PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CIÊNCIAS GENÔMICAS E BIOTECNOLOGIA

CENTRO DE ANÁLISES PROTEÔMICAS E BIOQUÍMICAS

ALBUMINAS 2S BACTERICIDAS EM SEMENTES DE

GERGELIM (Sesamum indicum L.): UMA NOVA ESTRATÉGIA

NO CONTROLE DE INFECÇÃO HOSPITALAR

Autora: Simone Maria Neto

Orientador: Octávio Luiz Franco

Co-orientador: Luiz Antonio Soares Romeiro

BRASÍLIA

Centro de Análises Proteômicas e Bioquímicas

SIMONE MARIA NETO

ALBUMINAS 2S BACTERICIDAS EM SEMENTES DE

GERGELIM (Sesamum indicum L.): UMA NOVA

ESTRATÉGIA NO CONTROLE DE INFECÇÃO

HOSPITALAR

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu

em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito para obtenção do Título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia.

Orientador: Octávio Luiz Franco

Co-orientador: Luiz Antonio Soares Romeiro

Brasília

2007

I

À Tia Nene, por ter acompanhado,

mesma à distância, cada passo desse

trabalho.

II

AGRADECIMENTOS

Ao meu sábio e jovem orientador, Prof. Dr. Octávio Luiz Franco, por ser meu pai

científico e me transmitir sua paixão pelas proteínas.

Ao meu co-orientador Luiz Antonio Romeiro, por sua constante disposição e

apoio em todas as horas.

À Ilka Vasconcelos, pelo seqüenciamento de Si-AMP.

Ao Carlos Bloch Jr., pela análise da massa molecular de Si-AMP.

Ao colega de bancada e amigo Fábio Teles Costa, pelo ótimo ponto de partida e

suporte em todas as etapas de realização desse trabalho.

Aos meus meninos, Renato G. Almeida e Daniel A. Sousa, por respirar proteínas de

gergelim.

À minha mãe Corina Maria Neto, por ter me mostrado que bom nunca é o bastante

e que desafios existem para ser vencidos.

À tia Irene dos Santos, pois nos momentos mais difíceis me provou que para todo problema há mil soluções, só nos resta

descobrir uma.

À Thais Bergamin, pelo seu lado aventureiro que me encoraja enfrentar esse

mundo desconhecido.

À Aline Ribeiro, por pacientemente me ouvir falar sobre a beleza das proteínas.

Aos meus amigos, pelo suporte emocional e compreensão pela minha ausência.

A todos no Centro de Análises Proteômicas e Bioquímicas, por fazer-me sentir em casa.

À Deus, por me permitir viver tudo isso.

III

Se fosse fácil achar o caminho das pedras, tantas pedras no caminho

não seria ruim .

H. Gessinger

IV

ÍNDICE

RESUMO ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VI

ABSTRACT ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII

LISTA DE ABREVIAÇÕES ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VIII

LISTA DE TABELAS ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XI

LISTA DE FIGURAS ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XII

INTRODUÇÃO

Antibióticos e resistência bacteriana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Bactérias patogênicas causadoras de infecção hospitalar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

Klebsiella sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Mecanismo de resistência e antibióticos desenvolvidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Peptídeos antimicrobianos: novas estratégias na resolução de velhos problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Proteínas da família 2S albumina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Gergelim: uma nova fonte de peptídeos antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

JUSTIFICATIVA... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

OBJETIVO ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

MATERIAL E MÉTODOS

Extração . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Isolamento de albuminas 2S de sementes de S. indicum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Análises de massa molecular por SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Análises de massa molecular por espectrometria de massa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Seqüenciamento de Si-AMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Análises in silico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Preparação das bactérias patogênicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

V

Bioensaio em meio sólido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Bioensaio em meio líquido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Isolamento de Si-AMP, nova albumina 2S de sementes de S. Indicum . . . . . . . . . . . . . 40

Análise de massa molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

Seqüenciamento de Si-AMP e análises in silico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Bioensaios meio sólido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Bioensaio em meio líquido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

CONCLUSÃO ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

PERSPECTIVAS ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

ANEXOS ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

VI

RESUMO

Durante toda a história da humanidade, a população mundial foi afetada

por infecções causadas por bactérias. Este quadro somente passou a ser

controlado com o advento dos antibióticos. Entretanto, o uso inadequado dos

agentes bactericidas disponíveis conduziu a uma problemática ainda maior, a

resistência bacteriana. Diariamente, surgem cepas bacterianas mutantes,

hábeis em escapar da ação de praticamente todos os fármacos desenvolvidos.

Atualmente, a infecção hospitalar é um dos maiores desafios encontrados

pelos países em desenvolvimento. Este quadro é agravado pela deficiência de

antibióticos capazes de reprimir o processo infeccioso. As bactérias são as

principais fontes de infecção hospitalar e a família Enterobacteriaceae

responde por 95% dos casos de infecção bacteriana. Dentre essas, Klebsiella

sp. assume o lugar de principal patógeno causador de infecções pulmonares

hospitalares, com altos índices de severidade nos quadros de pneumonia.

Dessa forma, torna-se urgente o desenvolvimento de novos antibióticos, com

mecanismos de ação alternativos. Peptídeos antimicrobianos de plantas

(AMPs) têm sido caracterizados como uma valiosa fonte para descoberta de

antibióticos. Dessa forma, o isolamento de peptídeos antimicrobianos em

Sesamum indicum é focado neste trabalho. Aqui, um novo peptídeo

antimicrobiano de sementes de gergelim (Si-AMP), com atividade contra

patógenos humanos, será descrito. Para o isolamento desse peptídeo, sementes

de gergelim foram trituradas com solução extratora, seguida por precipitação

com (NH4)2SO4 (100%). Após diálise, a fração rica em proteínas foi separada

em cromatografia de afinidade, seguida por cromatografia analítica em RP-

HPLC. A análise em espectrometria de massa (MALDI-ToF) indicou que a

massa molecular de Si-AMP é aproximadamente 5,8 kDa. A seqüência N-

terminal indicou que Si-AMP pode ser incluído na família das albuminas 2S.

Além disso, Si-AMP foi avaliado contra bactérias Gram-negativas incluindo

Klebsiella sp. e Proteus sp. Entretanto, Si-AMP causou inibição significativa

apenas no crescimento de Klebsiella sp., evidenciando a seletividade do

peptídeo. Em conclusão, os resultados reportados aqui indicam que, em um

futuro próximo, Si-AMP poderá ser utilizado no desenvolvimento de novos

antibióticos proteináceos contra bactérias Gram-negativas patogênicas.

Palavras-chave: peptídeos antimicrobianos, Sesamun indicum , albuminas

2S, Klebsiella sp.

VII

ABSTRACT

During human history, bacterial infections directly affect world

population. This situation has only been controlled with antibiotic

development. Nevertheless, the inadequate use of available bactericidal

agents can lead to bacterial resistance. Daily, mutant strains emerge, being

able to escape of practically all existent drugs. Actually, hospital infections

consist of an enormous challenge for developing countries. This problem is

aggravated by the deficiency of the antibiotics capacity to reduce infectious

processes. Bacteria are the hospital infection main causer, and the

Enterobacteriaceae family is responsible for 95% of these infection cases.

Among them, Klebsiella sp. is the main causal agent of hospital pulmonary

infections, with high severity indices for pneumonia development. Therefore,

novel antibiotics with different mechanism of action need to be urgently

developed. Plant antimicrobial peptides (AMPs) have been characterized as a

valuable source for antibiotics discovery. In this report, a novel antimicrobial

peptide isolated from Sesamum indicum is described. This new antimicrobial

peptide from sesame kernels (Si-AMP) showed activity toward human

pathogens. For peptide isolation, sesame kernels were triturated with an

extraction solution followed by precipitation with (NH4)2SO4 (100%). After

dialysis, a rich protein fraction was separated onto an affinity

chromatography, followed by RP-HPLC analytical chromatography. Mass

spectrometry analysis (MALDI-ToF) indicated that the molecular mass of Si-

AMP was approximately 5.8 kDa. The N-termini sequence indicated that Si-

AMP could be included into the albumin 2S family. Moreover, Si-AMP was

evaluated against Gram-negative bacteria, causing a remarkable reduction

only on Klebsiella sp. growth. In conclusion, results here reported indicate

that, in a near future, Si-AMP could be utilized in the development of novel

proteinaceus antibiotics against pathogenic Gram-negative bacteria.

Keywords: antimicrobial peptides, Sesamun indicum , 2S albumins, Klebsiella

sp.

VIII

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AMPs - Peptídeos antimicrobianos

cDNA - DNA complementar (Complementary DNA)

CLED - Cystine lactose electrolyte deficient

CN - Controle negativo

CP - Controle positivo

EMB - Eosin methylene blue

FRP - Fração rica em proteínas

H2S - Sulfeto de hidrogênio

HCl -Ácido clorídrico

HNP - Human neutrophil peptides

HPLC - Cromatografia líquida de alta performance (high performance liquid

chromatography)

ITU - Infecções do trato urinário

LB - Meio Luria Bertani

LPS

Lipopolissacarídio

LTP - Proteínas transferidoras de lipídeos (Lipid-transfer proteins)

MALDI-TOF - Matrix-assisted laser desorption time of flight analysis

ME - Membrana bacteriana externa

MI - Membrana bacteriana interna

MM - Marcador molecular

MS - Espectrometria de massa (Mass spectrometry)

IX

m/z - Massa/carga

NaCl - Cloreto de sódio

NCBI - National Center for Biotechnology Information

(NH4)2SO4 - Sulfato de amônio

OD - Densidade ótica

OMS - Organização Mundial da Saúde (World Health Organization)

pH - Potencial hidrogênio iônico

pI - Ponto isoelétrico

PIC - Porcentagem de inibição de crescimento

PNR - Proteínas não retidas

PR - Proteína retida

PS - Exo- e capsular-polissacarídeos

RPM - Rotações por minuto

RIPs - Proteínas inativadoras de ribossomos (ribosome-inactivating proteins)

RP-HPLC - Cromatografia líquida de alta performance por fase reversa

(Reversed-phase high-performance liquid chromatography)

SDS - Dodecil sulfato de sódio (Sodium dodecyl sulfate)

SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de

sódio (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

Si-AMP - Peptídeo antimicrobiano isolado de Sesamum indicum

TCA - Ácido tricloroacético

TFA - Ácido trifluoroacético

UFC - Unidade formadora de colônia

X

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Agentes mais comuns de infecções nosocomiais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

Tabela 2: Testes bioquímicos para identificação de gêneros de

Enterobacteriaceae .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Tabela 3: Maiores classes de antibióticos, seus mecanismos de ação,

resistência e doenças bacterianas relacionadas .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Tabela 4: Proteínas antimicrobianas isoladas de plantas e suas

respectivas atividades a microrganismos alvo .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Tabela 5: Modelos de ação de peptídeos antimicrobianos .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

Tabela 6: Seqüência N-terminal parcial de resíduos de aminoácidos de

Si-AMP por seqüenciamento de Edman ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

XI

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas . . . . . . . . . 12

Figura 2: Representação esquemática de um envelope celular de uma

enterobactéria Gram-negativa .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

Figura 3: Ilustração esquemática da ação antimicrobiana de peptídeos. . . . . . . . . . . 25

Figura 4: Estrutura tridimensional de uma albumina 2S de B. napus . . . . . . . . . . . . . . 30

