die stationäre phase - papa-gey.depapa-gey.de/kolloquien/2010-12.pdf · oxidantien, analgetika,...

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Die stationäre PhaseDie stationäre Phase

Sortimentsübersicht

Auswahlentscheidung

Sortimentsübersicht

Auswahlentscheidung

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TrennmechanismenTrennmechanismen

Adsorptions-Chromatographie

Verteilungs-Chromatographie

Ionenaustausch-Chromatographie

Komplex-Chromatographie

Adsorptions-Chromatographie

Verteilungs-Chromatographie

Ionenaustausch-Chromatographie

Komplex-Chromatographie

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Adsorption - VerteilungAdsorption - Verteilung

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Welche stationäre Phase ?Welche stationäre Phase ?AluminiumoxidKieselgelRP-SchichtenAmino-, Cyano und DiolphaseFlorisilPolyamidCelluloseKieselgurImprägnierte SchichtenIonenaustauscher-Schichten

AluminiumoxidKieselgelRP-SchichtenAmino-, Cyano und DiolphaseFlorisilPolyamidCelluloseKieselgurImprägnierte SchichtenIonenaustauscher-Schichten

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Weiteres über stationäre PhasenWeiteres über stationäre Phasen

SchichtuntergrundBinderPhosphoreszenzindikatorHersteller-/ChargenabhängigkeitLabordämpfe- Vorwaschen der SchichtAktivität der SchichtDC-HPTLC

SchichtuntergrundBinderPhosphoreszenzindikatorHersteller-/ChargenabhängigkeitLabordämpfe- Vorwaschen der SchichtAktivität der SchichtDC-HPTLC

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AbkürzungenAbkürzungen

(G Gips als Bindemittel

(H ohne artfremde Bindemittelzusätze

F Fluoreszenzindikator

245 Anregungswellenlänge des F

PSC präperative Schichten Schichtdicke > 0,25 mm

R hochgereinigtes Sorbens

RP 2,8,18 Reversed Phae/Umkehrphase mit

Kettenlänge/C-Atome 2,8,18

W wasserfeste,- benetzbare Schichten

S säurestabiler Indikator

60 mittlerer Porendurchmesser in Angström (=6 nm)

7

Terminologie & PolaritätTerminologie & Polarität

Normalphasen-Chromatographie(Straight Phase):polare SP + unpolare MP

Umkehrphasen-Chromatographie(Reversed Phase):unpolare SP + polare MPPolarität der Schichten

Si > NH2 > CN/Diol > RP-2 > RP-8 > RP-18

Normalphasen-Chromatographie(Straight Phase):polare SP + unpolare MP

Umkehrphasen-Chromatographie(Reversed Phase):unpolare SP + polare MPPolarität der Schichten

Si > NH2 > CN/Diol > RP-2 > RP-8 > RP-18

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Stationäre Phasen auf Kieselgel-BasisStationäre Phasen auf Kieselgel-BasisCuCu++

polarepolare PhasePhase

88]]

OOSiSi

SiSiOO

OO

OO

SiSiOO

CHCH33

SiSi

SiSi

OO

OOOO

OO

SiSi

SiSi

SiSi

SiSi

OO

OO OOOO

[[

CHCH33

]][[ 55

]][[

CHCH33

33 CHCH33CHCH33

CC NN

OOOHOH

OHOH

NHNH22

SiSi

OOHH

]]88

NNOOOO OHOH

[[chiralechirale PhasenPhasen mittelpolaremittelpolare chemischchemischgebundenegebundene PhasenPhasen

unpolareunpolare chemischchemischgebundenegebundene PhasenPhasen

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Gebundene Phasen - DIOLGebundene Phasen - DIOL

Weniger beeinflusst durch Feuchtigkeit

Einsatz als Normal- oder Umkehrphase

Brauchbarste der gebundenen Phasen

Grosse Ähnlichkeit mit Kieselgel

Geringere Retention

Hormone, Steroide

Weniger beeinflusst durch Feuchtigkeit

Einsatz als Normal- oder Umkehrphase

Brauchbarste der gebundenen Phasen

Grosse Ähnlichkeit mit Kieselgel

Geringere Retention

Hormone, Steroide

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Gebundene Phasen - AminopropylGebundene Phasen - Aminopropyl

Als Normalphase Trennung nach Art und Anzahl funktioneller Gruppen

Als NP: H+-Donor oder H+-Akzeptor

Als RP: schwacher Anionenaustauscher

Fluoreszierende Flecken mit Zuckern

Carbonsäuren, Phenole, Nucleotide, Vitamine, Xanthin-Derivative, Zucker

Als Normalphase Trennung nach Art und Anzahl funktioneller Gruppen

Als NP: H+-Donor oder H+-Akzeptor

Als RP: schwacher Anionenaustauscher

Fluoreszierende Flecken mit Zuckern

Carbonsäuren, Phenole, Nucleotide, Vitamine, Xanthin-Derivative, Zucker

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Gebundene Phasen - CyanoGebundene Phasen - Cyano

