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Genetica dei Procarioti - 5
Dipartimento di Scienze della VitaCdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)
Prof. Laura Marriricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail
A.A. 2014-15
Bacteria produce and secrete chemical signal molecules (autoinducers)
Concentration of molecules increases with increasing bacterial density
When critical threshold concentration of molecule is reached, bacteria alter gene expression
Quorum Sensing
Gram negative and Gram positive bacteria use different signaling molecules (Acyl Homoserine lactones vs peptides) GRAM-
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(b) Competence and sporulating stimulating factor (CSF)autoinducer of Bacillus subtilis. (c) AI-2 autoinducer. (d) The N-butyryl-homoserine lactone of Pseudomonas aeruginosa.
AHL
Acyl Homoserine Lactone
autoinduttori
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Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra in fase di morte dopo tre giorni di incubazione. In questa fase, il 90-99% della popolazione muore
Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra in fase di morte dopo tre giorni di incubazione. In questa fase, il 90-99% della popolazione muore
ossidazione di proteine e DNA, programma simile all’apoptosi eucariotica che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata
ossidazione di proteine e DNA, programma simile all’apoptosi eucariotica che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata
EDF (extracellular death factor) attiva l’operone mazEF responsabile del modulo tossina-antitossina che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata
mazF encodes a stable toxin, MazF: a sequence-specific endoribonuclease that preferentially cleaves single-stranded mRNAs at ACA sequences
mazE encodes a labile antitoxin, MazE, that counteracts the action of MazF
Any stressful condition that prevents the expression of mazEF will lead to a reduction of MazE levels in the cell, permitting the MazF toxin to act
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Biosensori batterici per la rivelazione di AHLs
gene reporter
promotore della famiglia LuxIproteina della
famiglia LuxR
Chromobacterium violaceum
A mutant of C. violaceum ATCC 31532, designed strain CV026, does not produce C6-HSL but does produce violacein in response to the presence of exogenous C6-HSL(McClean et al., 1997)
the proper production of AHL molecules has been blocked by mutation of the AHL synthase but the gene encoding the production of the purple pigment violacein remains AHL-responsive.
In the presence of specific AHLs with acylchain lengths shorter than C10, this strain willtherefore produce purple pigment due to violacein production
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Proteine specifiche si trovano:
associate alla IMnello spazio periplasmaticoOMin alcuni casi secrete completamente dalla cellula
Le proteine legate alle membrane comprendono:
CitocromiF1/Fo ATP sintasiProteine di trasportoPorine
Controllo post-traduzionale
SECREZIONE PROTEINE
Nei batteri Gram-positivi le proteine secrete o sono rilasciate nell’ambienteesterno oppure sono legate covalentemente al petidoglicano da specifici enzimiassociati alla membrana e vanno a costituire le proteine di superficie
almeno 8 sistemi IM almeno 8 sistemi OMGram-
Molte proteine sono secrete attraverso entrambe le membrane cellulari (IM, OM) dei batteri GRAM-negativiAlcune usano la via Sec per attraversare la IM ed un’altra via per la OMAltre dipendono da altri sistemi per attraversare entrambe le membrane
Sec-pathway
Il trasporto è realizzato attraverso un meccanismo dipendente da una
SEQUENZA SEGNALE
Met–X – Lys/Arg – Z(10 -12x) – Gly/Ala –
Regione basica core idrofobico N-terminus proteina matura5-6 residui
X = residuo idrofilico o idrofobico
Z= residuo prevalentemente idrofobico
translocationcomplex
peptidasePERIPLASMA
20aa
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delivering protein
1
chaperonetranslocation
competent state
CITOPLASMA
forma un canale
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La proteina matura inizia il processo di ripiegamento, se a destinazione periplasmatica, oppure può essere presa in consegna da un successivo sistema di trasporto se destinata a OM/ ambiente extracellulare
La proteina matura inizia il processo di ripiegamento, se a destinazione periplasmatica, oppure può essere presa in consegna da un successivo sistema di trasporto se destinata a OM/ ambiente extracellulare
homologues follow the phylogenies of the host organisms with few exceptions
Phylogenetic tree of sequenced homologues of the SecY protein of E. coli and Sec61 protein of Saccharomyces cerevisiae
A+Btwo-step process
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Type III – T3S
apparato che trasloca effettori in one step attraverso la parete usando una struttura ancestralmente correlata al flagello batterico
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nomenclatura di YersiniaYop: Yersinia outer protein
chaperonine specifiche
solo dopo il contatto con la
cellula eucariotica
Shigella type III secretion system
I batteri usano il sistema di secrezione di tipo IV (T4S) per due motivi fondamentali:
• scambio genico• rilascio di molecole effettrici (EFFETTORI) a cellule
eucariotiche bersaglio
ancestralemente correlato all’apparato della coniugazione che transloca DNA o substrati proteici attraverso la parete (spesso in relazione alla patogenesi)
Type IV – T4S
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(b) transmission electron microscopic image showingT-pili and flagella on A. tumefaciens.