Figura 5: Cromatografia de afinidade em Red-Sepharose CL-6B e Blue-

Sepharose CL-6B, de fração rica de S. indicum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

Figura 6: Cromatogramas de RP-HPLC de PR de Red-Sepharose .. . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Figura 7: SDS-PAGE a 12% de PR e PNR de Red-Sepharose .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Figura 8: SDS-PAGE das frações protéicas de semente de gergelim (S.

indicum L.) separadas por RP-HPLC ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

Figura 9: Espectro de massa (MALDI-TOF) de Si-AMP ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Figura 10: Alinhamento de Si-AMP com proteínas da família albumina

2S .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

Figura 11: Bioensaios em meio LB ágar. FRP, PR e PNR de Red-

Sepharose contra Klebsiella sp.; Proteus sp.; S. pyogenes ; E. coli ;

Salmonella sp. e S. aureus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

XII

Figura 12: Bioensaios em meio LB ágar. FRP, PR e PNR de Red-

Sepharose contra Rathayibacter sp.; Xanthomonas sp.; B. subtilis ;

Erwinia sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Figura 13: Bioensaios em meio LB líquido de PR e PNR de Red-

Sepharose contra Klebsiella sp. e Proteus sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Figura 14: Bioensaios de PR e PNR de Blue-Sepharose contra Klebsiella

sp.; Proteus sp. e S. pyogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

Figura 15: Bioensaio de PNR de Red-Sepharose contra Klebsiella sp.;

Proteus sp. e Salmonella sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

Figura 16: Bioensaio de PNR Red-Sepharose contra Escherichia coli;

Xanthomonas sp. e Rathayibacter sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

Figura 17: Bioensaio de Si-AMP contra Klebsiella sp.; Proteus sp. e E.

coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

Figura 18: Bioensaio de Si-AMP contra Klebsiella sp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

1

INTRODUÇÃO

Antibióticos e resistência bacteriana

Doenças infecciosas sempre acompanharam a humanidade, a qual é

constantemente acometida por diversos males. Contudo, por muito tempo,

desconhecia-se que os microrganismos eram os seus agentes causadores. O

próprio nome infectio indicava algo de origem estranha que atacava o

homem. O conhecimento que alguns povos antigos possuíam era basicamente

intuitivo e, somente a partir de Hipócrates e seus ensinamentos, os

conhecimentos relacionados aos quadros clínicos de infecção evoluíram. No

século I a.C., Varrão e Columela fizeram a primeira referência a

microrganismos, dizendo que as doenças eram causadas por seres vivos

invisíveis (Animalia minuta), capazes de penetrar no corpo através da

ingestão alimentos e ar . Já no século XVI, Hieronymus Fracastorius descreveu

esses seres como sementes invisíveis, denominadas contagium vivum , como

citado por Figueiredo (1995).

Fortalecia-se, então, a concepção de que as doenças eram causadas por

germes e miasmas, os quais são substâncias produzidas por matérias orgânicas

em decomposição e transmitidas pelo ar. Baseado nesse conceito, sobre tudo

durante as eclosões epidêmicas, o combate às doenças infecto-contagiosas

dava-se por meio da ação de substâncias químicas desinfetantes. O resultado

foi o emprego de grandes quantidades de diferentes produtos fabricados pela

indústria química, tais como sulfato de cobre, cloreto de cálcio, ácido

sulfúrico, enxofre, ácido fênico, sulfato de ferro, bicloreto de mercúrio,

carbonato de soda e ácido clorídrico, cresol, cal, álcool, vaselina,

2

permanganato de potássio e, mais ainda, os compostos, lisol e creolina. A

desinfecção era feita nos aposentos e prédios, onde se registrara a doença,

aspergindo-se os compostos químicos nas paredes, no teto e no assoalho

(Ribeiro, 2001).

O surgimento do microscópio por volta de 1600 foi de notável

importância para a descoberta dos microrganismos. No século XIX,

desenvolveu-se de maneira surpreendente o conhecimento sobre as infecções e

surgiu a microbiologia (Figueiredo, 1995). Entretanto, apenas no final da

década de 20, a concepção miasmática de transmissão da doença foi superada.

Isso ocorreu devido aos avanços nos conhecimentos epidemiológicos, os quais

permitiram demonstrar que os canais de transmissão das doenças infecciosas

eram mais complexos do que se presumia, concluindo que as desinfecções

eram ineficientes para evitar os surtos epidêmicos e a própria doença

(Ribeiro, 2001). A atividade antagônica entre o germe que agride e o

organismo defendendo-se, começou a ser entendida no final do século XIX,

com o surgimento da imunologia.

Nos últimos 60 anos, avanços referentes à rapidez no diagnóstico e início

do tratamento, promoveram redução considerável no índice de morbidade e

mortalidade relacionadas a essas doenças. Em parte, isso se deve a enorme

amplificação dos conhecimentos microbiológicos, fisiopatológicos e clínicos,

relacionados às infecções, com o advento do século XX. Dessa forma,

permitiu-se um melhor entendimento do fino mecanismo da biologia

molecular dessas doenças e, principalmente, o desenvolvimento de

3

tratamentos antimicrobianos seguros e eficazes, capazes de atacar o agente

específico causador da infecção (Figueiredo, 1995; Alanis, 2005).

A descoberta da penicilina G marca o início de uma era moderna dos

antibióticos, servindo de molde para a síntese de futuros fármacos, a partir de

modificações em sua estrutura molecular. Assim, foi possível o

desenvolvimento fármacos com maior eficiência e reações adversas menos

severas. As penicilinas isoladas de Penicillium chrysogenum foram

introduzidas na década de 40, mostrando-se ativas tanto sobre cocos Gram-

positivos quanto Gram-negativos, sendo 85% dos isolados de Staphylococcus

aureus susceptíveis a < 0,1 g da droga (Gootz, 1990). Inicialmente, o acesso

aos primeiros antibióticos sistêmicos disponíveis (sulfonamidas e penicilina)

era restrito, de uso reservado para as forças armadas durante a segunda guerra

mundial. Contudo, ocorreu a descoberta de novos antibióticos, a simplificação

do processo de manufatura e o desenvolvimento de novas formulações mais

eficazes e econômicas. Com isso, o acesso a antibióticos foi

consideravelmente facilitado, a ponto de tornarem-se verdadeiras panacéias

da medicina, sendo usados para os mais comuns e triviais tipos de infecção,

muitas das quais não-bacterianas (Alanis, 2005). Em conseqüência do uso

inadequado da penicilina, em apenas um ano surgiu um número significativo

de cepas mutantes de S. aureus resistente a este antibiótico e, em 1948, 50%

das cepas isoladas de hospitalares já se mostravam resistentes, atingindo o

nível de 80% em 1957 (Gootz, 1990; Alanis, 2005). Em seguida, outros

agentes como a eritromicina, cloranfenicol e tetraciclinas foram usados como

escolha mais freqüente para o tratamento de S. aureus , já resistentes à

penicilina. Entretanto, a resistência bacteriana a esses agentes também

4

cresceu, limitando seu uso clínico por volta de 1950. Até mesmo para a

meticilina, derivado semi-sintétido do núcleo ativo da penicilina (ácido 6-

aminopenicilânico) e que assumiu importante papel no controle da infecção de

S. aureus , foram observadas bactérias resistentes e, posteriormente, casos de

infecção hospitalar na Europa em 1960 (Gootz, 1990; Kollef, 2001).

Mais de 60 anos se passaram desde a introdução dos primeiros

antibióticos e o subseqüente desenvolvimento de resistência bacteriana.

Atualmente, entretanto, a situação permanece a mesma. Todos os dias

bactérias, até então susceptíveis a ação de algum agente antibacteriano, são

relatadas apresentando resistência. Além de causar significantes infecções

hospitalares, afetando pacientes hospitalizados, recentemente, essas bactérias

vêm se espalhando na comunidade e provocando doenças severas em pacientes

previamente saudáveis (Alanis, 2005). Dessa forma, segundo a Organização

Mundial da Saúde (2005), agentes antimicrobianos tornam-se medicamentos

essenciais para a saúde e bem-estar humano e animal, e a resistência a esses

agentes é uma preocupação de saúde pública mundial.

A infecção hospitalar ou nosocomial, que por definição é uma reação

patológica causada por microrganismos provindos de ambientes hospitalares

durante a internação ou após a alta do paciente (Ellenberg, 2004; ANVISA,

2004), representa um importante problema de saúde pública mundial. A

infecção hospitalar pode ser adquirida não apenas por pacientes, que

apresentam maior susceptibilidade, mas também, embora menos

freqüentemente, por visitantes e funcionários do próprio hospital (Lipsitch,

2000). No Brasil, segundo a ANVISA (2004), a taxa média de infecção

5

hospitalar é de cerca 15%, ao passo que nos EUA e na Europa é de 10%. A

Infectious Diseases Society of America relatou em 2004 que, nos hospitais

americanos, aproximadamente 2 milhões de pessoas são infectadas por

bactérias anualmente, resultando em óbito em aproximadamente 4,5% dos

casos. (http://www.idsociety.org/pa/IDSA_paper4_final_web.pdf). Uma das

causas principais da gravidade das infecções é a resistência bacteriana cada

vez maior aos agentes antimicrobianos, acometendo tanto países em

desenvolvimento como desenvolvidos (Simonsen, 2004; Kollef & Fraser,

2001).

Este quadro de emergência mundial é profundamente agravado pelo mau

uso dos agentes antimicrobianos disponíveis, onde se incluem freqüentes

prescrições inadequadas, dosagens inferiores à necessária e baixa qualidade

da formulação terapêutica. A alta parcela de contribuição nesse quadro

também é devida à baixa adesão aos programas de tratamento, onde é

freqüente a ocorrência de duração insuficiente da terapia ou mesmo o uso

intensivo e prolongado dos agentes. Por fim, o excesso de produtos

antimicrobianos comuns (artigos de limpeza, esponjas, chinelos e até tábuas

de carne com produtos antibacterianos) termina promovendo alta pressão

seletiva. Conseqüente, ocorre propagação de patógenos multi-resistentes em

hospitais, em outros centros de cuidado à saúde e na população, levando a

séria limitação quanto à escolha dos antibióticos adequados para o tratamento,

especialmente em pacientes em estado de saúde crítico. Assim, a resistência a

medicamentos é o maior sinal de debilidade no tratamento de doenças

infecciosas severas (Simonsen, 2004; Alanis, 2005; Byarugaba, 2004; Kollef

& Fraser, 2001; Barrett, 2005), consistindo em um grande desafio que requer

6

uma ação multidisciplinar e um esforço comum envolvendo todas as unidades

de saúde públicas e privadas (Organização Mundial da Saúde, 2005).

Bactérias patogênicas causadoras de infecção hospitalar

Diferentes microrganismos como bactérias, fungos e vírus causam

infecções hospitalares. Os fungos são responsáveis por aproximadamente 8%

das infecções hospitalares, enquanto as viroses representam por volta de 5%

das infecções. No entanto, o grupo de patógenos que mais se destaca é o das

bactérias, sendo estas relacionadas a 87% dos casos. Os patógenos que

lideram no ranking das infecções hospitalares estão descritos na Tabela 1

(ANVISA, 2004).

Tabela 1: Agentes mais comuns de infecções nosocomiais (ANVISA, 2004).

