto- 199

pyrimidin

D.7.3 4-Amino-5-(2',2'-diethoxy-ethyl)-6-hydroxypyrimidin 200

D.7.4 7-Carbahypoxanthin 201

D.7.5 6-Chlor-7-carbapurin 201

D.8 ß-Homo-deoxy-7-carbaadenosin 202

-V-

D.8.1 4,6-Di-0-benzoyl-2,3-dideoxy-D-glucose 202

D.8.2 6-Chlor-7-carba-9-(4',6'-di-0-benzoyl-2'^,-dideoxy-ß-D- 204

glucopyranosyl)purin

D.8.3 6-Amino-7-carba-9-(2',3'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)- 206

purin

D.8.4 6-(Benzamido)-7-carba-9-(2',3'-dideoxy-ß-D-glucopyrano- 208

syl)purin

D.8.5 6-(Benzamido)-7-carba-9-{2',3'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dime- 210

thoxytriphenyl)methyl]-ß-D-glucopyranosyl}purin

D.8.6 6-(Benzamido)-9-(4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopro- 212

pylamino)phosphino]-2',3'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxy-

triphenyl)methyl]-ß-D-glucopyranosyl}-7-carbapurin

D.9 ß-D-Allopyranosyl-isoguanin 215

D.9.1 2,6-Dichlor-9-(2',3',4',6'-tetra-0-acetyl-ß-D-allopyranosyl)- 215

purin

D.9.2 6-Amino-2-chlor-9-(ß-D-allopyranosyl)purin 217

D.9.3 2-Allyloxy-6-(N,N-dibenzoyl-amino)-9-(2',3',4',6'-tetra- 219

O-benzoyl-ß-D-allopyranosyDpurin

D.9.4 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-(ß-D-allopyranosyl)purin 221

D.9.5 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{(4',6'-0-tetraisopropyldisi- 223

loxan-1,3-diyl)-ß-D-allopyranosyl)purin

D.9.6 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{2',3'-0-isopropyliden-(4',6'- 225

0-tetra-isopropyldisiloxan-l,3-diyl)-ß-D-allopyranosyl]purin

D.9.7 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{2',3'-0-isopropyliden-ß-D- 227

allopyranosyljpurin

D.9.8 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphe- 229

nyl)methyl]-2',3'-0-isopropyliden-ß-D-allopyranosyl}purin

D.9.9 2-Allyloxy-6-(benzairddo)-9-(4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N- 231

diisopropylamino)phosphino]-6'-0-[(4,4'-dimethoxytri-

phenyl)methyl]-2',3'-0-isopropyliden-ß-D-allopyrano-

syljpurin

-VI-

D.9.10 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphe- 234

nyl)methyl]-2',3'-0-isopropyliden-4'-0-[5-(4-nitropheno-

xycarbonyl)pentyl]-ß-D-allopyranosyl}purinD.9.11 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6'-0-[(4,4'-dimethoxytriphe- 236

nyl)methyl]-2',3'-0-isopropyliden-4'-0-[5-(CPG-amido)-

pentyl]-ß-D-allopyranosyl}purin

D.9.12 9-(ß-D-Allopyranosyl)isoguanin 237

D.10 HPLC Reinigung der Oligonucleotide (Tabelle) 239

D.ll Tm-Werte, termodynamische Daten und CD-Daten der 247

Oligonucleotide (Tabelle)

D.12 Bemerkungen zur Nomenklatur 253

E Literaturverzeichnis 254

-vn-

A Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Synthese, Charakterisierung und

besonders der Aufklärung der AU-, AT- und die für die Homo-DNA eigene

AC-Paarung und dem Vergleich mit den analogen Sequenzen in der

natürlichen DNA.

Des weiteren wurden Oligonucleotide in der Reihe der Homo-DNA von

Adenin- und Thymin-haltigen Sequenzen mit a-Konfiguration am

anomeren Zentrum hergestellt und deren Eigenschaften untersucht.

Darauf wurde ein neues Nucleosid, Homo-deoxy-7-carbaadenosin, zur

strukturellen Aufklärung der AA-, AT- und AC-Paarungen, sowie, in

Zusammenarbeit mit K. Zimmermann [81], zur erstmaligen Darstellungeines Purin-Purin-Purin Homo-DNA Triplexes eingeführt. Die Synthesedieses Nucleosids erfolgte in Analogie zu derjenigen in der

Deoxyribofuranosylreihe, die in der Literatur von Seela [39] beschrieben ist.

Die Oligonucleotidsynthese aller Sequenzen erfolgte nach der von

Caruthers [31] und Letsinger [32] eingeführten Phosphoramiditmethode.Die Palette der bisher durch Arbeiten von Böhringer [18], Roth [21] und

Hunziker [22] bekannten Paarungseigenschaften von Homo-DNA konnten

durch die Resultate in dieser Arbeit wie folgt erweitert werden:

- Eine AU-Paarung in Homo-DNA ist deutlich schwächer als eine AT-

Paarung. Die grössere Stabilität der AT-Paarung beruht auf dem

betragsmässig grösseren Enthalpieterm des Paarungsprozesses.- Die AU-, wie auch die AT-Paarung in Homo-DNA Oligonucleotiden sind

stärker als die entsprechenden Paarungen der natürlichen DNA. Die

vergleichsweise grössere Stabilität ist entropisch bedingt.- In der Homo-DNA Reihe existiert eine AC-Paarung. Diese Paarung ist

deutlich schwächer als die entsprechende AT- und AU-Paarung.

Diese schwächere Paarung ist auf einen weniger negativen

Enthalpieterm des Paarungsprozesses zurückzuführen.

- Die AC-Paarung in Homo-DNA kann durch Protonierung des Homo-

deoxycytidins nicht beeinflusst werden.

- Blockweise AC Sequenzen der Homo-DNA Serie (dd(AsCs) und dd(A4C4»

gehen keine AC-, sondern eine AA-Paarung ein.

- Es konnte gezeigt werden, dass die AA-gepaarten Stränge in Homo-DNA

antiparallel orientiert sind.

-Vffl-

a-Homo-deoxy-adenosin- und a-Homo-thymidin-Oligonucleotide paaren

weder mit sich selbst, noch gehen sie eine ocA-aT-Paarung, noch eine

aA-ßT-Paarung ein. Diese Experimente wurden von R.P. Hammer

[82] ausgeführt.

Oligonucleotidstränge von Homo-DNA, die Watson-Crick-artig paaren,

sind antiparallel orientiert. Dieses Resultat wurde in

Zusammenarbeit mit C. Leumann [20] erhalten.

• Homo-DNA paart nicht mit einem entsprechenden parallelen oder

antiparallelen DNA-Komplementärstrang. Dieses Resultat wurde in

Zusammenarbeit mit C. Leumann [20] erhalten.

Oligonucleotide, die Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthalten, paaren nicht

mit sich selbst. Das bedeutet, dass eine AA-Paarung nicht Watson-

Crick-artig gepaart sein kann. Zusammen mit den Informationen

von BOhringer [18] ergibt sich als einzige verbleibende Möglichkeitfür die AA-Paarung in Homo-DNA eine reverse Hoogsteen-artige

Basenpaarung.

}~\i

n\ Y H

Homo-DNA bildet Purin-Purin-Purin Triplexe wie im Fall von dd(G6) •

dd(l6> • dd(7CHA5-A) gezeigt wurde. Der Schmelzprozess diese

Triplexes erfolgt stufenweise (Arbeiten z.T. von K. Zimmermann [81]

durchgeführt).Eine AC-Basenpaarung in Homo-DNA ist reverse Hoogsteen-artig

verknüpft. Dies folgt aus dem Schmelzexperiment mit Homo-deoxy-

7-carbaadenosin/Homo-deoxycytidin. Unter der Voraussetzung, dass

die Oligonucleotidstränge parallel orientiert sind und die Basen anti

zum Zuckergerüst stehen, muss eine AC-Paarung ebenfalls aus

antiparallel orientierten Oligonucleotidsträngen aufgebaut sein.

-IX-

Die Synthese des Allopyranosyl-isoguanin wurde in Anlehnung an die

Synthese von Homo-deoxy-isoguanosin von Fräser [47] durchgeführt. Die

Schutzgruppenstrategie für Allose wurde von Fischer [50] und Helg [51]

entworfen.

In der Reihe der Allopyranosyl-NA konnten anhand von

Oligonucleotiden, die die Basen Guanin und Isoguanin enthalten die

folgenden neuen Basenpaarungsmuster aufgefunden werden:

- Allo(Ig) zeigte einen deutlich höheren Schmelzpunkt als alle bisher

bekannten Allopyranosyl-NA Oligonucleotide.- AlIoCGsJ/allods) bilden in wässriger Lösung zwei koexistierende Triplexe,

einen (allo(Gg)}2' allo(Ig) mit einer Schmelztemperatur von etwa

81°C und einem {allo(Ig)}2 allo(G8) Triplex mit einer

Schmelztemperatur um 37°C. Bei den Schmelzprozessen scheint es

sich um Triplex-zu-Einzelstrang Uebergänge zu handeln. Im Fall des

G2I Triplex weist die Hybridisierungskurve gegenüber der

Schmelzkurve eine grosse Hysterese von 40°C auf. Dies impliziert

möglicherweise die vorgängige Bildung eines (thermodynamisch

instabileren) Gl-gepaarten Duplexes (Abb. C5.36), der als Rezeptor für

allo(Gg) oder allo(I8) dient.

- Allo(G4l4) scheint ebenfalls ein höheres Assoziat zu bilden.

- Allo(GI)4 scheint im Gegensatz zu aIlo(Gg)/allo(l8) ausschliesslich

Duplexstrukturen zu bilden, die weniger stabil sind als die

entsprechenden Duplexe in der Homo-DNA Reihe oder die Triplexe

des G2I und I2G Typs in Allopyranosyl-NA Oligonucleotiden.- Es bestehen deutliche Hinweise darauf, dass Gl-gepaarte Allopyranosyl-NA

Oligonucleotidsequenzen, die nur Duplexstrukturen bilden, eine

antiparallele Strangorientierung bevorzugen.

-X-

B Summary

The goal of this work is composed of the synthesis, characterisation and

especially the Classification of AU-, AT- and the, for homo-DNA exclusive,

AC-pairing and their comparison with analogous sequences of natural

DNA.

Furthermore, oligonucleotides of the homo-DNA series of adenine- and

thymine- containing sequences with an cc-configuration at the anomeric

center were prepared and their properties examined.

A new nucleoside, homo-deoxy-7-carbaadenosine, was introduced to

elucidate the structure of the AA-, AT- and AC-pairing and to achieve, in

collaboration with K. Zimmermann [81], for the first time a purine-purine-

purine homo-DNA triplex. The synthesis of this nucleoside was performed

analogously to the synthesis of the corresponding 7-carbaadenine

Compound in the DNA series described by Seela and co-workers [39].

The synthesis of all the oligonucleotides followed the phosphoramiditmethod developed by Caruthers [31] and Letsinger [32].

The palette of known pairing characteristics and properties of homo-DNA

oligonucleotides, created by the results of the research done by Böhringer

[18], Roth [21] and Hunziker [22], could thus be enlarged through the results

of this work as follows:

- An AU-pairing is clearly weaker than an AT-pairing in the homo-DNA

series. The greater stability of the AT-pairing is due to the more

negative enthalpy term of the pairing process.

- The AU- as well as the AT-pairing in homo-DNA is stronger than the

corresponding pairing in DNA. This effect is due to entropic factors.

- In homo-DNA there exists an AC-pairing. This pairing is clearly weaker

than the corresponding AT- and AU-pairing. This weaker pairing can

be traced back to the less negative term of enthalpy of the pairing

process.

- The AC-pairing can not be influenced by protonation of the homo-

deoxycytidine.- Blockwise homo-AC sequences (dd(AsCs) und dd(A4C4)) do not pair as AC-

but as AA-base pairs.- One could show, that AA-paired oligonucletide Strands in homo-DNA are

oriented in an antiparallel manner.

-XI-

a-Homo-deoxy-adenosine and a-homo-thiymidine oligonucleotidesneither pair with themselves, nor do they pair in an ccA-aT- or an

otA-ßT- fashion. These experiments were carried out by R.P. Hammer

[82].

Oligonucleotide Strands of homo-DNA which pair in a Watson-Crick

manner are antiparallel oriented. These experiments were carried out

in collaboration with C.Leumann [20].

• Homo-DNA does not pair with its corresponding parallel or antiparallel

complementary DNA oligonucleotide Strand. These experimentswere carried out in collaboration with C.Leumann [20].

Oligonucleotides which contain homo-deoxy-7-carbaadenosine do not pair

with themselves. This means that adenine can not pair with adenine

in a Watson-Crick fashion. Together with the results of Böhringer's

experiments [18] there is only one possibility left for an AA-pairing in

homo-DNA: a reverse Hoogsteen base pairing:

IMHO^ •- »-*

\ 1 »'

Homo-DNA forms a purin-purin-purin triplex as could be shown in the

case of dd(G6) • dd(I6) • dd(7CHA5-A). The melting process of this

triplex takes place stepwise.An AC-pairing in homo-DNA is connected in a reverse Hoogsteen

fashion. This is the conclusion of the melting experiment of a homo-

deoxy-7-carbaadenosine/homo-deoxycytidine oligonucleotide. Given

the condition that the bases are Standing anti to the sugar backbone,

an AC-pairing must be built up by antiparallel oriented

oligonucleotide Strands.

-xn-

The synthesis of allopyranosyl-isoguaninnucleoside was performed

analogous to the synthesis of homo-deoxyisoguaninnucleoside by Fräser

[47]. The strategy of the protecting groups was designed by Fischer [50] and

Helg [51]. In the series of allopyranosyl-NA oligonucleotides, the following

new Information on base pairing was discovered:

- Allods) has a much higher melting temperature than all other examined

allopyranosyl-NA oligonucleotides.- Allo(Gg)/allo(Ig) seems to form two coexisting triplexes, (allo(Gg)}2 • allods)

with a melting temperature of about 81°C and an [allo(Ig)}2 • allo(Gg)

triplex with a melting temperature of about 37°C. Both melting

processes seem to be triplex-to-single Strand transitions. For the G2I

triplex, the hybridisation curve has a large hysteresis of 40°C. This

could possibly mean the prior formation of a (thermodynamicallymore unstable) Gl-paired Duplex (figure C5.36) which can perform as

a receptor for allo(Gg) or allodg) as well as, in particular, build up the

thermodynamically more stable G2I triplex.- Allo(G4I4) seems to form higher associates as well.

- Allo(GI)4 seems to form, in contrary to the allo(Gg)/allo(Ig) System,

exclusively duplex structures which are less stable than the

corresponding duplexes in homo-DNA or the triplexes G2I and I2G in

allopyranosyl-NA oligonucleotides.- There is strong evidence that Gl-paired allopyranose-NA oligonucleotide

sequences which form duplex structures, prefer an antiparallel Strand

orientation.

-1-

C Allgemeiner Teil

C.l Einleitung und Problemstellung

Die chemische Synthese von Adenin durch Pentamerisierung von HCN [1] -

mit anderen Reaktionen einer der Grundpfeiler der präbiotischen Chemie -

kontrastiert stark mit der komplexen enzymatischen Bildungsweise von

Adenosin, welche die Natur einschlagen muss [2].

NH3/H205 HCN

Abb. Cl.l: Reaktionsschema der Oro'schen Adenin-

synthese [1].

Ganz ähnlich liegt auch der Fall der einfachen a-Aminosäuren und der

Kohlehydrate, resp. -phosphate. Es existieren sehr einfache, rein chemische

Zugänge zu diesen Stoffklassen, die biologischen Bildungsweisen sind jedoch

sehr verschlungen. Als Zugang aus einfachen Grundstoffen für die Klasse der

(einfachen) racemischen a-Aminosäuren gilt das Miller'sche Experiment [3].

Glycin, Alanin, Sarcosin,

ß-Alanin, Valin, Asparagin-Röckfluss

säure Glutaminsäure,^-

elektr a-Aminobuttersäure, Glykol-

Entladung säure, Milchsäure, Ameisen¬

säure, Essigsäure, Buttersäure

Hp + H2(g) + CH4(g) + NH3(g)

Abb. C1.2: Aus einfachsten Edukten gelang es Miller [3], verschiedene proteinogene

Aminosäuren und andere organische Säuren darzustellen.

-2- Allgemeiner Teil

Für die Kohlehydrate mit gerader Kohlenstoffzahl fand Butlerow [4] einen

einfachen Zugang durch die Formosereaktion, deren Produkte von Emil Fischer

[5] durch Isolierung des Osazons von d,l-Laevulose konstitutionell abgesichertwerden konnte. Diese Formosereaktion, deren ursprüngliche Bedingungen

Ca(OH)2 in wässrigem Formaldehyd waren, lieferte jedoch eine grosse Vielfalt

der verschiedensten racemischen Triosen, Tetrosen, Pentosen, Hexosen und

höheren Zuckern, sowohl Ketosen, wie auch Aldosen.

Existiert auch für Kofaktorstrukturen (wie z.B. Folsäure, Flavin,

Dihydronicotinsäure, Thiamin, Pyridoxal und die Familie der Porphrinoide) ein

Zugang aus einfachen Grundsubstanzen? In unserer Gruppe wurde die Frageunter anderen von C. Strupp [6] zu beantworten gesucht. Er untersuchte die

mögliche Bildung von Flavinen unter potentiell präbiotischen Bedingungen1.Das Azaanaloge von Dihydronicotinsäure und weitere für andere präbiotischeReaktionen wichtige Bausteine wurden von Y.-B. Xiang [7] hergestellt. U.P.

Trinks [8] stellte aus den präbiotisch zugänglichen Substanzen schliesslich

verschiedene Pteridine, sowie 2,6-Diaminopurin, dessen HydrolyseprodukteGuanin und Xanthin, sowie 2,4-Diaminopyrimidin und seine

Hydrolyseprodukte Uracil und Cytidin her. K. Koch [9] versuchte, ausgehend von

diesen Nucleobasen und verschiedenen Zuckern resp. Zuckerphosphaten, eine

Nucleosidierung unter potentiell präbiotischen Bedingungen durchzuführen,

was aber leider nicht gelang.

J. Ferris und S. Drenkard [10], [11] zeigten einen photolytischen Zugang zum

Aziridin-2-carbonitril aus 2-Aminopropennitril. E. Wagner und J. Guck [12], [13]

setzten dieses Aziridin-2-carbonitril mit Phosphorsäure in homogener und

heterogener Phase zu Glycolaldehydphosphat um (vgl. Abb. C1.3).

1 Die Bedingungen für eine 'präbiotische' Reaktionsführung waren:

- kein molekularer Sauerstoff- kein Wasser

- Ausgangsstoffe: Derivate von Cyanwasserstoff, Cyanacethylen und Ammoniak

- Aktivierung und Katalyse durch: Wärme, Licht, Basen, mineralische Oberflächen ('Säuren'und 'Basen')

nach Y.-B. Xiang [7].


H2C=^CN

NH,

hv

[10]

,\ CN H3P04>L-^

[13]CfeHOPO

CN

NH,

H20,80°C

[13]

•0,,HOPO

M•OH

'OH

Abb. C1.3: Konstitutioneller Zusammenhang zwischen 2-Aminopropennitril und

Glycolaldehydphosphat.

Das Glycolaldehydphosphat ist, wie die Arbeiten von Müller und Pi'rscft [14],

[15], [16] zeigten, Edukt der Bildung von racemischen 2,4,6-Hexose-triphosphaten

unter basischen Bedingungen und zusammen mit 0.5 Aequivalent Formaldehyd

zu racemischen Pentose-2,4-diphosphaten.Mit diesem Edukt gelang es, die Produktevielfalt der Formosereaktion drastisch

zu vereinfachen.

Pitsch [16] konnte rac-Pentose-2,4-diphosphat mit ähnlich beeindruckender

Selektivität herstellen. Das Hauptprodukt war hierbei Ribose-2,4-diphosphat.

HgO, NaOH rac-Tetrose-2,4-diphosphatrac-Hexose-2,4,6-triphosphat

P03--Ca*

Art des Zuckers prozentualer Anteil an der

Hexosetriphosphatfraktion

rac-Allose-2,4,6-triphosphat 51

rac-Altrose-2,4,6-triphosphat 18

rac-Mannose-2,4,6-triphosphat 10

rac-Gulose-2,4,6-triphosphat 8

rac-Talose-2,4,6-triphosphat 7

rac-Glucose-2,4,6-triphosphat 5

rac-Idose-2,4,6-triphosphat 3

rac-Galactose-2,4,6-triphosphat 2


CHyO, Hfi, NaOH

iP03"Ca**

x>P03-Ca^ rac-Pentose-

—-opcyca" H2o,NaOH 2,4-diphosphaI

CHjOH

Art des Zuckers prozentualer Anteil an der

Pentosediphosphatfraktion

rac-Ribose~2,4-diphosphat 48

rac-Xylose-2,4-diphosphat 25

rac-Arabinose-2,4-diphosphat 16

rac-Lyxose-2,4-diphosphat 11

H^PCTV^NdPOsHsHO

rac.-Hexose-2,4,6-triphosphat(Hauptprodukt: rac-Allose-2,4,6-

triphosphat)

rac.-Pentose-2,4-diphospat(Hauptprodukt: rac-Ribose-2,4-

diphosphat)

Abb.C1.4: Der Weg von 2-Aminopropennitril zu rac-Hexose-2,4,6-triphosphaten und

rac-Pentose-2,4-diphosphaten.


In unserer Arbeitsgruppe wurde die Frage gestellt, weshalb ausschliesslich aus

Pentofuranosen und nicht etwa aus Hexopyranosen ableitbare Nucleinsauren

von der Natur ausgewählt wurden "Es war die experimentelle Erfahrung der so

leicht und so selektiv erfolgenden Bildung von Hexose-2,4,6-tnphosphaten aus

Glycolaldehydphosphat gewesen, die uns seinerzeit zur Frage gefuhrt hat

Warum eigentlich hat die Natur Pentosen und nicht Hexosen als

Zuckerbausteine ihrer Nucleinsauren gewählt7 Denn aus chemischer Sicht sind

Hexosen offenbar nicht minder elementare Molekulstrukturen als Pentosen, und

bezuglich einer gegebenenfalls prabiologischen Bildung wäre ersteren eine

vergleichbare (wenn nicht gar höhere) Chance einzuräumen als letzteren

Offenbar müssen es funktionelle, strukturell bedingte und sich schlussendlich

auf Unterschiede in der chemischen Reaktivität beziehende Grunde sein, die für

die letztlich biologische Ueberlegenheit der Pentose-Nucleinsauren gegenüber

nicht (oder nicht mehr7) existierenden Hexose-Nucleinsauren verantwortlich

sind" [17]

Es sollte versucht werden, anhand von direkten Vergleichen der Eigenschaften

von Ohgomeren von Pentofuranose-Ohgonucleotiden und Hexopyranose-

Ohgonucleotiden Unterschiede der Paarungseigenschaften zwischen diesen

beiden grundsatzlich verschiedenen Ohgonucleotidfamihen zu suchen und

aufzuzeigenZur Untersuchung dieser Fragestellung wurde zunächst eine möglichst

einfache Pyranose gewählt Alle strukturellen Vorgaben des Zucker-Phosphat-

Ruckgrats von DNA und RNA sollten so weit wie möglich beibehalten werden

Anstelle einer 3,5-Verknupfung des Zucker-Phosphat-Ruckgrats m DNA, resp

RNA wurde eine 4,6-Verknüpfung in einer Hexose-NA unter Beibehaltung der

ß-Konfiguration am anomeren Zentrum gefordert Um die Synthese der Hexose-

NA Modellverbindung zu Beginn möglichst zu vereinfachen, wurde eine

Hexose ohne die zwei Hydroxygruppen, die nicht an einer

Phosphodiesterbindung beteiligt sind - also die Hydroxygruppen am C(2) und am

C(3) - gewählt Dies erleichterte durch das Wegfallen von zwei Stereogenen

Zentren und das Wegfallen von zwei funktionellen Gruppen, die sonst noch

geschützt werden mussten, die Synthese des Zuckerbausteines und der

Nucleoside

Die synthetisch sehr einfach aus 3,4,6-Tn-O-acetyl-D-glucal zugängliche 2,3-

Dideoxy-D-glucopyranose [18] erfüllt sämtliche oben geforderten Voraus-


Setzungen. Sie wurde deshalb in unserem Laboratorium als erste

Modellverbindung verwendet, um Hexose-Oligonucleotide mit

Pyranoseeinheiten zu untersuchen w Homo-DNA.

Der augenfällige Unterschied von Homo-DNA zu 2'-Deoxyribofuranosyl-NA

besteht in einer zusätzlichen Methylengruppe, wodurch der Pentofuranosering

zu einem Hexopyranosering erweitert wird.

0 o

0=P-0" 0=P-0"1 I

o o

VO VyO^Base/•Base T J

+J

<y o^^

o=p-o- 0=P-0"i i

o o

Lo ky.O^Base

0X>Base 0XJh2I I

DNA Homo-DNA

Eine zu Beginn der Arbeiten über Homo-DNA durchgeführte Konfor¬

mationsanalyse [19] zeigte, dass der Wert des endozydischen Torsionswinkels 5

(zur Definition der Torsionswinkel vergleiche man die Abb. C1.5) in der

natürlichen DNA für die Helicität eines DNA-Doppelstranges von grosser

Bedeutung ist.

Im Rahmen von drei wohldefinierten Kriterien (der verallgemeinerte

Anomereffekt soll gültig sein, keine 1,5 Repulsionen und eine gauche-gaucheKonformation am Phospodiestergruppe) existiert nur eine repetitive,

geringstgespannte und paarungsfähige Konformation eines Einzelstrang-

oligonucleotids. Diese Konformation ist linear. Es zeigte sich ferner, dass der

Wert des endozydischen Torsionswinkels für die Helicität der DNA

entscheidend ist. Eine später von Dobler mit dem MacMoMo - Programm

durchgeführte Berechnung der Abhängigkeit der Stranghelicität vom

Torsionswinkel 5 unter folgenden Voraussetzungen: aliphatisches Rückgrat-


element mit idealisierten Konformationen (Torsionswinkel: a = - 60°, ß = 180°, y= 60°, 6 = variabel, e = 180°, £ = -60°), Standardbildungslängen (C-C: 1.53 A, C-O:

1.45 A, P-O: 1.60 Ä) und tetraedrische BildungsWinkel, ergab ein Resultat, das in

Abb C1.6 dargestellt ist und dessen dramatische Aussage für sich spricht. Ist der

endozydische Winkel 8 >60°, so wie er dies in Pentose-NA zu sein hat, ergibt sich

obligat eine helicale Struktur des Zucker-Phosphat-Rückgrats des Oligonucleotid-

einzelstrangs.

Oß

'3SKJA

O ^J a H""|^

o^x

Base

Abb. C1.5: Lineare, paarungsfähige Konformation des Homo-DNA-

Einzelstrangs (idealisiert) mit Angabe der Torsionswinkel.


I -i Pitch

linear

helical

0 30 60 90 120 150 180 8 [°

6-Ring 5-Ring

Abb. C1.6: Einfluss von 8 auf die Helicität der DNA [19].

Furanose °

II H-UB

1 HO

RNA

(Furanose)

Pvranosen o

__^-p<

| H-i-H

o

II

-o--~\-o-o

-o-

1 HO

Allose-NAHomo-DNA

(als Testnucleotid für Hexose-DNA's und -NA's)

Abb. C1.7: Schematische Darstellung von Oligonucleotiden mit Furanosen und

Pyranosen.


Eine Erweiterung des Pentofuranose- zu einem Hexopyranosering als

Zuckerbaustein von Oligonucleotiden führt neben den dramatischen

Auswirkungen auf das Zucker-Phosphat-Rückgrat, wie Abb. C1.6 zeigt, auch zu

einer Aenderung der Lage der Nucleobase relativ zum Zuckerring.Molecular Modelling1 durch Relaxation eines als Startstruktur linear gesetzten

Homo-DNA Oligonudeotideinzelstranges ergaben ebenfalls eine beinahe lineare

Oligonucleotidstruktur für Homo-DNA mit einem Pitch (Ganghöhe) von 120-

130Ä.

Schon die ersten Paarungsversuche, die Mitglieder unserer Forschungsgruppe

(M. Böhringer [18], C. Leumann [20], H.-J. Roth [21] und J. Hunziker [22]) mit

Homo-DNA durchführten, ergaben sehr interessante Ergebnisse.

Die wichtigsten Eigenschaften von Homo-DNA, welche diese Mitarbeiter der

Gruppe gefunden haben, sind:

- Homo-DNA paart mit Homo-DNA, nicht aber mit natürlicher DNA.

- In der Homo-DNA existiert neben der AT- und GC- auch eine AA- und

eine GG-Paarung, die nicht nach dem von Watson und Crick 1953

gefundenen Basenpaarungsmuster assoziieren [23].

- Die Paarungen von Homo-DNA Oligonucleotiden sind deutlich stabiler

als die analogen Paarungen der DNA-Reihe. Die höhere Stabilität

der Basenpaarungen des Duplexes ist auf die weniger ungünstige

(weniger negative) Entropieänderung (AS) beim Paarungsvorgang

zurückzuführen.

- Die Oligonudeotidstränge eines Homo-DNA Duplexes sind antiparallel

orientiert.

- Als Zusammenfassung der Ergebnisse der Schmelzexperimente konnte

eine Reihenfolge der Stärke der Basenpaarung aufgestellt werden:

GC > AA - GG > AT

Problemstellung für die eigenen Arbeiten

Es sollten Daten über das Paarungsverhalten weiterer Homo-DNA

Oligonucleotide beschafft werden, um damit zu Vorstellungen über den

1 Durchgeführt von Prof. Dr. K. Müller (F. Hoffmann-La Roche, Basel)


Konstitutionstyp der Basenpaarungen in der Homo-DNA zu gelangen. Parallel

dazu sind auch die analogen DNA-Oligonucleotide zu synthetisieren und mit

den Resultaten der Homo-DNA zu vergleichen.Im Verlaufe der Arbeit stellte sich zudem die Aufgabe der Synthese von Homo-

DNA Oligonucleotiden, die anstelle von Adenin 7-Carbaadenin als Nucleobase

enthalten. Untersuchungen solcher Art modifizierter Oligonucleotide sollte

Auskunft über den Konstitutionstyp der Adenin-Adenin Paarung geben.

C.2 Synthese der Nucleosidbausteine

C.2.1 ß-Homo-deoxyuridin

Nucleosidierungsreaktionen wurden früher jeweils durch Reaktion von

Halozuckern und Quecksilber- oder Silbersalzen der Nucleinsäurebasen

durchgeführt [z.B. 24]. Hubert und Johnson [25] verwendeten O-alkylierte

Pyrimidinbasen und am anomeren Zentrum halogensubstituierte Zucker. Baker

et al. [26] benutzten als Katalysatoren erstmals Lewissäuren, um die Elektrophiliedes C(l') zu erhöhen. Eine weitere Verbesserung wurde von Nishimura et al. [27]

durch Silylierung der Nucleinsäurebasen erzielt. Silylierte Basen sind in den für

Nucleosidierungsreaktionen üblicherweise verwendeten Lösungsmitteln

(CH3CN, 1,2-Dichlorethan) gut löslich, was zu einer viel schnelleren Reaktion in

homogener Lösung führte. Da die Stabilität der silylierten Basen gering ist,

mussten sie jeweils erst kurz vor der Nucleosidierung hergestellt und sofort

verwendet werden. Die logische und äusserst erfolgreiche Weiterentwicklungwurde dann durch H. Vorbrüggen et al. eingeleitet [28]: Sie silylierten die Base in

CH3CN und gaben dann zur homogenen Lösung den Zucker und die Lewissäure

zu. Es konnte, dank geeigneter Lewissäuren, auf die häufig instabilen Halozucker

verzichtet werden. An deren Stelle konnten viel stabilere am O(l) acylierte oder

alkylierte Zucker verwendet werden.

In unserer Forschungsgruppe wurden Nucleosidierungsreaktionen nach der

letztgenannten Methode von Vorbrüggen durchgeführt, da sie in einer einfachen

Reaktionsführung in einem Schritt zum gewünschten Produkt mit guter

Ausbeute führte.


ACO

AcO

AcO

MeOH,BF3 Et20^-

Toluol, 40 Min.,

OTJ, 81%

AcO

AcO

-V'OCH,

H2, Pd/C

MeOH, HOAc

3d, RT, 82%

HO

HO

3.2MNaOH

MeOH, 10 Min.

'OCH, 0"C,89%

AcO

AcO

OCH,

OCH,

Abb. C2.1: Synthese der Zuckerbausteine 3 und S für Homo-DNA nach [29].

Der Zuckerbaustein 3 [29], der zur Nudeosidierung verwendet wurde, wurde,

wie von Böhringer beschrieben [18], ausgehend von Triacetylglucal 1 über das

Enopyranosid 2 im Kilolabor der ETH Zürich hergestellt (Abb. C2.1).

Für alle Nucleosidierungsreaktionen mit Purinbasen, die im Rahmen dieser

Arbeit durchgeführt wurden, wurde jeweils 4,6-Dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-

methylglucopyranosid 5 verwendet. 5 wurde direkt aus 3 via Abspaltung der

beiden Acetylschutzgruppen an den Hydroxygruppen am C(4) und C(6) in

methanolischem Natriumhydroxid bei 0°C und anschliessender Veresterung der

nunmehr freien Hydroxygruppen mit Benzoylchlorid in Pyridin bei 0°C in einer

Totalausbeute von 69% hergestellt.

Die Nudeosidierung von silyliertem Uracil 6 mit 3 in CH3CN bei 40°C unter

SnCl4-Katalyse verlief in 60% Ausbeute (vgl. Abb. C2.2). Durch Flash

Chromatograpie konnte das a-konfigurierte Nucleosid (20%) abgetrennt werden.


AcO-% n JL HMDS> TMSiO, SnCU ^^

^OCH3 H«, X CH3CN,40°C, AcO^\>~-V' "V"

N O 16 h, 60% OH

6

NHyMeOH12 h, RT, 88%

DMTO-v0fy° DMTC,,DMAP,N(E.)3

HO-^ qf^f

Ho^^N-VNH**

HO'^-^N^NHHO ^^ IT Pyridin, 4 h. RT, 93%HO ^^^ jf

O O

9 8

Abb C2 2 Nudeosidierung, Entschutzung und sei Schützen der 6'-Hydroxygruppe als

4,4'-Dimethoxy-tnphenylmethylether (DMT) nach Khorana und Mitarbeiter [30]

Die ß-Konfiguration am anomeren Zentrum von 7 konnte mit einem NOE

Experiment bewiesen werden (vgl Abb C2 3) Einstrahlen auf das Signal des

Protons bei 3 83 ppm (H-C(5')) ergab neben Resonanzen der Protonen am C(3),

C(4) und C(6) einen ausgeprägten NOE am Signal des H-C(l') (5 73 ppm) Das ist

nur bei einer ß-Konfiguration am anomeren Zentrum möglich

o7°

AcO- \ n


Abb. C2.3: NOE-Experiment mit 7. Da bei Einstrahlung auf das H-C(5') Proton

das H-CO') ein NOE zeigt, muss es sich bei dem Proton, auf das eingestrahlt

wurde, um ein a-Proton handeln, und die Konfiguration von 7 ist somit ß.

Die Behandlung von 7 mit NH3 gesättigtem Methanol führte zur Abspaltungder Acetylschutzgruppen und lieferte das freie Nudeosid 8 in 88% Ausbeute. Im

Hinblick auf die Oligonudeotidsynthese nach Caruthers [31] und Letsinger [32]

nach der Phosphittriestermethode wurde das freie Nucleosid 8 in Pyridin mit

DMAP und Triethylamin als Hilfreagenzien mit 4,4'-Dimethoxy-

triphenylchlormethan (DMT) an der 6'-Hydroxygruppe verethert, was in über

90% Ausbeute das DMT-gesdiützte Nucleosid 9 lieferte.

Zur Fixierung des ersten Nucleosids an die Festphase "Long-Chain AlkylamineControUed Pore Glass" wurde ein Teil des DMT geschützten Nucleosids 9 in

Pyridin mit Bernsteinsäureanhydrid verestert (vgl. Abb. C2.4). Die Carboxygruppeder resultierenden Säure 10 wurde nadi Gait [33] in Dioxan mit 4-Nitrophenolund DCC umgesetzt. Man erhielt in einer Totalausbeute von 40% über beide

Stufen den sogenannten Aktivester 11 von ß-Homo-deoxyuridin. Umsetzen

dieses Aktivesters 11 bei RT in DMF mit der freien Aminogruppe von "Long

Chain Alkylamine ControUed Pore Glass" lieferte ß-Homo-deoxyuridinbeladenes Trägermaterial 12 (Beladungsdichte: 31 umol/g). Um die nicht mit 11


derivatisierten Aminogruppen zu blockieren, wurden diese mit Essigsaure-

anhydrid in Pyridin zu Acetamiden umgesetzt ('capping').

DMTO

HO

f^^Y* Bernstemsaureanhydrid

3_^^0 ^ ^NH DMAP, Pyridin.18 "• RT

Yo

DMTO-

HO,

o 10

4-Nitrophenol, DCC,

Pyridin, Dioxan, 3 S h, RT

40% (über beide Stufen)

t

r^V° r**V<TO—v n

I I. DMTO—V n' '

H Q^£^NyNH DMF, N(B)3, PyrKim o^^H^m

^°

1202N^ ° 11

DMTO-

Abb C2 4 Synthese der an die Festphase gebundenen Starteinheit, ausgehend vom DMT-

geschutzten Nucleosid über den Aktivester

Ausgehend vom DMT-geschutzten Nucleosid 9 wurde der in der

Oligonucleotidsynthese verwendete Baustein, das 4-0-(2-Cyanoethoxy)-

phosphoramidit, nach Koster und Mitarbeitern [34] in CH2CI2 bei RT in über 90%

Ausbeute hergestellt

-. ^O CI-P(OR)(N(.-Pr)2)

DMTO-^ 0fY ('-P^BN DMT°

nu \^ y CH2CI2,1h, RT,91% P-

>^S^

° R0' ^N<lPr>2

ro

NH

R=^^'CN

13

Abb C2 5 Phosphoramidit nach Koster und Mitarbeitern [34]

Diese Cyanoethylschutzgruppe in Phosphoramiditen besitzt gegenüber den

früher verwendeten Methylschutzgruppen den Vorteil, dass sie nicht noch in


einem speziellen Schritt entfernt werden muss. Die Methylgruppe musste

jeweils noch extra mit Thiophenol entfernt werden. Die Abspaltung der

Cyanoethylgruppe wird bei basischer Behandlung der Oligonucleotide nach

deren Synthese im gleichen Arbeitsschritt wie die Entfernung der Schutzgruppender Basen und der Ablösung des Oligonucleotids von der Festphase in

wässrigem, konzentriertem Ammoniak ablaufen.

C.2.2 Synthese der a-Nucleosidbausteine

C2.2.1 a-Homo-deoxyadenosin (9-(2',3'-Dideoxy-a-D-glucopyranosyl)adenin)

Die Synthese der Monomereinheiten der a-Nucleoside und die Unter¬

suchungen der daraus hergestellten Oligomere wurden von R.P. Hammer [82]

durchgeführt.Vom Anomerengemisch (14a/14ß nach der Vorschrift von Böhringer [18]

synthetisiert, a : ß jeweils etwa im Verhältnis von 3 : 4 erhalten), das man nach

der Nucleosidierungsreaktion erhielt, konnte das ß-Anomere auf der

benzoylgeschützten Stufe selektiv kristallisiert werden. Versuche, dieses auch für

das a-Anomere durchzuführen, misslangen.

Es gelang allerdings, auf der Stufe des N6-Benzoyl-9-(2',3'-dideoxy-a,ß-D-

glucopyranosyl)-adenin 15 das a-Anomere bis zu einem Verhältnis a : ß > 20 :1,

wenn auch mit schlechter Ausbeute (< 10%), durch Kristallisation aus heissem

Methanol und Zugabe von CH3CN anzureichern, wobei das ß-Anomer in

Lösung blieb (Abb. C2.6).

Dieses a-Nudeosid wurde nach Standardverfahren an der 6'-Hydroxygruppe als

4,4'-Dimethoxy-triphenylmethylether selektiv blockiert, was 16 in 70% Ausbeute

ergab. Dieses wurde unter gegenüber anderen Nucleosiden leicht modifizierten

Bedingungen mit Bis-(N,N-diisopropylamino)-cyanoethoxyphosphin und Kata¬

lyse durch Diisopropyl-ammoniumtetrazolid in die von unserer Gruppe

verwendete Form des Phosphoramidits 17 in 73% Ausbeute überführt.

Ausgehend vom DMT-geschützten a-Nucleosid 16, wurde analog dem ß-

Nucleosid von Homo-deoxyadenosin der Aktivester 18 und dann der mit der

ersten Homo-deoxyadenosin Starteinheit versehene CPG-Festphasenträger 19

hergestellt. Nach Blockieren der freien Aminogruppen des "Long Chain


Alkylamine CPG" mit Essigsaureanhydrid in Pyridin wurde eine Beladungs¬

dichte der Festphase von 20 0 umol/g bestimmt

o^,ho

BzO

'*\S~-^H. --X 1)THFMeOHH20-5 41 HO'X-"—1BzO

_

U_/ 25NNaOH, 115Eq >N

j\_ 0°C,30Mm \rt //~ NHBz 2 ) Knstalhsation aus

N

NM8OH/CH3CN, 10%

NHBz

14 (aß. 5 1) 15(aß>20 1)

IDMTC1, (i-Pr)2EtN, DMAP,

Pyridin, RT, 4 h, 70%

DMTO DMTO

O V^-|_

P(ORHN(i Pr)2)2 HO^\>—^,F>K.„r,, xN>T *1 Dnsopropylammonium vN~~rf ^1

RONOPrfc^J

1tetrazol,d,CH2CI2 <J N

N-^" RT,4h,73% N-4^"R = "y\*'CN NHBz NHBz

17 16

1) BernstemsäureanhydridDMAP, Pyridin, RT, 16 h

2) 4-Nrtrophenol, DCC,Dioxan, RT, 4 h,


DMTO CPG-NHZ, DMF, Pyridin,l N(Et)3, RT, 14 h DMTO

<~~»' \ Beladungsdichte 20 0 umol/g lQ

NHBz OjN ^^ 7NHBz

19 18

Abb C2 6 Syntheseschema zur Verlangerungseinheit (Phosphoramidit) 17 und zum

Festphasentrager 19 von a-Homo-deoxyadenosin


C2.2.2 a-Homo-thymidin (l-(2',3'-Dideoxy-a-D-glucopyranosyl)thymin)

Nach der Vorschrift von Roth [21] wurde mittels Trimethylsilylchlorid und

Hexamethyldisilazan erschöpfend silyliertes Thymin mit Methyl-4,6-0-diacetyl-

2,3-dideoxy-a,ß-D-glucopyranosid 3 unter SnCU - Katalyse in CH3CN, analog der

modifizierten 'Silyl-Hilbert-Johnson' Methode von Vorbrüggen [28], zu den

entsprechenden Nucleosiden 20a und 20ß umgesetzt. Das aus dieser Reaktion

erhaltene Anomerengemisch konnte sehr leicht durch 'flash'-Chromatographie

aufgetrennt werden.

Analyse der Kopplungskonstanten der Zuckerringprotonen im :H-NMR und

NOE-Experimente von Roth [21] belegen klar, dass beim Acetylderivat 20a von a-

Homo-thymidin ein Pyranosesessel mit axialen Substituenten am C(4') und C(5'),dafür aber einem aequatorialen Basensubstituent am C(l') vorliegt.

Die Hydrolyse der Esterfunktionen nach der Vorschrift von Roth [21] durch

Stehenlassen der Lösung von 20a in mit NH3 gesättigtem Methanol führte in

75% Ausbeute zu a-Homo-thymidin 21 (vgl. Abb. C2.7). Die 6'-Hydroxygruppe

von 21 wurde in Pyridin mit 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan umgesetzt.

Man erhielt in 51 % Ausbeute das am 0(6') als 4,4'-Dimethoxy-

triphenylmethylether geschützte Nucleosid 22.

Die Herstellung des Phosphoramiditbausteins 23 erfolgte wiederum wie

diejenige zum Phosphoramidit von a-Homo-deoxyadenosin mit Bis-(N,N-

diisopropylamino)-cyanoethoxyphosphin und Diisopropylammoniumtetrazolidin CH2CI2 mit 74% Ausbeute. Die Aktivestersynthese 24 und das Beladen der

Festphase CPG mit dem a-Homo-tymidin 25 wurde, in Anlehnung an die bei ß-

Homo-thymidin von Roth [21] erfolgreich durchgeführte Synthese, ausgeführt.

25 konnte nach Blockieren der noch nicht reagierten freien Aminogruppen der

Festphase mit einer Beladungsdichte von 21.0 umol/g erhalten werden.

Die anschliessende Synthese der Oligonucleotide am DNA-Synthesizer, die

Entschützung und Ablösung der Oligonucleotide von der Festphase, sowie die

Trennung mit HPL-Chromatographie und das Entsalzen über SepPak C18 konnte

nach dem gleichem Muster wie bei den ß-Homo-DNA Oligonucleotiden

durchgeführt werden.


HO.

~0-7^N

AcO.

NO' H

NBj/MbOH

0 RT,24h,75%

20a

DMTO,

PtORHNO-PrfefeDiisopropylammonium-tetrazolid, CH2CI2RT, 3 h, 74%

-0-7~~N

O' H

N(i-Pr)2 23

R-^-^V^0

-o-7"~-n

CT H

21

Pyndln, DMTCI

RT, 30 Min,51%

1 ) Bemstainsaureanhydnd,DMAP, Pyndn.RT, 16 h

2)4-Nitrophenol, DCC,

Dioxan, RT, 4 h,


DMTO,

0,N

XXj^tCPG-NHj, DMF, Pyndin,

N(Et)a. RT, 14 h

Beladungsdichte 21 0 |imol/g

-0"7~N

N

O* H

24

DMTO,

&S-W'0-7—N

NO* H

25

Abb.C2.7: Syntheseschema zum Phosphoramidit 23 von a-Homo-thymidin und zur

Festphase 25, die mit CX6')-DMT geschützten a-Homo-thymidin derivatisiert ist.

C.2.3 ß-Homo-deoxy-7-carbaadenosin (Homo-7-deazaadenosin)

Man stellte 7-Carbaadenin 33 nach Davoll [37] her und schützte in Analogie zu

Ness [38] in einer Benzoesäureanhydridschmelze das N(6) als Monobenzoat (vgl.

Abb. C2.8).


4.5 Eq K2CQ3,1.0 cq r\2w3, n

/V^°V^ ?, 0.05EqNal^ JX ^\ X

N26 27 28

NHg/MeOHRT,22h

u C 4 h, 34% über 2 Stufen f / |N -TJ c

30_.

N

O

NH,

1 Eq Na, Thioharnstoff, EtOH,4.5 h, 42% ^

NH2

NH»„ .,. , ,

NH.2

Raney-Nickel

in wässr. NaOH-.^

-

->^-„ ^.

'2

H2N' N'^SH'

^' H2N^N

31 32

1.5Eq1NHCIRT,3h,71%

NHBz NH2Benzoesäureanhydrid

N

N-^N*^N-^N*1 140OC-2h.79%

H H

34 33

Abb. C2.8: Synthese des N(6)-benzoylgeschützten 7-Carbaadenin nach Davoll und Ness [37] und

[38].

Nucleosidierungsversuche von 34 mit 4,6-Dibenzoyl-2,3-dideoxy-methyl-a-D-

glucopyranosid 5 nach der Methode von Vorbrüggen [28] blieben trotz

Variationen der Silylierungsreagenzien und verschiedener Lewissäuren


erfolglos. Es wurden jeweils nur Edukte (5 und 34) sowie das Dibenzoylglucal 35

isoliert.

BzO

BzO--V*-~0v \^0V-^ BZ0^X.C|

35 36a/36ß

Seela und Mitarbeiter [40] beschrieben bei ihrer Synthese zum 9-(2'-Deoxy-ß-D-

ribofuranosyl)-7-carbaadenin1 einen Weg, der über eine SN2-artig verlaufende

Substitution eines am anomeren Zentrum C(l) halogensubstituierten Zuckers, 6-

Chlor-7-carbapurin 41 und KOH unter phasentransferkatalytischen Bedingungenin CH3CN verlief. Er verwendete dabei den von Hofer beschriebenen

Chlorozucker 2-Deoxy-3,5-di-0-(4-toluoyl)-l-chlor-a-D-ribofuranose.Auf Anregung aus diesen Arbeiten wurde analog der Vorgehensweise von

Hofer [24] l-Chlor-4,6-dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-glucopyranose 36 und 6-Chlor-7-

carbapurin (vgl. Abb. C2.9) hergestellt.

1 In der Natur existiert auch ein Nucleosid mit 7-Carbaadenin als Base, nämlich das sogenannteTubercidin (9-(ß-D-Ribofuranosyl)-7-carbaadenin). Es hat antivirale Eigenschaften und wurde von

Nishimura et al. [25] aus Streptomyces Arten isoliert. Tolman et al. [26] bestimmten die Struktur und

synthetisierten Tubercidin aus Tetra-O-acetyl-(jl-D-ribofuranose) und 8-Brom-7-carba-7-cyanopurinin einer Schmelze zu einem Nucleosid, woraus in mehreren Schritten Tubercidin hergestellt wurde.


Br^N^Ov0-.

26

NC

39

27

4 5 Eq KjCOa,0 05 Eq Nal

^-

4 h, 48% ff

OH

-oX J

H2N^N^

Raney-Nickelinwassr NaOH

1 h, 64% ff

15Eq1NHCIRT, 48 h, 90%

•yAc

N

28

-VnA

1 Eq Na, Thioharnstoff

EtOH, 3 5 h, 56%^

OH

-° X XH2N N'*SH

38

N-^-N^ 45 Min, 56% N^|\|^

40 41

Abb C2 9 Synthese von 7-Carbahypoxanthm 40 und davon ausgehend 6-Chlor-7-carbapunn 41

nach Davoll [40]

Der Versuch einer Kopplung von 41 mit 36 lieferte nach den identischen

Bedingungen, wie Seela und Mitarbeiter [40] sie angewendet hatten, nur am

anomeren Zentrum hydrolysierten Zucker 44

Die Idee einer Substitution am Chlorozucker 36a/36ß wurde noch nicht

aufgegeben Es wurde also 6-Chlor-7-carbapurin 41 mit 1 Aequivalent

Kahummethoxid (als Losung in Methanol) deprotomert, vom Losungsmittel

befreit und am HV getrocknet Dieses Kaliumsalz des Aglycons 43 wurde in

CH3CN suspendiert und der Chlorozucker 36a/36ß (a • ß > 20 . 1), in CH3CN

gelost, zugegeben (Abb C2.12). Schon nach wenigen Minuten war nach DC-

Kontrolle ein neuer Produktfleck zu sehen, der sich nach Aufarbeitung als

Anomerengemisch des Nucleosidierungsproduktes 42a/42ß (a ß > 1 2)

herausstellte Aus diesem Anomerengemisch Hess sich 42ß selektiv aus

Diethyleter kristallisieren


NHBz

neu.N N

BzO

BzO

OCH

34

BzO

BzO^c, * od —-°^?rH

^

3 6 41 42a/42ß

Abb. C2.10: Uebersicht über die zwei prinzipiellen Nucleosidierungsreaktionen, die

versucht wurden.

Der Chlorozucker 36a/36ß, der in dieser Reaktion verwendet wurde, wurde

nach Wilcox et al. [41] durch Reaktion von Tris-(N,N-dimethylamino)phosphinin THF und anschliessender Zugabe von CCI4 bei -78°C in situ aus dem stabilen

4,6-0-Dibenzoyl-2,3-dideoxypyranose 44 hergestellt (vgl. 1H-NMR Abb. C2.13 b))

und ohne weitere Reinigung direkt in die Nucleosidierungsreaktion eingesetzt.

44 wurde durch milde saure Hydrolyse des Methylpyranosids 5 in einem CH3CN-

MeOH-Wassergemisch in 67% Ausbeute hergestellt und in situ weiterverarbeitet.

Die ß-Konfiguration am anomeren Zentrum von 42ß konnte analog dem Fall

von a-Homo-thymidin mit einem NOE Experiment bewiesen werden (Abb.

C2.ll). Einstrahlen auf das Signal des Protons bei 6.21 ppm (H-C(l')) ergab neben

relativ schwachen Resonanzen der Protonen am C(2'), C(3'), C(8) und C(2) einen

starken NOE auf das Signal des H-C(5') (4.31 ppm). Das ist nur bei einer ß-

Konfiguration am anomeren Zentrum möglich.

BzO

VWBzO'

KJ42


Abb. C2.ll: NOE-Experiment mit 42ß. Da bei Einstrahlung auf das H-C(l') Proton das

H-C(5') ein NOE zeigt, muss es sich bei dem Proton, auf das eingestrahlt wurde, um ein

a-Proton handeln, und die Konfiguration von 42 ist somit ß.

Nucleosidierungsreaktionen von l-Chlor-a-D-2-deoxyribofuranosid mit dem

Anion der Nucleobasen unter phasentransferkatalytischen Bedingungenverlaufen nach Untersuchungen von Seela und Mitarbeitern [39] SN2-artig unter

Inversion am anomeren Zentrum.

Wir beobachteten als Produkte unserer Nucleosidierungsmethode mit dem

Chlorozucker 36 Anomerengemische der Nucleosidderivate 42a/42ß. Es

interessierte nun, ob die Nudeosidierung in unserem Fall nicht SN2-artig

verläuft, oder aber ob die Synthese des Chlorozuckers 36 nach Wilcox und

Mitarbeitern [41] nicht selektiv zum a-Anomeren führt.


Cl

BzO

BzO^V>-^v-OH//\AJ

44 41

BzO

BzO' N^—""Cl

36

BzO

P(N(CH3)2)3

IT-TB^C 1)CH3CN.45Min,RT

a ß = V2

2) Kristallisation aus

Ether 28% (anome-

renrein)

1 Eq KOMe

MeOH,

30 Min, RT

Cl

AJ43

Bz°r=\

Nj^.N

NHa^teOH,'

Autoklav, 20 h,

,'130',C,83%

42

HO,

HO,

l ^\ „.ua)TMSiO, Pyridin, 0°C T F=\

HO"*\^-^ T T b)BzCI,0«C HO^C^-^ T T

37

N^N c)2MNH3aq0°C, 73%

N^.N

38

DMTCI, (i-Pr)2EtN,

Pyndin,45 Mm ,

RT, 77%

OMTO C,-P(0R)-N(,-Pr)2DMTO f=\

Q-^>-^ T « („PrUFtNTHF HO^V^ T IIOIp

RO' SN(i-Pr)2

lu (i-Pr)2EtN,THF,

HO

*'

1h, RT, 59%Njs.N

4039

r. y\^.CN

Abb. C2.12: Syntheseweg zum Phosphoramidit 40 von Homo-deoxy-7-

carbaadenosin.


Zur Untersuchung des Mechanismus der Nucleosidierungsreaktion wurde

kristallines l-Chlor-4,6-dibenzoyl-2,3-dideoxy-D-glucopyranose 36a (enthält noch

ca. 15% hydrolysierten Zucker 44; vergleiche JH-NMR Abb. C2.13 a)), das analog

Hofer [24] von K. Groebke [42] direkt aus l-Methyl-4,6-dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-

glucopyranose 5 hergestellt wurde, verwendet. Dieser Chlorozucker 36a, der

keine detektierbaren Mengen an ß-Anomeren enthielt, wurde in die

Nucleosidierungsreaktion, die nach dem gleichen Vorgehen wie diejenige mit

dem in situ erzeugten Chlorozucker 36a/36ß durchgeführt wurde, eingesetzt. Im

1H-NMR-Spektrum des Rohproduktes (dazu wurde die Reaktionslösung ohne

Aufarbeitung direkt eingeengt und das 1H-NMR gemessen) konnte neben nicht

nucleosidischen Zuckerspaltprodukten ausschliesslich das ß-konfigurierteNucleosid 42ß detektiert werden (vgl. C2.14 e)).

Das Signal der anomeren Protonen ist scharf von anderen Signalen getrennt.

Bei der Analyse der Nucleosidierungsprodukte ist besonders das Signal des H-

C(2) um 8.6 ppm zur Abschätzung der Anomerenverhältnisse von grosser Hilfe.

a)

Ul-

b)

l_u-JX_

Abb. C2.13: Gemische aus l-Chlor-4,6-0-dibenzoyi-2,3-dideoxy-D-glucopyranosid,

Zuckerspaltprodukten und hydrolysiertem Zucker 44.

a) Kristallines 36a, aus einer Synthese nach Hofer [24]

b) Sowohl a- wie auch ß-Anomere von 36 im Verhältnis von etwa 3:1, wie es bei einer

Chlorozuckersynthese nach Wilcox [41] jeweils entsteht. Eine solche Reaktionslösung wurde,

nach beendeter Reaktion eingeengt, sofort in CDC1S gelöst und davon ein Roh- H-NMR

gemessen.


Abb. C2.14: 'H-NMR (Varian Gemini; 200 MHz),

c) Chlorobase 41: die Hauptverunreinigung in den NMR-Spektren der Nucleosidierungsreaktionen

(Spektren d) und e)).

d) NMR-Spektrum einer Nucleosidierungsreaktion mit einem Chlorozucker, hergestellt nach

Wilcox [41] vor der Aufarbeitung (Eduktspektrum von 36ct/36ß zu dieser Reaktion (a:ß=3:l): b»

e) NMR-Spektrum des Rohgemischs der Nudeosidierung mit dem anomerenreinem, kristallinen 1-

Chlor-4,6-0-dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-gluco-pyranosid, das nach Hofer [24] hergestellt

worden war (Eduktspektrum von 36a zu dieser Reaktion: a))

f) Anomerenreines ß-Nucleosid 42 nach Umkristallisation aus Diethylether

Aus den beschriebenen Experimenten lässt sich zusammenfassend schliessen,

dass selbst in der Reihe der Dideoxypyranosen eine Nucleosidierungsreaktionunter den angegebenen Bedingungen mit l-Chlor-4,6-0-dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-

D-gluco-pyranosid 36, wie im Fall der Ribofuranosylreihe beschrieben, SN2-artigunter Inversion am C(l) abläuft. Die Tatsache, dass in der beschriebenen

Nucleosidierungsreaktion a/ß-Gemische auftreten, ist auf ein

Diastereomerengemisch des Eduktes 36a/36ß am anomeren Zentrum

zurückzuführen, was sich durch Analyse des JH-NMR Spektrum nach der

Methode von Wilcox et al. [41] hergestellten Chlorozuckers (Abb. C2.13 b)) und

des daraus hergestellten Nucleosidierungsproduktes 42a/42ß (Abb. C2.14 d))

zeigen Hess.