(a) a model for T-pilus assembly in Agrobacterium tumefaciens
VirB4–VirB8–VirB5–VirB2 interaction sequence leadto the formation of VirB2–VirB5 complexes followedby T-pilus assembly
Secretion pathway and structure of the T4S system
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secondary amine derivatives formed by condensation of an amino acid, either with a ketoacid or a sugar
Crown gall tumors
galla del colletto
Ti è un esempio di plasmide batterico naturale
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Also, virulence plasmids from Salmonella, Shigella, Yersinia, B. anthracis, E.coli, and others.
MGEs: segmenti di DNA codificanti enzimi o altre proteine checonsentono lo spostamento di questi elementi nel genoma (mobilitàintracellulare) o tra cellule batteriche (mobilità intercellulare)
nella maggior parte dei casi sono molecole di DNA circolari
(1 - 1000 kb) ma anche lineari o integrati nel cromosoma
batterico (episomi)
PLASMIDI
dal 1977
plasmide superavvoltosupercoiled
plasmide circolare rilassato
plasmide linearizzato
nick
Le forme molecolari circolari superavvolte durante le
manipolazioni sperimentali possono rilassarsi o linearizzarsi
in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento.
PLASMIDI
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forma rilassataforma lineareforma superavvolata
forma linerizzata ( tagliata con un enzima di restrizione in un sito unico)
In un gel di agarosio e bromuro di etidio le tre forme migrano a velocità diverse e possono essere distinte
Three forms of plasmid DNA
Large-scale purification of plasmids by cesium chloride density gradient centrifugation
“old school method of purifying plasmid”since the 1950s
72-96 hrsduring this time, the CsCl forms a gradient and the molecules migrate according to their density until they float at their individual isopycnic points (the point in the gradient that equals the buoyant density of the molecule).
Plasmid replication
1. Plasmid replication requires host DNA replication machinery.
2. Most wild plasmids carry genes needed for transfer and copy number control.
3. All self replication plasmids have a oriV: origin of replication
4. Some plasmids carry and oriT: origin of transfer.
5. Plasmid segregation is maintained by a par locus-a partition locus that ensures each daughter cells gets on plasmid. Not all plasmids have such sequences.
6. There are 5 main “incompatibility” groups of plasmid replication. Not all plasmids can live with each other.
7. Agents that disrupt DNA replication destabilize or cure plasmids from cells.
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un plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNAun plasmide deve contenere un’origine per la replicazione del DNA
Replicazione plasmidicaReplicazione plasmidica
REPLICONI
I plasmidi si replicano
per replicazione (uni o bi-direzionale)
per circolo rotante
richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico
replicazione circolo rotante
Replicazione plasmidica
REPLICONI
I plasmidi si replicano
per replicazione (uni o bi-direzionale)
per circolo rotante
richiedono proteine plasmidiche e/o dell’ospite batterico
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Replicazione plasmidica
La capacità di replicarsi autonomamente è conferita loro dalla presenza di una origine di replicazione, ori (oriV, “ori vector”)
host protein
P1
Funzioni dell’origine di replicazione
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:
Il numero di copie
La specificità d’ospite
I gruppi di incompatibilità
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
I plasmidi si replicano con due modalità diverse
Alcuni, generalmente quelli di grandi dimensioni, si replicano in
maniera coordinata con la replicazione del cromosoma batterico
e si dicono sottoposti a
controllo stringente
In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE
Altri, in genere di piccole dimensioni, si replicano in maniera
indipendente dalla replicazione batterica e si dicono sottoposti a
controllo rilassato
Sono presenti in molte copie - fino a 1000 - per batterio.
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Plasmidi ori N. di copie
PUC e derivati ColE1 500-700
pACYC e derivati p15A 10-12
pSC101 e derivati Psc10 1-5
NUMERO DI COPIE e MODALITA' DI REPLICAZIONE HIHG
COPY
NUMBER
Sistema di ripartizioneLOW
COPY
NUMBER
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Sistema di ripartizione
parS-ParA-ParB
Bacterial plasmids encode partitioning (par) loci that ensure ordered plasmid segregation prior to cell division
Sister plasmid segregation is achieved through bidirectional insertional polymerization of the ParM filaments.
