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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

YGOR RAPHAEL GOMES ELOY

PAPEL DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO NA INTERAÇÃO DO FEIJÃO-DE-CORDA [Vigna unguiculata (L.) Walp.] COM O FUNGO Colletotrichum

gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [TELEOMORFO: Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. & von Schrenk]

FORTALEZA – CEARÁ 2007




Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em bioquímica.

Orientador: Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira

FORTALEZA – CEARÁ 2007

E42p Eloy, Ygor Raphael Gomes Papel do peróxido de hidrogênio na interação do feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] com o fungo Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [teleomorfo: Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. & von Schrenk] [manuscrito] / Ygor Raphael Gomes Eloy

137 f. : il. color. ; enc.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007 Orientador: José Tadeu Abreu de Oliveira Área de concentração: Bioquímica

1. Vigna unguiculata 2. Colletotrichum gloeosporioides 3. ITS 4. Explosão oxidativa 5. H2O2 I. Oliveira, José Tadeu Abreu de (orient.) II. Universidade Federal do Ceará – Mestrado em Bioquímica III. Título

CDD 574.192




Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em bioquímica.

Aprovada em 04 de maio de 2007.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________ Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira Universidade Federal do Ceará

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular (Orientador da Dissertação)

________________________________________ Dr. Enéas Gomes Filho

Universidade Federal do Ceará Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular

(Examinadora)

________________________________________ Dra. Ana Lúcia Horta Barreto

Centro Nacional de Pesquisa do Meio-Norte EMBRAPA Meio-Norte

(Examinadora)

Em muitos momentos de minha vida,

busquei pelas coisas que realmente achei que valia a pena.

Nessa jornada,

muitas pessoas ajudaram-me,

acolheram-me.

Hoje,

dedico este trabalho

a estas pessoas,

que sempre acreditaram

no que eu ia contar

no livro da Vida.

AGRADECIMENTOS

De forma especial ao professor Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira, pela sua

orientação, amizade, dedicação e, além de tudo, por ter acreditado sempre em

meu potencial.

À Dra. Ana Lúcia Horta Barreto, pelos inesquecíveis ensinamentos e

dedicação a minha formação, assim como, pela nossa grande amizade e

participação na avaliação deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Enéas Gomes Filho, pela disponibilidade, pelo apoio e

participação na avaliação deste trabalho.

À professora Ilka Maria Vasconcelos, pela amizade, colaboração e

disponibilidade sempre demonstradas.

Ao Dr. Francisco Rodrigues Freire Filho, por ter doado as sementes de

feijão-de-corda para fins experimentais.

À professora Dra. Vânia Maria Maciel Melo, pelos consideráveis

ensinamentos de Microbiologia e por ter despertado a paixão que tenho pela área.

Além disso, agradeço por ter disponibilizado o fungo (hoje identificado)

Colletotrichum gloeosporioides para o estudo.

Ao professor Dr. Talles Grangeiro Barbosa, pelos ensinamentos de Biologia

Molecular e por ter disponibilizado seu laboratório e equipamentos para a

identificação do fungo.

À Aparecida Simone, por ter participado como peça fundamental no meu

aprendizado, desde como lavar uma vidraria até como elaborar um experimento.

Ao José Edvar e Thiago Matos, pelo apoio e companheirismo nas horas

intermináveis de nossos afazeres científicos.

À Hévila e Betânia, por estar sempre de prontidão em apoiar e dar

sugestões importantes para o trabalho.

Ao Silvio e ao Hélio, pelo companheirismo descontraído, alegre e

conveniente, nos momentos empolgantes da vida acadêmica.

À Gabriela, pela amizade, companheirismo, cooperação e contribuição

notável para este trabalho.

À Mayra, pela amizade, pelo carinho e pelos momentos fervorosos de

discussão sobre pesquisa.

Ao Fredy e Fernando, pela amizade e companheirismo sempre

manifestados.

Aos demais amigos do Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa

(ausentes e presentes), Adem, Alethéia, Aline, Eduardo, Ana Maria, Antoniella,

Cléberson, Djane, Gina, Ivna, Júlio, Lara, Mayra, Magalline, Neílza, Raíssa,

Vadjah Cristine e Waneska.

Aos estudantes e amigos do Laboratório de Toxinas Vegetais (presentes e

ausentes), Andréa, Cláudio, Daniele, Elisângela, Fernanda, Geórgia, Henrique,

Isabel, Janne Keila, Juliana, Ricristhi, Silvinha e Hermógenes.

Ao Abdul, pela condizente amizade e companheirismo por ele

demonstrado.

Aos amigos do Laboratório de Fisiologia Vegetal, chefiado pelo Prof. Dr.

Enéas Gomes. Em especial ao Carlos Eduardo (Sagat), pela amizade,

companheirismo e pela imensa contribuição que por ele foi manifestada ao meu

trabalho.

Ao Prof. Dr. Joaquim Enéas, pelos imprescindíveis ensinamentos de

Fisiologia Vegetal.

Aos amigos do Bioplant, sob coordenação do Prof. Dr. Francisco Campos,

em especial ao Fábio, Emanuel, Emanuele, Tiago, Camila, Juliana Vaz e Juliana

Brasil.

Aos integrantes do Laboratório de Metabolismo de Plantas, chefiado pelo

prof. Albenísio, em especial ao Sérgio, Luis, Cristine e Eduardo.

Aos integrantes do Laboratório coordenado pelo Prof. Dr. Márcio Viana, em

especial ao Cléverson e Jefferson.

Aos integrantes do Laboratório coordenado pela Prof. Dra. Norma

Benevides, em especial à Luana.

Aos professores e amigos, Fábio Rossi e Cristina.

Aos demais professores, funcionários e colegas do DBBM

De maneira muita especial, à Ana Lúcia da Silva de Almeida e Wagner

Barbosa de Almeida pelo inesquecível apoio e amizade, que sempre foi a mim

concedido. A estas pessoas, dedico este trabalho como forma simbólica dos

frutos que estou colhendo graças a eles.

Aos meus pais, Francisco Carlos Eloy e Francisca Gomes Eloy, pela

maravilhosa educação que recebi e pelo crédito que a mim sempre foi depositado.

Apesar da distância Quixeramobim-Fortaleza foi possível que fizessem parte do

meu aprendizado e amadurecimento profissional.

À minha irmã, Karla Patrícia Gomes Eloy, pela confiança em conseguir

conquistar os meus ideais.

As minhas avós, Maria Eloy e Maria Medeiros, pelas orações, pelo amor e

carinho que foram a mim concedidos.

As minhas tias, tios, primos, primas e demais familiares por sempre

acreditar na minha força.

À Cecília Araújo da Silva, pela paciência, carinho e companheirismo que a

mim foram atribuídos durante o período em que estive realizando os meus

trabalhos acadêmicos no mestrado.

Aos meus amigos, Elton, Irla, Iramisto, Juliana, Baiano, Carmelita, Manoel

(Comparsa), Tia Celma, Fabiano, Paula Andréia, Joice, Daniel Vasconcelos,

Liduína, Jeferson Almeida, Júnior Almeida, Vicente, Leopoldo, Zilah, Domingos,

Anísia, Robson, Rui, Rubens, Sávio, Lucivanda, Aline, Karine, Dalva, Bosco,

Alenilda, Tia Lúcia, Igor Banholi, Gregório Banholi e todos os que neste momento

não recordo, mas com toda convicção, participaram na minha vida como peças

importantes para a lapidação e o polimento de minha pessoa.

Aos meus afilhados Samuel e Otávio, que este trabalho seja para vocês um

exemplo de atitude, força e perseverança. Assim, estudem para conquistar um

lugar ao sol.

Aos meus amigos, Geovane, Valdé, Fábio, Paulo, Thalita, Fátima, Paula,

Francisco, Rejane, Roseane, Maria Luíza, Marquinho, Marcão, pela grande

amizade que conquistei logo quando cheguei à cidade de Fortaleza.

Aos meus amigos e companheiros, Xavier e Catarina Riveiro, pela

amizade, confiança e ensinamentos.

Aos demais amigos, familiares, colegas e condiscípulos que contribuíram

direta e indiretamente para a execução deste trabalho.

MUITO OBRIGADO !!!!!!

Este trabalho foi possível graças ao auxílio das seguintes instituições:

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES/PICD).

Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(FUNCAP).

Banco do Nordeste do Brasil (BNB).

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Centro de Ciências,

Universidade federal do Ceará, Fortaleza – CE.

Departamento de Biologia, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará,

Fortaleza – CE.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS................................................................................... xii

RESUMO..................................................................................................... xvii

ABSTRACT................................................................................................. xviii

1. INTRODUÇÃO.............................................................................. 1

1.1. Plantas, Agricultura e Crescimento Populacional......................... 1

1.2. O Feijão-de-corda......................................................................... 4

1.3. Colletotrichum............................................................................... 6

1.4. Estratégias de Infecção de Espécies de Colletotrichum............... 9

1.5. Respostas de Defesa de Plantas a Patógenos............................ 14

1.5.1. Compostos de Defesa Pré-Formados.......................................... 15

1.5.2. Percepção, Transdução de Sinal e Indução de Defesa............... 16

1.5.3. Produção de ROS e Explosão Oxidativa...................................... 19

1.5.4. H2O2.............................................................................................. 21

1.5.5. Mecanismos Antioxidantes Não-Enzimáticos............................... 25

1.5.6. Mecanismos Antioxidantes Enzimáticos....................................... 26

1.5.6.1. Dismutase do Superóxido (SOD; EC 1.15.1.1.)............................ 26

1.5.6.2. Peroxidase do Ascorbato (APX; EC 1.11.1.11)........................... 27

1.5.6.3. Catalase (CAT; EC 1.11.1.6.)....................................................... 28

2. OBJETIVOS................................................................................. 29

2.1. Objetivo Geral.............................................................................. 29

2.2. Objetivos Específicos................................................................... 30

3. MATERIAIS.................................................................................. 31

3.1. Sementes...................................................................................... 31

3.2. Fungo............................................................................................ 31

3.3. Materiais para Certificação do Fungo........................................... 31

3.4. Reagentes Químicos.................................................................... 32

4. MÉTODOS.................................................................................... 33

4.1. Identificação do Fungo.................................................................. 33

4.1.1. Purificação do DNA genômico...................................................... 33

4.1.2. Reação em cadeia da DNA polimerase e Seqüenciamento dos

Fragmentos Amplificados............................................................. 34

4.1.3. Montagem dos Fragmentos Obtidos, Alinhamento e Edição da

Seqüência.....................................................................................

36

4.2. Obtenção dos Esporos................................................................. 37

4.3. Tratamento e Germinação das Sementes.................................... 37

4.4. Tratamento de Folhas Primárias de Feijão-de-Corda com

Substâncias Farmacológicas........................................................

40

4.5. Determinação do Teor de Peróxido de Hidrogênio....................... 42

4.5.1. Determinação Quantitativa........................................................... 42

4.5.2. Determinação Qualitativa.............................................................. 43

4.6. Peroxidação de Lipídios (Formação do Complexo MDA-TBA)..... 44

4.7. Tratamento de Folhas Primárias de Feijão-de-Corda com

Substâncias Farmacológicas e Inoculação com o Fungo C.

gloeosporiodes..............................................................................

45

4.8. Análises Macroscópicas................................................................ 45

4.9. Análises Microscópicas................................................................. 45

4.9. Delineamento Experimental.......................................................... 47

5. RESULTADOS.............................................................................. 48

5.1. Identificação do Fungo.................................................................. 48

5.2. Tratamento com AS...................................................................... 48

5.2.1. Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e

Peroxidação de Lipídios................................................................

48

5.2.2. Análises Macroscópicas................................................................ 55

5.2.3. Análises Microscópicas................................................................. 58

5.3. Tratamento com Oxidase da Glucose (GO) + Glucose

(G).................................................................................................

64



64



5.4. Tratamento com CAT.................................................................... 74

5.4.1.

Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e

Peroxidação de Lipídios................................................................ 74



5.5. Tratamento com Cloreto de Difenilenoiodônio (DPI) ................... 82



82


5.5.3. Análises Microscópicas................................................................ 89

6. DISCUSSÃO................................................................................ 91

7. CONCLUSÃO.............................................................................. 101

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................. 102

LISTA DE FIGURAS

FIGURA PÁG.

1.1 Estratégias de infecção adotadas por espécies de

Colletotrichum.

13

4.1 Representação esquemática da organização dos genes de

rDNA, em eucariontes, e do anelamento dos

oligonucleotídeos ITS-4 e ITS-5 nas suas respectivas

regiões.

35

4.2 Tratamento e germinação das sementes de feijão-de-corda,

genótipo BR-3.

39

4.3 Folhas primárias de feijão-de-corda infiltradas com

substâncias farmacológicas, atingindo uma área de 1 – 2

cm2 de infiltração.

41

5.1 Seqüência consenso completa da região ITS-1, 5,8S, ITS-2

do fungo C. gloeosporioides com um comprimento total de

558 pb.

49

5.2 Teores de H2O2 em extratos de folhas primárias de feijão-de-

corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas

em diferentes tempos após tratamentos com H2O e com

soluções de ácido salicílico (AS) em diferentes

concentrações. Valores basais de H2O2 em folhas que não

receberam tratamento nenhum são, também, apresentados.

50

5.3 Detalhe do acúmulo de H2O2 em folhas primárias

destacadas de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.],

genótipo BR-3, visualizado através da polimerização de

DAB, depois de tratadas com: (A) - H2O, 2 horas após

tratamento (hat); (B) - H2O, 12 hat; (C) – 5,0 mM de ácido

salicílico (AS), 2 hat; e (D) – 5,0 mM de AS, 12 hat.

52

5.4 Análise da presença de H2O2 em folhas primárias de feijão-

de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,

visualizado através da polimerização de DAB.

53

5.5 Concentrações de Malonaldeído (MDA) em folhas primárias

de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,

analisadas em diferentes tempos, após tratamentos com

H2O e 5,0 mM de ácido salicílico (AS).

54

5.6 Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V.

unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0

mM de ácido salicílico (AS) e inoculadas com esporos de C.

gloeosporioides.

56


unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com H2O e

inoculadas com esporos de C. gloeosporioides.

57

5.8 Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias


observado por microscopia de luz.

60



tratadas com H2O, observado por microscopia de luz.

61



tratadas com H2O, observado por microscopia de luz.

62

5.11 Desenvolvimento do fungo C. gloeosporioides nas folhas

primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.],

genótipo BR-3, tratadas com 5,0 mM de ácido salicílico (AS),

observado por microscopia de luz.

63

5.12 Teores de H2O2 em folhas primárias de feijão-de-corda [V.

unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas em

diferentes tempos, após tratamentos com tampão fosfato e

com diferentes concentrações de GO + 2,0 mM de G.

65

5.13 Detalhe do acúmulo de H2O2 através da visualização da

polimerização de DAB em folhas primárias de feijão-de-

corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após

tratamento com: (A) – Tampão fosfato 50 mM, pH 6,5, 2

horas após tratamento (hat); (B) – Tampão fosfato 50 mM,

pH 6,5, 12 hat; (C) – 200,0 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, 2

hat; (D) – 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, 12 hat.

66

5.14 Concentrações de Malonaldeído (MDA) de extratos de folhas


genótipo BR-3, coletadas em diferentes tempos após

tratamentos com tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5 e 200 U

mL-1 de GO + 2,0 mM de G.

68


unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 200 U

mL-1 de GO + 2,0 mM de G e inoculadas com esporos de C.

gloeosporioides.

69


unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com tampa

fosfato 50,0 mM, pH 6,5 e inoculadas com esporos de C.

gloeosporioides.

70



infiltradas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, observado

por microscopia de luz.

73

5.18 Teores de H2O2 em folhas primárias destacadas de feijão-

de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3,

analisadas em diferentes tempos após tratamentos com

tampão fosfato e com soluções de diferentes concentrações

de CAT. Valores basais de H2O2 em plantas que não

receberam tratamento nenhum são, também, apresentados.

76


de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após

tratamento com 2000 U mL-1 de CAT, através da

visualização da polimerização de DAB.

77

5.20 Concentrações de Malonaldeído (MDA) em folhas primárias


analisadas em diferentes tempos após tratamento com

tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5, e 2000 U mL-1 de CAT.

78


unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 2000

U mL-1 de CAT e inoculadas com esporos de C.

gloeosporioides.

79



infiltradas com 2000 U mL-1 de CAT, observado por

microscopia de luz.

81

5.23 Teores de H2O2 em extratos de folhas primárias de feijão-de-

corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas

em diferentes tempos após tratamento com soluções de

diferentes concentrações de DMSO e de DPI. Valores basais

de H2O2 em plantas que não receberam tratamento nenhum

são, também, apresentados.

84


de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após

tratamento com 0,050% (v/v) de DMSO, 2 (A) e 12 (B) horas

após tratamento (hat) e 5,0 µM de DPI, 2 hat (C) e 12 hat

(D), através da visualização da polimerização de DAB.

85

5.25 Concentrações de malonaldeído (MDA) de extratos de folhas


genótipo BR-3, analisadas em diferentes tempos após

tratamentos com 0,050 % (v/v) de DMSO e 5,0 µM de DPI.

86



µM de DPI e inoculadas com esporos de C. gloeosporioides.

87



% (v/v) de DMSO e inoculadas com esporos de C.

gloeosporioides.

88



infiltradas com 5,0 µM de DPI, observadas por microscopia

de luz.

90

RESUMO

Feijão-de-corda é um importante legume presente na região Nordeste do Brasil e

sua produção é afetada por fungos do gênero Colletotrichum. Estes fungos são

conhecidos por causar antracnose em uma grande variedade de plantas. Além

disso, o acúmulo rápido e transiente de espécies reativas de oxigênio, nomeado

de ‘explosão oxidativa’, é uma das primeiras reações observáveis em células de

plantas diante infecção microbiana. Como H2O2 produzido por plantas é

conhecido por apresentar efeitos antimicrobianos diretos, foi levantada a hipótese

de que alterações em suas concentrações induzidas por substâncias

farmacológicas poderiam conferir resistência do genótipo de feijão-de-corda, BR-

3-Tracuateua, ao ataque do fungo C. gloeosporioides. Deste modo, sementes

foram semeadas em papéis Germistest® umedecidos e, depois de 4 dias,

plântulas foram transferidas para solução hidropônica. Passados oito dias, as

folhas primárias foram cortadas, infiltradas com glucose oxidase (GO+G), ácido

salicílico (AS), catalase (CAT) e cloreto de difenilenoiodônio (DPI), transferidas

para placas de Petri e inoculadas com suspensão do fungo ajustada para

concentração de 2,0 x 105 esporos mL-1. Em seguida, as folhas foram mantidas

no escuro e foram coletadas em 2, 12 e 24 horas para análise de peróxido de

hidrogênio e peroxidação de lipídios. Outros grupos de folhas também foram

infiltrados com as mesmas substâncias para análises macroscópicas e

microscópicas do desenvolvimento do fungo sendo, no entanto, coletadas em 12,

24, 48 e 72 horas. Folhas tratadas com GO+G e AS mostraram 144,96 e 186,05

nmol H2O2 g-1 de massa fresca (MF), respectivamente, e o fungo apresentou

estratégia subcuticular, intramural necrotrófica, formando hifas secundárias

associadas com ágil crescimento e rápida morte das células hospedeiras. Nas

folhas tratadas com AS, foi observada peroxidação de lipídios e ausência de

apressórios melanizados. Contudo, folhas tratadas com CAT e DPI apresentaram

55,50 nmol H2O2 g-1 MF e, o fungo, mostrou modo de infecção hemibiotrófico,

com vesículas globulares e formação de hifas primárias e secundárias. Todos os

resultados sugerem que, apesar do H2O2 tenha influenciado diretamente o modo

de infecção do fungo, este não conferiu resistência no feijão-de-corda ao C.

gloeosporioides.

