diagnostico de dna

8/15/2019 DIAGNOSTICO DE DNA

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Universidad Nacional de TrujilloFacultad de Medicina

1. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

DEFINICIN!

Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son aquellas que

reconocen una secuencia entre 4-8 pb en DNAds. El sitio de reconocimiento se llama

sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace osodiester en la !ebra de arriba y otro

enlace osodiester en la !ebra complementaria.

En "#$% Daniel Nat"ans # $a%ilton . S%it" descubrieron un tipo de prote&nas 'lasenzimas endonucleasas o en&i%as de restricci'n- que act(an como )ti*eras

moleculares+, cortando la doble cadena de ADN a traés del esqueleto de osatos sin

daar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condu*o a dic!os microbióloos al

Nóbel en "#$8 y dio orien a la inenier&a enética.

Las enzimas de restricción permiten cortar el enoma de cualquier oranismo en

pequeos ramentos llamados (ra)%entos de restricci'n. La colección de miles o

millones de estos ramentos se llama *i*lioteca )+nica.

Las mismas permiten cortar DNA de !ebra doble, donde reconocen secuencias

palindrómicas /secuencias que se leen iual en ambas direcciones0.

1on e2tra&das de oranismos procarióticos /bacterias0, donde act(an como un

mecanismo de deensa, para deradar material enético e2trao que entre en la célula.

Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sire para distinuir entreel DNA e2trao y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA

metilado, de este modo solo aectan el DNA e2tran*ero y no el DNA bacterial.

Este sistema es an3loo a

un sistema inmune, y le

permite distinuir a la

bacteria entre su propio

DNA y el DNA e2óeno,

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siendo este (ltimo deradado por la enzima de restricción. El DNA propio no es

reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que preiamente lo !a modiicado por

metilación a traés de la acción de una metiltranserasa /enzima que transiere rupos

metilo desde 1-adenosilmetionina a bases espec&icas0. 1e conocen apro2imadamente"55 tipos dierentes de enzimas, las cuales act(an a 6$7 y se inactian r3pidamente.

El término )restricción+ proiene del mecanismo de acción que cumplen estas enzimas

en las bacterias que las sintetizan. ortan el ADN del irus que las parasitan

)restriniendo+ la duplicación del mismo.

Las enzimas de restricción cortan de*ando e2tremos co!esios o romos. Los e2tremosco"esivos son enerados cuando la enzima corta las dos !ebras asimétricamente,

de*ando los e2tremos de cada !ebra de simples cadenas complementarias entre s&. 9or

otro lado, los e2tremos ro%os son enerados cuando la enzima corta las dos !ebras por

el mismo luar, enerando dos e2tremos doble cadena.

Estas moléculas son indispensables para la inenier&a enética, ya que producen

ramentos que se pueden unir entre s& 3cilmente /con la ayuda de un )peamento

molecular+: la enzima liasa0. Estas enzimas tienen la capacidad de reconocer una

secuencia determinada de nucleótidos y e2traerla del resto de la cadena. Esta secuencia,

que se denomina ;estriction ti*era de ADN>, y la liasa en el >peamento>. 9or lo

tanto, es posible quitar un en de la cadena principal y en su luar colocar otro.


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cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN ligasa. En

el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos. Estos extremos

también pueden ser unidos con la a!uda de una enzima ligasa pero, como no los

extremos no son complementarios, la unión ser" m"s inespec#$ica.

Fra)%entos de restricci'n!

La lonitud de los ramentos de restricción depende de los sitios de corte de la enzima.

1i ocurriese un cambio de bases en el sitio de corte, la enzima respectia de*ar3 de

reconocer a éste como tal, dando luar a un corte en otro sector y por lo tanto se

oriinar3 un ramento de restricción de mayor lonitud. ?ambién !ay que tener en

cuenta que un cambio en una base puede crear un sitio de corte en una zona donde

!abitualmente no e2ist&a, dando luar a la aparición de un ramento de restricción de

menor lonitud.

Estas ariaciones de reconocen como %&' o olimor$ismo de longitud de los

$ragmentos de restricción.

RF-/ uso en identi(icaci'n de 0ersonas!

A lo laro de todo el enoma e2isten determinadas reiones en las cuales las bases se

repiten en secuencias cortas. Estas reiones se conocen como repeticiones en tandem den(mero ariable o @N?; . 1e !an identiicado numerosas enzimas de restricción que

act(an a este niel, las cuales al cortar determinan la aparición de ramentos cuyas

lonitudes depender3 del n(mero de @N?; e2istentes.

omo !ay una ran cantidad de reiones @N?; y dierentes entre s&, el patrón de

bandas resultante es e2clusio de cada indiiduo, dado que la probabilidad que se repita

en dos su*etos dierentes es inerior a una cada cien millones.

Esta particularidad resulta (til en la identiicación de las personas y en la enética

orense, ya que no e2iste un indiiduo con idéntico patrón énico que el otro.

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http://www.personales.ulpgc.es/ecastro.dbbf/Descargas/Transparencias/DNA%20recombinante.pdfhttp://www.personales.ulpgc.es/ecastro.dbbf/Descargas/Transparencias/DNA%20recombinante.pdf


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TIS DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN!

1istemas tipo :

1on comple*os multienzim3ticos, con pesos moleculares de 455.555 daltons o

mayores.

1us actiidades principales son reconocer la secuencia especiica del ADN,

mutilar y restrinir, pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento,

sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

;equieren A?9, =B y 1-adenosilmetionina para su actiidad.

Las enzimas de restricción correspondientes a este tipo tienen dierentes

actiidades enzim3ticas, como metilación de DNA, para lo que requieren 1-

adenosilmetionina y es estimulada por =B y A?9, actiidad A?9asa y actiidad

nucleol&tica sobre DNA.

Los sitios de ruptura en el DNA no son espec&icos, ocurriendo entre " y % Cb del

sitio de reconocimiento. Esta es la razón por la cual las enzimas de restricción

pertenecientes al tipo no !an sido muy utilizadas en biolo&a molecular.

1istemas tipo

Enzimas dierentes realizan la restricción y modiicación. La restricción ocurre

en el sitio de reconocimiento ó adyacente.

Estas enzimas tipo son las utilizadas en el clonamiento de enes, puesto que

permiten romper el DNA en sitios espec&icos, y as&, recuperar secuencias

conocidas.

1on menos comple*as, con pesos moleculares menores de 85.555 daltons

;equieren (nicamente =B para la actiidad nucleol&tica. No necesitan A?9.

Estas endonucleasas reconocen secuencias especiicas en el DNA, rompiéndole

en ambas cadenas y enerando ramentos equimolares en la molécula de DNA

sustrato.

Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo son de tipo pal&ndrome

/se leen iual de izquierda a derec!a que de derec!a a izquierda0.



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1e denominan isoquizómeros a aquellas enzimas que !an sido obtenidas de

dierentes especies de bacterias, pero que reconocen la misma secuencia de

DNA.

1e !an aislado alrededor de 6%5 dierentes endonucleasas de restricción del tipo

, con apro2imadamente unas 8% secuencias espec&icas de reconocimiento

dierentes.

Dada su especiicidad, que posibilita el predecir los posibles ramentos

producidos a partir de una secuencia conocida de DNA, estas enzimas !an sido

e2tremadamente (tiles en biolo&a molecular.

9roocan tipos de cortes:

• ortes escalonados, de*ando productos con e2tremos complementarios

/co!esios0 E*: Eco ;

• ortes simétricos, de*ando productos con e2tremos cieos E*: Alu

Aunque se utilizan ambas clases de ramentos /con e2tremos cieos y con

e2tremos escalonados0, en inenier&a enética se preieren aquellos con

e2tremos complementarios, puesto que permiten la unión espont3nea del en aclonar con el ector. 1i las moléculas a utilizar presentan e2tremos cieos, !ay

que conerirles e2tremos co!esios, por e*emplo utilizando la enzima transerasa

terminal.

E*emplos de enzimas de restricción tipo :

MICRRANISM ENZIMA SECUENCIA

Arthrobacter luteus Alu A ?

? A

Escherichia coli %)*+ Eco ; AA??

??AA

Escherichia coli - Eco ;@ A? A?

?A ?A

/lebsiella neumoniae Fpn ?A

A?

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Nocardia otitis0caviarum Not

1aemophilus aeg!ptus Gae ; H

H ;

1aemophilus in$luenzae Gin AN?

?NA

R: significa base púrica ( A ó G)

Y: significa pirimidina (C ó T)

N : significa cualquier nucleótido

: indica ruptura enlace fosfodiester

1istemas tipo

Es similar al sistema tipo ,

Itilizan una enzima oliomérica que realiza todas las actiidades enzim3ticas, y

rompen el DNA %-$ p b m3s all3 del sitio de reconocimiento.

omprende endonucleasas que requieren A?9 y =B aunque no tienen actiidad

de !idrólisis de A?9 detectable

La actiidad endonucleasa no tiene un requerimiento estricto de 1-

adenosilmetionina, aunque resulta estimulada por él.

La actiidad metilasa requiere 1-adenosilmetionina (nicamente como donador de rupos metilo y se !an aislado ormas metilantes libres de actiidad

nucleol&tica, suiriendo que la endonucleasa y la metilasa son componentes del

mismo comple*o molecular que es capaz de disociarse en condiciones

apropiadas.

El sitio de ruptura de DNA, por estas enzimas del tipo , ocurre a

apro2imadamente "5 a 5 nucleótidos de distancia del sitio de reconocimiento.

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A0licaciones!

El descubrimiento de las endonucleasas de restricción !a permitido el desarrollo

ertiinoso de lo que se denomina tecnolo&a del DNA recombinante. @amos sin

embaro a desarrollar breemente alunos aspectos en los que la utilización de estas

enzimas tienen una aportación especiica al campo de la biolo&a molecular.

Las enzimas de restricciJn !an sido utilizadas para la construcción de los mapas

enéticos de pequeos enomas como pl3smidos, bacterióaos o irus.

Adem3s de este uso son imprescindibles para la caracterización de enes obtenidos por

técnicas de DNA recombinante, como por e*emplo determinación de e2ones e intrones

de un en, zona de los promotores, secuencias adyacentes a los e2tremos %K, zonas de

poliadenilación, y en eneral todo tipo de estudios de car3cter estructural en los que es

imprescindible el desarrollo de mapas de restricción.

Estudio del numero de copias de un en.

En alunas ocasiones se puede determinar cual es él numero de copias de un en

presentes en un determinado enoma. Este an3lisis se realiza mediante la detección de la

ausencia de sitios de reconocimiento para determinadas endonucleasas de restricción,

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dentro de la secuencia codiicante del en. =ediante diestión del DNA enómico con

las enzimas de restricción para las que no e2isten sitios de reconocimiento en ese en e

!ibridación con sondas de DNA para ello, podemos tener una apro2imación del n(mero

de copias presentes en el enoma mediante la obseración del numero de bandas de!ibridación obtenidas en el dierido del DNA enómico.

Este tipo de apro2imación se !a utilizado en el an3lisis del numero de copias presentes

en el enoma !umano para él interer&an "K%K, as& como para él numero de copias

presentes para la subunidad a de la onadotropina corionica !umana K"4K.


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!ibridación, podemos asociar un determinado modelo de restricción con el

padecimiento de la enermedad que estamos estudiando.

Gay que destacar que las poblaciones !umanas son polimóricas, es decir que e2isten

pequeas ariaciones en la estructura del DNA de unos indiiduos a otros lo que se

pretende con el an3lisis por ;


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se producen por remoción alternatia de intrones. La ADN liasa R e2presada en

orma ubicua orma comple*os con la prote&na S;;" implicada en la reparación de

roturas de cadena sencilla .En contraste, la ADN liasa T se e2presa solo en células

meióticas masculinas, lo que suiere que interienen en la recombinación meiótica. LaADN liasa @ parece estar implicada en la reparación directa de roturas de doble

cadena D1 /double strand breaC0

-as a0licaciones en la investi)aci'n de la *iolo)2a %olecular.

Las liasas de ADN se !an uelto una !erramienta indispensable en la inestiación de

la biolo&a molecular moderna para el recombinante enerador las sucesiones de ADN.

9or e*emplo, se usan los liasas de ADN con las enzimas de la restricción para insertar ADN ramenta, a menudo los enes, en el pl3smidos.

Ino ital, y a menudo trapacero, es realizar la recombinación e2itosa e2perimenta

inolucrando el liase est3 controlando la temperatura óptima. La mayor&a de los

e2perimentos usa ?4 ADN Liasa /se aisló del bacterióao ?40 qué es muy actio a las

%U. 1in embaro para realizar el liado e2itoso, la temperatura de la enzima óptima

necesita ser equilibrada con la ?m de temperatura undición /también la temperatura del

recocido0 del los ramentos liados de ADN.

1i la temperatura ambiente e2cede la ?m, el apareamiento !omóloo de los ines

pea*osos no ocurrir3 porque la temperatura alta rompe la inculación de !idróeno. El

m3s corto el ADN ramenta, el m3s ba*o la ?m. As& para los ines pea*osos /los

traslapo0 muc!o tiempo, menos de diez pares de la base se realizan los e2perimentos del

liación a las temperaturas muy ba*as /M4-8U0 para un per&odo laro de tiempo /a

menudo de noc!e0.