Mittelpolar

Als Normalphase wie desaktiviertes Kieselgel

Hochselektiv für polare Heterocyclen

Als Umkehrphase zur Ionenpaar-Trennung

von Säuren

Pharmazeutische Konservierungstoffe

Mittelpolar

Als Normalphase wie desaktiviertes Kieselgel

Hochselektiv für polare Heterocyclen

Als Umkehrphase zur Ionenpaar-Trennung

von Säuren

Pharmazeutische Konservierungstoffe

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Umkehrphasen (RP 2, RP 8, RP 18)Umkehrphasen (RP 2, RP 8, RP 18)

Unpolare Stoffe (Lipide)• Fettsäuren, Carotenoide, SteroidePolare Stoffe• Basische und saure WirkstoffeStoffe, die auf aktiven Schichten labil sind• Vitamine, Antibiotika, CannabinoideInsektizide, Alkaloide, Barbiturate, Anti-oxidantien, Analgetika, Lebensmittelfarben

Unpolare Stoffe (Lipide)• Fettsäuren, Carotenoide, SteroidePolare Stoffe• Basische und saure WirkstoffeStoffe, die auf aktiven Schichten labil sind• Vitamine, Antibiotika, CannabinoideInsektizide, Alkaloide, Barbiturate, Anti-oxidantien, Analgetika, Lebensmittelfarben

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Trennung von Polyphenylen mit Hexan

Relative Feuchte

Aktivität der stationären PhaseAktivität der stationären Phase

Hängt ab vom Wassergehalt der Oberfläche• Aktivierung: Entfernung von

Wasser bei 120oC• Konditionierung:

Gleichgewicht mit definierter Feuchte

Beeinflusst: • RF Werte: hohe Aktivität -

kleiner RF

• TrennungMuss kontrolliert werden

Hängt ab vom Wassergehalt der Oberfläche• Aktivierung: Entfernung von

Wasser bei 120oC• Konditionierung:

Gleichgewicht mit definierter Feuchte

Beeinflusst: • RF Werte: hohe Aktivität -

kleiner RF

• TrennungMuss kontrolliert werden

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Einstellen der relativen FeuchteEinstellen der relativen Feuchte

Masse %H2SO4

%relativeFeuchte

GesättigteSalzlösung

% relativeFeuchte

10 96 Pb(NO3)2 9820 88 KBr 8430 75 NaNO2 6640 56 NaHSO4

. H2O 5250 35 KF 3160 16 HCOOK 2170 3 ZnCl2. 1.5 H2O 10

Masse %H2SO4

%relativeFeuchte

GesättigteSalzlösung

% relativeFeuchte

10 96 Pb(NO3)2 9820 88 KBr 8430 75 NaNO2 6640 56 NaHSO4

. H2O 5250 35 KF 3160 16 HCOOK 2170 3 ZnCl2. 1.5 H2O 10

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TLCTLC HPTLCHPTLCMittlere Korngrösse: 10 - 15 µm 5 - 7 µmKorngrössenverteilung: weit engSchichtdicke: 250 µm 100, 200 µmProbenzahl: max. 12 36 - 72Laufstrecke: 100 - 150 mm 30 - 50 mmEntwicklungsdauer: 30 - 200 min 3 - 20 minLM-Verbrauch: 50 ml 5 - 10 mlDetektionsgrenze, Abs.: 100 - 1000 ng 10 - 100 ng

Fluor.: 1 - 100 ng 0,1 - 10 ng

DC oder HPTLC ?DC oder HPTLC ?

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HPTLC – DC - VergleichHPTLC – DC - Vergleich

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HPTLC – DC: PartikelgrössenHPTLC – DC: Partikelgrössen

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Herstellung von Kieselgel und RPHerstellung von Kieselgel und RP

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HPTLC-SorbenzienLichrospher - HPTLC klassisch

HPTLC-SorbenzienLichrospher - HPTLC klassisch

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HPTLC - LichrospherHPTLC - Lichrospher

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UTLCUTLC

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HPTLC – DC: Optimale TrennstreckeHPTLC – DC: Optimale Trennstrecke

Fließmittelauswahl Methodenentwicklung in der DC

Anforderungen an das Fließmittel

Darf nicht mit der Probe reagieren

Ausreichende Selektivität und StärkeGeringe ToxizitätViskosität /sollte gering sein