Patógeno Sítios comuns de isolamento do patógeno

Bactérias Gram-negativas

Escherichia coli Trato urinário, feridas cirúrgicas, sangue

Pseudomonas sp. Trato urinário, trato respiratório, queimaduras

Klebsiella sp. Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas

Proteus sp. Trato urinário, feridas cirúrgicas

Enterobacter sp. Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas

Serratia sp. Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas

Bactérias Gram-positivas

Streptococcus sp. Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas

Staphyloccus aureus Pele, feridas cirúrgicas, sangue

Staphyloccus epidermitis Pele, feridas cirúrgicas, sangue

Fungi

Cândida albicans Trato urinário, sangue

Outros Trato urinário, sangue, trato respiratório

7

Enterobacteriaceae é a maior e mais heterogênica família de bactérias

Gram-negativas de grande importância associada à ocorrência dessas

infecções. Enterobacteriaceae são isoladas em 95% das amostras implicadas

em casos clínicos. Atualmente, são considerados 27 gêneros, 102 espécies e 8

grupos indefinidos dentro desta família (ANVISA, 2004). Dentre essas, as

causadoras de infecções hospitalares predominantes são Escherichia coli e

Proteus sp., envolvidas em infecções do trato urinário (ITU), bem como

Klebsiella sp. e Enterobacter sp., importantes na ocorrência de pneumonias e

infecções intestinais. Entretanto, todas as Enterobacteriaceaes têm sido

implicadas em infecções sangüíneas, peritonites, colites e outras infecções

intra-abdominais. Adicionalmente, um microorganismo como Salmonella sp. é

capaz de produzir gastroenterites e, subseqüentemente, em alguns pacientes,

infecção invasiva (Paterson, 2006; ANVISA, 2004).

As ITUs estão entre as doenças infecciosas mais comuns na prática

clínica, particularmente em crianças, adultos, jovens e mulheres sexualmente

ativas, sendo apenas menos freqüente que as do trato respiratório. No meio

hospitalar, ITUs são as mais freqüentes entre as infecções nosocomiais em

todo o mundo. Por convenção, define-se como ITU tanto as infecções do trato

urinário baixo (cistites), como as do trato urinário alto (pielonefrites).

Dentre as infecções hospitalares, a infecção pulmonar é a que leva a

óbito com maior freqüência, com um risco maior em unidades de terapia

intensiva. A prevalência de pneumonias varia entre 10 e 65%, com 13 a 55%

de casos fatais. Entre os agentes mais freqüentemente isolados estão

Klebsiella sp., E. coli , Enterobacter sp.. De uma maneira geral os

8

microrganismos podem alcançar o trato respiratório pela aspiração de

secreções da orofaringe, pela inalação de aerossóis contendo bactérias, pela

translocação de microrganismos do trato gastrointestinal ou pela disseminação

hematogênica de um foco a distância. Ainda, para que ocorra infecção

respiratória, é necessário que haja a perda das defesas do hospedeiro e um

inóculo suficiente para alcançar o trato respiratório, ou a presença de

microrganismos altamente virulentos (ANVISA, 2004).

Como características da família Enterobacteriaceae, têm-se bacilos

Gram-negativos, não esporulados, com mobilidade variável, oxidase negativa,

e que crescem em meios básicos (caldo peptona), meios ricos (ágar sangue,

ágar chocolate e CLED) e meios seletivos (Mac Conkey, EMB). Estes bacilos

são anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), fermentam

a glicose com ou sem produção de gás, são catalase positivos, e reduzem

nitrato a nitrito. A maioria é encontrada no trato gastrointestinal de humanos,

no reino animal, na água, solo e vegetais (ANVISA, 2004). Dessa forma,

considera-se necessário que os laboratórios de microbiologia utilizem

metodologias que permitam discriminar com 80% de acerto os gêneros e

espécies mais comuns. Nas quais se incluem uma série de provas bioquímicas

(Tabela 2), avaliação de crescimento em meios de cultura específicos, assim

como provas sorológicas, de acordo com a presença dos antígenos: somático,

flagelar e de envoltório ou cápsula.

9

Tabela 2: Testes bioquímicos para identificação de gêneros de Enterobacteriaceae (Trabulsi et al . , 1999)

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+/-

+/-

-

+/-

+: positivo, -: negativo, + / -: positivo e negativo

Bactérias Gram-negativas apresentam uma dupla camada membrânica, a

qual consiste em uma membrana interna (MI) rica em fosfolipídios e uma

externa (ME) rica em fosfolipídios e lipopolisacarídios (LPS). O espaço

periplasmático separa essas membranas e contém peptideoglicanos. Vários

grupos de proteínas estão associados a essas membranas, como as porinas,

associadas a ME, a qual permite a passagem de nutrientes; as lipoproteínas,

associadas a ME por uma calda lipídica na subunidade N-terminal; as

proteínas integrais, que atravessam a ME em várias regiões; as

periplasmáticas; e as associadas à MI, envolvidas com ligação a ATPs,

transporte de íons e pequenas moléculas (Cordwell, 2006). Bactérias Gram-

negativas produzem uma variedade de polissacarídeos. Entre esses, o LPS

bem como os polissacarídeos exo- e o capsular- (PSs) são particularmente

importantes para sua interação com o sistema imune do hospedeiro.

Testes bioquímicos

10

Entretanto, esses polissacarídeos diferem quanto à localização na parede

celular bacteriana e função. Enquanto LPSs estão ancorados na membrana

bacteriana externa de Gram-negativas através de sua camada lipídica e atuam

como moléculas padrão associadas ao patógeno, estimulando a resposta do

hospedeiro, PSs são liberados no meio extra celular e podem formar barreiras

físicas (biofilmes e estruturas capsulares), as quais favorecem a evasão da

resposta imune do hospedeiro (Herasimenka, 2005).

Além disso, bactérias Gram-positivas apresentam composição singular

em sua parede celular, a qual se baseia em mureína e peptideoglicanos,

formando um arcabouço composto por alternância de N-acetil-glicosamina e

ácido N-acetilmurâmico (Cordwell, 2006; Lodish, 2000), onde se encontra

ligado o ácido teicóico. Este ácido pode facilitar a ligação e a regulação de

entrada e saída de cátions nas células e regular a atividade das autolisinas

durante o processo de divisão celular (Baron, 1996). Estas diferenças entre

bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Figura 1) são características

determinantes na resistência ou susceptibilidade à entrada de um determinado

antibiótico no interior da célula.

No século XVIII, começaram os relatos envolvendo LPS, a partir da

busca por substâncias produtoras de febre e doenças, as quais estariam

associadas a condições anti-higiênicas. LPS foi referido inúmeras vezes como

sendo parte de um material pirogênico, veneno pútrido e toxina. Somente em

1892, LPS foi classificado como endotoxina, com sua identificação em Vibrio

cholerae . LPS tem como caracterização estrutural sua natureza anfipática e

forte tendência a formar agregados, o que dificulta a determinação da sua

11

massa molecular. LPS é constituído por três regiões as quais são, em ordem a

partir da membrana, um lipídeo (chamado lipídeo A) ligado a uma região

central de aproximadamente 10 oligossacarídeos, que por sua vez está ligado

a um glicosídio, constituído de subunidades repetitivas, chamado cadeia-O ou

antígeno-O específico. A estrutura do LPS se dirige para fora da superfície da

bactéria, estendendo-se até 10 nanômetros da superfície (Figura 2) (Caroff &

Karibian, 2003).

Embora secretadas pelas células, pequenas quantidades de LPS são

liberadas no meio sob algumas condições, como divisão celular. Porém, como

bactérias Gram-negativas crescem em alta densidade na circulação sangüínea,

grandes quantidades de LPS são liberadas rapidamente quando a bactéria é

destruída por antibióticos, fagócitos ou pelo tratamento com quelatos de

cátions divalentes (Caroff & Karibian, 2003; Munford & Varley, 2006). No

hospedeiro infectado, pequenas quantidades de LPS podem ser protetoras, por

estimular o sistema imune, tendo sido usadas, por exemplo, para a diminuição

de tumores. Entretanto, grandes quantidades de LPS induzem à resposta

exacerbada do sistema inflamatório, à febre elevada, ao aumento da

freqüência cardíaca, além de conduzir ao choque séptico e à morte pela falha

dos pulmões e rins, e coagulação intravenosa (Caroff & Karibian, 2003).

12

Parede celularParede celular

Figura 1: Parede celular de bactérias Gram-posit ivas (direita) e Gram-negativas (esquerda) (adaptada de Baron, 1996).

13

Figura 2: Representação esquemática de um envelope celular de uma enterobactéria Gram-negativa, à esquerda; uma estrutura l ipopossacarídica, à direi ta (adaptada de Caroff , 2003).

14

Klebsiella sp.

Bactérias do gênero Klebsiella são Gram-negativas, pertencentes à

família Enterobacteriacea, e têm como característica colônias com 0,3-1,0 µ m

de diâmetro e 0,6-6,0 µ m de comprimento, e temperatura ótima de

crescimento de 37 ºC. Em adição, Klebsiella sp. contém uma larga cápsula

polissacarídica, que a distingue das demais Enterobacteriacea, exceto para

algumas cepas de Enterobacter aerogenes e E. coli (Holt et al . , 1994). As

espécies de Klebsiella de importância médica são K. pneumoniae , K. oxytoca

e K. planticola (Podschun & Ullmann, 1998).

Klebsiella é a causa mais comum de pneumonia comunidade-adquirida do

tipo bacteriana, principalmente em alcoólatras crônicos, e sua patogenicidade

leva a altos índices de fatalidade quando não tratadas. Entretanto, as

infecções por Klebsiella sp. estão frequentemente associadas com

hospitalização, sendo uma das principais causas de infecções hospitalares.

Como um patógeno oportunista, essas bactérias atacam primariamente

indivíduos inumo-deprimidos, que estão hospitalizados, ou que apresentam

alguma doença debilitante severa. Estima-se que Klebsiella sp. seja

responsável por 8% de todos os casos de infecção hospitalar dos Estados

Unidos e Europa, principalmente Klebsiella pneumoniae , a qual responde por

uma porção significante das ITUs, pneumonias, septicemias e infecções

brandas em tecidos (Podschun & Ullmann, 1998).

Klebsiella pneumoniae é uma dos principais responsáveis por mortes

causadas por bacteremia, tendo sido relatado por Douglas (2004) como

causador de infecção sanguínea com fatalidade em 33% dos casos

15

australianos, só ficando atrás de Enterobacter sp. (43%). Ainda neste estudo,

Klebsiella sp. foi isolada em 12% dos casos de bacteremia intra-abdonimal, e

Klebsiella pneumoniae foi a segunda mais comum em pneumonias em adultos

(21%), ficando atrás apenas de Burkholderia pseudomallei (26%).

Recentemente, Klebsiella sp. também vem sendo associada à crescente

ocorrência de fasciite necrosante (Wong, et al . , 2004), que uma infecção

tecidual bacteriana associada com o rápido progresso de necrose subcutâneo e

fáscia superficial, podendo evoluir para o tecido adiposo e músculos (Lima et

al . , 2003; Wong, et al . , 2004). A fasciite necrosante causada por Klebsiella

sp. pode ser agravada em condições de predisposição, como diabetes mellitus ,

além da propensão a disseminação por metástase resultando em múltiplos

focos de infecção (Wong, et al . , 2004).