Los liasas de ADN disponibles comercialmente comunes se descubrieron

oriinalmente en el bacterióao ?4, E. coli u otras bacterias.

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3. ADN -IMERASA

DEFINICIÓN!

La b(squeda de una enzima que sintetizase el ADN lleo al descubrimientos de la ADN polimerasa por Art!ur Fornber y colaboradores. La ADN polimerasa es la principal

enzima de la replicación. 9artiendo de una cadena inicial o )primer+ la ADN polimerasa

aade nucleótidos complementarios a la cadena molde e2tendiendo la nuea cadena de

ADN en dirección %O- 6O.

La ADN polimerasa es la enzima principal en el proceso de replicación. 9artiendo de una

cadena inicial o )primer+ la ADN polimerasa es capaz de aadir nucleótidoscomplementarios a la cadena molde estableciendo enlaces osodiéster. La ADN

polimerasa sólo puede catalizar el crecimiento de la cadena inicial en dirección %K-6K,

ensamblando los triosatos de deso2irribonucleósido en el ADN, siriendo como patrón

una cadena simple de ADN. La ADN polimerasa también se encara de la reparación del

ADN asociada a la replicación. Vsta que onstituye la piedra anular de la reacción de la

polimerasa en cadena /9;0 que se utiliza para ampliicar el ADN. El modelo de

sustitución es altamente espec&ico.

-as actividades e4onucleasas de la DNA 0ol!

La ADN polimerasa son prote&nas que adem3s de las actiidades polimerasas que

poseen, tienen también actiidades e2onucleasas.

Los ADN pol de tipo terminan la replicación, eliminando los cebadores A;N en los

secuencias de PCazaCi y corriiéndo los

errores producidos por la polimerasa de tipo

.

9ara realizar ésta actiidad, una ADN

polimerasa de tipo posee dos tipos de

actiidades e2onucleasas. Ina actiidad

e2onucleasa %K 6K que elimina todos los

nucleótidos /ribonucleótido o

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deso2iribonucleótido0 situados al inal del cebador. Esta actiidad es muy (til para la

reacción en cadena en tiempo real y en la técnica del marcado de sondas denominada

translación nicC /nicC translation0. La otra actiidad /6K %K0 es la actiidad

>prooreadin>, osea la correción de errores. Esta actiidad no e2iste en los procariotas/bacterias0, solamente en los eucariotas y arc!aea. Las polimerasas que poseen ésta

actiidad e2onucleasas producen menos altas pero son "5 eces m3s lentas.

Las polimerasas se utilizan también para el secuenca*e. 1e considera que la actiidad

e2onucleasa %K 6K destruye una parte de los cebadores y como tal se pueden encontrar

polimerasas desproistas de éstas actiidades.

TIS!

Gay % ADN polimerasas dierentes bien caracterizadas, dierenci3ndose en su localización,

actiidad y sensibilidad a los in!ibidores: ala, beta, amma, delta y épsilon:

-as ADN 0oli%erasas delta # e0silon:

Dirien la replicación de la cadena conductora o )leadin strand+ que es la cadena

que crece de %K a 6K en mismo sentido que crece la nuea copia de ADN.

Estas dos ADN polimerasas uncionan durante la ase 1 del ciclo celular en las

células eucariontes. El ADN polimerasa delta es un !eterod&mero compuesto de

una subunidad 9"% y otra 9%5, aunque es probable que en leaduras y mam&eros

contenan una subunidad adicional con una masa apro2imada de %5CDa. 9 "% es

la subunidad catal&tica tanto para la actiidad de polimerasa como para la edición

con actiidad de e2onucleasa 6Q%Q. LA polimerasa delta es necesaria para la

s&ntesis tanto de la cadena libre como de la cadena rezaada durante la replicación.

La interacción de las polimerasas delta y epsilon con el ADN liasa es dierente

la presencia de esta enzima en la !orquilla de replicación reprime la acción de la

polimerasa delta y por el contrario, actia la polimerasa epsilon, de este modo !a

surido que la replicación de la cadena rezaada se debe a la polimerasa epsilon.

La ADN polimerasa epsilon parece que también est3 inolucrada en un tipo de

reparación del ADN. Adem3s, las ADN polimerasas amma, delta y epsilon tienen


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actiidad e2onucleasa 6K%K y, por tanto, son capaces de eliminar los nucleótidos

del e2tremo 6K que !an sido incorporados incorrectamente en un proceso conocido

como corrección de pruebas.

-a ADN 0oli%erasa al(a!

9articipa en el proceso de replicación del ADN diriiendo la replicación de la

cadena retardada o )lain strand+ que es la cadena que crece de 6K a %K que es el

sentido contrario al del crecimiento lobal de la nuea copia de ADN.

Ina propiedad adicional enzim3tica de la ADN polimerasa es su capacidad para

!idrolizar cadenas de ADN ba*o ciertas condiciones.La ADN polimerasa puede !idrolizar ADN proresiamente desde el e2tremo 6

W-!idro2ilo de una !ebra de ADN. Los productos son mononucleótidos. As& pues,

la ADN polimerasa es una e2onucleasa 6W%W. El nucleótido eliminado debe

tener un termino 6W-PG libre, y no puede ser parte de una doble !élice.

E2perimentos con una ariedad de pol&meros sintéticos !an indicado que la

ADN polimerasa siempre elimina residuos no aparentes de los e2tremos antes

de proseuir con la polimerización. No !ay !idrólisis, si los términos est3n

conenientemente acoplados y est3n presentes los precursores actiados. La

polimerización eita la !idrólisis a partir del e2tremo 6Q. La polimerización

eneralmente no ocurre e2cepto si los pares de bases enca*an en una doble

!élice. 1in embaro si se produce un error en esta etapa puede ser correido

antes que sea incorporado al siuiente nucleótido. En eecto, la ADN polimerasa

" e2amina el resultado de cada polimerización que cataliza antes de la

incorporación del siuiente nucleótido. La ADN polimerasa " puede también

!idrolizar ADN a partir del e2tremo %Q de la cadena. Esta actiidad de nucleasa

%Q6Q es muy dierente al de la e2onucleasa 6Q%Q. 9rimero el enlace roto

puede estar en una reión de doble !élice. 1eundo la rotura puede ocurrir en el

enlace osodiester ?erminal o en un enlace a arios residuos de distancia del

?erminal %Q.