Die Ammonolyse des diacetylierten Nucleosid 48 (vgl. Abb. C2.12) in mit NH3

gesättigtem Ammoniak bei 15 bar und 130°C führte einerseits zur Abspaltung der


Benzoylgruppe und anderseits zur Substitution des 6-Chlorsubstituenten, wobei

das ß-Homo-7-carbaadenosin 37 in 83% Ausbeute erhalten wurde Die

anschliessende selektive Monobenzoylierung am N(6) nach Galt [33] in Pyridinnach vorübergehender Blockierung der 4'- und der 6'-Hydroxygruppen als

Trimethylsilylether, anschliessender Zugabe von Benzoylchlond und

ammomakalischer Aufarbeitung (zur Ueberfuhrung des am N(6) dibenzoyhertenin das monobenzoylierte Derivat) lieferte 38 in 73% Ausbeute Die anschliessende

Bereitstellung des Nucleosidbausteins 40 für die Homo-DNA-Synthese führte in

bekannter Manier durch Reaktion des Nucleosiddenvates 38 mit 4,4'-Dimethoxy-

tnphenylchlormethan in Pyridin mit 77% Ausbeute zum 4,4'-Dimethoxy-

triphenylmethylether 39 Die Umsetzung von 39 mit Chloro(2-cyano-

ethoxy)(dnsopropylamino)phosphin in THF mit Ethyldnsopropylamin

(Hunigsbase) als Katalysator führte in einer Ausbeute von 59% zum

Phosphoramidit 401

C.2.4 ß-D-Allopyranosyl-isoguanin2

Die Herstellung des Allopyranosyl-isoguaninnucleosids ist in Abb C2 16

abgebildet Sie erfolgte im wesentlichen analog dem von Fräser [47] und Peng [48]

beschriebenen Syntheseweg zum Homo-deoxy-isoguanosin Dieser Weg

beinhaltete eine Nudeosidierung von 4,6-Dibenzoyl-2,3-dideoxy-a-D-

methylglucopyranosid 5 und 2,6-Dichlorpunn 49 als Nucleobase

Die Umsetzung des Zuckerdenvates der Allose 48 mit Dichloropunn 49 in

CH3CN mit N,0-Bis-(trimethylsilyl)-acetamid als Silylierungsreagens für die

Nucleobase und Trimethylsilyltrifluormethansulfonat als Lewissaure bei 65°C

lieferte ausschliesslich das ß-konfigunerte Nucleosid 50

Die Umsetzung des Nucleosids 50 in mit NH3 gesättigtem Methanol im

Stahlautoklaven bei 90°C führte zur Abspaltung der Acetylgruppen am

Zucker und zu einer selektiven Substitution des Chlorsubstituenten am C(6) des

1 Die Zuordnung der ,3C-NMR-Signale der Nucleobasen erfolgte in Anlehnung an Seela und

Mitarbeiter [39], [40]2 Das RNA-Analoge - 9-(ß-D-Ribofuranosyl)-isoguanm - wird als Crotonosid bezeichnet Crotonosid

ist kein Bestandteil von natürlichen Oligonucleotiden Die erste Isolierung von Crotonosid aus der

Bohne crotonum tiglium gelang Cherbuhez [43] Die erste Synthese des Nucleosids gelang Davoll

[44] durch Hydrolyse des am N-2 diazotierten 9-(Ribo-ß-D-furanosyl)-diaminopunn Das Aglyconiso-Guanin wurde von Purrmann [45] aus Schmetterhngsflugeln isoliert und von E Fächer bereits

1897 durch Einwirkung von Iodwasserstoffsaure auf 2-Ethoxy adenin dargestellt [46]


Basenteils des Nucleosids 50. Man erhielt in 67% Ausbeute das Nucleosidderivat

51. Zum Beweis der ß-Konfiguration von 51 wurde ein NOE-Experiment

durchgeführt. Einstrahlen auf das Signal des Protons bei 6.21 (H-C(D) ergab

neben Effekten an den Resonanzen der Protonen am C(8) und 0-C(2') einen

starken NOE am Signal des H-C(5') (3.75 ppm). Somit ist die ß-Konfiguration des

Nudeosids 51 bewiesen (Kopplungskonstanten vgl. experimenteller Teil).

OH

HOl

51 T

NH,

0 70 60 50 40 30 20 lOppm

Abb. C2.15: NOE-Experiment mit 51. Da bei Einstrahlung auf das H-C(l') Proton das H-C(5') ein

NOE zeigt, muss es sich bei dem Proton, auf das eingestrahlt wurde, um ein a-Proton handeln, und

die Konfiguration von 51 ist somit ß.

Die Schwierigkeit in der Synthese der Allopyranosylisoguaninnucleosidde-rivate 51 und 52 lag in der Handhabung dieser Verbindungen, die, verglichen

mit den entsprechenden Verbindungen der Homo-deoxyribonucleoside, deutlich


polarer sind1. Aus diesem Grund wurde der AUylether 52, der durch Reaktion

von 51 mit dem Natriumsalz von AUylalkohol bei 80°C hergestellt wurde, nicht

isoliert. Man neutralisierte nach der Allyletherbildung das überschüssige

Natriumallylat durch Zugabe einer aequimolaren Menge

Pyridiniumhydrochlorid. Das Lösungsmittel (AUylalkohol) wurde am RV

entfernt. Das auf diese Weise erhaltene Nucleosiderivat 52 wurde direkt in

Pyridin mit Benzoylchlorid zum vollständig benzoylierten Derivat 53 umgesetzt.

Die Reaktion von 51 zu 53 konnte mit 80% Ausbeute über zwei Stufen

durchgeführt werden. Die Isolierung des Hexabenzoylderivates 53 aus der

Reaktionslösung und nachfolgende Chromatographie an Kieselgel erfolgte ohne

weitere Probleme nach Standardmethoden.

Die Reaktion zur N(6) monobenzoylierten Verbindung 54 wurde in einem

THF, Methanol, Wassergemisch mit 2N NaOH (0.3 M NaOH) bei 0°C

durchgeführt. Da die Hydrolyse der Esterfunktionen im Zuckerteil im Vergleichzum Homo-deoxy-isoguanosin z.T. langsamer ablaufen, musste die Reaktion

genau mit DC verfolgt werden. Es gibt in dieser Reaktion keinen Zeitpunkt, bei

dem alles Edukt (oder teilweise am Zucker entschützte Zwischenprodukte)

verschwunden sind und gleichzeitig noch keine vollständig debenzoylierte

Verbindung vorhanden wäre. Die Reaktion wird zu dem Zeitpunkt durch

Zugabe von Ammoniumchlorid gestoppt, bei dem ein Maximum an

Produktbildung festzustellen ist.

Die nachfolgende Reaktion mit TIPDSiCk (l,3-Dichlor-l,l,3,3-tetraisopropyl-

disiloxan) nach Markiewicz [49] in Pyridin führte selektiv zum Silylderivat 56

mit einer Ausbeute von 81%. Die Selektivität ist erklärbar durch die kinetisch

bevorzugte Reaktion einer primären Hydroxygruppe mit TIPDSiCk.

1 So z.B. konnte eine Probe von 300 mg 52 konnte nur noch mit reinem Methanol von einer

Kieselgelsäule eluiert werden.

58.lsoguamn

Allopyranosyl-2',3,-0-Isopropyliden-geschutzten6'-DMT-undvonSynthese16C2Abb.

58

f-.„T

/=N

HO'

DMTO

82%h,53

RT,Pyridin,

DMAPDMTa,

°^^%57'

^HO

JN^^55

92%h,4RT,

3EqN(Bu)4F.THF,

56os/

=nyo'\<:-Nieinoxy-/=NyCr\

81%h,54RT,TIPDSiCI2,Pyridin,

t>s,:

Methoxy-

2-o'Sl-pX-U-

^o.54

Toh

°^^,53

VXi35M,„0.,20M,n,NV}£**

^NHBzN^LqL14N^k^N(Bz)2THFMeOHH20-5Ok

/=NHO

/=NBz0

6l51

N^NOHmyV

^NH2^N..O

/=N,

67%h,12

Autoklav90°C,

NhtyMeOH

C|50

N^NOAc

Stufenzweiüber80%

h160°-250C,

BzCIPyridin,

O^^52

HO'80°C,7h

AllylalkoholNa,

HO

7ohN^.NOHTT

ho^-VV^

68%h,931

65°cCH3CN,

Cl

4948

^?BY°»TV^L^AC°

/=N*•=?ClAcO

TeilAllgemeiner-30-


Die Wahl für die cychsche 2',3'-0-Isopropyhden - Schutzgruppe für die

Hydroxylfunktionen am C(2') und C(3') ergab sich in Analogie zur

Allosepyranosyl-NA Synthese nach Fischer [50] und Helg [51], welche diese

Schutzgruppe aus praparativ synthetischen Gründen gewählt haben So ist es

infolge der stenschen Verhaltnisse für die vorgesehene Ohgonucleotidsyntheseam DNA-Synthesizer zwingend, eine möglichst kleine Schutzgruppe zu wählen

Eine zyklische Schutzgruppe, welche die 2'- und die 3'-Hydroxygruppe

gleichzeitig schützt, ist aus stenschen Gründen sicherlich gut geeignet Des

weiteren darf die Schutzgruppe bei den Bedingungen, die wahrend der Syntheseam Synthesizer auftreten, nicht abgespalten werden Diese Bedingungen fordern,

dass eine 2,3 -O-Schutzgruppe genugende Stabilität in saurem Milieu aufweisen

muss, so dass sie bei den Detntyherungsbedingungen (3% Tnchloressigsaure in

1,2-Dichlorethan) wahrend des Synthesezyklus nicht auch abgespalten werden

Die Verwendung von Silylschutzgruppen für die 2'-, 3'-Hydroxygruppen ist im

Falle der Allose-NA ausgeschlossen, da bereits die Tetraisopropyldisiloxyl-

schutzgruppe zur Diskriminierung der 4'-Hydroxygruppe hinzugezogen wurde

Unter den Abspaltungsbedingungen für diese Schutzgruppe werden wohl auch

ein Teil der anderen Silylether gespalten Die gewählte Isopropyhden-Gruppelasst sich bei pH 2 innerhalb von 2-4 Stunden bei 55°C vollständig entfernen,

ohne dass Depunnisierung in betrachtlichem Ausmass eintritt1

Das Nucleosiddenvat 55 wurde in CHCI3 wahrend 37 Std mit 2-Methoxypropen

in 76% Ausbeute zum zyklischen Ketal 56 umgesetzt

Die Abspaltung der Tetraisopropyldisiloxan - Schutzgruppe in 56 mit Tetra-

butylammoniumfluond in CHCI3 ergab in 92% Ausbeute 57, das anschliessend in

Pyridin an der nunmehr freien primären Hydroxygruppe zum entsprechenden

4,4 -Dimethoxy-tnphenylmethylether 58 m 82% Ausbeute umgesetzt werden

konnte

Das derart geschützte Nucleosid 58 wurde nach Standardverfahren m CHCI3 mit

91% Ausbeute zum Phosphoramidit 59 umgesetzt (Abb C2 17), das gegenüberden Homo-deoxynbonucleosiden eine deutlich erhöhte Basenempfindhchkeitaufweist (zur Diskussion vgl Fischer [50] und Helg [51]) Deshalb musste 59 unter

milden Bedingungen extrahiert und chromatographiert werden

1 Ein Entschutzungsversuch von A Helg [51] mit einem Dimer ailo(C-G), wobei nur der Zucker von

alloG 2,3 -O-isopropyhden geschützt war, ergab eine Halbwertszeit von etwa 15 Min


DMTO^

DMTO

•v

.NHBz k n N. >#k. ^NHBz

^ty CI-P(OR)-N(i-Pr)2

6-V y CHCl3,45Min.,RT,91%R(Y»f\/^ <X ^ N(iPr):

58 59

Abb. C2.17: Synthese des Phosphoramidits 59 aus dem DMT-geschützten Allopyranosyl-

isoguanin 58.

Die Umsetzung von 58 mit Bis-(4-nitrophenyl)-adipinsäureester 61 in THF :

Pyridin = 1:1 führte in einer Stufe mit 58% Ausbeute zum entsprechendenAktivester 62 (Abb. C2.18). Dieser Aktivester wurde anschliessend direkt mit

"Long Chain Alkylamin CPG" in DMF umgesetzt. Man erhielt mit dem

geschützten Startnucleosid beladenenen Träger 63 mit einer Beladungsdichte

von 25.0 umol/g.


DMTO_.N

._ NO

^ OzN'

58 61

PyrkJin/THFABK 40°C

DMT9 ,=N

DMF, N(Ef)3, Pyridin, 5.5 d, RT

Beladungsdichte: 25.0 umol/g

DMTONl

NHBz

HI I O N- N

63

Abb. C2.18: Beladen des CPG mit dem verwendeten Allopyranosyl-isoguanin Aktivester

62 zur derivatisierten Festphase 63.

C.3 Herstellung der Oligonucleotide

Es wurden zwei verschiedene Geräte zur Oligonucleotidsynthese verwendet,

die beide nach der von Caruthers [31] und Letsinger [32] entwickelten

Phosphittriestermethode arbeiten. Die zwei DNA-Synthesizer unterscheiden sich


insbesondere in der Bereitstellung der Phosphoramiditlösungen und der

postsynthetischen Behandlung der Oligonucleotide.

Synthesizer 380 B DNA Synthesizer (ABI):

Am ABI Synthesizer wurden alle natürlichen DNA-Oligomere und alle, kein

Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltenden Homo-DNA Oligomere hergestellt.

Die Zusammensetzung der Phosphoramiditlösungen wurden nach einer im

experimentellen Teil angegebenen Formel berechnet. Das Syntheseprotokoll, das

für den ABI-Synthesizer verwendet wurde, entspricht genau dem von Böhringer

[18] modifizierten Verfahren mit einer auf 3x2 Min. verlängerten Kopplungszeit

(genaues Protokoll vgl. [18]). Die Ausbeuten der einzelnen Kopplungen wurden

durch Messen der Absorption der Detritylierungslösung relativ zum

vorangegangenen Kopplungsschritt bestimmt. Sie lagen für die Phosphoramidite

der Homo-DNA Reihe durchwegs über 98% je Kopplungschritt.

Nach beendeter Oligonucleotidsynthese wurden die Oligomere noch am Träger

von der letzten Dimethoxytritylschutzgruppe befreit.

Synthesizer Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB):

Auf diesem DNA-Synthesizer wurden alle Homo-deoxy-7-carbaadenosin

enthaltenden Oligonucleotide, sowie die Allopyranose-NA Oligonucleotide

hergestellt. Es wurden 0.1 M Phosphoramiditlösungen in CH3CN hergestellt [52].

Auch für diesen Synthesizer wurde das Syntheseprotokoll dahingehend

abgewandelt, dass man die Kopplungszeit auf 6 Min. erhöhte (vgl. nachfolgende

Tabelle 'Synthese des DNA-Synthesizer Gene Assembler Plus').

Die Kopplungsausbeuten lagen für Phosphoramidite von Homo-deoxy-7-

carbaadenosin und Allopyranosyl-guanin um 96% und für Allopyranosyl-

isoguanin zwischen 90 und 95%. Auch beim Pharmacia Synthesizer Modell

wurde jeweils eine Enddetritylierung noch vor der Ablösung des Oligonucleotids

von der Festphase durchgeführt.


Syntheseprotokoll des DNA-Synthesizer Gene Assembler Plus (Pharmacia):

Zeitdauer Reagens, das durch die Festphase in

der Kartusche durchgespült wird

Fluss

[ml/min.]

1.0 min. 1,2-Dichlorethan 2.5

2.9 min. 3% Trichloressigsäure

in 1,2-Dichlorethan

2.5

2.0 min. 1,2-Dichlorethan 2.5

0.2 min. CH3CN 2.5

zwei Mal

0.1 min.

0.1 min.

0.1 min.

0.5 M Tetrazollsg. in CH3CN

0.1 M Phosphoramiditlsg. in CH3CN

0.5 M Tetrazollsg. in CH3CN

0.9

0.8

0.9

6.0 min Spülen des Tetrazol/Phosphor-

amiditgemischs durdi die Kartusche

2.5

vier Mal

0.1 min.

0.1 min.

6% DMAP in CH3CN

20% v/v CH3CN:Ac20:sym. Collidin =

50:20:30

1.0

1.0

0.3 min. CH3CN 2.5

0.3 min. 0.01 M I2 in 260 ml CH3CN, 120 ml

H20, 24 ml sym. Collidin

2.5

0.5 min. CH3CN 2.5

Für den nächsten Synthesezyklus wieder bei der ersten

Zeile beginnen

Die Homo-DNA Oligonucleotide und die Allopyranosyl-NA Oligonucleotide

wurden nach erfolgter Synthese auf verschiedene Art weiterbehandelt:

- a) Homo-DNA Oligonucleotide:wurden jeweils für 14 Std. bei 55°C in konz. Ammoniak vom Träger

abgespalten und dabei gleichzeitig von den Schutzgruppen der Nucleobasen und

der Phosphate befreit. Solcherart behandelte Oligonucleotide wurden mittels

HPLC von den Fehlsequenzen bis zu einer geschätzten Reinheit von >97%

abgetrennt. Nach Entsalzen HPLC-gereinigter Oligonucleotide über SEP-PAK

standen die hergestellten Oligonucleotide für weitere Messungen zur Verfügung.


Fertig synthetisiertes n-mer

Oligonucleotid nach

(n -1) -SynthesezyklenDMTO

*N(i-PR)2 +11EqTetrazol

2.9 min

Detrltyllerung(3% Tnchloressigsaure

1,2-Dichlorethan)

Capplng(3% DMAP

10%Ac2O

CH3CN/

sym Collidin)

.8 min.

Oxldatlon

(0.01 Ml2

CH3CN/sym. Coliidin/H20)

DMTO-

Starteinheit (4'-Ende) des

zu synthetisierenden n-mer

Abb. C3.1: Schematische Uebersicht über die Oligonucleotid-Festphasensynthese auf dem

Gene Assembler Plus (entspricht, mit Ausnahme der Zeiten und der Reagenzien¬

zusammensetzung, dem Prinzip des ABI 380 A) nach Caruthers [31] und Letsinger [32].


- b) Entschützung Guanin oder Isoguanin enthaltender Allopyranosyl-NA

Oligonucleotide:Von Oligonucleotiden, die Isoguanin enthalten, wurden zuerst die Allyl-

schutzgruppen in Anlehnung an Noyori und Mitarbeiter [53] noch am Träger

Palladium(0)-katalytisch entfernt1. Darauf wurde das derart entschützte, immer

noch kovalent an das Trägermaterial gebundene Oligonucleotid für 14 Std. bei

55°C in konz. wässrigem Ammoniak suspendiert. Dabei wurde das

Oligonucleotid von der Festphase gelöst und die restlichen Basen- und

Phosphatschutzgruppen abgespalten. Die so behandelten Oligonucleotidewurden HPL-chromatographisch aufgetrennt. Zur Entfernung der Ketalschutz-

gruppe wurden diese Oligonucleotide in HCl - Lösung bei pH 2.0 gelöst und so

lange bei 55°C belassen, bis ein Optimum zwischen Zersetzungsprodukt und

noch nicht vollständig entschütztem Oligonucleotid eingetreten ist (HPLC -

Kontrolle), was bei jedem Oligonucleotid unterschiedlich lange dauert (vgl.

nachfolgende Tabelle).

Oligonucleotidsequenz Zeitdauer der Entschützung;

pH2.0,55°C

allo(I6) 13 Std.

allo(I8) 16 Std.

aIlo(G4I4) 4.5 Std.

allo(GI)4 5.0 Std.

allo(GGIGII) 4.0 Std.

allo(IIGIGG) 4.0 Std.

Zur Beendigung der Ketalspaltung wurde jeweils ein Ueberschuss an festem

NaHC03 zugegeben und das entsprechende, nunmehr von sämtlichen

Schutzgruppen befreite Oligonucleotid HPL-chromatographisch abgetrennt

(Tabelle Kapitel D.10, Fussnote2 gibt jeweils die Bedingungen für die Trennung

der Oligonucleotide nach der Ketalabspaltung an, während die Bedingungen für

1Bei Allose-NA Oligonucleotiden hat es sich als sehr vorteilhaft erwiesen, die DMT-Schutzgruppedes zuletzt an das Oligonucleotid gekoppelten Nucleotids erst nach Ablösung vom Trägerabzuspalten, was die Abtrennung der kürzeren Oligonucleotide stark vereinfachte. Bei

AUopyranosyl-isoguanin enthaltenden Oligonucleotiden war es jedoch nicht möglich, diese DMT-

Gruppe am Oligonucleotid zu belassen, da sie, wie in einem Vorversuch unter Allylent-schützungsbedingungen gezeigt werden konnte, vermutlich infolge der Reaktionstemperatur nicht

stabil war.


die Trennung vor der Ketalspaltung unter der Fussnote1 in derselben Tabelle

angegeben sind). Die produkthaltigen Fraktionen wurden über SEP-PAK entsalzt.

Die Abspaltung der Isopropylidenschutzgruppe der 2',3'-Hydroxygruppen am

Oligonucleotid unter sauren Bedingungen wird am Beispiel von allo(I8)

illustriert (vgl. Abb. C3.2). Der Gradient auf einer Aquapore RP-300, 7 uM war,

mit Ausnahme des Chromatogramms nach 16 Std. (Gradient 0 - 25% B in 30

Min.) bei allen folgenden Chromatogrammen derselbe,nämlich 0 - 30% B in 30

Min.1. Die aufgetragene Menge Oligonucleotid war in jedem Chromatogramm

gleich gross. Die Chromatogramme können also direkt miteinander verglichen

werden.

Es wurden jeweils Proben der Reaktionslösung nach 0 (Edukt), 15 und 30

Minuten, nach 1, 2, 4, 8, und 16 Stunden entnommen und analysiert (Abb. C3.2).

Mit Fortgang der Reaktion ist eine deutliche Zunahme der polareren

Zwischenprodukte zu erkennen, welche partiell entschützten Zwischenpro¬

dukten entsprechen dürften.

Nach zwei Stunden Reaktionszeit bemerkte man schon deutlich den

Produktpeak mit einer Retentionszeit von 13.4 Min. Dessen Intensität nahm mit

der Reaktionsdauer immer mehr zu, während diejenigen der apolaren

Zwischenprodukte immer kleiner wurden. Nach 16 Stunden waren schon erste

Zersetzungsprodukte von allods) (vermutlich Depurinisierungsprodukte) zu

erkennen.

1Laufmittel für die HPL-Chromatographie:- A: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0, H20- B: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0,20% H20,80% CH3CN.


r¥-

Wl

—i——i—i—i i—

10 20 30 40 in*n

0 10 20 10 40 min

r-»tI ' I ' 1 • I ' 1 '

0 10 20 30 40 min

, . , 1 1 . , r—

0 10 20 30 40 r

r-Y-

0 10 20 30 40 r

10 20 30 40 II

Waschsignal

Abb. C3.2: Abspaltung der 2,/3,-0-Isopropylidenschutzgruppen von allott,) bei pH 2.0 und 55°C


Ein 'Time of Flight'-Massenspektrum1 von allo(I8) mit einer Molmasse des

Monoanions von 2937.5 zeigte eine gemessene Masse von 2932.2 (Abb. C3.3). Die

Abweichung von 5 Masseneinheiten vom berechneten Wert rührt daher, dass

zur Probelösung für dieses Experiment kein Eichgemisch (ein Proteingemisch

aus: Hypertensin M - H+: 1030.2; Synacthen (2932.5); Calcithonin (3416.9); Hirudin

(6962.5)) zugegeben werden konnte. Es mussten deshalb die Kalibrierungsdaten

eines vorangegangenen Experiments übernommen werden. Dieses

Massenspektrum zusammen mit der HPL-Chromatographie zeigte, dass der

gewählte Syntheseweg für Isoguanin-haltige Allopyranosyl-NA Oligonucleotidedurchführbar ist und alle Schutzgruppen vollständig abgespalten werden.

Intensität

-35 0M

CS allo(I8)

-30 0 N

-25 0 l

-200

-15 0

.OS ©

I Ot

-10 0 /

_ SO^^^W^w-v^vJK^

2500 3000 3400

m/z

Abb. C3.3: Time of Flight'-Massenspektrum von allouV, Detektion: negative Polarität.

Dieses Experiment wurde freundlicherweise durch Dr. Schär von der Ciba-Geigy AG ausgeführt.

-41- allgemeiner Teil

C.4 Das Paarungsverhalten der

Homo-DNA

C.4.1 Einführung in die Methodik der DNA

Untersuchung

Zur Untersuchung über das Paarungs- oder Assoziationsverhalten von

Oligonucleotiden wurden verschiedene physikalisch-chemische Methoden

verwendet, die sich schon seit längerem in der DNA-Analytik etabliert hatten.

Das wichtigste in unserer Gruppe verwendete Hilfmittel war die Messung der

Absorption des Oligonucleotids in einer wässrigen Lösung (üblicherweise 150

mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1-150 uM an Oligonucleotid) als Funktion der

Temperatur bei konstanter, geeigneter Wellenlänge. Das Lösen einer DNA-

Paarung entspricht im allgemeinen einem kooperativen Prozess, verbunden mit

einer Aenderung der molaren Extinktion des Oligonucleotids. Wenn nun die

Absorptionen als Funktion der Temperatur aufgetragen wird, ergibt sich dabei

eine charakteristische, sigmaoide Kurvenform. Nichtpaarende Oligomere zeigen,

je nach Sequenz und Nucleotidbasenart, eine lineare Zu- oder Abnahme der

Absorption1. Diese lineare Aenderung der molaren Extinktion wird verursacht

durch das Aufheben einer gering geordneten räumlichen Struktur, wie sie

beispielsweise durch Basenstapelungswirkungen benachbarter aromatischer

Systeme verursacht werden [54]2, [44].

Die typische sigmaoide Form der Schmelzkurve in DNA - Duplexen wird auf

die diskontinuierliche Entordnung der Nucleobasen zueinander während des

Schmelzprozesses und dem damit einhergehenden 'destacking' der Basen

zurückgeführt [56], [57]. Dieses 'destacking' führt wie bei den nichtpaarenden

Oligomeren zu einer, diesmal aber - wie schon erwähnt - diskontinuierlichen

Zunahme der Absorption.

1 Nimmt die Absorption der Lösung zu, spricht man von einer Hyperchromie, nimmt sie hingegen ab,von einer Hypochromie.2 In dieser Literaturstelle wird auch eine kurze, theoretische Herleitung über die Absorptions¬änderung beim Uebergang vom Doppel- zum Einzelstrang gegeben.


Temperatur¬erhöhung

denaturieren

Helix, geordnet,Basen gestapelt

Coil (Knäuel),

ungeordnet, nicht

gestapelt

Abb. C4.1: Schematische Darstellung des Schmelzprozesses. Die ungeordnete Anordnung

(Einzelstrang) entspricht dem Zustand in 'geschmolzenem' Zustand, in dem keine

Beinflussung der n-Systeme von benachbarten Basen ('base stacking') mehr stattfindet.

Um ein deutlicheres Bild über den Dissoziationsprozess zu erhalten und um

relative, miteinander vergleichbare Werte zu erhalten, wurde nicht die

Absorption, sondern die relative, prozentuale Hyperchromizität (in einigen

wenigen Fällen die Hypochromizität so z.B. für alle Gl-gepaarten Oligonucleotide

der Homo-DNA Reihe1) verwendet.

Hyperchromizität:

% H(T) = 100%{D(T)-D°

D°

Dabei ist D° der minimalste Absorptionswert im Laufe eines Schmelz- oder

Hybridisierungsexperiments [54, Seite 22], [55, Seit 409].

Die sogenannte Schmelztemperatur Tm-Wert ist definiert als diejenige

Temperatur, bei der die Hälfte der totalen Menge Oligonucleotid gepaart und die

andere Hälfte ungepaart vorliegt. Im Hyperchromizität vs. Temperatur -

Diagramm ist sie bestimmt als die Temperatur, bei der die Absorption genau

1 Für alle Oligonucleotide und Oligonucleotidgemische gilt, dass ihre Absorption im allgemeinenwährend des Schmelzens steigt. Wenn aber im temperaturabhängigen UV mindestens ein

isosbestischer Punkt vorkommt, wie er z.B. bei allen (GD-Oligonucleotiden auftritt, so muss gelten,dass die Absorption in gewissen Wellenlängenbereichen während des Schmelzprozesses abnimmt.


zwischen der Maximal- und der Minimalabsorption der Oligonucleotidlösung

liegt (Abb. C4.2) [58]. Bei asymmetrischen Schmelzkurven wurde die

Schmelztemperatur als Schnittpunkt der Winkelhalbierenden der beiden

Tangenten der Schmelzkurve mit der Schmelzkurve bestimmt (Abb. C4.2).

Winkel

halt

ITC] ITC]

Abb. C4.2: Graphische Bestimmung des Schmelzpunktes. Die gestrichelten Linien sind die

Tangenten an die Schmelzkurven (dicke, geschwungen Kurven) im Hyperchromizität vs.

Temperatur - Diagramm.

Die eben angegebene Variante konnte sehr gut bei erkennbaren Basislinien

angewendet werden. Tm-Werte von Schmelzkurven mit nicht eindeutigeruierbaren Basislinien (z.B. Schmelzkurven, die sich schon im Schmelzbereich

befinden) wurden durch die Bestimmung des Wendepunktes eines durch die

Messpunkte gelegten Polynoms 9. Grades mathematisch berechnet1. Der Wende¬

punkt einer idealen sigmaoiden Funktion entspricht genau dem Punkt bei je

50% des Einzelstranges in gepaartem und ungepaartem Zustand, also genau dem

Schmelzpunkt. Dieses Verfahrens wurde ausschliesslich für die Sequenzenallo(GGIGII) und allo(IIGIGG) verwendet.

Die erste Methode Hess sich auch uneingeschränkt auf Oligonucleotide der

Homo-DNA und der Allopyranose-NA Reihen übertragen. Sie lieferte in

reproduzierbarer Art Tm-Werte und thermodynamische Daten der Duplex-

bildung.

1 Dieses Prozedere wurde mit Hilfe des Programmes Passage© (David Guenther & Chris Tigges,1987) auf einem MacintoshO-Computer durchgeführt.


Die Bestimmung der thermodynamischen Daten AH, AS, und AG einer Paarung

lässt sich nach Marky & Breslauer [58] und [59] auf drei prinzipiell verschiedene

Arten aus der Analyse der Schmelzkurven durchführen:

© Man benutzt nur eine Schmelzkurve und normiert diese derart, dass dem

Minimalwert 0 und dem Maximalwert 1 zugeordnet wird.

a Ist der Anteil des

Einzelstranges

Abb. C4.3: Bestimmung des Molenbruchs des Einzelstranges aus einer Schmelzkurve bei

einer bestimmten Temperatur.

Die van't Hoffsehe Schmelzenthalpie ist dann gegeben durch (Herleitung vgl.[59]):

AHvh(T)=6RT2Üy1

AHVH(T)=4RT2f|Yl

für nicht selbstkomplementäre Sequenzen

für selbstkomplementäre Sequenzen

R ist die universelle Gaskonstante (R = 1.9872 cal • K-1 • moF)

Bei der Schmelztemperatur gilt für selbstkomplementäre Sequenzen:

AHVH(Tm) = 4 RT2^L


Der Ausdruck in Klammern ist nichts anderes als die Steigung der Tangente bei

der Schmelztemperatur an die normierte Schmelzkurve, was gleichbedeutendmit dem Wert der Ableitung bei der Schmelztemperatur ist (Abb. C4.4).

Tangente an die normierte

Schmelzkurve bei der

Schmelztemperatur Tm

Abb. C4.4: Bestimmung der van't Hoffsehen Schmelzenthalpie aus

der Steigung der Tangente an die Schmelzkurve beim Schmelzpunkt.

Die Berechnung von AS erfolgt über die Berechnung von AG.

Zur Berechnung von AS wird angenommen, dass die van't Hoff'sche

Schmelzenthalpie AHvh temperaturunabhängig ist.

Zuerst muss über die Gleichgewichtskonstante bei einer festgesetzten

Temperatur (meist 298 K) die Gibbs - freie Enthalpie berechnet werden.

logK(Tm)

logK298

AHVH

2.3 •R 1,298 lm)

Dabei ist:

K(Tm):a/2

(l-a)2-Crfür selbstkomplementäre

Oligonucleotidsequenzen


2aK(Tm) = : für nicht selbstkomplementäre

(l-a)2-CT

Oligonucleotidsequenzen

a = ist der Molenbruch des Einzelstranges (bei Tm ist er definiert als 0.5, vgl. Abb.

C4.3)

er = Totalkonzentration an Oligonucleotid

Der Wert Keq(298 K) der nach der ersten Gleichung berechnet wurde, wird in

AG = -RTln(Keq)

eingesetzt. Man erhält AG0 (298 K) und daraus AS° (T = 298 K einsetzen) nach:

AG(298K) = AH-TAS

@ Eine zweite Möglichkeit zur Ermittlung der van't Hoff'schen

Schmelzenthalpie mit nur einer Schmelzkurve erhält man auch aus der

Ableitung der auf 1 normierten Schmelzkurve. Durch Einsetzen der

Temperaturen T1/4 und T3/4 (vgl. Abb. C4.5) bei der Halbwertsbreite des Peaks

dieser Ableitung in die nachfolgende Gleichung erhält man AHvh für den

Schmelzprozess.AS lässt sich in Anlehnung an die erste Methode berechnen. Diese beiden

Methoden haben den Nachteil, dass eigentlich eine Basislinienkorrektur für den

Effekt, den die Temperaturerhöhung auf das Einzelstrangoligonucleotid ausübt,

durchgeführt werden müsste, um zu relevanten Daten zu gelangen. Für eine

erste Abschätzung geben diese Daten doch schon einigen Aufschluss. Ohne

Basislinienkorrektur kann ein Fehler von = 20 % auftreten [58].

3.2AHvh = -

TTTf—TT/f—) für selbstkomplementäre Sequenzen

4.37AHvh = -

TT/t—. 1 ij—\ für nicht selbstkomplementäre Sequenzen


1. Ableitung der

normierten

Schmelzkurve

(It)v 3T 'max

(ff)

r m

max

t

1 /4 3/4

Abb. C4.5: Die Bestimmung der Werte T,/4 und T3/«.

® Eine dritte Möglichkeit, um von Schmelzkurven zu thermodynamischenDaten eines Schmelzprozesses zu gelangen, ergibt sich aus der Konzentrations¬

abhängigkeit der Schmelztemperatur von der Oligonucleotidkonzentration bei

sonst gleichen Messbedingungen.Die Abhängigkeit lautet (detailierte mathematische Herleitung in [59]:

T"1 =

R-(n-l)

AH -ln(c) + (AS-(n-l) -R -ln(2) + R -ln(n)) • AH"'

wobei gilt:

Tm = Schmelztemperatur [°K]

c = Oligonucleotidkonzentration [moH]

n = Ordnung des Schmelzprozesses

Erklärung der Ordnung des Schmelzprozesses n:

{d(A)m}2^2d(A)m

d(A)mxd(T)m <+ d(A)m + d(T)m

2xd(A)mxd(T)m <-> d(A)mxd(T)m + d(T)n

2xd(A)mxd(T)m «-» 2 d(A)m + d(T)m

{d(A)mxd(T)m}2 <"> 2 d(A)m + 2 d(T)m

n = 2 (selbstkomplementär)

n = 2 (nicht selbstkomplementär)n = 2

n = 3

n = 4

- 48 - allgemeiner Teil

1/T [K]

Achsenabschnitt = {AS-(n-1)-R-ln(2) + R-In(n)}-AH"1

(für selbstkomplementäre Sequenzen)

>v Steigung = R-(n-1)-AH"1

1In c

Abb. C4.6: Bestimmung der thermodynamischen Parameter nach der Methode der

konzentrationsabhängigen Schmelztemperaturen nach Marky & Breslauer [59].

Die Auftragung der reziproken Schmelztemperaturen gegen den natürlichen

Logarithmus der Oligonucleotidkonzentration liefert aus der Steigung die van't

Hoff'sche Schmelzenthalpie und aus dem Achsenabschnitt die Schmelzentropie

(vgl. Abb.C4.6). Die Gibbs-freie Enthalpie lässt sich dann sehr leicht berechnen:

AG(T)=AH-TAS

Eine modellunabhängige Auswertung der thermodynamischen Parameter für

die Duplexierung ergibt sich durch Differential Scanning Calorimetry (DSC). Die

Theorie zu dieser Methode wird von Breslauer in [58] gegeben. Das Integral der

Funktion in einem cp vs. T Diagramm liefert AHcai (cal = calorimetrisch

bestimmt). Eine Auftragung der molaren Wärmekapazität, dividiert durch die

jeweilige Temperatur, gegen die Temperatur aufgetragen (cp/T vs. T Diagramm),liefert als Fläche unter der Kurve die molare Entropie des Schmelzvorganges

ASca].

Zur Bestimmung des stöchiometrischen Verhältnisses zweier verschiedener

miteinander paarenden Oligonucleotide kann ein sogenanntes 'mixing curve'

Experiment durchgeführt werden. Dabei wird das Verhältnis der zwei

Oligonucleotidsequenzen zueinander bei gleichbleibender Oligonucleotidtotal-


konzentration variiert1. Darauf wird bei konstanter Temperatur (unterhalb der

Schmelztemperatur des DNA-Komplexes) die Absorption bei einer geeigneten

Wellenlänge gemessen. Die Auftragung der Absorption gegen den Molenbruch

führt dann zu einem leicht interpretierbaren Diagramm (vgl. Abb. C4.7). Anhand

des erhaltenen Diagramms kann ein 1 : 1 von einem 2 : 1, 1 : 2 oder anderen

relativen Verhältnissen unterschieden werden. Eine ausführliche Beschreibungdieser Methode findet sich in [55 (Seite 1135)]. Mit einem 'mixing curve'

Experiment alleine lässt sich allerdings ein stöchiometrisches Verhältnis nicht

definitiv belegen. Ein Vielfaches des gefundenen Verhältnisses (z B. 2 : 2 anstelle

von 1 : 1) kann nicht ausgeschlossen werden. Die Bestimmung der thermodyna¬mischen Daten mittels konzentrationsabhangigen Schmelztemperaturen und

einem DSC-Experiment liefert, zusammen mit einer 'mixing curve', einen

vollständigen Datensatz, mit dem eindeutig ein stöchiometrisches Verhältnis

eines DNA-Komplexes bestimmt werden kann.

Absorption Absorption Absorption

0 100 0 50 100 0 50 67 100% A

100 0 100 50 0 100 50 33 0% B

Abb C4 7: Das Diagramm links zeigt den Kurvenverlauf, wenn keine Interaktion der beiden

Oligonucleotide A und B eintritt. Im mittleren Diagramm ist das Absorptionsverhalten für

einen 1. 1 Paarungskomplex aufgezeichnet Das Diagramm rechts repräsentiert das Absorp¬

tionsverhalten von zwei Oligonucletiden, die nur einen 1 2 Komplex (gestrichelte Linie)

sowie für ein System von zwei Oligonucleotiden, die sowohl einen 1 .1 Komplex sowie durch

Anlagerung eines weiteren Oligonucleobdstrangs an den entstandenen Duplex noch einen 1 2

Triplex ausbilden (ausgezogene Linie; z B AU2 > AU + U>A + 2Uim Fall von poly A mit

polyU[61])

* Die einfachste und genaueste Methode dazu besteht dann, dass man von jedem Oligonucleotid eine

Stammlosung mit der exakt gleichen Konzentration an Oligonucleotid herstellt und deren

Verhältnis zueinander durch verschiedene Volumenanteile variiert


Eine weitere Methode zur Charakterisierung von Oligonucleotiden ergibt sich

aus deren CD-Spektren. Einerseits besteht in der Aufnahme von CD-Spektren bei

verschiedenen Temperaturen eine ergänzende UV-spektroskopische Methode

zur Bestimmung der Schmelztemperatur (Breslauer verwendet häufig eine

temperaturabhängige Messung der molaren Eliptizität bei einer bestimmten,

konstanten Wellenlänge so z.B. in [60]). Anderseits ist die CD-Spektroskopie eine

empfindliche Sonde für lokale Aenderungen der Konformation oder

Konfiguration eines Oligonucleotids. So konnte in natürlicher DNA leicht

zwischen A-, B-, C- und Z-Konformationstypen der DNA mittels CD-Spektros¬

kopie unterschieden werden. Theoretische Herleitungen des CD-Effektes von

Nudeosiden, Nudeotiden und Oligonudeotiden finden sidi in [54], [55], [62], [63].

Als weiteren qualitativen Hinweis über eine Paarung wurde auch die nicht

denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) verwendet [64].

C.4.2Die AT-Paarung

C.4.2.1 Einleitende Bemerkungen

Roth [21] gelangte beim Versuch dd(A6) mit dd(Vt) zu paaren, zur

überraschenden Feststellung, dass in der Homo-DNA Reihe eine starke AA-

Paarung existiert. Diese wurde in der Folge von Böhringer [18] weiter untersucht.

Roth [21] fand weiter, dass ein monobasiger AA-gepaarter Homo-DNA Duplexauch nicht durch ein monobasiges Homothymidinoligonucleotid derselben

Länge gebrochen werden kann.

Dieser Befund konnte mit folgenden Experimenten bewiesen werden:

- Die mathematische Summe der Hyperchromizitäten der Schmelzkurve der

Komponenten dd(T6) und {dd(A6))2 entspricht genau der gemessenen

Hyperchromizität der 1 :1 Mischung von dd(A6> + ddO"6)- Dabei entsprachdie Schmelztemperatur von {dd(A6)}2 derjenigen Schmelztemperatur von

dd(As) + dd(T6).

- Das CD Spektrum von {dd(Ai0)}z entspricht demjenigen von dd(Ai0) + dd(T10).


Wir stellten uns nach diesen Ergebnissen die Frage ob denn in der Homo-DNA

eine AT-Paarung nach dem Komplementaritätsprinzip der natürlichen DNA

überhaupt existiert. Vorversuche mit dd(AU)„ von Leumann [20] und Goebel [65]

zeigten, dass solche Oligonucleotide auf Grund ihrer Schmelztemperatur und

Hyperchromizität eine andere Paarung als die bisher beobachteten AA-

Paarungen nahelegen. Diese Resultate waren Anlass zu einer systematischen

Untersuchung von alternierenden Homo-deoxy-(AT)- und Homo-deoxy-(AU)-

Oligonucleotidsequenzen.

C.4.2.2 Alternierende AT-Sequenzen von Homo-DNA

Zur Untersuchung der Eigenschaften der alternierenden Oligonucleotide des

Typs dd(AT)„ (n = 3 - 6) wurden diese hergestellt und gereinigt.

Die UV-Schmelzkurven von solchen Oligonucleotiden zeigen ausnahmslos

einen sigmaoiden Kurvenverlauf. Mit zunehmender Sequenzlänge nimmt die

Schmelztemperatur zu (dokumentiert in Abb. C4.8).

dd(AT)n% Hyperchromizität

30

dd(AT)6 68°C

dd(AT)5 58°C

dd(AT)4 45°C

dd(AT)3 28°C

-i——i——i—•—i——i——i——i

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.8: Schmelzkurven von alternierenden Homo-(AT)n Oligonucleotidsequenzen

unterschiedlicher Länge, alle in einem Puffer aus 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl,

pH 7.0 bei 260 nm gemessen. dd(AT)3: 28°C (115 uM, 20% Hyp.); dd(AT)4:45°C (102

uM, 24% Hyp.); dd(AT>5:58°C (92 pM, 24% Hyp.); dd(AT),: 68°C (85 uM, 25% Hyp.).


Die Schmelztemperaturen nehmen bei allen hier untersuchten Oligonucleo¬tiden mit zunehmender Oligonucleotidkonzentration zu, was zeigt, dass es sich

nicht etwa um intramolekulare Basenpaarungen, sondern um intermolekulare

Duplexe handelt

Solche alternierende AT-Ohgonucleotide gehen immer eine AT-Basenpaarung

ein, die sich in der temperaturabhangigen UV-Absorptionsmessung durch eine

im Vergleich zur AA-Paarung deutlich erhöhte Hyperchromizität äussert (AA-

Paarung = 8%, AT-Paarung =23%)

Die Bestimmung der thermodynamischen Daten zur weiteren

Charakterisierung der (AT)-Ohgonucleotide wurden im Fall von dd(AT)g nach

Marky & Breslauer [59] durchgeführt (Methode ® in Kapitel C 4 1) Aus der

linearen Beziehung der reziproken Schmelztemperatur und dem naturlichen

Logarithmus der Oligonucleotidemzelstrangkonzentration konnte AHvh und

ASvh bestimmt werden (Abb C410)

dd(AT)6% Hyperchromizität

30 -i

25-

20-

15-

10-

5-

.>*!*

•i•«.

40uM

93uM

.36uM

•85uM

ffl.^V/f *

, , , , I—I—I——I—I—I—I—I

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb C4 9 Vier der neun Schmelzkurven von dd(AT)6, die zur Bestimmung der thermodynamischen

Daten des Schmelzprozesses nach Breslauer [67] benutzt wurden dd(AT)(: 1 8 uM 54 2°C, 4 0 uM

560°C, 52 uM 582°C, 93 uM 593°C, 95 uM 59 4°C, 132 uM 602°C, 364 ^M 64 5°C, 528 p.M

66 6°C, 85 uM 67 5°C Alle Messungen wurden im Standardpuffer (150 mM NaCl, lOmM Tns HCl,

pH 7 0 bei 260 nm mit einer Aufheizrate von 1 0°C/min durchgeführt


1/T [K]

3.04e-3 -

l^«w

3.00O-3 -

2.96e-3 -

BS.

-14.0 -13.0

1 '

-12.0 -11.0

1 '

-10.0 -9.0ln(c)

y = - 3.2984 10-5 • x+ 2.6233 10"3 R2 = 0.987

Abb. C.4.10: Auftragung des natürlichen Logarithmus der Oligonucleotidkonzentration

gegen die reziproke Schmelztemperatur zur Bestimmung der thermodynamischen Daten

anhand der linearen Regression (unterhalb der Grafik angegeben), die durch die

Messpunkte definiert ist.

Tabelle 1

AH°VH

[kcal mol"1]

AS°

[cal mol"1 K"1]

TAS°(298K)

[kcal mol*1]

AG° (298 K)

[kcal mol"1]

dd(A6)1 -39.4 -101 -30.2 -9.2

dd(AT)6 -60.2 -158 -17.1 -13.1

dd(AU)6 -51.2 -138 -41.1 -10.1

d(AT)6 -65.2 -200 -59.7 -5.5

d(AU)6 -52.5 -158 -46.9 -5.6

Die mittlere Duplexierungsenthalpie pro AT-Basenpaarwechselwirkung (AA:

39.4/5 = 7.9; AT: 60.2 /ll = 5.5) ist dabei deutlich schwächer als diejenige der AA-

Paarung. Die grössere Stabilität der AA-Paarung ist also im wesentlichen vom

Unterschied der Paarungsenthalpie abhängig. Wir schliessen daraus, dass die AT-

Paarung schwächer als die AA-Paarung ist2.

*Die thermodynamischen Daten für dd(A«) wurden von M. Böhringer bestimmt [18].2Die thermodynamischen Daten der AT-Dodecamerduplexe sind weitere Hinweise dafür, dass es

sich wirklich um einen AT-gepaarten Duplex und nicht etwa um einen AA-gepaarten Duplex mit

intermittierenden Homo-T-Nucleosiden handelt. Im Fall einer AA-Paarung (6 AA-Basenpaare im

Dodecamer dd(AU)6) würde man erwarten, dass die entsprechende Paarungsenthalpie des


Zum Zweck eines Vergleichs der AT-Paarung in Homo-DNA mit derjenigen in

natürlicher DNA wurden die analogen alternierenden d(AT)„ (n = 3 - 6)

hergestellt und deren Paarungseigenschaften untersucht (Abb. C4.ll).

d(AT)n% Hyperchromizität

50-i

40-^—— d(AT)6 28°C

d(ATk 23°C

30- Z»~~~—d(AT)4 17°C

20-

10-^,—~d(AT)3 --°C

0 10 20 30 40 50 60 70

i i i

80 90 100°C

Abb. C4.11:Schmelzkurven von alternierenden Deoxy-(AT)-Oligonucleotiden mit unterschiedlicher

Länge. Alle Schmelzexperimente wurden in einem Puffer aus 150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7.0

durchgeführt und die Absorption bei 260 nm gemessen. d(AT)3: - °C (58 uM, -% Hyp.); d(AT)4:17°C

(127 UM, 25% Hyp.); d(AT)5:23°C (83 uM, 30% Hyp.); d(AT>6 (45 uM, 35 % Hyp.).

Die zwei Schmelzkurven in Abb. C4.12 illustrieren deutlich die Unterschiede

und Gemeinsamkeiten der AT-Paarung von Homo-DNA und DNA. Beide

Kurven zeigen eine grosse Hyperchromizität von 25 % (Homo-DNA) resp. 35 %

(DNA). Beide besitzen, wie ein Vergleich mit anderen Oligonucleotidsequenzen

zeigt, eine sehr breite, relativ flach ansteigende Schmelzkurve.

Dodecamers nicht etwa (betragsmässig) grösser, sondern eher kleiner wäre als im dd(A6)-Dup!ex(ebenfalls 6 AA-Paarungen). Vergleiche hierzu die Erfahrungen aus alternierenden Homo-(TG)-

Oligomeren (Hunziker [22]).


d(AT)6 - dd(AT)6% Hyperchromizität

40-

30

20

10

d(AT)6 4.0 uM

-*-r *t—i—i i i i i—i i i—i— i

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb.C4.12: Vergleich der AT-Paarung eines Homo-DNA und eines DNA

Dodecamers bei gleichen Messbedingungen: dd(AT)(: 56°C (4.0 uM, 25% Hyp.);

d(AT)4: (35 pM, 35% Hyp.) (150 mM NaCl, 10 mM Tris • HO, pH 7.0,260 nm).

Zum Vergleich der Natur der Paarung der Oligonucleotide wurden die thermo¬

dynamischen Daten von d(AT)6 wie im Fall des Homo-DNA Oligonucleotids

dd(AT>6 bestimmt.

Dieser Vergleich der thermodynamischen Daten (Tabelle 1, Seite 53) der beiden

Duplexe zeigt eindeutig, dass die stärkere Paarung in einem Homo-DNA

Oligomer gegenüber einem DNA Oligomer auf eine betragsmässig deutlich

geringere Entropieänderung zurückzuführen ist.

Dies ist ein deutlicher Hinweis auf einen höheren Präorganisationsgrad des

Homo-DNA Einzelstranges zur Duplexierung, was sich empirisch auf die höhere

konformationelle Stabilität des Pyranosesessels von Homo-DNA im Vergleich

zum konformationell flexibleren Furanosefünfrings zurückführen lässt.

C.4.3Die AU-Paarung

Erste Paarungsuntersuchungen von Adenin und Uracil enthaltenden Homo-

DNA-Oligonucleotiden wurden von C. Leumann [20] und M. Goebel [65] mit

alternierenden Oligonucleotidsequenzen der allgemeinen Formel dd(AU)„ (n = 3


- 5) durchgeführt. Die Ergebnisse der UV-Schmelzkurven (Abb. C4.13) zeigen,

dass eine Assoziation dieser Oligonucleotide eingetreten sein muss. Die

Schmelzkurven der jeweiligen Oligonucleotidsequenzen zeigten einen

deutlichen kooperativen, sigmaoiden Verlauf, mit einer Schmelztemperatur, die

leicht unter den Werten von Homo-DNA-(AT)-01igonucleotiden liegen.Die Tatsache dass die Tm-Werte konzentrationsabhängig sind, lässt nur den

Schluss zu, dass es sich um intermolekulare Duplex-zu-Einzelstrang Uebergänge,

und nicht etwa um intramolekulare Schmelzprozesse (z.B. 'Hairpin' -

Bildungen) handelt.

Wie in der Reihe der natürlichen Nucleinsauren ist also auch Homo-DNA zu

einer Purin-Pyrimidin Adenin-Uracil Basenpaarung fähig.Es wurde erwartet, dass die Schmelztemperatur mit zunehmender Kettenlänge

des Oligonucleotids als Folge der grösseren Zahl möglicher Basenpaarungen

ansteigt, was aus Abbildung C4.13 eindeutig hervorgeht.

dd(AU)n% Hyperchromizität

20-*/• './.••

15-

10-

• •

. .«—

•i

*

•

*

dd(AU)3 20°C

dd(AU)4 32°C

-dd(AU)5 43°C

dd(AU)6 54°C

5-

••,••:•:••••0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.13: Die Schmelztemperatur von einem AU-gepaarten Duplex ist abhängig von

der Oligonucleoudlänge: dd(AU)3: 20°C (153 pM, 20% Hyp.); dd(AU)4: 32°C (97 pM,

20% Hyp.); dd<AU)„: 43°C, (78 uM, 20% Hyp.); dd(AU)6: 54°C (80 pM, 20% Hyp.). Alle

Schmelzkurven wurden in einem Puffer 150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7.0 bei 260

nm gemessen.

Die Zunahme je neue AU-Basenpaarung beträgt <• 5.5°C.


% Hyperchromizität25-

dd(AU)6

3.6 aM

7.1 uM

37 uM

78 uM

-i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.14: Einige der zur Bestimmung der thermodynamischen Daten von dd(AU)6

benutzten Schmelzkurven: 3.6 uM: 42.0°C; 4.5 pM: 42.4°C; 7.1 uM: 44.4; 37.2 uM:

51.1°C;78.1pM:54.1<>C.

Anhand des Dodecamers dd(AU>6 wurden die thermodynamischen Daten des

Duplex zu Einzelstrang Uebergangs aus den 1/Tm vs. ln(c) Wertepaaren analogder Bestimmung der entsprechenden Daten der dd(AT)6 und d(AT)6 Oligonuc¬leotiden nach Marky & Breslauer [59] bestimmt. Die Werte sind in Tabelle 1 (Seite

53) aufgelistet. Für die Reihe der Homo-(AU)-OHgnucleotide gilt als Hinweis auf

eine AU-Paarung (und nicht etwa eine AA-Paarung mit intermittierenden

Homo-U-Nucleosiden) genau dieselbe Begründung, wie sie auch für die Homo-

AT-Paarung in der Fussnote 2 in Kapitel C.4.2.2 gegeben wurde.

Man konnte darauf mit den alternierenden Homo-(AU)-Sequenzen einen

direkten Vergleich zu den Homo-(AT)-01igonucleotiden ziehen. Die Hyperchro¬

mizität der alternierenden Homo-(AU)-Oligonucleotide sind in etwa vergleich¬bar mit denjenigen der Homo-(AT)-01igonucleotide, die Schmelztemperaturender Homo-(AU)-OHgonucleotide liegen aber um etwa 15°C tiefer als die

entsprechenden Oligonucleotide der AT-Reihe (Abb. C4.19).


dd(AT)6 - dd(AU),% Hyperchromizität

25-

20-

15-

10-

5-

0-

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.15: Der direkte Vergleich zwischen dd(AU)« und dd(AT)6 zeigt, dass die

Schmelztemperatur von dd(AT)<, höher liegt, als diejenige von dd(AU)6. dd(AT)6:56°C (4.0 pM, 25%

Hyp.), dd(AU)6:40°C (4.0 pM, 20 % Hyp.).

Ein Vergleich der thermodynamischen Daten von dd(AU)6 und dd(AT)6 (vgl.Tabelle 1, Seite 53) zeigt deutlich, dass die Homo-(AU)-Paarung im Vergleich zur

Homo-(AT)-Paarung durch den betragsmässig kleineren Enthalpieterm eindeutig

weniger begünstigt ist.

Ein Vergleich der alternierenden AU-Oligonucleotide zwischen der Homo-

DNA und der DNA Serie führt zu ganz ähnlichen Unterschieden, wie sie sich

auch beim analogen Vergleich der AT-Oligonucleotide gezeigt hatten:

- Die Schmelztemperaturen der Homo-DNA Oligonucleotide liegen deutlich

über denjenigen der Deoxyribosereihe, die Hyperchromizität der

vollständigen Schmelzkurven der DNA Reihe ist aber deutlich höher als

diejenige der Homo-DNA Reihe (vgl. nachfolgende Tabelle).

- Die Gegenüberstellung der zwei vollständigen Schmelzkurven dd(AU)6 und

d(AU)6 (Abb. C4.20) zeigte auch die grosse Hyperchromizität von d(AU)n

Oligonucleotiden von etwa 35%, während dd(AU)„ Oligonucleotide eine

Hyperchromizität von deutlich unter 25 % aufweisen. Genau derselbe

Effekt wurde schon beim Vergleich von dd(AT)„ zu d(AT)n festgestellt

(Abb. C4.12).

.*^*Add(AT)6 4.0 uM

dd(AU)6 4.0 uM


% HyperchromizitätSO-

d(AU)6 - dd(AU)6

d(AU)6 25°C_

Abb. C4.16: Wie beim Vergleich der AT-Paarung zwischen Homo-DNA und

DNA, zeigen sich im Fall der AU-Paarung genau dieselben Unterschiede und

Gemeinsamkeiten (dd(AU)6: 52°C (37 pM, 20% Hyp.); d(AU)»: 25°C (35 uM, 35%

Hyp.).

dd(AU)„ d(AU)„

n = 3 20°C (153 uM, 20 % Hyp.) < 0°C (140 uM, -% Hyp.)

n = 4 32°C (97 uM, 20% Hyp.) < 5°C (100 uM, -% Hyp.)

n = 5 43°C (78 uM, 20% Hyp.) 16°C(47uM,30%Hyp.)

n = 6 52°C (38 uM, 20% Hyp.) 24°C (35 UM, 36% Hyp.)

Es ist bemerkenswert, dass eine Homo-DNA-(AU)-Paarung derart viel

schwächer ist als eine Homo-DNA-(AT)-Paarung. Wie man aus dem Vergleich

der thermodynamischen Daten der DNA Analogen d(AU)( und d(AT)6

feststellen kann, ist auch hier das gleiche Verhalten festzustellen (vgl. Tabelle 1,

Seite 53). Der Enthalpieterm der Duplexierung ist nämlich sowohl in der Homo-

DNA, wie auch in der DNA Reihe für AT-gepaarte Oligonucleotide

betragsmässig grösser. Dieser Effekt kann also nicht mit dem modifizierten

Zuckerbaustein alleine zusammenhängen. Es handelt sich eindeutig primär um

einen basenspezifischen Effekt.


Zur Frage nach dem Basenpaarungstypus von Homo-(AT)/(AU)-

Oligonucleotiden

Aus Experimenten von Roth [21] und Kapitel C.4.5.2 ist bekannt, dass Purin-

Pyrimidin gepaarte Duplexe eine antiparallele Strangorientierung aufweisen.

Aus NMR-Untersuchungen von dd(T6> ist bekannt, dass auch die Pyrimidinbase

anti zum Pyranosering steht1. Wenn wir diese Annahmen als vorgegeben

akzeptieren, so existieren nur noch zwei der vier verschiedenen in Abb. C4.17

skizzierten Möglichkeiten für einen AT-gepaarten Duplex. Die Möglichkeiten II

und III entfallen, da sie bei anti Orientierung der beiden glycosidischen Bindung

einen Duplex mit parallel orientierten Oligonucleotiden implizieren oder aber

die eine der beiden glycosidischen Bindungen muss im Duplex syn orientiert

sein, um zu einer antiparallelen Strangorientierung zu gelangen.

-, ,„--*X

R I^

ii

R/

v—N

V-N

R1 III

R-N N-o,

O H% HN^„

4 IV

Abb. C4.17

1 Bisher konnte noch in keinem der NMR-spektroskopisch untersuchten Homo-DNA Duplexe im

gepaarten Zustand eine anti Orientierung der nucleosidischen Bindung nachgewiesen werden.


Der Paarungstyp IV kann aufgrund der beobachteten Paarung von dd(7CHAs-A)

mit dd(T6) ausgeschlossen werden. Die für diesen Duplex (ddTCHA-T-Paarung)

gemessene Schmelztemperatur ist sehr gut mit derjenigen von d(AT)3

vergleichbar. Aufgrund einer eingehenden NMR-Analyse wurde gezeigt (Roth

[21]), dass im selbstkomplementären Duplex dd(A5T5) alle Basen in anti-

Konformation und Watson-Crick-artigen Paarung vorherrschen müssen. Wir

folgern daraus, dass alternierende Oligo-Homo-(AT) und -(AU) Sequenzen eine

Watson-Crick artige Paarung eingehen [23] (Abb. C4.18). Dies entspricht dem

ersten in Homo-DNA gefundenen Basenpaarungstyp nach natürlichem Muster.

„

Jt ,-»-Y^°"/,N-Tl VN O

^OH

^ Jl *'

ho rHO

Abb. C.4.18: Watson-Crick-artig verbrückte AU-Paarung mit

antiparalleler Orientierung der Oligonucleotidstränge .

C.4.4Die AC-Paarung

C.4.4.1 Altemierende (AC)/(CA)-Sequenzen von Homo-DNA

Aus Experimenten von gemischtbasigen Homo-DNA Sequenzen, die

Aufschluss über die Strangorientierung im Duplex und über Kreuzpaarung von

Homo-DNA mit DNA-Oligonucleotiden lieferten, stellte man fest, dass AC-

reiche Oligonucleotide Selbstpaarung zeigen (Kapitel C.4.5). Zur systematischen

Ueberprüfung der Existenz einer Paarung analog zu den Homo-(AU)- und

Homo-(AT)-01igonucleotiden, haben wir auch alternierende dd(AC)„ (n = 3 - 6)


sowie dd(CA)n (n = 3 - 6) hergestellt und die Paarungseigenschaften mittels UV-

Schmelzkurven und CD-Spektroskopie überprüft.