Palavras-chave: Vigna unguiculata, Colletotrichum gloeosporioides, ITS, explosão

oxidativa, H2O2.

ABSTRACT

Cowpea is an important legume of the Northeast of Brazil and its yield is affected

by Colletotrichum fungi. These fungi are known to occur on and cause disease

anthracnose on the broad range of plants. In addition, the rapid and transient

accumulation of reactive oxygen species, termed ‘oxidative burst’, is one of the

earliest observable reaction of plant cells to microbial infection. As plant H2O2 is

believed to have direct antimicrobial effects on pathogens it was raised the

hypothesis that alteration of H2O2 concentrations by pharmacological compounds

could confer differences in susceptibility of the cowpea genotype BR-3-Tracuateua

to C. gloeosporioides attack. Thus, seeds were germinated on humid Germitest®

paper and after four days seedlings were transferred to hydroponic solution. Eight

days later, the primary leaves were excised, infiltrated with glucose oxidase

(GO+G), salicylic acid (AS), catalase (CAT) and diphenyleneiodonium chloride

(DPI) transferred to Petri dishes and inoculated with 2.0 x 105 spores mL-1 fungal

suspension on the adaxial surface. After, leaves were placed in darkness and

collected at 2, 12 and 24 hours for hydrogen peroxide and lipid peroxidation

analysis. Infiltration with pharmacological compounds were carried out on the

another leaves to observe the macroscopic and microscopic alterations during the

infection process. The leaves were collected at 12, 24, 48 and 72 hours. By GO+G

and SA leaf treatments showed 144.96 and 186.05 nmol H2O2 g-1 fresh mass (FM),

respectively, and the fungus presented a subcuticular, intramural necrotrophic

strategy, forming secondary hyphae associated with a quick spread and a rapid

killing of the host cells. On the leaves treated with SA, it was observed lipid

peroxidation and the absence of melanized appresoria. However, CAT and DPI

treatment leaves presented 55.50 nmol H2O2 g-1 FM and the fungus showed

hemibiotrophic infection-type, with globular vesicles and primary and secondary

hyphae formation. All results suggest that despite H2O2 influenced directly the

fungal infection process-type it does not confer resistance of cowpea to C.

gloeosporioides.

Key words: Vigna unguiculata, Colletotrichum gloeosporioides, ITS, oxidative

burst, H2O2.

1 - INTRODUÇÃO

1.1. Plantas, Agricultura e Crescimento Populacional

Quando se fala sobre plantas pode-se pensar em uma infinidade de itens

relacionados: materiais de construção, fibras têxteis, perfumes, drogas,

combustíveis, cosméticos e, principalmente, alimento. Isto porque a história da

humanidade pode ser contada através de uma estreita interação do homem com

as plantas (NORSTOG e LONG, 1976).

Os antigos representantes do gênero Homo provavelmente subsistiram

basicamente da coleta de alimentos (apanhando frutos e sementes; coletando

ramos e folhas comestíveis; e cavando para a coleta de raízes), da alimentação a

partir de animais mortos e, ocasionalmente, da caça. Intempéries ambientais

como as glaciações era um bom motivo para que ocorressem migrações entre os

povos à procura de alimento. Porém, as migrações diminuíram drasticamente com

o advento da agricultura (RAVEN et al., 1992).

Estudos evidenciam que a agricultura teve sua origem a cerca de 12000

anos antes de Cristo, nas regiões montanhosas de clima semi-árido da Antiga

Mesopotâmia, atual Iraque (SANTANA, 2005). Por essa época, aquela região era

conhecida como Crescente Fértil. Desde então, as plantas têm influenciado a vida

de nossa espécie tanto nos aspectos sociais, como políticos e econômicos. Os

cereais, por exemplo, foram as primeiras plantas cultivadas desde o início da

agricultura. Essas plantas são ricas fontes de carboidratos, enquanto que as

leguminosas são abundantes fontes protéicas (NORSTOG e LONG, 1976;

RAVEN et al., 1992).

No entanto, um surto de aceleração na população mundial aconteceu no

começo da idade neolítica. Uma vez que a maioria dos grupos humanos se tornou

sedentária devido à agricultura, não mais havia a necessidade urgente de limitar o

número de nascimentos; as crianças devem ter-se tornado um componente mais

ativo para as suas famílias do que anteriormente, colaborando nas atividades

agrícolas e outros afazeres (SANTANA, 2005). Isto difere de populações que

sobrevivem da caça, pois apresentam uma característica notável que é de limitar

rigorosamente o seu próprio número (RAVEN et al., 1992).

A humanidade desenvolveu a agricultura, novas tecnologias apareceram e

a humanidade continuou a crescer. Enquanto que na época pleistocênica a

população mundial não ultrapassava os 5 milhões, hoje somos 6.576.343.311 de

habitantes. Dentre estes, 188.203.316 vivem no Brasil e, aproximadamente

8.097.000, vivem no Estado do Ceará (IBGE, 2007a).

No Brasil, o aumento no ritmo de crescimento deveu-se exclusivamente ao

declínio da mortalidade, com a esperança de vida ao nascer passando de 44 para

54 anos entre as décadas quarenta e sessenta. Neste intervalo, a fecundidade

manteve-se em níveis altos, tendo a taxa de fecundidade total decrescido apenas

de 6,3 para 5,8 filhos por mulher. A evolução diferenciada da mortalidade e

fecundidade fez com que a taxa bruta de mortalidade caísse muito mais

rapidamente do que a taxa bruta de natalidade, o que proporcionou, como

conseqüência, ampliação significativa da taxa de crescimento corrente da

população (CARVALHO, 2004).

No Estado do Ceará, enquanto nos anos cinqüenta o Estado apresentava

taxa de crescimento populacional da ordem de 2,6% anual, ao passar dos anos,

essa taxa declinou para 1,70% na década 1982/1991. Estes valores mantiveram-

se praticamente no mesmo nível na década seguinte, haja vista que no período

1991-2000 essa taxa foi de 1,73%, revelando nítida tendência de crescimento

moderado da população do Estado. A densidade demográfica tem apresentado

comportamento ascendente, passando de 14,2 habs./km², em 1940, para 50,9

habs./km², em 2000 e 53,74 habs/km2, em 2004 (IPECE, 2005).

Embora a humanidade tenha construído grande parte de sua história

através da agricultura, atualmente a maioria das pessoas que tenta sobreviver a

partir deste processo enfrenta muitas dificuldades. As condições de vida e bem-

estar de agricultores brasileiros ainda são tratadas com descaso, sendo que

muitos habitam precários assentamentos e ficam esperando pela desapropriação

e desconcentração fundiária, ou seja, a reforma agrária (SOTO, 2002). Em

adição, as terras disponíveis ao povo para a agricultura geralmente apresentam

baixa produtividade devido ao não aproveitamento completo da terra e, também,

pelo fornecimento de terras improdutivas para estes agricultores. Estas terras, por

sua vez, só podem se tornar produtivas com elevados investimentos financeiros

(TEIXEIRA, 2005).

De qualquer forma, essa grande massa populacional deve ser alimentada.

Muitos esforços estão sendo feitos para se conseguir melhorias na produtividade

agrícola, na proteção das culturas contra pragas e patógenos e na eficiência do

uso da água nas lavouras. O cultivo de leguminosas tem sido amplamente

executado, visto que suas sementes situam-se entre as mais ricas em proteínas

entre todas as plantas, compensando aminoácidos que são mal representados

nos cereais (GEPTS et al., 2005).

1.2. O Feijão-de-corda

O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.], também conhecido como

feijão caupi, feijão macassar, feijão miúdo e feijão fradinho, é uma planta

dicotiledônea que ocorre em muitos países tropicais e subtropicais, com ampla

distribuição mundial (FREIRE FILHO, et al., 1983; ALI et al, 2002). Pertence à

ordem Fabales, família Fabaceae, subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae,

subtribo Phaseolinae e gênero Vigna, que compreende cerca de 160 espécies

(FREIRE FILHO, 1988; PADULOSI e NG, 1997). Sua origem e domesticação

estão associadas ao cultivo conjunto de milheto (Pennisetum glaucum) e sorgo

(Sorghum spp.) no continente africano (QUINN e MYERES, 2002; ALI et al, 2002;

VALENZUELA e SMITH, 2002). Há evidências que esta cultura foi implantada no

continente americano no século XVI, durante o tráfico de escravos realizados por

colonizadores espanhóis e portugueses. Primeiro, possivelmente, nas colônias

espanholas e, em seguida, no Brasil, provavelmente no Estado da Bahia

(ARAÚJO e WATT, 1988).

A produção mundial de feijão vem crescendo progressivamente desde os

anos 60, devido ao fato de ser considerado uma cultura de subsistência com

elevado conteúdo protéico, energético e vitamínico. Superior em termos

nutricionais ao feijão comum, Phaseolus vulgaris L., é considerado de grande

importância na alimentação humana em regiões tropicais e subtropicais (LIMA et

al., 2001; MARINHO et al., 2001). O grande valor econômico se deve ao fato de

ser possuidor de ampla variabilidade genética, ampla capacidade de adaptação, e

alto potencial produtivo. Além disso, essa cultura é uma das poucas espécies

escolhidas pela National Aeronautical and Space Administration (NASA) para ser

cultivada e estudada nas estações espaciais (EHLERS e HALL, 1997).

A área ocupada com feijão-de-corda, no mundo, está em torno de 12,5

milhões de ha, com 8 milhões (64% da área mundial) na parte oeste e central da

África. A outra parte da área está localizada na América do Sul, América Central e

Ásia, com pequenas áreas espalhadas pelo sudoeste da Europa, sudoeste dos

Estados Unidos e da Oceania. Entre todos os países, os principais produtores

mundiais são Nigéria, Niger e Brasil (QUIN, 1997). No Brasil, aguarda-se para

2007 uma produção de 2,2 milhões de toneladas, superior a 37,5% da obtida em

2006 (1,6 milhão de toneladas). Numa área a ser colhida de 2,5 milhões de

hectares, a produtividade poderá alcançar 869 kg/ha (IBGE, 2007b).

A grande produção de feijão-de-corda no Brasil encontra-se na Região

Nordeste e em pequenas áreas na Amazônia. Os maiores produtores são os

Estados do Ceará, Piauí, Bahia e Maranhão, nessa ordem, os quais também

apresentam as maiores áreas plantadas (EMBRAPA INFORMÁTICA

AGROPECUÁRIA, 2007).

Com relação aos aspectos socioeconômicos, a cultura do feijão-de-corda é

responsável pela geração de 1.451.587 empregos/ano no Brasil, sendo que as

cultivares da Embrapa produzem 140.318 toneladas e geram 435.473 empregos,

movimentando US$ 75 milhões ao ano (EMBRAPA, 2007).

Diante do reconhecimento da importância dessa cultura, o estudo das doenças

que a afetam vem recebendo crescente prioridade, já que estas têm respondido

por perdas expressivas no processo de produção, sendo um dos principais fatores

limitantes do cultivo do feijão-de-corda. Os principais agentes causadores das

doenças que afetam o feijão-de-corda são vírus, bactérias, fungos e nematóides

(OLIVEIRA, 2006). Existem ainda, danos causados por insetos que se alimentam

de tecidos vivos de plantas e de grãos armazenados. Estes últimos apresentam-

se como um sério problema à conservação em armazéns (WATT e ARAÚJO,

1988).

Cerca de 40 espécies de fungos foram identificadas como patogênicas ao

feijão-de-corda, sendo 20 destas, identificadas no Brasil (ALLEN, 1982). Doenças

como a cercosporiose (Cercospora crunta e Cercospora canescens), a mela ou

murcha da teia micélia (Rhizoctonia solani), a sarna (Sphaceloma sp.), a murcha

do fusário (Fusarium oxysporum), a ferrugem (Uromyces vignae), a podridão das

raízes (Fusarium solani) e a antracnose (Colletotrichum sp.) são doenças

causadas por fungos fitopatogênicos que merecem destaque do ponto de vista

sócio-econômico (RIOS, 1988).

1.3. Colletotrichum

Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. é um organismo

eucarioto pertencente a ordem Melanconiales, classe Coelomycetes e subdivisão

Deuteromycotina (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001). Sua fase sexual

(teleomórfica) corresponde à espécie Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld. &

von Schrenk, pertencente a família Phyllachoraceae da divisão Ascomycota

(HAWKSWORTH et al., 2005). Esse fungo apresenta um grau de diversidade

morfológica e biológica muito grande, quando comparado com outros fungos e,

dentre as espécies de Colletotrichum, é a que apresenta patogenicidade a um

maior número de hospedeiros (AGOSTINI et al, 1992; BEEVER et al, 1995; DU et

al., 2005; LIYANAGE et al, 1992).

O gênero Colletotrichum foi descrito em 1790 por Tode com o nome

Vermicularia, o qual foi validado por Fries em 1825 (BAXTER et al., 2005).

Penzig, em 1882, descreveu o Vermicularia gloeosporioides, hoje conhecido

como C. gloeosporioides, quando foi isolado de folhas de um cítrico, na Itália

(ALAMEDA, 2005). Mais tarde, Saccardo, em 1884, transferiu o gênero

Vermicularia ao gênero Colletotrichum e este gênero foi estabelecido por Corda,

em 1831 (BAXTER et al., 2005).

Colletotrichum tem sido reescrito como diferentes gêneros, sendo os mais

comuns Vermicularia e Gloeosporium Desm. & Mont. (AKINWUNMI e LATUNDE-

DADA, 2001; WHARTON, 2005). Von Arx (1957, 1970) reduziu a confusão entre

gêneros ao escrever monografias sobre Colletotrichum, no que reduziu centenas

de táxons a 13 espécies aceitáveis. Além disso, agrupou 600 sinônimos em 8

formas de C. gloeosporioides, baseado na variabilidade do cultivo e na

especificidade do hospedeiro. Hoje em dia, ainda existem problemas taxonômicos

para C. gloeosporioides (ALAMEDA, 2005; JEFFRIES et al., 1990).

O número de espécies aceitas de Colletotrichum tem agora aumentado

para 39, baseado em outros estudos como características morfológicas, culturais

e patogênicas (SUTTON, 1992, 2005). Muitos táxons considerados como formas

hospedeiro-específicas por von Arx (1957) foram reconhecidos como espécies

íntegras por Sutton (1992). Por exemplo, Sutton (1992) considerou C. circinans

como distinto de C. coccodes e outras espécies de Colletotrichum, enquanto von

Arx (1957) reconheceu C. circinans como uma forma especiales de C. dematium

(C. dematium f.sp. circinans) (FAGBOLA e ABANG, 2004). A variação de

hospedeiro de muitas espécies de Colletotrichum não é muito bem conhecida e o

tratamento do gênero, com bases em Sutton, foi criticado por ser baseado na

suposição que espécies de Colletotrichum são hospedeiro-específicas (CANNON

et al., 2000).

Um dos problemas com a taxonomia com bases morfológicas de

Colletotrichum spp. reside na produção de conídios secundários que geralmente

são variáveis em tamanho e forma, dificultando assim a identificação da espécie

(BUDDIE et al., 1999). Devido a estes problemas, vários métodos moleculares

são usados para discriminar espécies de Colletotrichum, já que os critérios

morfotaxonômicos não são precisos (FREEMAN et al., 1996). A ocorrência

comum de características morfológicas similares entre as espécies e a variação

na especificidade a hospedeiros têm levado ao uso de marcadores bioquímicos e

moleculares para a identificação de espécies de Colletotrichum (ABANG et al.,

2002; CANNON et al., 2000).

Recentemente, o método de reação em cadeia de polimerase (PCR) tem

sido usado para amplificar fragmentos de DNA genômico com o emprego de

iniciadores específicos (primers) gerando cópias de regiões específicas da cadeia

de DNA (STARR e TAGGART, 1998) que permitem a classificação taxonômica.

De fato, análises das regiões ITS (Internal Transcribed Spacer), além dos

domínios D1 e D2 do rDNA nuclear, têm sido usados extensivamente para

resolver questões taxonômicas entre espécies de Colletotrichum (BAILEY et al.

1996; BARRETO et al., 2007; FREEMAN et al., 2000; LATUNDE-DADA et al.,

1996; SHERRIFF et al. 1994; SREENIVASAPRASAD et al., 1996). Acredita-se

que esses espaçadores, muito provavelmente, sejam íntrons do grupo I de auto-

emenda (splicing) que repetem unidades que evoluíram rapidamente e que

variam entre espécies e gênero (BALDWIN et al., 1995; WHITE et al., 1990).

1.4. Estratégias de Infecção de Espécies de Colletotrichum

Muitos fungos fitopatogênicos desenvolvem células especializadas

(estruturas de infecção) que são requeridas para o processo de penetração e

colonização de tecidos hospedeiros (HOCH e STAPLES, 1991; MENDGEN e

DEISING, 1993).

Os primeiros estágios do desenvolvimento fúngico do processo de infecção

são essencialmente os mesmos para todas as espécies de Colletotrichum. Os

estágios iniciais podem ser separados em: 1) deposição do conídio na superfície

do tecido vegetal; 2) aderência do conídio; 3) germinação e emissão de tubo

germinativo; 4) desenvolvimento de apressório; e 5) penetração da epiderme por

uma hifa de penetração (JEFFRIES et al., 1990). As diferenças cruciais entre um

modo de infecção e outro se dá depois da penetração (PRUSKY et al., 2000),

onde diferentes estruturas possuem características e funções distintas. Assim,

várias funções estão relacionadas à adesão (BRAUN e HOWARD, 1994;

NICHOLSON e EPSTEIN, 1991), reconhecimento (VIRET et al., 1994),

sinalização celular (READ et al., 1992), nutrição (SMITH e SMITH, 1990) e

proteção contra condições adversas do ambiente (NICHOLSON e EPSTEIN,

1991). Todas essas estruturas são cruciais para o sucesso da infecção.