?ercero, la actiidad de nucleasas %Q6Q es intensiicada por la s&ntesis

concomitante de ADN. uarto, el centro actio para la actiidad de nucleasa

%Q6Q es completamente dierente de los centros actios de la polimerización y


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la !idrólisis 6Q%Q. El ADN polimerasa " puede diidirse en ramentos de

$%555 y 6J555 daltons por diisión proteol&tica controlada. Los ramentos

pequeos tienen actiidad de nucleasa %Q 6Qoriinal, mientras los restantes

ramentos randes contienen las actiidades de la polimerasa y de nucleasas6Q %Q. As& pues la ADN polimerasa " contiene al menos tipos de enzimas

distintas en una cadena polipept&dica.

-a ADN 0oli%erasa *eta!

1e encara de los procesos de reparación del ADN.

-a ADN 0oli%erasa )a%%a!;ealiza la replicación del ADN mitocondrial.

1e est3 estudiando la relación entre mutaciones en la ADN polimerasa amma

/mitocondrial0 con enermedades neurodeeneratias como el 9arCinson o alunos

tipos de distroia muscular. En alunos casos estas mutaciones pueden deberse a la

presencia de reiones de polilutamina en la secuencia codiicante de la ADN

polimerasa amma. 9or otra parte, se !a encontrado que mutaciones en la ADN

polimerasa delta, probablemente en su dominio con actiidad e2onucleasaresponsable de la corrección de pruebas, pueden ser responsables del inicio y

desarrollo de tumores.

ADN

0oli%erasa

5I6 δ

5III6 ε

5II6

γ

-ocali&aci'n nuclear nuclear nuclear nuclear mitocondrial


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Funci'n en

s2ntesis

de ADN

cebar s&ntesis ADN reparación reparación replicación

otras(unciones

- 6W-%We2onucleasa

6W-%We2onucleasa

- 6W-%We2onucleasa

in"i*idores aidicolina aidicolina aidicolina deso2i-??9 deso2i-??9

7. TRANSCRITASA IN8ERSA

DEFINICIÓN!

Durante muc!os aos se creyó que ese lu*o de inormación enética era unidireccional,!asta tal punto que dic!o supuesto constitu&a el llamado >doma central> de la biolo&a

molecular . 1in embaro, !ace al(n tiempo, el descubrimiento de un rupo de

oranismos capaces de inertir el sentido de este lu*o conmoió los cimientos de este

doma central. Estos oranismos son un tipo de irus que se !a denominado ;etroirus.

La transcriptasa inersa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que

tiene como unción sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde A;N

monocatenario, es decir, catalizar la retrotranscripción o transcripción inersa. Esta

enzima se encuentra presente en los retroirus. 1u nombre obedece a que el proceso

normal de la transcripción, la que se puede llamar >directa>, codiica el A;N a partir de

la secuencia inicial de ADN, y no al reés. Ina orma sencilla de s&ntesis de DNA de

doble cadena a partir de transcriptasa inersa o también llamada DNA polimerasaX;NA

diriida ser&a partir de un cebador cola de poli-? que establecer&a bases

complementarias con la cola de poli-A del ;NA transcrito de la !ebra a sintetizar,

orm3ndose as& un !&brido ;NAXDNA. Dic!o !&brido podr&a separarse mediante

ribonucleasas, y posteriormente con la acción de una DNA-polimerasa y un nueo

cebador, ser completada la !ebra de DNA de doble cadena.

La enzima transcriptasa reersa, que naturalmente producen ciertos irus para inadir el

enoma de sus células blanco, se utiliza ampliamente para clonar enes a partir de sus

A;N mensa*eros

TRANSCRICIÓN RE8ERSA 9 CR 5RT:CR6

SEMINARI! T,CNICAS M-ECU-ARES DE- ADN "%

http://danival.org/100%20biolomar/4000notasbio/gen/dogma.htmlhttp://danival.org/100%20biolomar/4000notasbio/gen/dogma.htmlhttp://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/ADNhttp://es.wikipedia.org/wiki/ADNhttp://es.wikipedia.org/wiki/ARNhttp://es.wikipedia.org/wiki/Retrovirushttp://es.wikipedia.org/wiki/Transcripci%C3%83%C2%B3n_gen%C3%83%C2%A9ticahttp://danival.org/100%20biolomar/4000notasbio/gen/dogma.htmlhttp://danival.org/100%20biolomar/4000notasbio/gen/dogma.htmlhttp://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/ADNhttp://es.wikipedia.org/wiki/ARNhttp://es.wikipedia.org/wiki/Retrovirushttp://es.wikipedia.org/wiki/Transcripci%C3%83%C2%B3n_gen%C3%83%C2%A9tica


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Este método combina la reacción en cadena de la polimerasa /9;0 con el proceso de

transcripción reersa.

?iene como propósito enerar un ran n(mero de copias de un ramento de ADN de

interés in @itro .La concentración de copias aumenta e2ponencialmente, ya que en cadaciclo se copian las dos cadenas del ADN .1i se inicia la reacción con una copia del en y

este es copiado en el primer ciclo, se !a detener dos copias .En el seundo ciclo se a de

concluir con la ormación de cuatro copias, etc.

El método de ;?-9; permite medir la e2presión énica mediante una técnica

alternatia al Nort!en lot. Es m3s sensible y requiere menos A;N .1in embaro, la

presencia de A;N o ADN contaminante, tanto en las muestras, como en laboratorios y

reactios, debe ser eitada con el in de impedir la aparición de productos inespec&icos.

La transcripción reersa.,tanto utilizando A;N total como A;Nm, es la etapa clae en

el proceso de ;?-9;%$.E2isten arios actores que inluencian la eiciencia del

proceso ,tales como la acción de la enzima que llea acabo la reacción y la presencia de

estructuras secundarias en el A;N.

En el caso del estudio de te*idos cancerienos se realiza la e2tracción de A;N del te*ido,

se eect(a la transcripción reersa y inalmente se llea acabo el 9;. Los resultados

son comparados con los te*idos sanos los retroirus.

1. CARACTER;STICAS!

?écnica que consiste en la ampliicación in itro de un ramento de ADN

espec&ico, y que est3 presente en muy ba*as cantidades en el material cl&nico a

inestiar.

SEMINARI! T,CNICAS M-ECU-ARES DE- ADN "J


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El undamento de esta reacción en cadena es la repetición c&clica de 6 reacciones

simples que ar&an sólo en cuanto a la temperatura de incubación, estas son: la

desnaturalización, la alineación y la e2tensión.

Los elementos que se emplean y participan en esta técnica, son: la ADN

polimerasa, cantidades eleadas de deso2irribonucleótidos triosato /dA?9,

d?9, d?9, d??90 y dos olionucleótidos cebadores de !ebra simple

complementaria a las secuencias conocidas del ADN patrón.