Die Tm-Werte von dd(AC)„ und dd(CA)„ Oligonucleotiden bewegten sich etwa

in derselben Grössenordnung (vgl. Abb. C4.19 und C4.20).

% Hyperc15-1

hromizität

dd(AC)n

10-

5-

0-

/"'** *

**y*a^- ^-—"«ddtAQg 28°C

£,«1^^^"*"""* ' '"" dd(AC)5 20°C

^^*',,,,M,,,~,,,H,-,**~ dd(AC)4 <20°C

C

' i ' i

10 20

i i i i i i i i i i i i i i

30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.19: Homo-(AC) Oligonucleotide verschiedener Kettenlänge. Dass die

Schmelztemperaturen mit zunehmender Kettenlänge zunehmen, ist ein Beweis,

dass eine Paarung - wie auch immer geartet - vorliegt (dd(AC)3: <0°C (6.6 pM, -%

Hyp.); dd(AC),: <20°C (11.1 uM, -% Hyp.); dd(AC)5: 20°C (8.5 pM, 14% Hyp.);

dd(AC)«: 28°C (8.1 pM, 13% Hyp.)). Alle Schmelzkurven wurden in einem Puffer

150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7.0 bei 260 nm gemessen.

In der Homo-DNA zeigte es sich, dass die Schmelzpunkte von dd(CA)„ durchs

Band weg bei vergleichbaren Konzentrationen leicht (um 1 - 3°C) höher liegen

als diejenigen der dd(AC)„ Serie bei vergleichbaren Bedingungen. Die

Schmelztemperaturen liegen aber deutlich tiefer als die Schmelztemperaturen

von dd(AT)„ (ungefähr 30°C) und dd(AU)„ Oligonucleotiden (ungefähr 15°C)

gleicher Länge unter denselben Messbedingungen.



dd(CA)n

15

10

5

0

..-.<*********••**•*•*••,

s/S

dd(CA)6 29°C

dd(CA)5 19°C

*dd(CA)4 <20°C

dd(CA)3 <0°C

>—T— | 1 r—i— | | | l | l | l |

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.20: Schmelzkurven der dd(CA). Reihe. dd(CA),: <0°C (6.3 pM, -% Hyp.);

dd(CA)«: <20°C (6.4 pM, -% Hyp.); dd(CA),: WC (8.1 pM, 16% Hyp.); dd(CA)s: 29°C

(8.3 pM, 16% Hyp.). Alle Messungen wurden im Standardschmelzpuffer bei 260 nm

gemessen.

% Hyperc30-

25-

20-

15-

10-

hromizität

dd(AT)6 59°C•

*

^^^„^—.—...„. dd(AC)6 28°C

/. /

C

"' i i i i i i i i i i

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.21: Vergleich der UV-Schmelzkurven von dd(AT)„ dd(AU)„ dd(AC)t und

dd(CA),. dd(AT)6: 59°C (9.3 pM, 25% Hyp.); dd(AU),: 44°C (7.1 pM, 20% Hyp.);

dd(AC)6:28°C (8.1 pM, 13% Hyp.); dd(CA)4:29°C (83 pM, 16% Hyp.).

Wie aus Abbildung C4.21 ersichtlich ist, besitzen die Schmelzkurven der

Oligonudeotide dd(AC>6 und dd(CA)6 vergleichbare Hyperchromizitäten.


% Hyperchromizität15-1

10

5-

dd(AC)6

••• X

„-."--.—-— 1.8 uM

5J— 8.1 Jm'—.-^-w 16.7 uM

""—«- 40.3 uM

i——i——i——i——i——i——i——i——i——i

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.22: Einige der zur Bestimmung der thermodynamischen Parameter von

dd(AC), verwendeten Schmelzkurven: 1.76 pM: 25°C; 2.8 pM: 26.4°C; 35 pM: 26.7°C;

4.4 uM: 27.1°C; 8.1 pM: 28.5°C; 115 pM: 30.0°C; 16.7 pM: 31.0°C; 40.3 pM: 34.6°C.

% Hyperchromizität20-i

dd(CA)e

1.2 uM

3.2 pM8.3 uM

23 uM

38 uM

—i—i—i—i—i—i—i— i i—i—i—i—i—i

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.23: Zur Bestimmung der thermodynamischen Daten des Schmelzprozesses

von dd(CA)t wurden folgende Schmelzkurven verwendet: 1.18 pM: 245°C; 2.4 pM:

26.7 °C; 3.2 pM: 26.7°C; 5.1 pM: 28.8°C; 8.3 pM: 29.4°C; 12.3 pM: 29.9°C; 23.0 pM:

31.9°C; 37.9 pM: 33.7°C. Man beachte in den obigen Abbildungen auch, dass bei

höheren Konzentrationen die Hyperchromizität der Schmelzkurve bei höheren

Temperaturen immer mehr absinkt.


Die Bestimmung der thermodynamischen Daten nach Methode ® in KapitelC.4.1 lieferte die thermodynamischen Daten AH, AS und AG der beiden

Dodecamersequenzen dd(AC)6 und dd(CA)6.

AH°vh

[kcal mol-1]

AS0

[cal mol-1 K"1]

TAS°(298K)

[kcal mol-1]

AG° (298 K)

[kcal mol-1]

dd(AC)6 -61.6 -180 -53.7 -7.9

dd(CA)6 -53.0 -151 -45.1 -7.9

Die AC-gepaarten Homo-DNA-Duplexe zeigen vergleichbare Paarungsenthal¬

pien wie die AT- resp. AU-gepaarten Homo-DNA-Oligonucleotide, was aus dem

Vergleich mit den thermodynamischen Daten der Dodecamersequenzen dd(AT)«

und dd(AU>6 in Tabelle 1 (Seite 53) hervorgeht. Die im Vergleich zum AT-

gepaarten Duplex betragsmässig kleinere Gibbs-freie Paarungsenthalpie der AC-

Oligomere ist offensichtlich im betragsmässig grösseren Entropieterm zu suchen.

Aufgrund der leichten Protonierbarkeit von Cytosin, sowie der Tatsache, dass in

DNA-Triplexen CGC+ Basenpaarungen in leicht saurem Medium auftreten,

wurde in der Folge untersucht, ob es sich bei der beobachteten Paarung um eine

AC- oder AC+-Paarung handelt. Dazu wurden UV-Schmelzexperimente in

verschieden gepufferter Lösung durchgeführt.Aus Abbildung C4.24 geht hervor, dass die Schmelztemperatur kaum pH-

abhängig ist. Aufgrund dieser Ergebnisse ist also eine AC+-Basenpaarung

auszuschliessen.

Die Tatsache, dass sich beim Schmelzen von dd(AC)6 bei pH 4 eine im Vergleichzu den anderen Schmelzkurven viel grössere Hyperchromizität einstellt, weist

darauf hin, dass eine Zersetzung des Oligonucleotids eingetreten ist. Dies konnte

auch dadurch gezeigt werden, dass ein Schmelzprozess bei pH 3.5 nicht mehr

reversibel ist (Abb. C4.25). Die HPLC-Kontrolle nach diesem Schmelzexperiment

zeigte eindeutig Zersetzung des Oligonucleotids (vermutlich Depurinisierung)an.


Abb. C4.24: dd(AC)6 bei verschiedenen pH-Werten gemessen. pH 4 (Essigsäure): -°C (3.4

pM, '19% Hyp.'); pH 5 (Natriumacetat): 23°C (7.2 pM, 11% Hyp.); pH 6

(NaCacodylat): 28°C (7.7 pM, 12% Hyp.); pH 7 (Tris-Puffer): 28°C (8.1 pM, 13% Hyp.);

pH 8 (Tris-Puffer): 28°C (8.1 pM, 13% Hyp.); pH 9 (Tris-Puffer): 31°C (8.1 pM, 11%

Hyp.).

dd(AC)6 Zersetzung in saurem Milieu% Hyperchromizität

20-i

15-Kühlen

10-

.

5- „*• Erwärmen

0- .*•*.-.*..-••

-5-

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.25: dd(AC), pH 3.5 Tm: -°C (3.0 pM, - % Hyp.); 150 mM NaCl, 10 mM

NaFormiat, pH 35, 260 nm.

Ein Vergleich mit natürlicher DNA zeigt einen weiteren grossen Unterschied

zur Homo-DNA: Natürliche d(AC)n-respektive d(CA)n-01igonucleotide zeigen


kein kooperatives Schmelzverhalten (man vergleiche dazu die Schmelzkurven

in Abb. C4.26 und C4.27).

Abb. C.4.26: Oligonucleotide der DNA-Reihe mit alternierender AC-Sequenz

zeigen keine Basenpaarung.

d(CA)n% Hyperchromizität

20-

15-

d(CA)6 7.1 uM

10- ^^g, d(CA)5 7.7 uM

&W*^ d(CA)4 7.7 uM

5-

0-

d(CA)3 7.1 uM

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.27: DNA mit alternierender CA-Sequenz zeigen ebenfalls, wie erwartet,

kein Schmelzverhalten. Alle UV-Schmelzexperimente wurden im Standard-

schmelzpuffer pH 7.0 bei 260 nm durchgeführt.


Zur Frage nach dem Basenpaarungstyp einer AC-Paarung

Grundsätzlich existieren zwei Möglichkeiten für eine Paarung von dd(AC)„-

Oligonucleotiden mit antiparallel oder parallel orientierten Oligonucleotid-

strängen:- eine AC-Paarung oder

- zwei AA-gepaarte Oligonucleotidstränge mit jeweils intermittierenden Homo-

deoxycytosinnucleosiden.

i i i i i i i i i i i i i i i i

dd-ACACACAC dd-ACACACAC

I I I I II I I oder I I I ICACACACA-dd CACACACA-dd''' i i i i i i i i

Die zweite Möglidikeit ist unwahrscheinlich, da auch vergleichbare dd(TG)n (n

= 3-5) Oligonucleotide unter ähnlichen Messbedingungen kein Assoziationsver¬

halten zeigen. In diesem System tritt also weder eine GG- mit intermittierenden

Homo-thymidinnucleosiden, noch eine GT-Paarung auf. Eine GG-Paarung wäre

von vergleichbarer Stabilität wie eine AA-Paarung. Somit ist also im Fall von

dd(AC)n-01igonucleotiden eine AA-Paarung mit intermittierenden Homo-

deoxycytidinnucleosiden sehr unwahrscheinlich.

Ein weiterer Hinweis, der direkter die AA- resp. die AC-Paarung betrifft, erhält

man durch den Vergleich der thermodynamischen Daten von dd(AC>6 und

dd(A«):

AH°VH

[kcal mol-1]

AS0

[cal mol'1 K-1]

TAS°(298K)

[kcal mol-1]

AG0 (298 K)

[kcal mol-1]

dd(AC)6 -61.6 -180 -53.7 -7.9

dd(A«) -39.4 -101 -30.2 -9.2

Es gibt keine Erklärung, weshalb eine AA-Paarung, bei der sich noch

Cytosinnucleotide zwischen den AA-Basenebenen befinden, viel stärker sein

sollte als eine solche ohne diese Cytosinnucleotide mit gleicher Anzahl AA-

Wechselwirkungen (man vergleiche dazu die AH-Wert in der obenstehenden

Tabelle).


Protonierte Cytosinbasen lassen sich ausschliessen, da die reversiblen

Schmelztemperaturen pH unabhängig sind1. Es muss sich also bei der Paarung

von dd(AC)„ und dd(CA)„ Oligonucleotiden um eine AC- und nicht um eine

AA-Paarung handeln.

Es ergeben sich dann die zwei in Abbildung C4.28 gezeigten Möglichkeiten für

eine AC-Basenpaarung.

HO HO

Abb. C4.28

I wäre Watson-Crick-artig und II Hoogsteen-Watson-Crick-artig verknüpft. Die

Folge davon ist, dass Fall I, die reverse Watson-Crick-artige Basenpaarung, zu

einem parallelen Doppelstrang und Fall II, die reverse Hoogsteen-artige

Basenpaarung, zu einem antiparallelen Doppelstrang führen würde. Ein

paralleler Doppelstrang wurde bislang noch nie in der Homo-DNA Reihe

nachgewiesen, was somit I unwahrscheinlicher werden lässt. Zur Ueberprüfung,

ob eine Paarung vom Typ I oder Typ II auftritt, wurde ein dd(7CHA-C)6

hergestellt. Die Tatsache, dass dieses Oligonucleotid keine Selbstpaarung zeigt,

heisst, dass ein Paarungsmuster nach dem Typ I auszuschliessen ist. Aufgrund

1 Aufgrund der Tatsache, dass es sich um eine AC- und nicht um eine AC*-Paarung handelt, wurden

Basentautomere nicht in diese Betrachtungen miteinbezogen.


des fehlenden H-Brückenacceptors an der Postion 7 der Purinbase und der

fehlenden Selbstpaarung von dd(7CHA-C)6 muss ein Paarungstyp I für dd(AC)n

ausgeschlossen werden (vgl. Kapitel C.4.7.3). Aus diesen Erfahrungen würde man

erwarten, dass eine AC-Paarung somit nach Typ II stattfindet und strukturell mit

einer AA- resp. GG-Paarung verwandt ist (man vergleiche dazu auch Abb. C4.29).

9.H—N s*<

<>Tjn ihrV

A-C G -G

Abb. C4.29: Die Basenpaarungen von Homo-deoxyadenosin-Duplex, einem Homo-

deoxyadenosin/Homo-deoxycytosin-Duplex und einem Homo-deoxyguanosin-Duplex.

Zur Ueberprüfung dieses Paarungsmusters wurden CD-Spektren von dd(AC>6

gemessen und mit den CD-Spektren von dd(A6) und dd(AT)5 verglichen. Der

empirische Vergleich der CD-Spektren (Abb. C4.40) legt eigentlich einen

ähnlichen Konstitutionstyp zum AT-Typ und nicht zum AA-Typ nahe.

Daraus ergibt sich eigentlich ein Widerspruch zu dem zuvor beschriebenen

Experiment, das eine Watson-Crick artige AT-ähnliche Paarung ausschliesst und

eine Hoogsteen-artige Basenpaarung eindeutig favorisiert.

Inwiefern allerdings solche CD-Spektren von Purin-Purin- und Purin-

Pyrimidin-gepaarten Oligonucleotiden miteinander verglichen werden dürfen,

ist unbekannt.


C.4.4.2 Nicht alternierende AC-Sequenzen von Homo-DNA

a) Blockweise Homo-AC-Oligonucleotide

Man wollte wissen, ob beim Uebergang von alternierenden dd(AC)5 zum nicht

alternierenden, aber dennoch selbstkomplementären dd(A5C5) ein Wechsel von

einer AC- zu einer AA-Paarung eintritt. Dies war bei den AT-Oligonucleotidennicht der Fall (Roth [21]). Sowohl dd(AT)s, wie auch dd(A5T5) zeigten im CD

Spektrum eindeutig eine AT-Paarung. Der Wechsel trat erst beim Uebergang

zum dd(A6T4) ein. Dies erschien aber im Fall der AC-Paarung nicht unmöglich,

da die AC-Paarung im Vergleich zur AT-Paarung noch viel schwächer als die

AA-Paarung ist. Man erwartete genau dasselbe Verhalten bei AC, wie es bei AH1

von Diedrichsen [89] gefunden wurde, nämlich den Uebergang von einer AH-

Paarung im alternierenden Fall (dd(AH)s) zu einer AA-Paarung in einer

blockweise gleichen Oligonucleotidsequenz (dd(A5H5) und innerhalb dieser

blockweisen Sequenzen einen Wechsel zur AH-Paarung : dd(A4H4) zeigt gemäss

CD-Spektrum wieder ein AH-Paarung), da die AH-Paarung etwa ähnlich

schwach ist wie die AC-Paarung2.Schon die Schmelzkurve der Sequenz dd(A5C5), die eine Schmelztemperatur

von 35°C und einer Hyperchromizität von nur noch 2.5% ergab, war ein

eindeutiges Indiz für den Wechsel der Paarungspartner.Diese Werte liegen viel näher bei den für dd(A5) gefundenen 32°C (9% Hyp.,

11.0 uM) [18] als denjenigen von dd(AC)s mit 20°C (14% Hyp. bei 8.4 pJvI). Dass die

Schmelztemperaturen von dd(A5C5) bei kleinerer Konzentration als im Experi¬

ment mit dd(A5) noch etwas höher liegen, kann mit dem stabilisierenden Effekt

von überhängenden Enden (sog. 'dangling ends') erklärt werden (vgl. Abb.C4.30).

' H steht für Hypoxanthin, dessen Nucleosid mit Inosin bezeichnet wird. In unserer

Forschungsgruppe wird das Kürzel I für Isoguaninnucleoside benutzt.2 Die Schmelztemperatur des dd(AH)6 Dodecamers beträt 43°C (6.1 pM), der entsprechendedd(AC)6 29°C (8.1 pM), während dd(AT)6 mit 59°C (9.3 pM) deutlich höher liegt.

handeln.

AC-Paarung

eine

um

wohl

dabei

sich

es

wird

konnte,

werden

gezeigt

auch

Wie

Paar

ung.

anderen

einer

zu

AA-

einer

von

Wechsel

den

für

Beweis

als

Spektren

verschiedenen

der

Zusammenfassung

C430:

Abb.

CCCCAAAA-dd

Hyp.

)4.5%

nM,

(10.3

°C

16

=Tm

II

II

dd-AAAACCCC

100°C

80

60

40

20

0

L

s

..

ffU"C

&s^^

\1/

*VC

Ar

dd<A.)

Hyp.

)9%

UM,

(11.1

32°C

=Tm

AAAAA-dd

II

III

dd-AAAAA

100*C

60

60

40

20

0

100'C

60

60

40

20

0

CCCCCAAAAA-dd

35°C(7.2nM,2.5%Hyp.)

=Tm

II

II

Idd-AAAAACCCCC

\-1-

\

Xt

*

1-

^%

%H

3-

100*C

80

60

40

20

0

CACACACACA-dd

20oC(8.4nM,14%Hyp.)

=Tm

II

II

II

II

II

dd-ACACACACAC


10

Der Wechsel von der AA- zur AC-Paarung% Hyperchromizität

15-i

dd(AC)5 20°C

dd(A5) 32°C

""* dd(A5C5) 35°C

i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—|—i—|—i—i

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.31: Vergleiche zwischen dd(As), dd(A5C5) und dd(AC)s; dd(Aj): 32°C (11.0 UM,

9% Hyp.); dd(A5C5): 35°C (7.2 pM, 25% Hyp.); dd(AC)5: 20°C (8.4 pM, 14% Hyp.).

Selbst das Oligonucleotid dd(A4C4) mit einer Schmelztemperatur von 16°C (10.3

|xM) bei einer Hyperchromizität von 4.5% zeigt beim Vergleich des CD-

Spektrums mit denjenigen von dd(A5C5) und dd(Ag) eindeutig eine AA-

Paarung. Es konnte in einer gleichgearteten Reihe (blockweise geordnete

Sequenz) kein Uebergang von einer AA-Paarung zur anderen (AC-Paarung)

gefunden werden, wie es bei AT-Paarungen der Fall ist [21] und es von U.

Diedrichsen beim Uebergang von dd(A4H4) (AH-Paarung) zum dd(AsHs) (AA-

Paarung) [89] gezeigt werden konnte.

b) Ein weiterer Hinweis für die Antiparallelität der AA-Paarung

Die beiden Nonamere dd(AAAACCCAA) und dd(AACCCAAAA) wurden

hergestellt, um zu untersuchen, ob eine AA-Paarung parallel oder antiparallel

ist. Es wurde versucht, diesen Beweis mit AC-haltigen Oligonucleotiden zu

erbringen, da dd(A) mit dd(C) die schwächste der untersuchten Adenin-

Pyrimidin-Basenpaarung ausbildet und somit am wenigsten Fehlpaarungen zu

erwarten sind.

Mit den zwei AC-Sequenzen alleine und deren 1 : 1 Gemisch wären die in

Abbildung C4.32 dargestellten Paarungsmöglichkeiten denkbar.


Paarungsmöglichkeiten der

einzelnen Oligonucleotide

i i i i i i i i i

dd-AAAACCCAA

II I I II

dd-AAAACCCAA

Paarungsmöglichkeiten des

1:1 Gemischs der beiden

Oligonucleotide

6 x AA-Paarung

i i i i i i i i i

AAAACCCAA-dd

II I I II

AAAACCCAA-ddi i i i i i i i

6 x AA-Paarung

paralleleStrangorientierung

i i i i i i i i

dd-AACCCAAAAII I I

dd-AAAACCCAA

4 x AA-Paarung

dd-AAAACCCAA

I I I I

AACCCAAAA-dd

4 x AA-Paarungantiparallele

Strangorientierung

AAAACCCAA-dd

II I I

dd-AACCCAAAA

i i i i i i i i i

dd-AAAACCCAAII I I IIAAAACCCAA-dd

6 x AA-Paarung

4 x AA-Paarung

Abb. C4.32: Unter der Voraussetzung, dass eine neue Spezies beim 1 :1 Gemisch entsteht (was

eindeutig aus dem Gelexperiment hervorgeht), ergeben sich bei einer reinen AA-Paarung (vgl.

CD-Spektren Abb. C4.30) die oben skizzierten Möglichkeiten bei paralleler oder

antiparalleler Strangorientierung.

Das CD-Spektrums der beiden einzelnen Oligonudeotide und des 1 : 1 Gemischs

waren einander sehr ähnlich und typisch für eine AA-Paarung (mit einem


Minimum bei 255 - 258 nm und einem Maximum bei 277 - 282 nm). Das CD-

Spektrum des 1 : 1 Gemischs sieht demjenigen der einzelnen Oligonucleotidesehr ähnlich. Es wird also keine Aenderung der Basenpaarungspartner eingetre¬ten sein. Es kann demzufolge nicht sein, dass in den einzelnen Oligonucleotidenneben AA- noch AC-Paarungen auftreten und dann im 1 : 1 Gemisch nur noch

AA-Paarungen.Bei gleichbleibender Oligonucleotidtotalkonzentration wurden nun von den

Oligonucleotiden einzeln und vom 1 : 1 Gemisch UV-Schmelzkurven gemessen.

Die UV-Schmelzkurven der beiden Oligonucleotiden allein (vgl. Abb. C4.33)

zeigten keinen grossen Unterschied zueinander. Aber auch die

Schmelztemperatur des 1 :1 Gemischs lag nur geringfügig höher als diejenige der

beiden einzelnen Oligonucleotide.

Sehr

% Hyperc10-

nelzkurven zur Antiparallelität der AA-Paarunghromizität

8-

6 -

4- /•'...••" "• dd(AAAACCCAA)T

2-

/C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.33: Das 1:1 Gemisch der beiden Oligonucleotide, die jeweils zueinander

den antiparallel orientierten Komplementärstrang bilden, ergaben eine höhere

Schmelztemperatur als die Oligonucleotide alleine. dd(AAAACCCAA): <15°C

(9.4 pM, -% Hyp.); dd(AACCCAAAA): <15°C (9.6 pM, -% Hyp.); 1:1 Gemisch:

21°C(je4.1pM;9%Hyp.).

Ein nicht denaturierendes Polyacrylamidgelexperiment zeigte, dass in einem 1 :

1 Gemisch1 der beiden Oligonucleotide eine neue Bande, die weniger weit läuft

1 Das Verhältnis der beiden Stränge scheint in dieser Bahn nicht exakt 1 :1 gewesen zu sein. Es hat

einen kleinen Ueberschuss dd(AAAACCCAA) in der Probe.


als die beiden Einzelstänge, entsteht. Das Assoziat, das aus den beiden

Oligonucleotiden entsteht, scheint also stabiler zu sein als das, welches bei

Selbstpaarung der beiden Oligonucleotide entsteht.

Abb. C434: Polyacrylamidgel (20 :1 BIS), 0.1 M

Tris, 0.1 M Borsäure, 5 mM MgQi pH 8.1, 8W,

18 h, 3°C, Angefärbt mit 'stains all' Lösung.

Zusammenfassend kann man aus den CD-Spektren schliessen, dass es sich bei

der Paarung um eine AA-Paarung und nicht eine gemischte Paarung mit AA-

und AC-gepaarten Duplexen handeln muss. Das Gelexperiment beweist, dass

eine neue Spezies im 1 : 1 Gemisch entstanden sein muss. Die Schmelzkurven

und auch das Gelexperiment zeigen, dass das im 1 : 1 Gemisch entstandene, neue

Assoziat etwas stabiler ist als die je durch die zwei Einzelstränge gebildeten

Assoziate. Diese Resultate sind nur dann alle in Einklang zu bringen, wenn wir

eine AA-Paarung mit antiparallel orientierten Oligonucleotidsträngenvoraussetzen.


C.4.5 Gemischtbasige Oligonucleotide

Diese Paarungsexperimente wurden in Zusammenarbeit mit C. Leumann [21]

durchgeführt und sind der Vollständigkeit halber in die vorliegende Arbeit

aufgenommen worden.

Mit den im nachfolgenden Text besprochenen Oligonucleotidsequenzenwurden vor allem zwei Fragen zu beantworten gesucht:

© Ist die Orientierung von Watson-Crick-artig gepaarten Purin-Pyrimidin

Oligonucleotiden antiparallel?® Existiert eine DNA - Homo-DNA Paarung?

Diese Fragen konnten mit Hilfe von Schmelzexperimenten und

Gelelektrophorese abschliessend beantwortet werden.

Die Sequenzen der Hepta- und Octanucleotide, die für diese Experimenteverwendet wurden (Abb. C4.35), wurden so gewählt, dass möglichst einfache,

eindeutige Paarungen gemäss den Watson-Crick'schen Basenpaarungsmustern

eintreten. Die drei in Abbildung C4.35 in den Spalten zuoberst stehenden

Oligonucleotide (dd(AACTACT), dd(AACATACT) und d(AACATACT)) sind

jeweils die Stammsequenzen, die zweitobersten Oligonucleotidsequenzen sind

jeweils die parallel und die dritten Oligonucleotidsequenzen die antiparallelorientierten Komplementärstränge zum Stammoligonucleotid derselben Spalte.

dd(AACTACT) dd(AACATACT) d(AACATACT)

ddCTTGATGA) ddOTGTATGA) d(TTGTATGA)

dd(AGTAGTT) dd(AGTATGTT) d(AGTATGTT)

Abb.C4.35

C.4.5.1 Schmelzverhalten der einzelnen Oligonucleotide

Die in Abbildung C4.35 aufgeführten Oligonucleotide mussten daraufhin

überprüft werden, ob deren Selbstassoziation genügend klein ist, dass man einen

Unterschied bei der Assoziation des Stammoligonucleotids mit dem parallelen


oder dem antiparallelen Komplementärstrang überhaupt erst von einer

eventuellen Selbstassoziation unterscheiden kann.

Die Oligonucleotidsequenzen wurden derart gewählt, dass sie zu einer

möglichst eindeutigen Watson-Crick-artig verknüpften Basenpaarung führen

sollten.

a) DNA Oligonudeotide:

Die UV-Schmelzkurven der einzelnen Oligonucleotide zeigen eine lineare

Zunahme der Extinktion der Oligonucleotide, die nur auf ein Destacking der

Basen, aber nicht auf das Auseinanderbrechen einer Oligonucleotidpaarung

zurückgeführt werden kann (vgl. Abb. C4.36).


15-

10-

5-

d(AGTATGTT 9.2 uM

^^^Z dfTTGTATGA) 10.2 uM

^-•^i^11** d(AACATACT) 8.8 uM

0 - i "i- i i i i > i • i i i i

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.36: Schmelzkurven der DNA Oligonucleotide, die wie erwartet kein

Assoziationsverhalten zeigen.

b) Homo-DNA Oligonucleotide:

Die analoge Untersuchung zeigt für die entsprechenden Octamere der Homo-

DNA Reihe ein anderes Verhalten: zwei der verwendeten Oligonucleotide

zeigen kein beobachtbares Schmelzverhalten, aber dd(AACATACT) besitzt eine

sigmaoide UV-Schmelzkurve mit einem Tm-Wert von 20°C bei den

untersuchten Bedingungen (vgl. C4.37).


% Hyperc20-

15-

10-

5-

0-

C

hromizität

.'*" "*~*"—•—-«.h. dd(AACATACT) 8.9 uM•

•

•

•

^"r" i r»T—i—r i | r—i—i—r > i » i • i • i

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb.C4.37: Schmelzkurve der Homo-DNA Oligonucleotide. Die Schmelztemperaturen

sind in der untenstehenden Tabelle aufgelistet.

Oligonucleotidsequenz Schmelztemperatur

dd(AACATACT) Tm = 20°C (8.9 uM, 14 % Hyp.)

dd(AGTATGTT) Tm = -(9.2uM,-%Hyp.)

dd(TTGTATGA) Tm = -(8.9uM,-%Hyp.)

Die Schmelztemperatur von 20°C für das Octamer dd(AACATACT) würde eine

Paarung mit 4 AT und 4 AC gepaarten Basenpaare nicht ausschliessen (wie sie in

Abbildung C4.38 links oben dargestellt ist), denn ein AT-gepaartes Octamer

(dd(AT)4) hat eine Schmelztemperatur von 45°C und ein AC-gepaartes Octamer

(dd(AC>4) hat eine Schmelztemperatur von <20°C. Die Schmelztemperatur von

dd(AACATACT) von 20°C liegt sicher in einem Bereich, der für eine solche

Paarung noch zulässig wäre. Die bisherigen Kenntnisse über AT-Paarungen

(Watson-Crick-artig) in AT-haltigen Oligonucleotiden (Roth [21] und Kapitel

C.4.2), sowie AC-Paarungen (reverse Hoogsteen-artig) in AC-haltigen

Oligonucleotiden (Kapitel C.4.4) legen nahe, dass diese zwei Paarungen nicht in

einem Duplex koexistieren können (vgl. Abb. C4.39).


antiparalleleOrientierung

i i i i i i i i

dd-AACATACT

I I I I II I ITCATACAA-dd''

4 x AT-Paarung (WC)4 x AC-Paarung (rev. H)

paralleleOrientierung

i i i i i i i i

dd-AACATACT

II I Idd-AACATACT'''

4 x AA-Paarung (rev. H)

i i i i i i i i

dd-AACATACT

I I I ITCATACAA-dd

2 x AA-Paarung (rev. H)2 x AT-Paarung (WC)

um ein

Nudeosid

verschoben

dd-AACATACT

II II I I

dd-AACATACT


2 x AT-Paarung (WC)3 x AC-Paarung (rev. H)

i i i i i i i i

dd-AACATACT

I I I IITCATACAA-dd

3 x AA-Paarung (rev. H)2 x AC-Paarung (WC)

um ein dd-AACATACT

Nucleosid | I I I I Iverschoben dd-AACATACT

i i i i i i i i


2 x AT-Paarung (WC)

3 x AC-Paarung (rev. H)

Abb. C4.38: Die verschiedenen Möglichkeiten, wie dd(AACATACT) sowohl mit paralleler,

als auch mit antiparalleler Strangorientierung und auch um ein Nucleosid verschoben mit sich

selbst paaren kann. Dabei bildet die Möglichkeit links oben sicherlich den stabilsten Duplex.

Der Uebergang von einer AT (Watson-Crick-artig) zu einer AC (reverse

Hoogsteen-artig) gepaarten Basenpaarung würde grosse sterische Anforderungenan das Zucker-Phosphat-Rückgrat stellen. Dies wird in Abbildung C4.39 dadurch

offensichtlich, dass die glycosidischen Bindungen von Homo-deoxycytosin zum


Homo-thymidin bei der Ueberlagerung einer Homo-AC und einer Homo-AT-

Paarung sehr weit voneinander entfernt sind.

J

ft-

c6" T <xj>A-T A-C

(Watson-Crick) (reverse Hoogsteen)

Ueberlagerung von ATund AC-Paarung

(Watson-Crick und reverse

Hoogsteen-artig)

Abb.C4.39

Nicht auszuschliessen ist jedoch eine Duplexstruktur, die AC- und AT-

Basenpaarungen enthalten, die beide reverse Hoogsteen-artig verknüpft sind1.

Das CD-Spektrum von dd(AACATACT) (Abb. C4.40), das weder einem CD-

Spektrum für eine AC- noch einem für eine AT-Paarung entspricht, wäre in

diesem Fall plausibel, da die AT- und die AC-Paarung nur quasi-isomorph sind.

Dies wird insbesondere durch die Ueberlagerung der entsprechenden

Basenpaarungen in Abbildung C4.41 illustriert.

1 Eine solche AT-Paarung, die reverse Hoogsteen-artig verknüpft ist, existiert nach Helene und

Mitarbeitern [66] auch in einem d(aT,)d(ßA8)d(ßT,)-Triplex von DNA.


Abb C440 CD-Spektrum von dd(AACATACT) bei 5°C

<$ \ H „

tT•h \\ H^H

A-T A-C

(reverse Hoogsteen) (reverse Hoogsteen)

H

ß-tf

-CK"

*J

Ueberlagerung von AT-

und AC-Paarungbeide Paarungen reverse Hoogsteen

Abb C 4 41


Der Selbstpaarungsgrad der drei Heptanucleotide (dd(AACTACT),

dd(TTGATGA) und dd(AGTAGTT)) wurde in analoger Weise untersucht (vgl.

Abb. C4.42).

% Hyperchromizität

^— -»-»__«„ dd(TTGATGA)

10-

5- ^«.•-'•"""•"•»••««.H...» dd(AGTAGTT)

0-

•»•**

C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.42: Schmelzkurven der drei Heptanucleotide:

dd(AACTACT): - °C (10.1 pM, - % Hyp.); dd(AGTAGTT): 17°C (9.3 pM, 6% Hyp.);

dd(TTGATGA): 20°C (9.7 pM, 15% Hyp.).

Oligonucleotidsequenz Schmelztemperatur

dd(AACTACT) Tm =-°C (10.1 uM,-% Hyp.)

dd(AGTAGTT) Tm = 17°C (9.3 uM, 6% Hyp.)

ddCTTGATGA) Tm = 20°C (9.7 uM, 15% Hyp.)

Auch bei den drei Heptamersequenzen zeigen die zwei zum Stammstrang

(dd(AACTACT)) parallel und antiparallel orientierten Komplementärstränge

eindeutig Selbstpaarung. Im Fall von dd(AGTAGTT) ist am plausibelsten, dass

mit den bisherigen Kenntnissen eine um ein Nucleosid verschobene

Basenpaarung eine Selbstpaarung ausbildet, wie dies in der eingerahmten

Basenpaarungsstruktur in Abbildung C4.43 dargestellt ist. Eine solche Paarung

würde im selben Oligonucleotidstrang sowohl GG- (reverse Hoogsteen

verknüpft, Hunziker [22]), als auch AT-Paarungen vorliegen. Die AT-

Basenpaarungen könnten wiederum, wie im Fall der Octamersequenz

dd(AACATACT) in reverse Hoogsteen-artig verknüpfter Weise gepaart sein.

Eine Selbstpaarung von dd(AGTAGTT), bei der jede Base des Oligonucleotids in


antiparaller Orientierung mit einer Base gepaart ist (I in Abbildung C4.43), würde

4 GT-Basenpaarungen, die nach Untersuchungen von Hunziker [22] nicht

existieren, aufweisen.

m—r-n—i

dd-AGTAGTT

I I I ITTGATGA-ddi i i i i i i

i i i i i i i

dd-AGTAGTT

I I

TTGATGA-dd

Abb. C4.43: Die Paarungsmöglichkeiten für das Oligonucleotid dd(AGTAGTT).

Genau dasselbe Paarungsmuster gilt selbstverständlich auch für den

Oligonucleotidstrang, bei dem die Reihenfolge der Nucleoside umgekehrt ist,

also für den zum Stammstrang parallel orientierten Komplementärstrang

dd(TTGATGA). Dieser Befund deckt sich mit der Beobachtung, dass die

Schmelztemperaturen dieser zwei Oligonucleotide in etwa vergleichbar sind

(dd(AGTAGTT): 17°C (9%); dd(TTGATGA): 20°C (15%)). Nicht erklärbar ist

jedoch der Unterschied der Hyperchromizitäten der beiden Schmelzprozesse.

C.4.5.2 Zur Frage der Strangorientierung

Zu den Stammsequenzen der Heptamer- und Octamersequenzen

(dd(AACTACT) und dd(AACATACT)) wurde jeweils eine äquimolare Menge

sowohl des antiparallelen als auch des parallelen Komplementärstrang

zugegeben und eine temperaturabhängige Schmelzkurve aufgezeichnet.

Um ein Nucleosid

verschobene

Oligonucleotid-paarung

i i i i i i i

dd-AGTAGTT

II I I IITTGATGA-ddi i i i i i i


Mischexperiment mit den Homo-DNA Sequenzen% Hyperchromizität

20-

15-.* .* dd(AACATACT) +

10-

/ ; ddfTTGTATGA)•

•

•'" / dd(AACATACT) +

5- .•• / (TTGTATGA)dd

*>* y'

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb C4 44 Das Schmelzexpenment zeigt, dass der zu dd(AACATACT) antiparallel orientierte

Watson-Crick-artig paarende Strang dd(AGTATGTT) den stabileren Duplex bildet

dd(AACATACT) + dd(TTGTATGA) 38°C (je 4 8 pM, 18% Hyp)

dd(AACATACT) + dd(AGTATGTT) 48°C (je 4 8 pM, 18% Hyp)

Beide Schmelzkurven wurden in 150 mM NaCl, 10 mM Tns HCl, pH 7 0 bei 260 nm gemessen

Es zeigte sich für den Fall von dd(AACATACT), dass beide Oligonucleotid-

gemische einen kooperativen Uebergang zeigten, dessen Tm-Werte jeweils

deutlich hoher waren als diejenigen der einzelnen Komponenten Diejenige

Losung, in dem der Komplementarstrang antiparallele Orientierung zum

Stammstrang aufweist, hat eine höhere Schmelztemperatur (Abb C4 44) Wir

können deshalb annehmen, dass die Strangorientierung in diesen Homo-DNA

Octamersequenzen bevorzugt antiparallel ist Die Tatsache, dass die

Stammsequenz auch mit dem parallel orientierten Oligonucleotid paart, ist

erklärbar durch eine partielle, verschobene Basenpaarung, aber ebenfalls mit

antiparalleler Strangorientierung zum Stammoligonucleotid, wie sie in

Abbildung C4 45 dargestellt ist


antiparallelkomplemen¬tärer Strang

l i i l i l l l

dd-AACATACT

I I I I I I I I

TTGTATGA-dd

dd(AGTATGTT)C (je 4.8 uM, 20% Hyp.)

4 x AT (WC)und 4 x GC (WC)

Stammsequenz

parallelkomplemen¬tärer Strang

dd(TTGTATGA)

i i i i i i i~i

dd-AACATACT

I I I II I

AGTATGTT- dd

37c C (je 4.8 uM, 18% Hyp.)1 x AA (rev. H)

und 2 x GC (WC)

und 3 x AT (WC)

antiparallele Paarungder parallelkomplementären Stränge

Abb. C4.45: Antiparallel orientierte Paarung sowohl der antiparallel, wie auch der parallel

komplementären Oligonucleotidstränge.

Obwohl die Differenz der Schmelztemperaturen mit dem parallel und dem

antiparallel orientierten Komplementärstrang deutlich war, war es störend, dass

die Stammsequenz mit dem parallel orientierten Komplementärstrang eine so

starke Paarung eingeht. Aus diesem Grund hat man sich entschlossen, dasselbe

Experiment mit den Heptamersequenzen dd(AACTACT), dd(AGTAGTT) und

dd(TTGATGA) durchzuführen, was zu einem eindeutigeren Resultat führte

(Abb. C4.46).

Die Heptamer Stammsequenz (dd(AACTACT)) zeigt mit dem antiparallel

orientierten Oligonucleotidstrang eine Schmelzkurve mit einem deutlichen

sigmaoiden Verlauf, während die Stammsequenz mit dem parallel orientierten

Komplementärstrang offensichtlich keine Paarung eingeht. Der Schmelzkurven¬

verlauf dieses Oligonucleotidgemischs entspricht nämlich der Summe der

beiden UV-Schmelzkurven von dd(AACTACT) und dd(TTGATGA).



15-

-dd(AACTACT) +

/ (TTGATGA)dd•

•

•

•

•

10- •

•

•

•

5- jST' ~~"„...,.

dd(AACTACT) +

y ddfTTGATGA)

0 1 1 1 1 1 < 1 1 1 1 1 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.46: Dieses Schmelzexperiment zeigt, dass auch eine Watson-Crick-artige Paarung in Homo-

DNA eine antiparallele Strangorientierung aufweist.

dd(AACTACT) + dd(AGTAGTD: 42°C (je 5.0 pM, 18% Hyp.).

dd(AACTACT) + ddCTTGATGA): - °C (je 5.0 pM, - % Hyp.)

Diese beiden Schmelzkurven wurden bei denselben Bedingungen in 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl,

pH 7.0 bei 260 nm gemessen.

Die Purin-Pyrimidin Paarung nach einem Watson-Crick-artigen Basen¬

paarungsmodus in der Homo-DNA ist also antiparallel orientiert.

Zur Bestätigung der antiparallelen Orientierung bei der Watson-Crick-artig

gepaarten Purin-Pyrimidin-Paarung in der Homo-DNA wurde ein nicht denatu¬

rierendes Polyacrylamidgelelektrophoreseexperiment bei 20°C durchgeführt. Auf

die ersten drei Bahnen wurden die drei Oligonucleotide (dd(AACTACT),

ddCTTGATGA) und dd(AGTAGTT)) und auf die nächsten zwei ein 1 :1 Gemisch

des Stammoligonucleotids (dd(AACTACT)) mit seinem parallelen

(dd(TTGATGA) Bahn 4) und seinem antiparallelen (dd(AGTAGTT) Bahn 5)

Komplementärstrang aufgetragen. Auch aus diesem Experiment geht das im

Schmelzexperiment gefundene Resultat, einer antiparallelen Orientierung der

Oligonucleotidstränge, hervor. Eine Paarung äusserte sich im nicht

denaturierenden PAGE darin, dass die beiden Banden des Einzelstranges

verschwinden, dafür aber eine neue Bande, die weniger weit wandert, neu

entsteht. Die geringere Mobilität rührt daher, dass das Dimer weniger flexibel ist

und deshalb schlechter durch das Polyacrylamidnetzwerk gelangt.


oT3

s H u 3 SS< E* (3 < e

H < «: S < «C tjU o t* o o

AACT TTGA3 «i 5BTl •0 •o •0 "0•o

1o1

•o1

•0 TJ1 1 -dd

Abb. C4.47:20% Acrylamid (30 :1 Bis), 0.1 M Tris, 0.1 M

Borsäure, 5 mM MgCl2, pH 8.1, 10 W, 16 h, 20°C,

Angefärbt mit 'stains all'-Lösung

Zu Kontrollzwecken wurde ein analoges UV-Schmelzexperiment mit DNA-

Octanucleotiden durchgeführt (Abb.C4.48). Die Schmelztemperatur der

antiparallel orientierten Oligonucleotidstränge war 22°C (je 4.6 uM, 25% Hyp.),

diejenige der Stammsequenz mit dem parallel orientierten Komplementärstrang

konnte nicht bestimmt werden. Sie dürfte aber unterhalb von 10°C liegen (je 5.1

uM Oligonucleotidkonzentration).

Dieses Resultat war vergleichbar mit dem entsprechenden Versuch mit Homo-

DNA. Dabei kann als Erklärung, weshalb auch der zum Stammstrang parallel

orientierte Oligonucleotidstrang assoziiert, genau dasselbe Paarungsschema (Abb.

C4.45) dienen. Nur muss der Einfluss der AA-Paarung bei der Paarung der DNA-

Oligonucleotidstränge, die für Homo-DNA noch eine gewisse Stabilisierung

ergeben kann, wegfallen.


Mischexperiment mit den DNA Sequenzen% Hyperchromizität

£_,_

d(AACATACT) +n

„.-—-—* (TTGTATGA)d

„d(AACATACT) +

«««—'""'**"* dfTTGTATGA)

20

15

10

5

0

-."'

.*»-""

«tfV0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.48: Gleich wie im analogen Fall der Homo-DNA Oligonucleotide paart

auch der parallel orientierte Komplementärstrang mit dem Stammoligonucleotid

dd(AACATACT). Die Paarung ist aber wiederum deutlich schwächer als mit

dem antiparallel orientierten Komplementärstrang.

d(AACATACT) + dCTTGTATGA): <10°C (je 4.6 pM, -% Hyp.)

d(AACATACT) + d(AGTATGTT): 22°C (je 5.0 pM, 25 % Hyp.)

Diese Schmelzpunkte wurden im Standardpuffer bei 260 nm bestimmt.

C.4.5.3 Kreuzungsexperimente von Homo-DNA mit DNA - ein

weiterer Beweis für die Autonomie der Homo-DNA

Wie aus Experimenten von Roth [21]1 hervorgeht, scheint keine DNA - Homo-

DNA Paarung zu existieren.

Mit den zuvor schon verwendeten Oligonucleotiden wurde auch untersucht,

ob unter Einbezug aller vier Nucleobasen eine DNA - Homo-DNA Hybrid¬

paarung eintritt.

Zum DNA Oligonucleotid d(AACATACT) wurden in zwei verschiedenen

Experimenten dd(AGTATGTT) und dd(TTGTATGA) zugegeben, um zu sehen,

1 Roth fand [21], dass ein 1 :1 Gemisch von d(A10) und dd(T10) im UV-Schmelzexperiment dieselbe

Hyperchromizität aufweist wie die Summe der Hyperchromizitäten der beiden einzelnen

Oligonucleotide. Genauso zeigt der CD-Effekt des 1 :1 Gemischs der beiden Oligonucleotide keine

Aenderung gegenüber der Summe der CD-Effekte der beiden einzelnen Oligonucleotide. Diese beiden

Resultate zeigen für diesen Fall eindeutig, dass keine DNA - Homo-DNA Hybridpaarung eintritt.


ob DNA und Homo-DNA eine Paarung eingehen und ob diese, falls sie

vorhanden wäre, parallel oder antiparallel orientiert ist.

Kreuzungsexperiment mit d(AACATACT) + dd(AGTATGTT)% Hyperchromizität

8

7

6

5

4

3

2-

i: y

„»•»•»

^"

^.•"•Ü5-.*""I~ 1 :1 Gemisch

/r

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.49: Da die Summe der Schmelzkurven der einzelnen Oligonucleotidkomponen-

ten genau dieselbe Schmelzkurve ergibt, wie das 1 :1 Gemisch von DNA Teststrang und

dem antiparallel orientierten Homo-DNA Komplementärstrang, ist bewiesen, dass

keine antiparallel orientierte DNA - Homo-DNA Paarung stattfindet.

dIAACATACT) + dd(AGTATGTT): -°C (je 4.5 pM, -% Hyp.)

Die Tatsache, dass die Summe der Hyperchromizitäten der UV-Schmelzkurven

der einzelnen Spezies nahezu identisch mit der Schmelzkurve des 1 : 1 Gemischs

dieser Spezies ist (für den Fall mit antiparalleler DNA - Homo-DNA

Strangorientierung vergleiche man mit Abbildung C4.49, für denjenigen mit

paralleler Strangorientierung mit Abbildung C4.50), zeigt als besonders klares

Beispiel, dass eine DNA - Homo-DNA Hybridpaarung selbst unter Einbezug aller

vier Nucleobasen nach dem Watson-Crick-artigen Basenpaarungsmuster nicht

eintritt.


Kreuzungsexperiment mit d(AACATACT) + dd(TTGTATGA)% Hyperchromizität

8-

7-. y

6-

5-

4-

3-

2-

1 -

0

/

,*»".•»«•"'

,-•*„„£#. 1 : 1 GemiSCh

—I——l——l——l—'—i——l——l——I——l——l

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4J50: Auch mit dem zum DNA Teststrang parallel orientierten Homo-DNA

Oligonucleotidstrang findet keine Paarung statt.

d(AACATACT) + dd(TTGTATGA): -°C (je 55 pM, - % Hyp.).

Homo-DNA verhält sich also auch mit Watson-Crick-artiger Purin-Pyrimidin

Basenparung autonom.

Mit einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgelexperiment konnte dieser

Befund bestätigt werden (vgl. C4.51). Auf Bahn 8 wurde ein 1 : 1 Gemisch von

d(AACATACT) und dd(AGTATGTT), was zu einem antiparallel orientierten

Duplex und auf Bahn 9 ein 1 : 1 Gemisch von d(AACATACT) und

dd(TTGTATGA), was zu einem parallel orientierten DNA - Homo-DNA Duplex

führen würde, aufgetragen. Wie man deutlich sieht, bleiben in den Bahnen 8

und 9 jeweils zwei Banden bestehen, die gleich weit laufen, wie die jeweiligen

Einzelstränge auf Bahn 1 (d(AACATACT)), 5 (dd(TTGTATGA)) und 6

(dd(AGTATGTT)). Es liess sich also auch im Gelexperiment zeigen, dass keine

Paarung zwischen Homo-DNA und DNA eintritt.


in

•o 2•0 •0

H H

U §O < o 3 t* < u

(> H < o O

< O < H r-i H H S i< «: h h

< < AACAT TTGTArt <

t

AACA TTGT AACAT TTGTA1

AACAAGT Ü TTG <

T3 •0T3

2

I

Abb. C4.51: 20% Acrylamid (30 : 1 Bis), 0.1 M Tris, 0.1 M

Borsäure, 5 mM Mgd2, pH 8.1,8 W, 20 h, 3°C, Angefärbt mit

'stains all'-Lösung

Sowohl vom Homo-DNA als auch vom DNA Duplex (jeweils der beiden

antiparallel orientierten Komplementärstränge) wurden die thermodyna¬mischen Daten durch Analyse der oligonucleotidkonzentrationsabhängigen

Schmelztemperaturen nach Methode ® in Kapitel C.4.1 bestimmt (1 M NaCl).


AH°VH

[kcal mol-1]

AS°

[cal mol"1 K-l]

TAS°(298K)

[kcal mol-1]

AG0 (298 K)

[kcal mol-1]

dd(AACATACT) +

dd(AGTATGTD

1.0 M Nad

-12.4 -106 -32.1 -10.3

d(AACATACT) +

d(AGTATGTT)

1.0 M NaQ

-51.3 -146 -44.3 -7.0

Auch hier bestätigt es sich einmal mehr, dass DNA zwar enthalpisch stabiler ist,

der für Homo-DNA günstigere Entropieterm aber eine deutlich grössere Stabilität

des Duplexes ermöglicht, wie aus dem Vergleich der AG-Werte hervorgeht.

C.4.6 oc-Homo-DNA Oligonucleotide1

Diese Paarungsexperimente wuden von R.P. Hammer [82] durchgeführt und

sind der Vollständigkeit halber in die vorliegende Arbeit aufgenommen worden.

Im Hinblick darauf, dass a-DNA sowohl mit ß-DNA, als auch mit dem

entsprechenden a-Komplementäroligonucleotid paart, wurde dies auch in der

Homo-DNA Serie untersucht. Diese Untersuchungen wurden der Einfachheit

halber bei monobasigen Oligonucleotiden der Homo-DNA Reihe mit Adenin-

und Thymin-Nucleosiden durchgeführt.

Wie aus den Schmelzkurven sowohl von dd(a-As) als auch von dd(a-A6)

hervorgeht, tritt keine AA-Paarung zwischen zwei Homo-DNA Strängen mit

einer a-Konfiguration am anomeren Zentrum auf (vgl. Abb. C4.52).

1 Helene et al. [66] untersuchten die Eigenschaften eines d(aT,) mittels CD-Spektroskopie. Sie

fanden, dass d(aT() mit d(ßAs) ebenfalls einen stabilen 1 :1 Komplex bilden. Imbach et al. zeigten,dass a-DNA-Oligonucleotide mit einer beliebigen Basensequenz mit einem komplementären ß-Oligonudeotid auch antiparallel paaren, dass die Paarung immer noch Watson-Crick-artig ist und

dass die Duplexstruktur dem B-Konformationstyp ähnlich ist, wie aus NMR-Experimentengeschlossen wurde [67], [68], [69].Ein d(aT.) Oligonucleotid bildet gleich wie ein d(ßT„)-01igonucleotid einen zum Purinstrangparallel orientierten T2A-Tripelstrang [70].


dd(cc-A5) und dd(cc-A6)% Hyperchromizität

15'

10

0-T-

ddJa-As) Schmelzen p.•»

. ^* *

* *

.!»? dd(a-A6) Erhitzen

dd(a-A6) Abkühlen

-i—i—i—|—i—|—i—r——i——i——i——i——i

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.52: Reversible Schmelzkurven von dd(a-A«) 8.8 pM und dd(a-A5) 115

pM. Es findet keine Selbstassoziation von a-Homo-deoxy-adenosin statt.

Die Schmelzkurven eines 1 : 1 Gemischs von einerseits dd(a-As) und dd(ß-T$)

und anderseits dd(a-A6) und dd(a-Tj) zeigte ebenfalls keinen kooperativen

Uebergang, so dass eine Paarung zwischen aa-, wie auch aß-konfigurierten

Oligonudeotiden ausgeschlossen werden muss (Abb. C4.53).

dd(cc-A6) + dd(a-T6) / dd(a-A6) + dd(ß-T6)% Hyperchromizität

10- ^„dd(a-A6) + dd(a-T6)

8-

6-

**>'** je 10.0 uM

***^~*~

dd(«-A6) + dd(ß-T6)

jr"*'-******'^ je 5.0 uM

4-

2-4^

0 10 20 30 40 50 60 70 80 "C

Abb. C4.53: Es findet kein Paarung von a-Homo-deoxy-adenosin und a-Homo-thymidin

sowie von a-Homo-deoxy-adenosin und ß-Homo-thymidin Hexameren statt. Die

Konzentration an Oligonucleotid war im Experiment mit a-Homo-thymidin je 10.0 uM im

Experiment mit ß-Homo-thymidin je 5.0 pM. Die Schmelzkurven wurden im

Standardpuffer bei 260 nm bestimmt.


Im Fall des alternierenden Oligonucleotids dd(aT-aA>3 liess sich eine Paarung

anhand der ersten gemessenen UV-Schmelzkurve (bei c = 7.3 uM, Abb. C4.54)

nicht ohne weiteres ausschliessen, denn sie zeigte von 0°C an mit steigender

Temperatur einen anfänglich steilen Kurvenverlauf, der mit höherer Tempera¬

tur abflachte.

dd(aT-oA)3 0.15 M und 1.5 M NaCl

% Hyperchromizität

2-

.-*• •••

„»»^* *•

r•«;..«"14.

..•:."

•V*

*•

—i—

10 20 30 40

7.3 uM, 0.15M NaCl

3p.M, 1.5MNaCI

50 °c

Abb. C4.54: Der Verdacht, dass es sich bei der Schmelzkurve von dd(aT-aA)j bei 7.3 pM um

den obersten Teil einer Schmelzkurve handeln könnte, konnte beseitigt werden, weil die

Erhöhung der NaCl- und der Oligonucleotidkonzentration zu keiner deutlichen Erhöhung

der Hyperchromizität und somit zur Erhöhung eines allfälligen Schmelzpunktes führte.

Diese Kurvenform hätte als das Ende eines Schmelzprozesses interpretiert

werden können. Um nun festzustellen, ob es sich wirklich um ein

Schmelzverhalten handelte, bestanden zwei verschiedene Möglichkeiten:- Synthese eines längeren Oligonucleotids, das im Fall einer Paarung einen

höheren Schmelzpunkt haben müsste und somit eine vollständige

Schmelzkurve im Temperatur vs. Hyperchromizität Diagramm ergeben

müsste.

- Die Zugabe von NaCl oder eines anderen Elektrolyten würde zu einer

verminderten Interstrang Phosphat-Repulsion führen [71], [72], was

wiederum zu einer Erhöhung der Schmelztemperatur führen würde.

Diese Erhöhung der Schmelztemperatur müsste sich darin äussern, dass

ein grösserer Teil der Schmelzkurve sichtbar würde und damit die

Hyperchromizität der Schmelzkurve mit höherer NaCl Konzentration


deutlich höher liegen müsste. Gleichzeitig könnte in diesem Experiment

die Oligonucleotidkonzentration noch erhöht werden, was die

Schmelztemperatur noch weiter erhöhen sollte.

Dieses zweite Experiment wurde durchgeführt, und es zeigte sich, dass keine

Zunahme der Hyperchromizität beobachtet werden konnte. Es tritt also auch im

Fall von dd(aT-aA>3 keine Paarung ein.

Zusammenfassend lässt sich über a-Homo-DNA sagen, dass sowohl AA- wie

auch AT-Paarungen, wenn überhaupt, erst bei viel längeren Nucleotidsequen-

zenen eintreten. Mit Sicherheit sind aber eventuelle Basenpaarungen deutlich

schwächer als analoge Oligonucleotide in der Reihe der ß-Homo-DNA. Eine

gemischte Paarung zwischen Oligonucleotiden mit a- und ß-Konfiguration

existiert zumindest für Adenin- und Thymin-haltige Homo-DNA Oligonucleo¬

tide nicht.

C.4.7 Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltende

Oligonucleotide

C.4.7.1 Einführung

Die Synthese von Homo-deoxy-7-carbaadenosin und Oligonucleotide, die dieses

Nucleosid enthalten, wurden im Hinblick auf die Aufklärung der Struktur der

AA-Paarung in Angriff genommen. Sowohl auf diesem als auch auf anderen

Gebieten lieferten Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltende Oligonucleotidesehr aufschlussreiche Informationen. So trugen sie zur Aufklärung der Struktur

der AC-Paarung, der Absicherung der Watson-Crick-artigen AT-Basenpaarung

und zum ersten Zugang zu einem dd(T6) - 'dd(An)' Duplex bei1.

1 dd(An) steht in Anführungszeichen, da nicht ddA, sondern nur das 7-Carbaanaloge eben dd(7CHA)

verwendet wurde.


C.4.7.2 Homo-deoxy-7-carbaadenosin und die Frage der

Konstitution der AA-Paarung

Aus den Arbeiten von Böhringer [18], unter anderem den NMR-Analysen, ging

hervor, dass die Nucleobase in dd(An) immer anti zum Zucker steht. Unter der

weiteren Voraussetzung der bewiesenen antiparallelen Orientierung der

Oligonucleotidstränge verblieben von den vorgeschlagenen Basenpaarungsstruk¬turen nur noch deren zwei (vgl. Abb. C4.55).

H N=\n ^.oh

'oh

übII

Imino-Paarung

Abb. C4.55: Die zwei Möglichkeiten einer Homo-AA-Paarung, die antiparallele

Strangorientierung bei anti-Orientierung der glycosidischen Bindung erlauben.

Nach den Ergebnissen von Diedrichsen [89] entfällt eine Iminopaarung. Eine

sehr willkommene Stützung dieser Resultate wurde durch Oligonucleotide, die

Homo-deoxy-7-carbaadenin enthalten, erbracht.

Wenn man einen H-Brückenacceptor durch eine neutrale Gruppe ersetzen

würde, könnte effizient eine H-Brücke selektiv eliminiert werden. Die


exozyklische N(6) Aminogruppe kann nicht entfernt werden, da dann jeweils

beide Wasserstoffbrücken sowohl in I, wie auch in II wegfallen würden. Eine

Paarung wäre dann in jedem Fall ausgeschlossen.Wenn man aber das N(7) durch eine bezüglich Wasserstoffbrückenbildung

neutrale CH-Gruppe ersetzt, ist eine Basenpaarung im Fall I sehr wohl noch

möglich, bei II würde nur noch eine einzige H-Brücke je Basenpaar möglich sein,

und ein Duplex hätte, sofern er überhaupt noch entstünde, eine deutlich tiefere

Schmelztemperatur als der von dd(A6) gebildete Duplex.

dd(A6) - dd(7CHA5-A)% Hyperchromizität

8-«

6-

4-

dd(Ag) 9.5 uM•

•

•

•

•

2-•

•

0-

-2-

C

""•-•—w— dd(7CHA5-A) 8.7 p.M

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.56: Das Homo-deoxy-7-carbaadenosinoligonucleoHd zeigt im Gegensatz zu dd(Aj)

kein Schmelzverhalten. dd(A4): 43°C (9.5 pM, 7% Hyp.); dd(7CHAs-A): -°C (8.7 pM, -%

Hyp.).