Os conídios de fungos biotróficos geralmente produzem um tubo

germinativo e apressório que aderem na superfície do tecido vegetal. Outros

fungos podem infectar a planta através de uma porta de entrada natural, como um

estômato, por exemplo, ou por injúrias acometidas no órgão da planta

(BARRETO, 2005). Na maioria das espécies de Colletotrichum, a diferenciação de

um apressório é essencial para a penetração do hospedeiro (KUO, 1999). O

apressório se desenvolve quando a extremidade do tubo germinativo começa a

intumescer, sendo delimitado por um septo. Este septo não ocorre em fungos

pertencentes ao complexo C. orbiculare (C. lagenarium, C. malvarum, C. trifolii e

C. lindemuthianum) (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001). Em seguida, o

amadurecimento do apressório envolve a formação de uma hifa de penetração na

base da célula (identificada como uma mancha circular observável ao

microscópio), deposição de novas camadas da parede celular e a secreção de

uma matriz extracelular. Esse último processo, provavelmente, tem papel chave

para o estabelecimento do apressório na superfície do hospedeiro (PRUSKY et

al., 2000). Subsequentemente, melanina é depositada em uma camada da parede

celular e glicerol é gerado pelo metabolismo de glicogênio, trealose e lipídios

estocados (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001; DE JONG et al., 1997). Como

o glicerol é impermeável à camada de melanina, há uma combinação de uma

força mecânica, na forma de alta pressão de turgescência, e degradação

enzimática da cutícula e da parede da célula hospedeira (HOWARD e VALENT,

1996; MENDGEN e DEISING, 1993).

Durante o processo de melanização, três genes estruturais (PKS1, SCD1 e

THR1) e um regulador (CMR1) estão envolvidos. Durante sua síntese, duas

etapas subseqüentes de desidratação e redução são requeridas. Além disso, para

que este processo aconteça, a interação com estruturas lipídicas presentes na

camada de cera da célula vegetal deve ocorrer (PRUSKY et al., 2000).

Em relação ao modo de infecção, algumas espécies como as pertencentes

ao agregado C. orbiculare, C. graminicola, C. sublineolum, C. destructivum, C.

truncatum, C. linicola e muitos isolados de C. gloeosporioides são hemibiotróficos

(BAILEY et al., 1992; BAILEY, 1997; LATUNDE-DADA et al., 1996; SKIPP et al.,

1995). Esta estratégia hemibiotrófica começa com uma fase biotrófica transiente

que rapidamente evolui para uma fase necrotrófica destrutiva (Figura 1.1)

(AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001).

Durante a fase biotrófica, a membrana plasmática do hospedeiro expande-

se e invagina-se ao redor do desenvolvimento da vesícula de infecção e das hifas

primárias, e uma camada de matriz interfacial é depositada entre a parede celular

do fungo e a membrana plasmática do hospedeiro (MENDGEN e HAHN, 2002).

Contudo, a membrana plasmática perde sua integridade funcional e a célula

começa a degenerar e morre (O’CONNELL et al., 1985). Embora a hifa

intracelular, presumivelmente, obtenha nutrientes da célula hospedeira morta, a

morte celular é gradual e confinada a células de infecção e não é associada com

a dissolução extensa da parede celular do hospedeiro (PRUSKY et al, 2000).

O uso de anticorpos monoclonais UB25 pôde identificar uma proteína

sintetizada nas estruturas biotróficas, vesículas e hifas primárias (O’CONNELL et

al., 1996). A glicoproteína CIH1, reconhecida pelo UB25, é uma proteína rica em

prolina, que forma uma estrutura multimérica na matriz interfacial entre a hifa

intracelular e a membrana plasmática (PERFECT et al., 1998, 2001). CIH1 tem

algumas similaridades com proteínas ricas em prolina (PRPs) e glicoproteínas

ricas em hidroxiprolina (HRGPs), que são importantes componentes estruturais da

parede celular de plantas (CORBIN et al., 1987; SHOWALTER et al., 1985;

TEMPLETON et al., 1990). As PRPs e HRGPs podem, também, formar estruturas

ligadas por interações cruzadas, quando sob estresse oxidativo (HAMMOND-

KOSACK e JONES, 2000).

Depois da fase biotrófica, a fase necrotrófica é desenvolvida, estando

associada com a formação e ramificação de hifas secundárias estreitas no tecido

vegetal. Estas hifas têm a capacidade de infectar células vizinhas, produzindo

lesões nas superfícies de folhas infectadas. As hifas secundárias, juntamente com

hifas primárias, formam agregados em forma de nó iniciando o processo de

formação de acérvulo (DUFRESNE et al., 2000).

Com a formação de acérvulos, a cutícula é rompida mecanicamente,

ocorrendo a expansão de conídios, conidióforos e setas, se existirem, entre a

parede celular e cutículas. Este tipo de acérvulo é denominado como

hipostromático, sendo encontrado em todas as espécies de Colletotrichum

infectando gramíneas. Em contraste, a maioria das espécies de Colletotrichum

apresenta acérvulos pulviniformes, em que a parede epidérmica e a cutícula são

rompidas simultaneamente (WHARTON et al., 2001).

Diferente de espécies que realizam a hemibiotrofia, espécies como C.

circinans e C. capsici são exclusivamente necrotróficas (AKINWUNMI e

LATUNDE-DADA, 2001). Após penetração na cutícula, estes patógenos não

entram imediatamente dentro do lúmen da célula, mas se desenvolvem abaixo da

cutícula, dentro das paredes periclinais e anticlinais das células epidérmicas,

utilizando estratégia de infecção subcuticular, intramural necrotrófica (Figura 1.1)

(PRING et al., 1995).

No estágio mais inicial da penetração, o desenvolvimento intramural está

associado a um extensivo intumescimento e dissolução da parede celular

hospedeira, podendo ocorrer uma fase biotrófica curta ou apenas uma fase

necrotrófica destrutiva (PRUSKY et al., 2000). Como no hemibiotrofismo

intracelular, os mecanismos de defesa da planta não são induzidos e o fungo

continua a se ramificar e crescer intramuralmente, penetrando na célula apenas

posteriormente (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001).

Figura 1.1 – Estratégias de infecção adotadas por espécies de Colletotrichum. Acima, estratégia

hemibiotrófica intracelular e, abaixo, estratégia subcuticular, intramural necrotrófica. Conídio

binucleado (C), apressório (A), mancha interna observável por microscopia de luz (ILS), hifa de

penetração (PP), vesícula de infecção e hifa primária (PH), hifa secundária (SH), hifa secundária

intramural (ScH), cutícula (Cu), célula epidérmica (E), célula do mesófilo (M) e fase necrotrófica

subseqüente (N).

Fonte: Wharton e Diéguez-Uribeondo (2004).

Subseqüentemente, estes fungos difundem-se rapidamente intra e

intercelularmente, dissolvendo as paredes celulares e matando as células durante

o processo de infecção (WHARTON et al., 2001; WHARTON e DIÉGUEZ-

URIBEONDO, 2004).

Outras espécies de Colletotrichum combinam os dois tipos de estratégias,

produzindo hifa intracelular e hifa subcuticular com os mesmos tecidos. C. magna

em melancia (Citrullus vulgaris) e formas de C. gloeosporioides que infectam

abacate (Persea americana) e citrus (Citrus sp.) podem utilizar ambas as

estratégias (PRUSKY et al., 2000). Além disso, outras formas de infecção podem

ser observadas. C. gloeosporioides e C. acutatum podem penetrar em estômatos

abertos e se ramificar intercelularmente no mesófilo da folha (BARRETO, 2005;

MARTÍN e GARCÍA-FIGUERES, 1999).

1.5. Respostas de Defesa de Plantas a Patógenos

Como foi descrito, durante a patogênese, os microorganismos patogênicos

lançam mão de muitas estratégias para infectar as plantas. Contudo, a maioria

delas exibe resistência natural ao ataque dos fitopatógenos, pois desenvolvem

reação incompatível, na qual não há desenvolvimento da doença (KOMBRINK e

SOMSSICH, 1995). Sendo assim, a seleção natural, a geração de cultivares

resistentes e a co-evolução de raças de patógenos propiciaram, durante a

evolução, um quadro em que a doença é tida como exceção e não como regra.

Assim, poucos microorganismos especializados interagem compativelmente com

as plantas, isto é, desenvolvendo doença (HEATH, 1997).

De acordo com a hipótese de Flor (1955), estas interações são usualmente

mediadas pela relação gene-a-gene, ou seja, entre genes dominantes de

resistência da planta (R) e genes dominantes de avirulência do patógeno (Avr). A

resistência descreve a capacidade de prevenção, restrição ou retardamento que

as plantas têm à penetração do patógeno no tecido hospedeiro (BELL, 1981). No

entanto, genes recessivos de resistência foram descritos por Hammond-Kosack e

Jones (2000) em interações envolvendo patógenos que liberam substâncias

tóxicas no hospedeiro, sendo estas toxinas essenciais na compatibilidade da

interação.

O sistema de defesa das plantas inclui fatores de resistência pré-formados

(passivos, constitutivos) e pós-formados (ativos, induzíveis). Os primeiros

correspondem àqueles que estão presentes na planta mesmo antes dela ser

atacada por algum patógeno. Diferentemente, os pós-formados estão ausentes ou

em baixas concentrações antes da infecção, porém elevam seus níveis em

resposta a algum estresse imposto à planta (JEANDET et al., 2002; ODJAKOVA e

HADJIIVANOVA, 2001).

1.5.1. Compostos de Defesa Pré-Formados

As barreiras estruturais, como a cutícula e a parede celular, constituem os

principais constituintes pré-formados relacionados com a defesa vegetal.

Geralmente, estas defesas físicas são fortificadas pela deposição de suberina e

lignina durante o processo de invasão do patógeno (ODJAKOVA e

HADJIIVANOVA, 2001).

A cutícula consiste de ácidos graxos esterificados, juntamente com

compostos fenólicos (cutina) e álcoois graxos primários (cera). É encontrada na

parte aérea de plantas e sua estrutura é bastante relacionada com a suberina,

matriz de compostos fenólicos insolúveis similar à lignina (KOMBRINK e

SOMSSICHI, 1995; ODJAKOVA e HADJIIVANOVA, 2001). A camada de cera é

uma importante barreira para patógenos, mas controversa. A presença de

determinados compostos de natureza lipídica em sua estrutura estimula a

formação de apressório de fungos. Entretanto, outras substâncias de mesma

natureza podem inibir este processo de desenvolvimento fúngico (PRUSKY et al.,

2000).

Abaixo da cutícula fica a parede celular. Essa estrutura é bastante

importante como barreira física, dificultando a entrada de fitopatógenos. Consiste

de polímeros de carboidratos (celulose, hemicelulose e pectinas), aminoácidos,

HRGPs, PRPs, glicoproteínas ricas em glicina e compostos fenólicos (lignina)

(KOMBRINK e SOMSSICHI, 1995).

1.5.2. Percepção, Transdução de Sinal e Indução de Defesa

Uma diferença chave entre plantas resistentes e susceptíveis é o tempo de

reconhecimento do patógeno invasor e a ativação rápida e efetiva de mecanismos

de defesa. Uma planta resistente é capaz de desenvolver, rapidamente, ampla

variedade de respostas de defesa. No entanto, uma planta susceptível, quando

responde ao ataque do patógeno, o faz tardiamente (YANG et al., 1997).

A ativação da resposta de defesa na planta é iniciada pelo reconhecimento

de moléculas sinalizadoras, chamadas elicitores (MYSORE e RYU, 2004; NIKI et

al., 1998; NURNBERGER e BRUNNER, 2002). A interação destas moléculas com

os receptores do hospedeiro pode ativar uma cascata de transdução de sinal que

pode envolver fluxos de íons, produção de ácido salicílico (AS), produção de

espécies reativas de oxigênio (ROS), fosforilação de proteínas e outros eventos

de sinalização (ZHU et al, 1996).

A molécula elicitora é reconhecida por um receptor apropriado localizado

na membrana plasmática da célula hospedeira. Rapidamente, a interação do

elicitor com o receptor ativa canais de H+, K+, Cl- e Ca2+, interferindo no fluxo

destes íons. O efluxo de K+ e Cl-, e o influxo de H+ e Ca2+, causam mudanças no

pH dos espaços intra e extracelular ativando uma oxidase do NAD(P)H presente

na membrana plasmática, cujo sítio ativo se volta para a região extracelular.

Dessa forma, a enzima oxidase do NAD(P)H converte oxigênio molecular (O2) em

radicais superóxidos (�O2-) (YANG et al., 1997; WOJTASZEK, 1997). Estes

radicais superóxidos são produzidos e convertidos em outras ROS iniciando um

fenômeno chamado de explosão oxidativa, a qual será descrita mais adiante.

Além do fluxo de íons, a amplificação de muitos sinais durante a interação

planta-patógeno é devido, também, à produção de AS. Desde a descoberta de

que esse composto é produzido sob infecção em pepino (Cucumis sativus)

(MÉTRAUX et al., 1990) e fumo (Nicotiana tabacum) (MALAMY et al., 1990), o AS

é tido como um suposto sinalizador químico que está relacionado à ativação de

mecanismos de defesa das plantas.

Estudos mostram que o AS é produzido a partir da via do

shikimato/arogenato (ZENK e MULLER, 1964). Nesta rota metabólica, o

aminoácido fenilalanina é convertido em ácido cinâmico (AC) pela enzima

fenilalanina amônio-liase (PAL). Essa é uma enzima chave para a via do

shikimato visto que através dela são produzidos muitos compostos de defesa,

dentre os quais lignina e fitoalexinas (HORVATH e CHUA, 1994). Em seguida, o

AC pode seguir duas vias para a produção de AS. Primeiro, o AC é transformado

em ácido benzóico para, assim, ser convertido em AS pela enzima hidroxilase do

ácido benzóico. Segundo, o AC é convertido em ácido 2-cumárico e, então,

oxidado a AS (COQUOZ et al., 1998). Após sua síntese, AS pode ser encontrado

dentro da célula na forma conjugada com grupos glicosídios, ésteres e amido. Da

mesma forma, o ácido benzóico também pode estar conjugado com grupos

hidroxilas (COQUOZ et al., 1998; EDWARDS, 1994).

Durante o processo de interação entre a planta e o patógeno, a produção

de AS é, geralmente, seguida por aumento na produção e acúmulo de H2O2

(KLESSIG et al., 2000). Isto acontece pelo fato do AS inativar as enzimas

peroxidase do ascorbato (APX) e catalase (CAT), que são enzimas que

participam, também, no controle dos teores de H2O2. O aumento de AS está

também relacionado à fosforilação e desfosforilação de proteínas, assim como na

expressão de genes que codificam para Proteínas Relacionadas à Patogênese

(PR-Proteínas) (DING et al., 2002).

Embora a expressão de genes de defesa no local da infecção esteja

relacionada ao aumento de AS, existem dúvidas se esta molécula é responsável

pela indução da expressão de genes de defesa em células distantes do local de

infecção (resposta sistêmica adquirida – SAR) (GODIARD et al., 1994), sendo

sugerida a participação de um mensageiro secundário na ativação deste

processo, provavelmente, o H2O2 (YANG et al., 1997).

1.5.3. Produção de ROS e Explosão Oxidativa

Um dos mais peculiares eventos que acontece nos primeiros estágios da

interação entre a planta e o patógeno é a rápida e transiente produção de ROS

pela planta, chamado de explosão oxidativa (LOW e MERIDA, 1996). Essa

resposta foi observada em muitos sistemas planta-patógeno envolvendo fungos

(VERA-ESTRELA et al., 1992), bactérias (KEPPLER et al., 1989), vírus (DOKE e

OHASHI, 1988) ou elicitores (ZHANG et al., 2004). ROS, como o próprio nome

diz, são espécies de O2 ativadas por algum processo de oxi-redução. Dessa

forma, a produção de ROS a partir de O2 tem sido considerada como um dos

grandes paradoxos da vida aeróbica, já que o O2 funciona como molécula

essencial para a vida destes organismos (MARX, 1985).

As formas predominantes de ROS, porém não as únicas, encontradas em

plantas incluem �O2-, H2O2 e radicais hidroxil (�OH), e muitas enzimas têm sido

envolvidas na sua produção. Assim como em neutrófilos de mamíferos, a

participação da enzima oxidase do NAD(P)H tem sido relacionada com a

formação de ROS (APEL e HIRT, 2004). Como mencionado anteriormente, essa

enzima catalisa a produção de �O2- pela adição de um elétron à molécula de O2

usando NAD(P)H como doador de elétrons. Assim, o �O2- produzido serve como

material inicial para a produção de uma variedade de outras ROS. Além disso,

outros modelos alternativos têm sido propostos para a produção de ROS. Por

exemplo, peroxidases do apoplasto que estão ligadas ionicamente ou

covalentemente a polímeros da parede celular atuam em dois diferentes modos

catalíticos (WOJTASZEK, 1997). Na presença de H2O2 e substratos fenólicos elas

operam na síntese de lignina e outros polímeros fenólicos que servem como

barreira estrutural para deter a invasão da planta pelo patógeno. Porém, se o

substrato for substituído por NAD(P)H, ou outro composto redutor relacionado, há

formação de uma reação em cadeia com produção de H2O2 (APEL e HIRT, 2004).

Estas peroxidases diferem das oxidases do NAD(P)H por diferentes valores de Km

para O2 e por diferentes sensibilidades ao cianeto, azida e cloreto de

difenilenoiodônio (DPI) (BAKER et al., 1998; VERA-ESTRELLA et al, 1992).

Embora haja poucos relatos, outras enzimas estão relacionadas com a produção

de ROS no apoplasto. Entre elas estão diamino, poliamino e oxalato oxidases.

Estas enzimas produzem diretamente H2O2 a partir de O2 (LANGEBARTELS et

al., 2002).

Em relação ao radical �OH, este pode ser gerado quando há reação

espontânea entre o H2O2 e �O2-. Este processo é conhecido como reação de

Haber-Weiss, na qual, além da produção de �OH, há formação de íons hidroxila

(OH-) e H2O. �OH pode, ainda, ser produzido a partir de uma reação de oxi-

redução entre H2O2 e um íon divalente, que, geralmente, é Fe2+ ou Cu+. Este

evento químico é conhecido como reação de Fenton (WOJTASZEK, 1997).

Além de estresses causados por microorganismos patogênicos, estresses

abióticos podem levar ao aumento de ROS. Em plantas, em condições fisiológicas

normais, ROS são continuamente produzidas pelas mitocôndrias, cloroplastos e

peroxissomos, sendo suas concentrações controladas. Diferente dos mamíferos,

a contribuição das mitocôndrias para a produção de ROS em plantas é bem

pequena (PURVIS, 1997). A produção de ROS pelas mitocôndrias de plantas só

não é maior devido à participação de uma oxidase alternativa (AOX), que

compete pelos elétrons do citocromo bc1 para produzir água a partir de O2.

Embora esta enzima seja também encontrada nos cloroplastos, a produção de

ROS nas plantas se deve mais a esta organela do que a qualquer outra

(MITLLER, 2002). Nos cloroplastos, três eventos estão relacionados com a

produção de ROS: 1) a reação oxigenase da Rubisco, na qual há participação dos

peroxissomos; 2) a redução direta de oxigênio molecular pelo fotossistema I (PSI);

e 3) a respiração feita por estas próprias organelas (APEL e HIRT, 2004).