Atualmente, teme-se o surgimento de cepas de Klebsiella sp.

multiresistente a medicamentos, de forma totalmente justificável devido ao

seu longo histórico de desenvolvimento de resistência a antibióticos. Em

1970, surgiram cepas de Klebsiella sp. resistentes a aminoglicosídeos. E

desde 1982, surgem cepas produtoras de uma variedade de -lactamases,

capazes de inativar cefalosporinas e, posteriormente, ceftazidimas e demais

agentes -lactamâmicos. Como a ação das -lactamases é mediada por

plasmídeos, os quais são facilmente transferidos entre colônias, uma única

cepa pode ser resistente a mais de um ou até a todos os antibióticos -

lactamâticos existentes (Podschun & Ullmann, 1998).

16

Mecanismo de resistência bacteriana e antibióticos desenvolvidos

A lista de bactérias que desenvolveram resistência a antibióticos é

extensa e relativamente preocupante, correspondendo a mais de 70% das

bactérias que causam infecção (Barrett, 2005). O desenvolvimento de

mecanismos de resistência teve início com Staphylococcus aureus resistentes

à penicilina e sulfamidas nos anos 1930s e, em 1940, Neisseria gonorrhoeae

resistente à penicilina. Segue, em 1970, com Haemophilus influenzae mutante

produtor de -lactamases, S. aureus resistentes a meticil ina. No final dos anos

1970s e 1980s, ocorreu o ressurgimento de Mycobacterium tuberculosis multi-

drogas resistente, assim como resistência de diversas cepas de bactérias

Gram-negativas comuns entéricas e não entéricas, tais como Shigella sp.,

Salmonella sp., Vibrio cholerae , E. coli , K. pneumoniae , Acinetobacter

baumanii , Pseudomonas aeruginosa . A maioria destes casos de resistência

bacteriana está associada ao uso de produtos antimicrobianos em animais,

criados para o consumo humano, durante seu crescimento, principalmente nas

duas últimas décadas do século XX.

Entre 1988 e 1990, devido o uso excessivo de ceftazidima, Enterobacter

cloacae mostrou resistência a cefalosporina. Recentemente, com a ocorrência

de infecções adquiridas pela comunidade, causadas pela propagação de

bactérias resistentes fora do ambiente hospitalar, observerva-se o

desenvolvimento de determinadas cepas de Streptococcus resistentes a

macrolídeos, S. pneumoniae resistentes a diferentes classes de antibióticos,

incluindo penicilina, cepas mais virulentas de S. aureus resistentes a

meticilina (devido à expressão de determinadas toxinas), assim como

17

enterococos que se tornaram resistentes à vancomicina (Alanis, 2005; Kollef

& Fraser, 2001). Pelo menos 17 classes de antibióticos foram produzidas até

2005, mostradas na Tabela 3, e para todas foi desenvolvido um ou mais

mecanismos de resistência, sendo, na realidade, algumas bactérias capazes de

apresentar resistência, a dois ou mais antibióticos. Isto, além de tornar os

tratamentos de infecções causadas por esses microrganismos extremamente

difíceis, eleva os custos e o índice de morbidade e mortalidade associados à

infecção (Alanis, 2005). Portanto, é importante ter um bom conhecimento

sobre a base molecular dos mecanismos de resistência para que, a partir da

determinação do modo de infecção usado por essas bactérias, possam-se

desenvolver novas estratégias para o controle bacteriano. Os custos

biológicos mundiais associados ao controle e tratamento de infecções e

desenvolvimento de resistência, e a produção de novos antibióticos são

estimados entre 100 milhões a 30 bilhões de dólares. Além disso, a descoberta

de novos agentes antimicrobianos decaiu muito desde 1970 (Byarugaba, 2004;

Kollef & Fraser, 2001).

Em geral, tem sido visto que a resistência bacteriana tem fundamentação

em nível genético, indicando que mudanças na composição genética das

bactérias previamente suscetíveis ocorrem, tanto por mutação quanto por

introdução de novo material genético, e sua expressão resulta em

modificações em um ou mais mecanismos biológicos da bactéria afetada,

determinando o tipo de resistência que irá desenvolver (Alanis, 2005). Esses

genes de resistência podem ser adquiridos de outras espécies e transmitidos

por replicação (Byarugaba, 2004).

18

Tabela 3: Maiores classes de antibióticos, seus mecanismos de ação, resistência e doenças bacter ianas relacionadas (Alanis, 2005; Byarugaba, 2004; Carlavil laa et

al . , 2005; Rodríguez & Sánchez, 1994; Mendes et al . , 2002; Jackson et al . , 1998; Mangil i et al . , 2005; Schmitza et al . , 1999; Casellas et al . , 2003).

Mecanismo de ação Família de antibióticos Agente resistente Doença

S. pneumoniae Pneumonia Beta-lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenêmicos) N. gonorrhoeae Gonorréia tifóide

Glicopeptídeos S. aureus Nosocomiais

Lipopeptídeos cíclicos (daptomicina)

S. aureus Nosocomiais

Oxazolidononas Enterococcus sp. Nosocomiais

Streptograminas S. aureus Nosocomiais

Cetolídeos Enterococcus sp. Nosocomiais

Macrolídeos Enterococcus sp. Nosocomiais

Inibição da síntese de parede celular

Lincosamidas Enterococcus sp. Nosocomiais

Tetraciclinas N. gonorrhoeae Gonorréia tifóide Inibição da síntese de proteínas

Aminoglicosídeos

P. aeruginosa Nosocomiais Inibição da síntese de DNA Fluoroquinolonas

S. pneumoniae Pneumonia

Inibição da síntese de RNA Rifampina K. pneumoniae Pneumonia

Sulfonamidas M. pneumoniae Pneumonia Inibição competitiva da inibição da síntese do ácido fólico Trimetoprim S. aureus Nosocomiais

Agentes desorganizadores de membrana

Polimixinas (Polimixina B, Colistina)

S. aureus Nosocomiais

Outros mecanismos Metronidazol C. perfringens Gastrenterites

19

Para o desenvolvimento de resistência, é necessário que dois elementos

chaves combinem-se: a presença de um antibiótico capaz de inibir a maioria

das bactérias presentes em uma colônia e em uma colônia heterogênea de

bactérias, onde pelo menos uma destas bactérias carregue o determinante

genético capaz de expressar resistência ao antibiótico (Paterson, 2006). A

resistência a antibióticos pode ser natural, também conhecida como

intrínseca, ou adquirida. A forma de resistência natural é causada por mutação

gênica espontânea na falta de pressão seletiva pela presença de antibióticos,

sendo mais comum que a adquirida (Alanis, 2005).

Peptídeos antimicrobianos: novas estratégias na resolução de velhos

problemas.

Todos os organismos vivos, abrangendo desde microrganismos até

plantas e animais, evoluíram de forma a desenvolver mecanismos para

ativamente defender-se contra o ataque de patógenos. O mais sofisticado

desses mecanismos desenvolve anticorpos, após um primeiro reconhecimento,

os quais permitem eliminar invasores específicos (Bulet et al. , 2004;

Pelegrini & Franco, 2005; Franco et al. , 2006). Porém, essa ação de resposta

imune adquirida no reconhecimento de organismos estranhos, é apenas

elaborada por um pequeno subtipo de organismos, denominados vertebrados

superiores. Entretanto, a imunidade natural é muito mais comum, e entre suas

respostas, incluem-se componentes cruciais como fenóis, substâncias

secundárias e peptídeos antimicrobianos (AMPs) (Thomma et al. , 2002;

Frecer et al. , 2006).

20

AMPs são desprovidos de anticorpos com reconhecimento específico

para antígenos. Contudo, por serem simples produtos da transcrição e

tradução gênica, AMPs podem ser rapidamente sintetizados após a infecção,

com um gasto limitado de energia e biomassa (Pelegrini & Franco, 2005;

Thomma et al. , 2002; Bulet et al. , 2004; Boman et al. , 2003). Geralmente,

AMPs contém 15-45 resíduos de aminoácidos (Boman et al. , 2003) e são

catiônicos, principalmente aqueles que possuem carga líquida positiva em pH

fisiológico, a qual deve-se a sua constituição de aminoácidos, com maior

quantidade de argininas e lisinas (carregados positivamente). Essa

característica catiônica pode ser reforçada por uma amidação em C-terminal.

Em adição à propriedade catiônica, AMPs freqüentemente adotam estruturas

anfipáticas, com suas subunidades hidrofóbicas lado a lado, as quais

correspondem a mais de 50% dos seus aminoácidos. Assim, esses peptídeos

catiônicos/hidrofóbicos tende a ter maior facilidade em interagir e se inserir

em paredes celulares aniônicas ou em membranas fosfolipídicas de

microrganismos (Brown e Hancock, 2006; Bulet et al. , 2004).

AMPs são particularmente potentes e apresentam um amplo espectro de

ação. Normalmente sua atividade não se restringe a um único tipo de patógeno

como bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, protozoários.

Alguns AMPs também apresentam uma tendência a ser hemolíticos, enquanto

outros podem ser usados como inseticidas (Hancock et al. , 2006).

Recentemente, tem sido evidenciado que alguns AMPs podem exercer funções

na modulação da imunidade, as quais têm impacto em infecções e inflamações

(Brown & Hancock, 2006). Estes peptídeos podem ser isolados de insetos

(Casteels et al. , 1989; Cudic et al. , 1999), mamíferos, invertebrados (Bulet et

21

al. , 2004; Nagashima 2003; Hancock et al. , 2006), microrganismos (Bizani et

al. , 2005) e diversos tecidos de vegetais como folhas (Dahot et al. , 1999),

flores (Fujimura et al. , 2004), frutos (Pelegrini et al. , 2006), caules (Xiaa et

al. , 2005; Fujimura et al. , 2005) e sementes (Franco et al. , 2006; Fujimura et

al. , 2003).

Plantas são organismos incapazes de escapar do ataque de patógenos por

simples movimentação para um ambiente mais favorável, mas, ainda assim,

raramente são acometidas por doenças, apesar de constantemente expostas a

uma grande variedade de microrganismos. Dessa forma, ao longo da evolução,

as plantas desenvolveram barreiras físicas e a produção de AMPs como seu

sistema primordial de defesa, capazes de mostrar diferentes atividades contra

diferentes tipos de microrganismos (Thomma et al. , 2001). As plantas

constituem, portanto, uma fonte rica para descoberta de novos agentes

antimicrobianos. Isso se confirma através das centenas de proteínas e

peptídeos antifúngicos e antibacterianos que foram descobertos nos últimos

anos (Thomma et al. , 2001; Franco et al . , 2006), podendo estes ser

classificados em diversos grupos, de acordo com sua massa molecular,

atividade, carga e estrutura tridimensional. Alguns exemplos de proteínas

antimicrobiana dos principais grupos são apresentados na Tabela 4.

Contudo, o mecanismo de ação preciso destes peptídeos não é

completamente entendido (Frecer et al. , 2006). Diversos modelos têm sido

propostos para explicar o mecanismo de ação dos AMPs (Tabela 4), mas em

basicamente todos, inicialmente os peptídeos catiônicos ligam-se a carga

negativa do LPS e a fosfolipídios na face externa da membrana bacteriana,

22

formando acumulados e agregados na superfície da membrana, e finalmente

permeabilizando/desintegrando a membrana bacteriana através de vários

mecanismos possíveis de formação de poros (Figura 3) (Frecer

et al. , 2006).

Dessa forma, AMPs mostram capacidade de neutralizar endotoxinas de

bactérias como LPS (Hancock et al. , 2006).