Wie die Schmelzkurven in Abb. C4.56 sehr schön illustrieren, findet im Fall

von dd(7CHAs-A) keine Paarung mehr statt. Dieses Resultat zeigt indirekt, aber

nichts desto weniger eindeutig, dass die AA-Paarung dem Typ I entsprechenmuss.

In einer reverse Hoogsteen-artigen AA-Paarung sind die beiden Partner nicht

gleich verknüpft. Das eine Adenin paart als Pyrimidin Partner (Watson-Crick-

artig gepaart) und das andere als Imidazol Partner (Hoogsteen-artig gepaart).Im AA-gepaarten Homo-DNA Duplex sind verschiedene Abfolgen der Imidazol

resp. Pyrimidin Partner in einem Oligonudeotidstrang möglich (vgl. Abb. C4.57).

Homo-deoxy-7-carbaadenosin kann nur mit seinem Pyrimidinkern eine Watson-


Crick-artige Paarung eingehen. Deshalb ist an der Stelle in Abbildung C4.57, wo

WC steht ein Homo-deoxy-7-carbaadenosin zu verstehen.

H WCn rH WC-n rH WCi rH WC

H WC- -H WC- -H WC- -WC H

H WC- -H WC- -H WC- -H WC

H WC- -H WC- -WC H- -WC H

H WC- -H WC- -WC H- -H WC

H wc-l LWC H-> LWC HJ LWC H

II III IV

Abb. C4.57: Müssen bei einer AA-Paarung in Homo-DNA die Watson-Crick-Donoren alle auf

einem Oligonucleotid angeordnet sein, müssen sie alternieren oder ist die Reihenfolge frei? WC

steht für Watson-Crick-artig gepaarte Nucleoside (Homo-deoxy-7-carbaadenosin) und H für

reverse Hoogsteen-artig gepaarte Nucleoside.

Das Oligonucleotid dd(7CHA3-Aj) entspricht dem Paarungsschema III und

dd(7CHA-A)3 dem Paarungsschema IV in Abbildung C4.57.

Wie man den Schmelzkurven von drei Oligonucleotidtypen in AbbildungC4.58 entnehmen kann, ist die Schmelztemperatur höher, je homogener die

Funktionen der Paarungspartner (Pyrimidin- oder Imidazolpartner) auf je einem

Oligonucleotidstrang verteilt sind.


6-

• • dd(A6) 9.5 pM

,CHdd(7"nA-A)3 17.0 uM

,CHdd(7onA3-A3) 15.8 uM

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.58: Die Schmelzkurven zeigen deutlich, dass alle Watson-Crick-Donoren in einer AA-

Paarung auf einem Oligonucleotidstrang angeordnet sein müssen, denn die Schmelztemperatur


mit einem Funktionswechsel liegt schon deutlich unterhalb demjenigen von dd(A6), aber

deutlich höher als diejenige der Sequenz mit 5 Funktionswechsel dd(7CHA-A)3.

Sequenz Anzahl

Funktionswechsel

Tm[°C]

dd(7CHA-A)3 5 < 20°C (15.8 uM)

dd((7CHA)3-A3) 1 33°C (17.0 uM)

dd(A6) 0 43°C (9.5 uM)

Aus der Tatsache, dass die Blocksequenz dd(7CHA3-A3) eine tiefere

Schmelztemperatur aufweist als dd(A«), muss geschlossen werden, dass im Fall

von dd(A6) entlang des Oligonucleotids kein Paarungsfunktionswechselstattfindet, dass die Hoogsteen- und Watson-Crick-artig gepaarte Basen jeweils

homogen auf einem Strang vorliegen (vgl. I in Abb. C4.57), und dass ein

Funktionswechsel zu Struktur III in Abbildung C4.57, wie es im Fall von

dd(7CHA3-A3> unumgänglich ist, sich destabilisierend auswirkt. Diese Ordnungdürfte allerdings nicht fix sein, sondern müsste sich in einem schnellen

Austausch befinden, da die NMR - Experimente von Böhringer im Fall von

dd(A«) keinen Hinweis auf zwei verschieden gepaarte Oligonucleotidstränge

zeigen [18].

Von diesen Oligonucleotidsequenzen wurden noch CD-Spektren gemessen.

Wie man sieht, gleichen sich die Spektren immer mehr demjenigen von dd(A«)

an, je weniger Funktionswechsel sie haben.

5°C

Abb. C4.59: CD.Spektren bei 5°C von dd(A<): 16.7 pM; dd^Aj-A,):

19.0 pM; ddCT^A-A),: 233 pM.

-101- allgcmemer Teil

C.4.7.3 Beitrag von Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltenden

Oligonucleotiden zur Kentnis der AC-Paarung

Wie in Kapitel C.4.4 postuliert, existiert eine AC-Paarung. Diese AC-Paarung ist

relativ schwach. Sie ist die bisher schwächste aller aufgefundenen Paarungen, die

Homo-deoxy-adenosin mit einem anderen Nucleosid eingeht. Sie wurde bisher

nur in alternierenden AC-Sequenzen festgestellt, da in blockweisen Sequenzen

(dd(A4C4> und dd(A5C5)) jeweils eine AA-Paarung vorliegt, wie mittels CD-

Spektroskopie gezeigt wurde. Unter Annahme einer anti Orientierung der

glykosidischen Bindung von Homo-deoxy-adenosin und Homo-deoxy-cytidin bei

antiparalleler Strangorientierung würde also nur die Paarung, die in Abbildung

C4.60 mit Typ II bezeichnet wurde, erlaubt sein. Typ I wurde nämlich bei einer

anti Orientierung der glycosidischen Bindung eine parallele Strangorientierung

oder aber bei antiparalleler Strangorientierung eine syn-/anti-Orientierung der

glycosidischen Bindungen von Homo-deoxy-adenosin resp. Homo-deoxy-cytosin

voraussetzen.

HO HO

frO

H-N

H"

\

\

H

1

1

°Jho rHO II

Abb C4 60. Unter der Voraussetzung, dass die Nucleobasen in ihren stabilsten

tautomeren Formen eine AC-Paarung eingehen und dass der glycosidische Winkel der

Nudeotide bei einer AC-Paarung jeweils anti zum Zuckerring steht, sind I und II die

einzigen Möglichkeiten für eine Homo-AC-Paarung


Die UV-Schmelzkurve von dd(7CHA-C)j (vgl. Abb. C4.61) zeigt mit steigender

Temperatur eine lineare Abnahme der Absorption bei 260 nm, also keine

Selbstpaarung. Das beweist, dass eine Hoogsteen-Paarung bei einer AC-

Interaktion vorhanden sein muss. Es verbleibt unter Einbezug der hauptsächlich

vorliegenden tautomeren Form von Cytosin nur die Möglichkeit einer

Basenpaarung der Struktur des Typs II, welche dann zu antiparalleler

Orientierung der Oligonucleotidstränge führt. Das Experiment zeigte also

gleichzeitig, dass die Oligonucleotidstränge antiparallel orientiert sind und damit

in den bisher bekannten Paarungseigenschaften der Homo-DNA keine

Ausnahme bildet.

dd(AC)6 - dd(7CHA-C)6% Hyperchromizität

15-#B##

..•"*' ——-~~— dd(AC)6 8.1 pM

10-•

•

5-

0-

•

•

••

^^*"'*,M*,*,*-**wdd(7CHA-C)6 8.0 uM

c 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.61: dd(7CHA-C)» zeigt im Gegensatz zu dd(AO« keinen kooperativen Schmelzübergang, was

beweist, dass eine AC-Paarung reverse Hoogsteen-artig gepaart sein muss.

C.4.7.4 Einige neue Informationen zur AT-Paarung

Die Eigenschaften der AT-Paarung wurde sehr ausführlich von H.-J. Roth in

seiner Arbeit beschrieben [21]. Ergänzend zu den NMR-Untersuchungen von

Roth [21] anhand des AT-gepaarten Oligonucleotids dd(A5T5) wurden unter

Verwendung des Homo-deoxy-7-carbaadenosinnucleosids Sequenzen

konstruiert, welche die Art der AT-Paarung auch mit Schmelzexperimenten

aufzeigen lässt. Bisher ist es aufgrund von Selbstpaarungseigenschaften von

Homo-deoxyadenosin Oligonucleotiden noch nicht gelungen, die AT-Paarung in


monobasigen Homo-deoxyadenosin und Homo-thymidin Sequenzen zu

beobachten.

Mit monobasigen Homo-deoxy-7-carbaadenosin Sequenzen, die keine

Selbstpaarung des AA-Typs eingehen können, ist es gelungen, eine pseudo AT-

Paarung in monobasigen Oligonucleotiden aufzuzeigen und thermisch zu

denaturieren. Man vergleiche dazu die UV-Schmelzkurven in Abbildung C4.62.

Man erreichte mit diesem Experiment zwei Ziele:

- erstens wurde erneut bewiesen, dass A mit T wirklich nach dem Watson-Crick

Modus paart.- zweitens konnte zum ersten Mal ein Duplex aus monobasigen Oligonucleo¬

tiden 'dd(A6)' • dd(T6) hergestellt werden.

% Hyperc25-

20-

15-

10-

5-

dd(AT)3 - dd(7CHA5-A)-dd(T6)""""i^'

^dd(7CHA5-A)

/*"* -"-•*•—~+ dd(T6) je 88 ^M

.^"""———- dd(AI)3 12.8 uM

C

f 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.62: Vergleich des monobasigen dd(T6) • 'dd(A«)' - Duplex mit dem

alternierenden dd(AT)j Oligonucleotid. dd(7CHA5-A) • dd(T»): 23°C (je 8.8 pM, 24 %

Hyp.); dd(AT)3: 24°C (12.8 pM, 19% Hyp.).

Das CD Spektrum von dd^HAs-A) • dd(T6) (Abb. C4.64) weist deutlich auf eine

Watson-Crick-artige AT-Paarung hin (man vergleiche auch mit den CD-Spektren

von dd(AT)5 und dd(A5T5) in [21]).


Abb. C4.64: Das CD-Spektrum von dd(7CHA5-A) • dd(T4) entspricht

ziemlich genau demjenigen der alternierenden Homo-AT-

Oligonucleotidsequenz dd(AT)j, die Roth [21] gemessen hat.

C.4.7.5 Der Purin-Purin-Purin Triplex1

Die Experimente in diesem Kapitel wurden zum Teil von K. Zimmermann [81]

durchgeführt.

Untersuchungen von Fräser [52] und Hunziker [22] über Paarungseigenschaftenvon Oligonucleotiden der Homo-DNA Serie, die Isoguanin und Guanin als

Basen enthalten, zeigten die Existenz einer Gl-Paarung, die vermutlich Watson-

Crick-artig dreifach verbrückt ist.

Dass diese Homo-GI Paarung dreifach verbrückt ist, wird aus den hohen

Schmelztemperaturen geschlossen (dd(Ge) + dd(l6>: 61°C je 9 uM). Diese

Schmelztemperaturen sind ähnlich hoch wie diejenigen des dreifach Watson-

Crick-artig verbrückten Homo-GC Duplexes in dd(G6) • dd(C6) (Tm= 58 °C, je

9uM).

Eine Gl-Paarung mit diesem Paarungsmuster (Abb. C4.65) besitzt bei geforderter

anti-Orientierung der glycosidischen Bindung im Duplex antiparallel

angeordnete Oligonucleotidstränge.

1 In natürlichen Oligonucleotiden konnte bisher nur ein Purin-Purin-Purin Tripelstrang von RNA

nachgewiesen werden, nämlich der (r(H.))2 • r(A,) durch Arnott [73]. Bei diesem Tripelstranghandelt es sich eigentlich nur um ein zu einem Purinringsystem vergrösserten (rdJ„))2 • r(A„) Triplex.


..o.XV^'OHOH

HO

HO"

Abb.C4.65: Von Fräser [47] und Hunziker [22] postulierte Homo-G Homo-I

Paarung.

Im Hinblick auf die Frage nach der Möglichkeit einer Sequenzreproduktion via

Triplexstrukturen1 von Homo-DNA nach dem Hoogsteen-Modus wurden die

Paarungseigenschaften von dd(A6), dd(Gt) und dd(l6> in verschiedenen

stöchiometrischen Anteilen untersucht.

1 Felsenfeld und Rieh fanden anhand von Mischkurven, dass poly(U) und poly(A) einen stabilen 2 :1

Komplex bilden (75]. Der dritte Oligonucleotidstrang (poly(U)) lagert sich in einem solchen

Komplex in der major groove des poly(A)-polyCU) Duplexes an und paart reverse Hoogsteen-artigmit dem poly(A) Strang.

<-CK

Kurz nach diesen Versuchen wurden auch DNA Triplexe gefunden: d(A„) (d(T„))2 und auch solche

mit einem protonierten Cytosinoligonucleotid und einen GC-Duplex [76], [77], [78].

Amol konnte anhand einer Röntgenkristallstrukturanalyse zeigen, dass die von Rieh aufgestelltenVoraussagen zutreffen [79].

Folgendes Schema der vier wichtigsten Triplexe nach Dervan und Mitarbeitern [80] gibt Aufschluss

über die Orientierung der Oligonucleotide zueinander (Bemerkungen zur Abbildung:'-' bedeutet

jeweils, dass die 5'-3' Richtung nach unten zeigt,'+', dass die 5'-3' Richtung des Oligonucleotids aus

der Zeichenebene herauskommt).

+ ++++- +

arvc b>A-: oy^Gf d^GCEine Hoogsteen-Paarung ist also auch in natürlicher DNA, da allerdings nur in Triplexen, möglich(die AA- und die GG-Paarung in b) und c) entsprechen den von uns für Homo-DNA postulierten AA-

und GC-Paaningen) [80].


In all diesen Versuchen konnten der hohen Selbstpaarungseigenschaften dieser

Sequenzen wegen nur Gemische von Duplexen beobachtet werden.

Die Duplexschmelztemperaturen der zugrundeliegenden Oligonucleotideweisen alle eine Schmelztemperatur von über 40°C bei 15 - 20 uM auf (Tm: dd(A6)

= 47°C, dd(G6) = 43°C, dd(I«) = 42°C). Dies ist insbesondere relevant, da die

Abspaltung des dritten Stranges mit einem Tm-Wert von etwa 20°C verknüpftsein müsste, wie in den folgenden Experimenten mit Homo-deoxy-7-carbaadenosin enthaltenden Oligonucleotiden gezeigt werden konnte.

Das einzige Purinoligonucleotid, das genügend starke Watson-Crick-artige

Paarungen ausbilden könnte, ohne selbst eine hohe Schmelztemperatur bei

Selbstassoziation zu zeigen, war das dd((7CHA)j-A) (Kapitel C.4.7.2).

Ein nicht denaturierendes Polyacrylamidgel, auf dem ein 1:1:1 Gemisch an

dd(Ge): ddfU): dd(7CHA5-A) aufgetragen wurde, zeigte eine neue Bande, die als

Triplex gepaarte Spezies interpretiert wurde1. Aus diesem Grund wurde

versucht, auch mittels UV-Schmelzexperimenten die Triplexbildung zu

bestätigen (Abb. C4.66).

Purin-Purin-Purin Triplex mit Homo-DNA

% Hyperchromizität15

10

—CT i

/ dd(G6) + dd(l6) + dd(7CHA5-A)

i——i——i——i——i—i—i——i——i

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C4.66: Schmelzkurve eines 1:1:1 Gemischs von dd(G6): dduV: dd(7CHAr

A). Es zeigten sich zwei verschiedene, sauber getrennte Schmelzübergänge, die

sich nur mit dem Auseinanderbrechen eines Tripelstranges zu einem Duplex (bei

etwa 20°C) und bei etwa 63°C des übriggebliebenen Duplexes erklären lassen.

Tm: 21/63°C (je 6.0 pM, 7/6% Hyp.).

^Alle nicht denaturierenden G-I PAGE-Experimente werden von K. Groebke [42] erläutert und

detailiert besprochen.


Tatsächlich erhielt man zwei sauber getrennte Uebergänge, die nur mit dem

Uebergang eines Tripelstranges zu einem Doppelstrang und einem Einzelstrang(tiefe Temperatur) und anschliessender Spaltung des verbliebenen

Doppelstranges erklärt werden können. Die Temperatur des zweiten

Schmelzprozesses stimmt sehr gut mit derjenigen des dd(G6) • dd(I6) Duplexüberein und ordnet somit dem Schmelzprozess bei der tieferen Temperatur den

Uebergang vom Triplex zum dd(7CHAs-A) und dem dd(G6) • dd(I6) Duplex zu.

Die Schmelzkurve des Tripelstranges ist vollständig reversibel.

Abb. C4.67: Das temperaturabhängige UV-Spektrum von dd(G«): dd«,)

: dd(7c"A5-A) -1:1:1, je 6.0 pM im Standardpuffer pH 7.0.

Das temperaturabhängige UV-Spektrum (Abb. C4.67) und die CD Messung (Abb.

C4.68) verdeutlichen diese Resultate in einer anderen Form. In der Grundaussage

entsprechen auch sie der in der Schmelzkuve gefundenen Tatsache von zwei

Uebergängen.


Abb C4 68 Das temperaturabhängige CD-Spektrum von dd(G() dd(I4)

dd(7CHA5-A) = 1 1 1, je 4 65 pM im Standardschmelzpuffer pH 7 0 zeigt einen

deutlichen Unterschied für das Tnplex CD-Spektrum (3°C, 10°C) gegenüber dem

GI-Duplex + dd(7CHA5.A)-Spektrum (Kurven bei 350C, 50°C) Die Bande bei 297

nm verschiebt sich bathochrom, die Bande bei 270 nm verschwindet und die

Bande bei 252 nm verschiebt sich hypsochrom beim Uebergang vom Tnplex zum

Gl-gepaarten Duplex

dd(Gs) • ddO«) • dd(7CHA5-A)

Tm 21oC(je60pM,7%Hyp)

dd(G6)dd(I6) +dd(7CHA5-A)

Tm 63°C(je60pM,6%Hyp)

dd(G6) + dd(I6)

t

Abb C4 69 Schema des Schmelzprozesse des Tnplex dd(G«) dd(I«) dd(7CHArA)

1 Uebergang Zerfall des Tnplexes in einen GI-Duplex (21°C) und dann Zerfall des

GI-Duplexes in die Einzelstränge (63°C)

Wie aus Abb. C 4 70 hervorgeht, wird der dritte Strang (dd7CHAs-A) antiparallelzum Strang orientiert sein, an den er gebunden ist (also antiparallel an ddde)),

wenn wir die üblicherweise gefundene anti-Orientierung der glycosidischen


Bindung voraussetzen. Das dem Tripelstrang zugrunde liegende Basentriplett

kann eigentlich nur diese Basenpaarung aufweisen, denn eine Paarung des 7-

Carbaadenin mit Guanin ist auszuschliessen

CMX.

-o. i=\-£^Ä"H-\ \. ....-'* V^

H

..-H'Y

HO

HO"

Abb. C4.69: Die einzige Möglichkeit, ein G-I-TCHA-Triplex bei vorgegebener

H-N(3) Tautomerie am Isoguanin zu formulieren.

Untersuchungen über Duplexstrukturen und Eigenschaften in der AI-Reihe

von Homo-DNA Oligonucleotiden wurden von K. Groebke [42] ausgeführt und

beschrieben. Die gegenüber einer isostrukturellen AI-Duplexpaarung gefundene

Schmelzpunktabsenkung von über 20°C hängt möglicherweise mit den

veränderten Ladungsrepulsionseffekten im Triplex gegenüber einem Duplex

zusammen.


C.5 Oligonucleotide der Allopyra-nose-Reihe, die Allopyranosyl-isoguanin enthalten

C.5.1 Einleitung

Es ist aus Arbeiten von Fischer und Helg [50], [51] bekannt, dass Allopyranose-NA Oligonucleotide deutlich tiefere Schmelztemperaturen als Homo-DNA

Oligonucleotide mit der gleichen Sequenz haben. So ist die Schmelztemperatureines allo(A12) (Tm = 29°C, 10.0 uM, 56% Hyp.) sogar noch tiefer als diejenige des

nur halb so langen Homo-DNA Oligonucleotids dd(A6) (Tm = 43°C, 9.5 uM, 7%

Hyp.). Auch die CD-Spektren von Allopyranose-NA Oligonucleotiden

unterscheiden sich deutlich von den CD-Spektren der analogen Homo-DNA

Oligonucleotide, was auf eine andere Struktur der Allopyranose-NA

Oligonucleotide schliessen lässt.

Zwischen Allopyranose-NA und Homo-DNA bestehen allerdings auch

Gemeinsamkeiten. So ist in der Homo-DNA eine AU-Paarung deutlich

schwächer als eine AA-Paarung. In der Allopyranose-NA Reihe konnte bisher

noch keine AU-Paarung beobachtet werden. Weder allo(AU)«, noch

allo(UUAAAAUAAUUU) mit dem komplementären Oligonucleotid

allo(AAAUUAUUUUAA) zeigten Hinweise auf AU-Paarungen, sondern nur

auf AA-Paarungen, wie sich aus den CD-Spektren ergab.

Der Grund für die im Vergleich zur Homo-DNA drastisch abgeschwächten

Paarungen liegt vermutlich darin, dass die äquatoriale 2'-Hydroxygruppe der

Allopyranose eine Basenstapelung stört und deshalb die Schmelzenthalpie z.B.

des Adenin-Adenin gepaarten Duplexes gegenüber der Homo-DNA Reihe

drastisch abschwächt (Abb. C5.1).


Abb. C5.1: Die äquatoriale 2'-Hydroxygruppe liegt direkt zwischen den

Basenebenen und stört auf diese Art das 'base stacking'.

Für diese Erklärung sprechen auch die thermodynamischen Daten von

allo(Ai2). Der Vergleich mit dem halb so langen und deshalb halb so viele

Wasserstoffbrücken (eine gleichgeartete AA-Basenpaarung wird hierbei

vorausgesetzt) aufweisenden dd(A«) ergibt folgende Daten:

AH°VH

[kcal mol-1]

AS0

[cal mol"1 K-1]

TAS°(298K)

[kcal mol-1]

AG0 (298 K)

[kcal mol-1]

dd(A6)1 -39.4 -101 -30.2 -9.2

allo(Au) -67.8 -202 -60.1 -7.7

Der Enthalpieterm von allo(Ai2> ist im Gegensatz zum Entropieterm

betragsmässig nicht doppelt so gross wie derjenige von dd(A6>, was bedeutet, dass

die Schwächung der AA-Paarung der Allopyranose NA gegenüber Homo-DNA

enthalpischer Natur ist.

Untersuchungen von K. Groebke mit Altropyranose-NA [42], bei der die 2'-

Hydroxygruppe axial steht, und von R.P. Hammer mit 2'-Deoxyallopyranose und

3'-Deoxyallopyranose [82] zeigten sehr deutlich den markanten Einfluss der

äquatorialen 2'-Hydroxygruppe von Allopyranose2. Mit Altropyranose-NA und

1 Die thermodynamischen Daten wurden von M. Böhringer (dd(A<)) [18], resp. R. Fischer (allo(A12))[50] nach der Methode ® in Kapitel C.4.1 gemäss Marky & Breslauer [59] bestimmt.2 Die Resultate der angetönten Experimente sind in wenigen Worten zusammengefasst:- Ein Altropyranosyl-adenin Dodecamer hat eine Schmelztemperatur von 39°C (8.5 pM, 20% Hyp.)[42].


noch deutlicher mit 2'-Deoxyallopyranose-NA wurde gegenüber Allopyranose-

NA eine markante Erhöhung der Schmelztemperatur erzielt, während die

Schmelztemperatur bei 3'-Deoxyallopyranose-NA vergleichbar niedrig wie

diejenige von Allopyranose-NA ist.

Wie Fräser [47] in der Homo-DNA Reihe zeigte, bildeten Homo-deoxy-

isoguanin und Homo-deoxy-guanosin (neben dem Nucleotidpaar mit den

Aglycons Diaminopurin und Xanthin [42]) die stärkste Basenpaarung aus.

Bilden nun Isoguanin- und Guanin-haltige Allopyranose-NA Oligonucleotid-

duplexe mit deutlich höheren Schmelztemperaturen als z.B. allo(Gn) oder

allo(A„)? Paaren allfällige Duplexe in einer Watson-Crick-artigen Weise, wie im

Fall von Guanin und Isoguanin enthaltenden Homo-DNA Oligonucleotiden?

In Arbeiten von Benner und Mitarbeitern [83], [84] konnte gezeigt werden, dass

als Paarungspartner von Isoguanin sowohl Deoxyisocytidin als auch Thymidin

agieren konnten. Dies folgte daraus, dass durch Zugabe einer DNA-

.-*"*°^yx^!v>, I_T Paanm8

H^^H'*' T ] (Deoxy-isoguanosin in der Enolform)

Y

M ^H

I-iso-C Paarung(Deoxy-isoguanosin in der H-N(l)-Form)

Abb. C5.2: Benner [84] zeigte, dass N-9-(ß-D-deoxyribofuranosyl)-isoguanin nur mit

Thymidin und mit Deoxy-isocytidin eine Basenpaarung eingeht, dass Deoxy-isoguanosin

also entweder in der Form des Enoltautomeren oder aber im H-N(l) Tautomeren vorliegen

- Ein Hexamer von 2'-Deoxyallopyranosyladenin hat eine Schmelztemp. von 39°C (10 uM, 12%

Hyp.) [82]- Ein Hexamer von 3'-Deoxyallopyranosyladenin hat eine Schmelztemp. von 14°C (11.2 pM, 38 %

Hyp.) [82].Als Vergleiche dazu: allofA,): 16°C (11 pM, 48% Hyp.); dd(A«>: 43°C (9.5 pM, 9% Hyp.).


muss. Die Replikation von Thymidin ist also ungenau, denn es paart sowohl mit

Deoxyadenosin, als auch mit Deoxy-isoguanosin.

Polymerase (Klenow Enzym) und verschiedenen Deoxynucleosidtriphosphatennur Deoxyisocytidin und Thymidin als Paarungspartner für ein Deoxyisoguaninenthaltendes Oligonucleotid eingebaut wurden. Dieses Resultat Hess sich als

Folge von verschiedenen tautomeren Formen von Isoguanin interpretieren.Dabei würde die Enolform eine Paarung mit Thymidin und die tautomere Form

mit dem Proton am N(l) eine Paarung mit Deoxy-isocytidin erklären (vgl. Abb.

C5.2).

Aus Arbeiten von Kazimierczuk und Mitarbeitern geht hervor, dass Isoguanin

in wässriger Phase in der tautomeren Form mit dem Proton am N(l) vorliegt

[85], [86], [87], [88]. Er glaubt, zeigen zu können, dass Isoguanosinribonucleosid in

wässriger Phase ausschliesslich in der tautomeren Form mit dem Proton am N(l)

vorliegt. In einer aussagekräftigen Arbeit synthetisierte er die, in Abbildung C5.3

skizzierten, substituierten Isoguaninbasen und verglich deren UV-Spektren in

Wasser mit denjenigen des Isoguanosinribonucleosids.

Aufgrund von am N(9) methyliertem Isoguanin als Modellverbindung des

Deoxyisoguanosinnucleosids und verschiedenen Alkylierungsprodukten davon

(II, III, IV in Abb. C5.3), konnte Kazimierczuk aus der Aehnlichkeit der UV-

Spektren von I und II mit demjenigen von Deoxyisoguanosin zeigen, dass

letzteres in der tautomeren Form mit dem Proton am N(l) vorliegt [86].

Dass die Energien der verschiedenen tautomeren Formen nahe beieinander

liegen, zeigt neben dem Experiment von Benner und Mitarbeiter [83], [84] auch

die Tatsache, dass in einem apolareren Lösungsmittel als Wasser, nämlich

Dioxan, dem UV-Spektrum nach, die Enolform vorherrscht1.

1 Das Verhältnis der Enolform zum H-N(l) Tautomeren in Dioxan war » 5:2 [102].


Hv ^HN

N-

ICH3

K(H20) = <0.1

K(Dioxan)« 2.5

N

/Y^MHCH3

Deoxyisoguanosinnucleosidanaloges

II

Analoges zum H-N(l) Tautomeren

Analoges zum H-N(3) Tautomeren Analoges zum Enoltautomeren

Abb. C5.3: Die von Kazimierczuk und Mitarbeitern [86] synthetisierten Isoguaninderivate:

Modellverbindungen zu den verschiedenen möglichen tautomeren Formen für Isoguanin.

Die Ergebnisse von Benner [84] entsprechen denjenigen von Kazimierczuk [86]

aber in keiner Weise den von Fräser für die in der Homo-DNA Reihe

gefundenen Resultaten [47].


C.5.2 Hexa- und Octanucleotide von Allopyra-nosyl-isoguanin

Die Eigenschaften dieser Oligonucleotide weichen drastisch von den

Eigenschaften anderer Allopyranose-NA Oligonucleotide ab.

Die Schmelztemperatur von allo(I() betrug, wie aus Abbildung C5.4 hervorgeht,18°C (12.7 uM, 22% Hyp.), und die von allo(I8) 29°C (8.7 uM, 27% Hyp.). Das ist

deutlich höher als diejenige von allo(Ag) (16°C, 11.0 uM, 48% Hyp.) oder für

allo(G8) (13°C, 9.8 uM, 14% Hyp.). Auch das CD-Spektrum von allo(I8)

unterscheidet sich sehr stark von demjenigen von allo(A8) und allo(Gs). Man

vergleiche dazu die in Abbildung C5.37 aufgeführte Uebersicht von CD-Spektren

und Schmelzkurven von allo(Gg) + allods), allo(Gg), allods) und allo(Ag).

Abb. C5.4: Schmelzkurven von allo(I() und allo(It) im Standardpuffer pH

7.0, bei 247 nm gemessen, alloü,): 18°C (12.7 pM, 22% Hyp.); allo(I„): 29°C

(8.7 pM, 27% Hyp.).

Bereits im Fall der monobasigen Allopyranosyl-isoguanin-oligonucleotide

ergeben sich Schwierigkeiten bei der Aufklärung der Basenpaarung.

Das CD-Spektrum von allo(I8) ist in Abb. C5.37 auf Seite 149 abgebildet.Mit den vier prinzipiell möglichen tautomeren Formen der Isoguaninbase lässt

sich eine grosse Anzahl Isoguanin - Isoguanin Paarungen formulieren. Unter

Ausschluss der unwahrscheinlichen Imino- und Enolformen, verbleiben noch


die tautomeren Formen mit dem Proton entweder am N(l) oder am N(3).

Nehmen wir weiter an, dass eine reine Watson-Crick Paarung nicht eintritt1,

und schliessen eine Hoogsteen-artige Basenverknüpfung III2 aus, bleiben noch

die zwei in Abbildung C5.5 abgebildeten Möglichkeiten I und II für eine I-I-

Paarung.

H-N(l) tautomere Form H-N(3) tautomere Form

R

n H

R«

H—N

H-N(l) oder H-N(3)tautomere Form

antiparallele Orientierungder Oligonucleotidsträngebei anti-Orientierung der

glycosidischen Bindungreverse Hoogsteen

antiparallele Orientierungder Oligonucleotidsträngebei anti-Orientierung der

glycosidischen Bindungreverse Hoogsteen

parallele Orientierungder Oligonucleotidsträngebei anti-Orientierung der

glycosidischen Bindung

Hoogsteen

Abb. C5.5: Wenn die nachfolgend aufgezählten Annahmen akzeptiert werden, bleiben noch die

zwei skizzierten Möglichkeiten I und II für eine II-Paarung. Die Annahmen waren: Kein Enol- oder

Iminotautomeres von Isoguanin, antiparallele Orientierung der Oligonucleotidstränge sowie anti

Orientierung der glycosidischen Bindung.

Es war infolge der geringen Löslichkeit der Allopyranose-NA Oligonucleotidenicht möglich, mittels NMR-Spektroskopie zu zeigen, dass die glycosidische

Bindung anti orientiert ist. Diese Annahme wurde deshalb aus Analogie zur

Homo-DNA so postuliert.

1 Eine im Fall von Allopyranosyl-NA wohl begründete Annahme, da selbst bei Allopyranosyl-cytosin und Allopyranosyl-guanin enthaltenden Oligonucleotide keine WC-Paarung bewiesen

werden konnte.

2 Sie wurden aus Analogie zur Homo-DNA ebenfalls weggelassen.


Es ist unmöglich, nur aufgrund von Schmelzkurven und CD-Spektren eine

dieser zwei Paarungsmöglichkeiten I oder II auszuschliessen.

Aus der Uebereinstimmung der UV-Spektren (vgl. Abb. C5.6) des freien

Allopyranosyl-isoguaninnucleosid (c)) und dem Oligonucleotid (allo(I8) d)) mit

der Base II (Abb. C5.3), (b)) von Kazimierczuk ist die Annahme der tautomeren

Form mit dem Proton am N(l) gerechtfertigt. Unter der Annahme, dass die

Zuordnung der tautomeren Formen zutrifft, müsste eine Basenpaarung im

Duplex nach Typ I in Abbildung C5.5 bevorzugt werden. Der geometrischeUnterschied der beiden Basenpaarungstypen I und II ist relativ gering, es handelt

sich im Prinzip nur um eine translatorische Verschiebung der Basen zueinander.

Abb. C5.6: UV-Spektren von N-9-(ß-D-Ribofuranosyl)-isoguanin (a)), N-9-Methyl-

N^N'-tethylenMsoguanin (b)), Allopyranosyl-isoguanin Nucleosid 65 (c)), allo(I8) bei

45°C (d)). a) und b) wurden von Kazimierczuk [86] in Wasser, c) und d) im Standardpuffer

pH 7.0 gemessen.


C.5.3 Allo(G8) und allo(I8)

Die in der Homo-DNA gefundene starke Gl-Paarung war der Anlass zur

Untersuchung von Guanin- und Isoguanin-haltigen Allose-NA Oligonucleo¬

tiden.

Abb. C5.7: Drei Schmelzkurven von allo(Gt) + allod,) 1 : 1. Sie wurden im

Standardpuffer pH 7.0 bei 250 nm aufgenommen.

Ein Schmelzexperiment eines Gemischs von allods) und allo(G8) ergab eine

Schmelzkurve mit einem Tm-Wert von etwa 36°C.

Man sieht in Abb. C5.7, dass die verschiedenen UV-Schmelzkurven keine

einheitliche Form aufweisen. Vielmehr scheint es, als ob der Schmelzprozess aus

verschiedenen Teilübergängen zusammengesetzt ist. Eine genaue Bestimmung

der Schmelztemperatur war deshalb nicht bei allen Kurven möglich. Besonders

bei einer Duplexkonzentration von 4.20 |iM ist es klar, dass verschiedene

Uebergänge in den Schmelzvorgang involviert sind.

Dass dieser Schmelzprozess nicht etwa nur aus einer Ueberlagerung der

Schmelzvorgänge von allods) sowie allo(G8) zusammengesetzt war, konnte

(neben der höheren Schmelztemperatur des 1 : 1 Gemischs gegenüber den zwei

einzeln untersuchten Oligonudeotiden allods) und allo(G8) mit einem Vergleich

des CD-Spektrums von allo(I8), allo(G8), der mathematischen Summe dieser

beiden CD Kurven und dem CD-Spektrum des 1 : 1 Gemischs von allo(G8) +

allo(Ig) bei 5°C (also unterhalb der Schmelzpunkte aller beteiligten Spezies)


gezeigt werden (vgl. Abb. C5.8). Die Summe der CD-Spektren der einzelnen

Oligonucleotide allods) und allo(G8) zeigte deutliche Unterschiede zum CD-

Spektrum des 1 :1 Gemischs. Es müsste also eine neue Paarung eingetreten sein.

Abb. C5.8: Da die mathematische Summe von allo(G8) und allod«) nicht

mit dem CD-Spektrum des 1 :1 Gemischs übereinstimmte, war bewiesen,

dass eine neue Spezies gebildet worden war. Alle Spektren wurden im

Standardpuffer pH 7.0 bei 5"C und einer Oligonucleotidtotalkonzentration

von etwa 8 pM aufgezeichnet.

Alle Kurven in Abb. C5.7 zeigen bei Temperaturen über 60°C noch einmal eine

leichte Zunahme der Hyperchromizität. Dieser Effekt ist bei der Kurve mit einer

Konzentration von je 3.04 uM am deutlichsten sichtbar. Da nicht klar war, ob

diese Absorptionszunahme der Lösung oligonucleotidabhängig war oder ob es

sich um einen Verdunstungseffekt der Oligonucleotidlösung handelte, wurde

ein Schmelzexperiment bis zu einer Temperatur von über 90°C durchgeführt.Tatsächlich konnte, wie Abbildung C5.9 zeigt, ein zweiter Uebergang festgestelltwerden. Dieser zweite Uebergang war durch eine Schmelztemperatur von etwas

über 80°C gekennzeichnet und besass eine bedeutend grössere Hyperchromizitätals der erste. Die Abkühlkurve weist eine extrem grosse Hysterese gegenüber dem

Uebergang bei höherer Temperatur von etwa 40°C auf. Wie aus der

Abkühlkurve weiter hervorgeht, scheint die Renaturierung unter den gewählten

Bedingungen (0.5°C/min. Kühlrate) in einem scheinbar konzertierten Prozess


abzulaufen (vgl. Abb. C5.9). Beim erneuten Erwärmen derselben Probe bilden

sich dann, wie das Profil der UV-Schmelzkurve zeigte, dieselben zwei

Uebergänge aus, was die Reversibilität der beobachteten Paarungs- und

Entpaarungsprozesse bestätigt.


allo(G8) + allo(l8)je1.96]iM

r

—£- Abkühlkurve 35°C

1. Schmelzkurve 36/82°C

2. Schmelzkurve 37/82°C

'—i—r_i— i —i—i—i—"—i—i—i—i—i—i—i

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C5.9: Eine Oligonucleotidlösung von allo(G,): allod«) = 1:1 wurde auf

über 90°C erwärmt, wieder auf 0°C abgekühlt und erneut erwärmt. allo(G8):

allod,) je 1.96 uM: 1. Schmelzen: 36/82°C (12/18% Hyp.); Abkühlen: 35°C (40%

Hyp.); 2.Schmelzen: 37/82°C (17/19% Hyp.).

Die Hyperchromizitäten der zweiten Schmelzkurve sind nicht mehr gleich

gross, wie diejeningen der ersten. Dies könnte eine Folge davon sein, dass die

Probe zwischen dem Mischen und dem Aufheizen nicht genug Zeit hatte, um

ins thermodynamische Gleichgewicht zu gelangen (vgl. 'annealing'-Effekte in

natürlichen Oligonucleotiden).Die Abkühlkurve des Uebergangs bei 40°C ist etwa die Umkehrung des

Schmelzprozesses mit einer kleinen Hysterese von ungefähr 4°C (Tm(Schmelzen)

= 37.8°C, Tm(Hybridisieren) = 33.7°C bei einer Oligonucleotidkonzentration von

je 4.25 uM und einer Heiz- resp. Kühlrate von 0.5°C/min.). Dieses Resultat ergab

sich aus einem Schmelzexperiment, bei dem die Probe nur auf 70°C erwärmt und

dann wieder abgekühlt wurde (Abb. C5.10).


allo(G8) + allo(l8) je 4.30 uM% Hyperchromizität

20-

15

10

Schmelzen

Hybridisieren

i——i——t——i——i—>—i——i——i——i——i

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C5.10: Der untere Teil der Schmelzkurve von allo(G8) + allod,) ist in

etwa reversibel. allo(G,) + allod,): je 4.3 pM Schmelztemperatur 38°C,

Hybridisierungstemperatur 34°C im Standardpuffer pH 7.0 bei 250 nm

gemessen.

Mit einem Experiment zur Bestimmung des stöchiometrischen Verhältnisses,

dargestellt in Abbildung C5.ll (man vergleiche dazu auch Kapitel C.4.1), bei 5°C,

einer Temperatur also, bei der, wie die UV-Schmelzkurve zeigt, alle

Stöchiometrie bei 5°C (abs 290 nm)

0.1 0.11—I—I—I—I—I—1—I—I I I—I—1—I—I—I—1—I-

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100% allo(l8)

Abb. C5.ll: Wie die Bestimmung des stöchiometrischen Verhältnis von allo(G,)

zu allod,) zeigte, lag bei 5°C (bei allen beobachteten Wellenlängen 240, 250,

260,270,280,290, und 300 nm) eindeutig ein 1:1 Gemisch vor.


Oligonucleotide in gepaartem Zustand vorliegen, ergab für das Assoziat ein

Verhältnis der beiden Oligonucleotidstränge allo(G8) und allods) von 1:1. Das

entsprechende Experiment bei 60°C ist in Abbildung C5.14 dargestellt.

Die Absorptionen der verschiedenen prozentualen Zusammensetzungen der

beiden Oligonucleotide wurden bei verschiedenen Wellenlängen gleichzeitigbestimmt und aufgetragen. Cantor et Schimmel [55] berichten nämlich, dass der

Uebergang des Triplexes zum Duplex im Fall von {d(T)n}2 • d(A)„ nicht bei allen

Wellenlängen beobachtet werden konnte (vgl. Felsenfeld et al. [75]).

In unserem Fall ergab sich bei allen beobachteten Wellenlängen das gleiche

Ergebnis, mit dem Unterschied, dass nicht bei allen Wellenlängen ein so

deutlicher Knick in der Absorptionsänderung festzustellen war wie bei 290 nm.

Man konnte aber bei keiner Wellenlänge einen zweiten Knick feststellen.

Die UV-Spektren von allen Lösungen, deren Absorptionen in Abbildung C5.ll

aufgetragen wurden, wurden gemessen und in Abbildung C5.12 dargestellt. Man

sieht deutlich einen stufenweisen Uebergang von 100% allo(I8) zu allo(G8).

210 250 300 320 nm

Abb. C5.12: UV-Spektren der Lösungen, mit dem die Stöchiometrie bestimmt

wurden von 100% allo(G,) zu 100% allod,). Die totale Oligonucleotid¬

konzentration betrug jeweils 6.08 pM. Die Oligonucleotidlösungen wurden im

Standardpuffer pH 7.0 gemessen.


Die Berechnung der thermodynamischen Parameter nach Marky & Breslauer

[59] müssen infolge der in Kapitel C.5.1 angegebenen Gründe1 mit Vorsicht

betrachtet werden, da die Schmelztemperaturen mit einem gewissen Fehler

behaftet sind. Die Auftragung der inversen absoluten Schmelztemperatur gegen

den natürlichen Logarithmus der Oligonucleotidtotalkonzentration sollte jedochzu vernünftigen Resultaten führen, da der absolute Fehler bei der Bestimmungder Schmelztemperatur für alle Experimente derselben Reihe etwa gleich gross

sein dürfte.

% Hyperc60-

allo(G8) + allo(l8)hromizität

50-

40-

30-

20-

.—•je 5.17 uM

J-* je 2.44 uM•"" je 1.17 uM

• <p~ je 3.16 uM

10-

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C5.13: Verschiedene Schmelzkurven von al!o(G,) und allod,) = 1:1, um

die thermodynamischen Parameter der Schmelzübergänge zu ermitteln.

Verwendet wurden: je 1.6 pM: 35.8/81.2°C; je 2.1 pM: 37.1/81.5°C; je 2.3 pM:

37.2/81.6°C; je 3.7 pM: 38.8/82.0°C; je 5.2 pM: 40.2/82.3°C. Alle Messungen

wurden im Standardpuffer pH 7.0 bei 250 nm durchgeführt.

Die thermodynamischen Daten der zwei Uebergänge aus den Schmelzkurven

ergeben nach dem 'two - State' - Modell analog Methode ® in Kapitel C.4.1 für

einen bimolekularen Schmelzprozess berechnet folgende Werte:

1 Diese Einschränkung bezieht sich vor allem auf die grosse Hysterese des 2. Ueberganges der

Schmelzkurve von allo(G,) + allod,), die darauf hindeutet, dass wir es mit einem durch eine

langsame Kinetik verzögerten Schmelzpunkt zu tun haben könnten.


allo(G8) +

allods)

AH°VH

[kcal mol-1]

AS0

[cal mol"1 K"1]

TAS°(298K)

[kcal mol"1]

AG0 (298 K)

[kcal mol'1]

1. Uebergang -52.1 -143 -42.6 -9.5

2. Uebergang -267.1 -729 -217.0 -57.1

Die Schmelztemperaturen des Uebergangs bei 80°C liegen sehr nahe

beieinander. Es ist aber eindeutig, dass die Schmelztemperaturen bei kleineren

Oligonucleotidkonzentrationen tiefer liegen als bei höheren. Die Alternative, ein

monomolekularer Schmelzprozess, ist ausgeschlossen, da dies bedeuten würde,

dass allo(I8) und allo(G8) je eine intramolekulare Wechselwirkung eingehenmüssten. Da dies aber bei den Schmelzexperimenten mit nur allo(G8) oder

allo(I8) nicht beobachtet wurde, kann ein monomolekularer Prozess tatsächlich

ausgeschlossen werden.

Die extrem hohe Schmelzenthalpie1 von -267.1 kcalmol-1 (berechnet für einen

bimolekularen Schmelzprozess) für den zweiten Uebergang schliesst einen

normalen Duplexschmelzpunkt mit Sicherheit aus, während dies für den

Uebergang bei tieferer Temperatur mit einer Schmelzenthalpie von -52.1

kcalmoH durchaus möglich scheint.

Ein Versuch zur Bestimmung des relativen stöchiometrischen Verhältnisses

bei 60°C ergab keine schlüssigen Resultate (Abb. C5.14).

abs 290 nm

0.3

0.2

Stöchiometrie bei 60°C (abs 290 nm)

0.1

0.0

,00DB°'

—I——I——l——I—i—r-"—l——l——l— l —l

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100% allo(!8)

Abb. C5.14: Versuch zur Bestimmung des stöchiometrischen Verhältnisses von

aIlo(G,): allod,) bei 60°C.

1 Breslauer gibt einen Zusammenhang zwischen der Kurvenform und der Schmelzenthalpie [58]. Er

konnte herleiten, dass eine steile Schmelzkurve automatisch eine höhere Schmelzenthalpieimpliziert.


Das hängt damit zusammen, dass beide Oligonucleotide vor der Vereinigungbei 60°C mehrheitlich als Einzelstrang vorlagen. Man müsste also bei 60°C die

Hybridisierungskurve (vgl. Abb. C5.15), die durch die Abkühlkurve

wiedergegeben wird, und nicht die Schmelzkurve (bei der alle Oligonucleotide zu

Beginn gepaart vorliegen) betrachten. Bei 60°C aber ist auf der Hybridisierungs¬kurve kein Zwischenniveau festzustellen, und man erhält deshalb eine Gerade

als Resultat aus der Auftragung der Absorption gegen die prozentuale

Zusammensetzung des Oligonucleotidgemischs, nämlich die Summe der

Absorptionen der Oligonudeotideinzelstränge.

allo(G8) + allo(l8) je% Hyperchromizität 6C

60-i

S5.17M.M°c

50-

*

*

*

•

«~

^•

40-

30-

*

*

•

•—- Schmelzen

*Hybridisieren

•

20-*

•

•

10- ^^-^0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C5.15: Durch Zugabe des einen Oligonudeotideinzelstranges zum

anderen muss eine Paarung erfolgen. Die Lösung befindet sich also auf der

Hybridisierungskurve. Es ist nun aber, wie man aus der Grafik ersieht,nicht

möglich, bei 60°C auf der Hybridisierungskurve auf das Zwischenniveau der

Schmelzkuve bei etwa 60°C zu gelangen, denn die Paarung der

Oligonucleotide setzt, wie die Hybridisierungskurve zeigt, erst unterhalb

60°C ein.

Um das stöchiometrische Verhältnis von allo(G8) und allods) bei 60°C doch

noch herauszufinden, überlegte man sich, ob die Probe nach jeder neuerlichen

Zugabe eines Anteils des einen Oligonucleotids zum anderen zuerst auf das

Niveau vor dem ersten Schmelzpunkt abgekühlt werden müsste, um eine

vollständige Paarung der Oligonucleotide zu erhalten und erst danach auf 60°C

zu erwärmen sei. Schnelles Aufheizen und Abkühlen auf 60°C resp. 10°C führte


dazu, dass sich die Absorptionswerte bei 10°C und 60°C einander angleichen und

sidi beim Wert der Absorption bei 10°C (Abb. C5.16) treffen. Das zeigt, dass der

Paarungsprozess bei tieferen Temperaturen durch schnelles Aufheizen und

Abkühlen aus dem thermodynamischen Gleichgewicht gebracht wird.

Abs (250 nm)

0.20-

0.19-

•

a Abs250nm10°C

0.18- • • Abs 250 nm 60°C

0.17- G

•

3

C 2 4

I

6

' 'Nummer der

Messung

Abb. C5.16: Bei wiederholtem Aufheizen einer Oligonucleotidprobe (1 : 1 Gemisch

von allo(G,) und allod,) je 3.0 pM) auf 60°C (was bedeutet, dass der erste

Schmelzprozess abgelaufen ist) und anschliessendem Abkühlen auf 10°C (um diesen

Schmelzprozess wieder rückgängig zu machen) stellte man fest, dass sich die

Absorption bei 60°C derjenigen bei 10°C annähert. Der Schmelzübergang bei 40°C

scheint zu verschwinden! Die Messungen wurden im Standardpuffer pH 7.0 bei 250

nm durchgeführt.

Ob die vorher geäusserte Vermutung richtig war, sollte im folgenden

Experiment überprüft werden:

Schmelzen einer Oligonucleotidlösung allo(G8): allo(I8) = 1 : 1 bis 90°C,

Abkühlen auf 0°C (je mit 0.5°C/min. Aufheiz- resp. Kühlrate), anschliessend

wurde drei Mal rasch auf 60°C aufgeheizt und auf 10°C (beim dritten Mal auf 0°C)

abgekühlt. Man liess jeweils für 10 Min. bei den entsprechenden Temperaturen

äquilibrieren. Das abschliessende erneute Aufheizen der Oligonucleotidlösungauf 90°C ergab das in Abbildung C5.17 gezeigte Bild.


Abb. C5.17: Das Experiment bestätigt die Vermutung, dass der untere

Schmelzprozess bei wiederholtem Aufheizen über die Schmelztemperatur

und nachfolgendem Abkühlen verschwindet. Dies ist aus dem Vergleich der

Verhältnisse der Hyperchromizitäten des zweiten zum ersten Uebergang

ersichtlich:

Experimentrelative Hyperchromizität bei hoher Temperaturrelative Hyperchromizität bei tiefer Temperatur

1. Schmelzkurve 0.91

2. Schmelzkurve 2.97

Das in diesem Experiment beobachtete Verschwinden des ersten

Schmelzüberganges zugunsten des zweiten lässt darauf schliessen, dass beide

Uebergänge durch eine langsame Bildungscharakteristik gekennzeichnet sind

und dass es sich deshalb um höhere Assoziate handeln muss.

Für höhere Assoziate sprechen insbesondere auch die thermodynamischen

Daten des Schmelzprozesses bei hoher Temperatur.

Das bei 5°C zu 1 : 1 bestimmte stöchiometrische Verhältnis von allo(G8): allods)

muss nicht unbedingt heissen, dass auch bei 60°C ein 1 : 1 Verhältnis der beiden

Oligonucleotide vorliegt. Es wäre durchaus denkbar, dass die eine der beiden

Spezies (mit einer Schmelztemperatur von 81°C) {allo(G8)}2* allo(I8) und die

andere (mit einer Schmelztemperatur von 37°C) allo(G8) • {allo(I8))2 ist, was bei

5°C ein Verhältnis allo(G8): allo(I8) von 1 :1 ergibt.

Deshalb wurden auch die Schmelzpunkte der Oligonucleotidlösungen mit

einem Verhältnis von allo(G8) : allo (I8) = 2 : 1, 1 : 1 und 1 : 2 bei derselben

Oligonucleotidtotalkonzentration aufgezeichnet.


allo(G8): allo(l8), verschiedene rel. Verhältnisse

% Hyperchromizität50

..allo(G8): allo(l8)

40= 1:1

allo(G8): allo(l8)= 1 :2

allo(G8): allo(l8)

o -^^——i——i——i—>—i—i—f—'—I

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

= 2:1

Abb. C5.18: Bei gleicher Oligonucleotidtotalkonzentration sahen die

Schmelzkurven mit unterschiedlichen Anteilen an allo(G,) und allod,)

sehr verschieden aus.

allo(G,): allod,) =1:2:39/81°C (Totalkonz. 3.64 pM, 12/8% Hyp.)

1:1:36/82°C (Totalkonz. 3.88 pM, 9/35% Hyp.)

1:2:- /82°C (Totalkonz. 3.64 pM, 3/20% Hyp.)

Alle Schmelzkurven wurden im Standardpuffer pH 7.0 bei 250 nm gemessen.

Die Analyse der UV-Schmelzkurven in Abbildung C5.18 scheint die Vermu¬

tung zu bestätigen, dass der erste Uebergang von einem allo(G8) • {allo(I8)}2 und

der zweite von einem {allo(G8))2 • allo(I8) Tripelstrang herrührt, da bei einem

allo(G8): allo(I8) Verhältais von 1 : 2 die Hyperchromizität des ersten Uebergangs

gegenüber demjenigen bei einem Verhältnis von 1 : 1 deutlich grösser ist und bei

einem Verhältnis von allo(G8): allods) = 2:1 der erste Schmelzübergang kaum

existent ist.

In der folgenden Tabelle sind die relativen Verhältnisse der Hyperchromi¬

zitäten des ersten zum zweiten Uebergang bei den drei gemessenen Oligonucleo-

tidverhältnissen angegeben.


Tabelle C5.1:

Verhältnis

allo(G8): allo(I8)

rel. Hyperchrom. bei hoher Temp. rel. Hyperchrom. bei hoher Temp.

rel. Hyperchrom. bei tiefer Temp.

1. Schmelzkurve

rel. Hyperchrom. bei tiefer Temp.

2. Schmelzkurve

2:1 9.05 3.37

1:1 4.18 1.43

1:2 0.73 0.66

Wie aus den drei Schmelzkurven in Abbildung C5.19 ersichtlich ist, ist die

Form der Abkühlkurve jeweils sehr ähnlich. Die Hyperchromizität beginnt bei

etwa 45°C mit sinkender Temperatur abzunehmen und läuft, je grösser der

allo(I8) Anteil ist, um so flacher aus.

% Hyperc25-

20-

15-

10-

5-

0-

hromizitätallo(G8): allo(l8) = 2 :1 a)

•

* \

••

la -V^-B/Jü /. Hyunüibieien o/ u

i i—*' ° c'"'"—' 41/81°C

* JZ..»..........»..^ 1 Sr!hnrint7fin -lrW°r.

>^J^^

C 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

% Hyperchromizität60-1

allo(G8): allo(l8) = 1:1 b)

-•- Hybridisieren 35°C

--2. Schmelzen 41/82°C

.— 1. Schmelzen -/82°C

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C


% Hyperchromizität25 -i

allo(G8): allo(l8) = 1:2 C)

*- Hybridisieren 36°C

1. Schmelzen 39/81 °C

2. Schmelzen -/81°C

10 20 80 90 100°C

Abb. C5.19: Die Schmelzkurven, Hybridisierungskurven und die zweiten Schmelzkurven

von allo(G8) + allod,) mit den angegebenen rel. Verhältnissen im Ueberblick.

Die Rekombination der Triplexe aus den Einzelsträngen wird via einen

thermodynamisch instabileren Duplex erfolgen, an den sich danach sofort ein

weiterer Einzelstrang angliedert.

Bei sehr langsamer Abkühlung würde bei einem Verhältnis von allo(Gs) :

allods) =2:1 wohl vornehmlich der stabilere, also der {allo(G8))2 • allo(I8) Triplex

gebildet werden. Es entstehen aber offenbar bei solchen Abkühlprozessen andere,

unter kinetischer Kontrolle gebildete Assoziate, die bei den Schmelzprozessen

(insbesondere beim zweiten Schmelzen) zu stärker strukturierten Schmelz¬

kurven führen.

So lässt sich beispielsweise eine Schmelztemperatur um 10°C erkennen, die von

einem allo(G8) Duplex herrührt (Abb. C5.19 a), 2. Schmelzkurve), sowie mit

grosser Wahrscheinlichkeit auch ein allo(I8) Duplex (Abb. C5.19, c), 2.

Schmelzkurve; Tm nicht sichtbar).

Die zweiten Schmelzkurven decken sich nicht mit den ersten, denn bei den

ersten Schmelzkurven war der erste Uebergang im Vergleich zum zweiten

Uebergang in allen UV-Schmelzexperimenten jeweils kleiner als im zweiten

Schmelzexperiment mit derselben Schmelzprobe. Diesen Sachverhalt wider¬

spiegelt die Tabelle C5.1, Seite 129 mit den Werten der in Abbildung C5.19

gezeigten UV-Schmelzkurven.

Um die Existenz von verschiedenen gleichzeitig koexistierenden, gepaarten

Spezies in der Reihe der allo(G8) und allo(I8) Gemische nachzuweisen, wurde


eine nicht denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt1 (Abb.

C5.20).

Dazu wurden verschiedene relative Zusammensetzungen der einzelnen

Oligonudeotide auf die verschiedenen Bahnen aufgetragen.

Abb. C5.20: Nicht denaturierende PAGE, 18%, Acrylamid

(29 :1 BIS), 0.1 M Tris, 0.1 M Borsäure, 50 mM NaCl, pH

8.1; 8 W, 6 Std., 3°C; angefärbt mit 'Stains all', Marker =

Bromphenolblau.

Die Resultate aus der Polyacrylamidgelelektrophorese sind in der folgenden

Uebersicht zum Vergleich den Resultaten der Schmelzexperimente

gegenübergestellt.

allo(G8): allo(I8) = 1:0

Gel: eine scharfe Bande

Schmelzdiagramm (Abb. C5.37): nur ein Schmelzübergang

1 Allopyranose-NA Oligonucleotide zeigen eine gegenüber Homo-DNA stark verminderte Mobilität

im Gel, deshalb müsste der Acrylamidgehalt und der relative Anteil von N,N'-Methylen-bis-acrylamid (BIS) reduziert werden.



Gel: Man erkennt eine deutliche Bande ({allo(G8)}2 • allo(I8) - Triplex), eine sehr

schwache Bande (allo(G8) • {allo(I8))2 - Triplex) sowie eine schwache

Bande auf der Höhe von {allo(G8))2.

Schmelzdiagramm (Abb. C5.19.a)): Es ist eine leichte Zunahme der

Hyperchromizität bis 15°C festzustellen, diese könnte vom

Schmelzen des {allo(G8))2 - Duplex herrühren. Bei einem Vergleichmit dem 1 : 1 Oligonucleotidgemisch von allo(G8) und allods) ist das

Verhältnis der Hyperchromizitäten des Uebergangs bei 40°C im

Verhälnis zu demjenigen bei 80°C sehr viel kleiner.


Gel: Neben der Bande für den (allo(G8)]2'allo(I8) - Triplex ist wiederum auch

eine schwächere Bande für den allo(G8) {allo(I8))2 - Triplexfestzustellen. Neben diesen beiden Banden für die Triplexe sind

sonst keine Banden mehr zu erkennen.

Schmelzdiagramm (Abb. C5.19 b)): Es sind nur die beiden Schmelzübergänge der

beiden Triplexe festzustellen. In genauer Analogie zum Gel-

Experiment ist die Hyperchromizität des Uebergangs bei 80°C (im Gel

die Intensität der Bande) gegenüber demjenigen bei einem

Verhältnis allo(G8): allo(I8) = 2:1 grösser (Hyperchrom. (2 :1; 80°C) =

17%; Hyperchrom. (1 : 1; 80°C) = 34%).

allo(G8): allodg) = 1:2

Gel: Die Intensität der Banden vom {allo(G8)}2 • allo(I8) - und allo(G8) • {allo(I8))2 -

Triplex ist jetzt ungefähr gleich. Man erkennt auch schon eine

äusserst schwache Bande, die vom allo(I8) - Duplex herrührt (auf der

Photographie vom Gel nicht sichtbar).