A geração de ROS diante de estresses bióticos e abióticos é regulada de

maneira diferente (MITTLER, 2002). Geralmente, a planta responde a um ataque

feito por patógenos aumentando os teores de ROS, para que, dessa forma, estes

compostos possam causar danos ao invasor e sinalizar respostas de defesa no

hospedeiro, como a resposta de hipersensibilidade (HR) e a resposta sistêmica

adquirida (SAR). Entretanto, diante de um estresse causado por intempéries

ambientais, a planta produz, descontroladamente, uma grande quantidade de

ROS, sendo necessário degradar estes compostos para não haver danos no

tecido vegetal.

1.5.4. H2O2

Em resposta ao ataque de um patógeno, a planta produz H2O2 localmente

e sistemicamente (OROZCO-CARDENAS e RYAN, 1999). Embora o seu papel

não esteja bem estabelecido, é sabido que o H2O2 têm uma importante função na

defesa da planta (BUCKNER et al., 2000). Em interações incompatíveis, a

produção de ROS acontece de maneira bifásica. No início da infecção há acúmulo

muito rápido de H2O2 e, em seguida, um segundo acúmulo ocorre, sendo

caracterizado por ser mais prolongado do que o primeiro (BAKER e ORLANDI,

1995). Barreto (2005) observou que a cultivar de feijão-de-corda resistente a C.

gloeosporioides, TE-97-411-1E (TE-97), apresentou proeminente acúmulo de

H2O2. No entanto, este aumento nos teores de H2O2 não foi observado na cultivar

susceptível BR-3-TRACUATEUA, sugerindo, assim, que o H2O2 deve está

envolvido neste processo de resistência/susceptibilidade.

O acúmulo de H2O2 na planta pode favorecer a formação de ligações

cruzadas de HRGPs e PRPs e, consequentemente, promover o fortalecimento da

parede celular (TENHAKEN et al., 1995). HRGPs e PRPs estão envolvidas na

fortificação da parede celular por duas formas. Primeiramente, HRGPs e PRPs

pré-formadas estabelecem, rapidamente, interações cruzadas com constituintes

da parede celular sob indução de H2O2. Depois, ocorre síntese de novo de

HRGPs e PRPs e, em seguida, adição e polimerização de lignina (HAMMOND-

KOSACK e JONES, 2000).

Outra conseqüência da produção de H2O2 e de outras ROS é a

peroxidação de fosfolipídios e glicolipídios das membranas da célula (MCCORD,

2000). A peroxidação de lipídios é um processo que envolve três passos distintos:

iniciação; propagação; e terminação. Em seguida, as moléculas de hidroperóxido

de lipídios são degradadas em aldeídos, malonaldeído (MDA), hidrocarbonos e

etileno (BRADLEY e MINN, 1992; LESHEM, 1992). Além disso, o H2O2 pode

causar modificações e inativação de enzimas e moléculas de DNA (BARBER e

ANDERSSON, 1992; OLEINICK et al., 1986).

Em adição aos danos causados pelo H2O2, um dos fatores ligados à defesa

vegetal e que está relacionado com o seu acúmulo é a indução de HR, um tipo de

morte celular programada (PCD) (PALAVAN-UNSAL et al., 2005; DAT et al.,

2003). Como em animais, a morte celular é um evento muito importante

desenvolvido pelas plantas (KROEMER et al, 1998). Esta resposta de defesa se

apresenta sob forma de discretas lesões que impossibilitam a propagação de

determinados patógenos para outros tecidos da planta, parando, assim, a

progressão da doença (GOODMAN e NOVACKY, 1994). Diferente da morte por

necrose (morte celular passiva), a PCD é caracterizada pela formação de

agregados de cromatina, contração da célula, condensação do citoplasma e

núcleo, e fragmentação de DNA (BUCKNER et al., 2000). A morte por necrose

não é um evento fisiológico ativado pela planta durante o estresse, mas sim,

resulta de um processo degenerativo decorrente de traumas conseqüentes do

mesmo (O’BRIEN et al., 1998). Dessa forma, a HR é caracterizada por uma

intensa expressão e supressão de genes que desencadeiam o processo de morte

celular (JABS, 1999).

Trabalhos têm mostrado que o contato direto de H2O2 exógeno com fungos

pode inibir seu crescimento vegetativo (BARRETO, 2005; LU e HIGGINS, 1999).

Além disso, plantas transgênicas que expressam enzimas produtoras de H2O2

apresentam resistência a muitos fungos biotróficos e bactérias (SANTOS et al.,

2001; XU e PAN, 2000), como é o caso daquelas que super-expressam glucose-

oxidase (GO), uma enzima produtora de H2O2 através da degradação de D-

glucose (WU et al., 1997). Entretanto, fungos necrotróficos crescem mais

facilmente em plantas que acumulam muito H2O2 (GOVRIN e LEVINE, 2000).

Apesar de muitos estudos terem sido realizados para esclarecer a interação

destes dois tipos de fungos, muitos trabalhos ainda deverão ser realizados para

elucidar o papel do H2O2 na interação de plantas com fungos hemibiotróficos

(HAMMOND-KOSACK e JONES, 1996).

Muitos estudos têm mostrado que o H2O2 é um composto que pode se

difundir entre as células e servir como molécula sinalizadora para expressão de

genes relacionados à defesa vegetal (NEILL et al., 2002). Três principais modos

de atuação do H2O2 credenciam-no como molécula indutora da expressão gênica.

Primeiro, sensores de H2O2 podem ser ativados para induzir uma cascata de

sinalização. Segundo, componentes das vias de sinalização, como as proteínas-

quinases de ativação da mitose (MAPK, MAPKK e MAPKKK) podem ser oxidados

e ativados. Por último, o H2O2 pode modificar diretamente fatores de transcrição

envolvidos na expressão de genes de defesa (APEL e HIRT, 2004; NEILL et al.,

2002; WOJTASZEK, 1997).

A ativação de genes de forma sistêmica e o desenvolvimento de resistência

de forma duradoura consolidam-se em um processo chamado de Resposta

Sistêmica Adquirida (SAR) (GODIARD et al., 1994). Durante a SAR, muitas

proteínas de defesa são expressas. Dentre estas, as mais frequentemente

estudadas são as PR-proteínas. Atualmente, 17 famílias de PR-proteínas são

reconhecidas (ANTONIW et al., 1980; EPPLE et al., 1995; GARCÍA-OLMEDO et

al., 1995; GREEN e RYAN, 1972; LAGRIMINI et al., 1987; MELCHERS et al.,

1994; MÉTRAUX et al., 1988; OKUSHIMA et al., 2000; SOMSSICH et al., 1986;

TERRAS et al., 1992; VAN LOON, 1982; VAN LOON et al., 2006; VERA e

CONEJERO, 1988; WEI et al., 1998; ZHANG et al., 1995), dentre elas as β-1,3-

glucanases e quitinases que apresentam atividade antifúngica potencial. Além

disso, muitas peroxidases são reconhecidas como PR-proteínas já que estas

enzimas estão relacionadas à lignificação da parede durante a invasão por

patógenos e, também, por apresentarem atividade antifúngica (STAEHELIN,

1992).

1.5.5. Mecanismos Antioxidantes Não-Enzimáticos

Muitos compostos não-enzimáticos funcionam como verdadeiros tampões

redoxes nas células vegetais. Os mais importantes são ascorbato, glutationa,

tocoferol e carotenóides.

O ascorbato (vitamina C) é uma importante vitamina que está relacionada a

muitos processos fisiológicos na planta (FOYER, 1993). A síntese deste composto

ocorre no citosol a partir de hexoses, como a D-glucose. Sendo um antioxidante,

o ascorbato pode reagir com radicais superóxido, peróxido de hidrogênio e

radicais tocoferoxil para formar monodesidroascorbato (MHDA) e/ou

desidroascorbato (DHA). As formas reduzidas são recicladas na via Halliwell-

Asada, na qual há o envolvimento das enzimas monodesidroascorbato redutase

(MDAR) e desidroascorbato redutase (DHAR), usando equivalentes de NAD(P)H

ou glutationa, respectivamente (ASADA, 1992; FOYER e HALLIWELL, 1976).

A glutationa é um tripeptídio (Glu-Cys-Gly) que funciona como antioxidante,

assim como a vitamina C. Esta propriedade é conferida devido ao grupo sulfidrila

da cisteína, que serve como um agente redutor (HAUSLADEN e ALSCHER,

1993). A glutationa oxidada pode ser novamente reduzida através da enzima

redutase da glutationa (RG) dependente de NAD(P)H. Devido à participação

conjunta do ascorbato e glutationa, a via Halliwell-Asada também pode ser

chamada de via/ciclo Ascorbato-Glutationa (APEL e HIRT, 2004).

Outro composto importante como antioxidante é o tocoferol (vitamina E).

Esta vitamina possui um anel de benzoquinona e uma cadeia fitil reduzida que

reage com ROS (FRYER, 1992; HESS, 1993). Além disso, a vitamina E está

relacionada ao controle da peroxidação de lipídios e estabilização da membrana

plasmática.

Além desses compostos, isoprenóides C40 e tetraterpenos, como os

carotenóides, são moléculas antioxidativas importantes que estão presentes nos

plastídios de tecidos fotossintéticos e não fotossintéticos. Juntamente com o

tocoferol, este composto está envolvido no processo antioxidante de espécies

mais reativas, como o oxigênio singlet (KLOTZ, 2002).

1.5.6. Mecanismos Antioxidantes Enzimáticos

1.5.6.1. Dismutase do Superóxido (SOD; EC 1.15.1.1.)

A enzima superóxido dismutase (SOD) foi isolada pela primeira vez por

Mann e Kleilis (1938). Subseqüentemente, foi identificada por muitos nomes

como: eritrocupreina; indofenol oxidase; e tetrazolium oxidase. McCord e

Fridovitch (1969) descobriram a função catalítica da enzima e hoje está

estabelecido que ela catalisa a reação de dois radicais superóxido para a

formação de uma molécula de H2O2 e uma de O2. Diferentes isoformas são

encontradas no apoplasto, no citosol, nas mitocôdrias, nos peroxissomos e nos

cloroplastos (APEL e HIRT, 2004).

Existem quatro tipos distintos de SOD, classificadas com base no íon

presente no seu sítio ativo. SOD que apresentam cobre e zinco (CuZnSOD) são

encontradas em eucariotos e são as mais abundantes em plantas (SCANDALIAS,

1993). As CuZnSOD presentes no citosol geralmente apresentam estrutura

homodimérica, enquanto as do apoplasto são homotetraméricas. Embora

isoformas de CuZnSOD estejam em maior quantidade nas plantas, outras

isoformas de SOD que apresentam ferro (FeSOD) ou manganês (MnSOD) são

observadas em organelas como cloroplasto e mitocôndria de diferentes

eucariotos. No entanto, isoformas que apresentam níquel (NiSOD) em seus sítios

ativos são relatadas apenas em bactérias do gênero Streptomyces (FRIDOVICH,

1998).

1.5.6.2. Peroxidase do Ascorbato (APX; EC 1.11.1.11)

Durante o processo de infecção, as isoformas de peroxidases do ascorbato

(APX) eliminam peróxido de hidrogênio em uma reação dependente de ascorbato

(VENICE et al., 2002). Assim como as isoformas de SOD, as APX estão

distribuídas em muitos compartimentos da célula, tais como mitocôndrias,

cloroplastos, peroxissomos, citosol e apoplasto (VANACKER et al., 1998).

A APX requer um sistema de regeneração de ascorbato e glutationa, o ciclo

Ascorbato-Glutationa. A desentoxificação de H2O2 ocorre pela oxidação de

ascorbato a MHDA, que pode ser regenerado pela MDAR. A regeneração é

mediada por DHAR dirigida pela oxidação de glutationa. Finalmente, a glutationa

oxidada pode ser reduzida pela enzima RG (APEL e HIRT, 2004; ASADA, 1992;

FOYER e HALLIWELL, 1976).

Estudos têm mostrado que a APX e a catalase (CAT) são as principais

enzimas responsáveis pela eliminação de H2O2 nas plantas (SIEGEL, 1993). Da

mesma forma, ambas são sensíveis ao AS e ao óxido nítrico (NO), cujo aumento

causa inibição destas enzimas e, conseqüentemente, elevação dos teores de

H2O2 (KLESSIG et al., 2000).

1.5.6.3. Catalase (CAT; EC 1.11.1.6.)

A enzima CAT catalisa a conversão de H2O2 em água e oxigênio. Diferente

da APX, a CAT não requer um co-fator antioxidante e nem um sistema de

regeneração (APEL e HIRT, 2004). Esta oxirredutase possui quatro grupos

ferriprotoporfirínicos que são essenciais para desempenhar sua atividade.

Esta enzima é encontrada em todos os eucariotos aeróbicos e muitas

isoformas têm sido descritas em muitas plantas. São enzimas que apresentam

isoformas no citosol e mitocôndria, mas são encontradas principalmente nos

peroxissomos e glioxissomos (SCANDALIAS, 1993; SIEGEL, 1993). São

extremamente sensíveis à fotoinativação e podem ser inativadas por altas

concentrações de H2O2 (ANDERSON et al., 1995).

2 – OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Na interação entre planta e patógeno, o H2O2 é considerado uma molécula

muito relevante, sendo o aumento ou diminuição de sua concentração cruciais

para a defesa da planta. Assim, o modelo do presente trabalho foi baseado em

estudos realizados sobre a interação entre a cultivar suscetível de feijão-de-corda,

BR-3, com o fungo C. gloeosporioides. Nesta interação é observado baixo

acúmulo de H2O2, diferente do patossistema envolvendo a cultivar resistente TE-

97 que aumenta. Dessa forma, a pergunta central que norteou o presente trabalho

foi:

“Alterações nas concentrações fisiológicas de H2O2 em feijão-de-corda

determinariam alguma diferença quanto ao grau de resistência/susceptibilidade da

planta à doença causada pelo fungo hemibiotrófico C. gloeosporioides?”

Portanto, o presente estudo foi conduzido com o objetivo central de

elucidar o papel do H2O2 na interação feijão-de-corda x C. gloesporioides, através

da manipulação de seus teores na planta, investigando as respostas do

hospedeiro e o desenvolvimento do fungo diante de dois tipos de situações: com

os níveis aumentados ou diminuídos de H2O2.

2.2. Objetivos Específicos

1 – Induzir alterações nos teores de H2O2 presentes em folhas primárias

destacadas, através da intervenção de substâncias farmacológicas;

2 – Medir os teores de H2O2 nas folhas primárias destacadas tratadas com as

substâncias farmacológicas;

3 – Avaliar a peroxidação de lipídios em folhas primárias destacadas tratadas com

as substâncias farmacológicas;

4 – Avaliar o desenvolvimento do fungo e a formação de necroses nas folhas,

através de análises macroscópicas;

5 – Avaliar os vários estágios de desenvolvimento do fungo e de suas estruturas

relacionadas à infecção, através de análises microscópicas.

3 – MATERIAIS

3.1 Sementes

Sementes maduras quiescentes de feijão-de-corda (V. unguiculata),

genótipo BR-3 TRACUATEUA (BR-3), foram fornecidas pela Empresa Brasileira

de Pesquisa Agropecuária, Unidade do Estado do Piauí, Embrapa Meio Norte.

3.2. Fungo

O fungo C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. [teleomorfo: G. cingulata

(Stonem.) Spauld. & von Schrenk] foi obtido da micoteca do Laboratório de

Microbiologia do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará

(UFC). A cultura do fungo foi mantida em placas contendo meio de cultura Batata-

dextrose Ágar (BDA), à temperatura de 22 ºC.

3.3. Materiais para Certificação do Fungo

Kit de seqüenciamento (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing

Kit), matriz de poliacrilamida (MegaBACE Long Read Matrix) e marcadores

moleculares para eletroforese em gel de agorose foram adquiridos da Amersham

Bioscience Corp. (USA). Oligonucleotídeos sintéticos, para as reações de PCR,

foram sintetizados pela Invitrogen do Brasil. Os demais reagentes também foram

de grau analítico e obtidos comercialmente.

3.4. Reagentes Químicos

Ácido láctico, ácido salicílico, ácido tricloroacético (TCA), ácido

tiobarbitúrico (TBA), azul de Evans, Calcofluor White M2R, catalase isolada de

fígado bovino (E.C. 1.11.1.6), cloreto de difenilenoiodônio (DPI), 3,3-

diaminobenzidina (DAB), fenol, glicerol e glucose oxidase proveniente de

Aspergillus niger (E.C. 1.1.3.4) foram obtidos da Sigma-Aldrich Co., St. Louis

USA. Os demais reagentes utilizados também foram de grau analítico e obtidos

comercialmente.

4 – MÉTODOS

4.1. Identificação do Fungo

Para assegurar a taxonomia do fungo estudado foi feito a identificação da

espécie pela análise das seqüências do agrupamento interno ITS-1, 5,8S e ITS-2.

4.1.1. Purificação do DNA genômico

O DNA genômico do fungo foi purificado de acordo com a metodologia

descrita por Warner (1996), usando CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio), um

detergente muito empregado na purificação de DNA genômico, com pequenas

adaptações para as condições experimentais do presente trabalho.

No início do experimento foi adicionado ao tampão de extração [Tris-HCl

100 mM pH 8,0; EDTA 20 mM; NaCl 1,4 M; CTAB 2% (m/v) e 2-mercaptoetanol

0,2% (v/v)] 5 µL de proteinase K (USBTM Inc. EUA) para hidrolisar algumas

ligações da parede celular do fungo. No final, foi realizado um tratamento com 5

µL de RNAse A por 1 hora na temperatura de 37 ºC. Após a extração do DNA

genômico, uma nova precipitação foi realizada adicionando ao sistema uma

solução de acetato de amônio a 10% e, depois de 5 minutos, foram somados 2,5

volumes de etanol 100%. Em seguida, foi feita centrifugação a 1000 x g, por 20

minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi então descartado, o

precipitado lavado com etanol a 70% e submetido a uma nova centrifugação a

1000 x g por 10 minutos. Posteriormente, o precipitado foi suspendido novamente

em tampão TE [Tris – HCl 10 mM pH 8,0, contendo EDTA 1 mM (TE)]

esterilizado.

Eletroforeses de DNA em gel de agarose 0,8%, pH 8,0, foram

desenvolvidas de acordo com o protocolo descrito por Sambrook et al. (1989)

para averiguar a qualidade da extração do DNA por análise qualitativa de

formação de bandas.

4.1.2. Reação em cadeia da DNA polimerase e Seqüenciamento dos

Fragmentos Amplificados

As seqüências do agrupamento ITS-1, 5,8S e ITS-2 foram amplificadas por

reações em cadeia da DNA polimerase (PCR), a partir de DNA genômico isolado

de micélio do fungo. Para isso, foram utilizados iniciadores específicos da

Invitrogen Brasil LTDA (São Paulo, Brasil), ITS 5 (5´-

GCAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3´) e ITS 4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-

3´), para as extremidades que flanqueiam as referidas seqüências (Figura 4.1).