Zusammen mit Oberflächenspannung bestimmt sie die Geschwindigkeit der Fließmittelfront und die Trennzeit

Dampfdruck/ nicht hoch nicht niedrigHoher Dampfdruck erhöht Risiken die mit Adsorption und Desorption des FM-Dampfes an bzw. von der Schicht.Selektive Verdampfung möglich

Genügende Reinheit und Stabilität

Anforderungen an das FließmittelReinheit

Trennung von 4 Polyhydroxybutyraten mit Chloroform

Stabilisator: Ethanol Amylen

0 20 40 60 80 100mm

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200AE

A190

A200

A220

A240

A260

A280

A300

Analyse w:

Dateiname:0122.... Bahn:16Currenta SER-ANT, Chempark Dormagen, Geb. Da 5, 41538 Dormagen

3/FEB/2009

0 20 40 60 80 100mm

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200AE

A190

A200

A220

A240

A260

A280

A300

Analyse w:

Dateiname:0160.... Bahn:6Currenta SER-ANT, Chempark Dormagen, Geb. Da 5, 41538 Dormagen

14/MAR/2009

Eindampfrückstand aus 4 mL t-BME (Fluka 20257 , LOT 1390414)Im AMD-Gradient, UV-Detektion

Eindampfrückstand aus 4 mL t-BME (SIAL 34875 , LOT 8323A)Im AMD-Gradient „PF-Absicherung“, UV-Detektion

Anforderungen an das FließmittelReinheit

Anforderungen an das FließmittelStabilität

• Gereinigte Lösemittel gut verschlossen und gegebenenfalls lichtgeschützt aufbewahren

• Fließmittel immer frisch bereiten Systeme wie n-Butanol/Eisessig/Wasser neigen zur Veresterung!Noch bedenklicher sind Verseifungen- es entstehen freie Säuren und Alkohol !

Anforderungen an das FließmittelVerteilungsisotherme

Cs

cm

H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)

Verteilungsisotherme sollte linear sein

Zu trennende Substanzen sollen sich im System Fließmittel-Schicht gleichmäßig verteilen, damit der Fleck rund bleibt

Zusatz von Säuren, Basen , solvatisierenden Lösemitteln unterdrücken überlagernde Dissoziations- oder Assoziationsgleichgewichte- Substanzen werden in einheitliche Molekülform überführt

Charakterisierung von FließmittelnLösemittelstärke - εo

• Dimensionslose Größe zwischen 0 und 1

• Charakterisiert das Vermögen des Lösemittels zum Stofftransport

auf der Schicht

• Adsorptionsenergie des Lösemittels pro Flächeneinheit unabhängig

von Adsorptionsaktivität

• Pentan/Hexan ist als = 0.00 definiert

Geiss, Fundamentals of TLC, Huethig 1987

Eluotrope Reihe auf Kieselgel

Pentane / Hexane 0.00 Ethyl acetate 0.48

Cyclohexane 0.04 Acetone 0.50

CCl4 0.11 Acetonitrile 0.60

Toluene 0.27 Dioxane 0.60

Isopropyl ether 0.28 Pyridine 0.70

Dichloromethane 0.30 Propanol 0.82

Chloroform 0.36 Methanol 0.95

Diethylether 0.43 Acetic acid >>1

LösemittelstärkeZunehmende Fliessmittelstärke: Einfluss auf die Trennung eines Testfarbstoffes. MP: Hexan mit 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, und 90% Ethylacetat (von links nach recht)

CAMAG Applikationslabor

Lösemittelstärke binärer Mischungen

Die Lösemittelstärke einerMischung ist nicht additivBei Zugabe eines “starken” Lösemittels zu einem schwachen, ändert sich die Lösemittelstärke erstdrastisch, dann immer weniger

F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972

Lösemittelstärke und Selektivität

Vergleichende Entwicklung mitLösemittel εo

A,B = 0.18 auf Aluminiumoxid bei 58% r.F.

a) 7.1% Ethylacetat in Hexan

b) 9.53% Aceton in Hexan

c) 29.9% Toluen in Hexan

H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)

Polaritätsindex (P`) nach Snyder

• Maß für die Fähigkeit eines Fließmittels mit verschiedenen Lösungsmitteln (z.B. Ethanol, Dioxan, Nitromethan) in Wechselwirkung zu treten

• Zur Berücksichtigung der Protonenakzeptor-Protonendonator- und Dipoleigenschaften wurden die Verteilungskoeffizienten der Fließmittel gelöst in den oben genannten Lösemitteln hinzugezogen

• Aus diesen Daten berechnete Snyder log (K“)-Werte, die sich additiv zum P`-Wert zusammenstzen

P`= log (K“) Ethanol + log (K“) Dioxan + log (K“) Niromethan

Polaritätsindex (P`) nach Snyder

P`= log (K“) Ethanol + log (K“) Dioxan + log (K“) Niromethan

Es lassen sich daraus die Wechselwirkungsanteile der Fließmittel mit den Lösemitteln Etahanol, Dioxan, Nitromethan berechnen.

