Con  

Diatoms:  Programmed  cell  death  in  the  Ross  Sea  Mónica  V.  Orellana  1,2  Allison  Lee1,  Adrian  Lopez  Garcia  de  Lomana1,  Meredith  Jennings3,  Sarah  

Bercovici3,  Alexander  Bochdansky4,  NiHn  Baliga1,5,    and  Dennis  A.  Hansell  1,3      1.    InsHtute  for  Systems  Biology,  SeaOle  WA  USA  

2.    Polar  Science  Center-­‐APL,  University  of  Washington,  SeaOle  WA  USA  

3.  University  of  Miami    

4.  Old  Dominion  University,  

5.  Department  of  Microbiology,  University  of  Washington,  SeaOle  WA  USA  

Abstract  

FLow  

Anstra  

15µm  

The  Southern  Ocean  plays  a  criHcal  role  for  carbon  sequestraHon  in  the  oceans.    The  flux  of  carbon   (C)   and   nitrogen   (N)   export   to   the   deep   ocean   depends   on   the   efficiency   of   the  biological   pump   transporHng   biomass   to   depth.   This   study   focuses   on   the   impact   of  programmed  cell  death  (PCD)  in  the  Ross  Sea,  observed  in  the  late  austral  summer  during  TRACERS   (TRacing   the   fate   of   Algal   Carbon   Export   in   the   Ross   Sea,   2013).   Program   cell  death  (PCD)   likely  modulates  the  turnover  of  phytoplankton  in  the  oceans,  however  very  few   field   data   exists   recapitulaHng   this   phenomenon.    We   present   evidence   of   diatoms  undergoing   PCD   and   their   proximate   causes   in   the   Ross   Sea,   as   well   as   examine   other  primary  groups  of  organisms  undergoing  PCD   in   the  water  column.   Immunofluorescence  coupled   with   flow   cytometry   and   phylogeneHc   analyses   of   the   populaHons   undergoing  PCD  indicate  higher  occurrences  of  PCD  in  diatoms  within  the  eukaryote  community  at  the  ocean   surface,   while   prokaryotes   undergoing   PCD   were   found   at   a   greater   depth.     In  addiHon,  we  discuss   invesHgaHons  conducted   to  determine   the   role  of  PCD   in  mediaHng  carbon  export  through  the  producHon  of  biopolymers  as  free  and  assembled  polymer  gels.  

DistribuHon   of     eukaryotes   (mainly   diatoms)   undergoing   PCD   in   the   water   column.    Diatoms  dominate  the  eastern  area  of  the  Ross    Sea  (170oE)  where  they  are  subjected  to  low  iron  concentraHons  (0.03  nM  -­‐  0.1  nM)  and  seasonal  depleHon  (1,2,3).    (Color  scale  bar  maps  for  percentage    of  cells  undergoing  PCD  quanHfied  by  flow  cytometry).  

Effect   of   diatoms   undergoing   PCD.   Digital   inline   holographic   microscope  (DIHM)   images   in-­‐situ   show   exopolymeric   parHcles   (EP)   that   cause   cell  aggregaHon  and  concomitant  fast  sinking  pulses  of  organic  maOer  to  the  deep  ocean.    EP  account  for  =  20+/- 15µM C Kg-1.

108m  

Confocal  microscopy  shows  a  variety  of  diatoms  sorted  by  flow  cytometry  coupled  with  immunofluorescence  ,  and  indicates  that  80  %  of  the  diatoms  undergo  PCD.    

Results  A. EUKARYOTES  :                In  late  summer  the  majority  of  the  eukaryotes  undergoing  PCD  in  the  Ross    Sea  are  diatoms,  which  are  the  dominant  taxa  in  the  eastern  area  of  the  Ross  Sea  (see  map).  

Our  metagenomic    analysis  recapitulated    the  phylogeneHc  tree  of  eukaryoHc    species  showing  a  large  diversity  of  diatoms  in  the  Ross  Sea.  (Colors  correspond  to  different  areas  in  the  Ross  Sea,  bar  size  represents  species  abundance  in  log  scale.  