As misturas dos reagentes para PCR foram realizadas em tubos de 0,2 mL,

específicos para este tipo de reação, da Axygen Scientific Inc. (Union City – CA,

EUA). As reações de amplificação foram realizadas em um volume de 25 µL

contendo Tris-HCl a 20 mM, pH 8,4, KCl a 50 mM, MgCl2 a 1,5 mM, dATP, dCTP,

dGTP e dTTP a 100 µM cada, oligonucleotídeo (5 µmoles) e 1,25 U Taq DNA

polimerase (Invitrogen Brasil LTDA, São Paulo, Brasil). A cada tubo foi

acrescentada uma quantidade de 300 ηg de DNA e um volume de água estéril

para se obter um volume final de 25 µL por reação.

Figura 4.1 – Representação esquemática da organização dos genes de rDNA, em

eucariontes, e do anelamento dos oligonucleotídeos ITS-4 e ITS-5 nas suas

respectivas regiões. NTS – “espaçador não transcrito”, ETS – “espaçador

transcrito externo” e ITS – “espaçador transcrito interno”. Modificado de Doyle

(1987).

18 S rDNA

28 S rDNA

5,8 S rDNA

ITS-1 ITS-2

ITS-5

ITS-4

5’ 3’ NTS NTS ETS

As amplificações foram realizadas em um termociclador PTC-200 (MJ

Research Inc.,EUA) programado para um passo de desnaturação (4 min a 94 ºC),

seguido por 35 ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a 55 ºC e 2 min a 72 ºC. O último

passo foi seguido por uma incubação por 10 min a 72 ºC. Para a visualização dos

resultados das reações de PCR, descritos a seguir, foi realizada uma eletroforese

em gel de agarose a 1,0%, pH 8,0, seguindo o protocolo de Sambrook et al.

(1989).

Os produtos de PCR foram diluídos na proporção de 1:20 e submetidos a

reações de seqüenciamento pelo método da terminação da cadeia por

didesoxinucleotídeo (SANGER, 1977), em reações de 10 µL de acordo com as

especificações do fabricante (Amersham Pharmacia Biotech, DYEnamicTM ET

terminator). As amostras foram submetidas a um seqüenciador automático

(MEGABACE 1000, Amersham Pharmacia Biotech) e a análise inicial dos dados

obtidos do seqüenciamento foi feita por um pacote de programas, “MEGABACETM

DNA Sequencing System” (Amersham Pharmacia Biotech).

4.1.3. Montagem dos Fragmentos Obtidos, Alinhamento e Edição da

Seqüência

O resultado bruto do seqüenciamento proveniente das intensidades das

fluorescências foi submetido a um pacote de programas para montagem e

obtenção das seqüências de consenso, Phred (EWING et al., 1998; EWING e

GREEN, 1998) Phrap (Phil Green, University of Washington), em ambiente Linux.

As seqüências consensos das repetições montadas pelos programas foram

visualizadas e editadas pelo programa de interface gráfica Consed (GORDON et

al., 1998, 2001), e alinhadas com o auxílio do programa CLUSTALX, versão 1.82

(THOMPSON et al., 1997). A seqüência completa do fungo foi submetida à busca

por similaridade no GenBank (NCBI – National Center Biotechnology Information)

através da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL

et al., 1990 e 1997), para, a partir da similaridade com outras seqüências

depositadas, determinar se as seqüências consenso obtidas realmente

correspondem às regiões desejadas.

4.2. Obtenção dos Esporos

O fungo foi mantido em meio de cultura BDA. Na preparação do meio de

cultura, 39 g de BDA foram dissolvidos em água grau Milli-Q, q.s.p. 1 litro. A

seguir, o meio foi autoclavado (121 ºC, 20 minutos, 1,5 atm) e, após, distribuído

(20 mL) em placas de Petri de 10 cm de diâmetro. Após 12 dias de cultivo a 27 ºC

(fotoperíodo 12 h claro – 12 h escuro), os esporos foram liberados da superfície

das culturas do fungo com auxílio de uma espátula de Drigalsky, manuseada,

gentilmente, sobre a superfície da cultura. Esta suspensão foi filtrada em malha

de nylon e a concentração de esporos ajustada para 2 x 105 conídios mL-1, após

contagem com auxílio de Câmara de Neubauer.

4.3. Tratamento e Germinação das Sementes

As sementes de feijão-de-corda foram desinfetadas com NaOCl 0,05 %

(cloro ativo) por três minutos e, em seguida, lavadas abundantemente com água

destilada (Figura 4.2 A). Para germinação das sementes, foi utilizado papel toalha

de germinação Germitest®, nas dimensões de 28 x 38 cm (Figura 4.2 B),

umedecido com água destilada em um volume correspondendo 2,5 vezes ao seu

peso seco (Figura 4.2 C, D e E). As sementes, em número de 12, foram dispostas

em uma única fileira, sobre três folhas de papel sobrepostas, a uma distância

média de 4 cm do ápice da folha e 2 cm das bordas laterais (Figura 4.2 F). Após a

distribuição das sementes, o papel foi dobrado na forma de cartucho. Um grupo

de três cartuchos foi envolto por uma única folha de papel de germinação e

colocado dentro de um saco plástico transparente, desinfetado com álcool a 70%,

com o objetivo de manter as condições de umidade (Figura 4.2 G). O sistema foi

transferido para câmara de germinação com fotoperíodo ajustado para 13 horas

claro e 11 horas escuro, com intensidade luminosa de 110 µE.m-2.seg-1, umidade

relativa de 70% e temperatura de 27 ºC (Figura 4.2 H). Após o quarto dia de

plantio, as plantas sadias foram coletadas e transferidas para meios hidropônicos

em vasos de polietileno de 3 L, contendo 2,5 L de solução nutritiva de Hoagland &

Arnon (1950) diluída 10 vezes (Figura 4.2 I, J e L). O sistema foi mantido sob

aeração, utilizando-se de bombas aeradoras. Três dias após o transplantio, a

solução nutritiva foi concentrada, adicionando, em cada vaso, 80 mL de solução

estoque 5 vezes concentrada (1:5). As plantas foram mantidas sob as condições

da câmara por mais 8 dias (Figura 4.2 M).

Figura 4.2 – Tratamento e germinação das sementes de feijão-de-corda, genótipo

BR-3. (A): Tratamento com NaOCl 0,05 % (cloro ativo); (B): Papel de germinação;

(C), (D) e (E): Papéis de germinação umidificados com água destilada; (F):

Disposição das sementes; (G): Envolvimento do cartucho com saco plástico; (H):

Detalhe dos cartuchos dispostos na câmara; (I): Detalhe dos vasos e da solução

hidropônica sendo aerados; (J): Disposição das sementes transplantadas; (L):

Detalhe das condições da câmara, vasos, umidificador e aeradores; (M): plantas

com 8 dias após transplantio.

4.4. Tratamento de Folhas Primárias de Feijão-de-Corda com Substâncias

Farmacológicas

Folhas primárias de plantas sadias, crescidas sob condições hidropônicas,

foram destacadas no oitavo dia após transplantio e, com auxílio de uma seringa,

tratadas com substâncias farmacológicas produtoras ou eliminadoras de peróxido

de hidrogênio. O tratamento foi feito por infiltração, seguindo metodologia descrita

por Zhang et al. (2004), modificado para as condições do experimento.

Para elevar os níveis de H2O2 foliar, as folhas foram tratadas com ácido

salicílico a 1,0; 2,5 e 5,0 mM (AS). A injeção foi realizada na região abaxial, em

quatro campos da folha (2 do lado esquerdo e 2 do lado direito da nervura

central), utilizando-se seringa descartável de 1 mL (Injex Indústrias Cirúrgicas

LTDA), até atingir uma área foliar de 1 – 2 cm2 (Figura 4.3 b). Folhas tratadas com

água destilada serviram como controle. Para medir a área de infiltração na folha,

foi utilizado papel com medidas milimétricas impresso em transparência plástica e

com perfuração para encaixe da seringa (Figura 4.3 a). Após isso, as folhas foram

transferidas para placas de Petri contendo papel toalha umidificado com água

destilada estéril, na proporção 1:2,5 (m/v), para prover cerca de 100% de

umidade. As folhas permaneceram no escuro, a 28 ºC ± 2 ºC, para posterior

análise.

Com o mesmo objetivo, outro grupo de folhas foi tratado com oxidase da

glucose (GO), na concentração de 50; 100 e 200 U mL-1. A enzima foi dissolvida

com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5, contendo 2,0 mM de glucose

(GO+G), no momento da infiltração, de acordo com especificações de Grant et al.

Figura 4.3 – Folhas primárias destacadas de feijão-de-corda infiltradas com

substâncias farmacológicas, atingindo uma área de 1 – 2 cm2 de infiltração. (A):

Detalhe da folha primária e do medidor de área foliar; (B): Detalhe da infiltração

utilizando seringa descartável; (C): Região adaxial da folha após infiltração; (D):

Região abaxial da folha após infiltração.

(2000). Folhas tratadas com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5 serviram

como controle.

Com o propósito de diminuir os níveis de H2O2, folhas primárias foram

tratadas com catalase (CAT) na concentração de 500; 1000 e 2000 U mL-1, em

tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,5. Outro grupo de folhas foi tratado com 1,0,

2,5 e 5,0 µM de cloreto de difenilenoiodonio (DPI), dissolvido em DMSO 0,05%,

com o intento de inibir a oxidase do NAD(P)H. Folhas tratadas apenas com

tampão fosfato e DMSO serviram como controles.

Embora a concentração de tampão fosfato de sódio utilizada para dissolver

a enzima CAT tenha sido 50 mM, tampões com concentrações de 10 mM e 25

mM foram infiltrados em folhas primárias para avaliar, preliminarmente, que

concentração de tampão não interferia nos níveis de H2O2. Da mesma forma,

soluções de DMSO 0,010%, 0,025% e 0,050% foram testadas com o mesmo

intuito.

4.5. Determinação do Teor de Peróxido de Hidrogênio

4.5.1. Determinação Quantitativa

O acúmulo de peróxido de hidrogênio foi determinado de acordo com a

metodologia descrita por Gay et al. (1999). Folhas primárias destacadas foram

analisadas 2, 12 e 24 horas após tratamento com as substâncias farmacológicas .

Para isso, as folhas foram cortadas nas regiões que haviam sido infiltradas e, em

seguida, estas regiões foram armazenadas a -85 ºC. Em seguida, o material foi

homogeneizado com tampão borax-borato, 50 mM, pH 8,4, em gral, na proporção

de 1:5 (m/v). Logo após a homogeneização, a suspensão foi centrifugada (20 min,

12000 x g, 4 °C), e o sobrenadante usado para o ensaio. A mistura reacional

consistiu de 200 µL do sobrenadante + 1 mL da solução de alaranjado de xilenol

(100 µL solução A + 10 mL solução B); (solução A: FeSO4, 25 mM + (NH4)2SO4,

25 mM + H2SO4, 2,5 M + água grau Milli-Q, q.s.p. 10 mL. solução B: alaranjado de

xilenol, 125 µM + sorbitol, 100 mM + água grau Milli-Q, q.s.p. 100 mL). A mistura

reacional foi incubada por 30 minutos, à temperatura ambiente, e a absorbância

lida a 560 nm. Uma curva padrão com concentrações conhecidas de peróxido de

hidrogênio (0 – 8,0 nmol H2O2/1,2 mL) foi construída e usada para determinar a

quantidade de peróxido de hidrogênio nos tecidos vegetais.

4.5.2. Determinação Qualitativa

Para avaliar o teor de peróxido de hidrogênio nos tecidos foliares tratados

com substâncias farmacológicas, foi utilizado diaminobenzidina (DAB) (Thordal-

Christensen et al., 1997). Além dos tratamentos com AS, GO+G, CAT e DPI, e

seus respectivos controles (H2O, tampão e DMSO), folhas íntegras tratadas e não

tratadas com DAB, e folhas apenas com a lesão da seringa tratadas com DAB

foram analisadas. A infiltração com DAB (1 mg mL-1) foi conduzida segundo

Lohaus et al. (2001), modificado para as condições do experimento, como

descrita a seguir. DAB (100 mg) foi dissolvido em, aproximadamente, 50 mL de

água Milli-Q e o pH da solução ajustado para 3,0 com HCl 1 N (baixo pH é

necessário para solubilizar DAB). Posteriormente, a solução foi incubada a 50 ºC,

sob agitação, por 1 hora. Em seguida, o pH foi ajustado a 4,0 com NaOH 1N, o

volume aferido para 100 mL e a solução transferida para Kitassato acoplado a um

compressor (Dia-Pump®, Fanem LTDA®). Folhas primárias tratadas com as

substâncias farmacológicas foram coletadas nos tempos de 2 e 12 horas e

transportadas para o Kitassato contendo solução de DAB. Em seguida, as folhas

foram submetidas a uma pressão positiva de, aproximadamente, 20 kPa, por 10

minutos. Após lavagem com água destilada e de 8 horas de reação, as folhas

foram descoradas com solução de TCA em placas de Petri, até remoção completa

dos pigmentos. A fotodocumentação foi feita com câmera digital.

4.6. Peroxidação de Lipídios (Formação do Complexo MDA-TBA)

A peroxidação de lipídios foi determinada segundo a metodologia descrita

por Peever e Higgins (1989) modificada por Peixoto (1998). Folhas primárias

destacadas foram analisadas 2, 12 e 24 horas após tratamento com as

substâncias farmacológicas. Para isso, as folhas foram cortadas nas regiões que

haviam sido infiltradas. Em seguida, os tecidos infiltrados foram homogeneizados

na proporção de 1:3 (p/v) com ácido tricloroacético (TCA) a 1%, em almofariz de

porcelana, sob banho de gelo. O material obtido foi centrifugado a 12.000 x g, por

15 minutos, o precipitado descartado e o sobrenadante utilizado nas

determinações. 1,0 mL do sobrenadante foi adicionado a 3 mL de 0,5% ácido

tiobarbitúrico (TBA) em TCA 20% e a mistura imediatamente incubada em banho-

maria, a 95 °C, por 2 horas. A reação foi interrompida pelo resfriamento em banho

de gelo. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 9.000 x g, por 10

minutos, a 25 °C e a absorbância lida em duas faixas de comprimento de onda,

532 e 660 nm. Os valores de absorbância a 532 nm foram subtraídos dos valores

lidos em 660 nm (Sudhakar et al., 2001). A quantidade de complexo MDA-TBA

(Malonaldeído – Ácido tricloroacético) formada foi determinada utilizando-se, para

os cálculos, o coeficiente de absorptividade de 155 mM-1 cm-1.

4.7. Tratamento de Folhas Primárias de Feijão-de-Corda com Substâncias

Farmacológicas e Inoculação com o Fungo C. gloeosporiodes

Duas horas após o tratamento com substâncias farmacológicas, duas gotas

de 50 µL de água destilada estéril contendo, cada uma, 104 esporos do fungo

foram depositadas no campo direito da região adaxial do limbo foliar, enquanto

duas gotas de mesmo volume de água, depositadas no campo esquerdo,

serviram como controle. Foram realizadas análises macroscópicas e

microscópicas das folhas nos tempos de 12, 24, 48 e 72 horas após inoculação.

4.8. Análises Macroscópicas

As análises macroscópicas foram feitas através de observações a olho nu,

do número, tamanho e forma das lesões necróticas, e o desenvolvimento micelial

apresentadas nas folhas primárias de feijão-de-corda infectadas com C.

gloeosporioides. As lesões foram registradas através de fotografias com câmera

digital (1800 x 1200 pixels) (MVC-CD350, CD MAVICA SONY®).

4.9. Análises Microscópicas

Após tratamento das folhas primárias com H2O, tampão fosfato, DMSO,

GO+G, AS, CAT e DPI sendo que estes foram descoradas com solução de ácido

tricloroacético (TCA) [1,5 g de TCA em 750 mL de etanol e 250 mL de clorofórmio]

em placas de Petri, até remoção completa dos pigmentos.

Para visualizar as estruturas do fungo, as folhas descoradas foram

cortadas em secções, dispostas sobre lâminas de microscópio e coloridas em

lactofenol azul de anilina (Balows et al., 1991).

Para avaliar estruturas fluorescentes sob luz U.V., as folhas descoradas

foram tratadas com solução de calcoflúor 0,1% (Calcofluor White M2R, Sigma),

um fluorocromo com habilidade de se ligar à celulose e quitina. Antes da

coloração com a solução de calcoflúor, hidróxido de potássio a 10% foi utilizado

para atuar como um agente clareador por dissolução de células dos tecidos. O

corante Azul de Evans (0,04%) foi incorporado para minimizar o campo de fundo

e destacar as outras estruturas fluorescentes.

Todas as lâminas foram visualizadas em microscópio óptico (Olympus

System Microscope BX 60), sob luz branca e, em alguns casos, com

fluorescência de luz azul refletida (Olympus System Attachment Modelo BX-FLA,

Olympus), sendo fotografadas com o sistema de fotomicrografias (Olympus

Photomicrosgraphics System PM 20) acoplado ao microscópio. As

fotomicrografias foram digitalizadas e o brilho, contraste e plano de fundo das

imagens processados para melhor resolução das estruturas microscópicas

(Heath, 2000). Para o processamento das imagens, foram utilizados programas

básicos como Microsoft Office Picture Manager e PhotoImpact XL para Windows.

4.9. Delineamento Experimental

Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado, em triplicatas, para

os diferentes tratamentos, sendo cada parcela representada por três plantas. As

análises estatísticas foram conduzidas usando o programa SISVAR e as médias

comparadas pelo teste de Tukey.

5 – RESULTADOS

5.1. Identificação do Fungo

Para confirmar a identidade da espécie do fungo usado neste trabalho, a

seqüência completa do agrupamento ITS-1, 5,8S, ITS-2 foi determinada e

depositada no GenBank (nº. de acesso DQ868520). De acordo com o

alinhamento feito, o comprimento total da seqüência foi de 558 pb, sendo 167 pb

para a região ITS-1 e 157 pb para ITS-2 (Figura 5.1). A seqüência do fungo foi

submetida a uma busca de similaridade através da ferramenta BLAST e

apresentou identidade de 99 – 100% com seqüências ITS de diferentes isolados

de C. gloeosporioides.

5.2. Tratamento com Ácido Salicílico (AS)

5.2.1. Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e Peroxidação de

Lipídios

Folhas primárias destacadas de feijão-de-corda foram infiltradas com AS

nas concentrações de 1,0; 2,5 e 5,0 mM com o objetivo de distinguir qual seria a

concentração de AS que elevaria os teores de H2O2 a valores mais altos. Para

permitir comparações com teores basais de H2O2, estes foram determinados em

plantas não tratadas (controles) com substâncias farmacológicas, mas apenas

com água estéril, estando representados, também, na Figura 5.2.

Figura 5.1 – Seqüência consenso completa da região ITS-1, 5,8S, ITS-2 do fungo

C. gloeosporioides com um comprimento total de 558 pb.

CAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACTGAGTTTACGCTCTATAACCCTTTGTGAACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGTTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAA

Figura 5.2 – Teores de H2O2 em extratos de folhas primárias de feijão-de-corda

[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas em diferentes tempos após

tratamentos com H2O e com soluções de ácido salicílico (AS) em diferentes

concentrações. Valores basais de H2O2 em folhas que não receberam tratamento

nenhum são, também, apresentados. As barras verticais sobre as colunas

representam o desvio padrão das médias obtidas. Letras diferentes denotam que

houve diferenças significativas entre as médias de acordo com o teste de Tukey

(ρ ≤ 0,01). Letras minúsculas representam comparações entre as médias dos

diferentes tratamentos em cada tempo especificado. Letras maiúsculas,

comparações entre as médias de um mesmo tratamento ao longo do período

experimental.