1e emplean ADN polimerasas termoestables, e2tra&das de microoranismosadaptados a iir a altas temperaturas, restrictias para la mayor&a de los seres

ios, como las: ?!ermus aquaticus, /9olimerasa taq0 una bacteria que ie en

uentes termales y que es muy resistente al calor, lo que !ace que no se inactie

por desnaturalización cuando en el proceso se aumenta la temperatura, y por

ende se consiue una me*or idelidad del proceso, ya que es m3s espec&ica.

La reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica que permite replicar entre

cientos de miles y millones de eces, en el transcurrir de pocas !oras en in itro,

pequeas cantidades de ADN.

El producto que se obtiene al inalizar la reacción es una ran cantidad de un

ramento énico con alto rado de pureza.


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A) La Desnaturalización, por calentamiento a temperatura eleada / mayor de

#5 70 , del ADN patrón de doble !ebra en !ebras simples.

B) La Alineación o unión de los cebadores, se producir3 la !ibridación delcebador, es decir, el cebador se unir3 a su secuencia complementaria en el ADN

molde. 9ara ello es necesario ba*ar la temperatura a %5-J%7 durante 5-45

seundos /se(n el caso0, permitiendo as& el alineamiento. Los puentes de

!idróeno estables entre las cadenas de ADN sólo se orman cuando la secuencia

del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el

!&brido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los

cebadores actuar3n como l&mites de la reión de la molécula que a a ser

ampliicada.

C) La Extensión o Amplificación, act(a la ADN polimerasa, tomando el ADN

molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como

soporte inicial necesario para la s&ntesis de nueo ADN. La polimerasa sintetiza

una nuea !ebra de ADN complementaria a la !ebra molde aadiendo los

nucleótidos triosatos en dirección %O6O. El tiempo de e2tensión depende tanto

de la ADN polimerasa usada como de la lonitud del ramento de ADN que se

a a ampliicar.

Gay una rela b3sica: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN

polimerizar3 mil bases en un minuto.

Modi(icaciones de la t+cnica! Vstas siren para me*orar la especiicidad de la

reacción de las 9;s:

• CR anidada! /nested 9;0 ?écnica muy sensible de 9; en la que el

producto de la primera ampliicación, es utilizado como molde para realizar

una seunda ampliicación con cebadores que se ubican dentro de la primera

secuencia ampliicada. Este tipo de 9; es muy espec&ica.

• CR in situ: Consiste en una reacción de 9; en secciones !istolóicas o

células, donde los productos enerados pueden isualizarse en el sitio de

ampliicación. Es realizada sobre preparaciones i*as en un portaob*etos. En

la técnica de 9; in situ se realiza una primera ampliicación de ADN


http://es.wikipedia.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_(biolog%C3%ADa_molecular)http://es.wikipedia.org/wiki/Puente_de_hidr%C3%B3genohttp://es.wikipedia.org/wiki/Puente_de_hidr%C3%B3genohttp://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttp://es.wikipedia.org/wiki/Replicaci%C3%B3n_de_ADNhttp://es.wikipedia.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_(biolog%C3%ADa_molecular)http://es.wikipedia.org/wiki/Puente_de_hidr%C3%B3genohttp://es.wikipedia.org/wiki/Puente_de_hidr%C3%B3genohttp://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttp://es.wikipedia.org/wiki/Replicaci%C3%B3n_de_ADN


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blanco y lueo detección mediante !ibridación in situ conencional con

sondas de ADNXA;N. De esta manera pueden detectarse cantidades

peque&simas de enoma. Esta tecnolo&a es de ran alcance en la capacidad

de ampliicar espec&icamente una población de secuencias de menor representación.

• CR 0or contacto! ?écnica utilizada para incrementar la especiicidad sin

comprometer la producción. El principio es iniciar la s&ntesis a muy altas

temperaturas de alineamiento lo cual sólo permite la ormación (nica de los

pares perectamente alinéanos cebador-molde. La temperatura de

alineamiento es ba*ada de una orma radual con cada ciclo. Ina ez que las

copias de la secuencia diana !an comenzado a acumularse durante los

primeros ciclos, el alineamiento a alta temperatura llea a ser muc!o menos

cr&tico para la especiicidad, como son los productos preios que orman el

molde principal.

Los productos improbablemente tendr3n secuencias de alineamiento also.

El beneicio de disminuir la temperatura de alineamiento es el incrementar la

probabilidad de una interacción estable cebador-diana. El resultado es una

me*ora en la producción del producto espec&ico compar3ndolo con los

protocolos que utilizan alineamiento a una (nica alta temperatura.

• RT:CR 5Revese Transcri0tion CR6! Itilizado para ampliicar, aislar o

identiicar una secuencia conocida de te*ido ;NA. La 9; es precedida por

una reacción usando la transcriptasa inersa para conertir el ;NA a cDNA

/ADN complementario0. ;?-9; se utiliza ampliamente en periles de

e2presión, para determinar la e2presión de un en o para identiicar la

secuencia de una transcripción de A;N, incluyendo la transcripción de inicioy terminación de los sitios y, si la secuencia del

ADN eonómico de un en es conocido, el mapa de ubicación de e2ones e

intrones en el en.

3. A-ICACINES =>SICAS!

Las aplicaciones de la 9; son m(ltiples, esta técnica se desarrolla en diersos campos

como la biolo&a molecular, la enética, medicina y otros.

SEMINARI! T,CNICAS M-ECU-ARES DE- ADN "#

http://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Biological_tissue&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/RNA&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcriptase&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/RNA&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/CDNA&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/CDNA&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Expression_profiling&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Expression_profiling&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Exons&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Introns&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Biological_tissue&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/RNA&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcriptase&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/RNA&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/CDNA&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/CDNA&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Expression_profiling&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Expression_profiling&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Exons&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Deshttp://64.233.179.104/translate_c?hl=es&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Introns&prev=/search%3Fq%3Dpcr%26hl%3Des


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El producto que se obtiene al inalizar la reacción -una ran cantidad de un ramento

énico con alto rado de pureza- despierta el interés de los inestiadores por ampliar

los conocimientos sobre la estructura y unción de los enes.

9or su alta sensibilidad, esta técnica permite identiicar un en a partir de un solocabello, una célula som3tica o un espermatozoide.

Ga acilitado, y en muc!os casos !ec!o posible, la tarea de identiicación de personas,

por e*emplo de !i*os de desaparecidos, mediante el an3lisis de muestras del nio y de su

abuela materna.