%

B.    PROKARYOTES  

Prokaryotes  undergo  PCD  at  deeper  depths  than  eukaryotes,  at  the  same  regions  in  the  Ross  Sea.  

Orellana  and  Verdugo  2003  

Calcium   biding   stain   flow   cytometry  revealed   that   10-­‐25%   of   the   dissolved  organic   maOer   (DOM)   produced   by  prokaryotes   undergoing   PCD   assembled   as  microgels  in  the  water    column.      

Conclusions  1.  Planktonic  prokaryotes  and  photosyntheHc  eukaryotes  play  a  criHcal  role  in  biogeochemical  cycles.  2.  PCD  is  an  important  mechanism  sHmulaHng  export  producHon  in  the  Ross  Sea,  however  the  flow  and  fate  of  the  exported  organic  maOer  is  determined  by  the  taxa  that  undergoes  PCD.      3.  Diatoms  undergoing  PCD  in  the  Ross  Sea,  sHmulate  the  release  of  molecules  that  aggregate  into  big  (mm  size)  exopolymer  parHcles  that  rapidly  sink  into  the  deep  ocean;  instead  prokaryotes  undergoing  PCD  release  molecules  that  do  not  aggregate  into  big  parHcles  but  assemble  into  colloidal  size  polymer  gels  (nm  size)  and  account  for  10  to  25%  of  the  DOC.  4.  PCD  determines  parHculate  organic  carbon  and  organic  nitrogen  fluxes  and  biogeochemical  cycling  in  the  Ross  Sea.    

References  Coale  et  al.  2003.  Deep  Sea  Res.  50:  635-­‐653;  Cocklan  et  al.  2001.  Deep  Sea  Res.  48:  4127-­‐4153;  Sedwick,  et  al.  2000.  J  Geophys  Res.  Oceans,  105,  11321-­‐11336  

++  

Turbulent  diffusion  

ProducHvity    PCD,    Gels  

Carbon  Dynamics  

660  GC  

Sinking  

CCN  

Determine  the  mechanisms  by  which  the    biogeochemical  transformaHons  of  nutrients  and  carbon  variables  take  place  in  the  major  water  masses  located  on  the  Ross  Sea  shelf.  

ObjecHves  

Map:  Ross  Sea  and  sampling  staHons  (1500  samples  distributed  from  74oS-­‐  80oS  to  160oE-­‐160W  and  10  different  depths  ).  

Methods:  Immunofluorescence  coupled  with  flow  cytometry,   metagenomics,   confocal  microscopy,   and   inline   holographic  microscopy.      

50m                                                                                                                                    800m  

Ann

exin    V-­‐FITC  labe

led    

                                                                                                                                                                 Sytox  blue  fluorescence    

Surface                                                                                                                        10m                                                                                                                                  400m  

                                                                                                                                                 25m                                                                                                                                  600m  

Ann

exin  V-­‐  FITC  labe

led  

Programmed  Cell  Death    

Acknowledgements:  NSF:  1142049  

FITC  conjugate  

Flow  cytometric  measurements    

Eukaryotes  

Prokaryotes  

Metagenomics  show  a  very  diverse  populaHon  of  bacteria.    Bacteriodes,  Cyanobacteria    and  Proteobacteria    account  for  the  majority  of  the  prokaryotes.    

Figure  showing  the  framework  of  the  TRACERS  study  (2013)  

PCP   was   measured   by   flow   cytometry.   We   detected      plasma   membrane   permeability   and   externalizaHon   of  phospholipids   with   Annexin   V-­‐FITC   conjugate.   SYTOX   blue  an  impermeable  probe  that  stains  the  nucleus  was  used  to  detect  dead  cells  with  compromised  plasma  membrane.  

S i n g l e   c e l l  analysis  by  flow  c y t o m e t r y ,  showing   cells  double   stained  with  Annexin  V-­‐F ITC   labeled  and  Sytox  blue.  Double  posiHve  c e l l s   a r e  u n d e r g o i n g  PCD.