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BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES
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Colonizzazione cuteMigrazione tratto sottocutaneo
Colonizzazione punta CVC
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COMMENSALI della pelle: Staphylococcus epidermidis, S.aureus
Corynebacterium spp
COMMENSALI del tratto intestinale: Escherichia coli Klebsiella, Enterococcus
Batteri ambientali: Pseudomonas aeruginosa Sphyngobacterium spp Stenotrophomonas spp
COOMENSALE delle mucose: Candida albicans
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5 milioni di CVC 5 milioni di CVC impiantati ogni annoimpiantati ogni anno
250.000 infezioni associate a 250.000 infezioni associate a catetericateteri
12%- 25% mortalità12%- 25% mortalità
Aumento della spesa ospedaliera da Aumento della spesa ospedaliera da 3000$ a 56167 $ per paziente3000$ a 56167 $ per paziente
American College of Critical Care Medicine e della Society for Healthcare
Epidemiology of America
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Superficie di catetere sterileSuperficie di catetere sterile
Film proteico Film proteico depositato sulla depositato sulla
superficie del CVCsuperficie del CVC
Superficie di Superficie di catetere catetere colonizzato da colonizzato da
Staphylococcus epidermidisStaphylococcus epidermidis
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ESEMPIO:Central Venous Catheters
greatest risk of device-related infection
infection rates of 3 to 5%.
Biofilms are universally present on CVCsbiofilm development: outside of the catheter or inner lumen
Colonization and biofilm formation may occur within 3 days of catheterization
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Metodi utilizzati per la determinazione quantitativa della popolazione microbica adesa a
superfici rigide
Metodi diretti: microscopia ottica elettronica (trasmissione, scansione) confocale
Metodi indiretti: conta UFC di batteri eluiti
con mezzi fisici colorazione batteri adesi e successivo saggio del
colorante eluito radiomarcatura biologici
Svantaggi presentati dai vari metodi: impossibilità di distinguere tra cellule vive e morte possibile alterazione integrità cellulare possibile morte di parte della popolazione batterica distacco non garantito di tutte le cellule impiego di sostanze tossiche decadimento e diluizione dell’isotopo radioattivo necessità di curve di correlazione per ogni microrganismo
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METODI DIRETTI
•MICROSCOPIA OTTICA
•MICROSCOPIA ELETTRONICA
•MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE
•MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
•MICROSCOPIA CONFOCALE
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VANTAGGI
• Facilità di esecuzione
MICROSCOPIA OTTICA
SVANTAGGI E LIMITI
• Non distingue Vivi/Morti
• Porzioni di materiali
Mai diagnostica, mai predittiva, sempre complementare
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MICROSCOPIA ELETTRONICA
VANTAGGI
• Caratterizzazione strutture di adesione
• Localizzazione antigeni• Visualizzazione di un
fenomeno
SVANTAGGI E LIMITI
• Non distingue Vivi/Morti• Natura del materiale• Porzioni di materiali• Artefatti• Non facile • ANALISI QUALITATIVA• NON SU BIOMATERIALI
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MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE
VANTAGGI
• Dettegli sull’attaccamento microbico
• Osservazione anche del materiale opaco
• SOLO QUALITATIVA
SVANTAGGI E LIMITI
• Non distingue Vivi/Morti • Solo porzioni di materiale• Non facile
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VANTAGGI
• Distingue Vivi/Morti con colorazioni differenziali (BacLight Live/Dead)
MICROSCOPIA A FLUORESCENZA (CTC, ARANCIO DI ACRIDINA, DAPI, RODAMINA
123)SVANTAGGI E LIMITI
• Incubazione/Preparazione del campione
SYTO9: COLORANTE CATIONICO LIPOFILICO CHE PENETRA ATTRAVERSO LE MEMBRANE E MARCA I BATTERI VIVENTI CON UNA FLUORESCENZA VERDE
IODURO DI PROPIDIO: COLORANTE ANIONICO CHE NON PENETRA LE MEMBRANE. SE LE MEMBRANE SONO DANNEGGIATE O COMPROMESSE (BATTERI UCCISI) PENETRA E MARCA CON UNA FLUORESCENZA ROSSA
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MICROSCOPIA CONFOCALE
VANTAGGI
• Illuminazione laser• Materiale opaco e
trasparente
SVANTAGGI
• Non evidenzia interazioni Interno/Esterno materiale
• Solo porzioni di materiale
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METODI INDIRETTI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI ADESI
Metodi di conta con distacco dei batteri
METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUEMETODO DI CLERIMETODO DI SHERETZ
Metodi di conta in situ
MARCATURA CON ISOTOPISAGGI IMMUNOENZIMATICISAGGI BIOLOGICI
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Qualitativo
Vantaggi Svantaggi
Coltivazione in brodo di punta del catetere
Grande semplicità
Grande sensibilità
Non discriminante tracontaminazionecolonizzazione
infezione
Impossibilità di determinarese presente più di una specie