En la detecci'n de %utaciones! La técnica de 9; nos permite localizar mutaciones

preiamente descritas. 1e emplea as& en la secuenciación de ADN como un método de

dianóstico: Ina ez que se !a caracterizado la relación con una enermedad de unadeterminada mutación puntual /mutaciones en el en de la alactosa "9 uridiltranserasa

en la alactosemia, mutaciones en c-;as y c3ncer, etc.0 o de una pequea deleción

/deleción de tres bases en el en


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9or lo que se puede emplear en: dianóstico r3pido de inecciones &ricas, detección de

microoranismos en células inectadas o transormadas, determinación de la relación

enética entre arios tipos de microoranismos similares, para correlacionar la

presencia de aentes irales o inecciosos en te*idos neopl3sicos. La técnica de 9; tiene el potencial de realizar una r3pida detección del DNA bacteriano en muestras de

sanre, y eita los contratiempos encontrados con los cultios sanu&neos en el

dianóstico de bacteriemia.

Entre las a0licaciones %+dicas de la CR , cabe destacar su aporte al desarrollo de

nueas estrateias de dianóstico. 9ermite detectar aentes inecciosos como los irus

de las !epatitis y o reiones del enoma del irus de la inmunodeiciencia !umana

/G@0.

Ga sido aplicada, por e*emplo, para dianosticar la presencia o ausencia de G@ en

recién nacidos de madres ceropositias, pues la e2istencia de anticuerpos maternos

impide obtener resultados coniables, con los métodos conencionales, durante el

primer ao de ida.

?ambién !a acilitado el dianóstico de enermedades tales como las !emoilias A y ,

la distroia muscular y la ibrosis qu&stica, e !izo posible reconocer mutaciones de enes

inculadas con enermedades oncolóicas.

En %edicina, la 9; se emplea undamentalmente como !erramienta de dianostico:

• 9ermite el enotipar la especie o especies que proocan un determinado cuadro

ineccioso: para ello, se ampliica una zona del enoma bacteriano cuyo

producto de 9; posea unas caracter&sticas de tamao o temperatura de usión

que permitan identiicarlo de orma inequ&oca. En el caso de inecciones irales

que implican la interación del enoma del patóeno en el ADN del !ospedador,

como es el de la inección por @G, la 9; cuantitatia posibilita la

determinación de la cara iral e2istente y por tanto, del estadio de la

enermedad.

• La 9; también se puede usar en reisiones médicas rutinarias, como en los

sericios de donantes de sanre. A traés de esta técnica se pueden detectar

inecciones pelirosas en el donante /como @G o Gepatitis 0 mientras a(n

est3n en el periodo de incubación. Dada la sensibilidad de los test de 9; se

pueden tomar muestras colectias o >pools> /por e*emplo, #J pruebas


http://es.wikipedia.org/wiki/Diagn%C3%B3sticohttp://es.wikipedia.org/wiki/Hepatitishttp://es.wikipedia.org/wiki/Diagn%C3%B3sticohttp://es.wikipedia.org/wiki/Hepatitis


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indiiduales0. 1i una de estas muestras colectias da positio, se toman a partir

de ella muestras proresiamente menores !asta que se encuentra el causante.

• El dianóstico de enermedades !ereditarias presentes en el enoma es un

proceso laro y complicado que puede acortarse siniicatiamente racias a la9;. ada uno de los enes prueba se pueden ampliicar mediante sus

correspondientes primers y posteriormente secuenciar para detectar la e2istencia

de mutaciones.

7. 8ENTA?AS 9 -IMITACINES!

4.". 8entajas!

9roducir randes cantidades de sementos de un en, a partir de una muestra

m&nima de ADN

En un espacio corto de tiempo enera un eleado n(mero de copias de ADN.

;apidez

Especiicidad

NP requiere uso de radioisótopos /riesosos y costosos0

9racticable con te*idos procedentes de estiios arqueolóicos.

4.. -i%itaciones!

Conta%inaci'n en la CR La ;eacción en adena de la 9olimerasa es una

técnica muy sensible, por lo que es de ran importancia eitar contaminaciones,ya que es posible que el ADN no deseado /aunque se encuentre en una cantidad

muy pequea0 se ampliique y obtenamos un resultado que no es real. @emos

que una de sus mayores enta*as de la técnica, se conierte a la ez en el

principal inconeniente.

1. CARACTER;STICAS

SEMINARI! T,CNICAS M-ECU-ARES DE- ADN

http://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad_hereditariahttp://es.wikipedia.org/wiki/Genomahttp://es.wikipedia.org/wiki/Mutaci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad_hereditariahttp://es.wikipedia.org/wiki/Genomahttp://es.wikipedia.org/wiki/Mutaci%C3%B3n


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?écnica que permite la identiicación de secuencias espec&icas de DNA,

mediante el uso de electro(oresis en )el y de "i*ridaci'n utilizando sondas

especiicas.

Esta técnica ue desarrollado por E. =. 1out!ern para la detección de

enes espec&icos en el ADN celular.

9ara analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser

preiamente ramentada, por e*emplo utilizando sonicación ó enzimas de

restricción.

Itiliza la !ibridación de 3cidos nucleicos para la detección de las

moléculas buscadas.

9ermite detectar qué enes son transcriptos en determinadas condiciones.

El 1out!ern lot nos permite eidenciar el mismo material enético encambio el Nort!ern lot, la e2presión de dierentes enes.


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Lueo, el iltro se incuba con una sonda marcada, espec&icamente para la

secuencia que deseas identiicar /el traspaso de las muestras desde el el al iltro


El Sout"ern =lot es una técnica que permite la identiicación de secuencias

espec&icas de DNA como anterior ue mencionado.

nicialmente la muestra de ADN es sementada por una sonicaci'n o unaen&i%a de restricci'n/ son separados de mayor a menor tamao mediante una

electro(oresis de )el de a)arosa empleando corriente eléctrica. Ina ez

terminada la electrooresis y sin teir el el los ramentos de DNA se

traspasan a un iltro de nitro celulosa o a una membrana de nylon.


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es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases complementarias entre

sonda y secuencias de DNA en el el es muy ineiciente0.

Esta sonda es una secuencia de 3cido nucleico, DNAds ó ;NAm, que

reconocer3 a la secuencia de DNA inmoilizada en el iltro, a traés del

reconocimiento de secuencias complementarias de 3cidos nucleicos

/!ibridización0. La sonda se marca con un isótopo radioactio o con un

luorocromo.

La sonda unida al ramento de ADN complementario se puede isualizar en el

iltro de una orma sencilla mediante una e2posición a una pel&cula de rayos S

para el caso de sondas radiactias o con una pel&cula sensible a la luz, para elcaso de sondas con luorocromo.