23

Tabela 4: Proteínas antimicrobianas isoladas de plantas e suas respectivas at ividades a microrganismos alvo.

Classe Planta de origem Microrganismo alvo Referência

PR-1 Folhas de Lycopersicon

esculentum

Phytophthora infestans Niderman et al . (1995)

-glucanases Sementes de Trit icale zhongsi Trichoderma sp. Na et al . (2002)

Quit inases Folhas de Phaseolus vulgaris R. solani Benhamou et al . (1993)

Proteínas de l igação à

quit ina

Semente de Vigna unguiculata F. oxysporum Nóbrega et al . (2005)

Defensinas Semente de V. unguiculata S. aureus, E. coli , Pseudomonas

syringae

Franco et al . (2006)

Proteínas semelhantes a

taumatinas

Sementes de Castanopsis

chinensis

Botrytis cinerea, F. oxysporum,

Mycosphaerella arachidicola, P.

piricola

Chu et al . (2003)

Proteínas semelhantes a

ciclofi l inas

Cicer arietinum R. solani, M. arachidicola, B.

cinerea

Ye et al . (2003)

Proteínas inativadoras de

ribossomos

Sementes de B. híspida Coprinus comatus , F. oxysporum ,

Physalospora piricola e

Mycosphaerella arachidicola

Ng & Parkash (2002)

Proteínas transferidoras de

l ipídeos

Grãos de H. vulgare Clavibacter michiganensis Molina et al . (1992)

inibidores de proteinase Tubérculo de S. tuberosum C. albicans, R. solani, C.

michiganense

Kim et al . (2005)

albuminas 2S Semente de P. edulis T. harzianum , F. oxysporum , e

Aspergil lus fumigatus

Pelegrini et al . (2006)

24

Tabela 5: Modelos de ação de peptídeos antimicrobianos (Brogden, 2005).

Modelo de atividade antimicrobiana Peptídeos

Mecanismo de formação de poros transmembrânicos Poro toroidal Magainina 2, protegrina-1, melittina, LL-37 e MSI-

78 Carpete Dermaseptina S, cecropina, melittina, caerina 1.1 e

ovispirina Poro em barril Alameticina

Modelos de morte intracelular

Floculação e conteúdo intracelular Peptídeos Aniônicos

Alterações na membrana citoplasmática PR-39, PR-26, indolicidina1 e microcina 25

Inibição da síntese da parede celular Mersacidina

Ligação a ácidos nucléicos Buforina II e tachiplesina

Inibição da síntese de ácidos nucléicos Pleurocidina, dermaseptina, PR-39, HNP-1, -2 e indolicidina

Inibição da síntese de proteínas Pleurocidina, dermaseptina, PR-39, HNP-1, -2 e indolicidina

Inibição da atividade enzimática Histatinas, pirrhocoricina, drosocina e apidaecina

25

Figura 3: Ilustração esquemática da ação antimicrobiana de peptídeos (adaptada de Brogden, 2005).

26

Proteínas da família albumina 2S

Proteínas de armazenamento, como globulinas e albuminas, são as

principais fontes de nitrogênio para o crescimento após a germinação da

semente. Dessa forma, plantas são hábeis no acúmulo dessas proteínas, as

quais são ativamente sintetizadas no retículo endoplasmático como um

precursor (Li et al . , 2006). Em seguida, as proteínas de armazenamento são

transportadas em vacúolos específicos, durante a maturação das sementes,

onde são processadas para sua forma madura. Inúmeras vias biossintéticas têm

sido propostas, entretanto, apesar de sua importância e do esforço realizado,

ainda não se entende o mecanismo principal de alvo desses vacúolos (Li et

al . , 2006; Pantoja-Uceda et al . , 2004).

Proteínas globulina 11S formam hexâmeros de 300-350 kDa, compostos

de uma subunidade ácida (30-40 kDa) e uma subunidade básica (20-25 kDa),

ligadas por uma única ligação dissulfeto. Um único gene também é

responsável pela síntese de ambas as subunidades, a partir da produção de um

precursor comum com 50-60 kDa, o qual é clivado pós-traducionalmente por

uma endopeptidase após a formação de uma ligação dissulfeto intercadeias,

unindo a porção N-terminal da subunidade ácida com a C-terminal da

subunidade básica. Da mesma forma, tem sido observado que as isoformas de

albuminas 2S são constituídas de uma subunidade pequena (4 kDa) e uma

subunidade grande (9 kDa), unidas por duas ligações dissulfeto, originadas de

um único produto gênico (17 kDa), o qual sofre processo pós-traducional,

sendo clivado pela mesma enzima asparagina endopeptidase envolvida no

processamento de globulinas 11S (Hsiao et al . 2006; Pantoja-Uceda et al . ,

27

2004). Adicionalmente, albuminas 2S apresentam distribuição característica

dos seus 8 resíduos de cisteínas em um modelo conservado

(. . .C.. .C.../ . . .CC...CXC...C...C.. .) . Dessa forma, além das duas ligações

dissulfeto que unem as suas subunidades, as albuminas 2S têm sua estrutura

estabilizada e compactada por duas ligações dissulfeto intracadeia. A

estrutura geral das albuminas 2S, como observada em napinas e outras

proteínas da mesma classe, são constituídas por 5 -hélices (Figura 4), sendo

duas observadas na subunidade pequena e três na grande (Pantoja-Uceda et

al . , 2002).

Albuminas 2S receberam essa denominação com base em seu coeficiente

de sedimentação (S20 . w), que é de aproximadamente 2 (da Silva et al . , 1996).

Albuminas 2S, além da sua função primordial de armazenamento, têm sido

relatadas como agentes emulsificantes (Burnett et al . , 2002) e, mais

recentemente, como agentes antifúngicos (Agizzio et al . , 2003; Pelegrini et

al . , 2006). Igualmente, o precursor de uma proteína albumina 2S inativa tem

sido descrito como um novo inibidor de tripsina, o qual, expresso em tomate e

tabaco, permite o desenvolvimento de plantas insetos-resistentes, como à

lagarta do tabaco (Spodoptera litura) (Mandal et al . , 2006). Ainda, têm-se

obtido aumento da concentração de metionina e cisteínas em plantas de arroz

trangênico, a partir do acúmulo de proteínas albuminas 2S (Lee et al . , 2003).

Dessa maneira, albuminas 2S apresentam um largo espectro de função. Além

disso, albuminas 2S têm sido identificadas e caracterizadas em sementes dos

mais diferentes gêneros e espécies, tal como Ricinus communis (da Silva et

al . , 1996); Pseudotsuga menziesii (Chatthai & Misra, 1998); Brassica

campestris , B . oleracea , B. nigra , B. juncea , e B. carinata) (Dasgupta et al . ,

28

1995); Glycine max (Lin et al . , 2004); Vitis vinifera (Li & Gray, 2005);

Passiflora edulis (Agizzio et al . , 2003; Pelegrini et al . , 2006). Entretanto, até

o presente momento, não existem relatos na literatura sobre proteínas da

família albumina 2S com atividade antibacteriana.

Gergelim: uma nova fonte de peptídeos antimicrobianos

Sementes têm-se apresentado como uma enorme fonte de proteínas de

defesa. Trigo e cevada, por exemplo, têm sido estudados por conter proteínas

do grupo das defensinas com propriedades antimicrobianas contras fungos que

atacam as plantações. (Oita et al. , 2000; Lindorff-Larsen et al. , 2001; Jing et

al. , 2003). Gergelim é uma das mais antigas sementes oleaginosas em

utilização pela humanidade. A despeito da sua importância, sua origem é

incerta. Provavelmente, vem sendo cultivada na Índia há muitos séculos, e

teve sua cultura expandida para o Japão, China, Turquia, Egito até as

Américas. Suas sementes são pequenas, ovais, levemente achatadas e com

coloração variando entre branco e preto. Além disso, gergelim mostra alto

valor econômico devido sua alta constituição de óleos e proteínas e seu

potencial uso em indústrias alimentícia, química e farmacêutica,

apresentando, em especial, atividade antioxidante e antimutagênica (Beltrão

& Vieira, 2001; Hu et al. , 2004).

Os altos teores de ácido graxos insaturados no óleo e de proteína

digestiva fazem do gergelim um alimento de excelente qualidade para o

homem e animais domésticos não ruminantes. Assim, com a busca de

29

alimentação protéica de baixo custo, tem-se levado à utilização de

subprodutos de processamento de grãos em diversos alimentos, ficando o

gergelim em posição privilegiada, pois, além do óleo, é rico em proteínas e

em aminoácidos sulfurados, particularmente metionina. Proteínas

representam, aproximadamente, entre 15 e 25% da matéria seca (Beltrão &

Vieira, 2001; Hsiao et al . , 2006). Proteínas de armazenamento globulina 11S

e albumina 2S correspondem, respectivamente, a 60-70 e 15-25% dessa

porção protéica. Convencionalmente designadas como -globulina e -

globulina, respectivamente, proteínas globulina 11S e albumina 2S são

encontradas em gergelim em inúmeras isoformas, as quais são rearranjadas de

modo randômico para formar oligômeros (Pastorello, et al . , 2001; Hsiao et

al . , 2006).

A expansão das franquias de fast food e produtos panificados têm grande

parcela de contribuição no aumento expressivo do consumo de gergelim. As

reações de hipersensibilidade tendem a ser mais severas in natura ,

frequentemente resultando em choque anafilático. Entretanto, os sintomas

mais freqüentes são: urticária, angeodema e estresse respiratório (Beyer et

al . , 2002). Os fatores alergênicos nas sementes de gergelim são

frequentemente associados a suas duas proteínas de armazenamento

majoritárias, globulina 11S e albumina 2S (Tai et al . , 1999; Pastorello, et al . ,

2001; Hsiao et al . , 2006). Assim, os esforços atuais se concentram em

identificar completamente a família gênica que codifica essas proteínas de

armazenamento, a partir do seqüenciamento de fragmentos de cDNA (Hsiao et

al . , 2006).

30

Figura 4: Estrutura tr idimensional de uma albumina 2S (PDB: 1PNB) proveniente

de B. napus . Em azul são descri tas as -hélices da subunidade pequena e, em verde,

as da subunidade grande (Pantoja-Uceda et al . , 2002).

31

JUSTIFICATIVA

A importância deste estudo deve-se a necessidade de se obter novas

ferramentas para o combate a microrganismos causadores de infecções ao

homem, dos quais praticamente todos já se mostram resistentes a algum dos

medicamentos atualmente comercializados. Entre essas, incluem-se bactérias

da família Enterobacteriaceae, principais causadoras de infecção hospitalar.

Peptídeos antimicrobianos de plantas (AMPs) vêm sendo visados para este

propósito, por serem, em sua grande maioria, potentes agentes antibióticos.

Além do mais, AMPs atuam por mecanismos diferentes dos antibióticos

existentes, consistindo, portanto, em uma alternativa eficiente no combate aos

microrganismos resistentes. Sementes, em especial, têm se mostrado ricas em

AMPs, o que se deve ao seu apurado sistema de defesa. Dessa forma, o

conhecimento prévio da elevada constituição protéica das sementes de

gergelim (S. indicum), principalmente proteínas de armazenamento da família

albumina 2S, até então não relatadas na literatura como antibacterianas,

fazem desse grão um amplo campo de descobertas de novos AMPs.