Schmelzdiagramm (Abb.C5.19 c)): Sehr deutliche Schmelzübergänge sowohl bei

40°C, als auch bei 80°C. Die Hyperchromizität des Ueberganges bei

40°C ist etwas grösser als diejenige bei 80°C.

a!lo(G8): allods) = 0:1

Gel: Man erkennt eine schwache Bande für den allods) Duplex.

Schmelzdiagramm (Abb. C5.4): Es ist nur ein diskreter Schmelzübergang um 29°C

zu erkennen.

Die Schmelzkurven von allo(G8) und allo(I8) bei verschiedenen relativen

Anteilen und die bei den gelelektrophoretischen Experimenten gefundenen


Resultate stimmen sehr schön miteinander überein. Diese Uebereinstimmung

von zwei grundsätzlich verschiedenen Typen von Experimenten unterstützt die

These, wonach in allo(G8)/allo(I8) Systemen zwei Triplexe verschiedener

Konstitution koexistieren. Keines der gefundenen Resultate widerspricht diesem

Modell so sehr, dass dieses verworfen werden müsste. Das bei 5°C gefundene

stöchiometrische Verhältnis von 1 : 1 steht sehr wohl mit diesem Modell in

Einklang, denn das allo(G8): allo(Ig) Triplex Verhältnis von 2 : 1 würde erst bei

60°C vorherrschen, und da ist eine Bestimmung des stöchiometrischen

Verhältnisses der Oligonucleotide leider nidit möglich.Es konnten aber keine Gründe eruiert werden, weshalb der G2I Triplex derart

viel stabiler als der I2G Triplex sein sollte (vgl. auch das hypothetische

Basenpaarungsmodell für den G2I und den I2G Triplex Abb. C5.36).

Eine mit den experimentellen Resultaten kompatible Vorstellung über den

Paarungs- und Entpaarungsmechanismus ist in Abbildung C5.21 dargestellt.

Heizen

bei KT

zusammengeben

(alloUgJlj aUo(G,) GI-Duplex

/

\

37°C

^G-Triplex

82°C

QI-Triplex


Abkühlen

Abkühlen

ab50°C

ab 50°C sofort

+ alWGg)

GI-Duplex ab = 37°C

+ allodg)

Gjl-Triplex

IjG-Triplex

Abb. C5. 21: Vorstellung des Schmelz- und Hybridisierungsprozesses von allo(G,) und allod,).

C.5.4 Allo(G4l4) und allo(GI)4

Im Hinblick auf die Beantwortung der Frage nach der Sequenzspezifizität der

Gl-Paarung wurden allo(G4l4) und allo(GI)4 hergestellt und deren

Paarungseigenschaften untersucht.

Das temperaturabhängige UV-Spektrum von allofGJ^ (Abb. C5.22) zeigte von

30°C zu 45°C eine grosse Aenderung der Absorption im Bereich zwischen 240

und 280 nm an. Ab»

1.0

200 250 300 350 400nm

Abb. C5.22: Temperaturabhängiges UV-Spektrum von allo(G4I4) bei

12.1 pM im Standardpuffer pH 7.0.


Dieses temperaturabhängige UV-Spektrum Hess vermuten, dass allo(G4l4) bei

einer Detektion um 250 nm eine sehr scharfe Schmelzkurve mit einer grossen

Hyperchromizität aufweisen wird. Die Schmelzkurven bestätigten diese

Erwartung, denn innerhalb weniger Grad (= 11°C) war das vollständig gepaarte

Assoziat in die Einzelstränge gespalten, was durch das Abflachen der

Schmelzkurve angezeigt wird (Abb. C5.23).


40

30-

20

10 H

0

allo(G4l4)

-10

Tm = 40°C (10.1 uM)

—i——i——i——i—i—i——i • i——i——i—<—i

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C5.23: Allo(G4I4) zeigt einen ausgesprochen scharfen und steilen

Schmelzübergang allo(G4I4): 40°C (10.1 pM, 48% Hyp., 250 nm).

Die Schmelztemperatur bei einer Aufheizrate von 0.5°C/min. betrug 40°C

(c = 10 uM). Die Schmelztemperatur war oligonucleotidkonzentrationsabhängig,

was bedeutet, dass es sich um einen intermolekularen Schmelzprozess handeln

muss (Abb. C5.24).

Die Berechnung der thermodynamischen Daten wurde durch Auswertung der

Schmelztemperaturen in Abhängigkeit der Oligonucleotidkonzentration (vgl.Abb. C5.24) nach der Methode <3> in Kapitel C4.1 bestimmt.

Zur Auswertung der Schmelztemperaturen in Abhängigkeit der Oligonucletid-konzentration wurden als verschiedene Varianten bimolekulare (n = 2),

trimolekulare (n = 3) und tetramolekulare (n = 4) Schmelzprozesse in Betracht

gezogen. Die Frage der Interpretation der erhaltenen Resultate muss offen

bleiben.


allo(G4l4) AH°VH

[kcal mol"1]

AS0

[cal mol"1 K-l]

TAS°(298K)

[kcal mol-1]

AG° (298 K)

[kcal mol-1]

n = 2 -128.2 -387 -115.3 -12.9

n = 3 -256.4 -772 -230.1 -26.3

n = 4 -384.7 -1164 -346.7 -38.0

allo(G4l4) bei versch. Konzentrationen% Hyperchromizität

50

40

30

20

10

0

-10

"•

'

••

*

%__ ...

8.86 uM

2.11 uM

12.1 uM

19.2 pM

50 60 70

—I

80 °C

Abb. C5.24: Schmelzkurven von allo(G4I4) im Standardschmelzpuffer pH 7.0

bei 250 nm gemessen. Für die thermodynamischen Daten wurden verwendet:

2.1 uM: 37.8°C; 3.5 pM: 38.2°C; 6.8 pM: 39.4°C; 10.1 pM: 40.2°C; 12.1 pM:

40.4°C; 19.2 pM: 40.9°C. Wie man sieht, sind die Schmelztemperaturen wie

schon beim zweiten Uebergang von allo(G,): allod,) = 1:1 nur sehr schwach

konzentrationsabhängig (Aufheizrate: 0.5°C/min.).

Die Ueberlagerung der Aufheiz- und Abkühlkurve ergeben eine grosse

Hysterese, das erneute Aufheizen einer abgekühlten Probe führte wiederum zum

gleichen Schmelzverhalten wie beim ersten Schmelzversuch (Abb. C5.25).

Diese Beobachtung unterstützt die These, wonach es sich nicht um Duplexe,

sondern um höhere Aggregate handelt. Die Reversibilität, demonstriert durch

die erste und die zweite Aufheizkurve, weist darauf hin, dass nur ein Typ von

Aggregat gebildet wird (im Gegensatz zu den Untersuchungen von

allo(G8)/allo(I8) Systemen (vgl. Kapitel C.5.3)).


allo(G4l4) Heizen-Kühlen-Heizen% Hyperchromizität

50-i

40

30-

20-

"^Hjn

1. Schmelzen 40°C

Hybridisieren 28°C

2. Schmelzen 40°C

—r——i——i—<—i

50 60 70 80 °C

Abb. C5.25: Das Abkühlen von allo(G4I4) ergab im Vergleich zum

Aufheizen eine starke Hysterese. Nochmaliges Erwärmen der gleichen

Schmelzprobe ergab aber wieder dieselbe Schmelzkurve. allo(G4I4) (10.1

pM): 1. Schmelzen: 40.3 °C (48% Hyp.); Hybridisieren: 28.2°C (46% Hyp.);

2. Schmelzen: 39.9 (44% Hyp.), Heiz- resp. Kühlrate 0.5°C/min.).

Die Differenz der Tm-Werte der Aufheiz- resp. Kühlkurve ist deutlich abhängig

von der Aufheiz- resp. Kühlrate, wie aus Abbildung C5.26 hervorgeht und

bestätigt somit die Vorstellung,wonach Denaturierung und Renaturierung in

diesem System langsam erfolgen. Dies gilt als weiterer Hinweis zur Existenz

höherer Assoziate.

allo(G4l4) 8.86 pJvl Heiz- resp. Kühlrate 1.0°C/min.


60-

50

40-

30-

20-

10

0

-10

"-.« »+"*•

10

**'

-1—

20 30

""WMNMIOimi

— Schmelzen 41.3 °C

-*—Hybridisieren 28.3°C

40

—r—

50

—I

60 "C


alle

% Hyperc70-

60-

50-

40-

30-

20-

10-

0-

)(G4I4) 8.86 p:M Heiz- resp. Kühlrate 0.5°C/min.

hromizität

/"""»tmiiii .

.** •

•— Schmelzen 40.3 °C*

^**

MyDriuisieren ^y.u o

*

* •

y

;-—-,. -*** /

C 10 20 30 40 50 60°C

allo(G4l4) 8.86 ^iM Heiz- resp. Kühlrate 0.1°C/min.

% Hyperchromizität

70-i

60-

50-

40-

30-

20-

/£?«*»••«.

10-"*—-.»,% „* /

Schmelzen 36 2 °C

Hybridisieren 34 0°C

—i 1—i—i 1 i—i—i—i—

10 20 30 40 50

—I

60 °C

Abb C5 26 Aufheizen und Abkühlen von allo(G4I4) mit verschiedenen Heiz-

resp Kuhlraten Je kleiner die Heiz- resp Kuhlraten waren, desto mehr

näherten sich die Schmelz- und die Hybndisierungstemperaturen einander an

allo(G4l4) Schmelz¬

temp

Hybridisie-

rungstemp.

Differenz zwischen

Schmelz- und

Hybridisierungstemp.

AT

1.0°C/min. (8.8 uM) 41.3 28.3 13.0

0.5°C/min. (8.8 uM) 40.3 29.6 10.7

0.1°C/min. (10.1 uM) 362 34.0 22


Zur Untersuchung der pH-Abhängigkeit im alMCjU) Paarungssystem wurden

CD-Spektren bei pH 3.8 und verschiedenen Temperaturen aufgenommen. Aus

der Aehnlichkeit des CD-Spektrums bei pH 3.8 mit demjenigen bei pH 7.0 kann

geschlossen werden, dass keine strukturellen Aenderungen eingetreten sind (vgl.

Abb.C5.27undC5.37).

Der Vergleich der Schmelzkurven bei pH 7.0 mit derjenigen bei pH 3.8 ergab

eine Differenz der Schmelztemperatur von etwa 7°C, mit dem höheren Wert für

pH 3.8. Die Schmelzkurve mit nur einem Uebergang sieht dabei immer noch

ähnlich aus wie diejenige bei pH 7.0.

Die Frage nach der Erhöhung des Tm-Wertes in der Schmelzkurve bei tiefem

pH gegenüber derjenigen bei pH 7.0 bleibt offen. Das Absinken der

Hyperchromizität in diesem Zusammenhang könnte mit Phänomenen der

Basenprotonierung und -tautomerisierung zu tun haben.

allo(G4I4) pH 3.8

0 0

md«t

•50 0

W 70/60°C

«°c

30°C

15/5°C

210 250 300 nm

Abb. C5.27: Das CD-Spektrum bei pH 3.82 zeigt keinen Unterschied zum

CD-Spektrum bei pH 7.0 (vgl. Abb. C5.35).


Abb. C5.28: Schmelzkurven von allo(G4I4) bei pH 7.0 und 3.8. Die Schmelzkurven

bei pH 7.0 wurde mit Tris HCl und diejenige bei pH 3.8 mit NaCitrat als

Puffersalz bei 250 nm gemessen. allo(G4I4): pH 7.0:40°C (8.86 pM, 56% Hyp.); pH

3.8: 47°C (9.05 pM, 26% Hyp.).

allo(G4I4) 8.86 uM pH 7.0 allo(G4l4) 9.05 uM pH 3.8

40°C (55% Hyp.) 47°C (26% Hyp.)

Allo(G4l4) scheint schon in niedrigen Konzentrationen bei tiefen Temperaturennicht mehr löslich zu sein. Denn eine Oligonucleotidlösung absorbiert bei 30°C

Licht mit einer Wellenlänge von 350 nm, was nur durch Streuung des

eingestrahlten Lichts an den in der Lösung schwebenden Festkörpern

(wahrscheinlich ein höheres Assoziat; von blossem Auge sichtbar) herrühren

kann, da keine in der Lösung Vorhände Substanz bei 350 nm Licht absorbiert

(Abb. C5.29).


allo(G4l4) 8.9 uM mit Absorption bei 350 nm

% HyperchromizitätBu-

50-

/""\40- 1 \

*

*

30-*

20- *

.

10-

0-

^.Schmelzkurve(250 nm)

10 20

.rel. Absorption

*•"», .J. (350 nm)-i |*Wii|iiiiiyiTii|'lriii|» ,_;—| , f

80 °C40 50 60 70

Abb. C5.29: Neben der Schmelzkurve von allo(G4I4) ist auch die Absorption dieser

Lösung bei 350 nm als Mass, ob schon alles Oligonucleotid gelöst ist, aufgetragen

(für diese Kurve gilt die Hyperchromizitätsskala selbstverständlich nicht). Wie

man leicht erkennt, ist erst ab 40°C alles allo(G4I() in Lösung.

Eine auf 5°C gekühlte Allopyranose-NA Lösung zeigt deutlich feine, weisse,

schwebende Flocken. Genau dasselbe Phänomen stellten schon Fischer [50] und

Helg [51] bei anderen Allopyranose-NA Oligonucleotiden fest. Sowohl bei Homo-

DNA als auch bei natürlichen DNA Oligonucleotiden wurde nie ein solches

Phänomen beobachtet.

Es bleibt ungeklärt, weshalb allo(G4l4) eine Schmelztemperatur besitzt, die um

etwa 40°C tiefer liegt als diejenige des [allo(G8)}2-allo(I8) Triplex.

Die UV-Schmelzkurve der alternierenden Sequenz allo(GI)4 zeigte gegenüberseinen monobasigen Aequivalenten allo(G8)/allo(I8) sowie der blockweisen

Sequenz allo(G4I4) ein deutlich verschiedenes Schmelzverhalten. So betrug die

Schmelztemperatur von allo(GI)4 nur 17°C (9.6 uM, 19% Hyp.). Die

Schmelzkurve war deutlich weniger kooperativ als diejenige von allo(G4I4) oder

diejenige des zweiten Uebergangs eines allo(G8), allo(I8) Gemisches. Was

ebenfalls sofort auffällt, ist, dass die Schmelzkurve bei einer Aufheiz- und

Abkühlrate von 0.5°C/min vollständig reversibel ist. Wie die Abbildung C5.30

zeigt, entspricht die Hybridisierungstemperatur genau der Schmelztemperatur.


allo(GI)4 9.6 \iM% Hyperchromizität

20-

4tr"* ""^-ÄT Seh"1012611 17°c

15-f

^*"

Hybridisieren 17°C

•

0

10-

5-

•

•

*•

/

C

r i i i i i i i i ' i i

) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C5.30: Schmelzkurve von allo(GI)4. Die Schmelzkurve ist auch bei

einer Heiz- resp. Kühlrate von 0.5°C/min. vollständig reversibel, ganz im

Gegensatz zu allo(G4I4) oder allo(G,) + allo(I8), die jeweils grosse

Hysteresen aufweisen. allo((GI)4: Schmelzen: 17°C (9.6 pM, 19% Hyp.);

Hybridisieren: 17°C (19% Hyp.).

Auch das CD-Spektrum von allo(GI)4 zeigte deutliche Unterschiede zu den CD-

Spektren von allo(G4I4) und zum Gemisch von allo(Gg) und allo(I8), man

vergleiche dazu die Abbildung C5.37.

Diese gravierenden Unterschiede zu den anderen beiden Oligonucleotidtypenlassen sich nur durch sehr unterschiedliche Paarungsstrukturen (beispielsweisekeine Bildung eines höheren Assoziat, z.B. Triplex, Tetraplex) oder durch eine

andere Art der Basenpaarung (z.B. einem Wechsel von reverse-Hoogsteen-

artigen zu einer reinen Watson-Crick-artigen Paarung) erklären.

C.5.5 Untersuchungen zur Frage nach der

Strangorientierung in Allopyranose-NAOligonucleotidduplexen

Zur Beantwortung der Titelfrage wurden die beiden Sequenzen allo(GGIGII)

und allodIGIGG) hergestellt und deren Paarungsverhalten mit sich selbst, sowie

im 1:1 Gemisch untersucht. Eine schematische Darstellung der verschiedenen


möglichen Paarungen, sowohl bei paralleler als auch bei antiparalleler

Strangorientierung, werden in Abbildung C.5.34 gegeben.Die Resultate der vorangegangenen Experimente zeigten, dass eine

alternierende Gl-Paarung in der Allopyranosyl-NA Reihe etwa vergleichbar mit

einer GG- aber deutlich schwächer als eine II-Paarung ist. Oligonucleotide mit

einer blockweisen oder monobasigen Gl-Sequenz besitzen aber deutlich höhere

Schmelztemperaturen (man vergleiche dazu die Schmelztemperaturen der G-, L-

und Gl-Octamersequenzen in der nachfolgenden Tabelle).

Oligonucleotid Schmelztemperatur

allo(Gs) 13°C (9.8 uM)

allo(I8) 29°C (8.7 uM)

allo(G8) + allods) 37/82°C (je 2.3 uM)

allo(G4I4) 40°C (10.0 uM)

allo(GI)4 17°C (9.6 uM)

Das CD-Spektrum der beiden Oligonucleotide allo(GGIGII) und allo(IIGIGG)

und dem 1 : 1 Gemisch davon zeigten sowohl untereinander (vgl. Abb. C5.31) als

auch mit den CD-Spektren von allo(G4I4) und demjenigen von allo(Gg): allods)

= 1:1 grosse Uebereinstimmung.

Abb. C5.31: Bei allo(GGIGn), allodIGIGG) und dem 1:1 Gemisch dieser

beiden Oligonucleotide liegt, wie das CD-Spektrum dieser drei

Oligonucleotidlösungen bei 5°C zeigt, die gleiche Basenpaarungsart vor.

-144- allgememer Teil

Ein weiterer Hinweis auf die Gl-Paarung ergibt sich auch aus der

Unterschiedlichkeit der CD-Spektren von allo(GGIGII) und allo(IIGIGG) zu der

mathematischen Summe von allo(G8) und allo(Ig) in Abbildung C5 32

50 0 -i 1

Abb. C5.32: Der Vergleich der Summe der GG- resp. ü-gepaarten allo(Gs)

resp aIlo(Ia) Duplexe und den allo(GGIGII) zeigt durch die starke

Verschiebung der Bandenlage des charaktensischen Peaks von 292 auf 303

nm an, dass ein Wechsel in der Basenpaarung stattgefunden haben muss

Die Schmelzkurven der einzelnen reinen Oligonucleotidsequenzen sowie vom

1 : 1 Gemisch zeigten keinen grossen Unterschied zueinander Die

Schmelztemperaturen, die aus der ersten Ableitung der Schmelzkurve bestimmt

wurden, lagen bei Konzentrationen um 9 pM bei 8°C im Falle von allo(GGIGII)

und dem 1:1 Gemisch sowie 5°C im Falle von allo(IIGIGG)

Abb. C5 33. Die Schmelzkurven von allo(GGIGU), allodIGIGG) und dem 1

1 Gemisch davon Es zeigt sich im 1 : 1 Gemisch bei vergleichbaren


Konzentrationen keine Schmelzpunktserhöhung gegenüber den einzelnen

Oligonudeotiden. allofGGIGII): 8°C (955 pM - % Hyp.); allodIGIGG) 5°C

(9.41 pM, - % Hyp.); 1 : 1 Gemisch: 8°C (je 4.04 pM, - % Hyp.). Die

Schmelzkurven wurden im StandardpufferpH 7.0 bei 248 nm bestimmt.

Gemisch aus alMGCIGIRnur alWGGICII) und allo(IICIGG) nur allo(GGIGII)

3 x n-Paarung3 x CG-Paarung

i i i i i

allo-GGIGII

IIIIII

allo-GGIGIII I I I I I

undi i i i i i

allo-IIGIGG

ihm i

allo-IIGIGGparallelePaarung

allo-GGIGII

IIIIIIallo-GGIGII

3 x D-Paarung3xGG-Paarung

allo-GGIGII

IIIIIIallo-IIGIGG

allo--IIGIGG

II I III

allo-IIGIGG'''

3 x Il-Paarung3 x CG-Paarung

6 x Gl-Paarung

3 x Il-Paarung

i i i t i i

antiparallele «Ho-GGIGII

Paarung Ui.J.J.1*

IIGIGG-allo

6 x Cl-Paarung

allo-GGIGII

um i

GGIGII-allo

und

l i i i i l

allo-IIGIGG

IIIIIIIIGIGG-allo

allo-GGIGII

IIIIIIIIGIGG-allo

und

I I I I I 'I

allo-IIGIGGIIIIIIGGIGII-allo

6 x Gl-Paarung

l l i i i l

allo-IIGIGG

IIIIII

GGIGII-alloI I I I I I

6 x Gl-Paarung

Abb. C5.34: Die verschiedenen Möglichkeiten der Paarung von allo(GGIGII) (links),

allodIGIGG) (rechts) und dem 1:1 Gemisch (mitte). Im oberen Teil der parallelen oder

der antiparallelen Paarungsmöglichkeiten stehen jeweils die Möglichkeiten bei GG-

und Il-Paarung, im unteren Teil diejenigen mit einer Gl-Paarung. Das CD-Experiment


zeigt, dass wir es wohl mit einer Gl-Paarung zu tun haben, und weil keine

Schmelztemperaturzunahme beim 1 : 1 Gemisch gegenüber den einzelnen

Oligonucleotidsträngen festzustellen war, müssen beim 1 : 1 Gemisch noch dieselben

(allo(GGIGn))2 und {allo(nGIGG))2 Duplexe vorliegen.

Es zeigte sich, dass für das 1 : 1 Gemisch keine Schmelzpunktserhöhung

gegenüber den beiden einzelnen Oligonucleotiden erhalten werden konnten

(Abb. C5.33). Das bedeutet, dass vermutlich kgin allo(GGIGII) allo(IIGIGG)-

Mischkomplex entsteht.

Unter der Annahme, dass der Unterschied der CD-Spektren von allo(IIGIGG),

allo(GGIGII) und dem 1 : 1 Gemisch einerseits und der mathematischen Summe

der CD-Spektren von allo(G8) + alIo(I8) anderseits (Abb. C5.32) als Kriterium für

die Existenz einer Gl-Paarung in den erstgenannten drei Systemen herangezogen

werden darf, würde eine antiparallele Strangorientierung in diesen Systemen

resultieren1.

C.5.6 Zusammenfassung der Eigenschaften von

Allopyranose-NA Oligonucleotiden, die

Isoguanin enthalten

C.5.6.1 Gedanken zur Basenpaarung in den hypothetischen G2I- und

l^G-Triplexen

Die Voraussetzungen für die in Abbildung C5.36 dargestellten möglichen

Basenpaarungen in den beiden Triplexen G2I- und I2G:

- anti-Orientierung der glycosidischen Bindung (wie sie bisher auch immer

beobachtet wurde)

- Isoguanin liegt in der Form des H-N(l) Tautomeren vor.

Aus den Betrachtungen der verschiedenen möglichen Basenstrukturen, die sich

aus der Permutation der Basen ergab und mit dem Wissen, dass eine dritte

1 Eine Aehnlichkeit der Summe der CD-Spektren von allo(Ga) + allod«) und den CD-Spektren von

allo(GGIGII), allodIGIGG) sowie deren 1 :1 Gemisch wäre ein Hinweis gewesen, dass in diesen

Oligonucleotiden resp. -gemisch, GG- und II- aber nicht Gl-Paarungen vorgelegen hätten.


Paarung eine besondere, zusätzliche Stabilisierung ergibt, kristallisierten sich

anhand von Modellbetrachtungen1 die zwei Basenpaarungsmuster für die

Triplexe heraus. Bei diesen Strukturen wird jeweils jede Base durch die Paarung

mit den anderen beiden, den Triplex aufbauenden Basen zusätzlich stabilisiert,

was die grosse Stabilität besonders des G2l-Triplex erklären könnte.

I2G-Triplex j_/N

Tm = 37°C /%(2.3 uM)

R©'

G2I-TriplexT„ = 82°C

(2.3 uM)

Abb. C5.36: Eine mögliche Basenpaarung des G2I und des I2G Triplex mit dem Allopyranosyl-

isoguanin in seiner H-N(l) tautomeren Form. Die Strangorientierung wird durch die Symbole + und -

angegeben ('+' bedeutet, dass das 6'-Ende ist gegen den Betrachter,'-' bedeutet, dass das 6'-Ende vom

Betrachter weg hinter die Zeichenebene zeigt).

Dieses Modell stimmt sehr gut mit der Beobachtung überein, dass im

Schmelzexperiment ein Triplex-zu-Einzelstrang Uebergang festgestellt wird. Ein

Zerfall einer Paarung führt deshalb sofort zum Zerfall des gesammten Triplex.

Die Bildung eines allo(G8)-allo(I8) Duplex könnte die in Kapitel C.5.3 gefundene

Hysterese gegenüber der Schmelztemperatur des G2I Triplexes erklären. Ein

solcher Gl-gepaarter Duplex könnte einen generellen Rezeptor sowohl eines

Allopyranosyl-isoguanin Oligonucleotidstrangs, als auch eines Allopyranosyl-

guanin Oligonucleotidstranges darstellen und so sowohl den G2I als auch den I2G

Triplex ausbilden.

1 'HGS Biochemistry Molecular Models', Maruzen Co. Ltd., Tokyo.


C.5.6.2 Zusammenfassung der UV-Schmelzkurven und CD-Spektren

*o

a

+l SSS«s

o

o

4I

:! TbÜ

•a.

'S

o

"i3

CS

CO

ö

£ &K K

s£ ^CS o

in CS

§ Io\ \0

CO C\*w

U U

§ii II

HE ?O

r °HE

k.

88S88

JU8 S S 8 8 S °

>in o in

Olig

onuc

leot

ide

AUose-NA

angegebenen

der

CD-Spektren

und

Schmelzkurven

der

Vergleich

C5.37:

Abb.

9s

\s^7

i-c

/\

we

/\

U-C

St

w_

*°mc

allo(U

^c^^^i

f"

illo(G.)

iy^

allo(A.)

allo(U

allo

(G„)

allo

(A„)

100'C

80

i-1

60

40

20

Hyp.

)27%

nM,

(8.7

29°C

=Tm

)-K-^—I—

%H

100-C

80

60

40

20

Hyp.)

14%

nM,

(9.8

13°C

=Tm

0'

5-

10-

15-

20-1.

100°C

80

60

40

20

Hyp.)

48%

nM,

(11.

016°C

=Tm


C.5.7Ein Vergleich der GI-Basenparung von

Homo-DNA vs. Allopyranose-NA

Guanin- und Isoguanin-haltige Homo-DNA bildet, wie anhand von

Gelexpenmenten und UV-Schmelzkurven durch Hunziker [22], Fräser [47], Peng[48] und Zimmermann [81] gezeigt werden konnte, nur Duplexe mit jeweils nur

einem, relativ flachen Schmelzubergang, der in den verschieden geordneten

Oligonucleotidsequenzen nur geringe Unterschiede der Schmelztemperaturenaufweist (Abb C5 38 und Tabelle) Die Form der Schmelzkurven und sogar die

Hypochromizität der Schmelzkurven zeigt nur eine geringe Abhängigkeit von

der BasensequenzGuanin- und Isoguanin-haltige Allopyranosyl-NA Oligonucleotide zeigen ein

grundsatzlich verschiedenes Schmelzverhalten (Abb C5 39 und Tabelle)

- allo(GI)4 besitzt emen monophasischen Uebergang bei 17°C

- das blockweise Oligonucleotid allo(G4I4) besitzt ebenfalls einen

monophasischen, allerdings viel schärferen Uebergang bei 41°C

- Am ekklatantesten ist der Unterschied bei dem System aus allo(G8)/allods)

Diese Schmelzkurve besitzt zwei Uebergänge Aus der Diskussion dieser Kurve

müssen nicht nur Duplex-, sondern auch Triplexstrukturen in Betracht gezogen

werden

Homo-DNA (Hexamere)% Hypochromizität

20

15

10-

5

0

0 20 40 60 80 100°C

Abb C5 38 Schmelzkurven von Homo-DNA Oligonucleotiden, die ddG und

ddl enthalten Alle Schmelzkurven wurden von Fräser [47] und Peng[48] im

Standardspuffer pH 7 0 bei 265 nm gemessen

dd(l3G3)da(ü6) + aa(i6)

. +


Allose-NA (Octamere)% Hyperchromizität

6O-1

50- /*• allo(G8) + allo(l8)•

40 -

* •

30-

20 -

*

•

10- jF _^

0- "^^zzais"IUI | i | | | 1 • | | | | i |

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C5.39: Schmelzkurven von Allopyranose-NA Oligonucleotiden, die allo(G)

und allo(I) enthalten. Alle Schmelzkurven wurden im Standardpuffer pH 7.0 bei

250 nm gemessen.

Sequenz Schmelztemperatur

dd(G6) + dd(l6)1 61°C (18.0 uM, -14% Hyp.)

dd(I3G3)2 57°C (16.8 pM, -16% Hyp.)

dd(GI)3i 49°C (17.0 uM, -16% Hyp.)

allo(Gg) + allo(Ig) 40/82°C (10.3 pM, 13/37% Hyp.)

allo(G4l4) 41°C (10.1 uM, 47% Hyp.)

allo(GI)4 17°C (9.6 \>M, 19% Hyp.)

Die Konsequenz dieser Unterschiede ist, dass also die Gl-Paarungsstruktur in

der Homo-DNA Reihe verschieden von derjenigen in Allopyranose-NA sein

muss.

Diese Schmelztemperatur wurde von Fräser [47] bestimmt.

Diese Schmelztemperatur wurde von Peng [48] bestimmt.


Ein Vergleich zwischen dem Homo-DNA Triplex (ddlGfiMda^dd^CHA^-A))

(Kapitel C.4.7.6) und dem vermuteten Triplexgemisch. das von allo(Ga) und

allo(Ia) gebildet wird (Kapitel C5.3)

Der Homo-DNA Triplex zeigt sowohl beim Schmelzen wie auch beim

reversiblen Hybridisieren zwei Uebergänge. Beim Uebergang bei 21°C (bei je 6.08

pM) handelt es sich zweifelsfrei um die Abspaltung des dritten

Oligonucleotidstranges (dd(7CHA5-A)) und beim oberen um das

Auseinanderbrechen des verbliebenen dd(G6) • dd(I6) Doppelstranges, da der

obere Schmelzpunkt bei 63 °C genau mit demjenigen eines 1 : 1 Gemischs von

dd(G6> und dd(I6) übereinstimmt.

Ganz anders liegt der Fall bei den zwei durch Mischen von allo(Gs)- und

allo(I8)-Einzelsträngen (d.h. bei Temperaturen über 30°C) in Betracht zu

ziehenden G2I resp. I2G Triplexen. Hier ist anzunehmen, dass die Tripelstränge

in einer Schmelzstufe in die Einzelstränge zerfallen.

Tm = 82°C

{allo(G8)}2•

allo(I8) » 2 allo(G8) + allo(I8)

Dies ist dann der Fall, wenn der nach Abspaltung des einen

Oligonucleotidstranges entstehende Duplex weniger stabil als der Triplex ist.

Diese grössere Stabilisierung des Triplexes kann durch eine zusätzliche

Wasserstoffbrücke entstehen, z.B. so, dass jede der drei Nucleobasen mit den

anderen beiden Nucleobasen Wasserstoffbrücken ausbilden, wie das im

Strukturvorschlag für den G2I Triplex angegeben wurde (Abb. C5.42).

Ein Triplex, der in einem Schritt in die Einzelstränge zerfällt, kann nicht auf

demselben Weg wieder den Tripelstrang ausbilden. Es muss erst einmal ein

thermodynamisch instabilerer Duplex (der in Abb. C5.36 markierte Gl-gepaarte

Duplex) ausgebildet werden, an den sich dann entweder ein allo(G8) oder allods)

Oligonucleotidstrang anlagert und somit einen G2I resp. I2G Triplex bildet. Die

dem Triplex vorgelagerte Bildung eines Gl-gepaarten Duplex, von dem

anzunehmen ist, dass er instabiler ist als der G2I Triplex, erklärt die grosse

Hysterese von 40°C der Schmelzkurve zur Hybridisierungskurve (Abb. C5.40).


% Hyperchromizität40 1 Bildung des allo(G8)allo(Ig)Duplexes

und daraus sofort des Gjl-30

20

10

0

-10

und des IjG-Triplexes •iplexes i

V

Schmelzen des G2I-Triplexes

Schmelzen des IjG-Triplexes

i—i——i—i—i—i—i—i—i—i—i——i—i—i——t——|

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100°C

Abb. C5.40 Eine mögliche Erklärung für die beiden Uebergänge im

Schmelzexperiment resp. dem Uebergang im Hybridisierungsexperiment in

einem System, das aus allo(Gs) und allods) besteht.

-154-

P Experimenteller Teil

D.l Allgemeine Bemerkungen

Für die Aufnahme der Spektren danke ich den Herren R. Häfliger und O. Greter

(Massenspektren), H. Hediger und R. Dohner (IR-Spektren), D. Manser und Frau

B. Suter (Elementaranalysen) und dem gesamten NMR-Team, das sich aus Frau

B. Brandenburger, Frau V. Eggli und Herrn Dr. B. Jaun konstituiert.

Herrn P. Kälin danke ich für die unermüdliche Herstellung von verschiedenen

Zuckerbausteinen.

Absorptionskoeffizienten von OligonucleotidenDer Absorptionskoeffizient eines beliebigen Oligonucleotids der allgemeinen

Form (AxByCz) bei einer bestimmten Wellenlänge X wurde als

Linearkombination der einzelnen, das Oligomere aufbauenden

Nucleosideinheiten berechnet:

e(AxByCz, X.) = x• e(A, X.) + y

• e(B, X) + z• e(C, X)

Nucleosid e (260 nm) e (280 nm) e (292 nm)

ddA 14700 2100

ddC 7800 6000

ddG 11100

ddl 2900 8500

ddT 9500 7400

ddU 10200

dd7CHA 8900 9000

alloG 11500

allol 4200 7700 11600

-155- experimenteller Teil

Die Extinktionskoeffizienten e der einzelnen Mononucleosideinheiten wurden

dabei in Wasser (dd A, dd U) bzw. einem 150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl - Puffer

pH 7 bestimmt (dd C, dd G, dd T, dd I, dd (7CHA) allo I). Die

Extinktionskoeffizienten der natürlichen DNA-Oligomere wurden nach

Angaben aus der Literatur [90] und [91] auf ähnliche Weise berechnet. Für den

Extinktionskoeffizient von allo G wurde, da andere Angaben fehlten, der Wert

des natürlichen Guanosin aus [90] verwendet.

Ausbeuten

Die Ausbeuten und Molangaben sind nach den im 1H-NMR gefunden

Lösungsmittelanteil korrigiert. Kopplungsausbeuten von Synthesizeransätzenwurden VIS-spektroskopisch anhand der Absorption bei 498 nm der

Dertitylierungslösung, bezogen auf den vorangegangenen Kopplungsschritt,bestimmt.

Beladungsdichte

Etwa 10 mg mit 4,4'-Dimethoxytrityl-geschütztem Nucleosid als Starteinheit

beladenen CPG-Träger wurden in 25 ml 0.1 M p-Toluolsulfonsäure in CH3CN

suspendiert und die Absorption der Lösung bei 498 nm in einer 10 mm Küvette

bestimmt. Nach Einsetzen in folgende Gleichung erhält man die

Beladungsdichte in pxnol/g.

abs (498 nm) 357.5

Einwaage [mg]= Bdadungsdkhte [pmol/g]

Circulardichroismus (CD)

Jasco J-600 Spektropolarimeter; IBM AT Personalcomputer.

Messparameter:

Data mode CD

Band width 1.0 nm

Slit width auto

Senitivity 20 mdeg

Time constant 2.0 sec

Step resolution 0.1 nm

Scan speed 5 nm/min


Küvettenlänge: 1 cm. In der Zusammenfassung im Kapitel D.ll sind jeweils die

Oligonucleotidkonzentration, Lösungsmittel (falls verschieden von 150 mM

NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7.0, H2O), relativen Elliptizitätsmaxima resp -minima

© sowie die dazugehörenden, berechneten molaren Elliptizitäten (0) in 103°M-

^m"1 angegeben. Die Temperatur wurde direkt in der Probelösung mit einem

Thermoelement gemessen. Die Oligonucleotidkonzentration der Messlösung

wurde vorgängig aus der UV-Absorption im dehybridisierten Zustand berechnet

[55], [56].

Chromatographie

Dünnschichtchromatographie (DO

Es wurden DC-Fertigplatten, Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.25 mm Merck

verwendet. Die jeweils verwendeten Laufmittel und damit erhaltenen Rf-Werte

wurden angegeben. Die UV-aktiven Substanzen wurden unter einer UV-Lampe

(254 nm) detektiert. Verbindungen, die oxidierbare funktionelle Gruppen tragen,

wurden entweder in Cer(IV)sulfat- oder Anisaldehydlösung kurz eingetauchtund dann mit einem Föhn erhitzt.

- Cersulfatlösung: 2.1 g Cer(JV)sulfat, 4.2 g Phosphormolybdänsäure, 12 ml konz.

H2SO4,180 ml H20

- Anisaldehydlösung: 180 ml EtOH, 10 ml Anisaldehyd, 10 ml H2SO4, 2 ml

HOAc

Säulenchromatographie

In den Synthesevorschriften wurden die Menge Kieselgel und das Eluens

angegeben. Im allgemeinen wird der Durchmesser der Säule so gewählt, dass das

Kieselgel etwa 30 cm hoch ist. Bei sehr einfachen Trennproblemen, z.B. wenn

nur ein Salz abgetrennt werden muss, betrug die Säulenhöhe nur etwa 13 cm. Es

wurde jeweils Kieselgel 60, Korngrösse 40-63 um 230-400 mesh ASTM von Merck

verwendet und die Flash-Technik nach Still [92] angewandt.

High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Die Apparatur ist aus folgenden Komponenten zusammengesetzt:

LKB-Bromma 2249 (Pumpe), Kratos Spektroflow 757 (TJV-Detektor), HP-3396 A

(Integrator), oder Tarkan W+W Recorder 600, sowie den später aufgeführten

Säulen und Eluiersystemen. Die Detektion erfolgte bei 260 nm, einzig bei

Oligonucleotiden, die allo-iso-Guanosin enthalten, wurde bei 290 nm detektiert.


-Nucleogen-DEAE (Macherey & Nagel):

präparativ: Vorsäule Nucleogen Guard Column, 30 x 4.0 mm, ID; Säule:

Nucleogen-DEAE 60-7, 125 x 10.0 mm. Mobile Phase: Eluens A: 20 mM

K2HPO4/KH2PO4, pH 6.0, 20% CH3CN, 80% H20; Eluens B: 1 M KCl, 20 mM

K2HPO4/KH2PO4, pH 6.0,20% CH3CN, 80 % H20; Fluss 3.0 ml/min; Druck: 20 - 35

bar.

analytisch: Vorsäule Nucleogen Guard Column, 30 x 4.0 mm, ID; Säule:

Nucleogen-DEAE 60-7, 125 x 4.0 mm. Mobile Phase: Eluens A: 20 mM

K2HPO4/KH2PO4, pH 6.0, 20% CH3CN, 80% H20; Eluens B: 1 M KCl, 20 mM

K2HPO4/KH2PO4, pH 6.0,20% CH3CN, 80 % H20; Fluss 3.0 ml/min; Druck: 40 - 70

bar.

Aquapore RP-300 (Brownlee Labs):

präparativ: Aquapore Octyl Prep-10 Cartridge, 250 x 10.0 mm. Mobile Phase:

Eluens A: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0, H20; Eluens B: 0.1 M

Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0 20% H20, 80% CH3CN; Fluss: 4.0 ml/min.;

Druck: 45 - 55 bar.

analytisch: Vorsäule: RP-8 Newguard, 15 x 3.2 mm, 7 um; Säule: Aquapore RP-

300, 220 x 4.6 mm, 7 uM. Mobile Phase: Eluens A: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M

HOAc, pH 7.0, H20; Eluens B: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0 20% H20,

80% CH3CN; Fluss: 1.0 ml/min.; Druck: 60 - 85 bar.

Spherisorb 300Ä C-18 (Phase Sep):

präparativ und analytisch: Spherisorb 300Ä, C-18, 10 um 250 x 9.0 mm

(Festphase von Phase Sep, gepackt von Dr. J. Schreiber (ETH Zürich) nach der

'slurry'-Methode gepackt [93]). Mobile Phase: Eluens A: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M

HOAc, pH 7.0, H20; Eluens B: 0.1 M Triethylamin, 0.1 M HOAc, pH 7.0 20% H20,

80% CH3CN; Fluss: 3.0 ml/min.; Druck: 28 - 38 bar.

MonoO (Pharmacia LKB):

Mit einer Mono Q-Säule ist es möglich, bei pH 12 zu arbeiten. Dabei muss

allerdings auch ein gegen basisches Medium stabiles Pumpensystem verwendet

werden. Diese setzte sich zusammen aus: P-500 (Pumpe, Pharmacia), mit

Gradient Programmer GP-250 (Pharmacia). Der Detektor und der Recorder sind

identisch mit den oben zitierten Geräten.

präparativ und analytisch: Mono Q®, HR5/5 (Pharmacia LKB). Mobile Phase:

Eluens A: 0.01 M NaOH, H20; Eluens B: 1 M NaCl, 0.01 NaOH, H20; Fluss: 1.0

ml/min; Druck: 40 - 50 bar.


In der Tabelle der Reinigung der Oligonucleotide (Kapitel D.10) sind die

Retentionszeit (tu), die Halbwertsbreite o (was der halben Peakbreite bei 60% der

Peakhöhe entspricht) und die Bodenzahl N (N={tR/a)2) aufgelistet.

DNA-Synthesizer

Es wurden zwei verschiedene Modelle von DNA-Synthesizern verwendet:

- 380 B DNA Synthesizer (ABI):

Alle zur Synthese benötigten Reagenzien, ausser den Phosphoramiditen,wurden von ABI gekauft. Die Phosphoramiditlösungen wurden nach folgender

Formel zubereitet:

f • x • (n + 3) 1.5 MG = ug (Phosphoramidit)

f = Anzahl Equivalente Phosphoramidit je Kopplung (man verwendete jeweils10 Eq)

x = Beladungsdichte [umol/g] • Menge Träger [g]n = Anzahl Kopplungen für das jeweilige Nucleotid total

MG = Molekulargewicht des Phosphoramidits

Die Phosphoramidite wurden in (n + 3) • 0.15 ml CH3CN gelöst.

- Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB), gesteuert durch einen PC M-300

(Olivetti):

Alle Reagenzien wurden gemäss den Angaben in [52] selbst hergestellt. Die

Phosphoramiditlösungen wurden als 0.1 M Lösungen in CH3CN hergestellt. Es

wurde jeweils je Kopplung 0.16 ml Lösung verbraucht und für jedes Nucleotid

zwei Sicherheitskopplungen einberechnet. Die Tetrazol-Lösung war 0.5 M in

CH3CN. Man gab sowohl zur Phosphoramidit-, wie auch zur TetrazoUösungfrisch aktiviertes 4 A Molsieb.

a) Homo-DNA OligonucleotideDie Festphase, an welche Oligonucleotide der Homo-Reihe (vornehmlich

Homo-7-carbaadenosin enthaltende Oligonucleotid-Sequenzen) gebunden

waren, wurde in ein Gewindefläschchen gegeben, mit 4 ml 25 %

Ammoniaklösung überschichtet und für 14 Stunden bei 55°C belassen. Man

engte auf 0.5 ml ein und entfernte durch Mikrofiltration die Festphase, wusch


diese mit 4 ml H2O nach, engte diese Lösung auf 2 ml ein und trennte das

gewünschte Oligonucleotid HPL-chromatographisch ab (Bedingungen vgl Tabelle

Kapitel D.IO). Anschliessend wurden die Oligonucleotide noch über SEP-PAK

entsalzt.

b) Allopyranosyl-isoguanin enthaltende Oligonucleotideenthalten noch Allylschutzgruppen, die in Anlehnung an Noyori et al. [53]

noch am Träger entschützt wurden1. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:

Zum CPG-Träger wurde eine Suspension von 3.6 ml THF, 240 ul n-Butylamin,90 ul Ameisensäure, 122 mg Triphenylphosphin und 42.0 mg Tris-

(dibenzylidenaceton)-dipalladium(O) zugegeben. Die Suspension wurde für 20

Std. unter gelegentlichem kräftigen Durchmischen bei 55°C geheizt. Diese

Suspension wurde mit Hilfe einer Pipette vorsichtig von der Festphase abgesaugt

und zur Abtrennung von eventuell mitgeschlepptem Träger durch eine

Glasfilternutsche abfiltriert. Die Festphase wird sodann zwei Mal mit THF und

zwei Mal mit je 4 ml Aceton gewaschen. Dabei wurden die Lösungsmittel

wiederum durch die Nutsche abfiltriert. Der in der Nutsche zurückgehaltene

Träger wurde nun in die Gewindeflasche zurückgegeben und der Träger für 15

Min. in 0.1 M Natriumdiethyldithiocarbamat pH 9.7 suspendiert. Die Lösung

wurde analog der oben beschriebenen Vorgehensweise abpipettiert. Der Träger

wurde drei Mal mit Aceton, einmal mit H2O gewaschen und noch einmal für 15

Min. in 0.1 M Natriumdiethyldithiocarbamat suspendiert, drei Mal mit Aceton

und einmal mit H2O gewaschen. Darauf wurde das Trägermaterial in 4 ml 25 %

Ammoniaklösung suspendiert und für 14 Stunden bei 55°C im Heizblock

belassen. Dabei wurde das Oligonucleotid vom Träger abgespalten und die

Amidschutzgruppen der Basen abgespalten. Die ammoniakalische Lösung wurde

auf etwa 0.5 ml am RV eingeengt, das CPG durch Mikrofiltration abgetrennt und

mit 5 ml H2O nachgewaschen. Diese Lösung wurde auf = 2 ml eingeengt und

HPL-chromatographisch aufgetrennt (vgl. Tabelle zur Reinigung der

Oligonucleotide Kapitel D.10). Die vereinigten Produktfraktionen wurden so weit

wie möglich am RV eingeengt, mit 0.01 M HCl - Lösung in eine Gewindeflasche

ißei Allose-NA Oligonucleotiden hat es sich als sehr vorteilhaft erwiesen, die DMT-Schutzgruppedes zuletzt an das Oligonucleotid gekoppelten Nucleotids noch nicht abzuspalten, was die

Abtrennung der kürzeren Oligonucleotide stark vereinfachte. Bei Allopyranosyl-isoguaninenthaltenden Oligonucleotiden war es jedoch nicht möglich diese DMT-Gruppe am Oligonucleotidzu belassen, da sie, wie in einem kleinen Vorversuch unter Allylentschützungsbedingungen gezeigtwerden konnte, nicht stabil war.


gespült und dann mit 1.00 M und 0.10 M HCl - Lösung auf pH 2.0 eingestellt und

bei 55°C im Heizblock, um die Ketalschutzgruppen abzuspalten, so lange

gehalten, bis ein Optimum zwischen Zersetzungsprodukt und noch nicht

vollständig entschütztem Oligonucleotid eingetreten ist, was bei jedem

Oligonucleotid unterschiedlich lange dauert. Die Kontrolle, wie weit die

Entschützung der 2',3'-Hydroxygruppen bereits fortgeschritten war, erfolgte

durch analytische Injektion am HPLC. Um die Ketalspaltung zu beenden,

wurden 30 mg (360 umol, => 10 Eq. bez. H30+) NaHC03 zugegeben. Man engte

diese Lösung auf etwa 2 ml ein und trennte sie HPL-chromatographisch

(Bedingungen vgl. Tabelle Kapitel D.IO, Fussnote2 gibt jeweils die Bedingungen

für die Trennung der Oligonucleotide nach der Ketalabspaltung an, während die

Bedingungen für die Trennung vor der Ketalspaltung unter der Fussnote1 in

derselben Tabelle angegeben sind).

Elementaranalysenwurden im mikroanalytischen Laboratorium des Instituts für organischeChemie der ETH durchgeführt.

Entsalzen von Oligonucleotiden

Nach der HPL-chromatographischen Auftrennung von Oligonucleotidenmussten die produkthaltigen Fraktionen von überschüssigem KCl (DEAE-

Nucleogen-Chromatographie), Triethylammoniumacetat (RP-Chromatographie)oder NaCl (Mono Q) abgetrennt werden.

Dazu wurden die produkthaltigen Fraktionen auf 1.5 ml eingeengt. Diese

Lösung wurde sodann auf eine mit 5 ml MeOH und 20 ml H2O gespülte SEP-

PAK, 10 x 9 mm (Waters) RP-Säule, die auf eine 5 ml Hamilton Spritze

aufgesteckt wurde, gegeben und drückte sie mit Druckluft tropfenweise durch die

Säule, spülte mit 5 ml H2O nach, um das Salz vollständig zu eluieren und

eluierte das Oligonucleotid mit 10 ml MeOH : H2O = 3:7 von der Säule. Das

Eluens wurde in jeweils 1.5 ml Fraktionen gesammelt und nur die UV-aktiven

MeOH/H20 Fraktionen gesammelt und eingeengt. Vor allem Allose-NA

Oligonucleotide, die sehr polar sind, wurden schon teilweise mit Wasser eluiert.

Auch hier wurden nur die UV-aktiven MeOH/H20 Fraktionen gesammelt. Die

wassrigen Fraktionen wurden nochmals auf » 1 ml eingeengt und damit die

gesamte Entsalzungsprozedur noch zwei weitere Male wiederholt.


Fällen

Als Reinigungsmethode der Wahl bei den äusserst labilen, schon Flash-

chromatographierten Phosphoramiditen erwies sich das Fällen. Man löste dazu

die zu reinigende Verbindung in wenig Lösungsmittel (in dem diese Verbindung

gut löslich ist) und tropfte sie langsam zu einem intensiv gerührten, auf 0°C

gekühlten Lösungsmittel, in dem die Verbindung unlöslich ist. Darauf filtrierte

man das Präzipitat ab.

Gelelektrophorese

Die Apparatur für die Polyacrylamidgelelektrophorese besteht aus:

Model 3000/300 Power Supply (BIO-RAD); sowie den Gelhaltern von Biotec für

kleine Gels (145 x 120 x 0.8 mm) und Model S2 (Bethesda, Resarch Laboratories;

300 x 380 x 0.8 mm).

Die Angaben über die Gelzusammensetzung und die Temperatur, bei der das

Gel laufengelassen wurde, steht jeweils direkt bei den abgebildeten Gels. Die

übliche Menge Oligonucleotid wurde jeweils so gewählt, dass total ein Aliquot

von 40 nmol Base auf das Gel aufgetragen werden konnte. Es wurden

grundsätzlich zwei verschiedene Arten von PAGE (Polyacrylamidgel¬

elektrophorese) durchgeführt, nämlich denaturierende und nicht denaturie¬

rende Gels [64]. Die an einem Speedvac Concentrator SVC 100 H (Savant) in

Eppendorfröhrchen lyophilisierten Oligonucleotide wurden in 10 pl 10%

Saccharose-Lösung gelöst und auf das Gel aufgetragen. Ein denaturierendes

PAGE wurde durch Zusatz von Harnstoff (das Gel war 7 M an Harnstoff) erhalten

und das lyophilisierte Oligonucleotid wurde in Formamid gelöst und auf das Gel

aufgetragen. Die Gels wurden üblicherweise so lange laufen gelassen, dass ein

Marker (Bromphenolblau), ebenfalls in loading buffer aufgetragen, 2/3 des Gels

durchflössen hatte. Die Herstellung der Gels erfolgte nach [64]. Die

Oligonucleotide wurden durch Eintauchen des Gels für etwa 2 Stunden in einer

Anfärbelösung aus 50 mg Stains all, 200 ml (mit Ionentauscher MB-3 5 g/100 ml

für 1/2 Std. deionisiertem) Formamid und 200 ml deionisiertem Wasser [94] für

etwa eine Stunde und anschliessendes Waschen des Gels für eine weitere Stunde

auf dem Gel sichtbar gemacht und das Gel darauf fotografiert.


Hyperchromizität (% H)

Die prozentuale Hyperchromizität % H bei einer Temperatur T ist definiert als

{D(T)-D0}% H(T) = 100% •

—^5—L

Dabei ist D° der kleinste Absorptionswert im Laufe eines Schmelz- oder

Hybridisierungsexperiments [61, Seite 22], [62, Seit 409].

IR-Spektren

Perkin-Elmer Gitterspektrograph PE 983 (KBr-Spektren) und PE 781 (CHC13-

Spektren). Die Bandenlagen wurden in cm-1 und die relativen Peakintensitäten

und -formen mit folgenden Abkürzungen charakterisiert: vs = sehr stark, s =

stark, m = mittel, w = schwach, sh = Schulter, br. = breit.

Massenspektren

EI-Spektren: Tribrid (Ionisationsenergie 70 eV).

Pos-FAB-Spektren: ZAB-2 SEQ. Angabe von m/z, sowie in Klammern die

relative Intensität in % des Basispeaks. Mit M+ wird der Molpeak bezeichnet.

Mikrofiltration

Die Mikrofiltration diente dazu, Suspensionen, die das gewünschte

Oligonucleotid enthalten, vor der HPL-chromatographischen Reinigung vom

unlöslichen Anteil abzutrennen, um die Säule nicht zu zerstören.

Dazu wurde die Suspension in eine 5 ml Hamiltonspritze mit TLL-Anschluss,

an dem man ein Micropore braun: Spartan 13/20, 0.45um,Braunrand H

(Schleicher & Schuell) Filter angeschlossen hatte, gegeben. Man presste die

Lösung durch den Mikrofilter und wusch den unlöslichen Anteil nochmals mit

4 ml H2O nach.

lH-NMR-SpektrenDie Spektren wurden entweder auf einem Bruker WM-300, einem Varian XL-

300 oder einem Bruker AMX-400 gemessen. Chemische Verschiebungen sind in

ppm bezogen auf TMS = 0.0 oder CHCI3 = 7.26 ppm als internen Standard,

Kopplungskonstanten J in Hertz angegeben. Spinmultiplizitäten werden mit s =

Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett und m = Multiple«, breite Signale


mit br. abgekürzt. Die Signalzuordnung erfolgte vor allem anhand [95]. Die

Lösungsmittel, mit denen die Substanz noch vermischt ist werden im IH-NMR

nicht extra erwähnt.

13C-NMR-SpektrenDie 13C-NMR Spektren wurden entweder auf einem Varian XL-300 (75 MHz)

oder einem Bruker AMX-400 (100 MHz) Gerät aufgezeichnet. Als interner

Standard diente TMS = 0.0. Es wurden ausschliesslich 'H-breitbandentkoppelteund DEPT-Spektren aufgenommen.

31P-NMR-SpektrenSie wurden auf einem Bruker AMX-400 (162 MHz) breitbandentkoppelt

aufgezeichnet.

Optische Drehungen

Polarimeter Perkin-Elmer PE-241; d = 10 cm, c in g/100 ml, bei 25°C bei der

Natrium-D Linie gemessen.

Schmelzkurven

Die UV-Apparatur, um Schmelzkurven aufzunehmen war aus folgenden

Geräten zusammengesetzt:- Perkin-Elmer Lambda 2 (UV-Spektrometer)- Perkin-Elmer Digital Controller No. 570-0701

- Perkin-Elmer Temperatur Programmer C 570-710 (Temperaturgradienten¬

steuerung).

Der Probenraum wurde mit N2 gespült, um die Kondensation von Wasser an

der Küvette bei tiefen Temperaturen zu verhindern. Die Messlösungen wurden

vor der Messung am Hausvakuum (» 50 Torr) entgast, um die Entstehung von

C02-Blasen an der Wand der Küvette bei steigender Temperatur zu verhindern.

Die Temperaturen wurden im Heizblock direkt neben der Küvette gemessen.

Schmelz- resp. Hybridisierungsexperimente wurden bei einem

Temperaturgradienten von + resp. - 0.5°C/min. durchgeführt und alle 2.3 min.

ein Messpunkt aufgezeichnet. Die beobachtete Wellenlänge, die

Oligonucleotidkonzentration, die Schmelztemperatur, die prozentuale

Hyperchromizität und das Lösungsmittel, falls verschieden von 150 mM NaCl,

10 mM Tris • HCl, pH 7.0, H2O, sind angegeben. Die Oligonucleotidkonzentration


wurde aus der Absorption der Lösung bei der Temperatur, bei der das Oligomere

vollständig dehybidisiert vorliegt, und dem berechneten Absorptionskoeffizient

bestimmt.

Schmelzpunktewurden in einem offenen Röhrchen auf einem SMP-20 (Büchi) bestimmt und

sind nicht korrigiert.

Schmelztemperaturen (Tm) von Oligonucleotiden

Die Schmelztemperaturen von Oligonucleotiden (Tm) wurden rechnerisch

ermittelt - als diejenige Temperatur, bei der 50% der maximalen

Hyperchromizität erreicht ist. Falls im Temperatur vs. % Hyperchromizität -

Graphen die Bereiche der hybridisierten und der geschmolzenen Spezies beide

horizontal verlaufen. In anderen Fällen erfolgte die Bestimmung graphisch, als

Schnittpunkt der Schmelzkurve mit der Winkelhalbierenden von zwei

Tangenten an die Schmelzkurven.

UV/VIS-Spektren

UV-Spektren zur Charakterisierung wurden auf einem UVDCON 860 (Kontron)

durchgeführt. Es wurden die Absorptionsmaxima in nm und in Klammern die

molaren Extinktionskoeffizienten ([M"1]) angegeben.

D.2 Abkürzungen

Chemikalien, die mit der Molekularformel (z.B. CH2CI2 für Methylenchlorid)im Text zitiert werden, werden hier nicht mehr aufgeführt. Ebenso sind offizielle

Abkürzungen von Einheiten nicht aufgelistet.

abs absolutiert

AcOH EssigsäureAr Argon

aq. aquatisiertber. berechnet

BSA N,0-Bis-trimethylsilyl-acetamid


BuOH Butanol

CD Circulardichroismus

CPG Long Chain Alkylamin auf ControUed Pore Glass

DC Dünnschichtchromatographie

DCC N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid

dest. destilliert

DMAP 4-Dimethylamino-pyridinDMF N,N-DimethylformamidDMTC1 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan

EDTA EthylendiamintetraacetatEI Elektronenstoss-Ionisation

Eq Aequivalent

EtOAc Essigsäureethylester

FAB Fast Atomic Bombardement

ges. gesättigte wässrige Lösung des angegebenen

Salzes

%H relative, prozentuale Hyperchromizität

HMDS HexamethyldisilazanHPLC HochdruckflüssigchromatographieHV Hochvakuum (<0.05 Torr)

IR Infrarotspektroskopiekonz. konzentriert

Lsg. Lösung

M Molar oder Molekülpeak im MS

MeOH Methanol

MS MassenspektrumN Normalität einer wassrigen Lösung oder

Bodenzahl, N = [tR/a]2

NMR Kernmagnetresonanzspektroskopie

3-NOBA 3-Nitro-benzylalkohol

PAGE PolyacrylamidgelelektrophoresePTS Pyridin-(toluol-4-sulfonat)RP Umkehrphase

RT Raumtemperatur

RV Rotationsverdampfer

Sdp./Smp. Siede-/Schmelzpunkt


TBAF

TMS-Triflat

tR

techn.