Non garantito lo sviluppodi tutte le specie presenti
Necessaria la rimozionedel catetere
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Semiquantitativo
Vantaggi Svantaggi
Rotolamento di punta del catetere su piastra per 4 volte
<15 colonie
Contaminazione
Sviluppo di:
>15 colonie
Colonizzazione
Grande semplicità
Facilità di esecuzione
Coltivazione della solaporzione esterna del
catetere
Bassa specificitàBassa predittività
Non garantito il distaccodei batteri
Necessaria la rimozionedel catetere
METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE
Ampiamente utilizzato per cateteri venosi
Semina mediante striscio su opportuni terreni solidi
Microrganismi vivi
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Semi-quantitativo (CRI)
Vantaggi Svantaggi
Coltivazione della punta edel segmento distale del catetere
Sonicazione, vortex
<102 colonie
ContaminazioneSviluppo di:
>102 colonie
Colonizzazione
Microrganismi viviSensibilità alta
Facilità di esecuzioneNon distingue tra
colonizzatori parte esterna e lume
Non garantita la vitalitàed il distacco dei batteri
Necessaria la rimozionedel catetere
METODO DELLA SONICAZIONE
Distacco dei microrganismi adesi o mediante sonicazione o vortex
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SAGGI IMMUNOLOGICI ELISA
VANTAGGI
•No radioattivo
SVANTAGGI E LIMITI
• Conoscenza del microrganismo• Espressione dell’antigene
• Semi-quantitativa • Microrganismi in superficie• Antigene nella forma
plantonica è espresso?• Curve di riferimento
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Metodi biologici
VANTAGGI•No radioattivo•Indipendente dallo
stato del microrganismo (plantonico/sessile/biofilm)
•Distingue vivi da morti
•Nessuna manipolazione del supporto abiotico
SVANTAGGI E LIMITI
• Curve di riferimento con metodo della conta delle UFC
Correlazione tra un fattore batterico (ATP, consumo di O2, produzione di CO2, ecc.) e numero di batteri
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Contenuto di ATP e numero di batteri
VANTAGGI•Indipendente dallo stato del
microrganismo (plantonico/sessile/biofilm)
•Distingue vivi da morti
SVANTAGGI E LIMITI
• Curve di riferimento con metodo della conta delle UFC
• Rottura dei batteri non sempre efficace
Correspondence curves between log CFU-per-milliliter and log relative light unit (RLU) mean values
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IL METODO BIOTIMERIL METODO BIOTIMERIL METODO BIOTIMERIL METODO BIOTIMER Consente di determinare il numero di batteri adesi, aggregati o in
biofilm, mediante un test biochimico e non mediante la classica determinazione del numero delle unità formanti colonia (UFC)
Il BioTimer utilizza un terreno di coltura contenente un indicatore di pH (rosso fenolo), che vira dal rosso al giallo in seguito all’acidificazione del terreno
Il tempo richiesto per il viraggio dell’indicatore viene correlato con il numero di cellule batteriche presenti inizialmente nel campione attraverso una curva di correlazione specifica
Il nuovo metodo consente di determinare il numero di batteri in situ, senza manipolazione del campione
Ceppi utilizzati
Streptococcus sobrinus ATCC33478T
Streptococcus oralis ATCC35037T
Escherichia coli MG1655 ATCC47076Staphylococcus aureus ATCC6538Pseudomonas aeruginosa PAO1
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Esempi di curve di correlazione tra tempo di viraggio dell’indicatore e
numero dei batteri presenti nel campione
Log UFC
Tempo (ore)
Log UFC
4
5
6
7
8
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
y = -0,3056x + 8,2608
Streptococcus sobrinus
4
5
6
7
8
6 7 8 9 10 11 12 13 14
y = -0,301x + 9,0615Streptococcus oralis
4
5
6
7
8
1 2 3 4 5 6 7 8
y = -0,5443x + 8,5446
Staphylococcus aureus
Log UFC
Tempo (ore)
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Concentrazione Minima Inibente
Metodi di valutazione dell’attività degli antibiotici
in vitro
Metodi di valutazione dell’attività degli antibiotici
in vitroMETODI PER DILUIZIONE in TERRRENO LIQUIDO o SOLIDOMETODI PER DIFFUSIONE in TERRENO SOLIDO
11
22
MICMICMICMIC
Concentrazione Minima Battericida
MBCMBCMBCMBC
SOLO PER BATTERI IN FORMA PLANCTONICA!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
NON IDONEO PER BIOFILM
![Page 24: BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES](https://reader036.vdocuments.us/reader036/viewer/2022062315/56814bf3550346895db8e1e4/html5/thumbnails/24.jpg)
National Committee for ClinicalLaboratory Standards (NCCLS)
Calgary device
Sistema per la determinazione della minima concentrazione per l’eradicazione del biofilm (MBEC)
![Page 25: BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES](https://reader036.vdocuments.us/reader036/viewer/2022062315/56814bf3550346895db8e1e4/html5/thumbnails/25.jpg)
APPLICAZIONE DEL BIOTIMER NELLA DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA
SUSCETTIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI DA PARTE DI BATTERI ADESI IN BIOFILM A
CATETERI
NESSUNA MANIPOLAZIONE DEL CAMPIONE !!!!!!!!!!!!!