32

OBJETIVO

Isolar e caracterizar peptídeos de sementes de gergelim (S. indicum)

ativo contra bactérias patogênicas ao homem, causadoras de infecção

hospitalar.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Isolar e caracterizar peptídeos de sementes de gergelim (S. indicum) por

cromatografia de Red-Sepharose, seguida por cromatografia de fase reversa

em HPLC;

- Analisar a massa molecular dos peptídeos obtidos por SDS;

- Seqüenciar os respectivos peptídeos;

- Avaliar a atividade antibacteriana do peptídeo purificado contra

bactérias Gram-negativas e Gram-positivas patogênicas ao homem.

33

MATERIAL E MÉTODOS

Extração de Proteínas

As sementes de gergelim branco (Sesamum indicum L.), foram trituradas

e submetidas à extração através de trituração em solução extratora contendo

NaCl 0,6 M e HCl 0,1%, em proporção de 1:4 (massa/volume), permanecendo

em refrigeração (4ºC) durante 6 horas. O extrato bruto foi centrifugado por 90

minutos, a 4.000 RPM e 4ºC, tendo sido o precipitado descartado. Em

seguida, as proteínas presentes no sobrenadante foram precipitadas com

(NH4)2SO4 a 100% de saturação, com constante agitação, durante 12 a 24

horas. Seguiu-se nova centrifugação, nas condições descritas anteriormente,

por 45 minutos, tendo sido o precipitado dialisado 24 horas contra água

destilada (3.0 kDa cut off) . O material resultante foi então centrifugado a

3.500 RPM, por 15 minutos. O sobrenadante foi liofilizado, constituindo a

fração rica em proteínas (FRP).

Isolamento de albuminas 2S de sementes de S. indicum

A fração rica foi aplicada em duas colunas distintas, Red-Sepharose CL-

6B e Blue-Sepharose CL-6B, ambas com afinidade a moléculas catiônicas e

hidróficas, porém com ligantes diferentes (Procion Red HE-3B e Cibacron

Blue F3G-A, respectivamente), visando escolher a mais eficiente para

separação de proteínas com essas características. A coluna Red-Sepharose

CL-6B foi previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0,

34

contendo CaCl2 0,05 M, sendo as proteínas não retidas (PNR) eluídas com o

tampão de equilíbrio, enquanto as proteínas retidas (PR) foram liberadas com

tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0, contendo NaCl 3 M. Em paralelo, a coluna

Blue-Sepharose CL-6B foi equilibrada com tampão fosfato 0,02 M, pH 7,2, o

qual foi utilizado para lavagem do pico não retido, tendo sido o pico retido

eluído com o mesmo tampão acrescido de NaCl 2 M. A eluição protéica foi

monitorada em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 280 nm. O

fluxo aplicado na eluição foi de 0,25 mL.min- 1, sendo o volume das frações

coletadas de 2 mL.

Após nova diálise (3.0 kDa cut off) e l iofilização dos picos, os mesmo

foram avaliados quanto a sua atividade antimicrobiana. Em seguida, 1,0 mg

dos picos ativos foi ressuspendido em solução do pareador iônico ácido

trifluoroacético (TFA) a 0,1% e aplicados em uma coluna analítica de HPLC

de fase-reversa (Vydac C-18TP 522). Primeiramente, a fração retida foi eluída

usando gradiente l inear de acetonitr ila (0-100%) e fluxo de 1,0 mL.min- 1.

Entretanto, visando uma melhor separação dos picos protéicos eluídos na

faixa entre 20-50% de acetonitr ila, passou-se a utilizar gradiente não linear

de acetonitrila (5 a 0%; 5 de 0-20%; 35 de 20-50%; 10 de 50-70%; 5 70-

100%).

Análises de massa molecular por SDS-PAGE

As frações protéicas foram analisadas por SDS-PAGE, a 12 e 15%, de

acordo com Laemmli (1970), com menores modificações. Para tanto, alíquotas

35

de 30 g de proteína foram previamente precipitadas com ácido tricloacético

(TCA) 75%, na proporção de 133 L de TCA

75% para cada de 1,0 mL de

amostra, durante 30 minutos em repouso, a 15 C. Em seguidas, as amostras

foram centrifugadas, por 15 minutos a 13.400 RPM, e o sobrenadante

descartado. Os precipitados foram lavados com 1,0 mL de acetona gelada e

novamente centrifugados por 15 minutos a 13.400 RPM. Em seguida, as

amostras foram ressuspendidas em 20 L de tampão de amostra, contendo

Tris-HCl 20 mM pH 6,8, SDS 0,2%, azul de bromofenol 0,04%, glicerol 10%

e -mercaptoetanol 0,04%, e fervidas durante 10 minutos. A corrida foi feita

a 200 V e 20 mA, por aproximadamente 2 horas. Os géis foram corados com

prata.

Análises de massa molecular por espectrometria de massa

Os picos obtidos do HPLC foram liofilizados e submetidos à análise de

espectrometria de massa por Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight

Analysis (MALDI-ToF) em um Voyager-DE STR Bioworkstation. As amostras

foram dissolvidas em ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% e foi adicionado

ácido sinapínico (uma solução saturada dissolvida em acetonitrila/TFA 0,1%

1:1 v/v). A solução foi, então, homogeneizada em vortex e alíquotas de 1,0

mL foram aplicadas no Voyager Bioworkstation. As amostras foram secas à

temperatura ambiente. O espectrômetro foi operado em modo linear. Os íons

das amostras foram eliminados por irradiação com um laser N2 em

comprimento de onda de 337 nm, e acelerado a um potencial de 23 kV na

fonte do íon com um atraso de 150 ns. As amostras foram, então, ionizadas

36

com 100-200 tiros em um pulso de laser de 3 ns. O sinal foi digitalizado a

uma fração de 500 MHz e os dados avaliados foram mostrados em um sistema

de dados padrão do Voyager para manipulação.

Seqüenciamento de Si-AMP

As amostras provenientes de HPLC foram liofilizadas objetivando

remoção de acetonitrila e TFA. A seqüência N-terminal parcial do peptídeo

foi determinada usando o método de degradação de Edman (Edman, 1970), o

qual utiliza a reação seletiva de N-terminal com isotiocianato de fenila.

Entretanto, para determinar a seqüência completa do peptídeo, buscou-se

realizar análise por MS. Para tanto, a amostra foi submetida a reações de

redução e alquilação, através de adições consecutivas de DTT 100 mM,

permanecendo a 60 C por 1 hora, e iodoacetamida 500 mM, por 1 hora na

ausência de luz, ambos na proporção de 10% do volume da amostra. A reação

foi interrompida com a adição de DTT 100 mM, na proporção 1:1. Em

seguida, para digestão das proteínas, foi adicionado 100 µ L de bicarbonato de

amônio 200 mM e as amostras foram incubadas com tripsina (Promega) 20

µ g.mL- 1 em acetonitrila, por 4-16 horas, a 37º C. A solução resultante foi

purificada em uma coluna ZipTip, para remoção dos resíduos dos produtos e

sub-produtos gerados. As frações liofilizadas foram dissolvidas em água

milliQ, misturadas em uma solução saturada de uma matriz constituída por

ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico (1:3), depositada em uma placa do tipo

Anchorchip com 600 mm e secas a temperatura ambiente. Os compostos que

tiveram suas massas moleculares exatas determinadas, utilizando um

37

espectrômetro de massa MALDI-ToF/ToF Applied Biosystems 4700 e o

software 4000 Series Explorer, foram devidamente seqüenciados. Os espectros

foram obtidos com 3.000 nm de intensidade de laser e 3.000 disparos,

tolerância de 0,5 m/z. Os íons protéicos gerados por autólise da tripsina foram

usados como padrões internos para calibração do espectro de massa. Íons que

apresentaram relação sinal-ruído apropriada foram submetidos à fragmentação

(MS/MS). Os espectros foram analisados com o auxílio dos programas Protein

Prospector e Pepseq.

Análises in silico

A seqüência de aminoácido obtida foi comparada com outras proteínas

depositadas no NCBI Protein Data Bank (www.ncbi.nih.gov), utilizando o

programa Blastp (Chen et al . , 1998). As seqüências protéicas foram

submetidas a um alinhamento usando o programa ClustalW (Thompson, 1994).

Preparação das bactérias patogênicas

Foram utilizadas nos ensaios de atividade in vitro as bactérias

patogênicas humanas Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., E. coli,

Streptococcus pyogenes e S. aureus , assim como, contra as bactérias

fitopatogênicas Xanthomonas sp., Bacillus subtilis , Erwinia sp. e

Rathayibacter sp. .previamente replicadas em meio Luria Bertani (LB) (10

38

g.L- 1 de NaCl, 5 g.L- 1 de extrato de levedura e 45 g.L- 1 de bactopeptona,

dissolvidos em água), durante 18-24 horas a 37ºC.

Bioensaio em meio sólido

Inicialmente, visando uma análise geral da atividade antibacteriana, FRP,

PR e PNR eluídos da cromatografia em Red-Sepharose tiveram sua atividade

avaliada em placa, em meio LB acrescido de ágar (15 g.L-1), contra Klebsiella

sp., Proteus sp., Salmonella sp., E. coli, S. aureus , Xanthomonas sp., B.

subtilis , Erwinia sp. e Rathayibacter sp. . A densidade ótica inicial (OD) foi

de 0,12 nm, a qual corresponde a aproximadamente a 107 unidades formadoras

de colônia (UFC). As amostras a serem testadas foram ressuspendidas em

água desti lada em concentração padrão de 10.000 µ g.mL- 1, sendo utilizadas

alíquotas de 20 µ L, correspondendo a 200 µ g de proteína por ensaio. Os

ensaios utilizam água destilada como controle negativo (CN) e cloranfenicol

como controle positivo (CP) (34 µ L de uma solução estoque de 600 µ g.mL- 1).

A inibição foi avaliada após 12-16 horas de incubação a 37 C, e a

porcentagem de inibição de crescimento (PIC) foi determinada a partir da

fórmula, a qual traça relações com o controle negativo:

PIC = ((diâmetro de CN) - (diâmetro do tratamento)) / ((diâmetro CN) x 100)

39

Bioensaio em meio líquido

Buscando maior acurácia dos resultados, tanto o FRP, quanto os PR e

PNR de ambas as colunas cromatográficas, assim como peptídeos isolados por

HPLC tiveram sua atividade antibacteriana avaliada em meio LB líquido. As

frações protéicas foram, então, encubadas com Klebsiella sp. e Proteus sp. em

meio LB, por 4 horas, a 37ºC. A OD inicial foi de 0,05 nm, a qual

corresponde a aproximadamente 5 x 106 células por mL. O volume final do

ensaio foi de 1,0 mL. A evolução do crescimento bacteriano foi monitorada

por espectrofotômetro a 595 nm, durante cada hora experimental. Cada

experimento foi realizado em triplicata. Complementarmente, testou-se PR e

PNR da cromatografia em Blue-Sepharose quanto a sua capacidade de

inibição do crescimento bacteriano de S. pyogenes . Visando avaliar a

atividade antibacteriana das proteínas não retidas pela coluna Red-Sepharose,

o PNR, na concentração de 400 g.mL-1. , foi submetido confrontado com

Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., Escherichia coli , Xanthomonas sp.

e Rathayibacter sp., em iguais condições.