Zum Beispiel:

χe = log (K“)Ethanol / P´

P´= χeP´ + χdP´ + + χnP´

(χe + χd + + χn) = 1 P` Polaritätsindex

Χe Anteil Fließmittelwechselwirkung mit Ethanol (Protonenakzeptoreigensch.)

Χd Anteil Fließmittelwechselwirkung mit Dioxan (Protonendonatoreigensch.)

Χn Anteil Fließmittelwechselwirkung mit Nitromethan (Dipoleigensch.)

Einteilung der Lösemittel nachSelektivität (Snyder)

I Aliphatische Ether, Trialkylamine, TrialkylphosphateII Aliphatische AlkoholeIII Pyridin, THF, DMSO, DMF, DiethylenglycolIV Benzylalkohol, Ethylenglycol, Essigsäure, FormamidV Dichlormethan, 1,2-DichlorethanVI Ketone , Ester, Dioxan, NitrileVII Aromatische (halogenierte) Kohlenwasserstoffe,

NitroverbindungenVIII Chloroform, Wasser, Fluoroalkohole, m- Kresol

Polaritätsindex, Selektivitätsparameter, Selektivitätsgruppe

Xe- gemessene Protonenakzeptorstärke

Xd- gemessene Protonendonatorstärke

Xn- gemessene Dipolwirkung

Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for theAnalysis of Medical Plants“, Thieme Verlag

Lösemittelstärke und Selektivität

A: Hexan /15% Ethylacetat

B: Hexan /20% Aceton

C: Hexan /10% Isopropanol

D: Chloroform

Aceton und Ethylacetat- gleiche Selektivitätsgruppe IV

Isopropanol II, Chloroform VIII


Zusammenfassung

• Selektivität- entscheidender Faktor zur Trennung von Substanzen gleicher Polarität

• Fließmittelstärke Faktor zur Trennung von Substanzen unterschiedlicher Polarität

• Isoelutrope Fließmittel- gleiche Stärke unterschiedliche Selektivität-unterschiedlicheTrennungen

Vorbetrachtungen zur MethodenentwicklungDefinition der analytischen Zielstellung

• Soll die Methode zur Routine oder für eine Entwicklung erarbeitet werden?

• Soll die Methode zur Untersuchung von Rohmaterial, Extrakten, Endprodukten oder Mischproben dienen?

• Möchten Sie die Identität einer Komponente oder der Komponente in einer Mischung analysieren?

• Möchten Sie quantifizieren?

• Welche Matrices erwarten Sie, welche NWG?

• Können Sie bereits auf eine bestehende Methode zurückgreifen?


Vorbetrachtungen zur MethodenentwicklungAspekte

• Eine qualitative Methode dient als Fingerprint und sollte so viel wie möglich Komponenten auftrennen

• Steht Ihnen exklusives Referenzmaterial aus kontrolliertem Anbauzur Verfügung ist eine Identitätsprüfung weniger schwierig

• Ist Ihre Leitdroge Bestandteil einer Mischung kann ein komplexerFingerprint der Mischung entwickelt werden. Die spezifischen Banden der Leitdroge müssen herausgearbeitet werden, die übrigen werden als Matrix angesehen.

• Quantitative Methode setzt Basislinientrennung voraus. Das Chromatogramm kann so einfach wie möglich gestaltet werden. Extensive Probenvorbereitung kann erforderlich sein.


Vorbetrachtungen zur MethodenentwicklungAusgangspunkt

• Auftragen der Proben (Lösemittel, Probevolumen, Auftragegeschwindigkeit, Größe und Schärfe der Auftragezone)

• Modifikation der stationären Phase (Aktivität, Imprägnierung)

• Chromatographiekammer (Typ, Sättigungsgrad)

• Entwicklungsmodus (Einfach, Mehrfach, Gradient)

• Detektion und Derivatisierung (UV-Absorption, Fluoreszenz, Reagentien, Konditionierrung)


Was ist bekannt ?

• Anzahl der Komponenten• Chemische Struktur• Molekulargewicht• Löslichkeit• Matrix• Konzentrationsbereich• pKa ; UV Spektrum, etc. • Nichts

Probe Probenvor-bereitung

Analytengetrennt?

