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Polymerase Chain Reaction (PCR)
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Tópicos
1. DNA 2. PCR
– Alvos – Denaturação– Primers– Anelamento
– Ciclos – Requerimentos
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DNA
DNA é um ácido nucléico composto de duas cadeias antiparalelas complementares.
Os nucleotídeos são compostos de um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada
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DNA
• Acúcar do DNA – Ácido Desoxirribonucleico
• Açúcar do RNA– Ácido Ribonucleico
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DNA
O DNA tem quatro bases nitrogenadas.
• Duas são chamadas purinas– Adenina ( A ), Guanina ( G )
• Duas são pirimidinas– Citosina ( C ), Timina ( T )
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DNA
Essas quatro bases são ligadas em um padrão repetitivo por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas
A ligação de duas cadeias complementares é chamada de HIBRIDIZAÇÃO.
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DNA
Uma purina sempre se liga a uma pirimidina para manter a estrutura do DNA.
Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), através de duas pontes de hidrogênio.
Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), através de três pontes de hidrogênio.
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DNA
Examplo de padrão de ligação.• Padrão primário
CCGAATGGGATGCGGCTTACCCTACG
• Padrão complementar
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DNA Molecule
AdeninaAdenina
TiminaTimina
GuaninaGuanina
CitosinaCitosina
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PCR
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.
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OS Alvos do PCR
Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.
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PCR Targets
O número de bases nos alvos pode variar.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
O . . . . Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas em não conhecê-la para poder amplificá-la.
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PCR - Desnaturação
A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.
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PCR Primers
Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da seuqência-alvo.
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PCR Primers
Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções.
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PCR Primers
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTTAATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>e <. . . . . . . . . .
AAATTTGGCCAATTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
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PCR Primers
OS primers são colocados em excesso na reação de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.
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PCR - Anelamento
O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.
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PCR Taq DNA Polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.
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PCR Taq DNA Polimerase
Essa bactéria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de MG, a altas temperaturas.
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
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PCR Cycles
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PCR Ciclos
• Desnaturação: 94°- 95°C
• Anelamento: 55°- 65°C
• Extensão: 72°
• Número de ciclos: 25-40
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
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PCR Ciclos
Número de cópias da Região alvo de DNA
A = 2n
n = número de ciclos
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PCR Requerimentos
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM
• Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polimerase: 1-2.5 units
• DNA Alvo: 1 µg
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Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado deNão remover a faixa de células brancas.
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Extração de DNA de células sanguíneasExtrair cuidadosamente 200ul da região de células brancasE separar em tubos identificados
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Extração de DNA de células sanguíneas
AdicionarProtease a Cada tubo
Adicionar Tampão deLise em cadatubo
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Extração de DNA de células sanguíneasRealizarHomogeneizaçãoCriteriosa do material
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Extração de DNA de células sanguíneas
Incubar os tubosA 56C por peloMenos 10min.
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Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar os tubospara retirar quaisquergrumos
Adicionar etanol para lavageme centrifugar de novo.
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Extração de DNA de células sanguíneasAdicionar as maostras em colunas de afinidade e centrifugar .
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Extração de DNA de células sanguíneas
Tubo com coluna
A coluna vai ser retiradae adaptada em outro tubono qual será feita a eluição
Coluna.
Esse eluato (flowthrough) seráDescartado.
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Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna será colocada em um novo tubo, aonde seráLavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquerMoléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.
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Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna com o tubo é então centrifugadaMais uma vez, para remover excesso deTampão de Lavagem.O próximo passo é adicionar Tampão de
Eluição• Incuba-se por 30 minutos a 25C• O eluato da coluna é então guardado,
pois agora esse contém o DNA Alvo.
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Extração de DNA de células sanguíneasEntão pode-se preparar o mix de PCR.
Mix de PCR
•10x Buffer - 10 µl
•MgCl - 6 µl
•dNTPs- 0.8 µl
•Primer forward - 2 µl
•Primer reverse - 2 µl
•Taq polimerase - 0.5 µl
•H2O estéril - 73.7 µl
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Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubosEspecíficos e colocar em termociclador.
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Extração de DNA de células sanguíneas
Análise do produto de PCR.
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Bibliografia
• Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://www.accessexcellence.org/AB/GG/
forensci_PCR.htm.l• Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995.
Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html• Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and
Tom Wiggers.
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Bibliografia
• Ronald H. Holton, Ph.D.:– Molecular Diagnostics in the Clinical
Laboratory– Molecular Biology in the Clinical
Laboratory– Molecular Pathology: Basic
Methodologies and Clinical Applications– Expanding applications of PCR, by Peter
Gwynne and Guy Page