TEMED

THF

TIPDSKCy

Tm

TMSiCl

Tris

UV/VIS

zers.

e

o

0

(0)

Tetrabutylammoniumfluorid

Trifluormethansulfonsäuretrimethylsilylester

Retentionszeit

technische Qualität

N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin

Tetrahydrofuran

(l,3-Dichlor-)l,l,3,3-tetraisopropyl-disiloxan

Schmelztemperatur von Oligonucleotiden

Trimethylchlorsilan

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

Ultraviolett-/Visiblespektroskopie

Zersetzung

Extinktionskoeffizient [M"1cm_1]

Halbwertsbreite (Halbe Peakbreite auf 60% der

Höhe eines Peaks)

Elliptizität [mgrad]molare Elliptizität [103 gradM^cm-H

D.3 Lösungsmittel und Reagenzien

AcetanhydridAceton

Acetonitril

AcrylamidAdipinsäure-bis-(4-nitro-phenyl)-esterAUylalkoholAlox B

Ameisensäure

Ammoniak

AmmoniumperoxydisulfatArgonBenzoylchloridBernsteinsäureanhydridBorsäure

Merck, puriss. p.a.techn., dest. Sikkon/N2Für UV: Merck, für die Spektroskopiefür HPLC: Merck, für die ChromatographieFür Reaktionen: Fluka, puriss. p.a. dest.

CaH2/N2Fluka, puriss., vier Mal umkristallisiert

hergestellt von R. Fischer analog [96]

Fluka, purum >98%, dest. Natrium/Ar

Alumina Woelm® B, Akt. 1

Fluka, puriss. p.a.

Multigas, 99.9%

Fluka, puriss. p.a.Pan Gas, 4.8

Fluka, puriss.Fluka, puriss.Fluka, puriss. p.a.


Bromacetaldehyddiethyl-acetal

Bromphenolblaun-Butanol

BSA

CCI4CDCI3

CH2CI2

CHCI3

CPG

CyanessigsäureethylesterChloro(2-cyanoethoxy)-(N,N-diisopropylamino)phos-phinDCC

Dichloressigsäure2,6-DichloropurinDiethylether4,4'-Dimethoxy-triphenyl-chlormethan

4-Dimethylamino-pyridinDioxan

DMAP

DMF

DMSO-d6

EDTA, Dinatriumsalz,

DihydratEtOAc

EtOH

Ethyl-diisopropylaminFormamid

Harnstoff

HexamethyldisilazanHexan

HCl konz.

HCl 1.0 M, 0.1 M

Fluka, pract. dest./N2

Fluka, Standard Indikator

Fluka, puriss.Fluka, purumFluka puriss. p.a. dest. über CaH2/ArgonDr. Glaser, Basel, Isotopic purity >99.95% atom

%D

techn., dest. K2C03/N2für Chromatographie noch filtriert durch Alox B

(lOOg/1)Für Reaktionen: Fluka puriss. p.a., filtriert durch

Alox B

techn., dest. P4O10/N2, und filtriert durch Alox B

(100g/l)Für Reaktionen: Fluka puriss. p.a., filtriert durch

Alox B

Sigma, No L-8638

Fluka, purum

hergestellt nach [34]

Fluka, puriss.Fluka, puriss.Janssen, 97%techn. dest. NaH/N2Fluka, purum >97%

Fluka, purum >98%

Fluka, puriss. p.a., filtriert über Alox B (200 g/1)Fluka, purumFluka, puriss. p.a., dest. Molsieb 4Ä/N2Dr. Glaser, Basel, Isotopic purity >99.96% atom

%D

Siegfried

techn., dest. über Sikkon/N2

Fluka, puriss. p.a.

Fluka, puriss. p.a., dest. CaH2/N2Merck, pro analysisFluka, puriss. p.a.Fluka, purumtechn., dest. K2CO3/N2Fluka, puriss. p.a. >36.5%

Merck, Titrisol (0.01 M HCl aus 0.1 M

durch Verdünnung erhalten)


H20

HOAc

h

K2C03KCl

KH2PO4

K2HPO4

Kieselgel

MB-3 - Ionentauscher

MgCl2, HexahydratMgS04MetachlorperbenzoesäureMethanol

2-Methoxy-propenMolekularsieb

Natrium

NaCl

NaHC03NaI

NaOH

Na2S04

NH3aq.NH4CI

4-NitrophenolN,N'-Methylen-bis-acrylamidPd/Aktivkohle

Penta-O-acetyl-ß-D-allosePyridinPyridin-hydrochloridPyridin-(toluol-4-sulfonat)Raney - Nickel

SnCl4Stains all

TBAF.H2OTEMED

Tetrazol

THF

Thioharnstoff

TTPDSiCl2

Für HPLC, Gelelektrophorese und

Oligonucleotiduntersuchungen: ultrafiltriert

(Gerät, Sybron, Barnstead, Leitfähigkeit 186

Mu/cm) Für Extraktionen: deionisiertes Wasser

Fluka, puriss.p.a.Fluka, puriss. p.a., Kügelchentechn., wasserfrei

Merck, p.a.

Fluka, puriss. p.a.Merck, pro analysiMerck, Kieselgel 60, Korngrösse 0.040-0.063 mm,

230-400 Mesh ASTM für SäulenchromatographieFluka, Chemika, 20-50 mesh

Fluka, purum, p.a.techn. wasserfrei

Fluka, purum 90%

Fluka, puriss. p.a.

Fluka, pract. - 98%

Fluka, Union Carbide, Typ 4 A, aktiviert für 8

Std. am HV

Fluka, pract. in grossen Stücken

Fluka, puriss.Merck, p.a.

Fluka, puriss. p.a.

Siegfried, PhHVItechn., wasserfrei

Fluka, puriss. p.a. « 25%

Merck, puriss. p.a.Fluka, puriss. p.a.

Fluka, puriss.Fluka, puriss. 10%

Hergestellt im Kilolabor nach [97]

Fluka, puriss. p.a., dest. CaH2/ArgonFluka, purum >98%

Fluka, puriss. >99%

Fluka, (Nickel - Aluminium Legierung), purum50% Ni + 50%A1 aktiviert nach einer Vorschrift

aus dem Organikum [98]

Fluka, purumFluka, BioChemika >95%

Fluka, purum

Fluka, purumFluka, purum, sublimiert 110°C/0.05 Torr

Fluka, puriss. p.a., dest. Natrium/N2Fluka, puriss. p.a.

Fluka, purum >98%


Toluol

4-Toluolsulfonsäure

Monohydrat

Fluka, puriss. p.a.

Fluka, puriss.

Trifluormethansulfonsäure- Fluka, purum >98%

trimethylsilylesterTriethylamin

TrimethylsilylchloridTriphenylphosphinTris

Tris-(dibenzylidenaceton)-dipalladium(O)

Tris-(dimethylamino)-phos-phinUracil

Zitronensäure Monohydrat Fluka, puriss. p.a.

Fluka, puriss. p.a.für HPLC: ohne weiter Behandlung verwendet

für Reaktionen: dest. CaH2/ArgonFluka, puriss.Fluka, puriss.Fluka, BioChemika

Aldrich

Fluka prakt. >97%

Fluka, puriss.


D.4 ß-Homo-deoxyuridin

D.4.1 l-(4',6,-Di-0-acetyl-2',3,-dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)uracil

AcO i ACO ^^ß\,K + IT WYJ«

AcO^C^-^OCH3 kN^O AcO^^^ YH

°

3 6 7 oc/ß

Eine Suspension von 2 83 g (9 75 mmol) 3 und 1 33 g (10 88 mmol) Uracil in 120

ml abs CH3CN wurde unter Ar bei RT mit 2 45 ml (12 2 mmol) HMDS und 1 64

ml (12 9 mmol) TMSC1 versetzt Nach 30 min Ruhren wurden 1 60 ml (13 61

mmol) SnCU zugegeben und die nun homogene, farblose Reaktionslosung

wahrend 16 Std auf 44°C erwärmt Anschliessend wurde auf RT abgekühlt, am

RV bis auf 30 ml eingeengt, mit 200 ml EtOAc versetzt und zwei Mal mit je 100

ml H2O und einmal mit 100 ml ges NaHC03 gewaschen Die wassrigen Phasen

wurden zweimal mit je 150 ml EtOAc ruckextrahiert Die vereinigten org Phasen

wurden mit 250 ml ges NaCl gewaschen, über Na2S04 getrocknet und am RV

eingeengt Das so erhaltene Rohgemisch wurde mit Hexan EtOAc = 3 1 an 450 g

Kieselgel Chromatographien Die reinen, produkthaltigen Fraktionen der

einzelnen Komponenten wurden vereinigt und am RV vom Losungsmittel

befreit Auf diese Weise erhielt man nach Trocknen am HV bei RT für 16 Std

2 24 g (60%) Homo-deoxy-ß-undm (apolareres Nucleosid) 7 und 0 69 g (18%)

Homo-deoxy-cc-undin 7a je in Form eines farblosen Schaumes

Analytische Daten (ß-Anomer)

DC Rf = 0 53, (Kieselgel/EtOAc)

[ojcr^0 =-121(c = 187,CHCl3)

UV (EtOH) 206 (6610), 258 (9284)

IR (KBr) 3420w br, 3200w br, 3100w, 2980w, 2890w, 1745vs br, 1690vs br,

1630m, 1455m, 1380m, 1320w, 1280s, 1250s, 1195w, 1150w, 1130w,

1120w, 1090m, 1070m, 1045m, lOOOw, 930w, 820w


'H-NMR (300 MHz, CDCI3): 1.70-1.80 (m, 2H, H-C(3')), 2.00-2.14 (m, 7H, H-C(2'),

darunter auch 2.07,2.08 (2s, je 3H, CH3CO)), 2.33-2.38 (m, 1H, H-C(2')),

3.83 (ddd, J=2.2 5.4 10.0,1H, H-C(5')), 4.15 (dd, J=2.2 12.2 1H, H-C(6')),

4.24 (dd, J=5.412.2,1H, H-C(6')), 4.73 (ddd, J=4.8 10.2 10.2,1H, H-C(4')),

5.73 (dd, J=2.4 7.7,1H, H-C(l')), 5.79 (d, J=8.2,1H, H-C(5)), 7.39 (d, J=8.2,

1H, H-C(6)), 8.71 (s br., 1H, NH)

Abb. D4.1: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 7.

Differenz-NOE: 3.83 (H-C(5')) «" 4.15 (H-C(6')), 4.24 (H-C(6')), 4.73 (H-C(4')), 5.73

(H-C(D)

(75 MHz, CDCb): 21.7, 22.2 (2q, CH3CO), 23.9,24.5 (2t, C(2'/3')), 62.1 (t,

C(6')), 66.1 (d, C(4')), 75.9 (d, C(175')), 77.5 (d, CU75')), 102.7 (d, C(5)),

139.7 (d, C(6)), 150.2 (s, C(4)), 163.6 (s, C(2)), 170.2,170.5 (2s, C=0)

(EI): 327 «M + H)+, 1.5), 216 (20.9), 215 (98.3), 155 (76.6), 138 (13.0), 113

(100.0), 112 (11.0), 96 (16.2), 95 (100.0), 94 (23.0), 83 (13.0), 81 (24.0), 71

(15.4), 70 (15.5), 69 (29.7), 68 (12.3), 67 (64.0), 55 (15.7), 44 (12.9), 43 (98.0),

42 (10.7), 41 (24.6), 28 (10.0)

13C-NMR

MS


Analytische Daten (g-Anomer):

DC Rf = 0.42, (Kieselgel/EtOAc)

MrjZS0 = +10.1 (c = 1.49, CHCI3)

UV (EtOH): 207 (7183), 259 (10109)

IR (KBr): 3390w, 3020m, 2980w, 1740s br., 1715s, 1690s br., 1630m, 1455m,

1370m br., 1325w, 1265m, 1220s br., 1140m, 1080m, 1040m, 1020m,

970m, 935w, 810m

tl, \. jI.

..

,^M

L<LLjl^_

—1—-i 1 1 1 1 1 1 1 r 1 1 1 1 1—

90 80 70 60 SO 40 30 20

l l I

10 0 0 ppm

Abb. D4.2: ^-NMR (400 MHz, CDCI3) von 7a (verunreinigt mit ca. 20% 7ß).

JH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.63-1.73, 1.86-1.95, 2.08 (3m, 4H, H-C(2',3'), 2.10,

2.14 (2s, 6H, CH3CO), 4.22-4.30 (m, 2H, H-C(6')), 4.41 (m, IH, H-C(5)),

4.87 (ddd, J=1.6 3.0 3.0, IH, H-C(4')), 5.77 (d, J=8.2, IH, H-C(5')), 5.94

(dd, J=4.1 9.4, H-CÜ')), 7.47 (d, J=8.2, IH, H-C(6)), 8.68 (s br., IH, NH)

«C-NMR (100 MHz, CDCI3): 21.1 (q, CH3CO), 23.9 (t, C(3')), 25.0 (t, C(2')), 61.6 (t,

C(6')), 65.7 (d, C(5')), 75.7 (d, C(4')), 77.5 (d, C(l')), 102.7 (d, C(5)), 139 7

(d, C(6)), 150.2 (s, C(4)), 163.5 (s, C(2)), 170.2,170.5 (2s, C=0)

MS (EI): 327((M + H)+, 0.5), 215 (73.9), 155 (29.1), 113 (33.6), 95 (37.8), 94

(13.1), 81 (24.8), 69 (14.0), 67 (19.0), 43 (100.0), 41 (10.5).


D.4.2 l-UVS'-Dideoxy-ß-D-glucopyranosyDuracil

ACQ ^P HO ^yßA^^NH *- X^X^H^<'m

AcO-V^^ Y HO''X>^ YO 0

7 8

Eine Lsg. von 2.24 g (6.85 mmol) 7 in 20 ml mit NH3 gesättigtem Methanol

wurde bei RT 12 Std. gerührt. Nach Einengen und Trocknen am HV wurde der

feste Rückstand in siedendem Aceton gelöst und mittels isothermer Destillation

[99], [100] gegen Pentan kristallisiert. Nach 5 Tagen wurde die Mutterlauge

dekantiert, die Kristalle mit 2 x 10 ml eisgekühltem Aceton gewaschen und am

HV bei RT für 16 Std. getrocknet. Die Mutterlauge wurde in Aceton gelöst, über

Kieselgel filtriert, eingeengt und der Rückstand noch einmal in analoger Weise

zur Kristallisation gebracht. Insgesamt wurden aus beiden Kristallisationen 1.46 g

(88%) l-(2',3'-Dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)-uracil 8 in Form farbloser Nadeln

isoliert.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.30, (Kieselgel/EtOAc: EtOH = 5:1)

[alr^S" = +11.6 (c = 0.97/H2O)

UV (H20): 205 (11360), 260(10263)

IR (KBr): 3520m ,3380s

,3220m

,3100m

,3070m

,2960m

, 2870m, 1680vs

br., 1620m ,1470m

,1440m

,1415m

,1385s

,1350m

,1335m

,1320m

,

1300m,1275s

,1265s

,1240s

,1220m

,1190m

,1125m

, 1095s, 1060s,

1040m,1010m

,990m

,955m

,925m

,880m

,835m

,825m

,775m

,

730m

iH-NMR (300 MHz, DMSO-d<>): 1.46-1.60 (m, IH, H-C(3')), 1.71-1.79 (m, 2H, H-

C(2')), 1.97-2.09 (m, IH, H-C(3')), 3.16-3.38 (m, 2H, H-C(6')), 3.48 (m,

IH, H-C(4')), 3.67 (ddd, J=1.7 5.2 11.8, IH, H-C(5')), 4.48 (t, J=5.7, IH,

HO-C(6')), 4.85 (d, J=5.2, IH, HO-C(4')), 5.51 (dd, J=5.2 7.9, IH, H-C(l')),

5.61 (d, J=8.1, IH, H-C(5)), 7.69 (d, J=8.1, IH, H-C(6)), 11.32 (s, IH, NH)


"C-NMR (75 MHz, DMSO-d6): 28.7, 31.2 (2t, C(273')), 61.0 (t, C(6')), 63.9 (d,

C(4')), 80.8 (d, C(175')), 83.3 (d, C(175')), 101.5 (d, C(5)), 140.8 (d, C(6)),

149.7 (s,C(4)), 162.8 (s,C(2))

MS (EI): 243 (M+H+, 1), 131 (36), 113 (18), 69 (19), 58 (11), 57(10), 43 (100), 42

(12), 41 (11), 32 (22), 31 (26)

Abb. D43: 'H-NMR (400 MHz, DMSCM') von 8.

CioH14N205: ber.: C 49.58, H 5.83, N 11.56, gef.: C 49.70, H 5.93, N 11.49

Schmelzpunkt: 191°C.

D.4.3 l-{2',3,-Dideoxy-6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)methyl]-ß-D-glucopyranosyl}uracil

HO

HO'

O

DMTO f^N^C

rx>Vo

8 9


In 25 ml Pyridin wurden 2.824 g (11.1 mmol) 8 und 101 mg (0.80 mmol) DMAP

unter Argon gelöst. Man gab 2.50 ml (1.82 g, 17.9 mmol) Triethylamin und 4.50 g

(13.2 mmol, 1.1 Eq.) 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan zu. Die sich schwarz

verfärbende Lösung wurde für 4 Std. unter Ar bei RT gerührt. Man gab 100 ml

H2O zu und extrahierte zwei Mal mit je 500 ml CH2CI2. Man trocknete die org.

Phasen über Na2S04, engte am RV ein und koevaporierte zwei Mal mit je 30 ml

Toluol. Chromatographie an 150 g Kieselgel mit 2 1 EtOAc und anschliessende

Umkristallisation aus CH2C12 lieferte 7.10 g (93%) 9.

Analytische Daten:


[alrj25" =+46.2 (c = 1.43, CHCI3)

UV (EtOH): 234 (24072), 257 (12430)

IR (CHCI3): 3500w br., 3390w, 3010m, 2800w br., 1695s br., 1635w, 1610m,

1585w, 1510m, 1455m, 1390m br., 1330m, 1300m, 1250m, 1180m,

1095m br., 1035m, 830m

uu :LV_

0x^rT

1 1 1 1 1 1—

10.0 9.0 8.0

1 1 i~

6.0

—1 1 1 1 1 1 1 1 1 r

4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm5.0

Abb. D4.4: 'H-NMR (300 MHz, DMSO-d«) von 9.


iH-NMR (300 MHz, DMSO-d*): 1.52-1.60 (m, 1H, H-C(2',3')),1.75-1.88 (m, 2H, H-

C(273')), 1.99-2.08 (m, IH, H-C(273')) 3.08 (dd, J=6.3 10.1, IH, H-C(6')),

3.22-3.25 (m, 2H, H-C(476')), 3.57 (m, IH, H-C(5')), 3.72 (s, 6H, H3C-O),

4.81 (d, J=5.7, IH, HO-C(4')), 5.62 (dd, J=2.2 4.3, IH, H-C(l')), 5.71 (d,

J=8.1, IH, H-C(5)), 6.82 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.16-7.27 (m, 7H, H-

C(arom.)), 7.40 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.68 (d, J=8.1, IH, H-C(6)), 11.30 (s

br.,lH,NH)

«C-NMR (75 MHz, DMSO-d*): 28.6, 31.4 (2t, C(273')), 54.9 (q, CH3-O), 63.9 (t,

C(6')), 64.2 (d, C(4')), 80.8, 81.6 (2d, C(175')), 85.0 (s, O-C(DMT), 101.6

(d, C(5)), 112.9,126.4,127.5,127.8,129.7, (5d, C(arom.)), 135.7,135.8 (2s,

C(arom.)), 140.5 (d, C(6)), 145.0 (s, C(4)), 150.0 (s, C(2)), 157.9,162.9 (2s,

C(arom.))

MS (EI): 544 (M+, 0.9), 304 (42), 303 (100), 215 (10), 213 (10), 195 (10), 165

(15), 154 (28), 152 (15), 137 (15), 136 (32), 135 (40), 113 (30), 107 (13), 105

(25), 89 (19), 77 (33).

D.4.4 l-{4'-0-[(2-Cyanoethoxy)(N,N-diisopropylamino)phosphino]-2',3'-dideoxy-6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)methyl]-ß-D-

glucopyranosyljuradl

DMTO

^Y° JX^±J*DMTO

,N^,NHO

NH

H0 ^ T X-u'^o'^'0"Y

V^CN

A13

Unter Ar wurden bei RT 3.50 g (6.46 mmol) 9 in 30 ml abs. CH2CI2 gelöst und

mit 4.42 ml (25.8 mmol) N-Ethyldiisopropylamin und 2.34 g (9.75 mmol) ß-

Cyanoethoxy-(N,N-diisopropylamino)-chlorophosphin versetzt. Nach 1 Std.

wurde die nunmehr weisse Suspension in 400 ml EtOAc aufgenommen, zwei

Mal mit je 300 ml ges. Na2C03 und einmal mit 300 ml ges. NaCl gewaschen. Die

wassrigen Phasen wurden noch zwei Mal mit 200 ml EtOAc rückextrahiert. Die

vereinigten organischen Phasen wurden am RV vom Lösungsmittel befreit. Es


verblieben 5.76 g eines farblosen Schaums, welcher nun an 350 g Kieselgel mit

EtOAc : Hexan = 2:1 chromatographiert wurde. Die Fraktionen, welche die

beiden diastereomeren Phosphoramidite enthielten, wurden vereinigt, eingeengtund am HV bei RT (üi 18 Std. getrocknet. Man erhielt 4.36 g (91%) 13 (1 : 1

Diastereomerengemisch am Phosphor) als weissen Schaum.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.71, 0.66, (Kieselgel/EtOAc: Hexan = 2:1)

UV (EtOH): 234(17521), 259 (9321)

IR (KBr): 3420m br., 3200m br., 3060m, 2960m, 2940m, 2880m, 2840w,

2240w, 1700vs, 1630m, 1610m, 1580w, 1510s, 1455m, 1395w, 1380m,

1365w, 1330w, 1300m, 1270m, 1250s, 1220m, 1200m, 1180s, 1150m,

1130m, 1080m, 1040s, 1000m, 980s, 900w, 880w, 780m

X-

4TO t^tOX^"rm

t tXk I 1 J M J—I—

SO90 70 50 40 30—I—

20 1.0 0 0 ppm

Abb. D45: JH-NMR (400 MHz, CDCI3) von 13.

iH-NMR (400 MHz, CDCI3): 0.88 (m (dublettoid), 3H, H3C-(i-Pr)), 1.07,1.09,1.13

(3d, J=6.7, 9H, H3C-(i-Pr)), 1.62-1.80 (m, 2H, H-C(273')), 2.04-2.09 (m,

IH, H-C(273')), 2.30 (dd, J=6.2 11.5 IH, H2C-CN), 2.33-2.39 (m, IH, H-

C(273')), 2.58 (t, J=4.5, IH, H2C-CN), 3 27-3.58 (m, 2H, HC(CH3)2-(i-Pr),


3.43-3.49 (m, 3H, H-C(576')), 3.58-3.71 (m, IH, H2C-OP), 3.72-3.75 (m,

IH, H-C(4')), 3.76, 3.77, 3.78, 3.79 (4s, 6H, H3C-O), 3.91-3.93 (m, IH,

H2C-OP), 5.72-5.75 (m, IH, H-C(l')), 5.79, 5.81 (2d, J=4.1, IH, H-C(5)),

6.59-6.81 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.12-7.29, 7.32-7.34, 7.44-7.47, 7.51-7.57

(4m, 9H, H-C(arom.))

Abb. D45:3,P-NMR (1215 MHz, CDCI3) von 13.

"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 20.2, 20.5 (2dt, JCp=7.3, CH2CN)), 22.7 (t, C(273')),

24.27,24.35,24.45,24.53,24.57,24.62,24.7 (7q, CH3(i-Pr)), 30.2,30.7,32.0

(3t, C(273')), 43.07 (dt, Jcp=8.4, CH-(i-Pr)), 43.20 (dt, JCp=8.3, CH-i-(Pr)),

57.5 (dt, JCp=21.0, CH2-OP), 58.2 (dt, JCp=19.2, CH2-OP), 63.1, 63.3 (2t,

C(6')), 67.0 (dd, JCp=16.7, C(4')), 67.5 (dd, Jcp=12.1, C(4')), 81.4, 81.5 (2d,

C(5')), 81.6, 81.8 (2d, C(l')), 85.8 (s, O-C(DMD), 102.4,102.5 (2d, C(5)),

112.97, 112.99 (2d, C(arom.)), 117.6, 117.7 (2s, CN), 126.7, 126.8, 127.7,

128.4, 128.5, 130.25, 130.27, 130.33, 130.35, 136.07, 136.14, 136.18 (12d,

C(arom.)), 139.7,139.9 (2d, C(6)), 144.8,145.0 (2s, C(4)), 149.9 (s, C(2)),

158.45,158.51,163.1 (3s, C(arom.))

3'P-NMR (162 MHz, CDCI3): 148.3,149.1


MS (FAB+, 3-NOBA): 877 ((M + 131Xe)+, 0.3), 767 ((M + Na)+, 0.3), 305

(10.7), 304 (48.2), 303 (100.0), 223 (34.0), 201 (22.7).

D.4.5 l-{2,,3'-Dideoxy-6'-[(4,4l-dimethoxytriphenyl)methyl]-4l-0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)-propionyl]-ß-D-glucopyranosyl}-uracil (Aktivester von ddU)

DMTO

mX^N NH

Y0

DMTO

NH

10

DMTO

NH

0,NA^ °

11

Eine Lösung von 0.530 g (0.973 mmol) 9, 120 mg (0.97 mmol) DMAP und 89 mg

(0.868 mmol, 0.9 Eq.) Bernsteinsäureanhydrid in 2.0 ml Pyridin wurde bei RT

unter Ar für 18 Std. gerührt. Man engte am RV ein und koevaporierte den

Rückstand noch zwei Mal mit je 1 ml Toluol. Der Rückstand wurde in 12 ml

Methylenchlorid gelöst und bei 0°C einmal mit 10%-iger Zitronensäure und zwei

Mal mit je 6 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über NaSÜ4

getrocknet, auf 2 ml eingeengt und aus 200 ml einer auf 0°C gekühlten Hexan :

Ether = 1:1 Lösung gefällt. Das Präzipitat wurde abfiltriert und am HV bei RT für

2 Std. getrocknet, was 350 mg (0.54 mmol) Rohprodukt 10 ergab, das ohne weitere

Reinigung zusammen mit 75 mg (0.54 mmol) 4-Nitrophenol und 200 ul Pyridin

in 3 ml frisch über basisch Alox filtriertem Dioxan gelöst wurde. Zu dieser

Lösung gab man 278 mg (1.35 mmol) DCC. Nach 3.5 Std. wurde vom


ausgefallenen Harnstoff abfiltriert, eingeengt und einmal mit 5 ml Toluol

koevaporiert. Chromatographie an 40 g Kieselgel mit EtOAc : Hexan = 7:3

lieferte nach Trocknen am HV für 30 min. bei 45°C 295 mg (40% über beide

Stufen) 11 als leicht gelblichen, festen Schaum, der allerdings aus einem Gemisch

von 11 und einem als Bernsteinsäurediester verbrückten Dinucleosid im

Verhältnis von etwa 6 : 1 besteht. Dieses Dinucleosid ist besonders leicht am

Signal bei 8.20 und am aufgespaltenen OCH3-Signal bei 3.72 ppm zu erkennen.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.70,(Kiesegel/EtOAc:Hexan = 7:3)

JH-NMR (300 MHz, DMSO-d6) 0.98-2.32 (m, 4H, H-C(273')), 2.35-2.66 (m, 3H,

H2C-C(Bernsteinsäure, 2M/3")), 2.74-2.78 (m, IH, H2C-

C(Bernsteinsäure, 2"/3")), 2.95 (dd, J=4.1 10.4, IH, H-C(6')), 3.05-3.17

(m, IH, H-C(6')), 3.72 (s, 6H, OCH3), 3.84-3.88 (m, IH, H-C(5')), 4.87-

4.94 (m, IH, H-C(4')), 5.71-5.75 (m, 2H, H-CU75)), 6.81-6.85, 7.16-7.32,

7.32-7.41 (3m, 15H, H-C(arom.)), 7.79 (d, J=8.1, IH, H-C(6)), 8.27 (d,

J=9.1,2H, H-C(arom.)), 11.4 (s br., IH, H-N(3)).

Jb—1—1—1—r-

120 110

jCforA0aX^n*

Y

Ja ..^LAAOvaAnv^A^

"1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 T

10 0 90 80 70 60 50 40 30 20 10 00 ppm

Abb. D4.6: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 11 (verunreinigt mit -15% Dinudeosid).


"C-NMR (75 MHz, DMSO-d6): 24.2,24.9, 25.3,27.2 (4t, C(2'^'), CH2-C(Bernstein-

säure, 2",3"), 54.8(q, CH3-O), 62.2 (t, C(6*)), 66.8 (d, C(5')), 77.5 (d,

C(4')), 80.3 (d, C(l')), 84.9 (s, O-C(DMT)), 101.7 (d, C(5)), 112.7, 122.7,

124.9, 126.5, 127.4, 129.3, 129.4 (7d, C(arom.)), 135.0, 135.3 (2s,

C(arom.)), 140.3 (d, C(6)), 144.4 (s, C(4)), 144.6 (s, C(arom.)), 149.7 (s,

C(2)), 152.9, 154.8, 157.6, 162.6 (4s, C(arom.)), 169.5, 170.4 (2s, C=0

(Bernsteinsäure)).

D.4.6 l-{2,,3'-Dideoxy-6,-[(4/4'-dimethoxytriphenyl)methyl]-4,-0-[3-(CPG-amido)-propionyl]-ß-D-glucopyranosyl}uracil

(ddU-CPG-Träger)

DMTO

0,N

In 8 ml DMF wurden 2.00 g CPG-NH2 suspendiert und 500 ul (380 mg,

3.77 mmol) Triethylamin und 50 ul (49 mg, 0.62 umol) Pyridin zugegeben. Zu

dieser Suspension spritzte man unter Ar eine Lösung von 480 mg (0.62 mmol) 11

in 4 ml THF. Man liess sie für 48 Std. bei RT unter Ar bei gelegentlichemSchwenken stehen. Es wurde abfiltriert und mit je etwa 20 ml DMF, MeOH und

Ether gewaschen. Erneut wurde in 10 ml Pyridin suspendiert, 40 mg (0.33 mmol)

DMAP und 500 ul (0.54 g, 5.29 mmol) Essigsaureanhydrid zugegeben und 1 Std.

stehen gelassen. Nach Waschen mit je 20 ml MeOH und Ether verblieben noch

1.83 g CPG 12 mit einer Beladungsdichte von 31.0 umol/g.


D.5 cc-Homo-deoxyadenosin

D.5.1 N6-Benzoyl-9-(2V3'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl)adenin

HOBzO

BzO'\>—^-N'"1? »-

"

N^^N^

rVNHBz 4nV/^N HO

^.N

14

NHBz

15

Man löste 9.0 g (15.6 mmol) 14 mit einem Anomerenverhältnis et: ß = 5 :1 bei

0°C in 90 ml THF : MeOH : H20 = 5 : 4 : 1 und gab rasch 90 ml 2N NaOH (180

mmol, 11.5 Eq) zu. Nach 30 min. Rühren bei 0°C wurde die Reaktion durch

Zugabe von 11.6 g (0.22 mmol, 1.2 Eq bezogen auf NaOH) beendet. Nach

Erwärmen auf RT wurde die Reaktionslösung am RV zur Trockene eingeengt.

Der Festkörper wurde in 200 ml MeOH suspendiert und abfiltriert. Der

Filterrückstand wurde noch einmal mit 50 ml MeOH gewaschen. Die vereinigten

Filtrate wurden zur Trockene eingeengt und in 300 ml siedendem CH3CN

suspendiert, abfiltriert und über Nacht bei RT stehengelassen. Die Suspension

wurde abfiltriert, was 2.65 g weisse Kristalle mit einem a : ß Verhältnis von 7 : 1

ergab. Weitere Kristallisation der eingeengten Mutterlauge ergaben jeweils

ungünstigere a : ß Verhältnisse und wurden deshalb verworfen. Die Kristalle

wurden in heissem Methanol gelöst und CH3CN bis zur einsetzenden Trübung

zugegeben und über Nacht bei 0°C stehen gelassen. Die nach Filtration

zurückbleibenden Kristalle wiesen ein Anomerenverhältnis von a : ß = 11 :1

auf. Das Filtrat wurde wieder eingeengt und in gleicher Weise noch zwei Mal

kristallisiert. Die zwei daraus gewonnenen Kristallisate wiesen

Anomerenverhältnisse a : ß = 1 : 3.2 (0.17 g) und a : ß > 20 : 1 (0.46 g, 1.25 mmol,

9.6%) auf. Diese letzte Fraktion wurde zur Charakterisierung und zur

Weiterarbeit verwendet.


Analytische Daten:

DC

[ab20

UV

IR(KBr):

'H-NMR

Rf = 0.41, (Kieselgel/CHC13 : CH3OH = 9:1)

=+38.1 (c = 0.94, DMSO)

(CH3OH): 280 (12200)

3410s br., 3130m sh, 3060 m sh, 2955m, 2910m, 2880m, 1709s, 1616s,

1575s, 1524m, 1481m, 1458s, 1398m, 1355m, 1320m, 1304m, 1252s,

1210m, 1190m, 1160m, 1121m, 1075m, 1052m, 1028m, 1009m, 988w,

973w, 921m, 887w, 867w, 799m, 765m, 706s, 670m, 642m, 605m, 553m

(400 MHz, DMSO-d6): 1.67-1.78 (m, IH, H-C(273')), 1.99-2.15 (m, 2H,

H-C(273')), 2.85-2.94 (m, IH, H-C(273')), 3.32-3.43 (m, IH, H-C(5')),

3.52-3.62 (m, 2H, H-C(6')), 3.65-3.72 (m, IH, H-C(4')), 4.66* (t, J=5.3, IH,

HO-C(6')), 4.90* (d, J=5.7, IH, HO-C(4')), 6.16 (dd (tripletoid), J=4.6 Hz,

IH, H-C(l')), 7.52-7.58 (m, 3H, H-C(arom.)), 7.62-7.64 (m, IH, H-

C(arom.)), 8.04-8.07 (m, 2H, Bz), 8.64 (s, IH, H-C(2)), 8.76 (s, IH, H-

C(8)), 11.2* (s br., IH, NH)

*: Signal tauscht mit D2O aus.

J

0X^<v

^jlJLAa.1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1

9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm

Abbildung D5.1: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«) von IS



C(4')), 78.2, 78.9 (2d, C(175')), 125.6 (s, C(5)), 128.3, 128.4, 132.3 (3d,

C(arom.)), 133.3 (s, C(arom.), 143.2 (d, C(8)), 150.2 (s, C(4)), 151.4 (d,

C(2)), 152.0 (s, C(6)), 165.6 (s, C=0)

MS (FAB+, 3-NOBA)): 371.1 ((M + 2H)+, 18.2), 370.1 ((M + H)+, 66.6), 307.1

(16.5), 241.1 (20.5), 240.1 (100.0), 154.1 (60.4), 138.1 (22.0), 137.0 (40.4),

136.0 (49.9), 105.0 (35.3)

C18H19N504: ber.: C, 58.53, H, 5.18, N: 18.96, gef.: C: 58.24, H: 5.21, N: 18.87

Schmelzpunkt 145-147°C

D.5.2 N«-Benzoyl-9-{2,/3'-dideoxy-6'-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)-

methyl]-a-D-glucopyranosyl}adenin

HO DMTO

HO

NHBz NHBz

15 16

Man löste 100 mg (0.33 mmol) 15, 130 mg (0.39 mmol, 1.2 Eq) 4,4'-Dimethoxy-

triphenylchlormethan und 4.0 mg (33 nmol, 0.1 Eq) DMAP, das alles zuvor für 4

Std. am HV bei RT getrocknet wurde, in 1.0 ml Pyridin und 170 ul (0.98 umol, 3

Eq) Ethyl-diisopropylamin. Nach 4 Std. Rühren bei RT unter Argon wurde die

Reaktion durch Zugabe von 0.2 ml MeOH gestoppt. Die Reaktionslösung wurde

am RV eingeengt und an 50 g Kieselgel mit 100 ml ETOAc und dann 200 ml

EtOAc : Aceton = 4:1 flash - chromatographiert. Nach Einengen der

produkthaltigen Fraktionen erhielt man 153 mg (70 %) 16.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.34, (Kieselgel/EtOAc: Aceton = 4:1)


IR (KBr): 3420m (br), 3260w (sh), 3059w, 2950m, 2938m, 2837w, 1702m,

1610s, 1582s, 1510s, 1487m, 1455s, 1402w, 1320m, 1298m, 1250s, 1220m,

1178s, 1158m, 1119m, 1033s, 987w, 912w, 903w, 830m, 795m, 753m,

707s, 669m, 644m, 585m

IH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.68-1.80 (m, IH, H-C(273')), 1.93-2.05 (m, IH,

H-C(273')), 2.11-2.24 (m, IH, H-C(273')), 2.84-2.95 (m, IH, H-C(273')),

3.10 (dd, J=7.3 9.7, IH, H-C(6')), 3.24 (dd, J=2.0 9.7, IH, H-C(6')), 3.52-

3.56 (m, 2H, H-C(475')), 3.72, 3.73 (2s, 6H, OCH3), 4.85* (d, J=6.1, IH,

HO-C(4')), 6.26 (dd (tripletoid), J=4.7, IH, H-C(l')), 7.81-7.89 (m, 4H, H-

C(arom.)), 7.14-7.22 (m, 5H, H-C(arom.)), 7.22-7.33 (m, 4H, H-

C(arom.)), 7.53-7.59 (m, 2H, H-C(arom.)),7.62-7.67 (m, IH, H-

C(arom.)), 8.05-8.09 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.69 (s, IH, H-C(2)), 8.77 (s,

IH, H-C(8)), 11.25* (s br., IH, NH)


Abbildung D5.2: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) von 16

«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 24.7, 28.2 (2t, C(273')), 54.9 (q, OCH3), 63.0 (t,

C(6')), 64.2 (d, C(4')), 76.0, 79.0, (2d, C(175')), 85.0 (s, O-C(DMT)), 113.0

(d, C(arom.)), 125.7 (s, C(5)), 126.4,127.59,127.63,128.36,128.37,129.5,


MS

129.6,132.3 (8d, C(arom.)), 133.4,135.5,135.7 (3s, C(arom.)), 143.0 (d,

C(8)), 144.9 (s, C(arom.)), 150.3 (s, C(4)), 151.5 (d, C(2)), 152.3 (s, C(6)),

157.8 (s, C(arom.)), 165.6 (s, C=0)

(FAB+, 3-NOBA)): 694.2 ((M + Na)+, 4.6), 672.2 ((M + H)+, 7.8), 594.2

(1.6), 564.1 (1.6), 319.1 (4.2), 304.1 (37.3), 303.1 (100.0), 241.1 (15.2), 240.1

(64.9), 154.1 (17.1), 136.0 (18.4), 105.0 (37.9)

D.5.3 N6-Benzoyl-9-{4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropyl-amino)phosphino]-6,-0-[(4/4'-dimethoxytriphenyl)methyl]-2',3,-dideoxy-a-D-glucopyranosyl}adenin

DMTO

HO-^V^IN-r-N*,

NHBz

16

DMTO

JLIM"

Aa<vÖ-CN T

NHBz

17

Man trocknete 200 mg (0.30 mmol) 16 für 16 Std. bei RT am HV, gab 25.0 mg

(0.15 mmol, 0.5 Eq) Diisopropylammoniumtetrazolid zu, löste in 1.5 ml CH2CI2

und gab dann 130 ul (0.45 mmol, 1.5 Eq) Bis-(diisopropylamino)-2-cyano-

ethoxyphosphin2 unter Argon zu. Nach 4 Std. wurde die Reaktionlösung in 10

ml CH2CI2 aufgenommen, zwei Mal mit je 10 ml ges. NaHC03 und zwei Mal mit

10 ml ges. NaCl gewaschen. Die vereinigten wassrigen Phasen wurden mit 10 ml

CH2CI2 rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSÜ4

getrocknet, eingeengt und gelöst in 1 ml EtOAc aus 20 ml Hexan gefällt, was 190

mg (73%) 17 als weisses Pulver ergab. Diese Substanz enthält gemäss 'H-NMR

noch hydrolysiertes Phosphitylierungsreagens als Verunreinigung (Signale bei

1.27 und kleines Triplet bei 2.70 ppm).

Hergestellt nach einer Vorschrift in [34].


Analytische Daten:


IR (KBr): 3417m (br), 3058w, 3031w, 2964m, 2931m, 2875m, 2834w, 2251w,

1703m, 1608s, 1580m, 1508s, 1488m, 1453s, 1395m, 1381m, 1363m,

1324m, 1297m, 1250s, 1219m, 1201m, 1179s, 1156m, 1116m, 1100m,

1074m, 1058m, 1033s, 976s, 900w, 878m, 829m, 815m, 798m, 792m,

755m, 727m, 707s, 669w, 644m, 584m, 526w

!H-NMR (400 MHz, CDC13): 1.02 (d, J=6.8, 2.5H, H3C-(i-Pr)), 1.10-1.18 (m, 8H,

H3C-(i-Pr)), 1.34 (d, J=6.5, 1.5H, H3C-(i-Pr)), 1.77-1.93 (m, IH, H-

C(273')), 2.05-2.22 (m, 2H, H-C(273')), 2.42 (dt, JPH=3.7, Jhh=6.4, IH,

CH2CN), 2.59 (t, J=6.3, IH, CH2CN), 2.90-3.07 (m,lH, H-C(273')), 3.27-

3.61 (m, 5H, HC(i-Pr), H-C(5'), HrC(6')), 3.63-3.80 (m, IH, CH2OP), 3.78

(s, 3H, H3C-O), 3.79 (s, 3H, H3C-O, 3.83-4.09 (m, 2H, H-C(4'), CH2OP),

6.09-6.16 (m, IH, H-C(l')), 6.78-6.90 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.19-7.38 (m,

7H, H-C(arom.)), 7.41-7.47 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.50-7.56 (m, 2H, H-

C(arom.)), 7.59-7.61 (m, IH, H-C(arom.)), 8.01-8.07 (m, 2H, H-

C(arom.)), 8.42, 8.43 (s, IH, H-C(2)), 8.80 (s, IH, H-C(8)), 9.10 (s br., IH,

NH)

70

UMIU

oX^JL

i> . CG

A^JüIa^_JJ—1—1—1—

60 SO

-i 1 1 r

40 30 20

-| 1 1 1 1

10 00 ppm

Abbildung D53: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 17


^C-NMR (100 MHz, CDCI3): 19.4 (q, CHrö-Pr)), 20.3 (dt, JCp=7.1, C-CN), 20.4 (dt,

JCp=6.8, C-CN), 24.4, 24.5, 24.6, 24.7 (4q, CH3-(i-Pr)), 26.0, 26.1, 26.5 (3t,

C(273')), 43.18 (dt, JCp=3.1, CH-(i-Pr)), 43.30 (dt, Jcp=3.1, CH-(i-Pr)),

55.23,55.26 (2q, CH3-O), 57.9 (dt, Jrc = 19.2, CH2OP), 58.3 (dt, Jpc=18.6,

CH2OP), 62.9 (t, C(6')), 67.1 (dd, Jcp=16.9, C(4')), 67.8 (dd, Jcp=15.9,

C(4')), 76.8,77.0,80.0,80.2 (4d, C(175')), 86.4,86.5 (2s, O-C(DMD), 113.2

(d, C(arom.)), 117.5 (s, CN), 123.4 (s, C(5)), 126.9, 127.9, 128.2, 128.3,

128.9, 130.1, 130.2, 132.7 (8d, C(arom.)), 133.8, 135.88, 135.94 (3s,

C(arom.)), 141.9 (d, C(8)), 144.7 (s, C(arom.)), 149.5 (s, C(4)), 151.5 (s,

C(2)), 152.6 (d, C(6)), 158.6 (s, C(arom.)), 164.6 (s, C=0)

31P-NMR (162 MHz, CDCI3): 148.6,148.2

MS (FAB+, 3-NOBA)): 873.3 «M + 2H)+, 2.7), 872.3 «M + H)+, 5.0), 568.2

(3.1), 303.1 (100.0), 240.1 (25.3), 201.1 (19.7), 154.0 (13.5), 136.0 (11.1),

105.0 (12.0)

Abbildung D5.4:3,P-NMR (162 MHz, CDdj) von 17


D.5.4 N6-Benzoyl-9-{2',3*-dideoxy-6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)-methyl]-4'-0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)propionyl]-a-D-glucopyranosyl}adenin und N6-Benzoyl-9-{2,,3,-dideoxy-6'-

0-[(4,4*-dimethoxytriphenyl)methyl]-4'-0-[3-(CPG-amido)-propyl]-a-D-glucopyranosyl}adenin

DMTO

HO-^V^I

16

*N^yNHBz

DMTO

0,N

N-r-%

NHBz

DMTO

•Nr^° CO19

NHBz

Man rührte eine Lösung von 45 mg (67 nmol) 16, 7.4 mg (74 nmol, 1.1 Eq)

Bernsteinsäureanhydrid und 9.8 mg (81 nmol) DMAP in 0.6 ml Pyridin unter

Argon bei RT für 16 Std. Danach wurde die Reaktionslösung eingeengt, zwei Mal

in je 2 ml Toluol gelöst und wiederum eingeengt. Das zurückbleibende Oel

wurde in 5 ml CH2CI2 aufgenommen, je zwei Mal mit 5 ml 10 % Zitronensäure

und Wasser gewaschen. Nach Rückextraktion der vereinigten wassrigen Phasen

mit 5 ml CH2CI2 wurden die vereinigten org. Phasen über Na2S04 getrocknet und

eingeengt. Das Rohprodukt (60 mg) und 9.3 mg (67 mmol, 1.1 Eq) 4-Nitrophenol

wurden in 0.6 ml trockenem Dioxan gelöst und 60 ul Pyridin und 36 mg (0.17

mmol) DCC zugegeben. Nach 4 Std. filtrierte man den entstandenen

Dicyclohexylharnstoff ab und engte zur Trockene ein. Chromatographie an 20 g

Kieselgel mit 100 ml EtOAc : Hexan = 3:1 und 100 ml EtOAc : Hexan = 9:1

lieferte 25 mg (42 %) 18.


Analytische Daten:


!H-NMR (200 MHz, CDCI3): 1.88-2.03 (m, IH, H-C(273')), 2.08-2.25 (m, 2H, H-

C(273')), 2.57-2.94 (m, 5H, H-C(2737H2C-C(Bernsteinsäure), 3.40 (m

(dublettoid), J=5.1 Hz, 2H, H-C(6')), 3.78 (s, 6H, H3C-O), 4.01-4.08 (m,

IH, H-C(5')), 5.00-5.09 (m, IH, H-C(4')), 6.16 (dd, J=7.5 3.3, IH, H-C(l')),

6.79-6.89 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.20-7.65 (m, 14H, H-C(arom.)), 8.02-

8.08 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.20-8.26 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.28 (s, IH, H-

C(8)), 8.79 (s, IH, H-C(2)), 9.03 (s br., IH, NH)

Man suspendierte 200 mg CPG-NH2 in 0.4 ml DMF : Triethylamin = 10 : 1 und

gab 25 mg (28 nmol) 18 zu. Diese Suspension wurde über Nacht stehen gelassen.

Darauf wurde die Festphase drei Mal mit je 3 ml DMF gewaschen. Man

suspendierte den Träger in 1 ml Essigsaureanhydrid : Pyridin = 1 : 10 und 4.5 mg

DMAP und liess die Suspension für 16 Std. stehen. Der Träger wurde mit DMF

und Ether gewaschen und am HV bei RT getrocknet. Man erhielt mit o-Homo-

Adenosin derivatisierten Träger 19 mit einer Beladungsdichte von 20.0 umol/g.

D.6 a-Homo-thymidin

D.6.1 l-(4,,6'-Di-0-acetyl-2,/3'-dideoxy-a-D-glucopyranosyl)-

thymin

ACO j/ MS

MX^-\^°—- pr-5-vO AcO cr^M^o

20 20aH

Die Verbindung 20a wurde als Nebenprodukt einer Synthese des ß-Anomeren

durch H.-J. Roth synthetisiert und vom ß-Anomeren durch Flash

Chromatograpie mit EtOAc : Hexan = 3:1, gefolgt von EtOAc, abgetrennt. Die

analytischen Daten sind bei Roth nachzulesen [21].


D.6.2 l-(2',3'-Dideoxy-a-D-glucopyranosyl)thymin

AcOv HO^

AcO

°7^n^y' *- p°7^N^v^>u^n HO nXuXrO^ N o

nuCT N ^o

20aH

21H

3.0 g (8.8 mmol) 20a wurde in 200 ml mit NH3 gesättigtem Methanol gelöst und

für 24 Std. bei RT stehen gelassen. Darauf wurde die Lösung am RV zu einem

farblosen Oel eingeengt. Zugabe von Aceton Hess 1.68 g (75%) 21 als weissen

Niederschlag ausfallen. Für analytische Zwecke wurde eine kleine Menge 21 aus

siedendem Ethanol umkristallisiert.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.15 (Kieselgel/CHC13: CH3OH = 9:1)

[a]D20 = +23.6° (c = 1.0, CH3OH).

UV (H20): 265 (9880)

IR (KBr): 3440s br., 3142m, 3029m, 2964m, 2940m, 2891m, 2819m, 1704s,

1675s, 1528w, 1473m, 1451m, 1420m, 1365m, 1283s, 1271s, 1218m,

1114m, 1103m, 1068m, 1058m, 1031m, 986m, 978m, 943m, 921m,

908w, 876w, 852m, 783w, 765m, 709m, 562m, 487m

*H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.51-1.55 (m, IH, H-C(273')), 1.70-1.74 (m, IH,

H-C(273')), 1.80 (d, J=l.l, 3H, H3C-C(5)), 1.90-2.06 (m, 2H, H-C(273')),

3.58-3.61 (m, 3H, H-C(6'), H-C(4')), 3.77-3.79 (m, IH, H-C(5')), 4.73* (br.,

IH, HO-C(6')), 4.90* (br., IH, HO-C(4')), 5.73 (dd, J=10.4 2.9, IH, H-

C(l')), 7.60 (d, J=l.l, IH, H-C(6)), 11.25* (s br., IH, NH)


"C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 12.0 (q, CH3-C(5)), 23.6,26.3 (2t, C(273')), 59.9 (t,

C(6')), 62.0 (d, C(4')), 76.8, 80.9 (2d, C(175')), 109.0 (s, C(5)), 136.3 (d,

C(6)), 150.1 (s, C(2)), 163.7 (s, C(4)).

MS (FAB+, 3-NOBA)): 514.2 ((M + 2H)+, 7.7), 513.2 ((M + H)+, 27.6), 257.1

(52.5), 155.1 (23.2), 154.1 (77.5), 138.1 (29.4), 137.1 (55.1), 136.0 (61.6),

131.1 (42.3), 127.1 (100.0), 107.0 (22.3), 89.0 (25.0), 77.0 (25.6)


C11H16N2O5 ber: C: 51.56, H: 6.29, N: 10.93, gef.: C: 51.36, H: 6.02, N: 10.71

Schmelzpunkt 178-179°C

x^< i-V^

1 1 1 1 r-

ML~1 1 1 1 1 1 1 1 1—1—1—1—1—1

9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm

Abbildung D6.1: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 21

D.6.3 l-{2,,3,-Dideoxy-6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)methyl]-a-D-glucopyranosyljthymin

HO,

HO

DMTO

°7^n-^nXKXn

21

0"^N O

H

3„XKIXr

22

O^ N O

H

Man trocknete 1.0 g (3.9 mmol) 21 und 2.0 g (5.9 mmol, 1.5 Eq) DMTC1 bei RT für

16 Std. am HV. Es wurden 5 ml Pyridin unter Argon zugegeben und für 30 min.

bei RT gerührt. Durch Zugabe von 5 ml MeOH wurde die Reaktion gestoppt. Die

Lösung wurde nach weiteren 30 min. am RV eingeengt, erneut in 5 ml Toluol


gelöst und erneut eingeengt. Das verbliebene Oel wurde in 50 ml EtOAc

aufgenommen, zwei Mal mit jeweils 20 ml NaHC03 und einmal mit NaCl

gewaschen. Die vereinigten wassrigen Phasen wurden mit 20 ml EtOAc

rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO,j

getrocknet und eingeengt. Anschliessende Chromatographie an 120 g Kieselgelmit 600 ml EtOAc : Hexan = 3 :1 und dann 300 ml EtOAc lieferte 1.11 g (51%) 22.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.14 (Kieselgel/EtOAc: Hexan = 4:1)

IR (KBr): 3417m br., 3194w br, 3055w, 2930m, 2834w, 1689vs, 1606m,

1582w, 1508s, 1464m, 1445m, 1413w, 1371w, 1322w, 1300m, 1251s,

1176s, 1154w, 1116m, 1034s, 984m, 903w, 876w, 829m, 791m, 755w,

727w, 703m, 583m

r

_zü .M i«

S7^n^*^H

l."I I I I 1 I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 190 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm



C(273')), 1-92 (d, J=1.2, 3H, CH3-C(5)), 1.95-2.09 (m, IH, H-C(273')),

2.16* (br., IH, HO-C(4')), 3.32 (dd, J=7.0 9.8, IH, H-C(6')), 3.44 (dd, J=5.6

9.8, IH, H-C(6')), 3.79 (s, 6H, H3C-O, 3.88 (m (tripletoid), IH, H-C(4)),


4.07-4.12 (m, IH, H-C(5')), 5.77 (dd, J=3.2 10.3, IH, H-C(l')), 6.81-6.85

(m, 4H, H-C(arom.)), 7.18-7.23 (m, IH, H-C(arom.)), 7.27-7.33 (m, 6H,

H-C(arom.)), 7.36-7.41 (m, 3H, H-C(6)/H-C(arom.)), 7.42 (d, J=1.4, H-

C(6)),8.6»(sbr.,lH,NH)


«C-NMR (100 MHz, CDCI3): 12.5 (q, CH3-C(5)), 24.4, 26.1 (2t, C(273')), 55.3 (q,

OCH3), 62.4 (t, C(6')), 64.5 (d, C(4')), 78.3, 79.4 (2d, C(175')), 86.8 (s, O-

C(DMT)), 110.8 (d, C(5)), 113.3,127.0,128.0,128.1 (4d, C(arom.)), 135.5,

135.6 (2s, C(arom.)), 135.8 (d, C(arom.)), 144.5,149.9 (s, C(arom.), C(2)),

158.6 (s, C(arom.)), 163.6 (s, C(4))

MS (FAB+, 3-NOBA)): 558.0 ((M + H)+, 1.0), 304.0 (32.7), 303.0 (100.0)

D.6.4 l-{4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-düsopropylamino)phosphino]-6,-0-[(4,4'-dimethoxytriphenylmethyl]-2,,3,-dideoxy-a-D-glucopyranosyl}thymin

DMTO.DMTO.

HO Xx° X<° Xx°X±22

\23

CN

Man trocknete 200 mg (0.36 mmol) 22 für 16 Std. bei RT am HV, gab 31.0 mg

(0.18 mmol, 0.5 Eq) Diisopropylammoniumtetrazolid zu, löste in 1.5 ml CH2CI2

und gab dann 160 ul (0.54 mmol, 1.5 Eq) Bis-(diisopropylamino)-2-cyano-

ethoxyphosphin unter Argon zu. Nach 3 Std. wurde die Reaktionlösung in 10 ml

CH2CI2 aufgenommen, zwei Mal mit je 10 ml NaHC03 und zwei Mal mit 10 ml

NaCl gewaschen. Die vereinigten wassrigen Phasen wurden mit 10 ml CH2CI2

rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSÜ4

getrocknet und eingeengt. Das resultierende Oel wurde drei Mal als Lösung in 2

ml EtOAc aus 60 ml Hexan gefällt. Man erhielt 200 mg (74%) 23 als weisses,


flockiges Pulver, das noch mit H-Phosphonat (hydrolysiertes

Phosphitylierungsreagens) verunreinigt war.

Analytische Daten:

DC Rf= 0.40 (Kieselgel/EtOAc: Hexan = 4:1)

IR (KBr): 3429m br., 3191m br. sh, 3053m, 3035m, 2964s, 2931m, 2874m,

2835m, 2757w, 2752w, 2487w, 2428w, 1690vs, 1607m, 1583w, 1509s,

1464s, 1445m, 1396m, 1364m, 1325w, 1301m, 1252s, 1217m, 1179s,

1155m, 1130m, 1076m, 1053s, 1034s, 972s, 900m, 877m, 829m, 791m,

727m, 707m, 582m

IH-NMR (400 MHz, CDC13): 1.19-1.23 (m, 9H, H3C-(i-Pr)), 1.44 (d, J=6.5,3H, H3C-

(i-Pr)), 1.63-2.02 (m, 7H, H-C(273') darunter auch 1.91,1.92 (je d, J=l.l,

1.5H, CH3-C(5)), 2.58 (t, J=6.0, IH, CH2CN), 2.63 (t, J=6.3, IH, CH2CN),

Xr*-»

V

J

I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1—

9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0

—I 1 1 1 1 1 1 1

3.0 2.0 1.0 0.0 ppm

Abbildung D63: 'H-NMR (400 MHz, CDClj) von 23

3.26-3.35 (m, IH, H-C(6')), 3.37-3.44 (m, IH, H-C(6')), 3.62-3.71 (m, 2H,

CH(i-Pr)), 3.75-3.98 (m, 9H, CH2OP, H-C(5'), darunter auch 3.79 (s,

OCH3)) 4.24-4.29 (m, IH, H-C(4')), 5.74-5.80 (m, IH, H-C(l')), 6.80-6.86


(m, 4H, H-C(arom.)), 7.19-7.43 (m, 10H, H-C(arom.), H-C(6)), 7.9 - 8.8

(IH, H-N(3)).

13C-NMR (100 MHz, CDC13): 12.48,12.51 (q, CH3-C(5)), 19.4 (q, CH3(i-Pr)), 20.40,

20.47 (2dt, Jcp=17.7CH2CN), 24.6,24.7 (2q, CH3(i-Pr)), 24.8,25.0,25.3 (3t,

C(273')), 43.3 (dd, Jcp=12.3, CH(i-Pr)), 55.2 (q, OCH3), 58.2 (dt, Jo>=14.3,

CH2OP), 58.3 (dt, Jcp=14.4, CH2OP), 61.78, 61.83, (2t, C(6')), 66.1 (dd,

JCp=16.5, C(4')), 66.5 (dd, Jcp=17.6, C(4')), 77.8, 77.9, 78.9, 79.0 (4d,

C(175')), 86.7 (s, O-C(DMD), 110.8,110.9 (2s, C(5)), 113.25,113.28 (2d,

C(arom.)), 117.5 (s, CN), 126.92, 126.95, 127.9, 128.1, 130.0 (5d,

C(arom.)), 135.50,135.54,135.67,135.74 (2d, 2s, C(6), C(arom.)), 144.51,

144.54,149.8 (3s, C(arom.), C(2)), 158.6 (s, C(arom.)), 163.5 (s, C(4))

31P-NMR (162 MHz, CDCI3): -8.5,1.3,2.5,7.2,7.5,12.6,13.3,14.6,148.34,148.5

MS (FAB+, 3-NOBA)): 759.1 ((M + H)+, 0.7), 633.1 (0.5), 455.0 (3.4), 384.0

(1.3), 304.1 (30.5), 303.0 (100.0), 201.1 (18.7)


D.6.5 l-{2l/3l-Dideoxy-6,-0-[(4/4,-dimethoxytriphenyl)methyl]-4'-

0-[3-(4-nitro-phenoxycarbonyl)propionyl]-a-D-gluco-pyranosyl}thymin und l-{2,,3'-Dideoxy-6'-0-[(4,4,-dime-

thoxytriphenyl)methyl]-4'-0-[3-(CPG-amido)propyl]-a-D-glucopyranosyljthymin

DMTO

HO

£T"n^v'

DMTO

O J

22 Xj Ö 24

etO^NH^'O

02N

DMTO.