Orientierung über das chromatogr. System (z. B. Dreieck-Schema nach Stahl)

Wahl der stationären Phase (mit Kieselgel starten)

Analytenangetrennt1?

jajaneinnein

Optimierung Gasphase,Konditionierung, Zweifachentwicklung

Optimierung der mobilen Phase

jajaneinnein

AMD

Probenvorbereitung optimieren, evtl. prächrom. derivatisieren

Analytengetrennt?

jajaneinnein

Weitere chrom. Verfahren

Postchrom. Derivatisierung

jaja

neinnein

e/o e/o

Ende

11 Bei Beurteilung einer Trennung selektive Detektion berücksichtiBei Beurteilung einer Trennung selektive Detektion berücksichtigen gen

Analytendetektierbar?

Schema zur Methodenentwicklung


Auswahl des FließmittelsPraktische Lösung

• Standardsysteme

• Fleckentest

• Prisma-Modell

• CAMAG - Optimierungsschema

Auswahl des FließmittelsStandardsysteme

Lösemittelgemische:1.Toluen/Ethylacetat 95+5 für unpolare Komponenten2. Chloroform/Methanol/Wasser

70+30+4 für Saponine und Lignane3. Ethylacetat/Essigsre/Ameisensre/Wasser

100+11+11+27 für Flavonoide4. Acetonitril/Wasser/Ameisensäure

30+8+2 für Aminosäuren5. Butanol/Essigsäure/Wasser

7+1+2 für polare Komponenten


1.Toluen/Ethylacetat 95+5 für unpolare Komponenten

2. Chloroform/Methanol/Wasser 70+30+4 für Saponine und Lignane

3.Ethylacetat/Essigsre/Ameisensre/Wasser 100+11+11+27 für Flavonoide

4. Acetonitril/Wasser/Ameisensäure 30+8+2 für Aminosäuren

5. Butanol/Essigsäure/Wasser 7+1+2 für polare Komponenten


FleckentestVersuch und Irrtum

• Lösen der Probe in unpolarem Lösemittel

• Applikation auf die DC-Platte

• Applikation ~ 20 µL unterschiedlicher Lösemittel

auf die Probenflecken

• Es erfolgt eine Zirkularentwicklung

• Trocknen der Lösemittel

Fleckentest

Goldenseal CAMAG Applikationslabor

Fleckentest


Fleckentest

Lavender CAMAG Applikationslabor

Vor- und Nachteile Fleckentest

• Schnell und automatisiert• Lösmittelanzahl und Typ sind flexibel• Information über Lösemittelstärke und

Selektivität

• Ungesättigtes offenes System• Unsystematisch

VororientierungDreieck-Schema nach Stahl

Auswahl stationäre Phase

• Beginnen mit Kieselgel• Für spezielle Trennprobleme spezielle Schichten:

Bsp.:Eugenol, Methyleugenol, Isoeugenol

Kieselgel Amino- Cyano

MP: Toluen, D: Schwefelsäurereagenz,

1 Eugenol,

2 Methyleugenol,

3 Isoeugenol

OH

OMe

OMe

OMe

OH

OMe

1

2

3Eike Reich, Anne Schibli „High-Performance Thin-Layer Chromatography for theAnalysis of Medical Plants“, Thieme Verlag

Reine Fliessmittel

Herabsetzen / Erhöhen der Fliessmittelstärkem. Wasser oder stärkerenLSM gleiche Selektivitätsgruppe

Mischungen,Modifier-Zugabe(Säuren, Basen)

Umgebung der besten Mischung

Auswahl mobile Phase Stufe 1Beispiel Curcuma

A: TBME

B: Methanol

C: THF

D: Ethylacetat

E: DCM

F: Toluen

G: Chloroform

Gruppe A: die gewünschten Komponenten sind getrennt, die Rf-Werte sind im passenden Bereich, das Trennproblem ist gelöstGruppe B: Sie erhalten Rf-Werte über 0,8Gruppe C: Sie erhalten Rf-Werte kleiner 0,2



Lösemittel der Gruppe B werden mit n-Hexan „verdünnt“. Je höher die Lösemittelstärke, desto höher muss der Anteil an n-Hexan ausfallen. Sollte die Probe komplett in die Front laufen, sollte ein Verhältnis von mindestens 1:4 eingesetzt werden.

A-D 1:4 E und F 1:1

TBME Methanol THF Ethylacetat TBME Ethylacetat



Lösemitteln der Gruppe C wird ein polarer Modifier zugesetzt (z.B. Essigsäure, Ameisensäure oder Basen wie z.B. Diethylamin, Ammoniak). Ein erster guter Versuch sind ca. 10%. Auch der Zusatz von Wasser ist möglich, wenn die Mischbarkeit gegeben ist.