40

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Isolamento de Si-AMP, nova albumina 2S de sementes de S. indicum

Objetivando identificar proteínas antimicrobianas em sementes de

gergelim (S. indicum), as amostras foram submetidas à precipitação com

sulfato de amônio, através de salting out a 100% de saturação, objetivando

obter uma significativa representação da constituição protéica de sementes de

gergelim. Após diálise em cut off seletivo de 3.0 kDa, o rendimento da

extração foi avaliado pelo método de quantificação de proteínas descrito por

Bradford (1976). Para cada 100 g de sementes de gergelim, foram obtidas

aproximadamente 250 mg de proteína total. Seguiu-se com a separação

cromatográfica dessas proteínas (FRP) nas colunas Red-Sepharose CL-6B e

Blue-Sepharose CL-6B. As colunas Red-Sepharose e Blue-Sepharose foram

escolhidas por serem mais específicas na separação de proteínas com carga

final positiva e uma porção hidrofóbica, características essas encontradas em

peptídeos de defesa de plantas. As proteínas ácidas ou levemente básicas não

foram retidas pelas resinas. Assim, os PR cromatográficos obtidos formados

basicamente por peptídeos catiônicos das demais proteínas (Figura 5A e 5B).

Entretanto, a partir dos resultados da avaliação de atividade antibacteriana de

PR e PNR de ambas as colunas cromatografias (Figura 11 e 12), foi

comprovada maior eficiência da coluna Red-Sepharose quanto à separação

seletiva das proteínas de interesse. Essa característica tem feito da coluna

Red-Sepharose CL-6B uma ferramenta comumente utilizada na purificação de

peptídeos antimicrobianos (Bloch et al . , 1991; Melo et al . , 1999; Pelegrini et

41

al . , 2006). Dessa forma, a coluna Red-Sepharose foi escolhida como a forma

de separação protéica para os experimentos subseqüentes.

Em continuidade ao processo de purificação das proteínas antibacterianas

de gergelim, o PR de Red-Sepharose foi aplicado em coluna de fase reversa

(HPLC), capaz de separar proteínas quanto o seu grau de hidrofobicidade.

Inicialmente, utilizou-se gradiente linear de acetonitrila (0-100%) na eluição

das proteínas, revelando a presença de picos majoritários eluídos com 23 e

26% de acetonitrila (Figura 6A). Porém, com o intuito de obter separações

mais eficientes e refinadas, as eluições subseqüentes foram conduzidas

utilizando um gradiente não linear de acetonitrila, de 20 a 50% de acetonitrila

em 35 minutos, expandindo principalmente a região de eluição dos picos

majoritários (Figura 6B). Dessa forma, foi possível observar que a

constituição protéica do PR é consideravelmente maior do que mostrava o

primeiro perfil protéico obtido, com eluição protéica por gradiente linear de

acetonitrila. Possivelmente, isso ocorre devido à presença massiva de

proteínas catiônicas em sementes de gergelim.

42

Figura 5: Fração r ica em proteínas de semente de gergelim, obtida da precipitação com sulfato de amônio (100%), aplicada em cromatografia de afinidade (a) Red-Sepharose CL-6B e (b) Blue-Sepharose CL-6B. A seta indica o ponto de eluição das proteínas ret idas com adição do tampão com NaCl ((a) 3 M e (b) 2 M). PNR: proteínas não ret idas; PR: proteínas ret idas.

43

Purificação em RP-HPLC tem sido usada em AMPs das mais diferentes

classes, como defensinas (Fujimura et al . , 2005), proteínas de ligação à

quitina (Nielsen et al . , 1997) e albuminas 2S (Pelegrini et al . , 2006). Ainda,

similar concentração de acetonitrila foi usada na eluição de diversos

peptídeos antimicrobianos, como Pp-AMP1 e Pp-AMP2, de ramos de bambu

(Phyllostachys pubenscens) (Fujimura et al . , 2005); Tu-AMP 1 e Tu-AMP 2,

de bulbos de tulipa (Tulipa gesneriana L.) (Fujimura et al . , 2004); Fa-AMP1

e Fa-AMP2, de sementes de Fagopyrum esculentum (Fujimura et al . , 2003);

Pe-AFP1, de sementes de maracujá (P. edulis) (Pelegrini et al . , 2006); Cp-

tionina and Cp-tionina II, de sementes de V. unguiculata (Melo et al . , 1999;

Franco et al . , 2006); MiAMP2, de nozes de Macadamia (Macadamia

integrifolia) (Marcus et al . , 1999) e Rs-AFP1 and Rs-AFP2, de sementes de

rabanete (Raphanus sativus L.) (Terras et al . , 1992).

O protocolo de purificação associando Red-Sepharose e RP-HPLC

também tem se mostrado eficiente em isolar proteínas com diferentes

atividades, como Cp-tionina (Melo et al . , 2002) e Cp-tionina II (Franco et al . ,

2006), defensinas isoladas de sementes de V. unguiculata . Cp-tionina é um

potente inibidor de tripsina e Cp-tionina II possui atividade antibacteriana

contra S. aureus , E. coli e P. syringae . Dessa forma, é possível constatar que

a combinação desses dois métodos cromatográficos constitui uma ferramenta

adequada e seletiva na separação de peptídeos de defesa, com característica

catiônica e hidrofóbica, e baixa massa molecular.

44

Figura 6: Cromatogramas de RP-HPLC do PR da amostra de S. indicum obtido em Red-Sepharose. (a) gradiente l inear de acetonitr i la (0-100%). (b) gradiente não l inear de acetonitr i la. O gradiente é representado pela l inha diagonal . A seta indica a fração de eluição de Si-AMP.

45

Análises de massa molecular

Análises por SDS-PAGE foram utilizadas para estabelecer o padrão de

massa molecular das proteínas isoladas de sementes de gergelim. Para as

frações coletadas de Red-Sepharose foi usado gel separador de poliacrilamida

12% (Figura 7), cuja abertura da malha permite uma visualização geral das

proteínas. Já as frações de HPLC, foram submetidas à separação por massa

molecular com poliacrilamida 15% (Figura 8), constituindo, portanto, em uma

malha mais fechada, ideal para separação de peptídeos e, conseqüentemente,

em uma análise mais fiel da massa molecular dos peptídeos de interesse. Na

Figura 7, pode-se notar a diversidade de proteínas com massas moleculares

diferentes em sementes de gergelim, variando entre 5 e 65 kDa. Já na Figura

8, percebe-se uma maior restrição nessa faixa. É importante notar que, em

ambos os géis, há proteínas com massa molecular próximas a 5 kDa, as quais

são características em peptídeos antimicrobianos.

O gel com as frações coletadas de RP-HPLC mostrou a purificação de um

peptídeo eluído com 26% de acetonitrila, de interesse pela atividade

antibacteriana mostrada. Esse peptídeo isolado de S. Indicum foi nomeado Si-

AMP. Ainda em SDS-PAGE, fica aparente que Si-AMP possui duas bandas de

baixo peso molecular, uma com aproximadamente 6 kDa, e outra com menos

de 15 kDa (Figura 8). Esse padrão de duas bandas indica que, possivelmente,

Si-AMP apresenta estrutura dimérica, constituído por subunidades

independentes unidas por ligações dissulfeto, o que é muito característico nas

proteínas de armazenamento da família de albuminas 2S. Análises posteriores

deverão ser realizadas para confirmar essa hipótese. Contudo, albuminas 2S

46

constituídas por duas subunidades, uma grande e uma pequena, foram

relatadas em sementes de gergelim (Moreno et al . , 2005), assim como em B.

napus L. (Monsalve, et al . , 1991), Brassica juncea (Mandal et al . , 2002), R.

communis (Irwin et al . , 1990; da Silva et al . , 1996), de Cucurbita sp. (Hara-

Hishimura et al . , 1993), Arabidopsis thaliana (D'Hondt et al . , 1993), L.

esculentum L. (Oguri et al . , 2003), G. max (Lin et al . , 2004), e outrem.

Ainda, as frações eluídas com 21 e 23% de acetonitrila, bem como 43 e 44%

(Figura 8) mostraram-se semelhantes, contendo uma única banda. As demais

frações evidenciaram mais de um tipo de proteína, com massas moleculares

diferentes. A análise por espectrometria de massa (MALDI-ToF) de Si-AMP

(Costa et al . , 2004) encontrou massa de 5.799,89 Da (fig. 9), provavelmente

corresponde à subunidade de aproximadamente 6 kDa observada no gel SDS-

PAGE. Massa molecular semelhante foi relatada em albumina 2S nAL3,

isolada de G. max , cuja subunidade pequena mostra massa de 5138,30 Da e a

subunidade grande 8975,14 Da (Lin et al . , 2004). Da mesma forma, uma

albumina 2S de Pinus pinaster apresentou duas subunidades distintas, com

aproximadamente 5 e 10 kDa (Allona et al . , 1994). Entretanto, a maioria das

albuminas 2S descritas apresentam sua subunidade pequena com massa de

aproximadamente 4 kDa, como Lec2SA, de L. esculentum L. (Oguri et al . ,

2003); e Ses i1, de S. indicum L. (Moreno et al . , 2005).

47

Figura 7: SDS-PAGE a 12% de proteínas de semente de gergelim (S. indicum L.) separadas por cromatografia em Red-Sepharose (PR e PNR). A seta ponti lhada indica bandas com proteínas de massa molecular inferior a 6 kDa.

48

Figura 8: SDS-PAGE das frações protéicas de semente de gergel im (S. indicum L.) separadas por RP-HPLC. A seta ponti lhada indica Si-AMP. MM: marcador molecular .

49

Figura 9: Espectro de massa (MALDI-TOF) de Si-AMP (Costa, 2004).

50

Seqüenciamento de Si-AMP e análises in silico

O seqüenciamento N-terminal de Si-AMP por degradação de Edman

revelou um fragmento de 16 resíduos de aminoácidos (Tabela 6). Já o

seqüenciamento por MALDI-ToF/ToF, devido a presença excessiva de ruído,

não foi nítido o bastante para determinar a seqüência completa de Si-AMP e,

dessa forma, não permitiu complementar a seqüência parcial encontrada por

degradação de Edman. A comparação com as proteínas depositadas no NCBI,

mostrou que a seqüência obtida de Si-AMP apresentava 91% de similaridade

com sesina (Tai et al . , 2001), uma albumina 2S de S. indicum de 153 resíduos

de aminoácidos, indicando a classificação desse peptídeo no grupo das

proteínas albuminas 2S, as quais são comumente empregadas no

armazenamento de nutrientes para a germinação da semente (Tabela 7). Um

alinhamento da seqüência N-terminal, usando o Programa ClustalW, mostra

claramente a homologia de Si-AMP com albuminas 2S, embasando a sua

classificação nesta família. Apesar da alta similaridade, é possível determinar

que Si-AMP é um novo peptídeo isolado, devido, principalmente, a diferença

entre resíduos resíduos de aminoácidos de Si-AMP e sesina.

Tabela 6: Seqüência N-terminal parcial de resíduos de aminoácidos de Si-AMP por seqüenciamento de Edman.

Si-AMP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

12

13

14

15

16

G

L

Q

D Q

Q

V

Y

Q

R A R D L E P

51

Figura 7 : Alinhamento de Si-AMP com proteínas da família albumina 2S pelo programa ClustalW. A similar idade entre as seqüências comparadas é mostrada pela marcação dos resíduos de aminoácidos. Os resíduos completamente conservados são indicados por (*). O nome, o número de acesso no NCBI e a origem de cada isoforma são mostrados à esquerda do al inhamento.