Os dados demonstram não haver diferenças significativas dos teores basais de

H2O2 no intervalo de 2 a 24 horas após tratamento com H2O (Figura 5.2).

Entretanto, folhas tratadas com soluções de AS apresentaram acúmulo de H2O2

chegando a níveis de 186,05 ηmoles g-1 de massa fresca (MF), em folhas tratadas

com 5,0 mM de AS, 2 horas após tratamento (2 hat). Assim, folhas tratadas com

5,0 mM de AS apresentaram níveis de H2O2 aumentados em até 72 %, quando

comparadas com o grupo controle (Figura 5.2).

O acúmulo de H2O2 também foi determinado por análise qualitativa usando

o método de infiltração de DAB. Através dessa técnica, a formação de precipitado

indicou a presença de H2O2, cujo teor aumentou, consideravelmente, após 2

horas de tratamento (2 hat). Tal acúmulo foi visualizado pelo aparecimento de

manchas vermelho-amarronzadas na região infiltrada de folhas tratadas com AS

(Figura 5.3 C e D). No entanto, a polimerização de DAB não foi visualizada em

folhas controles (Figura 5.3 A e B). Para fins comparativos, folhas íntegras

tratadas e não tratadas com DAB, e folhas apenas com a lesão provocada pela

seringa e tratadas com DAB podem ser visualizadas na Figura 5.4.

A peroxidação de lipídios, nas regiões das folhas primárias de feijão-de-

corda tratadas com 5,0 mM de AS, foi observada pela formação do complexo

MDA-TAB. Durante o experimento, foi observado aumento de 112 % nos níveis

de MDA (13,21 ηmols g-1 MF), 2 hat, mantendo a concentração significativamente

constante (ρ < 0,01) no decorrer do tempo (Figura 5.5).

Figura 5.3 – Detalhe do acúmulo de H2O2 em folhas primárias destacadas de

feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, visualizado através da

polimerização de DAB, depois de tratadas com: (A) - H2O, 2 horas após

tratamento (hat); (B) - H2O, 12 hat; (C) – 5,0 mM de ácido salicílico (AS), 2 hat; e

(D) – 5,0 mM de AS, 12 hat. Zonas de coloração vermelho-amarronzado

representam regiões onde houve acúmulo de H2O2 (setas vermelhas).

Figura 5.4 – Análise da presença de H2O2 em folhas primárias de feijão-de-corda

[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, visualizado através da polimerização

de DAB. (A) - Folhas primárias íntegras sem DAB, 2 horas após a coleta; (B) -

Folhas primárias íntegras sem DAB, 12 horas após a coleta; (C) - Folhas

primárias íntegras tratadas com DAB, 2 horas após a coleta; (D) - Folhas

primárias íntegras tratadas com DAB, 12 horas após a coleta; (E) - Folhas

primárias mostrando lesões provocadas pela seringa (setas pretas), tratadas com

DAB, 2 horas após lesão; (F) - Folhas primárias mostrando lesões com seringa,

tratadas com DAB, 12 horas após lesão.

Figura 5.5 – Concentrações de Malonaldeído (MDA) em folhas primárias de feijão-

de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas em diferentes

tempos, após tratamentos com H2O e 5,0 mM de ácido salicílico (AS). As barras

verticais sobre as colunas representam o desvio padrão das médias obtidas.

Letras diferentes denotam que houve diferenças significativas entre as médias de

acordo com o teste de Tukey (ρ ≤ 0,01). Letras minúsculas representam

comparações entre as médias dos diferentes tratamentos em cada tempo

especificado. Letras maiúsculas, comparações entre as médias de um mesmo

tratamento ao longo do período experimental.

5.2.2. Análises Macroscópicas

Análises macroscópicas foram realizadas em folhas primárias tratadas com

5,0 mM de AS para avaliação do desenvolvimento de sintomas e de lesões

necróticas relacionadas ao tratamento com o ácido, bem como avaliar o modo de

interação do fungo C. gloeosporioides com o feijão-de-corda. Com isso, o

experimento foi conduzido com o intuito de testar o papel do H2O2 nesta interação

e analisar se este composto confere, ou não, ao feijão-de-corda resistência ao

fungo. As folhas foram avaliadas quanto ao número e intensidade das lesões

necróticas, como também, quanto ao crescimento fúngico em relação à formação

de micélio na superfície destas folhas. Folhas tratadas com H2O serviram como

controle.

As folhas primárias tratadas com AS não apresentaram lesões necróticas

nas primeiras 12 horas após inoculação (hai) (Figura 5.6 A), à semelhança das

folhas controles tratadas com H2O (Figura 5.7 A). Porém, necroses foram

observadas 24 hai (Figura 5.6 B), em contraste ao grupo controle que só

manifestou esse sintoma 48 hai (Figura 5.7 C e D). A colonização feita pelo fungo

foi caracterizada pelo intenso aumento das lesões e pela proeminente

propagação micelial (Figura 5.6 C-F). Entretanto, no grupo controle, as necroses

permaneceram pequenas e confinadas na região do inóculo (Figura 5.7 C-F).

Figura 5.6 – Detalhe de folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)

Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0 mM de ácido salicílico (AS) e

inoculadas com esporos de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50

µL de uma suspensão de 2 x 105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região

infiltrada do lado direito da nervura central. A deposição de água no lado

esquerdo da folha serviu como controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após

inoculação (hai); (B) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 24 hai

(setas pretas); (C) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 48 hai

(setas pretas); (D) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região

abaxial foliar, 48 hai (seta vermelha); (E) – Detalhe de lesões necróticas na região

adaxial foliar, 72 hai (seta preta); (F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do

fungo na região abaxial foliar, 72 hai (seta vermelha).


Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com H2O e inoculadas com esporos de C.

gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50 µL de uma suspensão de 2 x

105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região infiltrada do lado direito da

nervura central. A deposição de água no lado esquerdo da folha serviu como

controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas inoculação (hai); (B) – Região

adaxial foliar, 24 hai; (C) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar,

48 hai (seta preta); (D) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região

abaxial foliar, 48 hai (seta vermelha); (E) – Detalhe de lesões necróticas na região

adaxial foliar, 72 hai (seta preta); (F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do

fungo na região abaxial foliar, 72 hai (seta vermelha).

5.2.3. Análises Microscópicas

Para acompanhar as etapas do desenvolvimento e colonização do fungo C.

gloeosporioides nas folhas primárias de feijão-de-corda tratadas com 5,0 mM de

ácido salicílico (AS), foram realizadas análises através de microscopia de luz.

Para este experimento, folhas primárias tratadas com H2O serviram como

controle. Dessa maneira, o estudo foi dirigido com o propósito de analisar o papel

do H2O2 nesta interação e examinar se este composto está relacionado com a

susceptibilidade do feijão-de-corda ao fungo C. gloeosporioides.

Após inoculação em folhas tratadas com AS, conídios asseptados e

uninucleados com, aproximadamente, 5 µm de comprimento, aderiram à cutícula

e realizaram mitose. Neste processo, houve formação de um novo núcleo que se

localizou do lado oposto daquele que lhe deu origem, sendo separado por um

septo. Os conídios binucleados e septados (12 µm) germinaram e formaram

longos tubos germinativos (Figura 5.8 A), 12 hai, diferindo dos curtos tubos

germinativos em plantas do grupo controle (Figura 5.8 B). Esta estrutura adquiriu

aspecto intumescido formando, então, apressórios (5 – 8 µm) que não se

tornaram, porém, melanizados (Figura 5.8 C). Estes resultados diferiram do grupo

controle, já que os apressórios apresentaram-se melanizados (Figura 5.8 B e D).

Em seguida, o fungo penetrou na planta através dos estômatos, 24 hai (Figura 5.8

E). Embora o fungo tenha desenvolvido apressórios, mas não-melanizados, não

ficou evidenciado o processo de infecção da planta através do uso desta

estrutura, ou seja, de modo direto. Porém, no grupo controle, a penetração direta

foi consistentemente observada, caracterizando-se pela presença da hifa (peg) de

penetração, que emergiu da base do apressório, 48 hai (Figura 5.8 D). Após

penetração nas folhas do grupo controle, o fungo desenvolveu estratégia

hemibiotrófica de infecção, com formação de vesículas de infecção biotrófica em

formato globular (13 – 30 µm de diâmetro) (Figura 5.9 A, B e C), 48 hai. O

processo de infecção foi seguido pela emissão de brotos pela vesícula (Figura 5.9

A e B), que se estenderam para formar as hifas primárias (Figura 5.9 D). Estas

hifas apresentaram comprimento variado e diâmetro de, aproximadamente, 5 µm.

Estas estruturas apresentam a capacidade de se desenvolver intracelularmente e

infectar células vizinhas, produzindo lesões nas superfícies de folhas infectadas.

72 hai, hifas secundárias necrotróficas, com formato cilíndrico e filamentoso,

foram observadas (Figura 5.10 A, B e C). Estas hifas variaram muito em

comprimento, assim como em diâmetro (1,5 – 2,5 µm), sendo este muito menor

em relação às hifas primárias. Assim, o sucesso do processo de colonização ficou

patente pela observação da emissão de vários acérvulos, seguidas pela produção

de novos esporos. Os acérvulos são estruturas de reprodução assexuada do

fungo proveniente da formação da aglomeração de hifas na epiderme (Figura 5.10

D, E e F).

Em contraste, em folhas tratadas com AS, não foram observadas vesículas

globulares biotróficas nem hifas primárias, 24 hai. Porém, hifas secundárias

necrotróficas foram emitidas após infecção, sugerindo que, o fungo infectou o

tecido utilizando uma estratégia subcuticular, intramural necrotrófica (Figura 5.11

A). Este modo de infecção foi caracterizado pela rápida difusão de hifas

secundárias e intenso dano de membrana. Dessa forma, 48 hai, vários acérvulos

foram observados (Figura 5.11 B), aumentando de tamanho entre 48 e 72 hai

(Figura 5.11 C). Em seguida, a formação destas estruturas foi acompanhada por

uma intensa propagação de novos conídios (Figura 5.11 D).

Figura 5.8 – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de

feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, observado por

microscopia de luz. (A): Detalhe da germinação de conídios (c) mostrando o

desenvolvimento do tubo germinativo (TG) próximo à região estomática (e) em

folhas destacadas tratadas com 5,0 mM de ácido salicílico (AS), 12 horas após

inoculação (hai); (B): Detalhe da germinação de conídios (c) e do processo de

melanização de apressório (Ap1, Ap2 e Ap3) em folhas tratadas com H2O, 12 hai,

próximo a um estômato (e); (C): Detalhe de tubo germinativo e apressórios não-

melanizados (Ap) em folhas tratadas com AS, 24 hai; (D): Detalhe do apressório

com o poro de penetração em folhas tratadas com H2O, 48 hai; (E): Detalhe de

penetração de tubo germinativo em estômato, em folhas tratadas com AS, 24 hai.

Coloração feita com lactofenol azul de anilina (A , B, C e E) ou calcoflúor e azul de

Evans (D).


feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, tratadas com H2O,

observado por microscopia de luz. (A) – (C): Detalhe de conídio (c), tubo

germinativo (TG) apressório (Ap), vesícula de infecção (Ve) e emissão de brotos

(b), 48 hai; (D): Detalhe da formação e aglomeração de hifas primárias (hp), 48

hai. Coloração feita com lactofenol azul de anilina (D) ou calcoflúor e azul de

Evans (A – C). No quadro B, a visualização foi feita por fluorescência.

Figura 5.10. – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de

feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, tratadas com H2O,

observado por microscopia de luz. (A) – (C): Detalhe de conídio (c) e formação de

apressório (Ap), vesículas de infecção (Ve), hifas primárias (HP) e hifas

secundárias (HS), 72 hai; (D) e (E): Detalhe da formação de vesículas de

infecção, hifas primárias e desenvolvimento de acérvulo (Ac) com produção de

conídios (c), 72 hai; (F): Detalhe de acérvulos (Ac), 72 hai. Coloração feita com

lactofenol azul de anilina.

Figura 5.11. – Desenvolvimento do fungo C. gloeosporioides nas folhas primárias

de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, tratadas com 5,0

mM de ácido salicílico (AS), observado por microscopia de luz. (A): Formação de

hifas secundárias (HS), 24 hai; (B): Detalhe da formação de aglomerados de hifas

secundárias (HS) e de acérvulos (Ac), 48 hai; (C): Desenvolvimento de grandes

acérvulos, 72 hai; (D): Detalhe da propagação de novos conídios, 72 hai. Cmit –

Conídio em fase mitótica com desenvolvimento de apressório não-melanizado

(Cmit). Coloração feita com lactofenol azul de anilina.

5.3. Tratamento com Oxidase da Glucose (GO) + Glucose (G)

5.3.1. Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e Peroxidação de

Lipídios

Inicialmente, folhas primárias destacadas do feijão-de-corda foram

infiltradas com tampão fosfato de sódio nas concentrações de 10; 25 e 50 mM, pH

6,5, para avaliar que concentração seria ideal para a dissolução da enzima GO,

sem interferir no nível basal de H2O2. Esta análise quantitativa não mostrou haver

diferenças significativas (ρ ≥ 0,01) dos teores de H2O2 por ação do tampão (Figura

5.12).

Escolhida a concentração do tampão fosfato, 50 mM, folhas primárias

foram infiltradas com GO nas concentrações de 50; 100 e 200 U mL-1 + 2,0 mM

de glucose (G) com o intuito de averiguar qual seria a concentração da enzima

que promoveria elevação suave do teor de H2O2. O acúmulo de H2O2 chegou a

níveis de até 22 % (144,96 ηmoles g-1 MF) maiores que o grupo controle, nas

folhas tratadas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, 2 hat (Figura 5.12). Em

seguida, nos tempos de 12 e 24 hai, os teores de H2O2 em folhas tratadas com

200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G diminuíram cerca de 53 % em relação ao tempo

de 2 horas (Figura 5.12).

A análise qualitativa dos teores de H2O2, usando o método de infiltração de

DAB, mostrou formação de manchas levemente escuras, indicando a

polimerização de DAB na região infiltrada, 2 hat (Figura 5.13). Estes resultados

corroboram com as análises quantitativas, visto que, 2 hat houve maior acúmulo

de H2O2 na região infiltrada.

Figura 5.12 – Teores de H2O2 em folhas primárias de feijão-de-corda [V.

unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas em diferentes tempos, após

tratamentos com tampão fosfato e com diferentes concentrações de GO + 2,0 mM

de G. Valores basais de H2O2 em plantas que não receberam tratamento nenhum

são, também, apresentados. As barras verticais sobre as colunas representam o

desvio padrão das médias obtidas. Letras diferentes denotam que houve

diferenças significativas entre as médias de acordo com o teste de Tukey (ρ ≤

0,01). Letras minúsculas representam comparações entre as médias dos



experimental.

Ab

Aa

Aa

Ab

Aa

Aa

Ab

Aa

Aa

Ab

Aa

Aa

Ab

Aa

Aa

Ab

Bb

Bb

Aa

Bb

Bb

0

50

100

150

200

2 12 24

Tempo (h)

H2O

2 (nm

ol g

-1 M

F)

Sem TratamentoTampão 10,0 mMTampão 25,0 mMTampão 50,0 mM50 U de GO + 2,0 mM de G100 U de GO + 2,0 mM de G200 U de GO + 2,0 mM de G

Figura 5.13 – Detalhe do acúmulo de H2O2 através da visualização da

polimerização de DAB em folhas primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.)

Walp.], genótipo BR-3, após tratamento com: (A) – Tampão fosfato 50 mM, pH

6,5, 2 horas após tratamento (hat); (B) – Tampão fosfato 50 mM, pH 6,5, 12 hat;

(C) – 200,0 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G, 2 hat; (D) – 200 U mL-1 de GO + 2,0

mM de G, 12 hat. Zonas de coloração vermelho-amarronzado representam

regiões onde houve acúmulo de H2O2 (setas vermelhas).

A peroxidação de lipídios nas regiões tratadas com 200,0 U mL-1 de GO +

2,0 mM de G em folhas primárias de feijão-de-corda foi observada pela formação

do complexo MDA-TAB. Durante o experimento, foi observado aumento de 36 %

nos níveis de MDA (8,6 ηmols g-1 MF), 2 hat, mantendo concentração

significativamente constante (ρ < 0,01) no decorrer do tempo (Figura 5.14).

5.3.2. Análises Macroscópicas

À semelhança do tratamento das folhas primárias de feijão-de-corda com

AS, o experimento usando 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G foi conduzido para

testar o papel do H2O2 na interação entre feijão-de-corda e o fungo C.

gloeosporioides. O objetivo foi analisar se o aumento dos teores de H2O2 na

planta confere, ou não, resistência do feijão-de-corda ao fungo. As folhas foram

avaliadas da mesma forma que no experimento anterior.

As análises macroscópicas das folhas primárias de BR-3 tratadas com 200

U mL-1 de GO + 2,0 mM de G e inoculadas com esporos do fungo C.

gloeosporioides revelaram lesões necróticas, logo em 24 hai (Figura 5.15 A e B).

Durante este mesmo intervalo de tempo, folhas do grupo controle não

desenvolveram necroses, ao passo que, este sintoma só foi observado 48 hai

(Figura 5.16 A-D). Assim, como no tratamento com AS, o exame macroscópico de

folhas tratadas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G revelou rápida propagação

e intenso desenvolvimento micelial do fungo (Figura 5.15 C-E). Entretanto, folhas

tratadas apenas com tampão fosfato apresentaram apenas necroses de pequena

extensão e com pouco desenvolvimento de micélio (Figura 5.16).

Figura 5.14 – Concentrações de Malonaldeído (MDA) de extratos de folhas

primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, coletadas

em diferentes tempos após tratamentos com tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5 e

200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G. As barras verticais sobre as colunas

representam o desvio padrão das médias obtidas em diferentes experimentos.

Letras minúsculas representam comparação das médias dos tratamentos em

cada tempo especificado. Letras maiúsculas representam comparação das

médias de cada tratamento ao longo do período experimental. Letras diferentes

denotam que houve diferenças significativas entre as médias de acordo com o

teste de Tukey (ρ < 0,01).


Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G e





inoculação (hai); (B) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 24 hai

(setas pretas); (C) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 48 hai

(setas pretas); (D) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região

abaxial foliar, 48 hai (setas vermelhas); (E) – Detalhe de lesões necróticas na

região adaxial foliar, 72 hai (setas pretas); (F) – Detalhe do desenvolvimento

micelial do fungo na região abaxial foliar, 72 hai (setas vermelhas).


Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com tampa fosfato 50,0 mM, pH 6,5 e





inoculação (hai); (B) – Região adaxial foliar, 24 hai; (C) – Detalhe de lesões

necróticas na região adaxial foliar, 48 hai (seta preta); (D) – Detalhe do

desenvolvimento micelial do fungo na região abaxial foliar, 48 hai (seta vermelha);

(E) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 72 hai (setas pretas);

(F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região abaxial foliar, 72 hai

(seta vermelha).


As etapas do desenvolvimento e colonização do fungo C. gloeosporioides

nas folhas primárias de feijão-de-corda, tratadas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM

de G, foram acompanhadas através de microscopia de luz. Para este

experimento, folhas primárias tratadas com tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5,

serviram como controle. Dessa maneira, como já mencionado, o estudo foi

conduzido com o propósito de analisar o papel do H2O2 na interação entre feijão-

de-corda e C. gloeosporioides e examinar se este composto está relacionado com

a susceptibilidade do feijão-de-corda ao fungo C. gloeosporioides, agora, através

de observações microscópicas.

O processo infeccioso foi iniciado com a etapa de adesão dos conídios à

superfície do hospedeiro, como observado nos tratamentos anteriores. Não foram

observadas diferenças morfológicas nem na cronologia de desenvolvimento das

estruturas do fungo entre folhas tratadas com tampão fosfato e H2O. Entretanto,

folhas primárias tratadas com 200 U mL-1 de GO + 2,0 mM de G apresentaram, no

tempo de 12 hai, emissão de apressórios não-melanizados que, posteriormente,

tornaram-se melanizados (Figura 5.17 A e B). Nas primeiras 24 hai, o fungo

infectou células hospedeiras utilizando estratégia subcuticular, intramural

necrotrófica. Neste processo, não houve emissão de vesículas de infecção nem

de hifas primárias, caracterizando a não existência da fase biotrófica. A

progressão do crescimento do fungo ocorreu através da emissão de hifas

secundárias necrotróficas estreitas, que se alojaram em células epidérmicas.

Posteriormente, estas hifas se ramificaram e se espalharam para invadir tecidos

vizinhos (Figura 5.17 C). O sucesso do processo de colonização foi evidenciado

pela emissão de vários acérvulos, 48 hai (Figura 5.17 D). Estas estruturas de

disseminação se tornaram mais robustas 72 hai (Figura 5.17 E) e foram

acompanhadas por intensa produção de conídios jovens (Figura 5.17 F).

Figura 5.17. – Desenvolvimento do C. gloeosporioides nas folhas primárias de

feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 200 U

mL-1 de GO + 2,0 mM de G, observado por microscopia de luz. (A) e (B): Detalhe

da germinação de conídio (c) formando tubo germinativo (TG) e apressório (Ap)

12 e 24 hai, respectivamente; (C): Formação de hifas secundárias (HS), 24 hai;

(D): Formação de acérvulos (Ac) e hifas secundárias (HS), 48 hai; (E):

Desenvolvimento de grandes acérvulos, 72 hai; (F): Detalhe da produção de

novos conídios e da formação de novos apressórios, 72 hai. Coloração feita com

lactofenol azul de anilina.

5.4 Tratamento com CAT

5.4.1 Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e Peroxidação de

Lipídios

Com o propósito de diminuir os teores de H2O2, folhas primárias foram

infiltradas com solução de CAT nas concentrações de 500; 1000 e 2000 U mL-1.

As enzimas foram dissolvidas em tampão fosfato de sódio 50,0 mM, pH 6,5,

devido à não intervenção deste tampão nos níveis de H2O2. Dessa forma, esse

experimento foi conduzido para saber que concentração de CAT diminuiria mais

proeminentemente os teores deste composto. Assim, esta solução de

concentração escolhida seria utilizada para os experimentos posteriores.

Todas as soluções de CAT apresentaram diminuição nos teores de H2O2, 2

hat. A solução de 2000 U mL-1 de CAT foi a que reduziu mais os teores de H2O2,

chegando a 46,36 % (55,5 ηmoles g-1 MF) menos do que o controle (119,7

ηmoles g-1 MF) (Figura 5.18). Nos demais tempos examinados, os teores de H2O2

aumentaram e atingiram níveis 86,6 % mais elevados, 24 hai, em comparação ao

tempo de 2 horas (Figura 5.18), mas, mesmo assim, ainda permaneceram abaixo

dos níveis das plantas controles.

A presença de H2O2 também foi detectada por análise quantitativa usando

o método de infiltração de DAB. Durante o experimento, não foram observadas

manchas escuras na região infiltrada (Figura 5.19) que denunciassem a presença

excessiva de H2O2. Dessa forma, estes resultados sugerem que os teores de

H2O2 foram mantidos baixos, corroborando, assim, com os resultados

quantitativos.

Além disso, foi observada, em folhas tratadas com CAT, diminuição de

38,66 % nos níveis de MDA (3,87 ηmols g-1 MF), 2 hat. Estes resultados indicam

diminuição de peroxidação de lipídios nos tecidos infiltrados. Entretanto, os teores

de MDA chegaram a níveis similares ao do controle, 24 hat (Figura 5.20).

5.4.2 Análises Macroscópicas

As análises macroscópicas foram conduzidas para testar o papel do H2O2

na interação entre o feijão-de-corda e o fungo C. gloeosporioides, a fim de

analisar se a diminuição de seus teores na planta confere, ou não, resistência do

feijão-de-corda ao fungo. As folhas foram avaliadas da mesma forma que nos

experimentos anteriores.

Folhas primárias tratadas com CAT 2000 U mL-1 e inoculadas com

suspensão de esporos do fungo C. gloeosporioides apresentaram lesões

necróticas (Figura 5.21 A e B), 24 hai, diferenciando, assim, do grupo controle,

que desenvolveu necroses somente 48 hai (Figura 5.16). Da mesma forma que os

tratamentos com AS e GO, folhas tratadas com CAT desenvolveram lesões mais

extensas e com desenvolvimento micelial mais destacado do que os controles

(Figura 5.21 C-D).

Figura 5.18 – Teores de H2O2 em folhas primárias destacadas de feijão-de-corda

[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas em diferentes tempos após

tratamentos com tampão fosfato e com soluções de diferentes concentrações de

CAT. Valores basais de H2O2 em plantas que não receberam tratamento nenhum

são, também, apresentados. As barras verticais sobre as colunas representam o






experimental.

Aab

Aab

Aa

Aab

Aab

Aa

Aa

Aab

Aa

Aa

Aab

AabB

b

Aa A

abBbc

Aab A

b

Cc

Bb

Ab

0

50

100

150

200

2 12 24Tempo (h)

H2O

2 (n

mol g

-1 M

F)

Sem TratamentoTampão 10,0 mMTampão 25,0 mMTampão 50,0 mM500 U de CAT1000 U de CAT2000 U de CAT


[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após tratamento com 2000 U mL-1 de

CAT, através da visualização da polimerização de DAB. (A) e (B) representam

folhas 2 e 12 horas após tratamento, respectivamente.

Figura 5.20 – Concentrações de Malonaldeído (MDA) em folhas primárias de

feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas em

diferentes tempos após tratamento com tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5, e 2000

U mL-1 de CAT. As barras verticais sobre as colunas representam o desvio padrão

das médias obtidas. Letras diferentes denotam que houve diferenças significativas

entre as médias de acordo com o teste de Tukey (ρ ≤ 0,01). Letras minúsculas

representam comparações entre as médias dos diferentes tratamentos em cada

tempo especificado. Letras maiúsculas, comparações entre as médias de um

mesmo tratamento ao longo do período experimental.


Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 2000 U mL-1 de CAT e inoculadas com

esporos de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50 µL de uma

suspensão de 2 x 105 esporos mL-1 foram depositadas sobre a região infiltrada do

lado direito da nervura central. A deposição de água no lado esquerdo da folha

serviu como controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após inoculação (hai);

(B) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 24 hai (setas pretas);

(C) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 48 hai (setas pretas);

(D) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região abaxial foliar, 48 hai

(setas vermelhas); (E) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 72

hai (setas pretas); (F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região

abaxial foliar, 72 hai (seta vermelha).


Análises microscópicas de folhas tratadas com 2000 U mL-1 de CAT

mostraram diferenças nos primeiros estágios de desenvolvimento do fungo em

relação ao grupo controle. Assim, após 12 horas de inoculação (hai), conídios

binucleados desenvolveram tubos germinativos e apressórios. Uma característica

peculiar decorrente deste tratamento foi o desenvolvimento de múltiplos tubos

germinativos e apressórios por um mesmo conídio (Figura 5.22 A).

A penetração nas células epidérmicas pelo fungo foi observada pela

emissão da hifa de penetração, 24 hai. Este processo foi imediatamente seguido

pela formação de várias vesículas biotróficas globulares (Figura 5.22 B),

indicando que o fungo desenvolveu estratégia de infecção hemibiotrófica. Estas

vesículas emitiram brotos que se desenvolveram em hifas primárias filamentosas

de grande diâmetro (Figura 5.22 C). Além disso, foi observado o aparecimento de

massas de hifas em forma de nó na região estomática, indicando a formação de

acérvulo (Figura 5.22 D). Posteriormente, 48 hai, o processo de colonização

prosseguiu com o desenvolvimento de hifas secundárias, seguidas pela formação

de vários acérvulos e propagação de novos conídios (Figura 5.22 E). O progresso

da infecção se tornou mais expressivos 72 hai, quando novas infecções

autóctones foram observadas (Figura 5.22 F).


feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 2000 U

mL-1 de CAT, observado por microscopia de luz. (A): Detalhe de conídio (c)

formando tubo germinativo (TG) e apressório (Ap), 12 hai; (B) – (D): Formação de

vesículas de infecção (Ve), hifas primárias (HP) e acérvulo (Ac) na região

estomática (e), 24 hai; (E): Detalhe da formação de acérvulo e da maturação

gradual de conídios (c1, c2, c3 e c4), 48 hai; (F): Propagação de conídios e

formação de apressório, 72 hai. Coloração feita com lactofenol azul de anilina (A,

B, D, E e F) ou azul de Evans (C).

5.5 Tratamento com Cloreto de Difenilenoiodônio (DPI)

5.5.1 Determinação dos Teores de Peróxido de Hidrogênio e Peroxidação de

Lipídios

Para preparação da solução de DPI a ser infiltrada nas folhas de feijão-de-

corda, este composto, que é inibidor de NAD(P)H oxidase e, portanto, da

produção de ROS, foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO). Portanto, para

determinação da concentração ideal de DMSO suficiente para dissolução do DPI,

mas sem interferir nos níveis de H2O2 das folhas, DMSO foi infiltrado nas

concentrações de 0,010, 0,025 e 0,050 % (v/v). Estabelecida a concentração

operacional de DMSO (0,05%), folhas primárias foram infiltradas com DPI nas

concentrações de 1,0; 2,5 e 5,0 µM com o intuito de estabelecer qual seria a

concentração que promoveria maior diminuição dos teores de H2O2.

Assim, a análise quantitativa dos teores de H2O2 nas folhas primárias de

feijão-de-corda tratadas com soluções de diferentes concentrações de DMSO não

mostrou diferenças significativas (ρ ≥ 0,01) entre elas. Dessa forma, a solução de

maior concentração, 0,050 %, foi utilizada para dissolver DPI (Figura 5.23 ).

De acordo com a Figura 5.23, os teores de H2O2 somente foram reduzidos

quando foi utilizado DPI na concentração de 5,0 µM. Nesta concentração, as

folhas primárias apresentaram teor de H2O2 54,14 % menor (56,44 ηmoles g-1

MF) do que o grupo controle (123,03 ηmoles g-1 MF), tendo permanecido

constante seu nível no decorrer do experimento. Da mesma forma que o

tratamento com CAT, a análise qualitativa de H2O2 não mostrou manchas escuras

na região infiltrada. Estes resultados indicam a redução dos teores de H2O2,

corroborando com as análises quantitativas (Figura 5.24).

A peroxidação de lipídios nas regiões tratadas com 5,0 µM de DPI em

folhas primárias de feijão-de-corda foi observada pela formação do complexo

MDA-TAB. Durante o experimento foi observado redução de 51,2 % nos níveis de

MDA (3,56 ηmols g-1 MF), 2 hat, mantendo a concentração significativamente

constante (ρ ≤ 0,01) no decorrer do tempo (Figura 5.25).

5.5.2 Análises Macroscópicas

As análises macroscópicas de folhas primárias tratadas com 5,0 µM de DPI

foram conduzidas com o mesmo objetivo do tratamento com CAT. As folhas foram

avaliadas da mesma forma que os experimentos anteriores.

O exame macroscópico das folhas primárias tratadas com 5,0 µM de DPI

apresentou ausência de lesões necróticas nas primeiras 2 horas após inóculo

(hai) (Figura 5.26 A). Durante este mesmo intervalo de tempo, folhas do grupo

controle também não apresentaram necroses (Figura 5.27 A). No entanto, 24 hai,

folhas tratadas com DPI desenvolveram lesões (Figura 5.26 B). Este mesmo

sintoma somente foi observado 48 hai, no grupo controle (Figura 5.27 C). Assim

como nos outros tratamentos (AS, GO e CAT), as necroses cresceram e

expandiram-se, sendo acompanhadas por um intenso desenvolvimento micelial

(Figura 5.26 C-E e 5.27 C-E).

Figura 5.23 – Teores de H2O2 em extratos de folhas primárias de feijão-de-corda

[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas em diferentes tempos após

tratamento com soluções de diferentes concentrações de DMSO e de DPI.

Valores basais de H2O2 em plantas que não receberam tratamento nenhum são,

também, apresentados. As barras verticais sobre as colunas representam o






experimental.


[V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, após tratamento com 0,050% (v/v) de

DMSO, 2 (A) e 12 (B) horas após tratamento (hat) e 5,0 µM de DPI, 2 hat (C) e 12

hat (D), através da visualização da polimerização de DAB.

Figura 5.25 – Concentrações de malonaldeído (MDA) de extratos de folhas

primárias de feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, analisadas

em diferentes tempos após tratamentos com 0,050 % (v/v) de DMSO e 5,0 µM de

DPI. As barras verticais sobre as colunas representam o desvio padrão das

médias obtidas. Letras diferentes denotam que houve diferenças significativas

entre as médias de acordo com o teste de Tukey (ρ ≤ 0,01). Letras minúsculas

representam comparações entre as médias dos diferentes tratamentos em cada

tempo especificado. Letras maiúsculas, comparações entre as médias de um

mesmo tratamento ao longo do período experimental.

Aa

Aa

Aa

AbA

b

Ab

0

10

20

2 12 24

Tempo (h)

nm

ol/g

MF

0,050 % de DMSO

5,0 uM de DPI


Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0 µM de DPI e inoculadas com esporos

de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50 µL de uma suspensão

de 2 x 105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região infiltrada do lado direito

da nervura central. A deposição de água no lado esquerdo da folha serviu como

controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após inoculação (hai); (B) – Detalhe

de lesões necróticas na região adaxial foliar, 24 hai (setas pretas); (C) – Detalhe

de lesões necróticas na região adaxial foliar, 48 hai (setas pretas); (D) – Detalhe

da região abaxial foliar, 48 hai (setas vermelhas); (E) – Detalhe de lesões

necróticas na região adaxial foliar, 72 hai (setas pretas); (F) – Detalhe do

desenvolvimento micelial do fungo na região abaxial foliar, 72 hai (setas

vermelhas).


Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 0,050 % (v/v) de DMSO e inoculadas com

esporos de C. gloeosporioides. Neste experimento, 2 gotas de 50 µL de uma

suspensão de 2 x 105 esporo mL-1 foram depositadas sobre a região infiltrada do

lado direito da nervura central. A deposição de água no lado esquerdo da folha

serviu como controle. (A) – Região adaxial foliar, 12 horas após inoculação (hai);

(B) – Região adaxial foliar, 24 hai; (C) – Detalhe de lesões necróticas na região

adaxial foliar, 48 hai (seta preta); (D) – Detalhe da região abaxial foliar, 48 hai

(setas vermelhas); (E) – Detalhe de lesões necróticas na região adaxial foliar, 72

hai (setas pretas); (F) – Detalhe do desenvolvimento micelial do fungo na região

abaxial foliar, 72 hai (seta vermelha).


O exame microscópico do desenvolvimento do fungo, em folhas tratadas

com 5,0 µM de DPI, apresentou as mesmas características do tratamento com

CAT. Da mesma forma, as características morfológicas e cronológicas do fungo e

do processo de infecção, em folhas tratadas com DMSO 0,050 %, não diferenciou

dos tratamentos com H2O e tampão fosfato.

Nas primeiras 12 horas após inóculo (hai), conídios germinaram e

desenvolveram múltiplos tubos germinativos e apressórios (Figura 5.28 A), ao

contrário de folhas do grupo controle. Posteriormente o apressório desenvolveu

hifa (peg) de penetração, que emergiu de sua base 24 hai. Neste mesmo intervalo

de tempo, vesículas globulares biotróficas foram desenvolvidas (Figura 5.28 B)

nas quais, em seguida, emitiram hifas primárias de infecção (Figura 5.28 B e C).

Entretanto, estas estruturas foram observadas somente 48 hai em folhas tratadas

com DMSO. Posteriormente, a fase necrotrófica foi iniciada a partir 48 hai com a

emissão de hifas secundárias, seguidas pela formação de vários acérvulos e

propagação de novos conídios (Figura 5.28 D-F).


feijão-de-corda [V. unguiculata (L.) Walp.], genótipo BR-3, infiltradas com 5,0 µM

de DPI, observadas por microscopia de luz. (A): Detalhe da germinação de

conídio (C) formando dois tubos germinativos (TG) e um apressório (Ap), 12 hai;

(B) – (C): Formação de vesículas de infecção (Ve) e hifa primária (HP), 24 hai;

(D): Detalhe de hifas secundárias, 48 hai; (E) – (F): Detalhe de acérvulo (Ac) e

conídios (C), 48 e 72 hai, respectivamente. Coloração feita com lactofenol azul de

anilina (A, D, E e F) ou azul de Evans (B e C).

6 - DISCUSSÃO

A classificação de fungos tem cerca de 200 anos e, atualmente, os

sistemas de classificação para Colletotrichum não são eficientes. As espécies

constituintes deste gênero são inadequadamente definidas por características

inapropriadas, pouco entendidas e freqüentemente ignoradas por muitos

fitopatologistas (ABANG et al., 2002; MARTIN E GARCIA, 1999; SHEN et al.,

2001). Para avaliação das hipóteses do presente trabalho, o fungo utilizado para

infectar o feijão-de-corda foi classificado como da espécie Colletotrichum

gloeosporioides, através da análise do agrupamento ITS-1, 5,8S, e ITS-2 do rDNA

(Figura 5.1). A análise da seqüência completa de nucleotídeos deste

agrupamento isolado mostrou 99 – 100 % de identidade com seqüências ITS de

diferentes isolados de C. gloeosporioides presentes no GenBank. Comparação

feita entre a seqüência do fungo estudado (DQ868520) e C. gloeosporioides f. sp.

aeschynomene (NIRENBERG et al., 2002) com nº de acesso AJ301986, mostrou

identidade de 99%, diferenciando apenas em duas posições do alinhamento: uma

inserção/deleção e uma mutação. Da mesma forma, quando a seqüência do

fungo foi comparada com àquelas de C. gloeosporioides isolados de Agavaceae

(DQ286203, DQ286224, DQ286202 e DQ286200), foi possível observar

identidade de até 100%. Além disso, Latunde-Dada et al. (1997) mostraram que

seqüências da região ITS-2 e D2 do rDNA de isolados de Colletotrichum

encontrados em feijão-de-corda apresentavam 97-99% de similaridade com

isolados de alfafa, podendo apresentar modos de infecção similares. Além disso,

espécies de Colletotrichum que causam infecção latente e antracnose em feijão-

de-corda apresentaram 95-96% de identidade com C. gloeosporioides isolados de

Aeschynomene virginica, Stylosanthes scabra e Mangifera indica (LATUNDE-

DADA et al., 1999).