DCM/Essigsre Toluol/Essigsre Chloroform/Essigsre

9+1 8+2 9+1



Kombination von 2 Lösemitteln aus den Gruppen B und C zunächst als Mischung 1:1, dann im Umkreis durch „pobieren“ beste Mischung findenEinstellung der Lösemittelstärke mit Modifiern um scharfe Trennzonen zu bekommen. Bei Fleckentailing ist z.B. eine Wasserzugabe von 0,5-1% nützlich. Modifizierung der Trennbedingungen (Kammersättigung, Feuchte)


A: Isopropanol/Hexan/Wasser 1:6:0,2

B:TBME/Hexan/Ameisensre 5:5:0,1

C:Toluol/Methanol 4,5:0,5

D: Chloroform/Methanol/Ameisensäure 10:0,1:0,1

Feinabstimmung der Methode

Es wurde ein Fließmittel gefunden.

Variation des Auftragevolumens (qualitativ Maximum an Zonen, quantitativ linearer Arbeitsbereich)

Derivatisierung/Visualisierung ( spezifische und unspezifische Reagenzien, Optimierung der Derivatisierung für gute Reproduzierbarkeit)

Robustheit der Methode

Parameter der densitometrischen Messung (Wellenlänge, Spaltdimension, Geschwindigkeit)

Nun kann die Methode

validiert werden

Detektion/Derivatisierung in der DC

Detektion/DerivatisierungLokalisierung und Identifizierung

Lokalisierung (Ermittlung der Lage im Chromatogramm)

Physikalische VerfahrenChemische ReaktionenBiologische Reaktionen

Identifizierung (Verwendung von gruppenspezifischen Reagenzien)

Chemisches VerhaltenPhysikalische, chemische, biologische Eigenschaften

Physikalische Detektion

Chemische ReaktionenDerivatisierung

prächromatographisch

postchromatographisch

bei der Proben-vorbereitung am Start

chromatogr.Entwicklung

Chromatogramm

visuelle undphotom.

Auswertung

Prächromatographische in-situ-DerivatisierungChemische Reaktionen

Reagenzapplikation punkt- oderstrichförmig

Applikation Untersuchungslösung(in feuchte Reagenzzone)

eventuelle Wärmebehandlung(Startzone abdecken)

Chromatographische Entwicklung

Für Substanzen mit ähnlichen chromatographischen, aber unterschiedlichen chemischen Eigenschaften

Zur Erhöhung der Stabilität

Umsetzung flüchtiger Substanzen in Derivate

Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit durch z.B.Erzeugung einer Fluoreszenz

Nachteil:Analyt wird mit Derivatisierungsreagenz verunreinigtund muss zusätzlich abgetrennt werden

Molekül wird größer und durch das Reagenz in der Struktur ähnlicher- dadurch schlechtere Trennung

Beispiel: DansylierungenDansylhydrazin für CarbonylgruppenDansylchlorid für NH und OH-GruppenDansylsemipiperazid für FettsäurenDansylazirin selektiv für SH-Gruppen

Prächromatographische in-situ-DerivatisierungChemische Reaktionen

Beispiel: DansylierungenDansylhydrazin für CarbonylgruppenDansylchlorid für NH und OH-GruppenDansylsemipiperazid für FettsäurenDansylazirin selektiv für SH-Gruppen

Gerad- und ungeradzahlige Fettsäuren nach in-situ-Derivatisierung mit Dansylsemicadaverid

1: C-24 bis C-16 2: C-24 bis C-6 3: C-20 bis C-12 4: C-20 bis C-11

5: C-19 bis C-11 6: C24 bis C-16

Derivatisierungstechniken

Tauchen

Chemische ReaktionenPostchromatographische Derivatisierung

Entwicklung des Chromatogramms

Erwärmen

Trocknen

SprühenBedampfen

Trocknen der Platte• Vertikale Lage der Platte, um Fließen des Restlösemittels

und damit Fleckendiffusion zu verhindern (so lange wie Feuchte offensichtlich).

Kritische Trocknungim Luftstrom

Anethol in Anis- und FenchelölMP: Toluen/Ethylacetat 95+5 D: UV 254

Die etherischen Öle werden im Luftstrom von ihren Plätzen gerissen!