10

H P O^NH^ON^r^*k...L

|ö^j'Nr^°

25

Man rührte eine Lösung von 100 mg (179 nmol) 22, 20 mg (197 nmol, 1.1 Eq)

Bernsteinsäureanhydrid und 9.8 mg (81 nmol) DMAP in 1.0 ml Pyridin unter

Argon bei RT für 16 Std. Danach wurde die Reaktionslösung eingeengt und zwei

Mal in je 4 ml Toluol gelöst und wiederum eingeengt. Das zurückbleibende Oel

wurde in 10 ml CH2CI2 aufgenommen, je zwei Mal mit 10 ml 10 % Zitronensäure

und Wasser gewaschen. Nach Rückextraktion der vereinigten wassrigen Phasen

mit 10 ml CH2CI2 wurden die vereinigten org. Phasen über Na2S04 getrocknetund eingeengt. Das Rohprodukt (106 mg) und 25 mg (180 nmol, 1.1 Eq) 4-

Nitrophenol wurden in 1.0 ml trockenem Dioxan gelöst und 100 ul Pyridin und

96 mg (0.47 mmol) DCC zugegeben. Nach 4 Std. filtrierte man den entstandenen

Dicyclohexylharnstoff ab und engte das Filtrat zur Trockene ein. Nach

Chromatographie an 30 g Kieselgel mit 100 ml EtOAc : Hexan = 3:1 erhielt man

100 mg (72 %) 24.


Analytische Daten:

DC Rf = 0.60 (Kieselgel/EtOAc)

*H-NMR (200 MHz, CDC13): 1.50-2.00 (m, 7H, H-C(273'), darunter auchl.89 (s

br., 3H, CH3-C(5)), 2.79-2.90 (m, 2H, Bernsteinsäure), 2.92-3.01 (m, 2H,

Bernsteinsäure), 3.32-3.51 (m, 2H, H-C(6')), 3.78 (s, 6H, OCH3), 4.18-

4.26 (m, IH, H-C(5')), 5.02 (br s, IH, H-C(4')), 5.82-5.91 (m, IH, HC(l')),

6.79-6.88 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.21-7.45 (m, 12H, H-C(arom.), H-C(6)),

8.24-8.28 (m, 2H, H-C(arom.))

Man suspendierte 200 mg CPG-NH2 in 0.4 ml DMF : Triethylamin = 10 : 1 und

gab 28 mg (36 nmol) 24 zu. Diese Suspension wurde über Nacht stehen gelassen.Darauf wurde die Festphase drei Mal mit je 3 ml DMF gewaschen. Man

suspendierte den Träger in 1 ml Essigsaureanhydrid : Pyridin = 1 : 10 und 4.5 mg

DMAP und liess die Suspension für 16 Std. stehen. Der Träger wurde mit DMF

und Ether gewaschen und am HV bei RT getrocknet. Man erhielt mit a-Homo-

Thymidin derivatisierten Träger 25 mit einer Beladungsdichte von 21.0 umol/g.

D.7 6-Chlor-7-carbapurin

(Die Synthese dieser Bausteine wurde nach Davoll [37] durchgeführt, da aber

nirgends eine Zusammenstellung der analytischen Daten vorhanden ist wurden

alle Stufen hier angegeben)

D.7.1 2-Cyano-4,4-diethoxy-ethylbutanoat

N

'^O C

O

28

Analytische Daten:

DC Rf = 0.73, (Kieselgel/Hexan: EtOAc = 2:1)


UV (CHCI3): 209 (110.1), 273 (18.2)

IR (Film): 2979s, 2899m, 2251vw, 1749vs, 1445w, 1373m, 1262s, 1217m,

1128s, 1062vs, 855w

'H-NMR (400 MHz, CDC13): 1.21,1.22 (2t, J=7.1, je 3H, H3C-(Acetal)), 1.33 (t,

J=7.1,3H, H3C-(Ester)), 2.20 (ddd, J=5.1 8.113.9, IH, H-C(3)), 2.29 (ddd,

J=6.2 6.2 14.0, IH, H-C(3)), 3.54 (ddq, J=3.5 9.4 7.0, 2H, H2C-(Acetal)),

3.66 (t, J=6.4, IH, H-C(2)), 3.70 (ddq, J=9.4 10.8 7.1, 2H, H2C-(Acetal)),

4.26 (q, J=7.1,2H, H2C-(Ester)), 4.69 (dd, J=5.1 6.3, IH, H-(Acetal))

13C-NMR (100 MHz, CDCI3): 14.0 (q, C(2)-Ester), 15.20,15.22 (2q, C(2)-Acetal), 33.6

(d, C(2)), 33.7 (t, C(3)), 62.65, 62.67, 63.0 (3t, CH2-(Ester/Acetal)), 100.0

(d, C(4)), 116.4 (s, CN), 165.9 (s, CO)

MS (ED: 230.1 ((M + H)+, 26.2), 184.0 (100.0), 156.0 (47.9), 128.0 (30.7), 110.0

(26.5), 103.1 (74.5), 75.0 (27.0), 47.0 (32.9), 29.0 (42.7)

Siedepunkt: 60-62°C/0.03 Torr

D.7.2 4-Amino-5-(2',2,-diethoxy-ethyl)-6-hydroxy-2-mercapto-

pyrimidin


UV (MeOH): 203 (14280), 287 (13190)

IR (KBr): 3430m, 3340m, 2980m, 2900m, 1645vs, 1575vs, 1460s, 1300vw,

1220s, 1180m, 1130m, 1055s, 650vw, 610w, 545w

'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.08 (t, J=7.0,6H, H3C(Acetal)), 2.43 (d, J=5.6, 2H,

H2C(1')), 3.40 (dq, J=9.5, 7.1, 2H, H2C(Acetal)), 3.59 (dq, J=9.5, 7.1, 2H,

H2C(Acetal)), 4.47 (t, J=5.5, IH, H-C(2')). 6.24 (s br., 2H, H2N), 6.5-11.5

(br.,2H,OH,SH)


«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 15.3 (q, C(2)-Acetal), 28.2 (t, C(l')), 61.4 (t, C(D-

Acetal), 85.3 (s, C(5)), 102.3 (d, C(2')), 162.7 (s, C(2)), 173.7 (s, C(4/6)),

174.1 (s,C(4/6))

Schmelzpunkt: Zersetzung ab 171°C

D.7.3 4-Amino-5-(2',2'-diethoxy-ethyl)-6-hydroxypyrimidin

fViOH

39

DC Rf = 0.36, (Kieselgel/EtOAc: Methanol = 20 :1)

UV (MeOH): 215 (29470), 262 (10330)

IR (KBr): 3390m, 3150m, 2970m, 1660s, 1630vs, 1620vs, 1480m, 1455s,

1120s, 1050s, 910w,810w

JH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.07 (t, J=10.0, 6H, H3C(Acetal)), 2.53 (d, J=5.6,

2H, H2C(1')), 3.40 (dq, J=9.5, 7.0, 2H, H2C(Acetal)), 3.60 (dq, J=9.5, 7.0,

2H, H2C(Acetal)), 4.56 (t, J=5.6, IH, H-C(2')), 6.08 (s, 2H, H2N), 7.70 (s,

IH, H-C(2)), 11.5 (s br., IH, HO)

«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 15.2 (q, CHj(Acetal)), 28.7 (t, CH2(1')), 61.3 (t,

CH2(Acetal)), 93.2 (s, C(5)), 101.8 (d, C(2')), 146.9 (d, C(2)), 161.4 (s,

C(4/6)), 161.7 (s,C(4/6))

MS (EI): 227.1 (M+, 12.7), 182.1 (65.3), 124.0 (71.4), 103.1 (99.1), 75.0 (88.2),

47.0 (100.0), 45.1 (59.1), 43.1 (47.1), 29.1 (88.3), 28.1 (83.7), 27.1 (50.4)

Schmelzpunkt: 190-191°C


D.7.4 7-Carbahypoxanthin

o

N-^N^H

40

DC Rf = 0.50, (Kieselgel/EtOAc: MeOH = 10:1)

UV (MeOH): 203 (16720), 259 (11480)

IR (KBr): 3650-3300w br., 3100s, 2860s, 1675vs, 1575s, 1515m, 1430w,

1375m, 1230s, 1120m, 995m, 735w, 615m

IH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 6.47 (dd, J=2.1, 3.3, IH, H-C(7)), 7.06 (dd, J=2.5,

3.2, IH, H-C(8)), 7.87 (s, IH, H-C(2)), 11.8 (br., IH, H-N(l/9)), 11.9 (br.,

lH,H-N(l/9))

«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 101.9 (d, C(7)), 107.6 (s, C(5)), 120.3 (d, C(8)),

143.2 (d, C(2)), 148.0 (s, C(4)), 158.4 (s, C(6))

D.7.5 6-Chlor-7-carbapurin

ci

H

41

Rf = 0.49, (Kieselgel/Hexan: EtOAc = 1:1)

(MeOH): 221 (27270), 275 (4929)

(KBr): 3600-3320w, 3200m, 3120s, 2970m, 2830m, 1605s, 1570s, 1555vs,

1435m, 1350vs, 1260vs, 1210s, 960s, 845vs, 730s, 590m

(400 MHz, DMSO-d6): 6.62 (d, J=3.5, IH, H-C(7)), 7.71 (d, J=3.5, IH, H-

C(8)), 8.61 (s, IH, H-C(2)), 12.6 (br., IH, H-N(9))

DC

UV

IR

'H-NMR


«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 98.7 (d, C(7)), 116.5 (s, C(5)), 128.3 (d, C(8)), 150.2

(d, (C(2)), 150.4 (s, C(6)), 151.7 (s, C(4))

MS (EI): 155.0 ((M + 2H)+, 37.2), 154.0 ((M + H)+, 10.5), 153.0 (M+, 100.0),

118.0 (83.3), 91.0 (13.5), 64.0 (27.2), 28.0 (21.7), 18.0 (63.6), 17.0 (15.0)

D.8 ß-Homo-deoxy-7-carbaadenosin

D.8.1 4,6-Di-0-benzoyl-2,3-dideoxy-D-glucose

BzO BzO

>X^O.

BzO \S | BzO X* ^"OH

OMe

5 44

Eine Lösung von 10.0 g (27 mmol) Pyranosid 5 in 300 ml CH3CN und 200 ml

H2O wurde bei RT mit 17 ml konz. Salzsäure versetzt und anschliessend

während 1.5 Std. auf Rückflusstemperatur erhitzt. Danach liess man auf RT

abkühlen, neutralisierte mit 103 ml 2N Natronlauge und dampfte am RV zur

Trockene ein. Das Rohprodukt wurde in wenig Essigester gelöst, mit 40 g

Kieselgel versetzt und abermals zur Trockene eingeengt. Chromatographie

erfolgte an 320 g Kieselgel mit Hexan : Essigester = 2:1 (2.0 lt), gefolgt von

Hexan: Essigester = 1:1 (1.5 lt). Die reinen produkthaltigen Fraktionen wurden

vereinigt und vom Lösungsmittel befreit. Es resultierten nach Trocknen am HV

bei RT während 60 Std. 7.61 g 44 (ungefähr 60% a- und 40% ß-Anomer) in Form

eines hochviskosen Oels, welches nach ^H-NMR noch 1.16 g Essigester enthielt

(67% korr.).

Analytische. Daten:

DC Rf = 0.55, (Kieselgel/Hexan : EtOAc = 1:1)

UV (CHCI3): 240 (8700), 274 (1400)

IR (CHCI3): 3590w, 2970w, 1720vs, 1600w, 1450m, 1340s, 1270vs, 1130s,

1070s, 1030s, 1000m


BzO

Xj^

J

•

...L.M » __jj1jl

1 1 1 —1-

1

90 80

1 1 1 1 1 1 1

70 60 50 40 30 20 10 0 0 ppm


IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.66-1.77 (m, IH, H-C(2/3)), 1.86-2.00 (m, IH, H-

C(2/3)), 2.01-2.21 (m, 1.6H, H-C(2/3)), 2.37-2.43 (m, 0.4H, H-C(2/3)),

4.01-4.07 (m, 0.4H, H-C(5)), 4.37-4.51 (m, 1.6H, H-C(5,6)), 4.57-4.64 (m,

IH, H-C(6)), 4.95 (dd, J=2.3 8.3,0.4H, H-C(D), 5.05-5.17 (m, IH, H-C(4)),

5.36 (t, J=2.1,0.6H, H-C(D), 7.37-7.45 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.50-7.58 (m,

2H, H-C(arom.)), 7.98-8.08 (m, 4H, H-C(arom.))

»C-NMR (100 MHz, CDCI3): 23.4, 27.0, 28.9, 31.0 (4t, C(2/3)), 64.1,64.3 (2t, C(6)),

68.4, 68.9, 69.0, 75.3 (4d, C(4/5)), 91.0, 95.9 (2d, C(D), 128.32, 128 42,

128.44 (3d, C(arom.)), 129.68, 129.69, 129.74, 129.77 (4d, C(arom.)),

129.83, 129.91, 129.94 (3s, C(arom.)), 133.00, 133.05, 133.19, 133 27 (4d,

C(arom.)), 165.56,166.46 (2s, C=0)

MS (EI): 339.1 ((M - OH)+, 8.2), 227.1 (4.6), 191.0 (4.2), 165.0 (12.6), 123.0 (5.0),

105.0 (100), 77.0 (36.1).


D.8.2 6-Chlor-7-carba-9-(4,,6,-di-0-benzoyl-2,/3'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyDpurin

BzO

BzO^Sy~^"OH

44

BzO

BzO^^^^CI

36

BzO

BzO

<\ N^k/ClU

N*. N

Cl

//

H

41

^

Cl

//^X\ >

K+

43

J

42

Zu 2.37 g (15.4 mmol) 6-Chlor-7-carbapurin 41, welches nach Davoll [37]

hergestellt wurde, gab man 12,5 ml einer aus Kalium und Methanol frisch

zubereiteten und titrierten 1.236 M Lösung von Kaliummethoxid in MeOH (15.4

mmol) und rührte 30 min. bei RT unter Argon. Darauf wurde bei 25°C am RV

eingeengt, der feste Rückstand in 20 ml abs. CH3CN suspendiert, abermals

eingeengt und das entstandene Kaliumsalz für 52 Std. am HV bei RT getrocknet.

Separat dazu wurden 5.50 g (15.4 mmol) 4,6-Di-0-benzoyl-2,3-dideoxy-D-glucose44 während 52 Std. am HV bei RT getrocknet und anschliessend unter Ar in 70

ml abs. THF gelöst, auf -78°C abgekühlt und der Reihe nach mit 3.08 ml (16.9

mmol) Tris-(dimethylamino)-phosphin und mit 1.98 ml (20.3 mmol) CCI4

versetzt. Die Reaktionslösung wurde nun 1 Std. bei -78°C gerührt, 1 Std. auf RT

erwärmt und anschliessend am RV bei 25°C eingeengt. Der ölige Rückstand

205 - experimenteller Teil

wurde in 20 ml abs. CH3CN gelöst und die Lösung unter Argonüberdruck bei RT

durch einen Teflonschlauch zur Suspension des oben hergestellten Kaliumsalzes

von 6-Chlor-7-carbapurin in 20 ml abs. CH3CN gepresst. Nach 45 min. Rühren bei

RT wurde die Reaktionslösung bei 25°C am RV zu einem dunkelbraunen Oel

eingeengt, welches anschliessend an 450 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc = 2:1 (4.0

lt) gefolgt von Hexan : EtOAc = 1:1 (2.0 lt), chromatographiert wurde. Die reinen

produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt und am RV eingedampft. Auf

diese Weise erhielt man 3.9 g eines Gemisches bestehend aus dem Nukleosid 42

und dessen a-Isomeren im Verhältnis von ß : a = 2 :1 (gemäss !H-NMR). Dieses

Nukleosidgemisch wurde nun in 20 ml Aceton gelöst und durch Diffusion gegen

Pentan (analog der Vorgehensweise nach [99], [100]) zur Kristallisation gebracht.Das Kristallisat, welches gemäss JH-NMR die beiden Nukleoside in einem

Anomerenverhältnis von ß : a = 9 : 1 aufwies, wurde nochmals aus 0.7 1 Et2Ü

umkristallisiert. Man erhielt so 2.1 g (28%) ß-anomerenreines 42 in Form von

weissen Nadeln.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.42, (Kieselgel/Hexan : EtOAc = 2 :1)

[a]D25° = -4.3 (c = 0.89, CHCI3)

UV (CHCI3): 240 (19900), 274 (8600)

IR (CHCI3): 2999w, 1720vs, 1587m, 1550m, 1510w, 1450m, 1316s, 1267vs,

1115s, 1071s, 1028m, lOOOw, 944w, 918w, 854w


C(2')), 2.60-2.67 (m, IH, H-C(3')), 4.31 (ddd J=2.6, 5.4, 9.6, IH, H-C(5')),

4.44 (dd, J=12.1,5.5, IH, H-C(6'),), 4.63 (dd, J=12.1 2.5, IH, H-C(6'), IH),

5.22 (dt, Jt=10.6 Jd=4.8 IH, H-C(4')), 6.23 (dd, J=10.4 2.8, IH, H-C(l')),

6.67 (d, J=3.8, IH, H-C(7)), 7.48 (d, J=3.8, IH, H-C(8)), 7.35-7.60 (m, 6H,

H-C(arom.)), 7.96-8.05 (m, 4H, H-C(arom.)), 8.65 (s, IH, H-C(2))

Differenz-NOE (300 MHz, CDCI3): 6.21 (H-C(l') « 8.65 (H-C(2)), 7.48 (H-C(8)), 4.31

(H-C(5')), 2.29 (H-C(2')), 2.00 (H-C(3")

"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 28.5,30.3 (2t, C(273')), 63.7 (t, C(6')), 67.9 (d, C(4')),

77.7 (d, C(5*)), 81.1 (d, C(l')), 100.8 (d, C(7)), 118.0 (s, C(5)), 125.8 (d,

C(8)), 128.3,128.5 (2d, C(arom.)), 129.5 (s,C(arom.)), 129.70,129.73 (2d,

C(arom.)), 133.1,133.5 (2d, C(arom.)), 150.8 (s, C(6), 150.9 (d, C(2)), 152.4

(s, C(4), 165.5,166.2 (2s, CO)


MS (EI): 491.KM+, 0.9), 339.1 (32.2), 217.1 (5.2), 153.0 (6.2), 105.1 (100.0),

94.1(24.5), 77.1 (26.3)

C26H22CIN3O5: ber.: C: 63.48, H: 4.51, N: 8.54, gef.: C: 63.44, H: 4.54, N: 8.39

Schmelzpunkt: 152°C.

o^VV

r

Li—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—\—1—1—1—1 1—1—1

90 80 70 60 50 40 30 20 10 00 ppm


D.8.3 e-Ammo-T-carba-S-ßVS'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyUpurin

HOBZ°

f=\

42

HO

O. Nv> .NH,

IIN- N

37

Im Autoklaven wurden in zwei separaten Chargen je 2.08 g (4.21 mmol) 42 in

200ml Methanol suspendiert. Die Autoklaven wurden jeweils geschlossen und

bei 0°C mit 21 g gasförmigem NH3 gefüllt. Nach 20 Std. bei 130°C wurde die

Reaktionslösung am RV eingeengt. Die vereinigten Rohprodukte beider Chargen


wurden, in wenig Methanol gelöst, an 30 g Kieselgel adsorbiert und

anschliessend an 450 g Kieselgel zuerst mit EtOAc : Methanol = 20 : 1 (4.0 lt)

gefolgt von EtOAc : Methanol = 4:1 (3.5 lt) chromatographiert. Die reinen,

produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt, der Rückstand in

Aceton gelöst und durch Diffusion gegen Pentan kristallisiert. Es verblieben nach

Trocknen am HV bei RT während 10 Std. 1.90 g (83%) ß-Homo-Carbaadenosin 37

in Form von feinen weissen Kristallen.

Analytische Daten:


[alo25" = -13.0 (c = 0.55, MeOH)

UV (150 mM NaCl, 10 mM Tris • HCl, pH 7): 270 (10900)

IR (KBr): 3350vs br. sh, 3190vs br. sh, 1670s, 1640s, 1600vs, 1560vs, 1485m,

1275m, 1095m, 1060s, 995m, 915m, 745m, 720m

MS (FAB+, 3-NOBA): 265.1 (82.1, (M+H)+), 157.0 (34.4), 155.0 (11.7), 137.0

(41.7), 136.0 (49.6), 135.0 (58.0), 134.0 (33.2)

Ci2H16N4Q3-0.4 MeOH ber.: C: 54.14, H: 5.72, N: 20.36, gef.: C: 53.59, H: 6.11, N: 20.18

Schmelzpunkt: 189-192°C

Abbildung D83: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«) von 37


JH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.58-1.69, 1.82-1.87 (2m, 2H, H-C(273')), 2.08-

2.33 (m, 2H, H-C(273')), 3.34-3.48 (m, 3H, H-C(476')), 3.65-3.70 (m, IH,

H-C(5')), 4.48* (t, J=5.8, IH, HO-C(6')), 4.89* (d, J=5.2, IH, HO-C(4')),

5.82 (dd, J=2.0 11.0, IH, H-C(l')), 6.57 (d, J=3.6, IH, H-C(7)), 7.00* (s br.,

2H, NH), 7.31 (d, J=3.7, IH, H-C(8)), 8.06 (s, IH, H-C(2))



C(4')), 79.8 (d, C(5')), 83.1 (d, C(l')), 99.4 (d, C(7)), 102.3 (s, C(5)), 121.0

(d, C(8)), 149.5 (s, C(4)), 151.7 (d, C(2)), 157.4 (s, C(6))

D.8.4 6-Benzamido-7-carba-9-(2',3'-dideoxy-ß-D-glucopyranosyl)-purin

X^»7r J^-Ty-HO^\>~^^ TU ^

N^ N

N^ N ^

37 38

Zu einer Lösung von 1.85 g (7.00 mmol) 37 in 72 ml abs. Pyridin wurden unter

Ar bei 0°C innerhalb von 15 min. 4.7 ml (37 mmol) Trimethylchlorsilan

zugegeben, gefolgt von 4.3 ml (37 mmol) Benzoylchlorid in einem zeitlichen

Abstand von 30 min. Nach weiteren 5 min. wurde das Eisbad entfernt, die

Reaktionslösung 2 Std. bei RT gerührt, danach wieder auf 0°C gekühlt und mit

14.4 ml Wasser innerhalb von 5 min. und 15 min. später mit 14.4 ml 25 %

Ammoniaklösung versetzt. Nach 5 min. wurde das Eisbad entfernt und noch für

45 min. bei RT gerührt. Die Reaktionslösung wurde am RV eingeengt in 150 ml

Wasser aufgenommen und einmal mit 150 ml Ether extrahiert. Die Wasserphasewurde am RV eingeengt. Es resultierten 8.1 g Rohprodukt welches, in MeOH

gelöst, an 30 g Kieselgel adsorbiert und an 300 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc = 2 :

1 (2.0 lt), gefolgt von EtOAc : Methanol = 4:1 (4.5 lt) chromatographiert wurde.

Einengen der produkthaltigen Fraktionen bis zur einsetzenden Trübung und

Auskristallisieren lassen bei 4°C lieferte nach Trocknen am HV bei RT während

20 Std. 1.90 g (73%) 38 in Form von feinen weissen Kristallen.


Analytische Daten:


[dlrp5" =+12.7 (c = 0.59, MeOH)

UV (MeOH): 223 (30800), 302 (10300)

IR (KBr): 3460m br. sh, 3360s, 1695vs, 1560m, 1525vs, 1495vs, 1430m,

1345m, 1260vs, 1090vs, 1070s, 1050s, 940m, 710s

!H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.65-1.74,1.93-1.97 (2m, je IH, H-C(273')), 2.11-

2.15, 2.23-2.33 (2m, je IH, H-C(273')), 3.39-3.51 (m, 3H, H-C(47576')),

3.70 (dd, J=5.5 10.8, IH, H-C(6')), 4.54* (t, J=6.0, IH, HO-C(6')), 4.94* (d,

J=4.9, IH, HO-C(4')), 6.03 (dd, J=1.911.0, IH, H-C(l')), 6.68 (d, J=3.8, IH,

H-C(7)), 7.52-7.66 (m, 3H, H-C(arom.)), 7.69 (d, J=3.8, IH, H-C(8)), 8.06-

8.09 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.63 (s, IH, H-C(2)), 11.00* (s br., IH, NH)


HO

I I I I I

12.0 11.0 10.0

r

~1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1

9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm

Abbildung D8.4: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«) von 38

«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 29.4, 31.7 (2t, C(273')), 61.0 (t, C(6')), 64.3 (d,

C(4')), 80.0 (d, C(5')), 83.3 (d, C(l')), 102.9 (d, C(7)), 109.2 (s, C(5)), 124.4

(d, C(8)), 128.33,128.36,132.3 (3d, C(arom.)), 133.4 (s, C(arom.)), 150.2

(d, C(2)), 151.0,151.8 (2s, C(4/6)), 165.7 (s, C=0)


MS (EI): 368.2 (M+, 4.6), 341.1 (17.1), 91.0 (67.1), 69.0 (32.9), 57.0 (32.9), 55.0

(44.3), 43.0 (60.6), 41.0 (39.1), 27.0 (100.0), 18.0 (72.5)

Schmelzpunkt: 216-217°C.

D.8.5 6-Benzamido-7-carba-9-{2,,3'-dideoxy-6'-0-[(4,4'-dimethoxy-triphenyl)methyl]-ß-D-glucopyranosyl}purin

HO DMTO

.0. nXNHBz *- k^ A^NHBzHO'\>~^ T H HO*^s>~^ T II

N^N N^N

38 39

Zur Entfernung von Spuren von H2O wurden 1.76 g (4.79 mmol) 38 in 25 ml abs.

Pyridin gelöst, am RV eingedampft und am HV für 16 Std. getrocknet. Der

Rückstand wurde erneut unter N2 in 23 ml abs. Pyridin gelöst und mit 2.46 ml

(14.36 mmol) Ethyl-diisopropylamin versetzt. Zu dieser Lösung gab man bei RT

1.78 g (5.27 mmol, 1.1 Eq) 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan in kleinen

Portionen innerhalb von 5 min.. Nach 30 min. wurden weitere 300 mg (0.9

mmol, 0.2 Eq) Dimethoxy-triphenylchlormethan zugefügt. Die Reaktionslösungwurde anschliessend eingeengt und der Rückstand zur Entfernung von Spurenvon Pyridin noch zweimal mit je 30 ml Toluol koevaporiert. Anschliessende

Chromatographie an 200 g Kieselgel mit Hexan: EtOAc = 1:2 (3.3 lt) und EtOAc :

MeOH = 9:1 (2.0 lt) lieferte nach Trocknen am HV bei RT während 20 Std. 2.47 g

(77%) 39 in Form eines leicht gelblichen Schaumes.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.46, (Kieselgel/EtOAc)UV (CH3CN): 224 (43200), 281 (10400)

IR (CHCI3): 3006w, 1730w, 1700m, 1607m, 1560w, 1510s, 1481vs, 1340w,

1302m, 1087s, 1037s, 830m

IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.72-1.88 (m, IH, H-C(273')), 2.05-2.18 (m, 2H, H-

C(273')), 2.27-2.32 (m, IH, H-CG73')), 3.28 (dd, J=6.5 9.5, IH, H-C(6')),

3.34* (s, br., IH, HO-C(4')), 3.50 (dd, J=3.7 9.5, IH, H-C(6')), 3.79-3.84


(m, 8H, H3C-O, H-C(4^')), 6.12 (dd, J=5.3 7.3, IH, H-C(l')), 6.79-6.83

(m, 4H, H-C(arom.)), 7.09 (d, J=3.8, IH, H-C(7)), 7.12-7.33 (m, 7H, H-

C(arom.)), 7.34 (d, IH, J=3.8, H-C(8)), 7.39 - 7.62 (m, 5H, H-C(arom.)),

7.98 (d, J=7.5, 2H, H-C(arom.)), 8.53 (s, IH, H-C(2)), 8.80* (s, br., IH,

NH)


JL .Ja. jj

0X^»iX;

—1 1—1—1—1—1—1—1—1—1' 1—1—1—1—1

90 80 70 60 50 40 30 20 10 00 ppm

Abbildung D85: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 39

"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 30.4, 30.9 (2t, C(2730), 55.2 (q, CH3-O), 65.8 (d,

C(4')), 69.1 (t, C(6')), 79.1, 80.7 (2d, C(175')), 87.1 (s, O-C(DMT)), 104.7

(d, C(7)), 108.6 (s, C(5)), 123.2 (d, C(8)), 113.1,113.3,127.0,127.7,127.9,

128.0,128.9,129.2,130.0,132.7 (lOd, C(arom.)),133.6,135.3,135.5,144.3

(4s, C(arom.)), 150.5 (d, C(2)), 150.2, 152.5 (2s, C(4,6)), 158.7 (s,

C(arom.)), 165.2 (s,C=0)

MS (FAB+, 3-NOBA): 672.2 ((M + 2H)+, 2.7), 671.3 ((M + H)+, 6.2), 351.1

(3.4), 303.1 (100.0), 239.1 (28.4), 136.0 (5.6), 135.0 (6.4), 105.0 (34.0), 76.9

(12.5)


D.8.6 6-Benzamido-9-{4'-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-diisopropyl-amino)phosphino]-2',3,-dideoxy-6'-0-[(4/4l-dimethoxytri-phenyl)methyl]-ß-D-glucopyrano8yl}-7-carbapurin

DMTO

DMTO J^°v^NsA^NHBZ^—

_

v^ t 11"*" I N^ N

"^ N O ^^N*. N

1

39"^

40

Zu einer Lösung von 0.887 g (1.32 mmol) 39 in 5.4 ml abs. THF wurden unter Ar

bei RT 294 ul (1.58 mmol) Ethyl-diisopropylamin und 354 ul (1.58 mmol) ß-

Cyanoethoxy-(N,N-diisopropylamino)-chlorphosphin gegeben. Nach 1 Std.

Rühren bei RT wurde die Reaktionslösung in 100 ml EtOAc aufgenommen,zweimal mit je 50 ml ges. NaHC03 Lsg. gewaschen, über Na2S04 getrocknet und

am RV eingeengt. Der Rückstand wurde an 68 g Kieselgel in einer auf 0°C

gekühlten Säule mit CH2C12: EtOAc = 2:1+ 0.3% NEt3 (0.75 lt), CH2C12: EtOAc =

1:1 + 0.3% NEt3 (0.5 lt) und EtOAc + 0.3% NEt3 (1.0 lt) chromatographiert. Die

reinen, produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und der

Rückstand, gelöst in ca. 3 ml EtOAc, aus 100 ml eisgekühltem Hexan gefällt.

Zweimaliges analoges Umfallen lieferte nach Trocknen am HV bei RT während

20 Std. 648 mg (59%) Phosphoramidit 40 (1 : 1 Diastereomerengemisch am

Phosphor) in Form eines weissen Pulvers.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.78, (Kieselgel/CH2C12: EtOAc = 2:1)

UV (CH3CN): 224 (41700), 282 (10000)

IR (CHCI3): 2968m, 1699m, 1509s, 1481vs, 1301m, 1081m, 1036s, 978m,

829w

JH-NMR (400 MHz, CDCI3): 0.88-1.17 (m, 12H, H3C-(i-Pr)), 1.82-1.92 (m, IH, H-

C(273')), 2.03-2.18 (m, 2H, H-C(273')), 2.30 (dd, J=6.1 11.1, IH, H2C-

CN), 2.36-2.46 (m, IH, H-C(273')), 2.59 (t, J=6.3, IH, H2C-CN), 3.23-3.70

(m, 6H, H2C-OP, H-(6'), HC(CH3)2-(i-Pr)), 3.74 (s, 1.5 H, H3C-O), 3.75 (s,

1.5H, H3C-O), 3.76 (s, 1.5H, H3C-O, 3.77 (s, 1.5H, H3C-O, 3.78-4.09 (m,


2H, H-C(475')), 6.18-6.23 (m, IH, H-C(l')), 6.71-6.78 (m, 4H, H-



C(arom.), 7.58-7.60 (m, IH, H-C(arom.)), 8.00 (d, J=7.5, 2H, H-

C(arom.)), 8.56 (s, br., H-C(2), IH), 8.81 (s, br., IH, NH)

J

X*A

OMTO

90 80—l 1 1 1 1 1 1 l 1 1 1 1 1 1 1 1

70 60 50 40 30 20 10 00 ppm


13C-NMR (100 MHz, CDCI3): 20.2, (dt, Jcp=7.2, CH2-CN) 20.5 (dt, JCp=7.4 CH2-

CN), 24.26, 24.33, 24.45, 24.53, 24.58, 24.64, 24.73 (7q, (CH3)2CH-(i-Pr)),

30.9,31.0,31.2,31.6 (4t, C(273')), 43.06,43.18 (2dd, Jcp=12.1, CH(CH3)2-

(i-Pr)), 55.1, 55.2 (2q, CH3-O, 57.7 (dt, JCp=20.4, CH2-OP), 58.3 (dt,

JCP=19.0, CH2-OP), 63.4, 63.7 (2t, C(6')), 67.3 (dd, JCp=17.8, C(4')), 68.1,

(dd, JCp=13.1, C(4')), 80.9, 81.0, 81.1, 81.2 (4d, C(175')), 85.7 (s, O-

C(DMT)), 104.4,104.5 (2d, C(7)), 108.6 (s, CN), 112.9 (d, C(arom.)), 117.6

(s, C(arom.)), 123.4,123.5 (2d, C(8)), 126.6,126.7,127.61,127.63,127.68,

128.4, 128.5, 129.0, 130.3, 132.7 (lOd, C(arom.)), 133.7, 136.16, 136.23,

136.27,136.32,144.9,145.1 (7s, C(arom.)), 150.1 (d, C(2)), 150.4,152.5 (2s,

C(4,6)), 158.3,158.4 (2s, C(arom.)), 165.2 (s, CO)

31P-NMR (162 MHz, CDCI3): 148.7

-214-experimenteller Teil

MS (FAB+, 3-NOBA): 871.3 ((M + H)+, 2.0), 466.0 (1.6), 303.1 (100.0), 239.1

(25.4), 201.1 (10.1), 105.0 (27.8).

Abbildung D8.7:3IP-NMR (162 MHz, CDCy von 40


D.9 ß-Allopyranosyl-isoguanin

D.9.1 2,6-Dichlor-9-(2'/3,,4,,6'-tetra-0-acetyl-ß-D-allopyranosyl)-purin

AcO

48 49 50

Man suspendierte 2.50 g (13.0 mmol) 2,6-Dichlorpurin 49, das zuvor 18 Std. am

HV bei RT getrocknet wurde, in 140 ml abs. CH3CN unter Ar. Darauf spritzte

man 5.75 ml (4.77 g, 23.5 mmol, 1.8 Eq) N,0-Bis-(trimethylsilyl)-acetamid zu,

erwärmte auf 65°C, bis sich die Suspension gelöst hatte und gab 7.50 g (19.3 mmol,

1.5 Eq) 1,2,3,4,6-Penta-O-acetyl-ß-D-allose 48 und 4.60 ml (25.3 mmol, 1.95 Eq)

Trifluor-methansulfonsäure-trimethylsilylester zu und rührte bei 65°C für 9 Std.

unter Ar. Man liess weitere 14 Std. bei RT stehen und nahm in 500 ml EtOAc auf.

Es wurde einmal mit 150 ml ges. NaHC03 gewaschen. Die wässrige Phase wurde

zwei Mal mit je 100 ml EtOAc rückextrahiert. Die vereinigten org. Phasen

wurden noch einmal mit 200 ml ges. NaCl gewaschen, über MgS04 getrocknet, an

40 g Kieselgel adsorbiert und anschliessend an 450 g Kieselgel zuerst mit Hexan :

EtOAc = 2 :1 (1.51) gefolgt von Hexan : EtOAc = 1:1 (2.01) und Hexan : EtOAc = 1 :

2 (2.0 1) chromatographiert. Einengen der produkthaltigen Fraktionen lieferte

4.617 g (68%) 2,6-Dichlor-9-(2,,3',4,,6'-tetra-0-acetyl-ß-D-allopyranosyl)-purin 50

als weissen, festen Schaum.

Analytische Daten:


UV (CHCI3): 250 (5300), 272 (8570)

IR (CHCI3): 3000w, 1755vs, 1595m, 1560s, 1495w, 1370s, 1150m, 1100m,

1045s, 980w, 885m

IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.84, 2.07, 2.08, 2.28 (4s, je 3H, H3C), 4.11-4.17 (m,

2H, H-C(6')), 4.39 (ddd, J=2.7 4.1 10.4, IH, H-C(5')), 5.17 (dd, J=2.8 10.4,


IH, H-C(4')), 5.61 (dd, J=3.0 9.7, IH, H-C(2')), 5.85 (dd, J=2.9 2.9, IH, H-

C(3')), 6.15 (d, J=9.8, H-C(l')), 8.28 (s, IH, H-C(8))

"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 20.2,20.5,20.7,20.8 (4q, CH3), 61.7(t, C(6')), 65.7 (d,

C(4'), 67.6 (d, C(20,67.8 (d, C(3'), 72.9 (d, C(5')), 78.7 (d, C(l')), 130.9 (s,

C(5)), 143.5 (d, C(8)), 152.2 (s, C(4)), 153.2 (s, C(6)), 153.6 (s, C(2)), 168.7,

169.1,169.7,170.5 (4s, CO)

Zuordnung der 13C-Signale durch ein Hetcor - Experiment

MS (FAB+, 3-NOBA): 521.1 ((M + 3H)+, 17.7), 519.1 ((M + H)+, 26.0), 331.1

(100.0), 241.1 (36.6), 199.1 (42.7), 169.1 (66.9), 127.0 (34.0), 109.0 (57.5),

72.9 (63.1)

Abbildung D9.1: 'H-NMR (400 MHz, CDOj) von 50

217 - experimenteller Teil

D.9.2 6-Amino-2-chlor-9-(ß-D-allopyranosyl)purin

AC0/=N

HO/=N

| OAc Ns N I OH N^.xNAcO 7 HO 7

Cl Cl

50 51

In 13 verschiedenen Chargen wurden jeweils etwa 500 mg total 6.38 g

(11.77 mmol) 50 in 75 ml frisch mit NH3 bei 0°C gesättigtem Methanol in einem

Stahlautoklaven bei 100°C Badtemperatur für 11 Std. gerührt. Die Ansätze

wurden eingeengt und vereinigt. Umkristallisation aus Methanol : Aceton 1 : 1

nach der Methode der isothermen Destillation gegen Pentan analog [99], [100]

erhielt man 2.09 g 51. Adsorbtion der Mutterlauge an 10 g Kieselgel und

Chromatographie an 40 g Kieselgel mit CHCI3: MeOH = 4:1 (2.0 1) lieferte weitere

893 mg 51, was eine totale Ausbeute von 2.98 g (76%) ergab.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.60, (Kieselgel/n-BuOH : H20: AcOH = 5:3:2)

UV (MeOH): 263 (10600)

IR (KBr): 3500s, 3470s, 3330s, 3260s, 3210s, 3110s, 2910m, 1655vs, 1600vs,

1575s, 1345m, 1305s, 1250s, 1170m, HlOvs, 1045vs

IH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 3.41-3.50 (m, 2H, H-C(6')), 3.68 (ddd, J=1.9 7.3

10.1, IH, H-C(4')), 3.75 (ddd, J=1.8 4.1 9.6, IH, H-C(5')), 4.02 (dd, J=2.8

5.8, IH, H-C(3')), 4.11 (ddd, J=2.5 7.2 9.6, IH, H-C(2')), 4.52 (t, J=5.8, IH,

HO-C(6')), 4.83* (d, J= 7.4, IH, HO-C(4')), 5.11* (d, J=7.2, IH, HO-C(2')),

5.18* (d, J=3.6, IH, HO-C(3')), 5.64 (d, J=9.4, IH, H-C(D), 7.78* (s, br.,

2H, H2N), 8.36 (s, IH, H-C(8))


Differenz-NOE (300 MHz, DMSO-d6): 6.21 (H-C(l')) » 3.75 (H-C(5')), 5.11 (HO-

C(2')),8.36(H-C(8))

"C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 60.9 (t, C(6')), 67.0, 68.6, 71.3, 76.5, 79.4 (5d,

CU72737475'), 117.6 (s, C(5)), 140.1 (d, C(8)), 151.0 (s, C(4)), 153.0 (s,

C(2)), 156.6 (s,C(6))


MS (FAB+, 3-NOBA): 334.0 «M + 3H)+, 9.3), 332.0 ((M + H)+, 26.3)), 307.1

(41.7), 289.1 (19.6), 155.1 (41.8), 154.0 (100.0), 139.0 (25.9), 138.0 (50.5),

137.0 (77.8), 136.0 (72.5), 107.0 (30.8), 88.9 (25.9), 76.9 (24.1)

80

1 1—

70

T OH N^N

-I 1

20

—1 1 1 1

10 0 0 ppm

Abbildung D92: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) von 51


D.9.3 2-Allyloxy-6-[(N,N-dibenzoyl)amino]-9-(2,,3,,4,,6,-tetra-0-benzoyl-ß-D-allopyranosyl)purin

I OH N^ N

HO T

NHj

T

Cl

51

HO,= N

I OH N^NHO T

52

BZt <=\Bz0xt^"^r

I OBz N. N

N(Bz)2

BzO

53

T°^^

Zu 45.0 ml (29.8 g, 0.51 mol) AUylalkohol gab man 1.72 g (75 mmol, 10 Eq bez. 51)

Natrium und rührte bei 80°C, bis die AUylatbildung abgeschlossen war. Darauf

gab man 2.48 g (7.48 mmol) 51 zu und rührte für 7 Std. unter Ar bei 80°C

Badtemperatur. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10.40 g (90.0 mmol, 1.2 Eq

bez. Natrium) Pyridin-hydrochlorid in 40 ml AUylalkohol gestoppt. Es wurde

weitere 12 Std. bei RT gerührt. Die braune Suspension wurde abfiltriert und der

Filterkuchen zwei Mal mit je 20 ml Pyridin und 20 ml AUylalkohol

nachgewaschen. Einengen der Lösung ergab als Zwischenprodukt 52, mit einem

RrWert von 0.14 (Kieselgel/CH2Cl2: MeOH = 4:1).

Das Rohzwischenprodukt wurde noch einmal aus Pyridin eingeengt, für 4 Std.

am HV getrocknet und wieder in 77 ml Pyridin gelöst. Man kühlte auf 0°C ab

und spritzte innert 20 min. 14.7 ml (17.8 g, 127 mmol, 17 Eq bezüglich

Anfangsedukt 51) Benzoylchlorid unter Ar zu. Nach beendeter Zugabe wurde bei

RT noch weitere 16 Std. gerührt. Darauf wurde in 300 ml EtOAc aufgenommenund zwei Mal mit je 150 ml ges. NaHC03 gewaschen. Die wassrigen Phasen

wurden zwei Mal mit je 100 ml EtOAc rückextrahiert. Man trocknete die

vereinigten org. Phasen über Na2S04, engte am RV ein und chromatographiertedas braune hochviskose Oel an 400 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc : EtOH = 16 : 4 :


0.5 (1.01), Hexan: EtOAc: EtOH = 16:4:1 (1.01) und Hexan : EtOAc: EtOH = 8:4:

2 (1.0 1). Einengen der produkthaltigen Fraktionen lieferte nach Trocknen am HV

für 16 Std. 5.26 g (72% über diese zwei Stufen) 53 als hellbräunlichen, festen

Schaum.

Analytische Daten:


UV (CH3CN): 269 (12400), 280 (13600)

FR (CHCI3): 1733vs, 1601m, 1584s, 1508w, 1452s, 1394m 1336s, 1316m,

1267vs, 1091s, 1069s, 1027m

*H-NMR (400 MHz, CDCI3): 4.46-4.51 (m, 3H, H-C(6'), H-allyl-C(l")), 4.72 (dd,

J=2.5 12.5, IH, H-aUyl-C(l")), 4.84 (ddd, J=2.5 5.0 10.4, IH, H-C(5')), 5.10

(dd, J=0.9 10.4, IH, H-aUyl-C(3")), 5.20 (dd, J=1.5 7.2, IH, H-allyl-C(3")),

5.73-5.82 (m, 2H, H-allyl-C(2"), darunter auch 5.73 (dd, 1=2.9 10.3, IH,

H-C(4'))), 5.98 (dd, J=3.0 9.7, IH, H-C(2')), 6.41 (dd (tripletoid), J=2.9,

IH, H-C(3')), 6.51 (d, J=9.7, IH, H-C(l')), 7.22-8.10 (m, 30H, H-

C(arom.)), 8.16 (s, IH, H-C(D)


BaO T

III \

/

/

Jl\-ririu .1, -

i

.

> 1 1 , , 1 '1 1 1 1 1 1 1 1

9.0 8.0 7.0 (.0 5.0 4.0 3.0 2

i i i i i

.0 1.0 0.0 ppm

Abbildung D93: 'H-NMR (400 MHz,CDCy von 53


"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 62.7 (t, C(allyl-C(2")/6')), 66.8, 68.86, 68.91 (3d,

C(172737475')), 69.0 (t, C(allyl-C(2")/6')), 73.4, 77.2 (2d,

C(172737475')), 118.5 (t, allyl-C(3")), 122.8 (s, C(5)), 128.1, 128.4,

128.5,128.6,128.7,128.8,129.1,129.3,129.4,129.8,129.86,129.87,129.89,

130.1,132.3,132.9,133.3,133.5,133.7,133.8,134.0 (21d, C(arom.), allyl-

C(l")), 141.0 (d, C(8)), 152,5, 155.3 (2s, C(2/4)), 160.8 (s, C(6)), 164.4,

164.7,165.2,166.1,170.0,172.0 (6s, CO)

MS (FAB+, 3-NOBA): 979.1 ((M + 2H)+, 6.3), 978.1 ((M + H)+, 9.6), 856.1

(5.4), 579.1 (7.9), 106.0 (26.3), 104.9 (100.0), 76.9 (37.5)

D.9.4 2-AUyloxy-6-(benzamido)-9-(ß-D-allopyranosyl)purin

NHBz

T OBz N^Nnu

J NOH N^ N

BzO T HO T

53°^>

54°^>

In 29 ml THF : MeOH : H20 = 5:4:1 wurden 925 mg (0.94 mmol) 53 gelöst und

bei 0°C mit 3.76 ml 2N NaOH (7.52 mmol, 8 Eq) versetzt und für 40 min. bei 0°C

gerührt. Darauf wurde 1 Std. bei RT gerührt, wieder auf 0°C abgekühlt und nach

einer weiteren Stunde bei 0°C mit 806 mg (15.1 mmol, 2 Eq bez. NaOH) NH4CI

zugegeben. Nach 5 min. bei 0°C wurde noch 15 min. bei RT gerührt. Darauf engte

man auf = 8 ml ein. Die gelbe, zähflüssige Suspension wurde mit 5 ml H2O

verdünnt, 15 ml Ether überschichtet und bei 2°C für 17 Std. auskristallisieren

gelassen, was nach Trocknen für 1 Std. am HV 448 mg (99% korr.) 54,das noch

4.2 Gew.% Ether enthielt, als weisse KristaUe ergab.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.40, (Kieselgel/CH2C12: MeOH = 4:1)

UV (MeOH): 295 (14400)

IR (KBr): 3600-2800vs, 1680m, 1620vs, 1590vs, 1520s, 1490s, 1450s, 1400vs,

1335vs, 1245vs, 1110s, 1050s, 1030s, 975w, 930m, 790m, 710s


JH-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 3.43-3.53 (m, 2H, H-C(6')), 3.68 (ddd, J=1.8 7.1

10.0, IH, H-C(4')), 3.78 (ddd, J=1.9 6.0 9.7, IH, H-C(5')), 4.07 (d, J=2.2,

IH, H-C(3')), 4.23-4.26 (m, IH, H-C(2')), 4.58* (t, J=4.0, IH, HO-C(6')),

4.86 (d, J=4.9,2H, H-allyl-C(l")), 4.91* (d, J=7.3, IH, HO-C(4')), 5.19* (d,

J=7.3, IH, HO-C(2')), 5.25-5.28 (m, 2H, HO-C(3')*, H-allyl-C(3")), 5.43

(ddd, J=1.6 3.3 17.3, IH, H-aUyl-C(3")), 5.75 (d, J=9.4, IH, H-C(l')), 6.11

(ddt, Jd=10.5 17.3 Jt=5.4, IH, H-allyl-C(2")), 7.48-7.57 (m, 3H, H-

C(arom.)), 8.01-8.03 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.46 (s, IH, H-C(8)), 7.0-11.5*

(IH, H-N(6))


«C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 60.9 (t, C(allyl-C(2")/6')), 67.0 (d,

C(172737475')), 67.6 (t, C(allyl-C(2")/6')), 68.3, 71.3, 76.5, 79.7 (4d,

C(172737475')), 117.7 (t, allyl-C(3")), 121.2 (s, C(5)), 128.28, 128.35,

128.43,128.7,129.0,129.1,132.3,133.2,133.3 (9d, C(arom.), allyl-C(2")),133.4 (s, C(arom.)), 142.1 (d, C(8)), 151.0, (s, C(4)), 154.6 (s, C(2)), 160.1 (s,

C(6)), 165.7 (s,C=0)

u Jdf"

JJÜÜjIw

HON

aX^HXI OH N^. N

ho y

-| 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm

Abbildung D9.4: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d») von 54


MS (FAB+, 3-NOBA): 480.9 ((M + Na)+, 21.9), 479.9 ((M + Na - H)+, 81.7),

458.9 «M + 2H)+, 27.4), 457.9 ((M + H)+, 100.0), 295.9 (65.0), 155.0 (22.6),

154.0 (74.7), 138.0 (26.5), 137.0 (48.5), 135.9 (56.8), 104.9 (45.8), 76.9 (24.5)

D.9.5 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{(4,/6,-0-tetraisopropyldisiloxan-l,3-diyl)-ß-D-allopyranosyl}purin

HO=N

/=N

H0T^ v —-^KX^-WO ^

I OH NvN

Uv^% ho y54 55 °v^%

Man suspendierte 2.85 g (6.24 mmol) 54 in 75 ml Pyridin, engte am RV ein und

trocknete am HV für 16 Std. bei RT. Man suspendierte nochmals in 45.7 ml

Pyridin und spritzte unter starkem Rühren unter Ar 2.15 ml (2.16 g, 6.86 mmol

,1.1 Eq bez. 54) TXPDSCl rasch zu und rührte für 4.5 Std. bei RT. Die gelbliche

Reaktionslösung wurde zu 400 ml ges. NaHC03 gegeben und vier Mal mit je 200

ml CH2CI2 extrahiert. Die vereinigten org. Phasen wurden einmal mit 100 ml ges.

NaCl gewaschen und dieses mit 50 ml CH2CI2 rückextrahiert. Trocknen der

vereinigten org. Phasen über Na2S04, einengen und einmaliges Koevaporieren

mit 40 ml Toluol lieferte nach Chromatographie an 300 g Kieselgel mit CHCI3:

MeOH = 40 : 1 (2 1) gefolgt von CHCI3: MeOH = 10 : 1 (1.5 1) 3.53 g (81%) 55 als

festen, weissen Schaum.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.48, (Kieselgel/CHC13: MeOH = 9:1)

UV (MeOH): 295 (14200)

IR (CHCI3): 2945s, 2870s, 1710m, 1625s, 1590vs, 1465s, 1395s, 1333s, 1130s,

1056vs, 1036vs, 886m

^H-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.01-113 (m, 28H, H3C-(i-Pr)), 1.97* (br, IH, HO-

C(273')), 2.95* (br, IH, HO-C(273')), 3.91-3.98 (m, 2H, H-C(6')), 4.05


(dd, J=2.0 12.8, IH, H-C(5')), 4.14 (dd, J=2.7 9.5, IH, H-C(4')), 4.32-4.36

(m, IH, H-C(2')), 4.43, (m, IH, H-C(3')), 4.84 (m, 2H, H-allyl-C(l")),

5.24 (dd, J=1.3 10.5, IH, H-allyl-C(3")), 5.41 (ddd, J=1.5 3.1 17.1, IH, H-

aUyl-C(3")), 5.85 (d, J=9.3, IH, H-C(l')), 6.07 (ddt, Jd=10.5 17.2 Jt=5.6, IH,

H-allyl-C-(2")), 7.49-7.53 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.57-7.60 (m, IH, H-

C(arom.)), 7.91 (s, IH, H-C(8)), 8.02-8.04 (m, 2H, H-C(arom.)), 9.09* (s

br., IH, H-N(6))


«C-NMR (100 MHz, CDCI3): 12.4, 12.5, 13.1, 13.2, 13.6 (5d, C-Si), 17.08, 17.09,

17.13, 17.17, 17.19, 17.26, 17.31, 17.38 (8q, CH3-(i-Pr)), 60.8 (t, C(allyl-

C(2")/60), 66.4 (d, C(172737475% 68.8 (t, C(allyl-C(2")/6')), 69.6,

71.9,75.7,81.6 (4d, C(l72737475'), 118.1 (t, allyl-C(3")), 118.5 (s, C(5)),

128.1,128.7,132.6,132.8 (4d, C(arom.), aUyl-C(2")), 133.8 (s, C(arom.)),

140.5 (d, C(8)), 150.0 (s, C(4)), 154.0 (s, C(2)), 161.0 (s, C(6)), 164.9 (s, C=0)

MS (FAB+, 3-NOBA): 702.4 ((M + 3H)+, 16.6), 701.4 ((M + 2H)+, 35.2), 700.4

((M + H)+, 58.8), 297.1 (30.3), 296.1 (100.0), 192.1 (24.5), 135.0 (18.4),

105.0 (59.3)

Abbildung D95: 'H-NMR (400 MHz, CDCb) von 55


D.9.6 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{2',3,-0-isopropyliden-(4,,6'-0-

tetraisopropyldisiloxan-l,3-diyl)-ß-D-allopyranosyl}purin

<y'Si—0\ 0 O

,_N

| [ OH N^Nh6 y

55Q

x-

I I P NwN

6i^ T56

Man trocknete 3.53 g (5.04 mmol) 55 und 633 mg (2.52 mmol, 0.5 Eq bez. 55)

Pyridinium-(toluol-4-sulfonat) für 25 Std. am HV. Darauf wurde in 29 ml frisch

über basisch Alox filtriertem Chloroform gelöst. Man gab unter Ar bei RT 1.18 ml

(910 mg, 12.6 mmol, 2.5 Eq) 2-Methoxy-propen zu und rührte für 37 Std. bei RT.

Die Reaktionslösung wurde in 400 ml CH2CI2 aufgenommen und mit 150 ml ges.

NaCl gewaschen. Die wässrige Phase wurde zwei Mal mit je 100 ml CH2CI2

rückextrahiert. Nach Trocknen der vereinigten org. Phasen über Na2SO,j,

Einengen am RV, einmaligem Einengen aus 60 ml Toluol und Chromatographiean 240 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc : MeOH = 60 : 30 :1 (2.7 1) erhielt man 2.85 g

(76%) 56 als festen, weissen Schaum.

Analytische Daten:


UV (CH3CN): 293 (15500)

IR (CHCI3): 2995m, 2945s, 2870m, 1710m, 1625s, 1590vs, 1465vs, 1410s,

1395s, 1335s, 1135s, 1055vs, 1035s, 1005m, 810m

IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.03-1.16 (m, 28H, H3C-(TrPDSi)/HC-(TrPDSi)), 1.14

(s, 3H, HäC-Ketal), 1.48 (s, 3H, H3C-Ketal), 3.94-4.02 (m, 2H, H-C(6')),

226- experimenteller Teil

4.13 (dd, J=9.8 18.8, IH, H-C(4')), 4.39 (dd, J=3.7,9.8, IH, H-C(4')), 4.67

(dd (tripletoid), J=4.1, IH, H-C(3')), 4.80 (dd, J=8.5 4.5, IH, H-C(2')),

4.83-4.94 (m, 2H, H-allyl-C(l")), 5.25 (ddd, J=1.3 2.7 10.5, IH, H-allyl-

C(3")), 5.42 (ddd, J=1.5 3.117.3, IH, H-allyl-C(3")), 5.69 (d, J=8.5, IH, H-

C(l')), 6.10 (ddt, Jd=10.417.2 J,=5.7, IH, H-allyl-C(2")), 7.48-7.52 (m, 2H,

H-C(arom.)), 7.56-7.61 (m, IH, H-C(arom.)), 7.96 (s, IH, H-C(arom.)),

7.97-7.99 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.89* (s br., IH, H-N(6))


"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 12.1, 12.5, 13.2, 13.8 (4d, C-Si), 17.1, 17.16, 17.22,

17.26, 17.29,17.32 (6q, CH3-(i-Pr)), 26.0, 28.4 (2q, CH3-Ketal), 60.6 (t,

C(allyl-C(2")/6')), 64.1 (d, C(l72737475')), 68.6 (t, C(allyl-C(2")/6')),

75.2, 76.6, 76.7, 82.8 (4d, C(172737475')), 111.6 (s, C(CH3)2-Ketal),

118.0 (t, allyl-C(3")), 119.2 (s, C(5)), 127.9, 128.8, 132.7, 132.9 (d,

C(arom.), allyl-C(2")), 133.7 (s, C(arom.)), 140.0, (d, C(8)), 150.4 (d,

C(4)), 154.3 (s, C(2)), 161.2 (s, C(6)), 164.6 (s, C=0)

MS (FAB+, 3-NOBA): 742.4 ((M + 2H)+, 30.1), 741.5 ((M + H)+, 60.8), 740.5

(M+, 100.0), 297.1 (23.4), 296.1 (89.8), 289.2 (24.4), 261.1 (30.3), 147.0

(24.1), 135.0 (25.3), 119.0 (26.7), 105.0 (81.1)

-(V

JL jO1 1 1 r

.zzfl 1—1—1—1—

30 20

-1 1 1 1

10 00 ppm

Abbildung D9Jk: 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 56


D.9.7 2-AUyloxy-6-(benzamido)-9-{2,,3'-0-isopropyliden-ß-D-allo-pyranosyUpurin

X

i P N^N

NHBz

56

I P N^N

°7^ T

57

In 25 ml THF wurden 2.85 g (3.85 mmol) 56 gelöst und 4.37 g (13.9 mmol, 3.6 Eq)

TBAF-Trihydrat zugegeben und für 4 Std. bei RT unter Ar gerührt. Das

Reaktionsgemisch wurde direkt auf 240 g Kieselgel aufgetragen und mit

CH2CI2: MeOH = 20 : 1 (3.0 1) eluiert, was 1.77 g (92%) 57 als amorphen weissen

Festkörper ergab.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.36, (Kieselgel/CH2C12: MeOH = 9:1)

UV (MeOH): 294 (16200)

IR (KBr): 3600-3050m, 2980w, 2940m, 1705s, 1615vs, 1595vs, 1530s, 1460s,

1390s, 1330vs, 1260vs, 1220s, 1030s, 1080vs, 1040s, 930w, 790m, 710m

!H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.33 (s, 3H, H3C-Ketal), 1.58 (s, 3H, H3C-Ketal),

3.47-3.53 (m, IH, H-C(5'/6')), 3.72-3.79 (m, 2H, H-C(5'/6')), 3.85 (ddd,

J=3.9 6.8 10.0, IH, H-C(4')), 4.60 (t, J=4.2, IH, H-C(3')), 4.73* (t, J=6.0, IH,

HO-C(6')), 4.86 (d, J=5.0, 2H, H-allyl-C(l")), 4.97 (dd, J=4.5 8.8, IH, H-

C(2')), 5.26 (ddd, J=1.3 3.0 10.5, IH, H-allyl-C(3")), 5.38* (d, J=6.8, IH,

HO-C(4')), 5.41 (ddd, J=1.7 3.3 17.8, IH, H-allyl-C(3")), 5.67 (d, J=8.2,

IH, H-C(l')), 6.10 (ddt, Jd=10.5 15.3 Jt=5.7, IH, H-allyl-C(2")), 7.53-7.57

(m, 2H, H-C(arom.)), 7.62-7.67 (m, IH, H-C(arom.)), 8.01-8.03 (m, 2H,

H-C(arom.)), 8.57 (s, IH, H-C(8)), 11.17* (s, IH, H-C(8))


"C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 26.1, 27.9 (2q, CH3-Ketal), 60.5 (t, C(allyl-

C(2")/6')), 64.3 (d, C(172'/3'/475')), 67.6 (t, C(allyl-C(2")/6')), 73.6,

76.2, 78.2, 81.2 (4d, C(172'/37475')), 109.8 (s, C(CH3)2-Ketal), 117.8 (t,

-228- expenmenteller Teil

aUyl-C(3")), 121.0 (s, C(5)), 128.3,128.4,132.4,133.2,133.3 (5d, C(arom.),

allyl-C(2")), 141.6 (d, C(8)), 151.6 (s, C(4)), 154.1 (s, C(2)), 160.3 (s, C(6)),

165.7 (s,C=0)

MS (FAB+, 3-NOBA): 499.1 ((M + 2H)+, 18.4), 498.2 ((M + H)+, 45.2), 297.1

(17.1), 296.0 (56.8), 243.3 (31.9), 242.3 (100.0), 142.2 (18.1), 136.0 (16.3),

105.0 (48.9)

MO pH

"°TO N^N

h f"

^

__/

1/

r- 110 J/ ^

I-j

. -r .k -ii I ', ,\

90 80 70 60 50 40 30 2 0 10 00 ppm

Abbildung D9.7: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d«) von 57


D.9.8 2-AUyloxy-6-(benzamido)-9-{6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)-methyl]-2V3'-0-isopropyliden-ß-D-allopyranosyl}purin

HON

DMTON

'»...„ I vNHBz

HOX^^X*_

X^"XhI > N^N » T O N«N

57 58

Man engte 600 mg (1.22 mmol) 57 aus 7.0 ml Pyridin ein und trocknete für

18 Std. am HV. Es wurde wieder in 5.8 ml Pyridin gelöst und unter Ar 620 al

(0.470 g, 3.61 mmol, 3 Eq) Ethyl-diisopropylamin und darauf 490 mg (1.45 mmol,

1.2 Eq ) 4,4'-Dimethoxy-triphenylchlormethan zugegeben und für 3.5 Std. bei RT

gerührt. Man entfernte am RV das Pyridin, engte nochmals aus 10 ml Toluol ein

und chromatographierte an 100 g Kieselgel mit Hexan : EtOAc = 2:1 (3.0 1),

gefolgt von Hexan : EtOAc = 1:1 (1.0 1) und EtOAc (1.5 1), was 791 mg (83%) 58 als

gelblichen, festen Schaum ergab.