Dessa forma, a maioria dos avanços significativos em taxonomia se deve,

em geral, a comparações de análises de seqüência de DNA (SHERRIFF et al,

1994). Assim, comparações das regiões ITS do rDNA confirmam a utilidade das

análises das seqüências ITS de Colletotrichum para a descriminação de espécies

e resolução de problemas sistemáticos com o gênero (BAILEY et al., 1996;

FREEMAN et al., 2000; LATUNDE-DADA et al., 1996, SHERRIFF et al., 1994,

SHERRIFF et al., 1995, SREENIVASAPRASAD et al., 1996).

A presença do fungo C. gloeoeporioides em monoculturas de genótipos

susceptíveis de feijão-de-corda pode proporcionar grandes problemas, pois essas

plantas não apresentam mecanismos de defesa eficientes para bloquear a

infecção causada pelo patógeno (KOMBRINK E SOMSSICH, 1995). Muitas

moléculas sinalizadoras de resistência têm sido estudadas, sendo que,

atualmente, o H2O2 vem sendo relatado como um composto muito importante no

processo de defesa vegetal (BUCKNER et al., 2000; LU e HIGGINS, 1999; NEILL

et al., 2002).

A infiltração de 5,0 mM de ácido salicílico (AS) em folhas primárias de

feijão-de-corda proporcionou aumento nos teores de H2O2 e peroxidação de

lipídios (Figura 5.2; Figura 5.3; Figura 5.5). O aumento dos níveis de H2O2 está,

geralmente, relacionado à atividade da enzima oxidase do NAD(P)H, presente na

membrana plasmática de células vegetais e de neutrófilos de mamíferos

(WOJTASZEK, 1997). Esta produção de H2O2 é realizada no sítio catalítico gp91pox

desta enzima, no qual muitas proteínas citoplasmáticas regulam sua atividade.

Assim, folhas de Nicotiana benthamiana infiltradas com AS apresentam aumento

de expressão de genes e de transcritos relacionados à síntese desta subunidade

catalítica, responsável por elevar os níveis de H2O2 (YOSHIOKA et al., 2003).

Além disso, o aumento de AS nas plantas causa inibição de CAT e APX, enzimas

responsáveis pela degradação de H2O2 (APEL e HIRT, 2004).

As análises macroscópicas e microscópicas de folhas tratadas com 5,0 mM

de AS mostraram indiretamente que o fungo infecta a planta, utilizando, assim, os

estômatos como porta de entrada (Figura 5.8 E). Inicialmente, antes da infecção,

os conídios desenvolveram longos tubos germinativos e apressórios não-

melanizados (Figura 5.8 A e C). Alguns trabalhos mostram que a comunicação

molecular começa logo quando o conídio adere à superfície do tecido vegetal

(BRAUN e HOWARD, 1994; VIRET et al., 1994). Estudos realizados com C.

gloeosporioides mostram que ácidos graxos presentes na camada de cera das

células vegetais são importantes neste processo de adesão e,

conseqüentemente, no desenvolvimento do fungo sobre a superfície do tecido.

Além disso, a camada de cera contém alguns componentes lipídicos que

estimulam e outros que inibem a formação de apressório (PODILA et al., 1993;

PRUSKY et al., 2000). Assim, de acordo com Ali et al. (2005) o aumento da

concentração de MDA indica peroxidação de lipídios nas regiões onde ocorreu

acúmulo de H2O2. Dessa forma, é sugerido que o acúmulo de H2O2 efetuou

modificações estruturais em lipídios que estão relacionados à formação e ao

desenvolvimento normal do apressório Embora o apressório tenha sido

desenvolvido, a melanização não aconteceu (Figura 5.8 C). Assim como

observado em nosso trabalho, a emissão de longos tubos germinativos e

apressório não-melanizados também pode ser observada em mutantes

deficientes em melanina (CHUMLEY e VALENT, 1990). Neste caso, mutantes que

não expressam os genes PKS1, SCD1 e THR1 não são capazes de sintetizar

melanina e, portanto, não desenvolve o processo de melanização.

Embora folhas infiltradas com 200 U mL-1 de oxidase da glucose + 2,0 mM

de Glucose tenham apresentado aumento nos teores de H2O2 (Figura 5.12), o

mecanismo de alteração da concentração de H2O2 é diferente do tratamento com

5,0 mM de AS. Oxidase da glucose hidrolisa D-glucose a D-glucono-1,5-lactona,

liberando H2O2, numa reação dependente de O2 (MEGAZYME, 2007). Plantas

transgênicas do gênero Arabidopsis infiltradas com 2,5 U mL-1 de glucose oxidase

+ 2,5 mM de glucose apresentaram aumento na produção de H2O2 na região

infiltrada, bem como em regiões infectadas com Pseudomonas syringae pv.

Tomato (GRANT et al., 2000).

No presente trabalho, folhas tratadas com 200 U mL-1 de glucose oxidase +

2,0 mM de glucose não apresentaram mudanças marcantes nas fases iniciais do

desenvolvimento do fungo (Figura 5.17). O fungo penetrou nas células

hospedeiras e desenvolveu estratégia de infecção subcuticular, intramural

necrotrófica, 24 hai (Figura 5.17), desenvolvendo, então, uma vigorosa formação

de acérvulos (Figura 5.17 D e E). Trabalhos mostram que as fases iniciais do

desenvolvimento do fungo são, essencialmente, as mesmas para todas as

espécies de Colletotrichum (MORIN et al, 2000). Durante este processo o conídio

adere à cutícula e germina para produzir o tubo germinativo que, ao longo do

processo, se diferencia em apressório melanizado. Em seguida, uma estreita hifa

de penetração emerge da base do apressório e, posteriormente, penetra

diretamente na cutícula (Van der BRUGGEN e MARAITE, 2000). Como

demonstrado em outros trabalhos, seguindo a penetração da cutícula, este

patógeno não entra imediatamente no lúmen da célula, mas se desenvolve abaixo

da cutícula, dentro das paredes periclinais e anticlinais das células epidérmicas

(PRING et al., 1995). Esta estratégia é marcada por uma difusão rápida pelas

regiões intra e intercelular, causando morte da célula e dissolução das paredes

celulares durante o processo de infecção (PRUSKY et al., 2000).

Os resultados das análises microscópicas das folhas tratadas com 5,0 mM

de AS ou 200 U mL-1 de glucose oxidase + 2 mM de Glucose indicaram relação

do H2O2 na mudança da estratégia de infecção do fungo (Figuras 5.8, 5.11 e

5.17). Muitos trabalhos mostraram a participação do H2O2 na fortificação e

modificação da parede celular vegetal através da formação de ligações cruzadas

de proteínas ricas em hidroxiprolina (HRGPs) e proteínas ricas em prolina (PRPs)

(BRISSON et al., 1994; BUCHANAN et al., 2000; ILYAMA et al., 1994; LEVINE et

al., 1994; SHOWALTER et al., 1985; TENHAKEN et al., 1995). Diante deste

quadro, é possível sugerir que, no presente trabalho, durante a infecção em folhas

de feijão-de-corda, genótipo BR-3, tratadas com 5,0 mM de ácido salicílico ou

200,0 U mL-1 de glucose oxidase + 2,0 mM de glucose, o fungo C. gloeosporioides

(Isolado LPVD II) penetrou na cutícula da célula hospedeira, mas não foi capaz de

perfurar a parede celular devido sua fortificação. Diante destas alterações

estruturais da parede celular vegetal, o fungo, então, desenvolveu estruturas mais

adaptadas às condições adversas, que foram as hifas secundárias (Figura 5.11 A;

Figura 5.17 C), realizando, assim, infecção subcuticular, intramural necrotrófica.

Na folha controle, sem tratamento com ácido salicílco ou glucose oxidase +

glucose, o modo de infecção foi do tipo hemibiotrófico que abrange duas fases

que se alternam entre si, a biotrófica e a necrotrófica, nas quais o fungo progride

em seu desenvolvimento se alimentando de células vivas e, depois, de células

mortas do hospedeiro, respectivamente (Figura 5.9; Figura 5.10).

Em adição aos resultados das folhas tratadas com ácido salicílico e

glucose oxidase + glucose, não pode ser descartada a participação do H2O2 na

formação de ligações cruzadas na parede celular do fungo. Trabalhos mostram

que, durante a fase biotrófica de certas espécies de Colletotrichum que realizam a

estratégia hemibiotrófica, vesículas de infecção e hifas primárias são circundadas

por uma matriz que separa a parede celular do fungo da membrana plasmática da

célula hospedeira (PRUSKY et al., 2000). Recentemente, uma glicoproteína

fúngica rica em prolina e hidroxiprolina, CHI 1, foi identificada associada a esta

matriz (PAIN et al., 1994; PERFECT et al., 1998 e 2001; WHARTON et al., 2001).

Em adição, segundo observações feitas por Wharton et al. (2001), durante o

processo de penetração da cutícula, a hifa de penetração de Colletotrichum

sublineolum é diferenciada em vesícula antes mesmo de penetrar na parede

celular, podendo ser observada a formação de septo na hifa. Dessa forma, a

presença de altos teores de H2O2 no apoplasto da célula hospedeira pode causar

formação de ligações cruzadas das glicoproteínas ricas em hidroxiprolina e

prolina da vesícula imatura, dificultando seu desenvolvimento e forçando o fungo

a se desenvolver através da estratégia necrotrófica de infecção.

Entretanto, no presente trabalho, folhas tratadas com CAT e DPI

apresentaram diminuição dos níveis de H2O2 e baixa peroxidação de lipídios

(Figura 5.18; Figura 5.20; Figura 5.23; Figura 5.25). Estes resultados corroboram

com os de Borden e Higgins (2002), na qual a infiltração de CAT ou DPI em

Lycopersicon esculentum proporcionou diminuição de regiões coradas com DAB,

em conseqüência da diminuição dos níveis de H2O2.

Foi observado, em folhas tratadas com CAT e DPI, um processo de

infecção hemibiotrófico do fungo sendo caracterizado pela formação de vesículas

de infecção com formato globoso (Figura 5.22; Figura 5.28). É sugerido que a

presença de baixos níveis de H2O2 nas folhas da planta hospedeira não

favoreceria, aparentemente, fortificação da sua parede celular nem alteraria,

sensivelmente, a estrutura das vesículas de infecção do fungo (PANSTRUGA,

2003). De acordo com o processo de infecção, o fungo C. gloeosporioides se

assemelha com o do C. lindemuthianum em P. vulgaris. Estas vesículas

apresentaram muita semelhança com àquelas de fungos pertencentes ao

agregado de espécies C. orbiculare (AKINWUNMI e LATUNDE-DADA, 2001;

PRUSKY et al., 2000). Entretanto, diferiram das estruturas de C. destructivum,

infectando feijão-de-corda ou alfafa, casos nos quais são desenvolvidas vesículas

de infecção consideravelmente inchadas, formando estruturas multilobadas que,

eventualmente, expandem para preencher a célula hospedeira (LATUNDE-DADA

et al., 1996 e 1997).

Em adição, folhas controles de feijão-de-corda, genótipo Br-3, que

possuem naturalmente baixos teores de H2O2 (Figura 5.2; Figura 5.12; Figura

5.18; Figura 5.23), também foram infectadas através da estratégia de infecção

hemibiotrófica. Assim, diferente dos outros tratamentos, o grupo controle

apresentou lesões necróticas apenas 48 hai (Figura 5.7; Figura 5.16; Figura 5.27).

Entretanto, subseqüentemente após a formação de hifas primárias (Figura 5.9),

foi possível observar que ocorreu necrotrofia (Figura 5.7 B; Figura 5.16 B; Figura

5.27 B). De acordo com a literatura, a fase biotrófica de fungos hemibiotróficos é

assintomática, diferente da fase necrotrófica (PRUSKY et al., 2000). De acordo

com Wharton et al. (2001), esta fase necrotrófica está associada à formação de

hifas secundárias. Além disso, trabalhos mostram que durante este estágio as

células do hospedeiro morrem rapidamente com o avanço da infecção, sendo que

as paredes celulares das células hospedeiras são rapidamente degradadas e

inchadas, sugerindo a participação de enzimas hidrolíticas que são secretadas

neste estágio (LATUNDE-DADA et al, 1997; O’CONNELL et al, 1996; PERFECT

et al., 2001; WHARTON et al., 2001; WIJESUNDERA et al., 1989). Tendo em

vista que as hifas primárias estão confinadas nas células epidérmicas e nas do

esclerênquima, as hifas secundárias se ramificam por toda a parte da folha,

incluindo células do mesófilo e tecido vascular (PERFECT et al., 2001), o que

explica no presente trabalho, a intensa propagação de hifas na fase necrotrófica.

Trabalhos mostram que, ainda durante esta fase, as hifas secundárias se

desenvolvem entre as células hospedeiras, dentro das células e abaixo da

cutícula. Além disso, compostos de defesa do hospedeiro são sintetizados neste

estágio, mas o crescimento do fungo não é retardado porque as células

hospedeiras que produzem estas substâncias são mortas antes mesmo de

inibirem o desenvolvimento fúngico (PRUSKY et al., 2000).

Foi observado nos tratamento controles e com CAT e DPI a presença de

dimorfismo entre as hifas primárias e secundárias (Figura 5.9; Figura 5.10; Figura

5.22; Figura 5.28). Como notado por Heath e Skalamera (1997), a produção de

micélio dimórfico, com a produção de hifas primárias e secundárias, é uma

característica típica de muitos hemibiotróficos, incluindo C. destructivum, C.

truncatum, C. sublineolum e Magnaporthe grisea (WHARTON et al., 2001;

O’CONNELL et al., 1993; LATUNDE-DADA et al., 1996). A elevada razão

área/volume e a presença de paredes celulares mais finas das hifas secundárias

fazem com que estas estruturas se tornem bastante especializadas para a

nutrição, secreção de enzimas hidrolíticas e de toxinas, durante a fase

necrotrófica.

Em todos os tratamentos o sucesso do processo de colonização pôde ser

observado pela emissão de vários acérvulos (Figuras 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, 5.17,

5.22, 5.28) estruturas responsáveis pela reprodução assexuada e disseminação

de conídios. Além disso, estas estruturas não foram acompanhadas por setas.

Dessa forma, o fungo C. gloeosporioides estudado neste trabalho apresenta

acérvulos glabros, diferente de fungos setosos, como por exemplo, C.

lindemuthianum e C. destructivum (PRUSKY et al., 2000).

Em resumo, os dados referentes à atuação do H2O2 na interação feijão-de-

corda, genótipo BR-3, x C. gloeosporioides sugerem que o acúmulo desta ROS

na planta pode ativar uma estratégia mais violenta e destruidora de infecção do

fungo C. gloeosporioides no feijão-de-corda, como foi visto nos tratamentos das

folhas com 5,0 mM de ácido salicílico e 200 U mL-1 de glucose oxidase + 2,0 mM

de glucose. Em contrapartida, a diminuição dos teores de H2O2, por meio do uso

de CAT e DPI, não limitou o desenvolvimento do fungo na planta. Este fungo é

capaz de desenvolver estratégia de infecção mais branda, porém com o sucesso

da colonização. Estes resultados corroboram com observações feitas sobre a

interação de plantas com fungos necrotróficos, onde o aumento de H2O2 pelo uso

de substâncias farmacológicas facilita a entrada e propagação do patógeno

(GOVRIN e LEVINE, 2000; YE et al., 2006). Contudo, diferem da interação de

plantas com fungos biotróficos obrigatórios, onde o H2O2 atua na morte celular e,

subsequentemente, impede a propagação do fungo nos tecidos vegetais

(BORDEN e HIGGINS, 2002; HÜCKELHOVEN et al., 1999; LU e HIGGINS, 1999;

THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1997). Dessa forma, o H2O2 não confere

resistência ao genótipo de feijão-de-corda, BR-3, contra a infecção de C.

gloeosporioides.

Fica claro, então, que outros estudos deverão ser realizados com o objetivo

de elucidar outros mecanismos que estejam relacionados com a defesa do feijão-

de-corda a esse fungo. Por exemplo, folhas primárias do genótipo TE-97 de

feijão-de-corda, resistente ao fungo C. gloeosporoides, apresentam, além do

acréscimo de H2O2, aumento bastante significativo (ρ ≤ 0,05) dos níveis de β-1,3-

glucanase, que não é observado em folhas primárias do genótipo BR-3,

suscetível, quando infectado por este fungo (BARRETO, 2005). Dessa forma, a

ausência ou inibição de fatores que são ativados pelo H2O2, tais como fosfatases,

proteíno-quinases, MAPK e fatores de transcrição, relacionados à expressão da

enzima β-1,3-glucanase, pode ser crucial para falta de resistência do genótipo

BR-3, ao fungo C. gloeosporioides.

7 – CONCLUSÃO

A partir dos resultados apresentados neste trabalho, referentes ao estudo

do papel do peróxido de hidrogênio na interação feijão-de-corda x C.

gloeosporioides, foi observado que este composto, por si só, não conferiu

resistência ao genótipo de feijão-de-corda, BR-3, contra o ataque de C.

gloeosporioides. Em adição, a manipulação de suas concentrações proporcionou

diferenças quanto à cronologia do processo de infecção e ao tipo de estratégia

utilizada pelo fungo. É sabido que genótipos de feijão-de-corda resistentes ao

fungo C. gloeosporioides apresentam aumento de enzimas superóxido dismutase

(SOD) e diminuição de catalase (CAT), culminando em acúmulo de H2O2.

Entretanto, genótipos suscetíveis apresentam níveis baixos de SOD e altos de

CAT, tendo como conseqüência, diminuição dos teores de H2O2. Assim, de

acordo com os resultados obtidos, o H2O2 isoladamente não pode ser

considerado como único responsável pela resistência do genótipo de feijão-de-

corda. Dessa forma, é sugerida a participação de outras moléculas que estejam

relacionados com o grau de resistência/suscetibilidade da planta a esse

fitopatógeno. Assim, estudos posteriores deverão ser realizados para elucidar que

tipos de mecanismos estão envolvidos em interações incompatíveis e compatíveis

entre feijão-de-corda e C. gloeosporioides.

8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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