E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants“, Thieme 2006

DerivatisierungstechnikenThermochemische Reaktionen (Erwärmen)

Aminophase für die Trennung von ZuckernErhitzen der Platte 3-5 min auf 150°C

Bedampfen

• Doppeltrogkammer oder Konditionierkammer

• Nutzung von Joddämpfen , Ammoniak, Brom, Chlor,

Chemische ReaktionenPostchromatographische Derivatisierung

• Erzeugung einer Absorption im sichtbaren-oder UV-Bereich oder einer Fluoreszenz

• Verwendung von gruppenspezifischen Reagenzien zum stoffspezifischen Nachweis

• Steigerung der Selektivität• Steigerung der Nachweisempfindlichkeit

DerivatisierungstechnikenSprühen

Spraydosen

Laborsprüher

Sprühautomat (DESAGA)

DerivatisierungstechnikenSprühen

VorteileEinfach und schnellKeine besondere AusrüstungKleine Volumina

NachteileErzeugung von SprühnebelnSchwierige Gewährleistung der HomogenitätUndefiniertes VolumenRoutine zum exakten Sprühen muss erst erworben werdenEs könne partielle Feuchteinseln entstehen

DerivatisierungstechnikenTauchen

• Gleichmäßige Belegung mit Reagenz

• Reproduzierbare Ergebnisse durch standardisierte Bedingungen

• Keine Sprühnebel• Reinigen der Rückseite• Vertikale Lagerung um

Bandenverbreiterung auszuschließen

Vergleich Tauchen-Sprühen

Tauchen Sprühen


Vergleich Tauchen-Sprühen

Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel

Vergleich Sprühen-Tauchen

Derivatisierung von Capsaicinmit Gibbs-Reagenz(Dichlorchinon chlorimidgefolgt von Base)

Sprühreagenz: 1%-ige Lsg. Gibbs-Reagen; 2%-ige Natriumcarbonat- Lösungen haben hohe Viskosität und lassen sich somit schlecht dosieren

Tauchreagenz: 0,025% GibbsReagenz und basische Bedampfung mit z.B. Ammoniak

ReagenzienUniversalreagenzien

Ansprühen mit Wasser macht lipophileSubstanzen kurzzeitig als helle Flecken aufgrauem Grund

ReagenzienUniversalreagenzien

5-10 min 120-160°CVersch. Gefärbte Zonen auf hellem Grund

Vanillin-Phosphorsäure

1-20 min 95-140°CFluoreszierende Zonen bei 366nm,oderverkohlte Zone

Schwefelsäure-Reagenz

10 min 150-180°CBlaue Flecken auf gelbem Grund

3% Phosphormolybdänsäurein Propan-2-ol

90-125°C 1-5 minUntersch. gef. Zonen, häufig bei 365nm Fluoreszenz

Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz

Anisaldehyd-SchwefelsäureWelche Rezeptur soll ich nehmen?

Kraus,Koch,Hoffstetter,Kuhn

100°C, bis zur Farbentw.

85ml10ml5ml0,5ml

85ml

Methanol

100-105°C

100°C, 2-5 min

1-15 min, 90-125°C

Bedingungen

Stahl100ml2ml1ml

Reich,Schibli10ml5ml0,5ml

Jork,Funk,FischerWimmer

97 ml2ml1ml

LiteraturEssigsäureSchwefelsäureAnisaldehyd

Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz

10 ml Schwefelsäure werden vorsichtig in eine Mischung aus

170 ml eisgekühltem Methanol und 20 ml Eisessig eingerührt. Zu dieser Mischung wird 1 ml Anisaldehyd zugefügt.

Das Reagenz ist farblos und sollte im Kühlschrank aufbewahrt werden. Sollte sich die Farbe ändern, muss es verworfen werden!

Die Platte wird in das Reagenz mit einer Verweilzeit von 1 s getaucht. Danach wird 2-5 min auf 100°C erhitzt.

Auswertung im Weißlicht und bei UV 366 nm

Ergebnis in Abhängigkeit vom zugeführten Reagenz


Stoffspezifische ReagenzienZucker und Glycoside

Schicht: HPTLC Kieselgel 60 (rel. Feuchte über 62% SchwefelsäureFließmittel: Chloroform: Essigsäure: Wasser 30+35+5 Derivatisierung: Diphenylamin, Anilin und Orthophosphorsäure gelöst in Aceton

Beeinflussung der Nachweisempfindlichkeitzugeführtes Reagenz

Funk, Fischer, Wimmer ,Dünnschichtchromatographie Bd.1

Nachbehandlung

Trocknen

Abzugvertikale Lagerung

ev. Ventilator oder FönSubstanzeigenschaften (Flüchtigkeit, Oxidationsempfindlichkeit

beachten)

Einwirkung von Wärme

TrockenschrankHeizplatte

Nicht auf das Gitternetz legen

Metallblock verwendenoder frei schwebend

Visuelle Verfolgunghomogene Umsetzung

Hinweise zur Benutzung von Wärmeplatten

• Legen Sie die Platte auf die noch kalte Heizplatte und heizen Sie Platte und Gerät gleichzeitig auf.