3. A-ICACINES =>SICAS

Las aplicaciones son:

1e utiliza para caracterizar ADN clonado.

Ytil en patolo&a orense para identiicar criminales, ioladores, etc. La

identiicación con ADN o >!uella enética> se basa en el estudio de una

serie de ramentos de ADN presentes en todos los indiiduos pero que

poseen la caracter&stica de ser altamente ariables o polimóricos entre

los mismos.

El an3lisis de un determinado n(mero de estas secuencias o ramentosde ADN permite identiicar a un indiiduo con una probabilidad muy

cercana al "55Z.

Es aplicable para distinuir muestras de biopsias ante conusiones.

9ara la identiicación de ramentos de ADN que contienen un endeterminado de entre una mezcla de muc!os ramentos.

SEMINARI! T,CNICAS M-ECU-ARES DE- ADN %

http://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_Xhttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_X


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;eordenamiento enético en procesos linoprolieratios. 1e puede

determinar clonalidad a partir del en de las cadenas pesadas de

inmunolobulinas en linomas o de receptores de los ant&enos en loslinomas ?.

Aplicable para el estudio de alteraciones oncoénicas.

?ratado de alteraciones enéticas !ereditarias.

9ara la construcción de patrones de ADN identiicatios de cadaindiiduo como auténticas tar*etas de identiicación como el DN.

7. 8ENTA?AS 9 -IMITACINES

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8ENTA?AS -IMITACINES

Alta sensibilidad!

Alta especificidad!

Rapide" en el diagnóstico

#ebido a la alta sensibilidad de estas

t$cnicas% el ma&or riesgo es el de

contaminación de las muestras lo cual

disminu&e la especificidad!

se encuentra limitado principalmente por

la representación del material gen$tico

perteneciente al organismo patógeno en

la muestra a ser estudiada & la

sensibilidad del mismo a ser degradado!

'l conocer parcial o totalmente el

genoma del organismo en cuestión% para

poder desarrollar sondas moleculares

especficas a un organismo tenemos

que aber clonado & secuenciado o

parcialmente caracteri"ado el material

gen$tico que permita identificar regiones

especficas a cada organismo & a cada

especie! Con frecuencia se usan

secuencias repetiti*as en el A#N (i!e!

ARN ribosomal) que generan patrones

distinti*os de ibridación similares al

polimorfismo obser*ado en eucariotas!

1. CARACTER;STICAS:

Nort!ern blot o an3lisis Nort!ern /en alusión al nombre del cient&ico inentor de esta

técnica0, es b3sicamente una prueba para detectar las secuencias de A;Nm que son

complementarias a un ramento de ADN o A;N llamado sonda.

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Detecta la presencia del A;N mensa*ero en un te*ido en particular y permite

determinar as& el tamao de la trascripción de ese A;N mensa*ero.

La presencia de un A;N en particular se detecta !ibridizando esta membrana con una

sonda de 3cido nucleico, eneralmente de cADN o A;Nr del en de interés.


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manipulación0 y poseen mayor capacidad de unión de DNA, pudiendo ser utilizadas

para !ibridaciones sucesias adem3s, producen poca luorescencia de ondo

/luorescencia inespec&ica0 al ser iluminadas con radiación I@, lo que es muy (til

para la detección de bandas de DNA. La desnaturalización de los ramentos de DNA, preia a la transerencia, se realiza

introduciendo el el en una disolución de NaPG que se neutraliza posteriormente,

las cadenas de DNA desnaturalizadas no deben ser muy laras para que la

transerencia sea eectia.La transerencia puede realizarse por capilaridad, por electrooresis

/electrotranserencia0, por centriuación o por succión /mediante una bomba de

ac&o0, aunque los dos (ltimos sistemas necesitan dispositios espec&icos, por lo

que su uso es m3s restrinido.la electrotranserencia se utiliza cuando la separación del DNA se !a realizado en

eles de poliacrilamida /dado que el reticulado es m3s denso que el de la aarosa0

el tiempo de transerencia depende del rosor del el, del porcenta*e de aarosa y

del tamao de los ramentos de DNA.Ina ez en la membrana, el DNA se i*a a ella mediante calentamiento a 85U o

iluminación con radiación I@ al iual que en el \estern lot, las reiones de la

membrana no ocupadas por el DNA transerido deben bloquearse, para eitar que al

aadir la sonda, ésta es una inespec&icamente a la membrana y produzca un ondoen el reelado para realizar este bloqueo, la membrana se sumere en una

disolución que contena substancias de eleado peso molecular, como icoll

/455CDa0, poliinilpirrolidona /6J5CDa0 o seroalb(mina boina /JJCDa0, adem3s de

DNA !eteroéneo de diersos or&enes /bacteriano, timo de ternera, esperma de

salmón, etc.0.La ormación de las estructuras !&bridas /!eterod(ple20 entre la sonda y la secuencia

complementaria buscada es muy dependiente de las condiciones e2perimentales

/particularmente de la temperatura0 para realizarla se utilizan dos sistemas: en el

primero, la membrana se introduce en una bolsa de pl3stico !ermética que contiene

la disolución con la sonda, control3ndose la temperatura por inmersión en un bao

termostatizado el seundo, utiliza !ornos de !ibridación, introduciendo las

membranas en botellas que contienen la disolución de la sonda.



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ENERACIÓN DE UNA SNDA MARCADA

?radicionalmente, las sondas moleculares se !an preparado con nucleótido-

triosatos /A?9, dA?9, ?9, d?9, ?9, d?9, I?9 o d??90 radiactios, que

contienen ósoro-6 /)90 en la posición ala, estos marcadores est3n incorporados

en las bases del ADN.

En ciertas aplicaciones se nota el uso de isótopos de ener&a intermedia o ba*a, se

usan nucléotidos que contienen azure-6% /6%10 o tritio /6G0, respectiamente. Las

sondas marcadas con isótopos se isualizan mediante autorradiora&a, donde la

ener&a radiactia impresiona una pel&cula de rayos S, en eneral si las condiciones

del laboratorio lo permiten y contando con personal entrenado para el uso de

isótopos radiactios el marcado de sondas por métodos radiactios no conllea

mayores riesos y proporciona una alta sensibilidad a los ensayos.

$I=RIDACIÓN

Dentro de este proceso se pueden distinuir tres etapas bien marcadas:

re:"i*ridaci'n o *loueo

La membrana une 3cidos nucleicos. La sonda marcada puede unirse de

orma inespec&ica y aumentar el ruido.