N

acesso Nome Origem

NCBI

Si-AMP S. indicum GLQDQQVYQRARDLEP------------------

Q9AUD1 SESINA S. indicum G-QSQQVYQRARDL-PRRCNMR-PQQCQFRVIFV (Tai et al., 2001)

Q5FZI3 LEONURINA L. artemisia GGQSEEVYRKARML-PRTCGLR-SQQCQFNVIFV (Yang et al., 2004)

Q8L694 NAPINA M. charantia GSQ--ML-QKARML-PAMCGVR-PQRCDF----- (Vashishta et al., 2004)

Q8H2B8 ANAO3 A. occidentale GEEVRELYETASEL-PRICSISPSQGCQFQSSY- (Robotham et al., 2003)

Q7Y1C2 JUGNI J. nigra GEEMEEMVQSARDL-PKECGIS-SQRCEIRRSWF (Ling et al., 2002)

P93198 9ROSI J. regia GEEMEEMVQSARDL-PNECGIS-SQRCEIRRSWF (Teuber et al., 1998)

* * * *

52

Bioensaio em meio sólido

A avaliação da atividade antibacteriana de FRP, PR e PNR de Red-

Sepharose, na concentração de 100 µ g.mL- 1 em meio LB ágar, resultou em

ausência de inibição do crescimento bacteriano pelas proteínas testadas, mas

capacidade inibitória por parte do controle positivo (cloranfenicol 20 µ g),

como pode ser observado nas Figuras 10 e 11. Isso indica a incapacidade das

proteínas testadas em inibirem o crescimento bacteriano em meio sólido.

Conhecendo o perfil bactericida de proteínas de sementes de gergelim, o qual

será comprovado nos próximos ensaios apresentados, pode-se sugerir a

hipótese de que Si-AMP pode apresenta sítios para glicosilação, como tem

sido comumente relatado em proteínas albuminas 2S (Pastorello et al . , 2001;

Alcocer et al . , 2002) e, dessa forma, Si-AMP seria capaz de formar

complexos com o polímero ágar presente no meio LB. Ágar é um

polissacarídeo não ramificado, constituído de subunidades de galactose,

obtido da parede celular de algumas espécies de algas vermelhas,

especialmente Eucheuma muricatum (FAO, 1990). Dessa forma, Si-AMP

ficaria impossibilitado de exercer sua atividade antibacteriana, o que pode

explicar os resultados encontrados (Figura 10 e 11). Normalmente, albuminas

2S se ligam a pequenos sacarídeos, com intensidade variável, podendo ocorrer

tanto N- como O-glicosilação (Alcocer et al . , 2002).

53

Figura 10: Bioensaio em meio LB ágar. FRP, PR e PNR de Red-Sepharose (200 µ g cada) t iveram sua at ividade ant ibacteriana avaliada contra (a) Klebsiel la sp. ; (b) Proteus sp. ; (c) S. pyogenes ; (d) E. coli ; (e) Salmonella sp. ; (f) S. aureus . CN: controle negativo (água); CP: controle positivo (cloranfenicol 20 µ g).

54

Figura 11: Bioensaio em meio LB ágar. FRP, PR e PNR de Red-Sepharose (200 µ g cada) t iveram sua at ividade antibacter iana avaliada contra (a) Rathayibacter sp. ; (b) Xanthomonas sp. ; (c) B. subtil is ; (d) Erwinia sp. . CN: controle negativo (água); CP: controle posit ivo (cloranfenicol 20 µ g).

55

Bioensaio em meio líquido

As frações protéicas de semente de gergelim (S. indicum), separadas

pelas colunas cromatográficas Red-Sepharose e Blue-Sepharose, foram

utilizadas em bioensaios contra bactérias nocivas a seres humanos Klebsiella

sp. e Proteus sp.. Enquanto o PR de Red-Sepharose mostrou capacidade de

redução do crescimento de Klebsiella sp. em cerca de 15% (Figura 12A), a

mesma fração não foi capaz de inibir Proteus sp. (Figura 12B). Este resultado

é similar ao obtido anteriormente por Costa (2004), onde PR de Red-

Sepharose foi testado contra essas duas bactérias e, ainda, contra E. coli ,

apresentando atividade inibitória apenas na presença de Klebsiella sp.. Desta

forma, fica evidente a seletividade das proteínas de sementes gergelim para

apenas um dos gêneros de bactérias Gram-negativas testadas. Entretanto, as

frações protéicas separadas em Blue-Sepharose não mostraram a mesma

atividade observada naquelas separadas por Red-Sepharose (Figura 13A e B),

assim como também não se mostraram capaz de inibir S. pyogenes (Figura

13C), bactéria Gram-positiva. Isso ocorreu apesar da coluna Blue-Sepharose

apresentar características similares de retenção da resina Red-Sepharose,

hábil em separar proteínas catiônicas e hidrofóbicas na fração de proteínas

retidas, provavelmente por de serem constituídas por ligantes diferentes.

O PNR de Red-Sepharose foi submetido a ensaios contra várias bactérias,

Gram-negativas patogênicas ao homem (Figura 14), e bactérias

fitopatogênicas (Figura 15), na concentração de 400 µ g.mL- 1. Como esperado,

PNR foi incapaz de inibir o crescimento das bactérias testadas, mesmo em

alta concentração, comprovando que a atividade antibacteriana das sementes

56

de gergelim deve-se a proteínas com característica catiônica e hidrofóbicas,

as quais ficaram retidas no ligante Procion Red HE-3B da resina de Red-

Sepharose, sendo posteriormente eluídas com a adição de NaCl 3 M.

O peptídeo purificado, Si-AMP, mostrou-se ativo contra Klebsiella sp.

(Figura 16A e 17), sendo capaz de inibir aproximadamente 15% do

crescimento desta bactéria. Entretanto, Si-AMP não foi capaz de inibir

Proteus sp. (Figura 16B) e E. coli (Figura 16C). O conjunto de resultados

apresentados neste trabalho evidencia a hipótese de que Si-AMP atua

seletivamente contra Klebsiella sp., uma bactéria patogênica humana, da

família Enterobacteriaceae, fortemente envolvida em processos de infecção

hospitalar. Um exemplo de peptídeo antimicrobiano da família das albuminas

2S purificado por cromatografia na resina Red-Sepharose e RP-HPLC é Pe-

AFP1, isolado de sementes de maracujá (P. edulis), ativo contra T.

harzianum , F. oxysporum , e A. fumigatus (Pelegrini et al . , 2006).

Como descrito anteriormente, poucas albuminas 2S foram relatas como

agentes antimicrobianos, como Pf2-RP (Agizzio et al . , 2003) e Pe-AFP1

(Pelegrini et al . , 2006), ambos isolado de sementes de maracujá. Entretanto,

nenhuma proteína da família das albuminas 2S, mostrou-se capaz de inibir

crescimento bacteriano. Dessa forma, Si-AMP é o primeiro peptídeo de

armazenamento, de acordo com nossos conhecimentos, com homologia as

proteínas albuminas 2S, com atividade antibacteriana. Portanto, Si-AMP traz

um novo conceito para proteínas de armazenamento em sementes, além de ser

a principal fonte de nitrogênio para a germinação, compor o acurado sistema

57

de defesa vegetal. O qual claramente faz uso de proteínas com múltiplas

funções, permitindo um menor gasto de energia.

58

Figura 12: Avaliação da at ividade antibacteriana em meio LB líquido de 100 µ g.mL- 1 das frações protéicas separadas

cromatograficamente pela coluna Red-Sepharose contra (a) Klebsiella sp. ; (b) Proteus sp. . PR é representado por ; PNR por ; controle negativo (água desti lada) por ; controle posit ivo (cloranfenicol 40 µ g.mL- 1) por . O desvio padrão é representado por barras horizontais.

59

Figura 13: Avaliação da at ividade antibacteriana em meio LB líquido de 100 µ g.mL- 1 das frações protéicas separadas cromatograficamente pela coluna Blue-Sepharose contra (a) Klebsiella sp. ; (b) Proteus sp. . PR é representado por

; PNR por ; controle negativo (água desti lada) por ; controle posit ivo (cloranfenicol 40 µ g.mL- 1) por . O desvio padrão é representado por barras horizontais.

60

Figura 14: Avaliação da at ividade antibacteriana em meio LB líquido de 400 µ g.mL- 1 de PNR separadas cromatograficamente pela coluna Red-Sepharose contra (a) Klebsiella sp. ; (b) Proteus sp. ; (c) Salmonella sp. . PNR é representado por ; controle negativo (água desti lada) por ; controle posit ivo (cloranfenicol 40 µ g.mL- 1) por . O desvio padrão é representado por barras horizontais.

61

Figura 15: Avaliação da at ividade antibacteriana em meio LB líquido de 400 µ g.mL- 1 de PNR separadas cromatograficamente pela coluna Red-Sepharose contra (a) Escherichia coli; (b) Xanthomonas sp. ; (c) Rathayibacter sp. . PNR é representado por ; controle negativo (água desti lada) por ; controle posit ivo (cloranfenicol 40 µ g.mL- 1) por . O desvio padrão é representado por barras horizontais.

62

Figura 16: Avaliação da at ividade antibacteriana em meio LB l íquido de 100 µ g.mL- 1 de Si-AMP, purificado por RP-HPLC, contra (a) Klebsiella sp. ; (b) Proteus sp. ; (c) E. coli . PR é

representado por ; controle negativo (água dest i lada) por ; controle posit ivo (cloranfenicol 40 µ g.mL- 1) por .

63

Figura 17: Avaliação da at ividade antibacteriana em meio LB líquido de 100 µ g.mL- 1 de Si-AMP, purificado por RP-HPLC, contra Klebsiella sp. ; CN: controle negativo (água dest i lada). O desvio padrão é representado por barras horizontais.

64

CONCLUSÕES

Em conclusão, os resultados apresentados aqui sugerem que a albumina

2S Si-AMP, isolada de sementes de gergelim branco (S. indicum L.), exerce

severa inibição no crescimento do patógeno humano Klebsiella sp.. Dessa

forma, fica evidente a estreita relação entre as funções de armazenamento e

de defesa em plantas. Neste âmbito, observa-se claramente uma conservação

de uma função secundária em proteínas de armazenamento durante os milhões

de anos de evolução. Esta função, caracteristicamente como defensiva a

patógenos poderá ser utilizada eficientemente para fins biotecnológicos.

Torna-se, desta maneira, real a possibilidade de descoberta de novas proteínas

de armazenamento com capacidade bactericida, assim como o uso destas no

desenvolvimento de antibióticos com mecanismos de ação alternativos,

representando, portanto, em uma nova estratégia no combate à infecção

hospitalar.

65

PERSPECTIVAS

- Seqüenciamento completo Si-AMP, peptídeo isolados de sementes de

gergelim (S. indicum);

- Clonagem e expressão das albuminas 2S em sistema heterólogo.

- Produção de peptídeos sintéticos a partir de Si-AMP e avaliação da relação

estrutura-atividade.

- Elucidação do mecanismo de ação de Si-AMP:

- Por modelagem molecular e docking computacional;

- Análise topográfica da interação Si-AMP-bactéria, através de

microscopia de força atômica;

- Caracterização do mecanismo de resistência bacteriana para Si-AMP:

- Por análise do perfil de expressão protéica na secreção e membrana de

Klebsiella pneumoniae através de proteômica comparativa.

66

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