• Wollen Sie mehrere Platten derivatisieren kühlen Sie auf etwa 60°C ab.

• Haben Sie hohen Plattendurchsatz, dann legen Sie die Platten auf ca. 1mm dicke seitlich angebrachte Abstandhalter (das Luftpolster verhindert das Aufwölben der Platte. Wählen Sie eine 10°C höhere Temperatur um Wärmeverlust auszugleichen.

• Temperatur• Konzentration und Zusammensetzung

der Lösung• Stabilität der Lösung

DerivatisierungTemperatur

Flavonoids of St. John‘s Wort

1: 3 min Kaltluftstrom 2: 5 min 105°C3: 30 min 105°C

1 32


366 nm, NP, NP/PEG

366 nm, NP, NP/PEG nach 30 min

366 nm, NP, NP/PEG

DerivatisierungTemperatur


Konzentration und Zusammensetzung der Lösung


DerivatisierungAlter des Reagenz


Lagerung der derivatisierten Platte


Einfluss des Plattenuntergrundes auf Derivatisierung

Reagenz im Sorbens

Etherische ÖleMolybdatophosphorsäure

DihydroxybenzoleSilbernitrat

LipideAmmoniumsulfat

PAHCoffein

Nachgewiesene SubstanzenReagenz

Reagenz wird in die Sorbensschicht eingearbeitet

Reagenz im FließmittelVoraussetzung: -gleichmäßige Verteilung auf der Schicht-Reagenz muss mit der Fließmittelfront laufen

Beispiele: Ninhydrin bei AminosäurenFluorescamin bei biogenen Aminen

Ninhydrin in der mobilen Phase vermindert das Rauschen um den Faktor 2. Die selektive Derivatisierungist bestens geeignet, da die nicht derivatisierte Matrix die Detektion nicht beeinflusst

Identifizierung und Quantifizierung von Aminosäuren und Peptiden (CBS 101,Hamon,Diancourt,Roy,Sbaffo-Poasevara)

Probleme beim Derivatisieren

Verdünnen Reagenz, Temperatur herabsetzen, Platte vorwaschen

Hohe Untergrundfärbung

Polarität Lösemittel ändern ( KG-Polarität erhöhen, RP-Polarität senken)

Benetzungsprobleme

Polarität Lösemittel ändern ( KG-Polarität senken, RP-Polarität erhöhen)

Fleckenelution bzw. Vergrößerung

Standardisierte Bedingungen einhalten

Schlechte Reproduzierbarkeit

ReaktionProblem

Wirkungsbezogene Detektiondirektes Biomonitoring

Direkte Messung der physiologischen Wirkung – Referenzsubstanzen müssen nicht vorhanden sein

-Enzymatische Reaktionen

Acetylcholinesterase- Hemmung durch Phosphorsäureester und Carbamate

Bestimmung von Schwermetallen mit Urease

-Antibiotische Wirkung

mit Bacillus subtilis

-Toxische Wirkung

mit Vibrio fisheriMarines BakteriumKontinuierlilches BiolumineszenzsignalNicht pathogenSeit 1979 für ökotoxische Tests im Einsatz(DIN 38412-431)

Wie funktioniert das ?

Züchtung der Bakterien

Tauchen der DC-Platte in die Bakteriensuspension

Beseitigung des Überschusses

Ergebnis

200

ng

150

ng

100

ng

A B C D E

100 μg

75 μ

g

50 μ

g

25 μ

g

10 μ

g

Biolumineszenz-löschung

Biolumineszenz-stimulation

A-E: Probenverdünnungennp: Nitrophenol (toxische Referenz)

np

BeispielePatulin in Apfelsaft

Das CAMAG TLC-MS Interface

Laser on/off

Stempel rauf/runter

Schalter Reinigung

Sicherheitschutzschild

on/off Schaltventil zu MS

Stempel

Prinzip TLC-MS Kopplung

CAMAG TLC-MS Interface

HPLC Pump fördert Lösungsmittel (MeOH)Flow rate: 100µl/min

MS-ESI (Electrospray Ionization Interface)

Funktionsprinzip TLC-MS Interface

Positionierung Platte mit Laserkreuz auf gewünschten Spot/Zone

Stempel senkt sich mit 4 bar ab und Extraktion beginnt

DC/HPTLC Platte mit Spots/Zonen

Stempel senkt sich mit kontrolliertem Druck

HPLC Pumpe fördertLösungsmittel Massenspektometer

analysiert Probe

Funktion Stempel und Extraktion

MS2

die stationäre phase - papa-gey.depapa-gey.de/kolloquien/2010-12.pdf · oxidantien, analgetika,...

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