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La membrana es incubada con una solución de pre-!ibridación a la

temperatura de !ibridación.La solución de pre-!ibridación contiene compuestos que se unen

inespec&icamente a la membrana preiniendo la unión de la sonda a la

membrana, e2cepto a su !ebra complementaria. $i*ridaci'n La sonda marcada se aparea en solución con su !ebra complementaria,

inmoilizada en la membrana.ondiciones: Estas deben ser determinadas emp&ricamente. Los actores que aectan la !ibridación de 3cidos nucleicos. La solución de !ibridación presente en su inraestructura: %2 11,

6= Nal, 5,6= itrato de Na0, %5Z SICAS

Esta técnica se !a aplicado en estudios de la modulación de la s&ntesis de interleucina J

en pacientes con artritis reumatoide


http://www.monografias.com/trabajos10/modul/modul.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos7/sipro/sipro.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos10/modul/modul.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos7/sipro/sipro.shtml


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En el an3lisis de e2presión de receptores que participan en la s&ntesis de moléculas en

cultios celulares

En an3lisis de mutaciones y alteraciones del ;NAm de enzimas

En la reulación de la e2presión énica de marcadores moleculares de célulasleucémicas !umanas y moléculas del reconocimiento inmunolóico.

9or citar un caso: para analizar los ;NA que codiican la alb(mina con una ibra de

DNA.

9rimero las dierentes moléculas de ;NA intacto, de los !&ados mutantes y de los

normales se separan en bandas por electrooresis en el. Entonces, para que las

moléculas de ;NA sean accesibles a las ondas de DNA se !ace una replica del patrón de

bandas de ;NA del el con la transerencia de las moléculas raccionadas de ;NA a

una !o*a de nitrocelulosa o de papel de nailon. El papel se incuba con una solución que

contiene una sonda de DNA marcado cuya secuencia corresponde en parte a la cadena

molde que produce el ;NAm de la alb(mina.

Las moléculas de ;NA que se !ibridan en el papel con la sonda de DNA marcada /por

ser complementarias aparte de la secuencia normal del en de la alb(mina0 se colocan

detectando la sonda unida mediante autoradiora&a o métodos qu&micos. El tamao de

las moléculas de ;NA de cada una de las bandas que se unen a las sonda se puede

determinar usando como reerencia la miración de moléculas de ;NA de tamao

conocido /patrones de ;NA0 que se someten a electrooresis *unto con la muestra. As&

se puede descubrir que las células !ep3ticas del ratón aectado abrican alb(mina de

tamao normal y en cantidades normales alternatiamente podr&a ocurrir que el ;NA

de la alb(mina se detectara en cantidades muy reducidas.

El ;NA de la alb(mina mutante también podr&a ser anormalmente corto y desplazarse a

traés del el muy r3pidamente. En este caso el en transerido podr&a olerse a

estudiar con sondas de DNA masa selectias que reelasen que zona de ;NA esta

ausente.

7. 8ENTA?AS 9 DES8ENTA?AS

8ENTA?AS


http://www.monografias.com/trabajos7/sipro/sipro.shtmlhttp://www.monografias.com/trabajos7/sipro/sipro.shtml


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Es un método est3ndar que sire para la detección y la cuantiicación de los nieles

del ;NAm a pesar del adenimiento de técnicas de ran alcance, tales como ;?-

9;, an3lisis del arsenal del en y an3lisis de la protección del nucleasa.

9roporciona una comparación relatia directa de la abundancia del mensa*e entre las

muestras en una sola membrana /!ebra0.

Es el método preerido para determinar el tamao de la trascripción y para detectar

transcripciones alternatiamente empalmadas.

DES8ENTA?AS

Ina de las primeras limitaciones que podemos encontrar en este proceso estriba en

que si las muestras del ;NA !an sido deradadas lee y uniormemente, la calidad

de los datos y la capacidad de cuantiicar la e2presión se compromete seriamente.

9or e*emplo, incluso una sola !endidura en el 5Z de moléculas de la blanco de 4

F disminuir3 la seal uelta por el 5Z. As&, los reactios, ;NAs libres y las

técnicas son esenciales. ?ambién tenemos que esta técnica sensible pero sumamente

laboriosa y costosa, no consider3ndose adecuada para estudios de rutina de una

población rande.

TEMA 1! ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

En&i%as de restricci'n

!ttp:XX]]].dialoica.com.arXmedlineX55%X5#Xla^molecula^de^laîda.!tml.

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http://www.monografias.com/trabajos/explodemo/explodemo.shtmlhttp://www.dialogica.com.ar/medline/archives/cat_adn.phphttp://www.uprm.edu/biology/cursos/biologiageneral/EnzimasDNA.htmhttp://www.monografias.com/trabajos/explodemo/explodemo.shtmlhttp://www.dialogica.com.ar/medline/archives/cat_adn.phphttp://www.uprm.edu/biology/cursos/biologiageneral/EnzimasDNA.htm


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ADN -i)asa

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Adn oli%erasa

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!ttp:XXlauna.medic.unam.m2XMeazquezX5456XdnaZ5polimerasa.!tml

Lubert 1tryer. ioqu&mica. Editorial ;eerte 1.A. "#$#. Espaa

Transcri0tasa

!ttp:XXdanial.orXJ55Z5microbioX$455notasirXalunosXirâlunos^retroiru.

!tml

TEMA

;eacción en cadena de la polimerasa. ;e nest lin, 48, 45"-J.

!ttp:XX]]].bioloia.arizona.eduX!uman

=as Ea, 9oza ùlio iriza ès(s 55", ;eista Acuatic No. "%


36/36


:napoómo estudiar la e2presión de diersos enes 1out!ern, Nort!ern

y \estern lot iolo&a.!tm

:napoDesarrollo teórico de temas.!tm

!ttp:XXcaibco.uc.eXcaibcoXAPX@itaeX@itaeDosXArticulosX=edicina=olecularXmicrobio.!tm

!ttp:XXcriminalistic.orXinde2.p!p

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!ttp:XXmail.q.edu.uyXMmicrobioXA==XGerra=as".pptfJ5#,"J,Las

sondas son ramentos conocidos marcados

TEMA 7! NRT$ERN =-T

Gttp: XX]]].enome.o.

ò!n roc!er, Daid urnett, 55%, La iencia del Dianostico del

Laboratorio 7 edición, Editorial =c rau-Gill, arcelona 'Espaa.

an ;oitt, ònat!an rosto, "##$, nmunolo&a 47 edición, Editorial

Garcourt race, =adrid ' Espaa.

=ic!ael ?. =adian, ò!n =. =artinCo, 55J, rucC iolo&a de los=icroorarnismos "57 edición, Editorial 9earson Edicacion, =adrid '

Espaa.

diagnostico de dna

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