ParM binds to DNA-binding proteins, called ParR (orange proteins) around which segments of genomic DNA are coiled
Actina-omologo
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Controllo del numero di copie
I plasmidi possono controllare il numero di copie regolando l’inizio della replicazione plasmidica
inibizione mediante RNA + proteina dell’inizio della replicazione
La maggior parte dei vettori di clonaggio derivano dal plasmide ColE1
Controllo del numero di copie
ori
RNA IIRnasi H
la replicazione è innescata da un primer (RNA II), trascritto da un promotore situato 550 bp a monte di ori.
Gli ibridi DNA:RNA formati dal filamento di DNA e dall’RNA II nascente, costituiscono un substrato per la Rnasi H che taglia l’ibrido e fornisce l’OH al 3’ per la replicazione del DNA.
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oriRNA I rop
La maturazione di RNA II è controllata da RNA I, trascritto sul filamento opposto della stessa regione di DNA e, quindi, complementare a RNA II .
RNA I-RNA II compete con l’appaiamento tra RNA II e il filamento stampo, riducendo la frequenza di inizio della replicazione.
Il prodotto del gene rop stabilizza il complesso RNA I-RNA II , riducendo ulteriormente la frequenza di inizio.
RNA II
origin
P-II
P-I
Replicazione del plasmide ColE1
RNA I
RNA II
RNA I (108 b)
RNA II is required for priming DNA synthesis at the origin. Positive regulation.
P-I & P-II: promotori
-555 -20
RNA polimerasi
RNA I è complementare alla regione terminale 5’ di RNA II
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Funzioni dell’origine di replicazione
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:
Il numero di copie
Lo spettro d’ospite
I gruppi di incompatibilità
Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di
specie batteriche e si dicono a specificità d'ospite limitata : narrow
host range
Altri sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie
batteriche e si dicono a largo spettro d'ospite: broad host range, BHR
I plasmidi BHR derivano questa loro proprietà dal possesso di
funzioni per il riconoscimento dell' origine di replicazione, dipendono
meno, quindi, dall'apparato replicativo dell'ospite batterico
SPETTRO D’OSPITE
Funzioni dell’origine di replicazione
Oltre ad essere essenziale per la replicazione, l’origine di replicazione oriV controlla:
Il numero di copie
La specificità d’ospite
I gruppi di incompatibilità
Plasmidi con la stessa origine di replicazione sono incompatibili tra
loro.
Se in uno stesso batterio entrano due plasmidi con la stessa origine
di replicazione, questa compete per componenti proteici comuni.
Come risultato nel giro di poche generazioni uno dei due plasmidi
verrà perso.
Possono invece coesistere plasmidi con origine di replicazione
diverse che appartengono a diversi gruppi di incompatibilità
GRUPPI DI INCOMPATIBILITA’
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MARCATORI SELEZIONABILI
I plasmidi naturali a volte veicolano uno o più geni non
essenziali capaci di conferire loro un vantaggio selettivo in
alcune situazioni.
Per es. possono codificare per tossine o resistenza agli
antibiotici
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
capacità di trasferire materiale genetico tra batteri
mediante coniugazione
Per essere coniugativo un plasmide deve possedere:
Una specifica regione di riconoscimento chiamata Ori T (origine di trasferimento)
I prodotti genici, agenti in trans, specificati dal locus tra (trasferimento)
una delle funzioni tra: sintesi del pilo coniugativo
Plasmidi coniugativi e non coniugativi
plasmidi privi di queste funzioni geniche non sono trasmissibili
Tuttavia . . .
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Plasmidi coniugativi e non coniugativi
se un plasmide possiede un Ori T può essere trasferito per coniugazione utilizzando funzioni helper che forniscono, in trans, i prodotti genici mancanti
Distribution of conjugative, mobilizable, and nonconjugative plasmids according to plasmid size
Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:434-452
Schematic view of the genetic constitution of transmissible plasmids.
Smillie C et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010;74:434-452
MPF: mating pair formation T4CP: Type IV coupling proteins
Escherichia coli S17-1 λpir è in grado di mobilizzare plasmidi non coniugativi inbatteri Gram-negativi grazie all’integrazione stabile nel proprio cromosoma dei genicodificanti per le funzioni di trasferimento derivate dal plasmide RP4 che agisconosulla sequenza oriT presente sui plasmidi mobilizzabili
geni tra
Ricevente
plasmide
coniugazione
oriT