Analytische Daten:


UV (CHCI3): 292 (15100)

IR (CHCI3): 3005m, 1710m, 1610s, 1590vs, 1510vs, 1485m, 1445s, 1395s,

1335s, 1300m, 1155w, 1120m, 1080s, 1035s, 835m

IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.41 (s, 3H, HsC-Ketal), 1.68 (s, 3H, H3C-Ketal), 3.06*

(d, J=5.0, IH, HO-C(4')), 3.38 (dd, J=4.8 10.1, IH, H-C(6')), 3.46 (dd, J= 4.1

9.9, IH, H-C(6')), 3.77, 3.78 (2s, je 3H, H3C-O), 4.05-4.10 (m, 2H, H-

C(4'/5')), 4.70 (dd, J=3.7 4.9, IH, H-C(3')), 4.74 (dd, J=4.9 8.3, IH, H-

C(2')), 4.85-4.93 (m, 2H, H-allyl-C(l")), 5.24 (ddd, J=1.3 2.7 10.4, IH, H-

allyl-C(3")), 5.41 (ddd, 1=1.5 3.1 17.2, IH, H-allyl-C(3")), 5.74 (d, J=8.4,

IH, H-C(l')), 6.09 (ddt, Jd=10.5 17.2 J,=5.7, IH, H-allyl-C(2")), 6.78-6.83

(m, 4H, H-C(arom.)), 7.18-7.32 (m, 7H, H-C(arom.)), 7.40-7.42 (m, 2H,

H-C(arom.)), 7.48-7.52 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.57-7.61 (m, IH, H-

C(arom.)), 7.98-8.00 (m, 3H, H-C(arom.), H-C(8)), 8.85* (s, IH, H-N(6))



"C-NMR (100 MHz, CDCI3): 26.0, 28.0 (2q, CH3-Ketal), 55.2 (q, CH3-O), 64.2 ((t,

C(allyl-C(2")/6')), 67.6 (d, C(172'/37475'), 68.8 (t, C(allyl-C(2")/6')),75.1, 75.4, 75.7,82.0 (4d, C(172737475'), 87.0 (s, O-C(DMT)), 111.3 (s,

C(CH3)2), 113.3 (d, C(arom.)), 118.2 (t, allyl-C(3")), 119.2 (s, C(5)), 127.0,

127.9,127.98,128.02,128.8,130.0,132.7,132.8 (8d, C(arom.), allyl-C(2")),

133.6, 135.4,135.5 (3s, C(arom.)), 139.7 (d, (C(8)), 144.3 (s, C(arom.)),

150.4 (s, C(4)), 154.4 (s, C(2)), 158.7 (s, C(arom.)), 161.3 (s, C(6)), 164.6 (s,

CO)

MS (FAB+, 3-NOBA): 801.2 ((M + 2H)+, 15.7), 800.2 ((M + 1)+, 29.4), 304.1

(32.2), 303.1 (100.0), 296.1 (381.2), 154.0 (41.4), 137.0 (29.0), 136.0 (31.4),

105.0 (34.4)

iL

X V

n ii -fl .i 1 -Vi L—1 r

90 80 70

~i 1 1 1 1 1 r

60 50 40

-I 1 1 1 1 1 1

2 0 10 0 0 ppm

Abbildung D9& 'H-NMR (400 MHz, CDCI3) von 58


NHBz

HO

Ö

D.9.9 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{4,-0-[(2-cyanoethoxy)(N,N-

diiso-propylamino)phosphino]-6'-0-[(4,4'-dimethoxytri-phenyl)-methyl]-2',3'-0-isopropyliden-ß-D-allopyranosyl}-purin

DMT? /=NDMT0

f=N

ytY —-XaiI v

^ °^> A°"v °^

57 59

Aus 10 ml Chloroform wurden 694 mg (780 nmol) 57 eingeengt. Man fügte 53.0

mg (435 umol) DMAP hinzu und trocknete für 15 Std. bei RT am HV. Man löste

in 7.2 ml CH3CN unter Ar und spritzte bei 0°C 600 ul (450 mg, 3.47 mmol, 4 Eq)

Ethyl-diisopropylamin und dann tropfenweise 230 ul (250 mg, 1.04 mmol, 1.2 Eq)

ß-Cyanoethoxy-(N,N-diisopropylamino)-chlorphosphin zu. Nach 45 min. wurde

in 170 ml EtOAc bei 0°C aufgenommen und einmal mit 15 ml 0.1 M

Kaliumphosphatpuffer (pH 7) und einmal mit 40 ml ges. NaCl bei 0°C

gewaschen, über Na2S04 getrocknet, bei 25°C eingeengt und an 110 g Kieselgel an

einer auf 0°C gekühlten Säule mit Hexan : EtOAc =1:1 + 1% N(Et)3 chromatogra¬

phiert. Man erhielt 785 mg (91%) 59 als leicht gelblichen, festen Schaum.

Analytische Daten:


UV (CH3CN): 293 (17400)

IR (CHCI3): 2970m, 1710m, 1610s, 1590vs, 1510vs, 1465s, 1395s, 1330s,

1300m, 1155w, 1120m, 1035vs, 980m, 880w, 835w

IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 0.95,1.12 (2d, J=6.8, 3H, CH3-(i-Pr)), 1.20 (d, J=6.8,

6H, CH3-(i-Pr)), 1.38,1.40,1.70, 1.71 (je s, 1.5H, CH3-Ketal), 2.22-2.36

(m, IH, H2C-CN), 2.63 (t, J=6.4, IH, H2C-CN), 3.20-3.38 (m, 2H, H-C(6'),

HC(CH3)2-(i-Pr)), 3.44-3.64 (m, 3H, H-C(6'), HC(CH3)2-(i-Pr), H2C-OP),

3.74-3.89 (m, IH, H2C-OP, und 4s je 1.5H H3C-O bei 3.746, 3.750, 3.76,

3.78), 4.16-4.20 (m, 1.5H, H-C(273'/475')), 4.43-4.49 (m, 0.5H, H-


C(2'/37475')), 4.67-4.71 (m, 1.5H, H-C(2' $ ,4* $)), 4.77-4.79 (m, 0.5H,

H-C(27374'/5')), 4.82-4.95 (m, 2H, H-allyl-C(l")), 5.22-5.27 (m, IH, H-

allyl-C(3")), 5.40 (ddd, J=1.3 3.1 17.2, 0.5H, H-allyl-C(3")), 5.41 (ddd,

J=1.3 3.1 17.2, 0.5H, H-allyl-C(3")) 5.80 (m (dubletoid), J=8.6, IH, H-

C(l')), 6.04-6.16 (m, IH, H-allyl-C(2")), 6.71-6.78 (m, 4H, H-C(arom.)),

7.10-7.23 (m, 3H, H-C(arom.)), 7.28-7.30 (m, 4H, H-C(arom.)), 7.39-7.42

(m, 2H, H-C(arom.)), 7.49-7.53 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.58-7.62 (m, IH,

H-C(arom.)), 7.99-8.01 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.05, 8.07 (2s, je 0.5H, H-

C(8)), 8.84 (s br., IH, H-N(6))

Abbildung D9.9: 'H-NMR (400 MHz, CDCIj) von 59

«C-NMR (100 MHz, CDC13): 20.2 (dt, Jcp=20.6, CH2-CN), 20.3 (dt, JCp=20.6, CH2-

CN), 20.56, 20.63, 20.7 (3q, CH3-(i-Pr)), 26.1, 26.3, 28.3, 28.4 (4q, CH3-

Ketal), 43.3,43.4 (2d, CH(CH3)2-(i-Pr)), 55.2, 55.3 (2q, CH3-O), 58.3 (dt,

JCp=35.2, CH2-OP), 58.4 (dt, JCp=35.2, CH2-OP), 62.6, 63.2 (2t, C(allyl-

C(2")/6')), 66.9 (dt, JCp=18.9, C(4')), 67.3 (dt, JCp=21.7, C(4')), 68.65,68,67

(2t, C(aUyl-C(2")/6')), 75.48,75.58,75.67, 75.69,75.82,76.49, 76.54, 76.61,

77.24, 82.1 (lOd, C(1727374'/5')), 86.13, 86.15 (2s, O-C(DMD), 110.0,

111.4 (2s, C(CH3)rKetal), 112.98,113,01 (d, C(arom.)), 117.6 (ds, Jcp=9.1,


31P-NMR

MS

CN), 118.0 (t, aUyl-C(3")), 119.2 (s, C(5)), 126.7,127.7,127.9,128.3,128.6,

128.8, 130.18, 130.22,130.38, 130.42, 132.7, 132.9 (12d, C(arom.), allyl-

C(2")), 133.7,135.76,135.82,135.95,135.97 (5s, C(arom.)), 139.53,139.65

(2d, C(8)), 144.5, 144.8 (2s, C(arom.)), 150.5 (s, C(4)), 154.4, 154.5 (2s,

C(2)), 158.45,158.53 (2s, C(arom.)), 161.3 (s, C(6)), 164.5 (s, C=0)

(162 MHz, CDCI3): 150.0,151.7

(FAB+, 3-NOBA): 1002.4 ((M + 2H)+, 5.1), 1001.4 ((M + H)+, 12.8).

1000.4 ((M)+, 18.5), 478.1 (12.3), 304.1 (37.8), 303.1 (100.0), 296.1 (22.1),

201.1 (46.4), 105.0 (38.7)

Jl_-1—1—1—

9.0 80

L_

X_r

UJAa.

X-CZF v

i. 11

f

JuV—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1

50 40 30 2.0 10 00 ppm

Abbildung D9.10:3,P-NMR (162 MHz, CDCI3) von 59


D.9.10 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6,-0-[(4,4,-dimethoxytriphenyl)-methyl]-2',3,-0-isopropyliden-4,-0-[5-(4-nitro-phenoxy-carbonyl)pentyl]-ß-D-allopyranosyl}purin

DMTON

X P "VN

57

DMT0y=N

1NHBz

0X^"X1 I p N*^N

62

Man trocknete 232 mg (600 nmol, 4 Eq) Adipinsäure-bis-(4-nitrophenyl)-esterund 19.6 mg (150 umol, 1 Eq) DMAP für 24 Std. bei RT am HV. Darauf löste man

bei 40°C in 3.3 ml Pyridin : THF = 1:2 unter Ar. Zu dieser Lösung spritzte man

119.8 mg (150 umol) 57, das zuvor am HV bei RT für 24 Std. getrocknet wurde,

gelöst in 840 ul Pyridin : THF = 1:2 und rührte bei 40°C unter Ar für 48 Std.. Man

engte am RV bei 25°C ein und koevaporierte mit 10 ml Toluol. Man löste in 1.5

ml CH2CI2 und trug auf 15 g Kieselgel, welches mit Hexan : EtOAc = 6:4

aequilibriert wurde auf und eluierte mit Hexan : EtOAc = 6:4 (500 ml), was 91.0

mg (58%) eines hellgelben amorphen Schaumes ergab 62.

Analytische Daten:

DC Rf = 0.15, (Kieselgel/EtOAc)IH-NMR (400 MHz, CDCI3): 1.36 (s, 3H, HäC-Ketal), 1.61-1.77 (m, 7H, H3C-Ketal,

H2C(Adipinsäureester, C(2'", 3'"))), 2.21 (dt, Jd=16.2 Jt=7.1, IH,

H2C(Adipinsäure-ester, C(4'"))), 2.34 (dt, Jd=16.3 Jt=7.0, IH,

H 2C(Adipinsäureester, C(4'"))), 2.59 (t, J=7.2, 2H,

H2C(Adipinsäureester, C(5"'))), 3.19 (dd, J=4.1 10.7, IH, H-C(6')), 3.40

(dd,J=2.110.6, IH, H-C(6')), 3.75 (s, 3H, H3C-O), 3.76 (s, 3H, H3C-O), 4.20


(ddd, J=2.3 4.0 10.0, IH, H-C(5')), 4.77 (dd, J=4.7 8.5, IH, H-C(2')), 4.83

(dd (tripletoid), J=4.4, IH, H-C(3')), 4.85-4.95 (m, 2H, H-allyl-C(l")),5.25 (ddd, J=1.2 2.6 10.4, IH, H-aUyl-C(3")), 5.42 (ddd, J=1.5 3.117.2, IH,

H-allyl-C(3")), 5.48 (dd J=4.0 10.0, IH, H-C(4')), 5.79 (d, J=8.5, IH, H-

C(l*)), 6.10 (ddt, Jd=10.417.2 Jt=5.7, IH, H-alIyl-C(2")), 6.75-6.79 (m, 4H,

H-C(arom.), 7.15-7.29 (m, 9H, H-C(arom.)), 7.36-7.39 (m, 2H, H-

C(arom.)), 7.50-7.54 (m, 2H, H-C(arom.)), 7.58-7.62 (m, IH, H-

C(arom.)), 7.99-8.02 (m, 2H, H-C(arom.)), 8.07 (s, IH, H-C(8)), 8.24-8.28

(m, 2H, H-C(arom.)), 8.85 (s, IH, H-N(6))

LdQ —U UUL_J L.

r

i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i—i

90 80 70 80 50 40 30 20 10 00 ppm

Abbildung D9.ll: 'H-NMR(400MHz,CDCfe) von 62

«C-NMR (100 MHz, CDCI3): 23.97, 24.01 (2t, C-(Adipinsäure, 3'", 4'")), 26.1, 28.1

(2q, CH3-Ketal), 33.5, 33.8 (2t, Adipinsäure, 2'", 5'")), 55.2 (q, CH3-O),

62.1 (t, C(allyl-C(2")/6')), 66.3 (d, CÜ72737475')), 68.7 (t, C(allyl-

C(2")/6')), 73.4, 74.7, 75.5, 82.1 (4d, C(17273'/475'), 86.1 (s, O-

C(DMT)), 111.6 (s, C(CH3)2), 113.1 (d, C(arom.)), 118.1 (t, allyl-C(3")),119.2 (s, C(5)), 122.4,125.2,126.9,127.8,127.9,128.2,128.9,130.1,132.7,

132.9 (lOd, C(arom.), allyl-C(2")), 133.6, 135.6, 135.7 (3s, C(arom.)),

139.5 (d, C(8)), 144.4,145.4 (2s, C(arom.)), 150.5 (s, (C(4)), 154.4 (s, C(2)),


158.5 (s, C(arom.)), 161.3 (s, C(6)), 164.6 (s, C=0 (Benzoyl)), 170.7,171.9

(2s, C=0 (Adipinsäureester))

D.9.11 2-Allyloxy-6-(benzamido)-9-{6,-0-[(4/4,-dimethoxytriphenyl)-

methyl]-2V3*-0-isopropyliden-4M>[5-(CPG-amido)pentyl]-ß-D-allopyranosyl}purin

DMT0/=N

1NHBz

nI I O N^N

I I p N^N

/=N,'

NHBz

I^N^^k.0^ "T^63

In 1.15 ml DMF, 72 ul (52.6 mg, 51.9 umol) N(Et)3 und 7.2 ul (7.1 mg, 89 nmol)

Pyridin wurden 300 mg CPG suspendiert. Dazu spritzt man 91.0 mg (86.6 umol)

62, das zuvor für 14 Std am HV bei RT getrocknet wurde, gelöst in 500 ul THF

und liess unter gelegentlichem Umschwenken 5.5 Tage stehen. Die Suspension

wurde abfiltriert und mit 10 ml DMF, 15 ml MeOH und 15 ml Ether gewaschen.Das CPG wurde in 1.5 ml Pyridin suspendiert und unter Ar mit 6.0 mg DMAP

(49 umol) und 75 ul (81 mg, 790 umol) Essigsaureanhydrid versetzt und für 1 Std.

unter gelegentlichem Schwenken stehen gelassen. Nach Abfiltrieren und

Waschen mit 20 ml MeOH und 15 ml Ether erhielt man 277 mg mit dem

geschützten Allo-iso-Guanosin Nucleosid derivatisiertes CPG 63 mit einer

Beladungsdichte von 25.0 umol/g CPG.


D.9.12 9-(ß-D-AUopyranosyl)isoguanin

HON

I OH N^NHO TT

Cl

51

/=t

I OH N^,N ^^

xX)

HON

H0^YVH!1 OH HN^,N

HO V

O

65

Man rührte 10 ml Benzylalkohol und 231.6 mg (10.1 mmol) Natrium für 45

min. bei 65°C, bis die Benzylatbildung abgeschlossen war. Darauf wurde 504mg

(1.52 mmol) 51 zugegeben und für 3.5 Std. bei 65°C gerührt. Man trug das ganze

Reaktionsgemisch auf 60 g Kieselgel, das zuvor mit CHCI3: MeOH = 9:1

equilibriert worden war, auf und eluierte mit CHCI3: MeOH = 9:1 (300 ml),

CHCI3: MeOH = 4:1 (500 ml), CHCI3: MeOH = 2:1 (250 ml) und MeOH (150 ml),

was nach Trocknen am HV bei RT für 16 Std. 106 mg 64 ergab.

Man suspendierte 66.7 mg Pd/C in 10 ml H2O : EtOH = 1:5, evakuierte am

Hausvakuum und füllte den Kolben mit Argon. Dieses Vorgehen wurde drei

Mal wiederholt. Darauf wurde drei Mal evakuiert und der Kolben mit H2 gefüllt.Zu diesem aktivierten Katalysator gab man 100 mg (255 nmol) 64, gelöst in 2.5 ml

H20 : EtOH = 1:5 und rührte für 3 Std. bei RT unter H2. Man filtrierte durch

Cellite, wusch mit 20 ml H2O : EtOH =1:5 nach und engte am RV ein. Der

Rückstand wurde in 35 ml MeOH gelöst, wieder auf 15 ml eingeengt und bei 2°C

für 16 Std. auskristallisieren gelassen. Abzentrifugieren des Präzipitats lieferte

10.8 mg (2% über beide Stufen) DC und *H-NMR reines 65, das noch 4.5 Eq H20

enthielt.


Anlytische Daten:

DC

UV

IR

IH-NMR

«C-NMR

Rf = 0.42, (Kieselgel/n-BuOH: H20: AcOH = 5:3:1)

(150 mM NaCl, 10 mM TrisHCl, pH 7): 246 (9600), 292 (11600), 230

(4200), 240 (7700), 250 (8900), 260 (4200), 270 (3800), 280 (7700), 290

(11250), 300 (9300), 310 (2500)

(KBr): 3600-2500vs, 1680 vs, 1620vs, 1530s, 1480m, 1400s, 1220m, 1110s,

990vs, 920w, 820w, 770w, 690w

(400 MHz, DMSO-d6): 3.45 (d, J=6.4,2H, H-C(6')), 3.64-3.72 (m, 2H, H-

C(4'/5')), 4.00-4.01 (m, 2H, H-C(2'/3')), 4.54* (br., IH, HO-C(6')), 4.83*

(br. IH, HO-C(4')), 5.08* (br., IH, HO-C(2')), 5.18* (br., IH, HO-C(3')),

5.52 (d, J=9.4, IH, H-C(l')), 7.66 (br., 2H, H-N(6)), 7.92 (s, IH, H-C(8))

(100 MHz, DMSO-d6): 60.9 (t, C(6')), 67.0, 68.5, 71.4 (3d, C(273'/4'))

76.2, 78.5 (d, C(l'/5')), Die 13C-Signale der Base erschienen nur als

sehr bereiter Peak um 137 ppm

i i i i i i

120 110 100

W

i '-".

T HU*"

I I 1 I I I I I I I I I I I I I 1 I I I I

90 80 70 60 50 40 30 20 10 00 ppm

Abbildung D9.12: 'H-NMR (400 MHz, DMSO-d') von 65

min.

0-30

von

ist,

angegeben

anderes

nicht

wenn

immer,

gelt

enGradienten

angegebenen

Die

1

iOnCL-

3CCTQ

nnXo

n>

N=10900

min.

20.9/0.2B)

(8-26%

B)

(27-45%

DEAE

d(AT)6

1—1

tuer

N=770

min.

13.9/0.5B)

(7-25%

N=830

min.

20.2/0.7

B)

(15-35%

B)

(25-45%

DEAE

d(AT)s

HN=1640

min.

16.2/0.4B)

(7-25%

N=610

min.

19.8/0.8

B)

(15-35%

B)

(20-40%

DEAE

d(AT)4

Qu

o

N=6800

min.

24.8/0.3B)

(5-20%

N=460

min.

17.2/0.8

B)

(10-30%

B)

(15-35%

DEAE

d(AT)j

>—i

C3

5')

für

B95%

1'in

B60-95%

22'

in

B(50-60%

B)

(8-26%

RP-300

Aquapore

d(AC)6

N=480

min.

10.9/0.5B)

(7-25%

N=780

min.

25.1/0.9

B)

(40-60%

B)

(8-26%

RP-300

Aquapore

d(AC)5

N=1120

min.

13.4/0.4B)

(7-24%

N=780

min.

25.1/0.9

B)

(25-45%

B)

(7-25%

RP-300

Aquapore

d(AC)4

N=2500

min.

20.0/0.4B)

(6-24%

N=2680

min.

20.7/0.4

B)

(20-40%

B)

(6-24%

RP-300

Aquapore

d(AC)3

um1

C-18,10

Ä,

300

Sphe

riso

rbKo

ntro

llin

jekt

ion

RP-3001

Aquapore

tion

Kont

roll

inje

k¬Q1

Mono

tion

Kontrollinjek¬

Nucleogen1

DEAE

tion

Kont

roll

inje

k¬

min.)1

30

in

(Gradient

Trennung

präp

.Substanz

N=940

min.

9.2/0.3

B)

(12-20%

N=1070

min.

26.2/0.8

B)(12-32%

B)(12-32%

DEAE

d(AGTATGTD

N=860

min.

17.5/0.6

B)(15-32%

B)

(25-45%

DEAE

d(AACATACT)

N=1050

min.

19.4/0.6

B)

(22-37%

B)

(25-40%Q

Mono

d(CA)s

N=950

min.

21.6/0.7

B)

(17-32%

35')

in

B(17-32%Q

Mono

d(CA)s

N=940

min.

18.4

/0.6

B)

(15-30%

B)

(18-38%

DEAE

d(CA)4

N=3060

min.

16.6/0.3B)

(6-24%

N=2870

min.

21.4/0.4

B)(20-40%

B)

(6-24%

RP-300

Aquapore

d(CA)3

N=5400

min.

29.4/0.4B)

(7-25%

N=770

min.

24.9/0.9

B)(25-45%

B)(25-45%

DEAE

d(AU)6

N=2760

min.

21.0/0.4B)

(7-25%

N=670

min.

20.7/0.8

B)

(25-45%

B)(25-45%

DEAE

d(AU)5

N=720

min.

13.4/0.5B)

(7-25%

N=370

min.

13.4/0.7

B)(25-45%

B)

(25-45%

DEAE

d(AU)4

N=640

min.

15.2/0.6

B)(15-35%

B)(15-35%

DEAE

d(AU)3

N=1430

min.

15.1/0.4

B)

(10-28%

N=80

min.

12.4/1.4

B)(25-45%

B)

(10-28%

RP-300

AquaporeB)

(40-60%

DEAE

dd(AC)5

N=2740

min.

15.7/0.3B)

(8-26%

N=560

min.

9.5/0.4

B)

(20-40%

B)

(33-53%

DEAE

dd(AC)4

N=3890

min.

18.7/0.3

B)

(20-40%

B)

(7-25%

RP-300

Aquapore

dd(AC)3

N=1600

min.

16.0/0.4

B)

(10-28%

min.

26.5/0.9

5')

in

B95-100%

10*

in

B60-95%

20'

in

B(40-60%

5')

in

B95-100%

10'

in

B60-95%

20"

in

B(40-60%

DEAE

B)

(10-28%

RP-300

Aquapore

dd(AsC5)

N=3080

min.

22.2/0.4B)

(8-26%

N=2300

min.

24.0/0.5B)

(8-26%

N=730

min.

24.3/0.9

B)

(28-58%

B)

(8-26%

Spherisorb

ddtAtQ)

N=6030

min.

23.3/0.3B)

(0-20%

N=18500

min.

27.2/0.2B)

(0-20%

B)

(0-20%

Spherisorb

dd(T6)

N=6170

min.

31.3/0.4B)

(0-20%

B)(0-20%

Spherisorb

dd(A«)

N=850

min.

26.2/0.9

B)(12-32%

B)

(12-32%

DEAE

dOTGTATGA)

N=990

min.

37.8/1.2

45')

in

B(10-25%

N=1200

min.

49.0/1.4

30')

in

B15-45%

15'

in

B(0-25%

B)

(40-60%

DEAE

dd(AU)«

N=8600

27.8/0.3

B)

(10-25%

45")

in

B(10-25%

RP-300

dd(AU)5

N=7600

min.

26.2/0.3

B)

(10-20%

B)

(10-20%

RP-300

dd(AU)4

N=8300

min.

27.3/0.3B)

(5-20%

N=4600

min.

20.4/0.3

B)(10-20%

B)

(10-20%

DEAE

dd(AU)3

N=3100

min

16.7/0.3

B)

(12-30%

N=680

min.

18.2/0.7

45')

in

B(35-55%

45')

in

B(30-57%Q

Mono

dd(AT)t

B)

(31-51%

DEAE

dd(AT)5

N=5700

min.

30.2/0.4

B)

(10-28%

B)

(22-42%

DEAE

dd(AT)4

N=6400

min.

32.0/0.4B)

(8-26%

B)

(16-36%

DEAE

dd(AT)3

N=1010

min.

12.7/0.4

B)

(12-30%

N=870

min.

29.5/1.0

5')

für

B95%

1'in

B60-95%

22'

in

B(50-60%

B)

(12-30%

RP-300

AquaporeB)

(50-70%

DEAE

dd(AC)«

N=3200

min.

22.8/0.4

B)

(12-20%

B)

(12-32%

DEAE

dd(AACATACT)

N=740

min.

19.1/0.7B)

(8-26%

N=460

min.

23.6/1.1

5')

in

B95-100%

10'

in

B60-95%

20'

in

B(40-60%

5')

in

B95-100%

10'

in

B60-95%

20'

in

B(40-60%

DEAE

dd(AACCCAAAA)

N=3080

min.

22.2/0.4B)

(8-26%

N=1180

min.

24.0/0.7

5')

in

B95-100%

10'

in

B60-95%

20'

in

B(40-60%

5')

in

B95-100%

10'

in

B60-95%

20'

in

B(40-60%

DEAE

dd(AAAACCCAA)

min.

tR=37

B)

(7-25%

9')

für

B95%

5'in

B60-95%

20'

in

B(50-60%

DEAE

B)

(12-30%

RP-300

Aquapore

dd(CA)6

N=4440

min.

20.0/0.3B)

(8-26%

N=220

min.

29.6/2.0

B)

(15-35%

B)

(30-50%

DEAE

dd(CA)5

N=3760

min.

18.4/0.3B)

(7-25%

N=470

min.

19.6/0.9

B)

(15-35%

B)

(28-48%

DEAE

dd(CA)4

N=2050

min.

18.1/0.4B)

(7-25%

N=1330

min.

21.9/0.6

B)

(20-40%

B)

(20-40%

DEAE

dd(CA)3

N=14600

min.

24.2/0.2B)

(4-32%

N=6830

min.

24.8/0.3

B)

(10-30%

N=3140

min.

16.8/0.3B)

(0-90%

B)

(4-32%

Spherisorb

dd(7CHA3-A3)

N=5700

min.

15.1/0.2B)

(0-20%

N=250

min.

18.9/1.2

B)(14-80%

25')

in

B10-17%

5'in

B(0-10%

RP-300

Aquapore

dd(7CHAj-A)

N=8400

min.

27.5/0.3B)

(0-25%

B)(5-25%

Sphe

riso

rbdd(aT-aA)3

N=7200

min.

25.5/0.3B)

(0-25%

B)

(5-25%

Sphe

riso

rbdd(aTs)

N=4900

min.

35.0/0.5

45')

in

B(0-25%

45')

in

B(5-25%

RP-300

Aquapore

dd(oA6>

N=7500

min.

34.6/0.4

45')

in

B(5-25%

40')

in

B(5-25%

RP-300

Aquapore

dd(oA5)

B)

(20-60%Q

Mono

ddttTGATGA)

B)

(20-60%Q

Mono

dd(AGTAGTD

B)

(20-50%Q

Mono

dd(AACTACD

N=4500

min.

20.2/0.3

B)

(12-20%

N=870

min.

23.6/0.8

B)(12-32%

B)

(12-32%

DEAE

ddOTGTATGA)

N=4800

min.

20.8/0.3

B)

(12-20%

N=650

min.

25.4/1.0

B)(12-32%

B)

(12-32%

DEAE

dd(AGTATGTT)

Keta

lspa

ltun

gNach

2

Ammonolyse

und

Allylentschützung

Nach

1

N=1750

min.

16.7/0.4B)

(0-25%

N=1200

min.

13.9/0.4B)

(0-25%

N=3300

min.

23.0/0.4

B)(15-55%

B)

(0-25%

Spherisorb

2

B)

(0-30%

Spherisorb

1al

lo(G

I)4

N=3140

min.

16.8/0.3B)

(0-25%

N=2180

min.

14.0/0.3B)

(0-25%

N=1470

min.

23.0/0.6

B)

(15-55%

B)

(0-25%

Spherisorb

2

B)

(0-30%

Spherisorb

1allo(G

4l4)

N=590

min.

14.6/0.6B)

(0-25%

Zersetzung

N=390

min.

23.7/1.2

B)

(20-45%

B)

(0-25%

Spherisorb

2

B)

(0-30%

Spherisorb

1al

lo(I

g)

N=1330

min.

14.6/=0.4B)

(0-25%

N=660

min.

12.8/0.5B)

(0-25%

N=1460

min.

15.3/0.4

B)

(15-55%

B)

(0-28%

Spherisorb

2

B)

(0-28%

Spherisorb

1al

lo(I

6)

N=5040

min.

21.3/0.3B)

(4-32%

N=2120

min.

13.8/0.3

B)

(15-30%

N=3250

min.

22.8/0.4B)

(0-90%

B)

(4-32%

Spherisorb

dd(7A-G)3

N=5530

min.

22.3/0.3B)

(8-26%

N=4270

min.

19.6/0.3B)

(0-90%

B)

(8-26%

Sphe

riso

rbdd(7CHA-C)6

N=6120

min.

31.3/0.4B)

(0-20%

B)

(0-20%

Spherisorb

dd(7CHA-A)3

S.H•iff*§E3n>33.

TJxn

I&1

N=6080

min.

15.6/0.2B)

(0-27%

N=3480

min.

12.4/0.2B)

(0-27%

N=5930

min.

15.4/0.2

B)(0-30%

N=4030

min.

12.7/0.2B)

(0-27%

N=540

min.

16.2/0.7

B)

(20-45%

N=710

min.

16.0/0.6

B)

(20-45%

B)

(0-27%

Spherisorb

2

B)

(0-27%

Spherisorb

1

B)

(0-30%

Spherisorb

2

B)

(0-30%

Spherisorb

1

alloÜTGIGG)

aüo(GGIGII)

T3

4.0

pH

AcONa,

mM

10

NaCl,

mM

2150

35

pH

AcONa,

mM

10

NaCl,

mM

!l50

»«

nm)

260

H,

%-

uM,

(73

-

d(CA)5

ög

nm)

260

H,

%-

|iM,

(120

-

d(CA)4

nm)

260

H,

%-

uM,

(100

-

d(CA)3

-5.6

aG°

-46.9,

TaS

AS-158,

AH-52.5,

nm)

260

H,

30%

uM,

(63

24°C

d(AU)6

9*

nm)

260

H,

30%

uM,

(125

16°C

d(AU)5

nm)

260

H,

%-

uM,

(100

<10°C

d(AU)4

n3

sr

önm)

260

H,

%-

uM,

(140

<0°C

d(AU)3

3ff*»

-6.7

AG0

-58.5,

TaS

-200

,AS

-65.2,

AH

nm)

260

H,

35%

uM,

(74

29°C

d(AT)6

nm)

260

H,

30%

uM,

(83

23°C

d(AT)s

nm)

260

H,

25%

uM,

(127

17°C

d(AT)4

nO

nm)

260

H,

%-

uM,

(58

<0°C

d(AT)3

srsRHM•

nm)

260

H,

%-

uM,

(43.3

-PH4.02:

nm)

260

H,

%-

uM,

(6.7

-PH3.51:

nm)

260

H,

%-

uM,

(8.4

-

7.0:

pH

d(AC)6

0nm)

260

H,

%-

uM,

(8.5

-

d(AC)s

nm)

260

H,

-%

uM,

(8.3

-

d(AC)4

nm)

260

H,

-%

uM,

(9.1

-

d(AC)3

Temp

.[°C

]/conc,

(Wel

lenl

änge

)

Molton-1]

[grad

(0)

CD-Daten

[calK-lmol-1]

AS[kca

lmol

"!],aG°(25°C)

TaS,

AH,

Daten

Thermodynamische

Wellenlänge)Hyperchrom.,

%(conc,

Tm

Schmelzdaten

Substanz

nm)

260

H,

14%

uM,

(8.4

20°C

dd(AC)5

nm)

260

H,

%-

üM,

(11.

1<20°C

dd(AC)4

nm)

260

H,

%-

uM,

(6.6

<0°C

dd(AC)3

288(281)

-168(257)/7.8uM,5°C

nm)

260

H,

8%

fiM,

(7.2

35°C

dd(A5C5)

(277

)+152

-127(254)/8.6uM,5°C

nm)

262

H,

5%

uM,

(10.3

16°C

ddtAjC,)

nm)

260

H,

%-

uM,

(12

-

dd(T6)

(276

)+273

-185(252)/13.8uM,5°C

-9.2

AG

-30.2,

TaS

-101

,aS

-39.4,

AH

nm)

260

H,

7%

uM,

(9.5

43°C

dd(A«)

nm)

260

H,

%-

uM,

5.5

(je

-

ddOTGTATGA)+

d(AACATACT)

nm)

260

H,

%-

uM,

4.5

(je

-

dd(AGTATGTD+

d(AACATACT)

nm)

260

H,

%-

uM,

4.6

(je

-

dfTTGTATGA)

+d(AACATACT)

-7.7

AG°

-43.6,

TaS

-146

,AS

-51.3,

AH

nm)

260

H,

25%

uM,

5.0

(je

22°C

d(AGTATGTD

+d(AACATACT)

nm)

260

H,

%-

uM,

(10.2

-dCTTGTATGA)

nm)

260

H,

%-

uM,

(9.2

-

d(AGTATGTT)

nm)

260

H,

%-

UM,

(8.9

-d(AACATACT)

nm)

260

H,

%-

[iM,

(76

-

d(CA)6

9.0

pH

Tris-HCl,

mM

10

NaQ,

mM

6150

8.0

pH

Tris-HCl,

mM

10

NaQ,

mM

5150

6.0

pH

NaCacodylat,

mM

10

NaCl,

mM

4150

5.0

pH

AcONa,

mM

10

NaCl,

mM

3150

4.0

pH

AcONa,

mM

10

NaQ,

mM

2150

35

pH

NaFormiat,

mM

10

NaQ,

mM

H50

-10.1

aG°

-41.

1,TaS

-138,

aS

-51.

2,aH

nm)

260

H,

20%

UM,

(80

54°C

dd(AU)6

nm)

260

H,

20%

uM,

(78

43°C

dd(AU)5

nm)

260

H,

20%

UM,

(97

32°C

dd(AU)4

nm)

260

H,

20%

uM,

(153

20°C

dd(AU)3

-13.0

AG°

-47.

3,TaS

-159,

AS

-60.3,

AH

nm)

260

H,

25%

uM,

(53

67°C

dd(AT)«

nm)

260

H,

24%

uM,

(66

56°C

dd(AT)5

nm)

260

H,

24%

uM,

(100

45°C

dd(AT)4

nm)

260

H,

20%

UM,

(51

26°C

dd(AT)3

(272

)-246(2

53)

-72

-264(228)/7.2uM,5°C

-7.8

AG°

-53.3,

TAS

-180,

AS

-61.

6,AH

nm)

260

H,

11%

uM,

(8.1

31°C

PH9.06:

nm)

260

H,

13%

uM,

(8.1

28°C

pH&O5:

nm)

260

H,

13%

uM,

(8.1

28°C7.

0:pH

nm)

260

H,

12%

UM,

(7.7

28°C

pHÖ.O4:

nm)

260

H,

11%

jiM,

(7.2

23°C

PH5.03:

nm)

260

H',

"19%

uM,

(3.4

-PH4.02:

nm)

260

H",

'50%

uM,

(5.4

-PH3.51:

dd(AC)6

MNaQ)

1.5

nm,

260

H,

%-

uM,

(14.3

-

nm)

260

H,

%-

uM,

(7.3

-

dd(aT-aA)3

nm)

260

H,

%-

uM,

(8.8

-

dd(ccA6)

nm)

260

uM,-%H,

(11.5

-

dd(aAs)

nm)

260

H,

%-

uM,

5.0

(je

-

ddOTGATGA)

+dd(AACTACT)

nm)

260

H,

18%

uM,

5.0

(je

42°C

dd(AGTAGTD

+dd(AACTACD

260nm)

H,

15%

uM,

(9.7

20°C

ddOTGATGA)

nm)

260

H,

6%

uM,

(9.3

17°C

dd(AGTAGTT)

nm)

260

H,

%-

uM,

(10.

1-

dd(AACTACD

nm)

260

H,

18%

uM,

4.8

(je

38°C

ddOTGTATGA)

+dd(AACATACT)

-10.8

AG°

-31.6,

TaS

-106,

AS

-42.4,

AH

nm)

260

H,

19%

uM,

4.8

(je

48°C

dd(AGTATGTT)

+dd(AACATACT)

nm)

260

H,

%-

uM,

(8.9

-ddOTGTATGA)

nm)

260

H,

%-

uM,

(9.2

-dd(AGTATGTT)

-357(274)/12.1uM,5°C

nm)

260

H,

14%

uM,

(8.9

20°C

dd(AACATACT)

+60(277)

-127(255)/je5.3uM,5°C

nm)

260

H,

9%

uM,

5.1

(je

28°C

dd(AACCCAAAA)

+dd(AAAACCCAA)

(279

)+94

-309(255)/6.8uM,5°C

nm)

260

H,

%-

uM,

(9.6

<20°C

dd(AACCCAAAA)

(282

)+92

-184(257)/10.7uM,5°C

nm)

260

H,

%-

uM,

(9.4

<20°C

dd(AAAACCCAA)

-7.9

aG°

-45.1,

TaS

-151,

AS

-53.0,

AH

nm)

260

H,

16%

uM,

(8.3

29°C

dd(CA)6

nm)

260

H,

16%

uM,

(8.1

19°C

dd(CA)5

nm)

260

H,

%-

uM,

(6.4

<20°C

dd(CA)4

nm)

260

H,

%-

uM,

(6.3

<0°C

dd(CA)3

(312

)+90

(292

)-390

5°C

uM,

(258

)/6.

1+49

nm)

292

H,

18%

uM,

(8.7

29°C

allo(Ig)

nm)

292

H,

30%

uM,

(12.7

15°C

allo(I6)

-85(253)/je5.0uM,75°C

-68(283)

(278

)-48

55°C

uM,

5.0

/je

(247

)-116

(298

)+34

(283

)-17

(271

)+24

-174(252)/je5.0uM,3°C

reversibel

nm)

265

H,

7/6%

uM,

6.0

(je

21°/63°C

dd(I

6)+

dd(G6)

+dd(7CHA)s-A

-66(286)

(268

)-10

-71(232)/10.0uM,5°C

nm)

260

H,

%-

uM,

(14.4

<20°C

dd(7^"A-G)3

nm)

260

H,

%-

uM,

(8.0

-

dd(7CHA-C)s

-87(260)/23.3uM,5°C

nm)

260

H,

5%

uM,

(140

18°C

dd(7A-A)3

(208

)+117

(255

)-160

uM

(283)/19.0

62

+nm)

260

H,

3%

uM,

(17

32°C

dd(7tHA3-A3)

(290

)-141(2

44)

-22

5°C

uM,

11.7

(223

)/je

-177

nm)

260

H,

26%

uM,

8.8

(je

23°C

ddOe)

+dd(7A5-A)

(286

)+105

5°C

uM,

12.9

(261

)/je

-158

nm)

260

H,

5%

uM,

7.0

(je

44°C

dd(Aj)

+dd(7A5-A)

(280

)-74

(240

)-13

-61(215)/13.1uM,5°C

nm)

260

H,

%-

uM,

(18.8

-

dd(7CHA5-A)

nm)

260

H,

%-

uM,

5(j

e-

dd(ßT6)

+dd(aA6)

nm)

260

H,

%-

uM,

10

(je

-

dd(aT6)

+dd(oA«)

3.82

pH

NaCitrat,

mM

10

NaQ,

mM

J150

(302

)-175

3°C

uM,

4.6

/je

(264)

+65

nm)

248

H,

%-

uM,

4.1

(je

8°C

allo(IIGIGG)+

allo(GGIGII)

(303

)-199

3°C

uM,

(264

)/9.

1+65

nm)

248

H,

%-

uM,

(9.4

-5°C

alloüTGIGG)

(302)

-174

3°C

uM,

(264)/9.1

+41

nm)

248

H,

%-

UM,

(9.6

8°C

aUo(GGIGID

(304

)-75

(260

)+49

-27(240)/10.0uM,5°C

nm)

270

H,

20%

uM,

(9.6

17°C

allo

(GI)

4

(302

)-411

(268)

+159

-56(248)/9.9uM,5°C

PH3.

821:

(304

)-381

(267)

+110(2

50)

-38

5°C

uM,

(234)/9.8

+34

nm)

250

H.,

26%

uM,

(9.0

547°C

PH3.821:

0.5°C/min.)

nm,

250

H,

-58%

uM,

(10.

129.6°C

Hybridisieren:

nm,0.5°C/min.)

250

H,

58%

uM,

(10.1

40°C

Schmelzen:

allo

(G4I

4)

nm)

250

H,

-35%

uM,

3.64

OTotalkonz.

36°C

Hybr

idis

iere

n:

nm)

250

H,

12/8%

uM,

3.64

(Totalkonz.

39/81°C

Schmelzen:

l:2

=aUo(Ig)

+al

lo(G8)

nm)

250

H,

-23%

uM,

3.64

(Totalkonz.

37°C

Hybr

idis

iere

n:

nm)

250

H,

3/20%

uM,

3.64

(Totalkonz.

-/82°C

Schmelzen:

aüo(I»)=2:l

+allo(G

g)

(291

)-212

+34(265)/jel.3uM,55°C

(290

)-327

5°C

uM,

1.3

(264

)/je

+92

nm)

250

H,

39%

-

uM,

1.94

(je

35°C

Hybr

idis

iere

n:

nm)

250

H,

11/20%

uM,

1.94

(je

36/82°C

Schmelzen:

1:1

=allodg)

+al

lo(G

8)


D.12 Bemerkungen zur Nomenklatur

7-Carbaadenin wird von anderen Autoren (z.B. Seela) als 7-Deazaadenin

bezeichnet. Seela benutzte auch häufig, neben der Purinnomenklatur, die auch

von Davoll verwendete systematische Nomenklatur, die sich neben der

Namensgebung vor allem auch in der Numerierung der Ringatome

unterscheidet:

Purinnomenklatur systematische Nomenklatur

(Pyrrolo[2,3-d]pyrimidin)

Die in dieser Arbeit verwendete Nomenklatur hält sich an die von der RJPAC-

IUB Komission empfohlenen Richtlinien [101], [102], [103].

-254-

E Literaturverzeichnis

[I] J. Or6, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1960, 2, 407; J. Orö, A.P.

Kimball, Arch. Biochem. Biophys., 1961,94, 217

[2] A. Kornberg, DNA Replication, W.H. Freeman and Company, San

Francisco, 1980

[3] S.L. Miller, Science, 1953,117,528; S.L. Miller, J. Am. Chem. Soc, 1955, 77,

2351

[4] A. Butlerow, Liebigs Ann. Chemie, 1861,120,295; A. Butlerow, C. R. Hebd.

S6ances Acad. Sei., 1861,53,145

[5] E. Fischer, Chem. Ber. 1888, 21, 988; E. Fischer, E. Passmore, Chem. Ben,

1889,22,359; E. Fischer, Chem. Ber., 1890,23,370

[6] C. Strupp, 'Untersuchungen über die niehtenzymatische Simulation des

Biosyntheseweges zu Riboflavin', Diss. ETH Nr. 9832,1992

[7] Y.-B. Xiang, 'Beiträge zur Chemie der a-Aminonitrile', Diss. ETH Nr.

7993,1986

[8] U.P. Trinks, 'Zur Chemie der Aminopyrimidine', Diss. ETH Nr. 8368,

1987

[9] K. Koch, Diss. ETH, in Vorbereitung

[10] S. Drenkard, 'Zur Chemie von 2-Amionpropennitril und Aziridin-2-

carbonitril', Diss. ETH Nr. 9362,1991

[II] S. Drenkard, J. Ferris, A. Eschenmoser, Helv. Chim. Acta, 1990, 73,1373

[12] J. Guck, 'Zur Chemie des Aziridin-2-carbonitril', Diss. ETH Nr. 9027,1989

[13] E. Wagner, Y.-B. Xiang, K. Baumann, J. Guck, A. Eschenmoser, Helv.

Chim. Acta, 1990,73,1391

[14] D. Müller, S. Pitsch, A. Kittaka, E. Wagner, C. E. Wintner, A.

Eschenmoser, Helv. Chim. Acta, 1990, 73,1410

[15] D. Müller, 'Aldomerisierung von Glykolaldehydphosphat zu

racemischen Hexose-2,4,6-triphosphaten', Diss. ETH Nr. 9280,1990

[16] S. Pitsch, Diss. ETH, in Vorbereitung

[17] A. Eschenmoser, Nova acta Leopoldina, 1992, 281, 201

[18] M.P. Böhringer, 'Synthese und strukturelle Charakterisierung von

Adenin-Oligonucleotiden mit 2,3-Dideoxy-D- und -L-Glucopyranosen als

Zuckereinheiten', Diss. ETH Nr. 9377,1991

[19] A. Eschenmoser, M. Dobler, Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 218

-255- Literaturverzeichnis

[20] C. Leumann, Postdoc Bericht, ETH Zürich, 1986

[21] H.-J. Roth, 'Homo-DNS: Herstellung, Paarungseigenschaften und

Struktur von Adenin-/Thymin-haltigen Oligonukleotiden, Diss. ETH Nr.

9591,1991

[22] J. Hunziker, 'Homo-DNA: Herstellung und Paarungseigenschaften von

guaninhaltigen Oligonucleotiden', Diss. ETH Nr. 9814,1992

[23] J.D. Watson, F.H. Crick, Nature, 1953,171,737

[24] M. Hofer, Chem. Ber., 1960,93, 2777

[25] G.E. Hubert, T.B. Johnson, J. Am. Chem. Soc., 1930,52,4489

[26] B.R. Baker, R.E. Schaub, J.P. Joseph, J.H. Williams, J. Am. Chem. Soc,

1955,77,12

[27] T. Nishimura, B. Shimizu, I. Iwai, Chem. Pharm. Bull., 1963, 11, 1479; L.

Birkhofer, A. Ritter, H.-P. Kühlthau, Chem. Ber. 1964, 97, 934; E.

Wittenburg, Chem. Ber., 1968,101,1095

[28] H. Vorbrüggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber., 1981, 1234; H.

Vorbrüggen, G. Höfle, Chem. Ber., 1981, 114, 1256; H. Vorbrüggen, B.

Bennua, Chem. Ber., 1981,114,1279

[29] R.J. Ferrier, N. Prasad, J. Chem. Soc. (C), 1969,570

[30] M. Smith, D.H. Rammler, LH. Goldberg, H.G. Khorana, J. Am. Chem.

Soc., 1962,84,430

[31] M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 1980, 21, 3243; M.D.

Matteucci, M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc, 1981, 103, 3185; S.L.

Beaucage, M.D. Matteucci, Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859; L.J. McBride,

M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett., 1983, 24, 245

[32] R.L. Letsinger, J.L. Finnan, G.A. Heavner, W.B. Lunsford, J. Am. Chem.

Soc, 1975, 97, 3278; R.L. Letsinger, W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc, 1976,

98,3655

[33] M.J. Gait, 'Oligonucleotide Synthesis - a practical approach', IRL Press,

Oxford, Washington, 1985

[34] N.D. Sinha, J. Biernat, H. Köster, Tetrahedron Lett., 1983, 24, 5843; N. D.

Sinha, J. Biernat, J. McManus, H. Köster, Nucleic Acids Res., 1984,12,4539

[35] H. Nishimura, K. Katagiri, K. Sato, M. Mayama, N. Shimaoka, J. Antibiot.,

1956,9 A, 60

[36] R.L. Tolman, R.K. Robins, L.B. Townsend, J. Am. Chem. Soc, 1969, 91,

2102

[37] J. Davoll, J. Chem. Soc, 1960,131


[38] R. K. Ness, in W. W. Zorbach, R. S. Tipson, 'Synthetic Procedures in

Nucleic Acid Chemistry', Wiley, New York, London, Sydney, Toronto,

1968,1,183

[39] F. Seela, H.-P. Muth, U. Bindig, Synthesis, 1988, 670

[40] H.-D. Winkeler, F. Seela, Chem. Ber., 1980,113, 2069

[41] CS. Wilcox, R.M. Otoski, Tetrahedron Lett., 1986, 27,1011

[42] K. Groebke, Diss. ETH, in Vorbereitung

[43] E. Cherbuliez, K. Bernhard, Helv. Chim. Acta, 1932,15,464

[44] J. Davoll, J. Am. Chem. Soc, 1951,73, 3174

[45] R. Purrmann, Anal. Chem., 1940, 544,182

[46] E. Fischer, Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1897,30,2226

[47] W. Fräser, Postdoc Bericht, ETH Zürich, 1991

[48] L. Peng, Diss. ETH, in Vorbereitung

[49] W.T. Markiewicz, J. Chem. Research (M), 1979,178

[50] R.W. Fischer, Diss. ETH, in Vorbereitung

[51] A.G. Helg, Diss. ETH, in Vorbereitung[52] Gene Assembler Plus (Owners manual), Pharmacia LKB

[53] Y. Hayakawa, S. Wakabayashi, H. Kato, R. Noyori, J. Am. Chem. Soc,

1990,112,1691

[54] H.-J. Galla, 'Spektroskopische Methoden in der Biochemie', Georg

Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 1987, 22

[55] CR. Cantor, P.R. Schimmel, 'Biophysical Chemistry', W.H. Freeman and

Company, San Francisco, 1980

[56] I.D. Campbell, R.A. Dwek, 'Biological Spectroscopy',

Benjamin/Cummings Publishing Company Inc., Menlo Park, 1984

[57] R.D. Wells, R.M. Warteil, 'The Influence of Nucleic Acids', Eds.: H.L.

Kronberg, D.C. Phillips, K. Burton, Butterworths, London, 1974, 41-64

[58] K.J. Breslauer, 'Methods for Obtaining Thermodynamic Data on

Oligonucleotide Transitions', in "Thermodynamic Data for Biochemistryand Biotechnology' Ed.: H.-J. Hinz, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg,New York, Tokio, 1986,402

[59] L.A. Marky, K.J. Breslauer, Biopolymers, 1987,26,1601

[60] R.J. Kenneth, K.J. Breslauer, R.A. Jones, B.L. Gaffney, Science, 1990, 250,

543

[61] CL. Stevens, G. Felsenfeld, Biopolymers, 1964,2,293


[62] M. F. Maestre, 'Circular Dichroism' in 'Optical Techniques in Biological

Research', Ed.: D.L. Rousseau, Academic Press, Orlando, San Diego, New

York, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokio, 1984, 291

[63] I. Tinoco, CR. Cantor, 'Application of Optical Rotatory Dispersion and

Circular Dichroism to the Study of Biopolymers', in 'Methods of

Biochemical Analysis', Ed.: D. Glick, Interscience Publishers, New York,

London, Sydney, Toronto, 1970,18,81

[64] T. Maniatis, E. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold SpringHarbor Laboratory, 1982

[65] M. Goebel, Postdoc Bericht, ETH Zürich, 1987

[66] J.S. Sun, C. Giovannangeli, J.C Francois, R. Kurfürst, T. Montenay-

Garestier, U. Asseline, T. Saison-Behmoaras, N.T. Thuong, C Helene,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1991, 88, 6023; M. Durand, J.C. Maurizot, N.T.

Thuong, C. Helene, Nucleic Acids Res., 1988,16,5039

[67] F. Morvan, B. Rayner, J.-L. Imbach, M. Lee, D.-K. Chang, J.W. Lown,

Nucleic Acids Res., 1987,15, 7027

[68] F. Morvan, B. Rayner, J.-L. Imbach, D.-K. Chang, J.W. Lown, Nucleic

Acids Res., 1987,15,4241

[69] F. Morvan, B. Rayner, J.-P. Leonetti, J.-L. Imbach, Nucleic Acids Res., 1988,

16,833

[70] C. Helene, Anti-Cancer Drug Design, 1991,6,569

[71] C. Schildkraut, S. Lifson, Biopolymers, 1965,3,195

[72] L.A. Marky, K.S. Blumenfeld, K.J. Breslauer, Can. J. Chem., 1988, 66, 836

[73] S. Arnott, P.J. Bond, E. Seising, P.J.C Smith, Nucleic Acids Res., 1976, 3,

2459

[74] W.N. Hunter, T. Brown, N.N. Anand, O. Kennard, Nature, 1986, 320,552

[75] G. Felsenfeld, D.R. Davies, A. Rieh, J. Am. Chem. Soc, 1957, 79,2023

[76] J.H. Miller, H.M Sobell, Proc. Naü. Acad. So U.S.A., 1966,55,1201

[77] A.R. Morgan, R.D. Wells, J. Mol. Biol., 1968, 37,63

[78] J.S. Lee, D.A. Johnson, A.R. Morgan, Nucleic Acids Res., 1979,6,3073

[79] S. Arnott, E. Seising, J. Mol. Biol, 1974,88, 509

[80] P.A. Beal, P.B. Dervan, Nucleic Acids Res., 1992,20, 2773

[81] K. Zimmermann, Postdoc Bericht, ETH Zürich, 1987

[82] R.P. Hammer, Postdoc Bericht, ETH Zürich, 1992

[83] J.A. Piccirilli, T. Krauch, S.E. Moroney, S.A. Benner, Nature, 1990, 343, 33

[84] C. Switzer, S.E. Moroney, S.A. Benner, J. Am. Chem. Soc, 1989,111, 8322


[85] T. Golas, M. Fikus, Z. Kazimierczuk, D. Shugar, Eur. J. Biochem., 1976,65,

183

[86] J. Sepiol, Z. Kazimierczuk, D. Shugar, Z. Naturforsch., 1976,31c, 361

[87] Z. Kazimierczuk, D. Shugar, Acta Biochimica Polonica, 1974, 21,455

[88] D. Shugar, B. Kierdszuk, Proc. Int. Symp. Biomol. Struct. Interactions,

Suppl. J. Biosd., 1985,8,657

[89] U. Diedrichsen, Diss. ETH, in Vorbereitung

[90] G.D. Fassmann, Handbook of Biochemistry and Molecular Biology 3rd Ed.,

CRC Press, Cleveland Ohio, 1975,589

[91] CR. Cantor, M.M. Warshaw, Biopolymers, 1970,9,1059

[92] W.C Still, M. Kahn, A. Mitra, J. Org. Chem., 1978,43,2923

[93] E. Walter, J. Schreiber, E. Zass, A. Eschenmoser, Helv. Chim. Acta, 1979,

62,899

[94] DNA Synthesizer Model 380/381 User Bulletin (ABD, 1987,13

[95] E. Pretsch, T. Clerc, J. Seibl, W. Simon, 'Tabellen zur Strukturaufklärung

organischer Verbindungen', Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New

York, London, Paris, Tokyo, 3. Auflage, 1986

[96] E.C Horning, Organic Syntheses, J. Wiley and sons New York, London,

Sydney, 1955,3,28

[97] C. Spinner, Diplomarbeit ETH, 1988

[98] K. Schwetlick et al. Organikum, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaf¬

ten, Berlin, 16-te Auflage, 1988

[99] C. Angst, 'Neue Hexahydroporphinoide Ligandsysteme', Diss. ETH Nr.

6783,1981

[100] R. Lattmann, 'Synthetische Studien in der Hydroporphyrinreihe', Diss.

ETH Nr 7383,1983

[101] IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature of Organic

Chemistry, Biochem., 1971,10, 3983

[102] IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature;

Abrevations and Symbols for the Description of Conformations of

Polynucleotide Chains, Eur. J. Biochem., 1983,131,9

[103] IUPAC Commission on the Nomenclature of Organic Chemistry and

IUPAC-RJB Commission on Biochemical Nomenclature; Tentative Rules

for Carbohydrate Nomenclature, Eur. J. Biochem., 1971,21,455

Curriculum Vitae

1964 Geboren am 17. September 1964 in Zürich als das jüngere von

zwei Kindern des Alfred und der Marie Giger - Bircher

1971 -1977 Besuch der Primarschule in Dietikon

1977 - 1983 Besuch der Kantonsschule Limmattal in Urdorf und Abschluss

mit der Matura Typus B

1984 -1988 Studium an der Abteilung für Chemie an der ETH Zürich,

Diplomabschluss November 1988

seit Nov. 1988 Promotionsarbeit am Laboratorium für org. Chemie an der

ETH Zürich unter der Leitung von Prof. Dr. A. Eschenmoser

seit Okt. 1990 Praktikumsassistent

1991 Heirat mit Andrea Neumann am 10. August 1991

Zürich, im November 1992 Alfred Giger

dspace cover page - eth z › mapping › eserv › ... · 2020-03-26 · -i-inhaltsverzeichnis a...

Documents